MX2008012843A - Polipeptidos con propiedades antiinflamatorias aumentadas y citotoxicas reducidas y metodos relacionados. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un polipéptido que contiene por lo menos una región de FC de IgG, dicho polipéptido tiene una actividad antiinflamatoria y una menor actividad citotóxica comparado con un anticuerpo no purificado y métodos de producción de dicho polipéptido.

Description

POLIPÉPTIDOS CON PROPIEDADES ANTIINFLAMATORIAS AUMENTADAS Y CITOTÓXICAS REDUCIDAS Y MÉTODOS RELACIONADOS Referencia cruzada a solicitudes de patentes relacionadas Esta solicitud de patente reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Provisoria Estadounidense Acta N° 60/789.384, presentada el 5 de abril de 2006.

Declaración con respecto a Investigación Financiada por el Gobierno Federal La investigación que deriva en la presente invención estuvo financiada en parte, por el Subsidio del Instituto Nacional de Salud N° AI 034662. Por consiguiente, el Gobierno de Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre esta invención.

Campo de la invención La presente invención se relaciona con métodos novedosos para diseñar polipéptidos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Antecedentes de la invención Aunque los receptores celulares para inmunoglobul ina se identificaron por primera vez hace casi 40 años, su función principal en la respuesta inmune se descubrió recién en la última década. Son los jugadores claves tanto en la fase aferente como eferente de una respuesta inmune, estableciendo umbrales para la activación de las células B y la producción de anticuerpos, regulando la maduración de las células dendríticas y acoplando la especificidad exquisita de la respuesta de los anticuerpos a las vías efectoras, tales como fagocitosis, citotoxicidad celular que depende de los anticuerpos y el reclutamiento y la activación de células inflamatorias. Su función central en la unión del sistema inmune humoral a las células efectoras innatas los ha convertido en blancos inmunoterapéuticos atractivos para aumentar o restringir la actividad de los anticuerpos in vivo.

La interacción de los anticuerpos y los complejos de anticuerpo y antígenó con células del sistema inmune efectúa una variedad de respuestas, que incluyen la citotoxicidad mediada por células que depende de los anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad que depende del complemento (CDC) , la fagocitosis, la liberación de mediadores inflamatorios, el aclaramiento de antígeno, y la semivida del anticuerpo (revisado en Daron, Annu Rev Immunol , 15, 203-204 (1997); Ward y Ghetie, Therapeutic Immunol , 2, 77-94 (1995); Ravetch y Kinet, Annu Rev Immunol, 9, 457-492 (1991)), cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia) .

Los dominios constantes de anticuerpos no están involucrados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras. Según la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, se puede asignar a los anticuerpos o a las inmunoglobulinas a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden a su vez dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , e IgG4 ; IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. De las diferentes clases de inmunoglobulinas humanas, IgGl e IgG3 humana median la ADCC en forma más eficaz que IgG2 e IgG4.

La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizarse rápidamente. La región Fe es central para las funciones efectoras de los anticuerpos. Se ha determinado la estructura del cristal de la región Fe de la IgG humana (Deisenhofer , Biochemistry, 20, 2361-2370 (1981), que se incorpora en la presente como referencia) . En las moléculas de IgG humana, la región Fe se genera por la ruptura por papaína del extremo de N a Cys, 226.

Se ha apreciado durante mucho tiempo que IgG media tanto las actividades proinflamatorias como antiinflamatorias a través de interacciones mediadas por su fragmento Fe. Por lo tanto, si bien las interacciones Fc-FcyR son responsables de las propiedades proinflamatorias de los complejos humanos y los anticuerpos citotóxicos, la gamma globulina intravenosa (IVIG) y sus fragmentos Fe son antiinflamatorios y se usan ampliamente para suprimir las enfermedades inflamatorias. El mecanismo preciso de dichas propiedades no está claro pero se ha propuesto que la gl icosilación de IgG es crucial para la regulación de la citotoxicidad y el potencial inflamatorio de IgG.

IgG contiene un solo glican unido a N en Asn297 en el dominio de CH2 en cada una de las dos cadenas pesadas. El carbohidrato complejo unido covalentemente está compuesto por un penta-polisacárido biantenario de núcleo que contiene N-ace ilglucosamina (GIcNAc) y mañosa (man) . Otra modificación de la estructura de carbohidrato de núcleo se observa en los anticuerpos de suero hallando en forma variable la presencia de grupos fucosa, GIcNAc ramificado, galactosa (Gal) y ácido siálico de extremo (sa) . Por lo tanto se ha detectado que más de 40 glicoformas diferentes están unidas en forma covalente a un solo sitio de gl icosilación . Fujii et al., J. Biol. Chem. 265, 6009 (1990) . Se ha mostrado que la glicosilación de IgG es esencial para la unión a todos los FcyRs manteniendo una conformación abierta de las dos cadenas pesadas. Jefferis y Lund, Immune .1 Lett., 82, 57 (2002), Sondermann et al, J. Mol. Biol., 309, 737 (2002) . Este requisito absoluto de la glicosilación de IgG para la unión a FcyR explica la incapacidad de los anticuerpos de IgG desglicosilados de mediar las respuestas inflamatorias disparadas in vivo, tales como ADCC, fagocitosis y la liberación de mediadores inflamatorios. Nimmerjahn y Ravetch, Immunity 24, 19 (2006) . Otras observaciones de que glicoformas individuales de IgG pueden contribuir a la modulación de respuestas inflamatorias han sido sugeridas por las afinidades alteradas para FcyRs individual informadas para anticuerpos de IgG que contienen o que carecen de fucosa y sus consecuentes efectos sobre la citotoxicidad . Shields et al., J. Biol. Chme . 277, 26733 (2002), Nimmerjahn y Ravetch, Science 310, 1510 (2005) . Se ha observado un vínculo entre los estados autoinmunes y patrones de glicosilación específicos de anticuerpos de IgG en pacientes con artritis reumatoide y varias vasculitis autoinmunes en las cuales se han informado galactosilación y sialilación reducidas de anticuerpos de IgG. Farekh et al., Nature 316, 452 (1985), Rademacher et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 6123 (1994), Matsumoto et al., 128, 621 (2000), Holland et al., Biochim. Biophys. Acta Dec 27; [Epub anterior a la impresión] 2005. También se ha informado que las variaciones en las glicoformas de IgG están asociadas con el envejecimiento y con posterioridad a la inmunización, aunque la significación in vivo de estas alteraciones no se ha determinado. Shikata et al., Glycoconj . J. 15, 683 (1998), Lastra et al, Autoimmunity 28, 25 (1998) .

Por consiguiente, existe una necesidad de desarrollar métodos para la generación de polipéptidos que explicarían las observaciones dispares de las propiedades de IgG in vivo.

Extracto de la invención La presente invención satisface la necesidad precedente proporcionando tales métodos y moléculas. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que contiene por lo menos una región de IgG, dicho polipéptido tiene una mayor actividad antiinflamatoria y una menor actividad citotóxica comparado con un anticuerpo no purificado. En diferentes realizaciones de la invención, el polipéptido comprende una región de Fe de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 humana, dicho polipéptido tiene un contenido más alto de ácido siálico comparado con un anticuerpo no purificado .

En otro aspecto, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe que tiene una mayor actividad antiinflamatoria y una menor actividad citotóxica, en combinación con un portador o diluyente adecuado.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un método de preparación de un polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe, dicho polipéptido tiene una mayor actividad antiinflamatoria y una menor actividad citotóxica que un anticuerpo no purificado, el método comprende: proporcionar una fuente no purificada del polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe, la fuente no purificada del polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe comprende una pluralidad de polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG que tiene ácido siálico y una pluralidad de polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG que no tiene ácido siálico; y aumentar la relación de la pluralidad de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG que tiene ácido siálico a la pluralidad de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG que no tiene ácido siálico. En diferentes realizaciones de la invención, la relación de la pluralidad de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG que tiene ácido siálico al pluralidad de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG que no tiene ácido siálico se logra a través de una eliminación de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG que no tiene ácido siálico o a través de una sialilación de la fuente no purificada de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 demuestra espectros de carbohidratos de isotipos de anticuerpos 6A6-IgG. N-glican derivados de 6A6-IgGl, IgG2a e ¦ IgG2b se analizaron mediante NALDI-TOF S . Los picos que contienen residuos de ácido siálico están indicados por el paréntesis. El anticuerpo 6A6 recombinante cuyas variantes producidas por la transfección transitoria de células 293T contenían niveles mínimos de residuos de ácido siálico en su Asn- 297 se unieron a carbohidratos.

La Figura 2 muestra que la sialilación reduce la citotoxicidad de IgG. (A) Estructura del grupo carbohidrato totalmente procesado unido a asparagina 297 (N297) en el fragmento de Fe del anticuerpo. La estructura de azúcar del núcleo se muestra en negrita. Los residuos variables tales como los azúcares de extremo y de bisección están subrayados y las ligaduras específicas están indicadas. Los sitios de rotura para PNGasa y neuraminidasa también están indicados. Esta estructura totalmente procesada está presente en un 5% de la mezcla de IgG de suero total (1) . Abreviaturas: GlcNAc = N-acetil glucosamina, man= mañosa, gal= galactosa, sa= ácido siálico. (B) Enriquecimiento de anticuerpos 6A6-IgGl e IgG2b con alto contenido de ácido siálico a través de cromatografía de afinidad a aglutinina Sambucus nigra (SNA) . (C) Actividad in vivo de anticuerpos 6A6-IgGl e IgG2b enriquecida para ácido siálico (SA) o con ácido siálico agotado mediante tratamiento con neuraminidasa (NA) . 4 g de cada anticuerpo se inyectaron en grupos de ratones (N=4 , media +/-SEM) ; * indica p<0,0001, ** indica p<0,01. (D) Constantes de asociación (KA) para FcyRIIB, FcyRIII y FcyRIV en la unión a anticuerpos con altos o bajos niveles de sialilación; n.b. indica ninguna unión. Los números en negrita indican los receptores de Fe específicos del isotipo que son responsables de mediar la actividad del anticuerpo in vivo. El error estándar en todas estas mediciones fue inferior al 5%.

La Figura 3 ilustra que el anticuerpo in vivo es modulado por ácido siálico. 6A6-IgGl se enriqueció para ácido siálico mediante cromatografía de afinidad con SNA-agarosa. Una fracción de esta preparación enriquecida con SNA se trató con neuraminidasa (enriquecida con SNA + Neuraminidasa) . (A) Contenido de ácido siálico en preparaciones de anticuerpo se determinó mediante manchado con lectina con SNA. (B) La actividad de anticuerpo in vivo se ensayó monitoreando el agotamiento de las plaquetas inducido por la inyección de 4 ^ig de las preparaciones de anticuerpos respectivas (n=4-5 ratones por grupo) .

La Figura 4 demuestra que la actividad antiinflamatoria de IVIG requiere ácido siálico. (A) Calificaciones clínicas de la artritis inducida por suero de K/BxN en ratones tratados con PBS, IVIG e IVIG tratada con PNGasaF (PNGasaF IVIG) . (B) Además del tratamiento que se muestra en la Figura 4 (A) , se trató a los ratones con IVIG tratada con neuraminidasa (NA IVIG) o IVIG enriquecida con SNA (SNA IVIG) . (C) Calificaciones clínicas de ratones tratados con fragmento Fe de IVIG, Fe tratado con neuraminidasa (NA Fe), o Fe enriquecido con SNA (SNA Fe) (N=4 , promedio +/- SEM) . (D) Se muestran perfiles de carbohidratos de preparaciones de IVIG. Perfiles de NALDI -TOF-MS de N-glican derivados de IVIG no tratada o tratada con neuraminidasa. Los picos que contienen residuos de ácido siálico están indicados por paréntesis y la composición de carbohidrato de los picos se presenta en la Figura 5. (E) Manchado con hematoxilina/eosina representativa de articulaciones de tobillo de ratones control o artritis inducida por K/N tratados con o sin IVIG enriquecida con SNA (0,1 g/kg) . La infiltración de neutrófilos amplia observada en ratones tratados con K/N está ausente de ratones tratados con IVIG-SNA (0,1 g/kg) . (F) Manchado con lectina de fragmento de Fe control de IVIG, Fe tratado con neuraminidasa (NA Fe) y Fe con alto contenido de ácido siálico a través de cromatografía de afinidad con aglutinina Sambucus nigra (SNA) (SNA Fe) . (G) Análisis de residuos de ácido siálico unidos a 2,3 y 2,6 en IVIG. IVIG se dejó sin tratar (carril 2) o se trató con una neuraminidasa específica para los residuos de ácido siálico unidos a 2,3 (carril 3) o una neuraminidasa específica para residuos de ácido siálico unidos a 2,3 y 2,6 (carril 4) . La eliminación del ácido siálico se ensayó mediante el manchado con lectina con SNA (que reconoce residuos de ácido siálico unidos a 2,6) y MAL- I (que reconoce residuos de ácido siálico unidos a 2,3) . Como control para una glicoproteína rica en residuos de ácido siálico unido a 2,3 se usó fetuina (carril 1) . El gel manchado con Coomassie sirvió como control de carga (Coomassie) . (H) Actividad antiinflamatoria de IVIG agotada en residuos de ácido siálico unido a 2,3 o 2,3 y 2,6. Se inyectó a los ratones con suero KRN para inducir la artritis y se los dejó sin tratar (KRN) , se los trató con IVIG (KRN + IVIG) , IVIG agotada en residuos de ácido siálico unidos a 2,3 (a2-3 sialidasa tx IVIG + KRN) , o IVIG agotada en residuos de ácido siálico unidos a 2,3 y 2,6 (oc2-,6 sialidasa tx IVIG + KRN) . Como control negativo se inyectó a los ratones con PBS (sin tratar) .

La Figura 5 ilustra la composición de los grupos carbohidrato liberados dede N297 IgG Fe. La estructura de azúcar del núcleo unida al residuo de asparagina 297 en la cadena pesada del anticuerpo está compuesta por N-acetilglicosamina (GlcNac) y mañosa (Man) . La glicoformas individuales varían con respecto a la unión de uno o dos residuos de galactosa de extremo (Gal) , la unión del residuo de ácido siálico de extremo (ácido N-acetilneuramínico o Neu5Ac para humanos y ácido N-gl icol ilneuramínico o Neu5Gc para ratón) y/o la unión de GlcNAc o fucosa (Fue) de bisección. Los números indican el peso molecular de las diferentes composiciones de azúcar determinadas por NALDI-TOF MS . La masa para las estructuras de glican están indicadas para humano y ratón (subrayado) .

La Figura 6 ilustra la semivida de suero y la integridad de proteína de IVIG des-sialilada . (A) El nivel de IgG humana en el suero de ratones tratados con IVIG en los días indicados se midió mediante ELISA (N = 4, media +/- SE ) . No hubo ninguna diferencia significativa en la semivida de IVIG e IVIG des - sial ilada . La importancia se determinó mediante el ensayo ANOVA de medida repetida. (B) Se resolvieron diez microgramos de IVIG o IVIG des-sialilado mediante SDE-PAGE un 8% de gel de pol iacrilamida en condiciones no reducidas y se visualizaron con manchado azul brillante de coomassie. La composición monomérica y la integridad estructural de IVIG no estuvieron afectadas por el tratamiento con neuraminidasa .

La Figura 7 demuestra la semivida de suero y la composición de la subclase de IVIG enriquecido con SNA. (A) El nivel de IgG humana en el suero de ratones tratados con IVIG en los días indicados se midió mediante ELISA (N = 4, promedio +/- SEM) . No hubo ninguna diferencia significativa en la semivida de IVIG y la fracción de IVIG enriquecida con SNA. La importancia se determinó mediante el ensayo ANOVA de medida repetida. (B) Subclases de IgG en IVIG sin tratar y enriquecida con SNA se determinaron mediante ELISA. No se observó ninguna diferencia.

La Figura 8 ilustra que las proteínas sialiladas con estructuras de carbohidratos similares no protegen a los ratones de la artritis inducida por suero de K/BxN. Se administraron cantidades de equivalente molar (6,7 µp??? por kilogramo) o un igual peso (1 g por kilogramo) de IVIG o sialo-proteínas fetuina y transferrina 1 hora antes de la inyección de suero de /Bx y las calificaciones clínicas se examinaron el día 4 (N = 4, promedio +/- SEM) . Se usó PBS como control adicional. Comparada con IgG, fetuina o transferrina no tuvieron ninguna actividad antiinflamatoria estadísticamente significativa a concentraciones molares equivalentes. La importancia se calculó con el ensayo U de Mann-Whitney , La Figura 9 demuestra que la actividad antiinflamatoria de IVIG enriquecida con SNA requiere FcyRIIB. (A) IVIG no fraccionada (1 g/kg de peso del ratón), IVIG enriquecida con SNA (0,1 g/kg de peso del ratón) , PBS como control se inyectaron en ratones con deficiencia de FcyRIIB 1 hora antes de la inyección de suero de K/BxN, y las calificaciones clínicas se ensayaron el día 4 (N= 4, promedio +/- SEM) . No se observó ninguna diferencia significativa en las calificaciones clínicas de artritis. La importancia se calculó con el ensayo U de Mann-Whitney. (B) Acumulación in vivo de monocitos de FcyRIIB+ por IVIG enriquecida con SNA. Se inyectaron ratones de tipo silvestre con 1 g/kg, 0,1 g/kg IVIG o 0,1 g/kg de IVIG enriquecida con SNA, o PBS como control. Se extrajeron células de médula ósea (panel izquierdo) y de bazo (panel derecho) y se analizaron mediante citometría de flujo 1 día después de la inyección (N = 4) . Las células de F4/80+ FcyRIIB+ se acumularon significativamente después del tratamiento con 1 g/kgDE IVIG o 0,1 g/kg de IVIG tratada con SNA. La importancia se calculó con el ensayo t de Student .

La Figura 10 demuestra que la inmunización activa deriva en la sialilación de IgG reducida. (A) IgG de suero de ratones no tratados (preinmune) o ratones con nefritis nefrotíxica (NTN) inducida por inmunización con IgG de oveja y suero nefrotóxico (NTS) se caracteró para el contenido de ácido siálico manchando con aglutinina de Sambucus nigra (SNA) (véanse los métodos) . (B) Cuantificación del nivel de sialilación de IgG de suero total y anticuerpos IgM y anticuerpos de IgG específicos de IgG en ratones sin tratar y con NTN (promedio +/- SEM) determinado mediante densitometría . No estuvo presente ningún IgG de oveja detectable en las preparaciones de anticuerpos de ratón (datos no mostrados) . (C) Análisis NALDI-TOF de residuos de azúcar unidos a anticuerpos de IgG de ratones sin tratar o con NTN. Los grupos que contienen ácido siálico se indican con un paréntesis. La composición detallada de los carbohidratos de los picos individuales se muestra en la Figura 5. (D) Detección del contenido de ácido siálico en anticuerpos depositados en los glomérulos de ratones inyectados con suero nefrotóxico con (NTS+CFA) o sin (NTS sola) preinmunización con IgG de oveja en coadyuvante de Freund completo (CFA) .

Descripción Detallada de la Invención Los inventores han descubierto sorpresivamente que la respuesta citotóxica y antiinflamatoria del dominio de Fe de IgG deriva de la sialilacion diferencial del polisacárido de núcleo unido a Fe. La citotoxicidad de los anticuerpos de IgG se reduce después de la sialilacion; a la inversa, la actividad antiinflamatoria de IVIG aumenta. Se muestra que la sialilacion es regulada después de la inducción de una respuesta inmune específica del antígeno, proporcionando por lo tanto un medio novedoso de IgG cambiante de una molécula antiinflamatoria innata en el estado estacionario, a una especie proinflamatoria adaptiva después del desafío antigénico .

Por consiguiente, la presente invención proporciona una estrategia ventajosa de crear y seleccionar IgG con potencial citotóxico y antiinflamatorio deseado.

Definiciones En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es aquella del índice de EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed . , Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md (1991), que se incorpora expresamente en la presente como referencia. El "índice de EU como en Kabat" se refiere a la numeración de los residuos del anticuerpo de EU de IgGl humana.

El término "nativo" o "parental" se refiere a un polipéptido no modificado que comprende una secuencia de aminoácidos de Fe. El polipéptido parental puede comprender una región de Fe de secuencia nativa o una región de Fe con modificaciones de la secuencia de aminoácido preexistentes (tales como agregados, eliminaciones y/o sustituciones) .

El término "polipéptido" se refiere a todo fragmento de una proteína que contiene por lo menos una región de Fe de IgG, que incluye, en forma no taxativa, proteínas totalmente funcionales, tales como, por ejemplo, anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos de IgG.

El término "región de Fe" se usa para definir una región de extremo de C de una cadena pesada de inmunoglobul ina . La "región de Fe" puede ser una región de Fe de secuencia nativa o una región de Fe variante. Aunque los límites de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobul ina puede variar, la región de Fe de cadena pesada de IgG humana habitualmente se define para el estiramiento desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, al extremo de carboxilo en sí.

El "dominio de CH2" de una región de Fe de IgG humana (también denominado dominio "Cy2") habitualmente se extiende desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 340. El dominio de CH2 es único en que no se aparea estrechamente con otro dominio. En cambio, dos cadenas de carbohidrato ramificadas unidas a N se interponen entre los dos dominios de CH2 de una molécula de IgG intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el par de dominio-dominio y contribuir a estabilizar el dominio de CH2 (Burton, Mol Immunol, 22, 161-206 (1985) , que se incorpora en la presente como referencia) .

El "dominio de CH2" comprende el estiramiento del extremo de C de los residuos a un dominio de CH2 en una región de Fe (es decir, desde el residuo de aminoácido 341 al residuo de aminoácido 447 de un IgG) .

El término "región de bisagra" generalmente se define como el estiramiento desde Glu216 a Pro230 de IgGl humana (Burton (1985) . Las regiones de bisagra de otros isotipos de IgG se pueden alinear con la secuencia de IgGl colocando el primero y el último residuos de cisteína que forman los enlaces de S—S de cadena inter-pesada en las mismas posiciones.

El término "dominio de unión" se refiere a la región de un polipéptido que se une a la otra molécula. En el caso de un FcR, el dominio de unión puede comprender una parte de una cadena de polipéptido de él (por ejemplo, la cadena a de él) que es responsable de la unión de una región de Fe. Un ejemplo de dominio de unión es el dominio extracelular de una cadena de FcR.

Una "región de Fe funcional" posee por lo menos una "función efectora" parcial de una región de Fe de secuencia nativa. Ejemplos de "funciones efectoras" incluyen unión a Clq; citotoxicidad que depende del complemento; unión de receptor de Fe ; citotoxicidad mediada por células que depende del anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR) , etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región de Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se puede evaluar usando diferentes ensayos revelados en la presente, por ejemplo.

Una "región de Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácido idéntica a la secuencia de aminoácido de una región de Fe hallada en la naturaleza. Una "región de Fe de variante" como lo apreciará un experto en el arte comprende una secuencia de aminoácido que difiere de aquella de una región de Fe de secuencia nativa en virtud de por lo menos una "modificación del aminoácido". Preferentemente, la región de Fe de variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido comparada con una región de Fe de secuencia nativa o con la región de Fe de un polipéptido parental, por ejemplo de una a diez sustituciones de aminoácido y preferentemente de uno a cinto sustituciones de aminoácido en una región de Fe de secuencia nativa o en una región de Fe del polipéptido parental. La región de Fe de variante de la presente preferentemente posee por lo menos un 80% de homología con una región de Fe de secuencia nativa y/o con una región de Fe de un polipéptido parental y más preferentemente por lo menos un 90% de homología con ella, más preferentemente por lo menos un 95% de homología con ella, aún más preferentemente por lo menos un 99% de homología con ella.

El término "gl icosilación alterada" se refiere a un polipéptido, definido anteriormente, sea nativo o modificado, en el cual el agregado de carbohidrato a la región constante de cadena pesada se manipula para aumentar o disminuir componentes de azúcar específicos. Por ejemplo, los polipéptidos , tales como por ejemplo, anticuerpos, preparados en líneas de células específicas, tales como por ejemplo, Lec2 o Lec3 , pueden ser deficientes en el tratamiento de grupos azúcar tales como fucosa y ácido siálico.

Los términos "receptor de Fe" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región de Fe de un anticuerpo. En una realización de la invención, FcR es un FcR humano de secuencia nativa. En otra realización, FcR, que incluye FcR humano, se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases de FcyRI , FcyRII, FcyRIII, que incluyen variantes alélicas y alternativamente formas empalmadas de estos receptores-. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de ellos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión en Daron, Annu Rev Immunol., 15, 203-234 (1987) ; FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, Annu Rev Immunol, 9, 457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods , 4, 25-34 (1994); y de Haas et al, J Lab Clin Med, 124, 330-41 (1995), Nimmerjahn y Ravetch 2006, Ravetch Fe Receptors in Fundamental Immunology, ed . William Paul 5th ed. cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia) .

"Citotoxicidad mediada por células que dependen del anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células in vitro o in vivo en la cual las células citotóxicas que expresan FcRs (por ejemplo, células monocíticas tales como células asesinas naturales (NK) y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido sobre una célula blanco y posteriormente producen la lisis de la célula blanco. En principio, cualquier célula efectora con un FcyR activador se puede disparar para mediar ADCC. Una de tales células, la célula NK expresa solamente FcyRIII, mientras que los monocitos que dependen de su estado de activación, localización o diferenciación, puede expresar FcyRI , FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas se resume en Ravetch y Bolland, Annu Rev Immunol , (2001), que se incorpora en la presente como referencia.

"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y cumplen funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan por lo menos un tipo de un receptor de Fe activador, tal como, por ejemplo, FcyRIII y cumplen la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periféricas (PBMC) , células asesinas naturales (NK) , monocitos y neutrófilos, con FBMC y células NK son preferidas. Las células efectoras se puede aislar de una fuente nativa de ellas, por ejemplo de sangre o PBMC como se describe en la presente.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre los anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa) , anticuerpos pol iclonales , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecí fieos) y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada.

La frase "contenido de ácido siálico" de un anticuerpo se refiere tanto al número total de residuos de ácido siálico sobre una región de Fe de una cadena pesada de un anticuerpo como la relación de anticuerpos sialilados a los anticuerpos asialilados en una preparación de anticuerpos no purificados, a menos que la frase esté en un contexto que claramente sugiere que se desee otro significado.

"Fragmentos de anticuerpos" , como se define para el propósito de la presente invención, comprenden una parte de un anticuerpo intacto, que generalmente incluye la unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto o la región de Fe de un anticuerpo que retiene la capacidad de unión de FcR. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de una sola cadena; y anticuerpos multiespecí fieos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos preferentemente retienen por lo menos parte de la bisagra y optativamente la región de CHl de una cadena pesada de IgG. Más preferentemente, los fragmentos de anticuerpos retienen la región constante entera de una cadena pesada de IgG e incluyen una cadena liviana de IgG.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es . decir, los anticuerpos que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante sobre el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben usarse de acuerdo con la presente invención se pueden fabricar mediante el método de hibridoma descrito primero por Kohler y Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975), que se incorpora en la presente como referencia, o se puede fabricar mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense N° 4.816.567, que se incorpora en la presente como referencia) . Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fago usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352, 624-628 (1991) y Marks et al., J Mol Biol , 222, 581-597 (1991), por ejemplo, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.

En otras realizaciones de la invención, el polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe de IgG se puede fusionar con oros fragmentos de proteína, que incluyen, en forma no taxativa, proteínas enteras. Un experto en el arte apreciará indudablemente que muchas proteínas se pueden fusionar con el polipéptido de la presente invención, que incluyen, en forma no taxativa, otras inmunoglobul inas , especialmente, inmunoglobul inas que carecen de sus respectivas regiones de Fe. Alternativamente, otras proteínas biológicamente activas o fragmentos de ellas se pueden fusionar con el polipéptido de la presente invención, como se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense N° 6.660.842, que se incorpora en la presente como referencia. Esta realización es especialmente ventajosa para la administración de dichas proteínas biológicamente activas o fragmentos de ellas a células que expresan receptores de Fe. Además, se pueden usar diferentes marcadores, tales como, por ejemplo, el marcador GST o la proteína fluorescente verde, o GSP.

Los anticuerpos monoclonales de la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobul inas) en las cuales una proteína de la cadena pesada y/o liviana es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena (s) es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (véase la Patente Estadounidense N° 4.816.567; Morrison et al, Proc Nati Acad Sci USA, 81, 6851-6855 (1984); Neuberger et al, Nature, 312, 604-608 (1984); Takeda et al, Nature, 314, 452-454 (1985) ; Solicitud de Patente Internacional N° PCT/GB85/00392 , cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia) .

Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobul ina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobul inas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de la región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región de marco de Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se hallan en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos uno y normalmente dos, dominios variables, en donde la totalidad o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de la inmunoglobul ina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de los residuos de FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina . El anticuerpo humanizado optativamente también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobul ina (Fe) , normalmente aquella de una inmunoglobul ina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321, 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332, 323-329 (1988); Presta, Curr Op Struct Biol, 2, 593-596 (1992); Patente Estadounidense N° 5.223.529, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia.

Los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG incluyen aquellas en las cuales las sustituciones, agregados o eliminaciones de aminoácidos específicas se introducen en una secuencia parental a través del uso de técnicas de ADN recombinante para modificar los genes que codifican la región constante de cadena pesada. La introducción de estas modificaciones siguen técnicas bien establecidas de biología molecular, descritas en manuales tales como Molecular Cloning [Clonación Molecular] (Sambroook y Russel, (2001)) . Además, los polipéptidos con por lo menos una región de Fe incluyen aquellos polipéptidos que se han seleccionado para contener modificaciones de carbohidratos específicas, obtenidas mediante la expresión en líneas de células conocidas para su especificidad de glicosilación (Stanley P., et al, Glycobiology , 6, 695-9 (1996); eikert S., et al, Nature Biotechnology , 17, 1116-1121 (1999); Andresen DC y Krummen L., Current Opinión in Biotechnology, 13, 117-123 (2002)) o mediante enriquecimiento o agotamiento en lectinas específicas o mediante tratamiento enzimático (Hirabayashi et al, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 771, 67-87 (2002) ; Robertson y Kennedy, Bioseparation, 6, 1-15 (1996) ) . Se sabe en el arte que la calidad y el nivel de glicosilación del anticuerpo difieren según el tipo de célula y las condiciones de cultivo empleadas. (Por ejemplo, Patel et al, Biochem J, 285, 839-845 (1992)) han informado que el contenido de ácido siálico en cadenas laterales de azúcar unida al anticuerpo difiere significativamente si los anticuerpos se produjeron como ascitos o en medios de cultivo que contienen suero o libres de suero. Además, Kunkel et al, Biotechnol Prog, 16, 462-470 (2000) han mostrado que el uso de diferentes bioreactores para el crecimiento celular o la cantidad de oxígeno disuelto en el medio influyeron en la cantidad de galactosa y ácido siálico en los grupos azúcar unidos al anticuerpo. Estos estudios, sin embargo, no enfrentaron cómo influyen los niveles variables de los residuos de ácido siálico en la actividad de los anticuerpos in vivo .

Sistemas de Expresión Huésped El polipéptido de la presente invención se puede expresar en un sistema de expresión huésped, es decir, células huésped, capaces de gl icosilación unida a N. Normalmente, dichos sistemas de expresión huésped pueden comprender sistemas de expresión fúngicos, vegetales, vertebrados o invertebrados. En una realización, la célula huésped es una célula de mamífero, tal como una línea de células de ovarios de hámster chino (CHO) (por ejemplo, CHO-Kl; ATCC CCL-61), línea de células de Mono (COS) (por ejemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)) ; célula de ratón (por ejemplo, NS/0) , línea de células de pulmón de Hámster Bebe (BHK) (por ejemplo, ATCC CRL-1632 o ATCC CCL-10) , o célula humana (por ejemplo, HEK 293 (ATCC CRL-1573)), o cualquier otra línea de células adecuada, por ejemplo, disponible en depositarios públicos tales como la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense, Rockville, Md . Además, una línea de células de insectos, tal como una línea de células de Lepidópteros, por ejemplo, Sf9, una línea de células vegetales, una línea de células fúngicas, por ejemplo, levadura tal como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula spp . Un experto en el arte apreciará que en algunos casos se pueden requerir modificaciones de las células huésped para asegurar que la glicosilación unida a N y la maduración de glican ocurran para derivar en un azúcar biantenario, complejo como se halla normalmente en el dominio de Fe de IgG humana (véase por ejemplo Hamilton, SR, et al, Science, 313, 1441 (2006); Li, H et al, Nature Biotechnology 24, 210 (2006); ildt, S y Grengross, TU Nature Reviews Microbiology 3, 119 (2005) .

Formulaciones Terapéuticas Las formulaciones terapéuticas que comprenden los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG se pueden preparar para el almacenamiento mezclando los polipéptidos de la presente invención que tienen el nivel deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed . (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenilo, butilo o bencilo; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol ; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular (menos de 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobul inas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosao sorbitol; contra iones que forman sales tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína de Zn) ; y/o surfactantes no iónicos tales como T EEN®, PLURONIC® o politeilenglciol (PEG) .

Las formulaciones de la presente también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no afectan negativamente unos a otros. Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito deseado .

Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsula de poli (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Dichas técnicas se revelan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed. (1980) .

En realizaciones preferidas, las formulaciones que deben usarse para la administración in vivo son estériles. Las formulaciones de la presente invención se pueden esterilizar fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles .

También se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo modificado, cuyas matrices están en la forma de artículos con forma, por ejemplo, películas, o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil -metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliactidos (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense N° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradable tales como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de leuprolido) , y ácido poli-D- ( - ) -3 -hidroxibutírico . Si bien los polímeros tales como etileno-acetato de etilo y ácido láctico y ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 10 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo cual deriva en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la imunogenicidad . Se pueden prever estrategias racionales para la s estabilización según el mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación del enlace de S—S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr modificando residuos de sulfhidrilo, liofilizando desde soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

Creación de polipéptidos sialilados que contienen por lo menos una región de Fe de IgG Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar o modificar adicionalmente de manera tal que t.engan una mayor cantidad de ácido siálico comparados con anticuerpos no modificados y/o no purificados. Existen varios métodos para alcanzar este objetivo. En un método, la fuente de polipéptidos no purificados, tales como, por ejemplo, fracciones de plasma que contienen IgG desde las cuales se purifica habitualmente IVIG, se pasa a través de la columna que tiene lectina, que se sabe que une el ácido siálico. En una realización, la lectina se selecciona de Sambuccus nigra. Por lo tanto, una fracción sialilada de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG se retiene en la columna mientras que una fracción asialilada pasa a través de ella. La fracción asialilada de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG se pueden eluir con otro lavado con condiciones de astringencia diferentes. Por lo tanto, es posible obtener una preparación del polipéptido de la presente invención en donde el contenido de ácido siálico aumenta comparado con el contenido normal. Además, se puede emplear una reacción enzimática con una sialiltranferasa y un donante de ácido siálico como se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense N° 20060030521.

Ejemplos no taxativos adecuados de enzimas sialiltransferasa útiles en los métodos reivindicados son ST3Gal III, que también se denomina a- (2 , 3 ) sialiltransferasa (EC 2.4.99.6) y ot-(2 , 6) sialiltransferasa (EC 2.4.99.1) . Alfa- (2 , 3 ) sialiltransferasa cataliza la transferencia del ácido siálico a la Gal de Gal-ß-l,3GlcNAc o Gal -ß- 1 , 4GlcNAc glicósido (véase, por ejemplo, en et al, J. Biol . Chem. 267: 21011 (1992); Van den Eijnden et al, J. Bil. Chem. 256: 3159 (1991)) y es responsable de la sialilación de oligosacáridos unidos a asparagina en gl icopéptidos . El ácido siálico se une a una Gal con la formación de una ligadura a a entre los dos sacáridos . El enlace (ligadura) entre los sacáridos es entre la posición 2 de NeuAc y la posición 3 de Gal . Esta enzima particular se puede aislar del hígado de rata ( einstein et al, J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982)); el cADN humano (Sasaki et al (1993) J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269. 1394-1401) y secuencias de ADN genómico (Kitagawa et al (1996) J. Biol. Chem. 271: 931-938) son conocida, facilitando la producción de esta enzima mediante expresión recombinante .

La actividad de a- (2 , 6) sialiltransferasa deriva en oligosacéridos 6 -sial ilados , que incluyen galactosa 6-sialilada. El nombre "ot-(2 , 6) sialiltransferasa" se refiere a la familia de las sialiltransferasas que se unen al ácido siálico en el sexto átomo del polisacárido aceptor. Se pueden aislar forma diferentes de a-(2 , 6 ) sialiltransferasa de diferentes tejidos. Por ejemplo, una forma específica de esta enzima, ST6Gal II, se puede aislar de tejidos cerebral y fetal. Krzewinski -Recchi et al, Eur . J. Biochem. 270, 950 (2003) .

Además, una persona con conocimientos promedio en el arte apreciará que las condiciones del cultivo celular se pueden manipular para cambiar el índice de sialilación. Por ejemplo, para aumentar el contenido de ácido siálico, se reduce el índice de producción y la osmolaridad generalmente se mantiene dentro de un margen más bajo adecuado para la célula huésped particular que se está cultivando. La osmolaridad en la gama de 250 a mOsm a 450 mOsm es apropiada para el contenido aumentado de ácido siálico. Ésta y otras condiciones adecuadas del cultivo celular se describen, por ejemplo, en la Patente Estadounidense N° 6.656.466. Patel et al, Biochem. J. 285, 839-845 (1992) han informado que el contenido de ácido siálico en las cadenas laterales de azúcar unidas al anticuerpo difiere significativamente si los anticuerpos se produjeron como ascitos o en medios de cultivo libres de suero o que contienen suero. Además, Kunkel et al, Biotechnol . Prog . 16, 462-470 (2000) han mostrado que el uso de diferentes bioreactores para crecimiento celular y la cantidad de oxígeno disuelto en el medio influyó en la cantidad de galactosa y ácido siálico en los grupos azúcar unidos al anticuerpo.

En otra realización, células huésped, tales como, por ejemplo, células de retina de embrión humana inmortalizada, se pueden modificar introduciendo un ácido nucleico que codifica una sialiltransferasa tal como, por ejemplo, una cc-2,3-sialiltransferasa o una a-2 , 6-sialiltransferasa, operativamente unida a un promotor, tal como, por ejemplo, un promotor de CMV. La a-2 , 3 -) sialiltransferasa puede ser la a-2 , 3 -sialiltransferasa humana, denominada SIAT4C o ST2 (acceso GenBank número 123767) y descrita, por ejemplo, en la Patente Estadounidense N° 20050181359.

El ácido nucleico que codifica la sialiltransferasa se puede introducir en la célula huésped mediante cualquier método conocido para un experto en el arte. Los métodos adecuados para introducir secuencias de ácido nucleico exógenas también se describen en Sambrook y Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición), Cold Spring Harbor Press, Y, 2000. Estos métodos incluyen, en forma no taxativa, técnicas de transferencia física, tales como, por ejemplo, microinyección o electroporación ; transíecciones , tales como, por ejemplo, transíecciones de fosfato de calcio; transferencia por fusión de membrana, usando, por ejemplo, liposomas; y transferencia viral, tal como, por ejemplo, la transferencia usando ADN o vectores retrovirales .

El polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe de IgG se puede recuperar desde el sobrenadante de cultivo y se puede someter a uno o más pasos de purificación, tales como, por ejemplo, intercambio de iones o cromatografía de afinidad, si se desea. Los métodos adecuados de purificación serán evidentes para un experto en el arte.

Un experto en el arte apreciará que diferentes combinaciones de métodos de sialilación, reveladas anteriormente, pueden derivar en la producción de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG con un nivel muy alto de sialilación. Por ejemplo, se puede expresar el polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe de IgG en las células huésped que sobreexpresan sialiltransferasa, como se describió anteriormente, y luego enriquecer adicionalmente la fracción sialilada de estos polipéptidos, por ejemplo, sialilando estos polipéptidos en una reacción enzimática seguida por una cromatografía de afinidad usando columnas que contienen lectina. En forma similar, se puede usar una reacción enzimática seguida por una cromatografía de afinidad para la fuente de IVIG de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG.

Para examinar la magnitud de gl icosilacion sobre los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe de IgG, estos polipéptidos se pueden purificar y analizar en SDS-PAGE en condiciones de reducción. La gl icosilacion se puede determinar haciendo reaccionar los polipéptidos aislados con lectinas específicas, o, alternativamente como lo apreciaría un experto en el arte, se puede usar HPLC seguida por espectrometría de masa para identificar las glicoformas (Wormald, MR et al, Biochem 36 : 1370 (1997) .

Para describir la presente invención más detalladamente, se dan a continuación varios ejemplos ilustrativos no taxativos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. IVIG CON CONTENIDO DE ÁCIDO SIÁLICO AUMENTADO PRESENTA CITOTOXICIDAD REDUCIDA Para determinar si las glicoformas específicas de IgG están involucradas en la modulación de funciones efectoras de anticuerpos se exploró la función específica, carbohidratos unidos a Asn297 en la mediación de la citotoxicidad de anticuerpos monoclonales de IgG definidos. Los anticuerpos anti -plaquetas , derivados del hibridoma GAS, expresado como una variante de cambio de IgGl, 2a o 2b en células 293 como se describió previamente en Nimmerjahn et al, Immunity 23, 41 (2005) se analizaron mediante espectrometría de masa para determinar su composición y estructura de carbohidrato específica (Figura 1) . Estos anticuerpos contienen residuos de ácido siálico mínimos. El enriquecimiento de la especie que contiene ácido siálico por cromatografía de afinidad de lectina de Sambuccus nigra dio anticuerpos enriquecidos 60-80 veces en el contenido de ácido siálico (Figura 2B y Figura 3) . La comparación de la capacidad de los anticuerpos 6A6-IgGl y 2b sialilados y asialilados de mediar el aclaramiento de plaquetas reveló una correlación inversa entre la sialilación y la actividad in vivo. La sialilación de los anticuerpos 6A6 IgG derivó en una reducción del 40%-80% en la actividad biológica (Figura 2C y Figura 3) .

Para determinar el mecanismo de esta reducción en la resonancia de plasmon de actividad superficial la unión se realizó en estos anticuerpos para cada uno de los FcYR y con su antígeno análogo.

El análisis de resonancia de plasmón de superficie se realizó como se describe en Nimmerjahn y Ravetch, Science 310, 1510 (2005) . En resumen, variantes de anticuerpo 6A6 que contienen altos o bajo niveles de residuos de ácido siálico en sus cadenas laterales de azúcar se inmovilizaron en la superficie de chips de sensores C 5. Se inyectaron receptores de Fcy a diferentes concentraciones a través de células de flujo a temperatura ambiente en tampón de HBS-EP (10 mM Hepes, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, y 0,005% surfactante P20) a una velocidad de flujo de 30 ul/minuto. Los receptores Fe solubles se inyectaron durante 3 minutos y la disociación de moléculas unidas se observó durante 7 minutos. La unión de fondo a las células de flujo control se restó automáticamente. Los experimentos control se realizaron para excluir limitaciones de transporte de masa. Se obtuvieron constantes de afinidad de los datos del sensograma usando el ajuste simultáneo a las fases de asociación y disociación y el ajuste global a todas las curvas en el grupo. Un modelo de unión de Lanmuir se ajustó estrechamente a los datos del sensograma observados y se usó en todos los experimentos .

Se observó una reducción de 5-10 veces en la afinidad de unión para las formas sialiladas de estos anticuerpos a sus respectivos FcyR activadores comparados con sus similares asialilados, mientras que no se observó ninguna diferencia en la afinidad de unión para el antígeno (Figura 2D) . Por lo tanto, la sialilación de la estructura de glican unida a ASN297 de IgG derivó en afinidades de unión reducidas para los FcyR de activación restringida por la subclase y por lo tanto redujo su citotoxicidad in vivo.

Para determinar la generalidad de la observación de que la sialilación del glican unido a N de IgG estuvo involucrada en la modulación de su actividad inflamatoria in vivo, luego examinamos la función de los glican unidos a N sobre la actividad antiinflamatoria de IVIG. Esta fracción de IgG purificada obtenida del suero mezclado de 5-10.000 donantes, cuando se administra por vía intravenosa a dosis altas (1-2 g/kg) , es una terapéutica ampliamente usada para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Dwyer, N. Engl . J. Med . 326, 107 (1992) . Esta actividad antiinflamatoria es una propiedad del fragmento de Fe y es protectora en modelos murinos de ITP, RA y nefritis nefrotóxica. Imbach et al, Lancet 3, 1228 (1981), Samuelsson et al, Science 291, 484 (2001), Bruhna et al, Immunity 18, 573 (2003), Kaneko et al, J. Exp . Med. 203, 789 (2006) .

Se propuso un mecanismo común para esta actividad antiinflamatoria que comprende la inducción de la expresión superficial de la molécula de FcyRIIB en macrófagos efectores, terapia que eleva el umbral necesario para anticuerpos de IgG citotóxicos o complejos inmunes para inducir las respuestas de células efectoras mediante el disparo de FcyR de activación. Nimmerjahn y Ravetch, Immunity 24, 19 (2006) .

EJEMPLO 2. DES-SIALILACIÓN DE IVIG REDUCE EL EFECTO ANTIINFLAMATORIO DE IVIG EN MODELO DE ARTRITIS DE RATÓN Ratones Se compraron ratones C5TBL/6 y NOD de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Se generaron ratones FcyRIIB~/_ en el laboratorio de los inventores y se cruzaron nuevamente para 12 generaciones al fondo C57BL/6. Los ratones transgénicos KRN TCR sobre un fondo C57BL/6 (K/B) fueron donaciones de D. Mathis y C. Benoist (Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA) y se alimentó a los ratones NOD para generar ratones K/BxN. Se usaron ratones hembra de 8-10 semanas para todos los experimentos y se los mantuvo en las instalaciones de la Universidad Rockefeller. Todos los experimentos se hicieron cumpliendo con las leyes federales y las pautas institucionales y han sido aprobados por la Universidad Rockefeller (Nueva York, NY) .

Anticuerpos y receptores de Fe solubles Las variantes de cambio de anticuerpo 6A6 se produjeron mediante la transfección transitoria de células 293T seguida por la purificación a través de la proteína G descrita en Nimmerjahn et al, Immunity 23, 41 (2005) y Nimmerjahn y Ravethc, Science 310, 1510 (2005) . Las variantes de anticuerpos ricas en ácido siálico se aislaron de estas preparaciones de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad de lectina con agarosa de aglutinina Sambucus nigra (SNA) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) . El enriquecimiento para el contenido de ácido siálico se verificó mediante manchado con lectina (véase a continuación) . La inmunoglobul ina intravenosa humana (IVIG, 5% en 10% maltosa, purificada por cromatografía) se compró a Octapharma (Hemdon, VA) . La digestión de IVIG humana se realizó como se describe. Kaneko Y et al, Exp . Med 203, 789 (2006) . En resumen, IVIG fue digerida por 0,5 mg/ml de papaína durante 1 hora a 37°C y se detuvo agregando 2,5 mg/ml de yodoasetamida . Los fragmentos resultantes Fab y Fe se separaron de la IVIG no digerida sobre una columna HiPrep 26/60 S-200R (GE Healthcare, Piscataway, NJ) , seguida por la purificación de los fragmentos Fe y Fab con una columna de Proteína G (GE Healthcare) y uan columna de Proteína L (Pierce, Rockford, IL) . Se verificó la pureza de los fragmentos mediante inmunomanchado usando anticuerpos específicos de Fe y Fab de IgG anti-humana. (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) . Se juzgó que la pureza fue superior al 99%. El anticuerpo F4/80 era de Serotec (Oxford, Reino Unido) . El anticuerpo Ly 17.2 era de Caltag (Burlingame, CA) . El antisuero de membrana de base anti -glomerular de oveja (GBN) (suero nefrotóxico, NTS) fue una donación de M.P. Madaio (Universidad de Pennsylvania , Philadelphia , PA) . Los receptores Fe solubles que contienen marcador de hexa-histidina de extremo de C se generaron mediante transfección transitoria de células 293T y se purificaron desde sobrenadantes de cultivo de células con agarosa Ni-NTA como lo sugirió el fabricante (Qiagen) .

IVIG se trató con neuraminidasa y la composición y la estructura de la preparación resultante se analizaron mediante espectroscopia de masa. No quedaron glican que contienen ácido siálico detectables después del tratamiento con neuraminidasa (Figura 4D, F y 5) . Estas preparaciones de IgG luego se ensayaron por su capacidad de proteger a los ratones de la inflamación de las articulaciones inducida por la transferencia pasiva del suero de KxN, un modelo de enfermedad inflamatoria mediada por complejo inmune de IgG 1. La des-sialilación con neuraminidasa anuló el efecto protector de la preparación de IVIG en el modelo de artritis inducida por suero de KxN (Figuras 4B, C, E) . Esta pérdida de actividad no fue el resultado de la semivida de suero reducida de las preparaciones de IgG asialilada (Figura 6A) o el resultado de cambios en la composición monomérica o integridad estructural de la IgG (Figura 6B) . La eliminación de todos los glican con PNGasa tuvo un efecto similar y anuló el efecto protector de IVIG in vivo (Figura 4A) . La eliminación selectiva de ligaduras de ácido 2,6 siálico anuló la actividad de IVIG, mientras que la eliminación de las ligaduras 2,3 no tuvieron ningún efecto aparente. (Figuras 4G, N) .

EJEMPLO 3. FRACCIÓN DE IVIG CON CONTENIDO DE ÁCIDO SIÁLICO ENRIQUECIDO REDUCE INFLAMACIÓN EN MODELO DE ARTRITIS DE RATÓN Preparación de IVIG con un contenido aumentado de ácido siálico Dado que el ácido siálico pareció ser requerido para la actividad antiinflamatoria de IVIG, la base para el requerimiento de dosis alta (1 g/kg) para esta actividad antiinflamatoria puede ser la concentración limitante de IgG sialilada en la preparación total de IVIG. La IVIG se fraccionó sobre una columna de afinidad de SNA-lectina para obtener moléculas de IgG enriquecidas para estructuras de glican modificadas con ácido siálico.

Estas fracciones enriquecidas con ácido siálico se ensyaron por los efectos protectores en el modelo de artritis de transferencia de suero de KxN comparadas con IVIG no fraccionada. Se observó un aumento de 10 veces en la protección para la fracción de unión a SNA, de manera tal que la protección equivalente se obtuvo a 0,1 g/kg de IVIG enriquecida con SNA comparada con 1 g/kg de IVIG no fraccionada (Figura 4B, C) . La semivida de suero y la distribución de subclase de IgG de la fracción enriquecida con SNA fue equivalente a aquella de IVIG no fraccionada (Figura 7A,B) . El efecto de la sialilación fue específico para IgG; las glicoproteínas unidas a N sialiladas tales como fetuina o trasnferrina con estructuras de carbohidrato complejo biantenario similares no tuvieron ninguna actividad antiinflamatoria signficativa estadísticamene a concentraciones molares equivalentes de IgG (Figura 8) . Finalmente, el mecanismo de protección de la preparación de IVIG sialilada fue similar a la IVIG no fraccionada en que dependió de la expresión de FcyRIIB y derivó en la expresión aumentada de este receptor inhibitorio sobre los macrófagos efectores (Figura 9) .

EJEMPLO 4. LA RESPUESTA A TIINFLAMATORIA AUMENTADA DE IVIG CON CONTENIDO DE ÁCIDO SIÁLICO AUMENTADO ES MEDIADA POR SIALILACIÓN DEL GLICAN UNIDO A N SOBRE EL DOMINIO DE FC Dado que la IgG policlonal en IVIG también ede contener glican unidos a O y N sobre las cadenas livianas o >s dominios vriables de cadena pesada que pueden sialilarse, confirmamos que el aumento en la actividad antiinflamatoria de la preparación de IgG enriquecida con SNA derivó de la sialilación aumentada del sitio de glicosilación unido a N en el Fe. Los fragmentos de Fe se generaron a partir de IVIG no fraccionada y fraccionada con SNA y se ensayaron por su actividad in vivo. Como se observó para la IgG intacta, los fragmentos de Fe purificados con SNA mejoraron su efecto protector in vivo comparados con los fragmentos de Fe generados desde IVIG no fraccionada (Figura 4C) . En cambio, los fragmentos Fab no presentaron ninguna actividad antiinflamatoria en este ensayo in vivo. Por lo tanto, el requerimiento de dosis alta para la actividad antiinflamatoria de IVIG se puede atribuir a los aportes minoritarios de IgG sialilada presente en la preparación total. El enriquecimiento de estas fracciones mediante cromatografía de lectina de unión a ácido siálico en consecuencia aumentó la actividad antiinflamatoria.

Estos resultados usando inmunización pasiva de anticuerpos IgG indicaron que la capacidad de IgG de cambiar de una especie proinflamatoria a una especie antiinflamatoria está influida por el nivel de sialilación del glican unido a N sobre el dominio de Fe .

EJEMPLO 5. AUMENTO DE ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA, MEDIADA POR SIALILACIÓN DE IgG, OCURRE DURANTE UNA RESPUESTA INMUNE ACTIVA Modelo Murino para Enfermedad de Goodpasture En este modelo, primero se sensibiliza a los ratones con IgG de oveja junto con coadyuvante y cuatro días después se les inyecta una preparación de membrana de base glomerular anti-raón de oveja (suero nefrotóxico, NTS) . En resumen, se preinmunizó a los ratones vía intraperitoneal con 200 µg de IgG de oveja (Serotec) en CFA, seguido por la inyección intravenosa de 2,5 µ? de suero NTS por gramo de peso corporal cuatro días después. Se extrajo sangre decuatro ratones control no tratados cuatro días después de la inyección de anti-suero anti-GBN, y el suerpo de IgG se purificó con Proteína G (GE Healthcare, Princeton, NJ) y columna de IgG de safarosa, generada acoplando en forma covalente IgG de oveja sobre una columna de sefarosa activada por NBS (GE Healthcare, Princeton, NJ) , cromatografía de afinidad.

La sensibilización previa seguida por el tratamiento con NTS induce anticuerpos de IgG anti -oveja de IgG2b de ratón (inmunizados con NTN) . Kaneko Y. et al, Exp . Med., 203:789 (2006) . Se depositan anticuerpos de IgG2b de ratón en el glomérulo junto con los anticuerpos de NTS y derivan en una respuesta inflamatoria aguda y fulminante mediante la activación mediada por IgG2b de FcyRIV en macrófagos de infiltración. En la ausencia de sensibilización previa no se observa inflamación, indicando que los anticuerpos de IgG anti -oveja de IgG2b de ratón son los mediadores de la respuesta inflamatoria.

Para determinar si la inmunización activa que deriva en la IgG pro- inflamatoria está asociada con un cambio en la sialilación, IgG e IgN de suero de ratones preinmunes e inmunizados con NTS se caracterizaron para el contenido de ácido siálico mediante la unión a SNA lectina (Figura 10A,B,C) . La sialilación de IgG total se redujo en promedio un 40% en ratones inmunizados comparados con los controles no inmunizados. El efecto fue específico para IgG; la sialilación de Ig fue equivalente a la inmunización previa y posterior. Esta diferencia en la sialilación fue más pronunciada cuando se analizó la fracción de IgG específica de oveja de suero de ratón, lo cual muestra una reducción del 50%-60% en la sialilación comparada con la IgG preinmune (Figura 10B) .

Estos resultados se confirmaron con el análisis NALDI -TOF-MS . El análisis de la composición de los monosacáridos fue realizado por UCSD Glycotechnology Core Resource (San Diego, CA) . Se desnaturalizaron muestras de gl icoproteína con SDS y 2-mercaptoetanol y se digirieron con PNGasa F. Los N-glican mezclados liberados se purificaron mediante HPLC de fase invertida y extracción de fase sólida y luego los grupos hidroxilo expuestos de los N-glican se metilaron. Los sacáridos derivados resultantes se purificaron nuevamente mediante HPLC de fase invertida y se sometieron a NALDI -TOF-MS .

El análisis de las IgG antes y después de la inmunización confirmó que los cambios en la estructura de los N-glican fueron específicos para los grupos ácido siálico de extremo (Figura 10C) . Los anticuerpos anti-oveja de IgG2b de ratón que se depositaron en los glomérulos, que previamente se mostró que son responsables de la unión del portador de FcyRIV, los macrófagos de infiltración presentaron un contenido de ácido siálico reducido comparados con los controles preinmunizados (Figura 10D) .

Todas las patentes y publicaciones que no son patentes citadas en esta invención se incorporan en la presente en su extensión como si cada una de esas patentes y publicaciones que no son patentes se incorporara en la presente en su totalidad. Además, aún cuando la invención de la presente se ha descrito con referencia a ejemplos y realizaciones particulares, se debe entender que estos ejemplos y realizaciones son simplemente ilustrativos de los principios y aplicaciones de la presente invención. En consecuencia se debe entender que se pueden hacer numerosas modificaciones en las realizaciones ilustrativas y que se pueden prever otros arreglos sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención definida en las siguientes reivindicaciones.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe de IgG, dicho polipéptido que tiene una mayor actividad antiinflamatoria y una menor actividad citotóxica comparada con c un anticuerpo no purificado.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una región de Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 , dicho polipéptido tiene un contenido de ácido siálico más alto comparado con un anticuerpo no purificado.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que tiene una actividad antiinflamtoria aumentada in vitro.

4. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaiones 1-3, que tiene una actividad antiinflamatoria aumentada in vivo.

5. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, derivado de una fuente de anticuerpos natural .

6. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, derivado de una fuente de anticuerpos recombinante .

7. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que tiene el mayor porcentaje de contenido de ácido siálico comparado con el anticuerpo no modificado, en donde el anticuerpo no modificado comprende IVIG.

8. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, derivado de una línea de células que tiene una actividad de sialilacion de proteína mejorada.

9. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, modificado por el tratamiento con sialiltransferasa .

10. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que está purificado.

11. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en combinación con un portador o diluyente adecuado.

12. Un método de preparación de un polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe, dicho polipéptido tiene una mayor actividad antiinflamatoria y una menor citotoxicidad que un anticuerpo no purificado, dicho método comprende: Proporcionar una fuente no purificada del polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe, dicha fuente no purificada del polipéptido contiene por lo menos una región de Fe que comprende por lo menos una región de Fe que tiene ácido siálico y una pluralidad de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe que carece de ácido siálico; y Incorporar la relación de la pluralidad de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe que tienen ácido siálico a la pluralidad del polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe que carece de ácido siálico.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha fuente no purificada del polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe comprende un anticuerpo de IgG no purificado humano .

14. El método de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde la fuente no purificada del polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe se proporciona desde la expresión de un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico en un sistema de expresión , en donde dicha del ácido siálico se traduce en un anticuerpo de IgG.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el sistema de expresión comprende sistemas de expresión huésped modificados capaces de gl icosilación unida a N seleccionada del grupo formado por sistemas de expresión fúngica, vegetal, vertebrada e invertebrada, y cualquier combinación de ellas.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en donde el paso de aumentar la relación de la pluralidad de los polipéptido que contienen por lo menos una región de Fe que tiene un ácido siálico a la pluralidad de polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe que carece de ácido siálico se realiza a través de una eliminación de los polipéptidos que contienen por lo menso una región de Fe que carece de ácido siálico.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la eliminación se realiza mediante métodos físicos o químicos.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde dicha remoción se realiza mediante un método seleccionado del grupo formado por HPLC, cromatografía de afinidad de lectina, cromatografía de intercambio de aniones de alto pH, y cualquier combinación de ellas.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-18, en donde el paso de aumentar la relación de la pluralidad de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe que tiene ácido siálico a la pluralidad de los polipéptidos que contienen por lo menos una región de Fe que carece de ácido siálico se realiza a través de un enriquecimiento de dicha fuente no purificada del polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe .

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho enriquecimiento se realiza mediante seleccionado del grupo formado por HPLC, cromatografía de afinidad de lectina, cromatografía de intercambio de aniones de alto pH y cualquier combinación de ellas.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 19 o 20, en donde dicha sialilación se realiza mediante una reacción química con una enzima que el ácido siálico a un carbohidrato unido al polipéptido que contiene por lo menos una región de Fe.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde enzima es a- (2 , 6) sialiltransferasa .