CN102947333A

CN102947333A - 抗体组合物

Info

Publication number: CN102947333A
Application number: CN2011800296575A
Authority: CN
Inventors: F·卡瑟曼; S·梅斯舍尔
Original assignee: CSL Behring AG
Current assignee: CSL Behring AG
Priority date: 2010-05-07
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2013-02-27
Also published as: JP2013527850A; AU2011249832A1; WO2011138354A1; US20130058917A1; EP2566889A1

Abstract

本发明涉及可由血浆免疫球蛋白，尤其是血浆IgG的分级分离，由在西洋接骨木（Sambucus nigra）亲和性柱上亲和层析获得的抗体群，及其用途。

Description

抗体组合物

【技术领域】

【背景技术】

免疫球蛋白，也被称为抗体，是免疫系统的主要分泌产物。它们一般由各具有2个重链和2个轻链的基本结构单元形成而形成具有一个该单元的单体，具有2个单元的二聚体，具有5个单元的五聚体，或具有6个单元的六聚体。抗体在先天性免疫中起到显著作用。在针对病原体的天然的免疫应答中，在病原体和抗体之间形成复合物。这些免疫复合物活化广范围的效应子功能，由此导致病原体的杀死，移出和破坏。抗体也可与身体的自身抗原反应，其可导致自身免疫疾病，及贡献于慢性炎性症状。抗体可，例如通过在炎性级联中靶向及中和各种介质而具有抗-炎性活性。

有免疫球蛋白的5种主要同种型，其实施不同作用。IgG提供大多数针对侵袭病原体的基于抗体的免疫，且在以下更细讨论。IgM以膜结合形式及在溶液中发生。在溶液中，其一般形成五聚体，在结合抗原中提供高亲合力。其常常是在产生足够的特定IgG之前针对感染的第1，立即防御。IgA通常作为二聚体发生及见于粘膜区，例如肠，肺和泌尿生殖道。其保护这些表面免于由病原体定居。IgE主要涉及过敏性反应。其结合过敏原及引发组胺自肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放。IgD主要见于未暴露于抗原的B淋巴细胞表面。

在人中，根据它们的在正常血清中相对浓度定义及编号4种亚类的IgG：IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，其分别占血清IgG的大致60%，25%，10%和5%，各IgG亚类具有独特效应子功能。

一般而言，各个体单体免疫球蛋白单元，例如IgG分子，由2个同一轻链和2个同一重链组成，其进而包含大致110个氨基酸残基的重复结构基序。轻和重链的结构域以共价和非-共价关联配对，由此形成通过柔性的接头，所谓的铰链区连接的3个独立蛋白部分。这些部分之2个指称为Fab（抗原-结合片段）区，且是同一结构。各Fab区形成相同的特异性抗原-结合位点。第3部分是Fc（可结晶化的片段）区，其形成活化清除及运输机理的配体的相互作用位点。

IgG在疾病中起到重要作用。IgG1-型抗体是在癌免疫治疗中最通常使用的抗体，其中抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性（ADCC）常常被认为是重要的。此外，IgG已知通过由它们的Fc片段介导的相互作用介导促炎和抗炎活性。一方面，Fc和其相应受体之间的相互作用负责免疫复合物和细胞毒性抗体的促-炎性性质。另一方面，静脉内γ球蛋白（IVIG）和其Fc片段是抗-炎性的，及广泛使用以抑制炎性疾病。该矛盾的性质的精确的机理是不清楚的，但已建议IgG的糖基化对于调节IgG的细胞毒性和炎性潜力是关键的。

至今，对于由IgG介导的细胞毒性和炎性效应的调节中糖基化的作用的研究主要聚焦于Fc区。IgG的糖基化对于通过维持2个重链的开放构象结合全部FcyR是必要的。此FcyR结合对IgG糖基化的需求解释去-糖基化的IgG抗体不能介导体内引发的炎性应答，诸如抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性（ADCC），炎性介质的吞噬和释放。自身免疫状态和IgG抗体的特定糖基化模式之间的联系已在患类风湿性关节炎和几自身免疫血管炎的患者中观察到，其中已报道IgG抗体的降低的半乳糖基化和唾液酸化（Parekh et al.,Nature 316,452(1985);Rademacher et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,6123(1994);Matsumoto et al.,128,621（2000））。

国际专利申请WO 2007/117505公开含有至少1个IgG Fc区的多肽，所述多肽相比未纯化的抗体具有更高抗-炎性活性及更低细胞毒性活性。在本申请中发现，就增加的Fc片段上N-联糖基化位点的唾液酸化富集的IgG制备物显示增强的体内抗-炎性活性。相反，得出Fab片段显示在此体内测定中无抗-炎性活性。

由与WO 2007/117505相同的发明人的国际申请WO 2008/057634公开含有至少1个IgG Fc区的多肽，其中所述至少1个IgG Fc区用至少1个由α-2,6连接与相应末端唾液酸部分连接的半乳糖部分糖基化。WO 2008/057634的多肽相比未纯化的抗体具有更高抗-炎性活性。也在本申请中发现，就增加的Fc片段上N-联糖基化位点的唾液酸化富集的IgG制备物显示增强的体内抗-炎性活性。相反，得出Fab片段显示在此体内测定中无抗-炎性活性。由相同的发明人的国际申请WO 2009/079382提供进一步证据显示，抗-炎性活性是由于Fc片段，而非Fab片段上增加的唾液酸化。

在由Nimmerjahn & Ravetch的注释（JEM 204,11～15（2007））中，作者明显教导，Fc区中的唾液酸化对于IVIG的抗-炎性活性是关键的。此外，它们陈述，位于Fab区的抗原结合结构域，在IgG的抗-炎性活性中的一般化的作用是不可能的，给定在它们的掌握中，完整IVIG和其Fc片段具有相当的抗-炎性活性。

国际申请WO 2007/005786针对控制含有Fc的分子的性质的方法，所述方法包括改变Fc区中寡糖的唾液酸化。在本申请中发现，Fc寡糖的唾液酸化的水平改变重组-产生的治疗性抗体对Fcγ受体的亲和性，导致这些抗体的各种方面的生物学作用的调节。还发现，唾液酸自Fc寡糖的移出增强重组-产生的治疗性抗体对它们的靶分子的亲合力。但是，效应被认为完全是Fc介导的，因为观察到在各Fab臂和靶之间的固有亲和性中无差异。WO 2007/005786的发明人假定，带电的静态基团自Fc寡糖的移出允许总体抗体结构中更多柔性，由此提供彼此关联的2个结合结构域的更高相互作用潜力。

由Jefferis的新近综述（Jefferis,R.;Nat Rev Drug Discov.2009Mar;8(3):226-34）讨论糖基化为改善基于抗体的治疗剂的策略。根据Jefferis，大致30%的多克隆人IgG分子在IgG Fab区中带有N-联寡糖，和对于IgG Fab相比IgG Fc观察到更高水平的半乳糖基化和唾液酸化。当存在时，糖基化附接于可变区，且不清楚多克隆IgG的IgGFab糖基化的功能意义。基于对单克隆抗体的研究，推测抗体的Fab区的糖基化可对抗原结合具有中性，阳性或阴性影响。无对此进一步研究的动机，也无对富集Fab区中糖基化的抗体群的进一步研究的动机。

由此，已加强地研究具有增加的量的抗体Fc区中的唾液酸化的抗体制备物用于预防和治疗各种疾病，也已讨论抗体Fab区的糖基化的潜在作用。

在国际专利申请PCT/US2010/028889中，我们报道了抗体由西洋接骨木（Sambucus nigra）亲和层析的分级分离，其中全部结合的物质用单级分（+SA）中的酸性乳糖洗脱。我们显示，洗脱的具有增加的Fab区中的唾液酸化的级分具有惊人免疫调节效应。

但是，然而许多抗体产物目前用于治疗，仍有对于提供在临床应用中具有更有益有效性的替代性的和/或改善的抗体制备物的需求。

对于此技术问题的解决方案通过提供权利要求中表征的实施方式来达到。在本文中，我们公开结合到西洋接骨木（Sambucus nigra）亲和性柱的物质的进一步分离，用中性pH的碳水化合物第1次洗脱，之后是用酸性pH的碳水化合物洗脱。我们显示，在用中性碳水化合物预洗脱之后用酸性碳水化合物洗脱的抗体意外地增强了免疫调节活性。

【发明概述】

本发明的一方面是产生具有增强的免疫调节活性的抗体群的方法，包括以下步骤：

（a）使抗体制备物在西洋接骨木（Sambucus nigra）凝集素或其相当体上经历亲和层析，

（b）任选地收集非-结合抗体群（-SNA级分），

（c）任选地洗涤亲和性基质；

（d）用中性pH的碳水化合物洗脱结合的抗体群（E1级分），

（e）用酸性pH的碳水化合物洗脱余下的结合的抗体群（E2级分），

其中E2级分相比SNA基质的总洗出液（+SNA级分）具有增强的免疫调节活性。

优选地，碳水化合物是糖，更优选，糖是乳糖。

优选地，中性pH是6～8的范围内的pH，更优选在6.5～7.5的范围内，甚至更优选，pH是约7.5。

优选地，酸性pH是5以下的pH，更优选4以下的pH，甚至更优选3.5以下的pH，最优选约3的pH。

抗体制备物优选是自人血浆分离的IgG制备物，更优选自从至少1000个供体合并的人血浆分离的IgG制备物，甚至更优选抗体制备物是IVIG或SCIG制备物。

免疫调节活性可通过使用用于测量抗-炎性活性的体外测定来测定。优选地，测定测量炎性刺激对血细胞或细胞系的效应的抑制，例如由植物凝集素，干扰素-γ，脂多糖（LPS），TLR激动剂或其他剂对外周血单核细胞（PBMC）或细胞系诸如U937或类似细胞系的刺激。炎性效应可，例如，通过测量细胞表面标记物或细胞因子的产生来测定。优选地，免疫调节活性通过测量由单核细胞的植物凝集素-诱导的或LPS-诱导的CD54表达或血细胞的细胞因子分泌的抑制来测定。

优选地，可在步骤e中获得的抗体群（E2级分）的免疫调节活性至少10%大于总结合的及洗脱的级分（+SNA级分）或可在步骤d中获得的抗体群（E1级分）的免疫调节活性。

本发明的另一方面是可由上述方法获得的抗体群。

优选地，在以上描述的方法的步骤d中可由用中性pH的碳水化合物洗脱获得的抗体群（E1级分）

（a）具有与亲和层析之前的抗体制备物约相当的Fc区中的唾液酸化；和/或

（b）具有相比亲和层析之前的抗体制备物至少50%，优选至少60%，甚至更优选至少70%，甚至更优选至少80%，最优选大于90%更高的Fab区中总聚糖的唾液酸化。

优选地，在以上描述的方法的步骤e中可由用酸性pH的碳水化合物洗脱获得的抗体群（E2级分）

（a）具有相比亲和层析之前的抗体制备物或相比步骤d的级分至少15%，优选至少20%，甚至更优选至少22，24，25，26，27，28，29，30%更高的Fc区中的唾液酸化；和/或

（b）具有相比亲和层析之前的抗体制备物至少50%，优选至少60%，甚至更优选至少70%，甚至更优选至少80%，最优选大于90%更高的Fab区中总聚糖的唾液酸化；和/或

（c）具有相比步骤d的抗体群至少4%，优选至少5%，甚至更优选至少6%更高的Fab区中总聚糖的唾液酸化。

本发明的再一方面是药物组合物，其包含本发明的抗体群，及药学可接受的载体或赋形剂。

本发明的再一方面是本发明的抗体群，其用作药物。

本发明的仍再一方面是本发明的抗体群，其用于治疗或预防炎性病情。优选地，炎性病情是自身免疫疾病或神经退行性疾病。更优选，自身免疫或神经退行性疾病选自：类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮（SLE），抗磷脂综合征，免疫血小板减少症（ITP），川崎病，GuillainBarré综合征（GBS），多发性硬化（MS），慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病（CIDP），皮肤发疱病，皮肌炎，多发性肌炎，阿尔茨海默病，帕金森病，与唐氏综合征相关的阿尔茨海默病，脑淀粉样血管病，痴呆伴列维小体，额颞叶退化和血管性痴呆。

【发明详述】

本发明涉及产生抗体群的方法，以及得到的具有增强的免疫调节活性的抗体群。方法基于由在西洋接骨木（Sambucus nigra）凝集素（SNA）亲和性基质或其相当体上亲和层析分级分离。抗体群具有相比分级分离之前的抗体制备物或甚至相比自亲和性基质洗脱的抗体的总级分（+SNA）增强的免疫调节活性。免疫调节活性可通过使用，例如，用于测量抗-炎性活性的体外测定来测定。本领域技术人员熟知该测定。优选地，测定测量炎性刺激对血细胞或细胞系的效应的抑制，例如由植物凝集素，LPS；干扰素-γ，TLR激动剂或其他剂刺激对外周血单核细胞（PBMC）或细胞系诸如U937或类似细胞系。炎性效应可，例如，通过测量细胞表面标记物或细胞因子的产生来测定。优选地，免疫调节活性通过测量植物凝集素-诱导的或LPS-诱导的由单核细胞的CD54表达的抑制来测定。

抗体群的免疫调节活性增强至少10%，优选至少12%，13%14%，或15%，更优选至少18%，甚至更优选至少20%，甚至更优选21，22，23，24，25，26，27，28，29，30%，最优选大于30%（相比总+SNA IVIG）。

本发明的另一实施方式是抗体群，其可由以下步骤自抗体制备物获得：

（a）使抗体制备物经历在西洋接骨木（Sambucus nigra）凝集素基质或其相当体上亲和层析，

（b）任选地收集非-结合群（-SNA级分），

（c）任选地包括洗涤的步骤，以及

（d）用中性pH的碳水化合物洗脱结合的群（E1级分），以及

（e）用酸性pH的碳水化合物洗脱仍结合的群（E2级分），

其中E2级分具有相比SNA柱的总洗出液（+SNA级分）增强的免疫调节活性。

本发明的进一步实施方式是产生具有增强的免疫调节活性的抗体群的方法，包括以下步骤：

（b）任选地收集非-结合群（-SNA级分），

（c）任选地包括洗涤的步骤，

（d）用中性pH的碳水化合物洗脱结合的群（E1级分），

（e）用酸性pH的碳水化合物洗脱余下的结合的群（E2级分），

用于洗脱的碳水化合物优选是糖，更优选其是乳糖或唾液酸乳糖，最优选的是乳糖。

抗体制备物优选分离自人血浆，优选自至少1000个供体合并的人血浆，更优选抗体制备物富集IgG，甚至更优选，其是纯化的IgG。最优选，其是配制用于静脉内或皮下施用给患者的人IgG制备物，诸如IVIg或SCIg，尤其是治疗性产品诸如Sandoglobulin，Privigen或Hizentra。一般抗体制备物的IgA和IgM含量会在2%以下，优选在1.5%以下，更优选在1%以下。

本发明也涉及包含本发明的抗体群的组合物。

术语"组合物"根据本发明，涉及包含本发明的抗体群的组合物。由于本发明的抗体群可由在结合唾液酸残基的亲和性基质上分级分离来获得，其也是自抗体制备物富集的抗体群，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物在抗体的Fab区内具有改变的唾液酸化模式，或其包含至少抗体群，其中抗体群相比富集之前的抗体制备物在抗体Fab区内具有改变的唾液酸化模式。组合物可，任选地，还包含能改变本发明的抗体群的特征，由此，例如，减少，稳定化，延迟，调节和/或活化抗体功能的分子。组合物可为固体，或液体形式，和可为，尤其，粉，片剂，溶液或气雾剂形式。

在优选的实施方式中，本发明的组合物是药物组合物，其任选地还包含药学可接受的载体，赋形剂和/或稀释剂。

根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于施用给患者，优选人患者的组合物。本发明的药物组合物包含以上叙述的抗体群。本发明的药物组合物可，任选地和另外地，包含药学可接受的载体。“药学可接受的载体”是指非-毒性固体，半固体或液体填料，稀释剂，包裹材料或任何类型的辅助制剂。适合的药学载体的例为本领域所熟知及包括氯化钠溶液，磷酸盐缓冲的氯化钠溶液，水，乳剂，诸如油/水乳剂，各种类型的润湿剂，无菌溶液，有机溶剂等。优选载体是肠胃外载体，更优选与受者血等渗的溶液。载体适宜地含有少数量的添加剂诸如增强等渗性和化学稳定性的物质。该物质以所采用的剂量和浓度对受者是非-毒性的，及包括缓冲剂诸如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，乙酸，及其他有机酸或它们的盐；抗氧化剂诸如抗坏血酸；低分子量（小于约10个残基）(聚)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白，诸如血清白蛋白，明胶或还有免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，脯氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露糖醇或山梨糖醇；对离子诸如钠；和/或非离子表面活性剂诸如聚山梨酯，泊洛沙姆或PEG。

包含该载体的组合物可由熟知的常规方法配制。一般而言，制剂通过使药物组合物的组分与液体载体或精致地细分的固体载体或二者均匀和密切地接触来制备。然后，如果必需，产物塑形为期望的制剂。

可将这些药物组合物以适合的剂量施用于受试者。剂量方案会由主治医师和临床因素确定。如在医疗领域熟知，任何一个患者的剂量依赖于许多因素，包括患者的大小，身体表面积，龄，待施用的特定化合物，性别，时间和施用途径，一般健康和同时施用的其他药物。给定情况的治疗有效量会通过常规实验容易确定，且在普通临床医师或医师的技能和判断之内。药物组合物可为用于一次施用或用于规则施用延长的时间。一般而言，药物组合物的施用应在对于单剂量例如10μg/kg的体重～2g/kg的体重的范围内。但是，更优选的剂量可在对于单剂量100μg/kg～1.5g/kg的体重，甚至更优选1mg/kg～1g/kg的体重和甚至更优选10mg/kg～500mg/kg的体重的范围内。本发明的药物组合物的施用可由不同方式实现，例如，由静脉内，腹膜内，皮下，肌内，真皮内，口腔，鼻内或支气管内施用。

待用于治疗性施用的药物组合物的组分必需是无菌的。无菌性由通过无菌过滤膜（例如,0.2μm膜）过滤容易实现。

药物组合物的组分通常会作为水溶液或作为用于再构成的冻干制剂存储于单元或多-剂量容器，例如，密封的安瓿或瓶中。作为冻干制剂的一例，10ml瓶用5ml的无菌过滤的1%（w/v）水溶液填充，并将得到的混合物冷冻干燥。输注溶液通过使用抑菌注射用水重建冷冻干燥的化合物来制备。也可存在防腐剂和其他添加剂诸如，例如，抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等。药物组合物可依赖于旨在的药物组合物的用途包含其他剂。

另一实施方式是本发明的抗体群，或组合物，优选包含本发明的抗体群的药物组合物的医疗用途。

也包括在本发明中的是本发明的抗体群，其用于治疗或预防炎性病情，例如自身免疫疾病和/或神经退行性疾病，诸如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮（SLE），抗磷脂综合征，免疫血小板减少症（ITP），川崎病，Guillain Barré综合征（GBS），多发性硬化（MS），慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病（CIDP），皮肤发疱病，皮肌炎，多发性肌炎，阿尔茨海默病，帕金森病，与唐氏综合征相关的阿尔茨海默病，脑淀粉样血管病，痴呆伴列维小体，额颞叶退化或血管性痴呆。优选地，用于这些病情的抗体群具有增加的唾液酸含量，优选在抗体的Fab或Fc区，更优选Fab区内增加的唾液酸含量。

本发明也涉及本发明的抗体群，其用于预防和/或治疗动脉粥样硬化，癌和感染诸如细菌，病毒或真菌感染。

本发明的抗体群可用于不依从于传统处理方案（例如由于针对抗生素的抗性的发生）的感染的预防和/或治疗是特别优选的。

本文所述的全部疾病为本领域技术人员所熟知，及根据本领域技术人员的现有技术和公知常识定义。

如上所述，本发明的抗体群可由抗体制备物在西洋接骨木（Sambucus nigra）亲和性基质上分级分离获得。西洋接骨木（Sambucus nigra）凝集素是特异于末端α2,6-连接的唾液酸残基的凝集素。因此，抗体群与亲和性柱的结合与本发明的抗体群相比见于亲和性柱的流通的抗体群和甚至用中性pH的碳水化合物洗脱的抗体群的增强的唾液酸化关联是可能的。增强的唾液酸化可能见于Fab区，但增强的唾液酸化也可见于Fc区。术语"唾液酸化的量"和"唾液酸的量"在本文互换使用。如下定义，改变的量的唾液酸化可为抗体的Fab区或Fc区内唾液酸化的量的增加或减小。优选地，本发明的抗体群不同于亲和层析之前的抗体制备物在于具有相比亲和层析之前的抗体制备物中Fab区内唾液酸化的量至少1.25倍更高或更低，更优选至少1.5倍更高或更低，更优选至少2倍更高或更低诸如至少3倍或至少4倍更高或更低的量的唾液酸化。更优选，唾液酸化的量相比亲和层析之前的抗体制备物中的Fab区内的唾液酸化的量至少5倍更高或更低。术语"倍更高或更低"指称当测量总聚糖的%唾液酸化的聚糖时相比原材料相对增加或减小。例如，如果抗体群在亲和层析之前具有聚糖的15%的唾液酸的量，则抗体群具有3倍更高或更低量的唾液酸会分别具有45%或5%聚糖有唾液酸。在IgG的情况中，Fc片段的唾液酸化通过用蛋白酶诸如胰蛋白酶消化，之后是分析得到的Fc-特异性糖肽（例如描述于实施例2,方法（a））来测定，及本文引述的富集数指称总Fc-特异性糖肽中具有一个或更多唾液酸残基的Fc-特异性糖肽的富集倍数或百分率。IgG分子的总唾液酸化（包括Fab和Fc唾液酸化）可通过用N-糖苷酶F消化胰蛋白酶肽，之后是分析释放的聚糖（例如描述于实施例2,方法（b））来测定。在此情况中，数指称总聚糖中具有一个或更多唾液酸残基的聚糖的数或百分率。

本发明的抗体群可为分离的和/或纯化的抗体群，依赖于抗体制备物作为用于亲和层析的原材料的选择。

根据本发明的全部实施方式，抗体可从血浆提取，或可由本领域知道的各种过程中的任何一种产生，例如如描述于Harlow和Lane（1988）和（1999），loc.cit。由此，抗体可，例如，合成产生，及也可包括拟肽。而且，可应用为单链抗体的产生所描述的技术（见,尤其,US专利4,946,778）。而且，转基因动物或植物（见,例如,US专利6,080,560）可用于表达（人源化的）抗体。为制备单克隆抗体，可使用提供由连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。本领域知道的该技术的例，例如描述于Harlow和Lane（1988）和（1999），loc.cit.及包括杂交瘤技术（和Milstein Nature 256（1975），495～497），三源杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术（Kozbor,Immunology Today4（1983），72）和EBV-杂交瘤技术，以产生人单克隆抗体（Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc（1985），77～96）。在本发明的情景中也面对，术语“抗体”包含可在细胞中表达的抗体构建体，例如可经，尤其是，病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。

因为根据本发明，在Fab区内具有低水平的唾液酸化或无唾液酸化的抗体会不被亲和层析结合，在步骤（a）中不结合的及在步骤（b）中收集的抗体群是相比亲和层析之前的制备物具有降低的量的抗体的Fab区内的唾液酸化的群。换言之，此抗体群是唾液酸耗竭的群。在步骤（a）中结合的及自亲和性基质用碳水化合物洗脱的抗体群是相比亲和层析之前的制备物具有增加的量的抗体的Fab区内的唾液酸化的群，由于具有高水平的Fab区内的唾液酸化的抗体与亲和层析的结合。由此，起始的抗体群的抗体分离到具有增加的或降低的量的抗体的Fab区内的唾液酸化的富集的群。

在本发明的方法的优选的实施方式中，在装载柱及起始洗脱之间实施至少一个洗涤步骤（权利要求1中的步骤c）。适合的洗涤溶液为本领域技术人员所熟知，可使用例如，Tris-缓冲的盐水（TBS）或磷酸盐缓冲液（PBS）。

在本发明的方法的更优选的实施方式中，亲和层析对于唾液酸化的抗体Fc区相比对于唾液酸化的抗体Fab区具有更低亲和性，即亲和性对于Fab唾液酸化超过Fc唾液酸化是选择性的。由此，在本发明的方法中采用的亲和性基质会优先结合抗体Fab区中含有的唾液酸但不，或仅以更小程度，结合抗体Fc区中含有的唾液酸。因而，由于分离基于Fab唾液酸化，由洗脱（权利要求1中的步骤d和e）获得的抗体群相比具有Fc唾液酸化的抗体，更富集具有Fab唾液酸化的抗体及，类似地，在步骤（b）中获得的抗体群更富集无或几乎无Fab唾液酸化的抗体，无关于它们的Fc唾液酸化。优选地，Fc唾液酸化会不同小于100%，更优选小于50%，甚至更优选小于30%，最优选小于20%，当测量总糖肽的%唾液酸化的糖肽时。

本发明还涉及抗体群，其中抗体群具有相比亲和层析之前的抗体制备物改变的量的抗体的Fab区内的唾液酸化。

可如以上描述实施确定是否抗体群具有相比富集之前的抗体制备物改变的量的抗体的Fab区内的唾液酸化。改变的量的唾液酸化被认为是与在目前可利用的方法的多血症的检测限之内的IVIG的唾液酸化的量不同的任何量的唾液酸化。优选地，抗体群的唾液酸化量相比富集之前的抗体制备物中的抗体中Fab区内的唾液酸化的量至少1.25倍更高或更低，更优选至少1.5倍更高或更低，更优选至少2倍更高或更低诸如至少3倍或至少4倍更高或更低。更优选，唾液酸化的量相比富集之前的抗体制备物中的抗体中Fab区内的唾液酸化的量至少5倍更高或更低。如上所述，术语"倍更高或更低"指称相比富集之前的抗体制备物中的唾液酸的量相对增加或减小。

也面对的是，本发明的抗体的Fab区的唾液酸化的量可进一步修饰。

例如，唾液酸化的量可修饰使得获得抗体的Fab区内的唾液酸化的进一步增加或减小，导致相应抗体群的唾液酸化的总量的进一步修饰。面对抗体Fab区中唾液酸量的增加以及减小。当本发明的抗体群在抗体Fab区中具有增加的量的唾液酸时是优选的，进一步修饰是抗体Fab区中唾液酸量的另外的增加。当本发明的抗体群在抗体Fab区内具有降低的量的唾液酸时其也是优选的，进一步修饰是抗体Fab区内唾液酸量的另外的减小。

也面对进一步修饰唾液酸化的模式，即唾液酸类型和/或抗体Fab区内它们的位置。

唾液酸化模式的修饰酶学地实现。酶促修饰可，例如，通过使用唾液酸转移酶和唾液酸的供体实施，以便增加抗体Fab区内的唾液酸量。或者，例如，通过使用唾液酸酶，由此移出唾液酸可达到抗体Fab区内唾液酸量的减小。

唾液酸转移酶的非限制性例是ST3Gal III，也被称为α-(2,3)唾液酸转移酶（EC 2.4.99.6），及α-(2,6)唾液酸转移酶（EC 2.4.99.1）。α-(2,3)唾液酸转移酶催化唾液酸向Gal-β-1,3GlcNAc或Gal-β-1,4GlcNAc糖苷的Gal的转移（Wen et al.,J.Biol.Chem.267:21011(1992);Van denEijnden et al.,J.BioI.Chem.256:3159（1991））及负责糖肽中天冬酰胺-连接的寡糖的唾液酸化。α-(2,6)唾液酸转移酶的活性导致6-唾液酸化的寡糖，包括6-唾液酸化的半乳糖。存在不同形式的α-(2,6)唾液酸转移酶及可从不同组织分离，或可通过使用重组技术产生。

唾液酸酶（也被称为神经氨酸酶,N-乙酰神经氨酸糖原水解酶）的非限制性例是唾液酸酶Au，α-(2-3,6,8,9)（EC 3.2.1.18）；唾液酸酶Cp，α-(2-3,6)（EC3.5.1.18）和唾液酸酶Spα-(2-3)（EC 3.5.1.18）。

为了达到抗体的Fab区内的唾液酸化的量的选择性修饰，可由本领域知道的任何各种方法保护抗体Fc区免于酶促活性。例如，可采用特异性Fc-结合配体来掩罩Fc区。该Fc-特异性配体的非限制性例包括化学合成的配体诸如上述那些，或生物学配体诸如可溶性Fc受体，Fc特异性抗体或蛋白A/G。

此外，可改变细胞培养条件，以变化细胞培养中产生的抗体的唾液酸化的量。例如，当生产率降低时获得增加的量的唾液酸，及同渗质量摩尔浓度通常维持在约250mOsm～约450mOsm。此和其他适合的细胞培养条件描述于，例如，US专利No.6,656,466。此外，已由Patel等人（Patel等人,Biochem J,285,839～845（1992））报道，如果抗体作为腹水或在无血清或含血清的培养基中产生，连接糖侧链的抗体中的唾液酸含量显著不同。而且，也显示，用于细胞生长的不同生物反应器的使用和培养基中溶解的氧的量影响连接糖部分的抗体中半乳糖和唾液酸的量（Kunkel等人,Biotechnol.Prog.,1.6,462～470（2000））。

改变的量的唾液酸化可为Fab区内的唾液酸化的量的减小，如上所述。改变的量的唾液酸化可替代性地是Fab区内的唾液酸化的量的增加，如上所述。

具有改变的量的抗体的Fab区内的唾液酸化的抗体群可，例如，用于治疗疾病诸如炎性和自身免疫病情，例如动脉粥样硬化，多发性硬化，SLE和以上所列的其他。

【定义】

贯穿本发明使用的术语"抗体"包括，例如，多克隆或单克隆抗体。术语“抗体”也包含仍保留抗原结合特异性的衍生物或其片段。由此，也包括的是实施方式诸如嵌合（人恒定区,非-人可变结构域），单链及人源化的（人抗体，例外是非-人CDR）抗体，以及抗体片段，如，尤其，Fab或Fab’片段。抗体片段或衍生物还包含Fd，F(ab')₂，Fv或scFv片段；见，例如，Harlow和Lane"Antibodies,A LaboratoryManual"，冷泉港实验室出版，1988和Harlow和Lane“UsingAntibodies:A Laboratory Manual”冷泉港实验室出版，1999。

根据本发明的全部实施方式，术语"抗体群"指称均质，即包含仅一种特异性抗体的几个分子的一组抗体，或异源，即包含多种不同抗体。在各情况中，抗体群优先由IgG类的抗体组成或包含IgG类的抗体（也见下文）。但是，其也可包含IgM或IgA类的抗体或IgG，IgM和/或IgA类的免疫球蛋白的混合物或由IgM或IgA类的抗体或IgG，IgM和/或IgA类的免疫球蛋白的混合物组成。

贯穿本发明使用的术语"Fab区"指称由自抗体的各重和轻链的一个恒定及一个可变结构域组成的抗体区，及其含有涉及抗原结合的位点。各完整天然的IgG抗体包含2个Fab区。根据本发明，术语"Fab片段"用于通常当抗体用木瓜蛋白酶消化时获得的抗体的那些片段。木瓜蛋白酶消化导致抗体在连接2个重链的二硫桥上切割及，由此，释放2个个体Fab片段。用胃蛋白酶消化，另一方面，导致由抗体的铰链区连接在一起的2个Fab片段，所谓的"F(ab')2片段"的释放。关于不被这些酶消化消化的抗体，术语"Fab区"指称如果实施用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的消化，会形成Fab和/或F(ab')2片段的抗体的那些部分。关于由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化获得的抗体片段，Fab区对应于Fab片段。在Fab片段的情况中，对应的分子与Fab区相同。

但是，由于Fab区中的糖基化位于抗体的可变区，在本发明的情景中，Fv区，单链Fv片段或其他含有抗体的可变区的片段被认为是相当体。

根据本发明使用的术语"改变的量的唾液酸化"指称抗体群中唾液酸量的变化，其中唾液酸位于所述群的Fab区和/或抗体Fc区。由此，如果富集的抗体群的Fab区和/或抗体Fc区内的唾液酸总量不同于富集之前的抗体制备物的Fab区和/或抗体Fc区内的唾液酸总量，就富集的抗体群的唾液酸化的量被改变。唾液酸量的变化可为增加的量的唾液酸或降低的量的唾液酸。确定是否抗体群具有相比富集之前的抗体制备物改变的量的抗体的Fab区内的唾液酸化可使用本领域知道的任何各种方法实施。例如，可测定富集之前的抗体制备物和目标抗体群的唾液酸化的量，且可直接比较由此获得的结果。测定唾液酸化的量的方法为本领域所熟知。非限制性例包括如在实施例部分中细节化的方法或目标抗体的胃蛋白酶消化，之后是分离得到的F(ab’)2和自Fc片段的胃蛋白酶片段（例如使用Centricon管）和定量这些级分中的唾液酸（例如用HPLC或MS或基于酶的光度测定,可自QA-bio LLC,Palm Desert,Ca:qa-bio.com利用的），如描述于，例如，Current Protocols in Protein Science:Unit 12.4（Hudson et al），12.6（Royle et al）及12.7（Harvey et al），John Wiley和Sons（2006）。这些方法可用于确定本文所述的全部实施方式的改变的量的唾液酸化。唾液酸化的增加或减小的量通常表达为总聚糖中%唾液酸化的聚糖，或对于Fc唾液酸化，表达为总糖肽中%唾液酸化的糖肽。

根据本发明，术语"唾液酸"指称神经氨酸的N-或O-取代的衍生物，具有9-碳主链的单糖。神经氨酸衍生物的此家族的最常见的成员是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac或NANA）。家族的其他成员是N-羟乙酰神经氨酸（NGNA或Neu5Gc），其中Neu5Ac的N-乙酰基被羟化。也由术语唾液酸包括的是2-酮基-3-脱氧壬酮糖酸（KDN）（Nadano etal.(1986)J.BioI.Chem.261:11550-11557;Kanamori et aI.,J.BioI.Chem.265:21811-21819（1990））以及9-取代的唾液酸诸如9-O-C-C6酰基Neu5Ac，如9-O-乳酰-Neu5Ac或9-O-乙酰-Neu5Ac，9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac（Varki,Glycobiology 2:25-40(1992);Sialic Acids:Chemistry,Metabolism and Function,R.Schauer,Ed.(Springer Verlag,New York(1992))）。

根据本发明，术语“免疫调节性质”指称抗体群对免疫系统发挥的效应。免疫调节效应可为免疫抑制或免疫刺激。本领域技术人员可利用各种体外或体内方法来测量物质如抗体群的免疫调节性质。例如，源于单核细胞的细胞系，例如。U937细胞，可用视黄酸或维生素D生长及分化。它们可然后，例如用干扰素-γ或植物凝集素，在测试物质的存在和缺失下刺激。在适当的温育之后，可在细胞的上清液中测量炎性标记物诸如IL-8的量，及可由荧光活化的细胞分析（FACS分析）测定U937细胞上的细胞表面标记物，例如CD54，CD14或CD45，例如。具有免疫抑制，例如抗-炎性，性质的物质会导致相比对照样品降低量的炎性标记物。物质也可就它们的用该测定的抗-炎性效应排序；产生越低量的炎性标记物，越高抗-炎性效应。另一例是使用自人血分离的外周血单核细胞（PBMC）的方法，其用特定物质诸如洛索立宾或CpG在测试物质的缺失或存在下刺激。由测试物质的干扰素-α产生的抑制会指示免疫抑制，例如抗-炎性效应。类似测定，测量免疫刺激，也可利用。例如，可使用上述相同的方法，但不使用由例如干扰素或植物凝集素或类似刺激物刺激。

根据本发明，术语"(血)血浆免疫球蛋白G制备物"指称自（血）血浆分离的免疫球蛋白G制备物。待从（血）血浆分离的免疫球蛋白G可已由循环B细胞（抗体分泌浆细胞）分泌。（血）血浆免疫球蛋白G制备物可从哺乳动物诸如例如人得到，但也由非限制性例的方式自表达人免疫球蛋白G库的转基因动物，诸如例如猪，山羊，绵羊或牛得到（见综述Echelard Y and Meade H.,"Toward a new cash cow."Nat Biotechnol.2002Sep;20(9):881-2）。为回避怀疑，“血浆（bloodplasma）”常常简单称之为“血浆（plasma）”-两者互换使用。

根据本发明，"静脉内免疫球蛋白G(IVIG)"，为本领域技术人员所熟知及指称含有合并的自超过1000个血供体的血浆提取的IgG免疫球蛋白的血浆制备物。IVIG在医学中用作用于治疗疾病诸如免疫缺陷，炎症和自身免疫疾病以及急性感染的静脉内施用的产品。IVIG的优选的例是Privigen^TM。

根据本发明，“皮下免疫球蛋白G(SCIG)”为本领域技术人员所熟知及指称类似于IVIG的血浆制备物，仅其在医学中用作皮下施用的产品。SCIG的优选的例是Hizentra^TM。

本文所用的"纯化的抗体群"指称包含仅一类抗体，诸如IgG的抗体群。抗体群也可纯化以实现其含有或基本上含有（即大于90%）仅特定亚类的抗体诸如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其含有或基本上含有仅对于抗原定义的特异性的抗体。本文所用的术语"分离的抗体群"指称不包含任何非抗体分子的抗体群。

术语“炎性病情”指称与发炎关联的异常，其成为大量的人疾病的基础。发炎是对有害刺激的复合生物学应答，切实身体的旨在移出有害刺激及起始治愈的尝试。但是，异常可发生，导致炎性病情，诸如慢性发炎或自身免疫疾病。

术语“自身免疫疾病”指称免疫系统攻击自身抗原的病情。例包括类风湿性关节炎，多发性硬化，狼疮，重症肌无力，银屑病。

术语“神经退行性疾病”指称观察到神经元的结构或功能的进行性损失的病情，包括神经元死亡。神经退行性疾病的例包括阿尔茨海默病，帕金森病，多发性硬化，亨廷顿病。

根据本发明，"动脉粥样硬化"指称影响动脉血管的慢性疾病。其是动脉壁中的慢性炎性应答，大部分由于巨噬细胞白细胞的蓄积，及被低密度脂蛋白促进，无由功能高密度脂蛋白（HDL）的脂肪和胆甾醇自巨噬细胞充足的移出。其通过动脉内多噬斑的形成导致。发炎在动脉粥样硬化的全部阶段是中心，及涉及先天性和适应性免疫-炎性机理。疾病进展相关于针对氧化的脂蛋白的自身抗体的形成和循环细胞因子和炎性标记物的增加。

根据本发明，"癌"指称由细胞的不受控的分裂和这些扩展的能力表征的一类疾病或病症，其由通过侵入直接生长到相邻组织，或由通过转移移植到远处的位点表征（其中癌细胞通过血流或淋巴系统运输）。

根据本发明，"感染"是宿主生物被外源物种的有害定居。在感染中，感染的生物寻求利用宿主的资源，以便倍增（通常消费宿主）。宿主针对感染的应答是发炎。

细菌感染，根据本发明包括但不限于细菌脑膜炎，霍乱，白喉，利斯特菌病，百日咳（Whooping Cough），肺炎球菌肺炎，沙门氏菌病，破伤风，斑疹伤寒，结核，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或尿道感染。

病毒感染，根据本发明包括但不限于单核细胞增多症，AIDS，鸡痘，普通感冒，巨细胞病毒感染，登革热，埃博拉出血热，手-口蹄疫，肝炎，流感，风疹，脊髓灰质炎，狂犬病，天花，病毒脑炎，病毒胃肠炎，病毒脑炎，病毒脑膜炎，病毒肺炎或黄热病。真菌感染根据本发明包括但不限于曲霉菌病，芽生菌病，念珠菌病，球孢菌病，隐球菌病，组织胞浆菌病或脚癣。

【附图说明】

图1：使用凝集素亲和层析（SNA）的IVIG的分级分离。显示典型层析谱（A）。在用SDS-PAGE分离期间用凝集素印迹使用非-还原性条件（B和C）或还原性条件（D）监测IgG中的总唾液酸含量。显示的是考马斯染色的凝胶（B）和SNA-生物素探查的印迹（C和D）。可检测重和轻链唾液酸化（D）。

图2：由LC-MS分析测量IVIG中的唾液酸化的N-聚糖（如在实施例2中描述）。对不同IVIG级分计算总N-聚糖，Fc-特异性糖肽和F(ab’)₂-聚糖的相对量。F(ab’)₂-聚糖从IVIG，-SA IVIG和+SA IVIG由胃蛋白酶消化产生。

图3：在改变浓度的IVIg，-SNA，+SNA，E1和E2级分的存在下用PHA刺激的全血。由流式细胞术（FACS）测量单核细胞上的CD54。

图4：在改变浓度的IVIg，-SNA，+SNA，E1，E2，唾液酸酶-处理的IVIg（NA酶IVIg），及唾液酸酶-处理的E2（NA酶E2）的存在下用PHA刺激的全血。由流式细胞术（FACS）测量单核细胞上的CD54（A），及由ELISA测量上清液中的MCP-1（B）。

【实施例】

下列实施例旨在例证但不限制本发明。

【实施例1：使用2,6唾液酸特异性西洋接骨木（Sambucus nigra）凝集素（SNA）的IVIG的分级分离】

将100ml Tris-缓冲的盐水（TBS），0.1mM CaCl₂，pH7.5中的1g IVIG装于100ml西洋接骨木（Sambucus nigra）凝集素（SNA）柱上。收集流通。在用含有0.1mM CaCl₂的300ml的TBS洗涤之后，将与SNA柱结合的级分（+SNA IVIG）用200ml的TBS中的0.5M乳糖洗脱（E1），随后是用50ml的0.2M乙酸中的0.5M乳糖洗脱（E2）。在柱上第2次运行流通级分，以获得-SNA IVIG（图1）。

用SDS PAGE（非-还原性条件）和凝集素印迹监测IgG中的总唾液酸含量（图1）。将得到的IVIG级分用SDS PAGE使用Nupage10%BisTris Gels分离。将凝胶用考马斯染色及印迹到硝酸纤维素上。将印迹用生物素-SNA和AP-链霉亲和素探查，及用发色底物可视化。在图1D中，将重和轻链用SDS PAGE在还原性条件下分离。在用SNA-生物素探查的凝集素印迹中，两条链是明显可见的，指示轻链唾液酸化。因此，在+SNA IVIG中可检测显著Fab唾液酸化。

【唾液酸的定量】

唾液酸由酸性水解释放，和衍生化用1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基苯二盐酸盐（DMB）进行。定量用反相高效液相层析（RP-HPLC）使用N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）作为标准物来实施，及表达为唾液酸/IgG（重量/重量或Mol/Mol）。

【实施例2：聚糖分析】

为了研究在分离之前及之后IVIG的糖基化特征，鉴定源于典型IVIG制备物的Fc区的胰蛋白酶糖肽及表征，及通过聚糖释放和分析表征IVIG的总N-聚糖群。

【方法】

【（a）由肽谱的IgG1和IgG2/3Fc聚糖特征的确定】

由液相层析-质量光谱法（LC-MS）在胰蛋白酶消化之后分析IVIG样品，以测定特异于IgG1和IgG2/3Fc区的聚糖特征。监测糖肽的IgG2Fc区也可见于IgG3Fc区，由于此原因，它们被称为IgG2/3。基于血清中IgG亚类的知道的相对丰度，对IgG2/3肽见的大多数信号预期来源于IgG2分子。变性，还原（用胍鎓-HCl和DTT加热）和烷基化（用碘乙酰胺）之后是使用1:50酶对底物比的胰蛋白酶消化。分离胰蛋白酶肽及在C18固相提取（SPE）旋柱上纯化，及在真空下在管中干燥。在使用用于肽分离的Agilent Proshell 300SB-C18柱的Agilent Q-TOF系统上实施LC-MS分析。提取层析谱及对各IgG1和IgG2/3糖肽整合，总和[M+2H]2+和[M+3H]3+信号，及使用预测的结构的计算的单同位素质量。通过使用Agilent MassHunter软件，版本B.02.00分析及处理数据（Huddleston et al.Anal Chem 65,877,1993）。

【IgG糖肽的鉴定】

胰蛋白酶消化的LC-MS分析导致复合层析谱。在鉴定潜在糖肽的努力下，从Entrez蛋白数据库得到IgG亚类1～4的重链恒定区的序列（分别登录号No.12054072,12054074,12054076和12054078）。虚拟消化序列。由N-联糖基化共有序列的存在将表1中列的肽鉴定为潜在糖肽。也计算偶联到常见的IgG聚糖G0F的这些肽的理论重量，及预测的[M+3H]3+离子。

表1．自4种IgG亚类的预测的糖肽的列表。N-联糖基化共有序列以粗体凸显。给裸肽，与G0F聚糖连接的肽的计算的单同位素质量，及[M+3H]3+离子

*在样品制备期间，样品用碘乙酰胺处理。含有半胱氨酸的肽的计算的质量包括一个羧酰胺甲基的质量，以解释此处理。

【（b）全局聚糖特征的确定】

如下分析样品，以测定全局聚糖特征。源于250μg的各样品的干燥的胰蛋白酶肽在50μL 100mM NH₄HCO₃中重构成，及与250U N-糖苷酶F（PNG酶F）于37℃温育过夜。实施第2C18SPE纯化以自释放的聚糖分离去糖基化的胰蛋白酶肽。将释放的聚糖使用碱性硼氢化钠溶液转化为糖醇，于45℃温育过夜。余下硼氢化物的分解后，将聚糖糖醇在Dowex 50 WX4-400离子交换树脂旋柱上脱盐及干燥。甲醇中1%乙酸的重复的添加和蒸发用于移出残留的硼酸。聚糖糖醇在起始移动相（10mM NH₄HCO₃）中重构成，及以一式两份由LC-MS在阴性模式下分析。在石墨化的碳高HPLC柱上使用10mMNH₄HCO₃/乙腈移动相系统实施聚糖分离。提取层析谱及对各聚糖整合，自聚糖糖醇的[M-1H]1-，[M-2H]2-及[M-3H]3-信号总和信号。聚糖糖醇的制备和分析类似于之前报道的工作（Karlsson et al.RapidCommun Mass Spectrom 18,2282,2004）。

【结果】

如显示于图2，相比在IVIG，-SNA IVIG和E1级分，在+SNA IVIG中Fc中的唾液酸化水平不是显著更高。但是，E2级分相比其他抗体群显示Fc区中IgG1糖肽的约2～3%更高唾液酸化，其增加约30%（图2A）。另一方面，总N-聚糖的唾液酸化水平，包括Fab和Fc区内的唾液酸化，在+SNA IVIG级分E1和E2中显著更高（图2B）。如可见于图2C，Fab区内的唾液酸化增加约100%，即总聚糖的自37%～74%（E1）和80%（E2）。基于这些结果可得出，由SNA亲和层析的分级分离主要基于IVIG的Fab区中聚糖的不同唾液酸化。

总之，实施例1中描述的分级分离方法导致相比源IgG制备物（IVIG）被更高唾液酸化（E1和E2+SNA IVIG）或更低唾液酸化的（-SNA IVIG）的IgG群。观察的更高唾液酸化水平主要是由于IgG的Fab区内的更高唾液酸含量。结果提示，在用中性乳糖洗脱E1级分之后用酸性乳糖洗脱的E2级分，可相比E1级分在Fc和Fab区内具有稍微更高唾液酸化。

【自IVIG，-SNA IVIG，E1+SNA IVIG和E2+SNA IVIG的F(ab’)₂的聚糖分析】

F(ab')2如在实施例1中描述产生的IVIG和IVIG级分的由胃蛋白酶消化来产生。IVIG用胃蛋白酶（0.5mg/g IVIG）在乙酸盐缓冲剂pH4.0中于37℃消化2小时。反应通过添加2M Tris碱直到达到pH 8停止。通过使用Centricon管（30’000Mw截止值）实施自小消化产物浓缩和纯化和缓冲剂交换为PBS（如描述于,例如,Current protocolsin Immunology:Unit 2.7and 2.8(Andrew et al)John Wiley and Sons(1997)）。

样品在胰蛋白酶消化之后由LC-MS分析。物质的变性，还原和烷基化之后是上述胰蛋白酶消化。样品如上述分析，以测定全局聚糖特征（图2C）。

【实施例3：全血刺激测定】

用1mg/l植物凝集素-M（PHA）刺激来自健康供体的全血。在刺激期间或在添加刺激剂之前已将唾液酸增强的（+SNA;E1;E2）及耗竭的IVIG（-SNA）和其级分加入细胞。在对照样品中，将无刺激和IgG添加的全血温育。

在于37℃20+/-2h的温育后，通过由商业ELISA试剂盒或珠阵列细胞因子定量试剂盒测量上清液中的炎性标记物来监测刺激。

血细胞已用PBS洗涤及取入PBS。炎性细胞表面标记物已由流式细胞术（FACS analysis）使用荧光标记的抗体（BD Pharmingen）在CantoII（BD Bioscience）上定量。

观察到单核细胞上的刺激标记物（CD54）由E2IVIG级分的剂量依赖性减小至阴性对照（仅血）的CD54水平。+SNA级分显示炎性标记物的中等抑制，然而-SNA（非SNA结合）及源IVIG未显示抑制性效应。（图3）

重复实验，包括，除了上述IgG制备物之外，唾液酸酶-处理的IVIg（NA酶IVIg）和唾液酸酶-处理的E2级分（NA酶E2）。通过根据生产商的使用说明（自产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）克隆的，NewEngland Biolabs）于37℃用7U/mg的神经氨酸酶温育IgG经24小时来实施IgG的去唾液酸化。除了由FACS测量单核细胞上的CD54之外，也使用ELISA试剂盒（R&D Systems）根据生产商的使用说明测定上清液中的MCP-1浓度。结果显示于图4。再次，如上述获得剂量-依赖性抑制性效应，E2显示全部制备物的最佳抑制。E2的抑制性效应由唾液酸酶处理完全消除，指示唾液酸残基对于效应是重要的。在我们的一些实验中，未分级的源IVIg也显示一些抑制性效应，尽管有时仅以更高浓度（例如以50mg/ml）。

当用0.1～1ng/ml浓度的LPS进行刺激时获得类似结果。

【实施例4：Fab唾液酸化对体外细胞刺激测定中测试的抗-炎性活性的效应】

在各种自身免疫和神经退行性疾病中，炎性病情与疾病关联。在体外细胞培养检定中，将体内观察的炎性病情建模，以测试不同唾液酸富集的及耗竭的IVIG和Fab级分的抗-炎性活性。

许多系统性红斑狼疮（SLE）患者具有与疾病活性和严重性关联的I型“IFN标签”（Bengtsson et al,(2000)Lupus 9(9)664-671）。含有RNA或DNA核蛋白的免疫复合物（IC）可被胞吞以刺激Toll-样受体（TLR 7,9），导致IFN-α产生（Vollmer et al(2005)J.Exp.Med.2002(11),1575-1585）。在此实验中，目标是测定在人细胞的TLR7/TLR9刺激之后唾液酸化的（SA+）IgG是否和如何调节IFN-α产生。

从肝素化的健康自愿者的静脉血由在Ficoll-Paque（AmershamBiosciences）上密度-梯度离心来分离外周血单核细胞（PBMC）。将PBMC培养物（在96-孔圆底组织培养板中5×10⁵/孔,Nunc,总体积150μL）用洛索立宾（200μM,Invivogen）或CpG 2216（200nM,Invivogen）刺激，及用如在实施例1中描述的IVIG和唾液酸富集的（即.E1和E2级分）或耗竭的（即-SNA）IVIG，或对应的F(ab’)2或Fc部分以500μg/ml浓度的IgG或等摩尔量的F(ab’)2和Fc片段（333μg/ml F(ab’)2resp.167μg/ml Fc）处理。在20±2h之后收集上清液，及IFN-α由内部ELISA使用如描述的可商购的抗体定量（Santeret al.,(2009)J.Immunol 182,1192-1201）。结果表达为相对于未接收IVIG处理的细胞的IFN-α的抑制百分率。

E2显示炎性标记物相比-SNA IVIG，IVIG和E1，以及总洗脱的+SNA级分的增强的减小。可见，以等摩尔浓度，F(ab’)2制备物给与它们的全IgG对应物约相当的水平的抑制，指示其是具有增加的唾液酸化的Fab部分，其负责更大IFN-α抑制。

【实施例5：使用人单核细胞细胞系U937的Fab唾液酸化对体外抗-炎性活性的效应】

将U937细胞（ATCC）根据由ATCC提供的使用说明培养生长。在用视黄酸（0.5μM）及/或维生素D实验之前一天分化细胞。

由以400×g离心收获分化的U937细胞，及用含有1%人白蛋白的PBS重悬浮。然后将细胞用50～500U干扰素-γ（IFNγ）或0.1～2μg植物凝集素（PHA）刺激。在刺激期间或在添加刺激剂之前将唾液酸增强的（即E1和E2级分）及耗竭的（即-SNA）IVIG和其片段加入细胞。

在于37℃20+/-2h的温育后，通过测量上清液中的炎性标记物由商业ELISA试剂盒或自Becton Dickinson的人炎性细胞因子珠阵列（BD Biosciences）监测刺激。通过使用ELISA试剂盒（Biosource/Demeditec diagnostics）测量IL-8和新蝶呤。

由FACS分析使用荧光标记的抗体（BD Pharmingen）在BD FACSCantoII（BD Bioscience）上定量表面标记物（CD54,CD14,CD45）。

相比未分级的IVIG和-SNA级分，观察到由IVIG的+SNA级分，尤其是由E2级分的炎性标记物的减少。

【实施例6：单核细胞来源的树突细胞（moDC）刺激测定】

【人单核细胞的分离和源于未成熟的单核细胞的树突细胞（iMoDC）的分化】

从含有一个供体的全血捐赠的细胞部分的血沉棕黄层（Blutspendedienst SRK,Bern,CH）由密度离心分离外周血单核细胞（PBMC）。血沉棕黄层在PBS中1/1稀释。将25ml的稀释的血沉棕黄层装于15ml Ficoll Plaque（GE Healthcare Europe GmbH,Otelfingen,CH），及离心35mins（RT,400g,无停止用制动器）。收集及合并含有PBMC的细胞层。在洗涤（在50ml PBS中两次）之后，由磁细胞分选（MACS）使用CD14-MACS珠（Miltenyi Biotech GmbH,Bergisch Gladbach,GER）分离单核细胞。在MACS缓冲剂（PBS,0.5%BSA,2mM EDTA）中取校正数的PBMC（10×需要的单核细胞数），及在冰上（暗）与抗-CD14mAb-包被的MACS珠（80μl/10⁷PBMC;Miltenyi Biotech GmbH）温育20mins。在用MACS缓冲剂洗涤之后（以200g离心10mins），将珠-标记的细胞装于预洗涤的（3ml MACS缓冲剂）LS MACS柱（Miltenyi Biotech GmbH），洗涤（3×用3mlMACS缓冲剂）及在自磁场移出柱之后用5ml MACS缓冲剂冲洗。在用PBS洗涤之后，在含有10%iFCS（Biochrom AG,Berlin,DE），10,000U/ml青霉素和链霉素（Amimed,BioConcept,Allschwil,CH）和10mM HEPES的RPMI-1640中取新鲜分离的单核细胞，及以0.5×10⁶单核细胞/ml的浓度分到24-孔（0.5×10⁶单核细胞/孔（ml））或48-孔板（0.25×10⁶单核细胞/孔（0.5ml））（BD Biosciences）。由FACS分析由CD14染色评定分离的单核细胞的纯度。随后描述FACS分析的细节。

在随后6天期间，单核细胞在50ng/ml GM-CSF（R&D SystemsEurope Ltd.,Abingdon,UK）和20ng/ml重组人IL-4（PeproTech ECLtd.,London UK）的存在下分化为源于未成熟的单核细胞的树突细胞（iMoDC）。在分化期间，每隔一天，移出一半的培养基及由完全补充的（见以上）新鲜培养基取代。在6天之后，由光学显微镜及由FACS分析分析细胞的DC-表型。评定CD14，DC-SIGN（CD209），CD11c和CD1a（自BD Biosciences的全部单克隆Abs）的细胞表面表达。随后描述FACS分析的细节。

【新鲜分离的单核细胞，分化的iMoDC及成熟化的MoDC的FACS分析】

将50μl FACS缓冲剂（PBS,2%iFCS）中的约60,000～100,000细胞用1～2μl的即用mAbs（抗-CD14,CD11c,CD1a,DC-SIGN,HLA-DR,CD80,CD86,CD83,CD64,CD32和CD16;全部Abs是BDBiosciences的直接标记的单克隆Abs）染色，及于4℃（暗）温育30mins。将细胞用PBS洗涤，及在50μl PBS中取，在350μl1×BD CellFix（BDBiosciences）中固定，及于4℃避光存储直到获取。用FACS Calibur获取每样品，10,000细胞，及由BD CellQuest软件（BD Biosciences）分析。

【由免疫复合物的iMoDC的刺激】

将未成熟的(i)MoDC用不同量的IVIG级分（如根据实施例1产生的）和其片段预温育3h。将iMoDC用0.1～100μg/ml LPS刺激。将在24孔板中在完全补充的RPMI（incl.50ng/ml GM-CSF&20ng/mlIL-4）中分化的0.5×10⁶iMoDC，于37℃，5%CO₂与LPS温育24hs。为分析IC-介导的刺激（成熟），实施FACS分析和细胞因子测量。通过经移液洗涤它们自孔底部离开来收获细胞。收集细胞悬浮液及立即在冰上存储。在离心（300g,10mins,4℃）后，收集上清液及于-20℃存储用于随后细胞因子测量。在50μl的FACS缓冲剂（PBS,2%iFCS）中取细胞，和如上述实施FACS分析。测量2种共刺激分子CD80（B7-1）和CD86（B7-2）的细胞表面表达，以及DC-特异性成熟标记物CD83（全部直接标记的mAbs,BD Biosciences）。

【细胞培养上清液中的细胞因子测量】

收集iMoDC-刺激实验的细胞培养上清液及于-20℃存储直到细胞因子测量。根据生产商的使用说明，由自Becton Dickinson的用于人炎性细胞因子细胞计数珠阵列（CBA）（BD Biosciences）测量IL-12p70，IL-10，IL-6，IL-8，TNF-α和IL-1β。

观察到由IVIG的+SNA级分（E1和E2）的炎性标记物的减少，指示就增加的唾液酸化富集的免疫球蛋白的抗-炎性性质。用E2级分效应更显著。可见，以等摩尔浓度，F(ab’)2制备物给与它们的全IgG对应物约相当的水平的抑制，指示其是具有增加的唾液酸化的Fab部分，其负责更大IFN-α抑制。

【实施例7：在EAE小鼠模型中唾液酸化的IVIg相比常规IVIg的有益效应的评定】

IVIG+SNA级分的抗-炎性效应的评定可在自身免疫模型中观察到，和可研究成为基础的机理。在此模型中显示，IVIG通过扩展调控性T细胞来发挥其抗-炎性效应。使用EAE，进行+SNA（E1和E2）Fc，+SNA（E1和E2）F(ab’)₂，+SNA（E1和E2）完整IVIg及未分级的IVIg之间的比较。自第0天到疾病峰或到第5天施用不同剂量的这些制备物。测定临床分值和存活。

EAE的诱导：小鼠C57BL/6J株用于诱导EAE。在动物实验中根据伦理规则实施实验。将10～12周龄雌性小鼠用在含有800μg的非-有活力的干燥的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37RA的CFA（1v/1v）中乳化的200μg MOG_35～55肽（>95%纯度）免疫。200μl的最终体积在胁上的4个位点注射皮下。此外，在同一天和2天后静脉内给300ng的百日咳毒素。每天利用以下评分系统评定EAE的临床体征：0-无迹象；1-尾麻痹；2-后肢虚弱和尾麻痹；3-后肢和尾麻痹；4-后肢和尾麻痹和前肢虚弱；5-患病；6-死亡。从第10天往后和免疫后约21～25天的峰观察到EAE症状，平均临床分值是3。

相比未分级的IVIG，观察到由IVIG的+SNA级分的临床症状的减少，指示就增加的唾液酸化富集的免疫球蛋白的抗-炎性性质。相比用E1级分或总洗脱的级分（+SNA）的对应的剂观察的效应，E2级分的效应是更显著的。

Claims

1.产生具有增强的免疫调节活性的抗体群的方法，包括以下步骤：

（b）任选地收集非-结合抗体群（-SNA级分），

（c）任选地洗涤亲和性基质；

（d）用中性pH的碳水化合物洗脱结合的抗体群（E1级分），

其中E2级分具有相比SNA基质的总洗出液（+SNA级分）增强的免疫调节活性。

2.权利要求1的方法，其中碳水化合物是糖。

3.权利要求2的方法，其中糖是乳糖。

4.权利要求1～3之任一项的方法，其中中性pH是6～8的范围内的pH。

5.权利要求1～4之任一项的方法，其中酸性pH是5以下的pH。

6.权利要求1～5之任一项的方法，其中抗体制备物是自人血浆分离的IgG制备物。

7.权利要求6的方法，其中抗体制备物是自从至少1000个供体合并的人血浆分离的IgG制备物。

8.权利要求7的方法，其中抗体制备物是IVIG或SCIG制备物。

9.权利要求1～8之任一项的方法，其中免疫调节活性通过用于测量抗-炎性活性的体外测定来测定。

10.权利要求9的方法，其中可在步骤e中获得的抗体群（E2级分）的免疫调节活性至少10%大于总结合的及洗脱的级分（+SNA级分）或可在步骤d中获得的抗体群（E1级分）的免疫调节活性。

11.抗体群，其可由权利要求1～10之任一项的方法获得。

12.权利要求11的抗体群，其中在步骤d中可由用中性pH的碳水化合物洗脱获得的级分（E1级分）

（b）具有相比亲和层析之前的抗体制备物至少50%更高的Fab区中总聚糖的唾液酸化。

13.权利要求11的抗体群，其中在步骤e中可由用酸性pH的碳水化合物洗脱获得的级分（E2级分）

（a）具有相比亲和层析之前的抗体制备物或相比步骤d的级分至少20%更高的Fc区中的唾液酸化；和/或

（b）具有相比亲和层析之前的抗体制备物至少50%更高的Fab区中总聚糖的唾液酸化；和/或

（c）具有相比步骤d的抗体群至少5%更高的Fab区中总聚糖的唾液酸化。

14.药物组合物，其包含权利要求11～13之任一项的抗体群，及药学可接受的载体或赋形剂。

15.权利要求11～13之任一项的抗体群，其用作药物。

16.权利要求11～13之任一项的抗体群，其用于炎性病情的治疗或预防。

17.权利要求16的抗体群，其中炎性病情是自身免疫疾病或神经退行性疾病。

18.权利要求17的抗体群，其中自身免疫或神经退行性疾病选自：类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮（SLE），抗磷脂综合征，免疫血小板减少症（ITP），川崎病，Guillain Barré综合征（GBS），多发性硬化（MS），慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病（CIDP），皮肤发疱病，皮肌炎，多发性肌炎，阿尔茨海默病，帕金森病，与唐氏综合征相关的阿尔茨海默病，脑淀粉样血管病，痴呆伴列维小体，额颞叶退化和血管性痴呆。