CN104535381A

CN104535381A - 一种纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法

Info

Publication number: CN104535381A
Application number: CN201410722773.0A
Authority: CN
Inventors: 邹霞娟; 杨彬
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2014-12-02
Filing date: 2014-12-02
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-12-02
Also published as: CN104535381B

Abstract

本发明公开了生物医学纳米材料技术领域的一种纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法。所述纳米壳聚糖衍生物的颗粒大小为1-300nm，固载基质为壳聚糖，该衍生物带有活性羧基官能团，并与过渡金属Ti⁴⁺离子络合。所述的纳米壳聚糖衍生物既含有糖链也含有金属Ti⁴⁺离子，因此能高选择性、特异性地富集和纯化糖基化多肽。此外，纳米壳聚糖衍生物不仅能够富集含有唾液酸的糖基化多肽(如IgG)，而且能富集其他不同糖基的多肽(如HRP)。所述纳米壳聚糖衍生物可用于生物样品中低丰度的糖基化多肽的富集和纯化，用于生物和医学领域，包括临床诊断。

Description

一种纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法

技术领域

本发明属于生物医学纳米材料技术领域，具体涉及一种纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法。

背景技术

翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中研究的热点课题，其中蛋白质的糖基化是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一。蛋白质的糖基化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，新陈代谢，免疫应答，肿瘤发生等。一些糖基化蛋白质作为治疗疾病的相关靶或生物标识物用于癌症的早期检测和鉴定，如癌胚抗原用于检测直肠癌，乳腺癌，前列腺癌和肺癌；CA-125用于检测卵巣癌；专一性前列腺癌胚抗原用于检测前列腺癌；Her2/neu用于检测乳腺癌等。

目前，质谱技术已经发展成为鉴定糖基化蛋白的重要工具之一。但是质谱在鉴定糖基化蛋白时，仍面临巨大的挑战，其具体体现是：第一，糖基化蛋白在细胞内所有蛋白中为低丰度；第二，酶解产物中存在的大量非糖基化多肽的质谱信号通常会淹没糖基化多肽的离子信号。鉴于此，当前国际上的主要研究策略是利用现有技术体系，分离富集糖蛋白质/糖肽，实现大规模高通量蛋白质的糖基化位点的鉴定。

蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即不同的糖链可连于同一位点，同一蛋白质上也可有不同的位点连接不同的糖链。糖基化的不均一性给糖蛋白质的分离分析带来了很大的困难：不同糖型的同一蛋白质会在电泳上呈现弥散的条带，导致信号分散，较低丰度的蛋白质得不到鉴定，造成糖蛋白质在色谱中不能良好的分离。

目前，常用的糖蛋白质分离富集技术有：凝集素亲和技术、肼化学富集法、苯硼酸亲和法、亲水相互作用色谱法等。其中a)凝集素亲和技术对含甘露糖基和N-混多糖的糖蛋白具有较好的亲和作用，但是对二触角的N-多糖糖蛋白的亲和作用较弱，对三，四触角的N-多糖糖蛋白没有亲和作用；b)肼化学富集法需一步氧化反应，从而增加了样品制备时间和样品的复杂性；c)含苯硼酸的材料，对含有N-糖基化和O-糖基化的糖蛋白都具有较好的富集作用，但是对免疫球蛋白的Fc端的糖肽没有富集作用；d)最近开发的金属氧化物TiO₂和Ti-IMAC主要对含有唾液酸的糖基化多肽具有富集作用。

壳聚糖(Chitosan)又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，化学名为2-氨基-β-1,4-葡聚糖，它是甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗肿瘤等优异性能，广泛应用于医药、食品、化工、环保等行业，素有万能多糖的美誉(R.Jayakumar et al.Carbohydrate Polymers 62(2005)142–158)。甲壳素在自然界分布非常广，是一种廉价易得的原料。

在专利ZL 200910086838.6中，报道了含苯硼酸的纳米壳聚糖衍生物、制备方法及其在富集和纯化糖基化多肽/蛋白方面的应用；但是该衍生物对免疫球蛋白(IgG)的Fc端的糖肽没有富集作用。在ZL 200810179716.7中报道了一种纳米壳聚糖衍生物、制备方法及其在富集和纯化磷酸化多肽方面的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法。

本发明所述纳米壳聚糖衍生物为专利ZL 200810179716.7中所述的纳米壳聚糖衍生物，其颗粒大小为1-300nm，固载基质为壳聚糖；该衍生物带有活性羧基官能团，并与过渡金属离子Ti⁴⁺络合。

所述活性羧基官能团选自亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸。

上述纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法，是将酶解后的待分析物溶于上样液中，将其加入到纳米壳聚糖衍生物中进行富集，洗涤后得到选择性吸附有糖基化多肽的纳米壳聚糖衍生物，直接用于质谱分析(例如MALDI-TOF-MS)或洗脱负载的糖基化多肽。

吸附结合的糖基化多肽可用糖解酶将糖基与多肽解离，从上述纳米材料中洗脱下来。

所述上样液为含有80％乙腈和5％三氟乙酸的水溶液，且其中含有一定量的2,5-二羟基甲酸(DHB)、邻苯二甲酸或羟基乙酸等。洗脱负载的糖基化多肽时所用的洗脱溶液为5％～10％的氨水溶液或含有10％～50％乙腈、5％甲酸的水溶液。

酶解时所用的酶为胰酶，蛋白内切酶Glu-C或糜蛋白酶。

待分析物是血清、血浆、体液、组织或细胞裂解液。

此外，将上述纳米壳聚糖衍生物涂在芯片上进行微量的糖基化多肽的富集和纯化，或填充入色谱柱中进行大规模的糖基化多肽的富集和纯化。

本发明的有益效果：本发明的纳米壳聚糖衍生物相对于现有材料而言，所选材料廉价易得，具有良好的生物相容性，性质稳定，颗粒大小为1-300nm，外比表面积大，具有很强的吸附能力，可制膜和填充于色谱柱中，富集糖基化多肽后可直接用于质谱分析，无需脱盐。所述纳米壳聚糖衍生物既含有糖链也含有金属Ti⁴⁺离子，因此该纳米壳聚糖衍生物能高选择性、特异性地富集和纯化糖基化多肽。此外，纳米壳聚糖衍生物不仅能够富集含唾液酸的糖基化多肽(如IgG)，而且能富集不同糖基的多肽(如HRP)。所述纳米壳聚糖衍生物可用于生物样品中低丰度的糖基化多肽的富集和纯化，可用于生物和医学领域，包括临床诊断。

附图说明

图1为纳米壳聚糖衍生物的透射电镜图；由图可以看出，此纳米材料为球型，颗粒大小为20-60nm，外表与金属Ti⁴⁺结合。

图2A为辣根过氧化物酶酶解产物(浓度为2×10^-8M)的MALDI-TOF质谱图；图2B为纳米壳聚糖衍生物对辣根过氧化物酶酶解产物中糖基化多肽富集和纯化的MALDI-TOF质谱图。

图3A为免疫球蛋白(IgG)酶解产物(浓度为2×10^-6M)的MALDI-TOF质谱图；图3B为纳米壳聚糖衍生物对IgG酶解产物中糖基化多肽富集和纯化的MALDI-TOF质谱图；图3C为图3B的放大图；图3D为IgG糖基化多肽用PNGase F去糖基后的MALDI-TOF质谱图。

图4A为β-酪蛋白酶解产物(浓度为1×10^-6M)的MALDI-TOF质谱图；图4B为纳米壳聚糖衍生物对β-酪蛋白酶解产物中磷酸化多肽富集和纯化的MALDI-TOF质谱图。

图5A为β-酪蛋白酶解产物和辣根过氧化物酶酶解产物的MALDI-TOF质谱图；图5B为纳米壳聚糖衍生物对其进行磷酸化多肽和糖基化多肽富集和纯化的MALDI-TOF质谱图。

图6A为β-酪蛋白酶解产物和IgG酶解产物的MALDI-TOF质谱图；图6B为纳米壳聚糖衍生物对其进行磷酸化多肽和糖基化多肽富集和纯化的MALDI-TOF质谱图。

图7为IgG糖基化多肽的结构分析图。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明给予进一步的说明。

实施例1-15为利用纳米壳聚糖衍生物进行富集和纯化糖基化多肽和磷酸化多肽，其中所述纳米材料为本发明的纳米壳聚糖衍生物。

实施例1

辣根过氧化物酶(HRP)的糖基化多肽的富集及其分析

1)样品溶液的制备：25μg辣根过氧化物酶(Sigma)加入10μL含8M尿素，乙二胺四乙酸(EDTA)和10mM磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，在室温振动1小时，再加入40μL 50mM的碳酸氢氨溶液中(pH8.2)，按照与胰蛋白酶的质量比为(40:1)的比例加入胰蛋白酶进行酶解反应，酶解温度控制在37℃，过夜反应，加入2％三氟乙酸(TFA)终止反应。获得的蛋白酶解溶液储存在-80℃冰箱中备用。

2)糖基化多肽的富集和MALDI-TOF质谱分析：将2μL 1×10^-6mM的辣根过氧化物酶酶解溶液溶于100μL上样液中，其中，上样液为含80％乙腈和5％三氟乙酸的水溶液，加入到装有约0.5mg纳米壳聚糖衍生物的EP管中。在30℃，振速为1000rpm下，振动30分钟，离心去上清液，用80％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液洗涤一次即可用于质谱分析。吸取0.5μL上述富集有糖基化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与0.5μL含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图，所有的MALDI-TOF质谱分析是在岛津的AXIMA-CFP plus(KRATOS Analytical,ShimadzuGroup Company)飞行时间质谱仪上完成，N₂脉冲激光的波长为337.1nm，实验中所得数据都在线性正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法，所用标准物为II Bradykinin(fragment 1-7)(M/z 757.3997),血管紧张素肽(Angiotensin II，M/z 1046.5423),[Glu1]-Fibrinopeptide B(M/z 1570.6852)和ACTH(fragment 18-39)(M/z 2465.1989)。所得谱图再用内标法进行校正，所用内标为m/z2533.30和4986.20。

图2A是0.5μL 2×10^-8mM的辣根过氧化物酶酶解所得多肽的质谱图，以CHCA作基质，由图可知，谱图中主要为非糖基化多肽，只能观察到信噪比很低的2个糖基化多肽。图2B是用所述纳米材料对其进行富集后所得质谱图，只有信噪比很高的5个糖基化多肽，说明此纳米材料能特异、高效地富集和纯化低丰度的糖基化多肽，分析结果见下表1。

实施例2

与实施例1的方法相同，其中步骤2)将富集的糖基化多肽用5％～10％的氨水溶液或含有10％～50％乙腈、5％甲酸的水溶液进行洗脱，浓干，加入2μL 0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，吸取0.5μL含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液点在靶板上，加入0.5μL上述含糖基化多肽的溶液混合，进行MALDI-TOF质谱分析。

实施例3

与实施例2的方法相同，其中所用质谱仪为nano-LC-ESI-MS，按本领域的常规方法进行。

实施例4

血液中的免疫球蛋白(IgG)的糖基化多肽的富集及其分析

1)血液中的免疫球蛋白(IgG)的制备：将1μL的血清用12％的SDS-PAGE胶进行分离，对IgG的条带进行胶内酶切，所用酶为胰蛋白酶。

2)糖基化多肽的富集和MALDI-TOF质谱分析：将2μL 1×10^-6mM的IgG酶解溶液溶于100μL上样液中，其中，上样液为含80％乙腈和5％三氟乙酸的水溶液，加入到装有约0.5mg纳米壳聚糖衍生物的EP管中。在30℃，振速为1000rpm下，振动30分钟，离心去上清液，用80％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液洗涤一次，再用50％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液洗涤一次即可用于质谱分析。吸取0.5μL上述富集有糖基化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图。

加入10μL10mM的碳酸氢铵溶液和5单位的肽-N-糖苷酶(PNGase F)，温度控制在37℃，过夜反应，离心，收集上清液，再加入10μL50％乙腈和0.1％甲酸的水溶液洗涤一次，离心，收集上清液。合并上清液，浓干，加入5μL50％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，用于质谱分析。所有的MALDI-TOF质谱分析是在岛津的AXIMA-CFP plus(KRATOS Analytical,Shimadzu Group Company)飞行时间质谱仪上完成，N₂脉冲激光的波长为337.1nm，实验中所得数据都在线性正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法，所用标准物为IIBradykinin(fragment 1-7)(M/z 757.3997),血管紧张素肽(Angiotensin II，M/z 1046.5423),[Glu1]-Fibrinopeptide B(M/z 1570.6852)和ACTH(fragment 18-39)(M/z 2465.1989)。

图3A是0.5μL 2×10^-6mM的IgG酶解所得多肽的质谱图，以CHCA作基质，由图可知，谱图中主要为非糖基化多肽，只能观察到2个信噪比很低的糖基化多肽。图3B是用所述纳米材料对其进行富集后所得质谱图，只有信噪比很高的19个糖基化多肽，图3C是其放大图，图3D是糖基化多肽去糖基后所得质谱图。说明此纳米材料能特异、高效地富集和纯化低丰度的糖基化多肽，分析结果见下表1。图7为IgG糖基化多肽的结构分析图。

实施例5

与实施例4的方法相同，其中步骤2)将富集的糖基化多肽用5％～10％的氨水溶液或含有10％～50％乙腈、5％甲酸的水溶液进行洗脱，浓干，加入2μL 0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，吸取0.5μL含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液点在靶板上，加入0.5μL上述含糖基化多肽的溶液混合，进行MALDI-TOF质谱分析。

实施例6

与实施例5的方法相同，其中所用质谱仪为nano-LC-ESI-MS，按本领域的常规方法进行。

实施例7

磷酸化多肽的富集及其分析

1)样品溶液的制备：1mgβ-酪蛋白(Sigma,纯度为90％)溶于1mL 50mM的碳酸氢氨溶液中(pH8.2)，按照与胰蛋白酶的质量比为(40:1)的比例加入胰蛋白酶进行酶解反应，反应时间为6小时，酶解温度控制在37℃，加入2％三氟乙酸(TFA)终止反应。获得的蛋白酶解溶液储存在-80℃冰箱中备用。

2)磷酸化多肽的富集和MALDI分析：将2μL 2*10^-6mM的β-酪蛋白酶解溶液溶于198μL上样液中，其中，上样液为含80％乙腈和5％三氟乙酸的水溶液，加入到装有约0.5mg纳米壳聚糖衍生物的EP管中。在30℃，振速为1000rpm下，振动30分钟，离心去上清液，用80％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液洗涤一次即可用于质谱分析。吸取0.5μL上述富集有磷酸化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(20mg/mL)基质溶液混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图。所有的MALDI-TOF质谱分析是在岛津的AXIMA-CFP plus(KRATOS Analytical,Shimadzu Group Company)飞行时间质谱仪上完成，N₂脉冲激光的波长为337.1nm，实验中所得数据都在线性正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法，所用标准物为II Bradykinin(fragment 1-7)(M/z 757.3997),血管紧张素肽(Angiotensin II，M/z 1046.5423),[Glu1]-Fibrinopeptide B(M/z 1570.6852)和ACTH(fragment 18-39)(M/z 2465.1989)。所得谱图再用内标法进行校正，所用内标为m/z1031.34,2061.83和3122.27

3)分析结果：图4A是0.5μL 2×10^-6mM的β-酪蛋白酶解溶液所得多肽的质谱图，由图可知，谱图中主要为非糖基化多肽，只能观察到2个信噪比很低的磷酸化多肽。图4B是用所述纳米材料对其进行富集后所得质谱图，由图4B可见有14个磷酸化多肽峰。β-酪蛋白酶解产物中的磷酸化多肽被所用纳米材料捕获，而非磷酸化多肽被洗脱，由于所用的β-酪蛋白纯度为90％，其中含有α-S1-酪蛋白，α-S2-酪蛋白，其酶解产物中的磷酸化多肽，也被此纳米材料富集，其分析结果见下表2，说明此纳米材料能特异、高效地富集和纯化低丰度的磷酸化多肽。

实施例8

与实施例7的方法相同，其中步骤2)将富集的磷酸化多肽用含有5％～10％的氨水进行洗脱，浓干，加入2μL 0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，吸取0.5μL含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液点在靶板上，加入0.5μL上述含糖基化多肽的溶液混合，进行MALDI-TOF质谱分析。

实施例9

与实施例8的方法相同，其中所用质谱仪为nano-LC-ESI-MS，按本领域的常规方法进行。

实施例10

同时富集磷酸化多肽和糖基化多肽及其分析

1)磷酸化多肽和糖基化多肽的富集和MALDI分析：将2μL 1×10^-6mM的辣根过氧化物酶酶解溶液和2μL 2×10^-6mM的β-酪蛋白酶解溶液溶于100μL上样液中，其中，上样液为含80％乙腈和5％三氟乙酸的水溶液，加入到装有约0.5mg纳米壳聚糖衍生物的EP管中。在30℃，振速为1000rpm下，振动30分钟，离心去上清液，用80％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液洗涤一次即可用于质谱分析。吸取0.5μL上述富集有糖基化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图，所有的MALDI-TOF质谱分析是在岛津的AXIMA-CFP plus(KRATOS Analytical,Shimadzu Group Company)飞行时间质谱仪上完成，N₂脉冲激光的波长为337.1nm，实验中所得数据都在线性正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法，所用标准物为II Bradykinin(fragment 1-7)(M/z 757.3997),血管紧张素肽(Angiotensin II，M/z1046.5423),[Glu1]-Fibrinopeptide B(M/z 1570.6852)和ACTH(fragment 18-39)(M/z2465.1989)。所得谱图再用内标法进行校正，所用内标为m/z1031.34和4986.20。

2)分析结果：图5A是0.5μL 2×10^-6mM的β-酪蛋白酶解溶液和1×10^-6mM的辣根过氧化物酶酶解溶液所得多肽的质谱图，由图可知，谱图中主要为非糖基化多肽，只能观察到2个信噪比很低的磷酸化多肽。图5B是用所述纳米材料对其进行富集后所得质谱图，由图5B可见有15个磷酸化多肽峰和4个糖基化多肽。说明此纳米材料能特异、高效地富集和纯化低丰度的磷酸化多肽和糖基化多肽。

实施例11

与实施例10的方法相同，其中步骤1)将富集的糖基化多肽用含有10％乙腈和5％甲酸的水溶液洗脱两次，合并浓干，加入2μL 0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，吸取0.5μL含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液点在靶板上，加入0.5μL上述含糖基化多肽的溶液混合，进行MALDI-TOF质谱分析。再对纳米材料用5％～10％的氨水进行洗脱，浓干，加入2μL 0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，吸取0.5μL含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液点在靶板上，加入0.5μL上述含磷酸化多肽的溶液混合，进行MALDI-TOF质谱分析。这样可实现对富集的磷酸化多肽和糖基化多肽的分离。

实施例12

与实施例11的方法相同，其中所用质谱仪为nano-LC-ESI-MS，按本领域的常规方法进行。

实施例13

同时富集磷酸化多肽和糖基化多肽及其分离分析

1)磷酸化多肽和糖基化多肽的富集的富集和MALDI分析：将10μL 1×10^-6mM的IgG酶解溶液和2μL 2×10^-6mM的β-酪蛋白酶解溶液溶于100μL上样液中，其中，上样液为含80％乙腈和5％三氟乙酸的水溶液，加入到装有约0.5mg纳米壳聚糖衍生物的EP管中。在30℃，振速为1000rpm下，振动30分钟，离心去上清液，用80％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液洗涤一次,离心去上清液。

加入10μL10mM的碳酸氢铵溶液和5单位的肽-N-糖苷酶(PNGase F)，温度控制在37℃，过夜反应，离心，收集上清液，再加入10μL50％乙腈和0.1％甲酸的水溶液洗涤一次，离心，收集上清液。合并上清液，浓干，加入5μL50％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，用于质谱分析。纳米材料用50％乙腈和2％三氟乙酸的水溶液洗涤一次，用20μL 10％氨水溶液洗脱磷酸化多肽，收集上清液，浓干，加入5μL50％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，用于质谱分析。所有的MALDI-TOF质谱分析是在岛津的AXIMA-CFP plus(KRATOS Analytical,Shimadzu Group Company)飞行时间质谱仪上完成，N₂脉冲激光的波长为337.1nm，实验中所得数据都在线性正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法，所用标准物为IIBradykinin(fragment 1-7)(M/z 757.3997),血管紧张素肽(Angiotensin II，M/z 1046.5423),[Glu1]-Fibrinopeptide B(M/z 1570.6852)和ACTH(fragment 18-39)(M/z 2465.1989)。所得谱图再用内标法进行校正，所用内标为m/z1031.34和2957.78。

2)分析结果：图6A是0.5μL 2×10^-6mM的β-酪蛋白酶解溶液和5×10^-6mM的IgG酶解溶液所得多肽的质谱图，由图可知，谱图中无糖基化多肽和磷酸化多肽，图6B是用所述纳米材料对其进行富集后所得质谱图，由图6B可见有15个磷酸化多肽峰和19个糖基化多肽。说明此纳米材料能特异、高效地富集和纯化低丰度的磷酸化多肽和糖基化多肽。

实施例14

与实施例13的方法相同，其中步骤1)将富集的糖基化多肽用含有10％乙腈和5％甲酸的水溶液洗脱两次，合并浓干，加入2μL 0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，吸取0.5μL含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液点在靶板上，加入0.5μL上述含糖基化多肽的溶液混合，进行MALDI-TOF质谱分析。再对纳米材料用5％～10％的氨水进行洗脱，浓干，加入2μL 0.1％三氟乙酸的水溶液溶解，吸取0.5μL含1％H₃PO₄和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液点在靶板上，加入0.5μL上述含磷酸化多肽的溶液混合，进行MALDI-TOF质谱分析。这样可实现对富集的磷酸化多肽和糖基化多肽的分离。

实施例15

与实施例14的方法相同，其中所用质谱仪为nano-LC-ESI-MS，按本领域的常规方法进行。

表1检测到的糖基化多肽序号、氨基酸序列、糖基化数位点数及理论分子量

其中，糖基化位置以下划线表示。

表2检测到的磷酸化多肽序号、氨基酸序列、磷酸化数位点数及理论分子量(其中磷酸化位置以下划线表示，β-C表示β-酪蛋白，α-S1和α-S2表示α-S酪蛋白)

^a磷酸化多肽为[M+Na]⁺；^b为双电荷峰。

Claims

1.一种纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：将酶解后的待分析物溶于上样液中，然后加入到纳米壳聚糖衍生物中进行富集，洗涤后得到选择性吸附有糖基化多肽的纳米壳聚糖衍生物，直接用于质谱分析或洗脱负载的糖基化多肽；所述纳米壳聚糖衍生物的颗粒大小为1-300nm，固载基质为壳聚糖；该衍生物带有活性羧基官能团，并与过渡金属离子Ti⁴⁺络合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上样液为含有80％乙腈和5％三氟乙酸的水溶液，且其中含有DHB、邻苯二甲酸或羟基乙酸；洗脱负载的糖基化多肽时所用的洗脱溶液为5％～10％的氨水溶液或含有10％～50％乙腈、5％甲酸的水溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶解时所用的酶为胰酶、蛋白内切酶Glu-C或糜蛋白酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将上述纳米壳聚糖衍生物涂在芯片上进行微量的糖基化多肽的富集和纯化，或填充入色谱柱中进行大规模的糖基化多肽的富集和纯化。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中待分析物是血清、血浆、体液、组织或细胞裂解液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性羧基官能团选自亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸。