JP2009504569A - 向上した治療活性をもつ方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
Wright,A.とMorrison,S.L.、Trends Biotech.15:26−32(1997) Stockert,R.J.(1995)Physiol.Rev.75、591−609 Lifely,M.R.ら、Glycobiology 5:813−822(1995) Jefferis,R.ら、Immunol Rev.163:59−76(1998) Raju,T.S.ら Glycobiology 2000.10(5):477−86 Presta L.2003.Curr Opin Struct Biol.13(4):519−25 Idusogie EEら 2000.J Immunol.15:164(8):4178−84 Boydら、1995 WrightとMorrison(1998) Wrightら、2000 Mimuraら(2000) Lundら、1996 上記 Jassalら、2001 Biochem Biophys Res Comm 286:243−249
本発明は、Fc含有分子、とりわけ抗体治療薬の体液性および細胞性免疫機能の至適化方法を含んでなる。
略語
α1,3GT、α−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ;α2,3ST、α−2,3−シアリルトランスフェラーゼ;β1,4GT、β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ;ADCC、抗体依存性細胞傷害;ATCC、American Type Culture Collection;BATDA、ビス(アセトキシメチル)2,2’:6,2”−テルピリジン−y,y”−ジカルボキシレート;BSA、ウシ血清アルブミン;CD培地、既知組成培地;CDC、補体依存性細胞傷害;CMP−Sia、シチジン一リン酸N−アセチルノイラミン酸;DMEM、ダルベッコ変法イーグル培地;E:T、エフェクター細胞対標的細胞比:FBS、ウシ胎児血清;ESI−MS、エレクトロスプレーイオン化質量分析。NK細胞、ナチュラルキラー細胞;IgG、免疫グロブリンG;IMDM、イスコフ変法ダルベッコ培地;MALDI−TOF−MS、マトリックス支援レーザー/脱離イオン化飛行時間質量分析;MHX、ミコフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチン;NANA、シアル酸のN−アセチルノイラミン酸異性体;NGNA、シアル酸のN−グリコリルノイラミン酸異性体;PBMC、末梢血単核細胞;PBMC、末梢血単核細胞;PBS、リン酸緩衝生理的食塩水;PNGアーゼF、ペプチドNグリコシダーゼF;RP−HPLC、逆相高速液体クロマトグラフィー;RT、室温;Sia、シアル酸;UDP−Gal、ウリジン二リン酸ガラクトース;UDP−GlcNAc、ウリジン二リン酸N−アセチルグルコサミン。
本明細書で使用されるところの「アフィニティー」という用語は、その同族の結合パートナーに対する単純な一価リガンドの結合定数(例えば抗原若しくはエピトープに対するFabの結合)の尺度であることを意図している。アフィニティーは、限定されるものでないが、例えばプラズモン共鳴(BiaCore)によりオンおよびオフ速度(それぞれkonおよびkoff)を測定することを包含するいくつかの方法で測定し得、そして全体会合(Kass)若しくは解離定数(KD)(ここでKassはkon/koffでありかつKDはkoff/konである)として表し得る。KDは、例えば結合パートナーへのリガンドの結合が半飽和である濃度を測定することにより経験的にもまた測定しうる。KDの別の測定方法は、1種の結合体若しくはリガンドを標識(labeled)若しくは標識(tagged)しかつ一定濃度で保持する一方、試験結合体若しくはリガンドを変動する濃度で添加して、競合してその同族の結合パートナーから標識物質を離す競合アッセイ、および標識が半分だけ減少される濃度を決定することによる。
Fcオリゴ糖のシアリル化のレベルがFcγ受容体に対する組換え産生された治療的抗体のアフィニティーを変えて前記抗体の生物学的作用の多様な局面の調節をもたらすことが、予期せぬことに見出された。より具体的には、高度にシアリル化されたAbが、低アフィニティー受容体FcγRIIA(CD32A)およびFcγRIIIA(CD16A)に対する有意に低下されたアフィニティーを有し、また、FcγRIIIAが関連受容体であると考えられているin vitro ADCCアッセイで有意に低下された活性を有することが発見された。高度にシアリル化されたAbが、高アフィニティーFcγ受容体FcγRI(CD64)に対する増大されたアフィニティーを有すること、および、完全にシアリル化されたFc含有タンパク質が、アシアリル化若しくは部分的シアリル化Fc含有タンパク質に比較して短縮された血清半減期を有することがさらに発見された。
シアル酸含量が異なる特定のFc含有タンパク質の下位ロットを製造するための1アプローチは、シアリル化およびアシアリル化双方の分子を包含する不均質なFcオリゴ糖とFc含有タンパク質調製物を一緒にし、そして、シアリル化およびアシアリル化オリゴ糖に対する差別的アフィニティーを有する固定されたレクチンを含有するカラムにそれを通すことである。結合しない通過物(T、through)すなわちカラム未結合画分を結合画分(B、bound)から分離し得、後者は溶出緩衝液がカラムを通過する間に収集される。弱結合画分すなわちカラム停滞画分(R、retarded)を、例えば、元のサンプル緩衝液でのカラムの継続的洗浄の間に溶出するFc含有タンパク質を収集することにより別個に収集することもまた可能でありうる。使用されるレクチンに依存して、非結合画分は、結合する画分より高い若しくはより低いシアル酸含量を有しうる。
シアル酸含量が異なるFc含有タンパク質の下位ロットを製造するための代替の一アプローチは、Fc含有タンパク質調製物の一部分をシアリダーゼ酵素で処理してそれによりシアル酸を除去することである。生じるアシアリル化物質を、生物学的活性の差違について、元の部分的シアリル化物質と比較し得る。元のFc含有タンパク質ロット中のシアル酸含量が高いほど、生物学的活性のいずれかの差違を検出する機会が多くなる。例えば、元のタンパク質調製物中のFcオリゴ糖の10%のみがシアル酸を含有した場合、オリゴ糖の0〜1%がシアル酸を含有する場合にシアリダーゼ処理後の生物学的活性の差違を検出することが困難でありうる。シアリダーゼ処理の前および後のFc含有タンパク質の生物学的活性を比較することは、シアリダーゼ処理がフコシル化およびアフコシル化オリゴ糖の異なる分布をもたらす場合に、より困難になることができる。フコースレベルは、ヒトFcγRIIIAに対するアフィニティーおよびADCC活性のようなある種の生物学的活性に対する顕著な影響を有するからである。例えば、オリゴ糖の30%から0%までのシアル酸含量の低下が、5%から15%まで増大するアフコシル化オリゴ糖の比率をもたらす場合には、ADCC活性の差違をシアル酸含量の低下のみに帰することが可能でないことができる。フコシル化およびアフコシル化オリゴ糖の相対比率に対するシアリダーゼ処理のこうした影響は、シアル酸残基を除去するためのシアリダーゼでの処理の前のフコシル化およびアフコシル化オリゴ糖のシアリル化の差違により可能である(そして観察されている)。
シアル酸バリアントを含有するオリゴ糖の構造の特徴付けのため、抗体調製物を包含する糖タンパク質調製物をペプチド−N−グリコシダーゼFで処理してN結合したオリゴ糖を遊離させた。酵素ペプチド−N−グリコシダーゼF(PNGアーゼF)はアスパラギンに結合したオリゴ糖を切断する。遊離されたオリゴ糖を、記述されるとおり(Anumula,K.R.とDhume ST Glycobiology.1998 Jul;8(7):685−94を参照されたい)アントラニル酸(2−アミノ安息香酸)で蛍光標識し、精製しかつHPLCにより分析した。図3に示されるとおり、クロマトグラム中でG0、G1、G2、G2S1およびG2S2として分離されるオリゴ糖を検出かつ定量し得る。グリカンを天然に欠く、またはグリカンが化学的若しくは酵素的に奪われたアグリコシル化種をGnoと称する。
Fc含有タンパク質を、数種の公知のin vitroアッセイにより機能性について比較し得る。とりわけ、Fcγ受容体のFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIファミリーのメンバーに対するアフィニティーは興味深い。これらの測定は、組換えの可溶性の形態の受容体若しくは細胞と会合した形態の受容体を使用して行い得る。加えて、FcRn(IgGの延長された循環半減期の原因である受容体)に対するアフィニティーは、例えば組換えの可溶性FcRnを使用するBIAcoreにより測定し得る。ADCCアッセイおよびCDCアッセイのような細胞に基づく機能アッセイは、特定のバリアントの構造のありそうな機能の結果への洞察を提供する。一態様において、ADCCアッセイは、一次エフェクター細胞として作用するNK細胞を有するよう構成され、それによりFcγRIIIA受容体に対する機能の影響を反映する。食作用アッセイもまた、スーパーオキシド若しくは炎症メディエーター遊離のような細胞応答を測定するアッセイがし得るように、多様なバリアントの免疫エフェクター機能を比較するのに使用しうる。
天然に多価である抗体を、標的タンパク質への結合の多様なパラメータを決定するために試験し得る。見かけのKdを決定するための慣習的一形式はELISA(酵素結合免疫吸着検定法)若しくはRIA(ラジオイムノアッセイ)である。「ELISA」は、間接検出法を使用して固体支持体上で実施される結合アッセイを意味するために一般に使用されるようになった。一般に、ELISAでは、可溶性被検体を、固相反応体に特異的に結合した後に溶液から除去する。該方法で、固相反応体は、抗原若しくは抗体をプラスチック製マイクロタイタープレートに吸着させることにより調製し;他の方法では、固相反応体は細胞に会合した分子である。全部のプロトコルで、固相試薬を、酵素に共有結合させた二次若しくは三次反応体とインキュベートする。未結合の複合物を洗浄することにより除去し、そして色素生産若しくは蛍光発生基質を添加する。結合された酵素複合物により基質が加水分解される際に、着色した若しくは蛍光の生成物が生成される。最後に生成物を視覚的に若しくはマイクロタイタープレートリーダーで検出する。生成されるシグナルの強度は試験混合物中の当初の被検体の量に比例する。
治療的Fc含有タンパク質の消失および従って薬物動態における抗体グリコシル化の役割は最低限と思われ;循環からのIgG除去の原因であると考えられる新生児Fc受容体(FcRn)への結合は、抗体のFc部分のN結合したオリゴ糖の欠如により破壊されないようである。
Fc含有タンパク質の製造に関与する多様な方法が、シアル酸を包含するFcオリゴ糖構造に影響し得る。一態様において、上昇された熱処理(例えば56℃30分間)に以前にかけられなかった血清、例えばウシ胎児血清(FBS)の存在下で、Fc含有タンパク質を分泌する宿主細胞を培養する。これは、それらの細胞から分泌されるFc含有タンパク質からシアル酸を除去し得る活性のシアリダーゼ酵素の血清中での天然の存在により、シアル酸を含有しないか若しくは非常に少量のシアル酸を含有するFc含有タンパク質をもたらし得る。別の態様において、それが望ましいかもしれない場合に応用(例えば治療的適応症)のためより高レベルのシアル酸をFc含有タンパク質が有するような、上昇された熱処理にかけられてそれによりシアリダーゼ酵素を不活性化させた血清の存在下、または血清若しくはシアリダーゼ酵素を含有しうる他の培地成分の非存在下のいずれかで、Fc含有タンパク質を分泌する細胞を培養する。
本明細書に記述されるとおり、組換えFc含有タンパク質若しくはモノクローナル抗体の発現に選ばれる宿主細胞は、免疫グロブリンCH2ドメイン中のタンパク質を装飾するオリゴ糖部分の組成の変動を制限なしに包含する最終組成への重要な寄与因子である。従って、本発明の一局面は、所望の治療的タンパク質を発現する産生細胞の使用および/若しくは開発のための適切な宿主細胞の選択を伴う。
本出願に記述される抗体は、限定されるものでないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類を挙げることができるいずれかの哺乳動物若しくはそれらのいずれかの組み合わせを包含し得るか若しくはそれらに由来し得、そして、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化および/若しくはCDR移植抗インテグリン抗体、免疫グロブリン、切断生成物、ならびにそれらの他の指定される部分およびバリアントを包含する。本発明は、当該技術分野で既知であるものと組合せられるところと一緒に本明細書に記述されるところの、抗体をコードする若しくは相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、装置、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、ならびにそれらの作成および使用方法にもまた関する。
本明細書に記述される宿主細胞は、前記抗体のオリゴ糖含有物中の規定されたシアル酸含量をもつ特定の抗体を産生することが可能な宿主細胞を含んでなる。
MAA(イヌエンジュ(Maackia amurensis)アグルチニン)若しくはWGA(コムギ胚芽アグルチニン)に複合させたアガロースビーズはVector Labs若しくはEY Labsいずれかから購入した。試験抗体Ab1はヒトTNFを結合する完全にヒトのモノクローナル抗体である。20mM CaCl2および20mM MgCl2を含有する20mMトリス−HCl緩衝液(pH7.0)中のAb1(約1〜10mg)を、MAA−アガロース若しくはWGA−アガロースカラムで分画した。MAA−アガロースカラムに結合したAb1を0.5%酢酸で溶離し、1Mトリス−HCl(pH7.0)で中和し、そしてその後PBSに緩衝液交換した。この物質をAb1 MAABと称した。
精製した抗体サンプルを、酵素的方法を介してガラクトシル化するため、Sigma Chemical Co.(ミズーリ州セントルイス)から得たウシβ−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ(β1,4GT)およびUDP−Galを酵素サンプルに添加する。組換えラット肝α−2,3−シアリルトランスフェラーゼ(α2,3ST)、組換えα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α1,3GT)およびCMP−SiaはCalbiochem(カリフォルニア州サンディエゴ)から得た。PNGアーゼFはNew England Biolabs(マサチューセッツ州ビバリー)若しくはProzyme(カリフォルニア州サンレアンドロ)若しくはSelectin BioSciences(カリフォルニア州プレザントヒル)から得た。肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)からのβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルコサミニダーゼはProZyme若しくはSelectin BioSciencesいずれかから得た。ウシ腎からのβ−ガラクトシダーゼおよび全部の他の酵素はProZyme若しくはSelectin BioSciencesいずれかからであった。NAP−5およびHiTrapプロテインAカラムはPharmacia Biotech(ニュージャージー州ピスカタウェイ)からであった。全部の他の試薬は分析等級のものであった。
エフェクター細胞上のFc受容体のいくつかの型のうち、Fcgamma型IIおよびIIIは低若しくは中程度のアフィニティーの受容体とみなされる。一般に、単量体結合は検出されるには低すぎるアフィニティーのものでありうるか、若しくは非常に低レベルで検出されうる。例えば、Fcgamma型IIAへの単量体IgGの結合は測定することがより困難である。これらの受容体は免疫複合体を結合するように機能し、それら複合体は、それらの多価の性質により、おそらく該複合体の遅いオフ速度によりより貪欲に結合する。
抗TNF Abの標的細胞は、成熟TNFのアミノ酸1−12の欠失の導入により膜貫通形態に留まる、その表面上で組換えヒトTNFを安定に発現するSp2/0マウス骨髄腫細胞株を含んだ(Perezら、1990)。K2細胞を、熱不活性化FBS、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸およびMHXを含有するイスコフ培地中で培養した。培地および補充物はGibco(Invitrogen)から購入した。細胞は2〜3日ごとに1:5で継代した。アッセイ日にK2細胞を遠心分離しかつPBSで1回洗浄した。細胞を培地で約1×106細胞/mlに調節し、そして15マイクロリットルのBATDA蛍光標識試薬(Delfia EuTDA細胞傷害性試薬キット、Perkin−Elmer Life Sciences中)を5mlの細胞に添加した(Blombergら、1996)。細胞を37℃で30分間インキュベートし、その後PBSで1000rpm、5分で2回洗浄した。PBMCエフェクター細胞と混合する直前に、標的細胞を遠心分離し、そして1%BSAを含有するイスコフ培地に2×105細胞/mlで再懸濁した。
高アフィニティーヒトFc受容体FcγRI(CD64)へのシアル酸含量の異なった試験Abの結合を、ヒト単球細胞株U−937細胞で競合結合形式を使用して測定した。U−937細胞を、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび10%FBSを含むRPMI 1640培地中、Tフラスコ中で培養し、そして37℃で5%CO2を含むインキュベータ中で維持した。マウス/ヒトIgG1キメラAb、Ab2を、IODO−Gen前被覆ヨウ化チューブを使用して17.2mCi/mgの比活性までヨウ化した。U−937細胞を6×106細胞/mlで新鮮培地に再懸濁し、そしてその後、ウェルあたり3×105細胞の密度でフィルター付きMillipore 96ウェル組織培養プレートに播種した。細胞はより高いFcγR発現を誘導するために前処理しなかった。ヨウ化Ab2を、50μlの容量中で、希釈剤として培地を使用して、変動する量の未標識Mab競合体(試験サンプル)と前混合した。混合物をその後、0.2ng/mlの最終のヨウ化Ab2濃度を生じるように、U−937細胞の50μl培養物に添加した。細胞をその後4℃で16時間インキュベートした。培地で洗浄することおよびプレート真空装置を使用して3回吸引することにより未結合IgGを除去した。細胞に結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
本実施例において、マウス骨髄腫細胞中で発現される抗体可変領域配列ならびにヒトIgG1ヒンジ、CH2およびCH3ドメインに融合されたN末端ペプチドを含んでなるFc含有融合タンパク質を、完全にシアリル化された(G2S2)形態を形成するよう処理した。正常雌性CD1ラット(処置群あたり4匹)に、5%シアリル化されたFcオリゴ糖を含有した未改変の形態のFcP1の静脈内注入を与えたか、若しくは完全シアリル化バージョン(約98%シアリル化)を雌性CD1ラットの群に別個に静脈内注入したかのいずれかであった。1時間、5時間、24時間、72時間、7日、14日および21日に後眼窩採血により血液を収集し、そしてその後、CO2麻酔した動物から心穿刺により第28日に終末部血液収集物を採取した。血液サンプルから血清を調製し、そして血清中のヒトFcの濃度を比色ELISAを使用して測定した。簡潔には、96ウェルEIAプレートをポリクローナルヤギ抗ヒトFc抗体で最初に被覆した。血清サンプルの変動する希釈をウェル中室温で1時間インキュベートした。洗浄することにより未結合タンパク質を除去し、そして、結合したヒトFcを、酵素複合ヤギ抗ヒトIgG抗体、次いで適切な色基質を使用して検出した。
本明細書に記述される結果は、Fcドメイン(二量体化したヒンジ−CH2−CH3)のFcグリカンのシアル酸含量の変化がタンパク質全体に影響することができるという理論を裏付ける。抗体およびグリコシル化Fcを含んでなる融合タンパク質の二価性に関して、該影響は特異的標的に対するタンパク質のアビディティーに明示されうる。本実施例の実験は、この理論を試験し、そしてさらに標的結合アフィニティーに対するシアル酸含量の特定の影響を示すために実施した。
ADCCアッセイで使用した同一のAg発現標的細胞を用い競合形式で実施した抗原結合実験は、予期しないことに、Ab1−29がAb1−20より約3倍より小さいアフィニティーで細胞表面抗原を一貫して結合することを示した(図10A)。Ab5−26は、対照的にAb5−0と識別不可能であったアフィニティーを示した(図10B)。2対のレクチン由来バリアントを用いて実施した同一の分析は、Ab1の天然バリアントに類似の結果を示した。すなわち、より多くシアリル化されたAb1−WGA−41は、同一程度の競合結合を達成するために、より少なくシアリル化されたAb1−WGA−29より4ないし6倍より高濃度で必要とされ(図10C)、また、より多くシアリル化されたAb2−GT−WGA−67は、より少なくシアリル化されたAb2−GT−WGA−5より4ないし6倍より高濃度で必要とされた(図10D)。
Claims (48)
- Fc領域中のオリゴ糖のシアリル化を変えることを含んでなる、Fc含有分子の特性の制御方法。
- シアリル化がFc領域中で増大される、請求項1に記載の方法。
- 制御される特性が、FcγRI、FcγRIIAおよびFcγRIIIA受容体の1種若しくはそれ以上に対するアフィニティー、ADCC活性、マクロファージ若しくは単球活性化、血清半減期ならびにアビディティーよりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- シアリル化が、酵素処理、分子の酵素的改変、分子の遺伝子操作、レクチンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、タンパク質の発現に使用される細胞株を変えること、Fc含有タンパク質を産生するのに使用される宿主細胞を血清中で培養すること、およびタンパク質を多様なpH環境に曝露することよりなる群から選択される最低一の方法により野生型Fc領域から変えられている、請求項1に記載の方法。
- 酵素処理がシアリダーゼ若しくはシアリルトランスフェラーゼで処理することを含んでなる、請求項4に記載の方法。
- Fc含有分子が標的に特異的な結合ドメインを有し、前記標的が固定された標的である、請求項1に記載の方法。
- Fc含有分子が標的に特異的な結合ドメインを有し、前記標的が細胞の表面上に発現される、請求項1に記載の方法。
- Fc含有分子が抗体である、請求項1に記載の方法。
- G2S2糖形態のものでないFc含有治療的タンパク質を、実質的にG2S2シアリル化糖形態のものであるオリゴ糖に転化することを含んでなる、Fc含有治療的タンパク質のCH2免疫グロブリンドメイン中のアスパラギン残基に共有結合された二分岐オリゴ糖を有することを特徴とするFc含有治療的タンパク質の特性の制御方法。
- 前記Fc含有タンパク質が、G2S2糖形態のものでない同一のFc含有治療的タンパク質に比較して、FcγRIIAおよびFcγRIIIAに対する低下されたアフィニティー、NK細胞媒介性のADCCアッセイにおける低下された活性、FcγRIに対する高められたアフィニティー、マクロファージを活性化する高められた能力、ならびにより短い血清半減期よりなる群から選択される特性の1種若しくはそれ以上を有する、請求項9に記載の方法。
- 転化段階が、組換え発現されたモノクローナル抗体を酵素的に工作すること、クロマトグラフィーを使用して特定の糖形態を濃縮すること、シアリルトランスフェラーゼを使用してシアル酸残基を付加すること、および該タンパク質の発現に使用される細胞株を変更することの最低1つを含んでなる、請求項9に記載の方法。
- クロマトグラフィーが、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー若しくはサイズ排除クロマトグラフィーを含んでなる、請求項11に記載の方法。
- 遺伝子工作がグリコシルトランスフェラーゼを組み込む、請求項12に記載の方法。
- G2S2糖形態のFc含有治療的タンパク質を実質的にG2、G1若しくはG)のシアリル化されていない糖形態のものであるオリゴ糖に転化することを含んでなる、Fc含有治療的タンパク質のCH2免疫グロブリンドメイン中のアスパラギン残基に共有結合された二分岐オリゴ糖を有することを特徴とするFc含有治療的タンパク質の特性の制御方法。
- 前記Fc含有タンパク質が、実質的にシアリル化されたG2S2糖形態の同一のFc含有治療的タンパク質に比較して、FcγRIIAおよびFcγRIIIAに対する高められたアフィニティー、NK細胞媒介性のADCCアッセイにおける高められた活性、FcγRIに対する低下されたアフィニティー、マクロファージを活性化する低下された能力、ならびにより長い血清半減期よりなる群から選択される特性の1種若しくはそれ以上を有する、請求項14に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれかに記載の方法により製造若しくは変更されたFc含有タンパク質。
- 実質的にG2S2シアリル化糖形態のものであるFc含有治療的タンパク質のCH2免疫グロブリンドメイン中のアスパラギン残基に共有結合された二分岐オリゴ糖を有することを特徴とする、Fc含有治療的タンパク質であって、前記Fc含有タンパク質が、実質的にシアリル化されていないG0、G1若しくはG2糖形態の同一のFc含有治療的タンパク質の調製物に比較して、FcγRIIAおよびFcγRIIIAに対する低下されたアフィニティー、NK細胞媒介性のADCCアッセイにおける低下された活性、FcγRIに対する高められたアフィニティー、マクロファージを活性化する高められた能力、およびより短い血清半減期を有する、上記タンパク質。
- 該タンパク質の標的結合ドメインにより結合される標的が固定された標的である、請求項17に記載のタンパク質。
- 該タンパク質の結合ドメインにより結合される標的が細胞の表面上で発現される、請求項17に記載のタンパク質。
- タンパク質が、腫瘍学関連障害、慢性疾患若しくは感染性疾患の処置に指示される、請求項17〜19のいずれか1つに記載のタンパク質。
- 感染性疾患が、ウイルスおよび細菌の一方若しくは双方を含んでなる抗体にオプソニン化された細胞若しくは粒子のFcR媒介性の消失、ならびに長期処置を必要とする慢性疾患を伴う、請求項20に記載のタンパク質。
- タンパク質が、組換え発現されたモノクローナル抗体を含んでなり、該抗体がシアリルトランスフェラーゼを使用して酵素的に改変されるか、レクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用して特定の糖形態が濃縮されているか、若しくはシアリダーゼを使用してシアル酸残基が除去されている、請求項17に記載のタンパク質。
- タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの1種若しくはそれ以上を使用して精製された、組換え発現されたモノクローナル抗体である、請求項17に記載のタンパク質。
- アフィニティークロマトグラフィーがレクチンアフィニティークロマトグラフィーである、請求項23に記載のタンパク質。
- タンパク質が、シアリル化若しくはアシアリル化モノクローナル抗体の高められたレベルを有する、遺伝子的に工作された宿主細胞中で発現されたモノクローナル抗体である、請求項17に記載のタンパク質。
- 実質的にシアリル化されていないG0、G1若しくはG2糖形態にあるFc含有治療的タンパク質のCH2免疫グロブリンドメイン中のアスパラギン残基に共有結合された二分岐オリゴ糖を有することを特徴とする、Fc含有治療的タンパク質であって、前記Fc含有タンパク質が、実質的にG2S2糖形態にある同一のFc含有治療的タンパク質に比較して、FcγRIIAおよびFcγRIIIAに対する高められたアフィニティー、NK細胞媒介性のADCCアッセイにおける高められた活性、FcγRIに対する低下されたアフィニティー、マクロファージを活性化する低下された能力、および延長された血清半減期を有する、上記タンパク質。
- 腫瘍学関連の適応症および状態の処置に指示される、請求項26に記載のタンパク質。
- 腫瘍学関連の適応症が非ホジキンリンパ腫である、請求項26に記載のタンパク質。
- タンパク質が、シアリルトランスフェラーゼ若しくはシアリダーゼを使用して酵素的に改変された組換え発現されたモノクローナル抗体である、請求項26に記載のタンパク質。
- タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの1種若しくはそれ以上を使用して精製される、組換え発現されたモノクローナル抗体である、請求項26に記載のタンパク質。
- アフィニティークロマトグラフィーがレクチンアフィニティークロマトグラフィーである、請求項30に記載のタンパク質。
- タンパク質が、シアリル化若しくはアシアリル化オリゴ糖の高められたレベルを有するように遺伝子的に工作された宿主細胞中で発現されるモノクローナル抗体である、請求項30に記載のタンパク質。
- タンパク質が、Ab1、Ab2、Ab3若しくはAb5よりなる群から選択される、請求項17若しくは30に記載のタンパク質。
- 最低1個のヒンジ領域、CH2およびCH3ドメインの1個の免疫グロブリンIgGアイソタイプドメインを含んでなることを特徴とする治療的組換えFc含有タンパク質のバッチの製造方法であって、該方法が、前記タンパク質に結合された多糖鎖から糖残基を付加若しくは除去するために酵素でバッチを処理することを含んでなる、上記方法。
- 製薬学的に許容できる担体と組合せの、請求項34に記載の方法により製造されるタンパク質を含んでなる製薬学的組成物。
- 疾患若しくは状態の処置若しくは診断のための、請求項35に記載の方法により製造されるタンパク質の使用方法。
- 前記タンパク質が、癌腫、リンパ腫、肉腫および骨髄腫よりなる群から選択される腫瘍性疾患を処置するのに使用される、請求項36に記載の方法。
- 前記タンパク質が、乾癬、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病および全身性エリテマトーデスよりなる群から選択される炎症性障害を処置するのに使用される、請求項36に記載の方法。
- タンパク質が、角膜若しくは網膜血管新生を伴う障害を処置するのに使用される、請求項36に記載の方法。
- Fc領域のオリゴ糖のシアリル化を変えることを含んでなる、標的に特異的な結合ドメインを有するFc含有分子の標的に対する結合アフィニティーの制御方法。
- シアリル化がFc領域中で増大されかつアビディティーが減少される、請求項40に記載の方法。
- シアリル化がFc領域中で減少されかつアビディティーが増大される、請求項40に記載の方法。
- シアリル化が、酵素処理、分子の酵素的改変、分子の遺伝子操作、レクチンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、タンパク質の発現に使用される細胞株を変えること、Fc含有タンパク質を産生するにの使用される宿主細胞を血清中で培養すること、およびタンパク質を多様なpH環境に曝露することよりなる群から選択される最低一方法により野生型Fc領域から変えられている、請求項40に記載の方法。
- 酵素処理がシアリダーゼ若しくはシアリルトランスフェラーゼで処理することを含んでなる、請求項43に記載の方法。
- 標的が固定された標的である、請求項40に記載の方法。
- 標的が細胞の表面上で発現される、請求項40に記載の方法。
- Fc含有分子が抗体である、請求項40に記載の方法。
- 本明細書に記述されるいずれかの発明。
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