JP2020501576A - 抗体のインビトロ糖鎖工学における酵素の再使用 - Google Patents

Abstract

本明細書において、Fc領域中に改変されたグリコシル化を有する抗体の酵素的調製/生産のための方法が報告されており、該方法は、該Fc領域のグリコシル化を規定の形態へと改変するための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で、該Fc領域中にグリコシル化を有する抗体を1つまたは複数の酵素と共にインキュベートする工程、該Fc領域中に改変されたグリコシル化を有する抗体を、1つまたは複数のクロマトグラフィー工程において該1つまたは複数の酵素から分離し、かつそれによって、該Fc領域中に改変されたグリコシル化を有する抗体、および1つまたは複数のリサイクルされる酵素を生産する工程、ならびに、該1つまたは複数のリサイクルされる酵素を用いて、該インキュベートする工程を少なくとも1回繰り返す工程を含む。

Description

本発明は抗体工学の分野に属する。より具体的には、使用した酵素を回収して再使用する、抗体のFc領域におけるグリコシル化のインビトロ糖鎖工学のための方法を本明細書において報告する。

発明の背景
IgGは最も豊富に存在する抗体アイソタイプであり、IgG1抗体は最も重要な程度および一連のエフェクター機能を呈するサブクラスである。IgG1抗体は、ADCCおよびCDCが重要とみなされることの多い免疫治療において、最もよく使用される抗体である。抗体の構造内では、CH2ドメインならびにIgGヒンジ領域が、Fcによって媒介される抗体エフェクター機能に大きな役割を果たす。各CH2ドメインは、約297番目（KabatのEUインデックスに従う番号付け）に位置するアスパラギンに、保存されたグリコシル化部位を含み、グリカン部分はそこに共有結合している（Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 （1997） 26-32（非特許文献1））。成熟IgG分子では、グリカンがCH2ドメインの間に埋もれて、IgG分子の三次構造に影響を及ぼしている。

抗体のFc領域のグリカンは、主として、高度に不均一な複合型バイアンテナ構造である。抗体のFab領域内には保存されていないさらなるグリコシル化部位も存在しうるが、抗体のグリコシル化がそのエフェクター機能に及ぼす影響は、Fc領域のグリコシル化に起因すると考えられている。

抗体のFc領域に存在するN結合型グリカンが、ADCCなどのエフェクター機能を媒介するために、抗体にとって不可欠であることは公知である（Lively, M.R. et al. Glycobiol. 8 （1995） 813-822（非特許文献2）、Jefferis R. et al. Immunol Rev. 163 （1998） 59-76（非特許文献3））。N結合型グリカンの組成は、IgG分子のFc領域の構造に影響を及ぼし、それによってFc受容体結合、ADCC活性、およびCDC活性などの抗体エフェクター機能を変化させることが示されている（Presta, L., Curr. Opin. Struct. Biol. 13 （2003） 519-525（非特許文献4））。

例えば原核宿主細胞または真核宿主細胞における発現によって、組換え発現系において発現させたIgG抗体では、N結合型グリカン構造が個々の抗体分子ごとに異なる。それゆえに、組換え発現系で生産された抗体は「抗体の集団」（本明細書においてこれ以降も使用する用語）とみなすことができ、抗体はアミノ酸配列こそ同一であるものの、Fc領域のN結合型グリカンパターンについては不均一性を呈する。

組換え抗体の発現に使用する宿主細胞種が異なると、Fc領域グリカンの組成が異なることは公知である。抗体の組換え発現によく使用される宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）とマウス骨髄腫細胞（例えばsp2/0、P3X63Ag8.653、NSO）の2つである。CHO細胞は、末端シアル酸残基が実質的に欠けておりグリカンパターンの大部分がフコシル化されている、組換え抗体を発現する。対照的に、マウス骨髄腫細胞は、最大50％（相対頻度）のシアル酸残基を有するがフコース残基は少ない抗体集団を生じる。

グリカン構造の末端残基のいくつかがIgGエフェクター機能に影響を及ぼすことは公知である。末端フコース残基の存在がFcガンマRIIIa結合の低減およびADCCの低減の一因になることは公知である。したがって、末端フコース残基を欠く抗体（「フコース欠損（afucosylated）」抗体）は、その抗体集団が媒介するADCCの増加に関連する。ADCC媒介の改良に対するフコース欠損（afucosylation）の影響は、当技術分野では広く受け入れられているが、ADCC媒介におけるFc領域ガラクトシル化の役割については議論の余地はあるが報告がなされている。いくつかの研究が、ガラクトシル化はADCCに影響しないことを示しているのに対し（Boyd, P.N., et al. Mol Immunol. 32 （1995） 1311-1318（非特許文献5）、Hodoniczky, J., et al. Biotechnol. Prog. 21 （2005） 1644-1652（非特許文献6）、Raju, T.S., Curr. Opin. Immunol. 20 （2008） 471-478（非特許文献7））、IgGのガラクトシル化がFcガンマRIIIa結合を増加させると報告している研究もある（Houde, D., et al., Mol. Cell .Proteom. 9 （2010） 1716-1728（非特許文献8）、Kumpel, B.M., et al., Hum. Antibod. Hybridom. 6 （1995） 82-88（非特許文献9）、Thomann, M., et al., Mol. Immunol. 73 （2016） 69-75（非特許文献10））。

現在、抗体が媒介するADCCを改良するために行われるIgG分子の操作は、IgG分子のフコシル化を調節することに焦点を合わせている。組換え発現IgGのフコース欠損は、遺伝子改変宿主細胞、例えばタンパク質フコシル化が欠損しているLecl3 CHO細胞、またはアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8）遺伝子がノックアウトされているCHO細胞などのノックアウト細胞株において抗体を発現させることによって達成しうる。

しかし、CHO細胞などの現行の発現系によって生成する抗体は不均一なグリカンパターンを呈し、それが、生成した抗体の異なるバッチ間での異なるグリカン種の分布のばらつきにつながる。それゆえに、組換えIgG抗体のエフェクター機能を目的に合わせることの必要性、とりわけ治療用抗体によって媒介されるADCCを改良するための手段の提供の必要性が依然としてある。

WO2011/012297（特許文献1）では、規定の糖鎖構造（glycostructure）を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を生産するための方法であって、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を含有するアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出液を提供する工程、アフィニティークロマトグラフィーカラム溶出液を植物起源の、例えばコーヒー生豆由来の、（a1,3）ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.22）と共にインキュベートする工程、インキュベートしたアフィニティークロマトグラフィーカラム溶出液をプロテインAクロマトグラフィー材料に適用する工程、およびプロテインAクロマトグラフィー材料から免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を回収し、かつそれによって規定の糖鎖構造を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を生産する工程を含む、方法が報告されている。

WO2015/123754（特許文献2）では、アフィニティーリガンドに結合した不均一グリコフォーム抗体試料を、治療的用途のための実質的に均質な所望する単一グリコフォーム抗体試料に再構築するための酵素法と、それらの方法を実施するためのキットが提供されている。アフィニティーリガンドに結合した抗体のFc領域を不均一なグリコフォームから実質的に均質な単一グリコフォームへ酵素的に変化させるための方法は、アフィニティーリガンドに結合した不均一グリコフォーム抗体を、Fc領域のグリコフォームを実質的に均一な単一型へと改変するための、十分な時間にわたってかつ条件下で、特定のグリコフォーム改変のために設計された反応緩衝液と接触させる工程、1つまたは複数のヌクレオチド糖および/またはコファクターを任意で加える工程、ならびに実質的に均一な単一グリコフォーム抗体試料を該アフィニティーリガンドから遊離させる工程を含む。この発明は、がんおよび免疫障害を処置するための、酵素的に生産された単一グリコフォームのmAbおよびポリクローナル抗体を含む生物製剤、ならびに生物製剤としての単一グリコフォーム抗体を含む組成物も包含する。

WO2016/037947（特許文献3）では、IgG1アイソタイプのガラクト改変型（galactoengineered）組換え抗体、該抗体の生産のための方法およびその用途が報告されている。

WO2011/012297 WO2015/123754 WO2016/037947

Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 （1997） 26-32 Lively, M.R. et al. Glycobiol. 8 （1995） 813-822 Jefferis R. et al. Immunol Rev. 163 （1998） 59-76 Presta, L., Curr. Opin. Struct. Biol. 13 （2003） 519-525 Boyd, P.N., et al. Mol Immunol. 32 （1995） 1311-1318 Hodoniczky, J., et al. Biotechnol. Prog. 21 （2005） 1644-1652 Raju, T.S., Curr. Opin. Immunol. 20 （2008） 471-478 Houde, D., et al., Mol. Cell .Proteom. 9 （2010） 1716-1728 Kumpel, B.M., et al., Hum. Antibod. Hybridom. 6 （1995） 82-88 Thomann, M., et al., Mol. Immunol. 73 （2016） 69-75

使用した酵素が抗体の改変後に回収されかつ再使用のために調整される、抗体のインビトロ糖鎖工学の方法、一態様では組換え生産モノクローナル抗体のインビトロ糖鎖工学の方法を本明細書において報告する。本明細書において報告する方法は、中でも抗体改変のための改良された方法、とりわけ、より経済的な方法である。

本明細書において報告する方法により、抗体のグリコシル化の改変に使用した酵素を抗体調製物から取り除くことができ、その結果、改良された調製物が得られる。

本明細書において報告する方法は、任意のモノクローナル抗体の改変に役立ち、上流生産プロセス工程に対する改変の必要はない。本明細書において報告する方法は、既存のプロセスに組み込むことができる。本質的に、既存の抗体生産細胞株に対する大きな変更の必要はない。糖鎖構造改変は、本明細書において報告する方法により、下流プロセシング中になされるからである。

抗体のグリコシル化の改変に使用した酵素は、酵素活性の好ましくない喪失を伴うことなく、再調整した酵素を同じ反応に再使用することができるような形で、回収できることがわかった。驚いたことに、酵素は、酵素活性および変換効率の有意な喪失を伴うことなく、少なくとも1回再使用できることがわかった。

本明細書において報告する一局面は、酵素的改変に使用した酵素を、グリコシル化の改変後に抗体から分離する工程、および、その酵素を少なくとも1回（同じ酵素的調製/生産プロセスにおいて）再使用する工程を含む、改変された（実質的に均一な）グリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体の酵素的調製/生産のための方法である。

一態様において、分離はクロマトグラフィー工程による。一態様において、クロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィー工程および/またはカチオン交換クロマトグラフィー工程である。一態様において、アフィニティークロマトグラフィー工程は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程または抗体軽鎖アフィニティーリガンドによるアフィニティークロマトグラフィーである。一態様において、カチオン交換クロマトグラフィー工程は強カチオン交換クロマトグラフィー工程である。一態様において、強カチオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホプロピルカチオン交換基を有する架橋アガロースのマトリックス（SP-Sepharose）を有する。

一態様において、分離は、2つのクロマトグラフィー工程により、第1の工程はアフィニティークロマトグラフィー工程でありかつ第2の工程はカチオン交換クロマトグラフィー工程であり、アフィニティークロマトグラフィー工程は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程または抗体軽鎖アフィニティーリガンドによるアフィニティークロマトグラフィーであり、かつ、カチオン交換クロマトグラフィー工程は、カチオン交換クロマトグラフィー材料がスルホプロピルカチオン交換基を有する架橋アガロースのマトリックス（SP-Sepharose）を有するカチオン交換クロマトグラフィー工程である。

一態様では、酵素的改変において、酵素的改変の際、抗体は、溶液中に存在するか、抗体（軽鎖）アフィニティーリガンドに結合している。一態様において、酵素的改変は溶液中である。

本明細書において報告する方法の一態様において、モノクローナル抗体は、改変された糖鎖構造をN-グリコシル化部位に有するモノクローナル抗体調製物を生産するために1つまたは複数のグリコシル化改変酵素と共にインキュベートすることによって、溶液中で改変され、このインキュベーション後に、抗体および該1つまたは複数の酵素は、アフィニティークロマトグラフィーおよび/またはカチオン交換クロマトグラフィーによって分離され、その後、該酵素は、同じ反応において少なくとも1回再使用される。

本明細書において報告する方法の一態様において、モノクローナル抗体は、改変された糖鎖構造をN-グリコシル化部位に有するモノクローナル抗体調製物を生産するための酵素的オンカラム改変のために、アフィニティーリガンドに、とりわけ抗体軽鎖アフィニティーリガンドに、結合され、反応後に酵素は抗体から分離されて、同じ反応において少なくとも1回再使用される。

したがって、一態様において、改変された（実質的に均一な）グリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体の酵素的調製/生産のための本明細書において報告する方法は、
（a）N-グリコシル化部位において規定の（実質的に均一な）形態（均一なグリコシル化）へと改変するための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で、N-グリコシル化部位に（非改変）グリコシル化を有する抗体を1つまたは複数の酵素と共にインキュベートする工程、
（b）改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体を、1つまたは複数の酵素から分離し、かつそれによって、改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体、および1つまたは複数のリサイクルされる酵素を生産する工程、ならびに
（c）工程（b）の1つまたは複数のリサイクルされる酵素を用いて、工程（a）を少なくとも1回繰り返す工程
を含む。

一態様において、インキュベートする工程は、溶液中であるか、または抗体（軽鎖）アフィニティーリガンドに結合した抗体を用いる。一態様において、インキュベートする工程は溶液中である。

驚いたことに、抗体軽鎖アフィニティーリガンドに結合した抗体は、あたかも抗体が溶液中に存在するかのように効果的に、酵素的に改変されうることがわかった。

したがって、一態様において、改変された（実質的に均一な）グリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体の酵素的調製/生産のための本明細書において報告する方法は、
（a）N-グリコシル化部位におけるグリコシル化を規定の（実質的に均一な）形態（均一なグリコシル化）へと改変するための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で、N-グリコシル化部位に（非改変）グリコシル化を有する抗体を1つまたは複数の酵素と共に溶液中でインキュベートする工程、
（b）改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体を、1つまたは複数のクロマトグラフィー工程において1つまたは複数の酵素から分離し、かつそれによって、改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体、および1つまたは複数のリサイクルされる酵素を生産する工程、ならびに
（c）工程（b）の1つまたは複数のリサイクルされる酵素を用いて、工程（a）を少なくとも1回繰り返す工程
を含む。

したがって、一態様において、改変された（実質的に均一な）グリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体の酵素的調製/生産のための本明細書において報告する方法は、
（a）N-グリコシル化部位におけるグリコシル化を規定の（実質的に均一な）形態（均一なグリコシル化）へと改変するための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で、N-グリコシル化部位に（非改変）グリコシル化を有する抗体を1つまたは複数の酵素と共に溶液中でインキュベートする工程、
（b）改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体を、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて1つまたは複数の酵素から分離し、かつそれによって、改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体、および1つまたは複数のリサイクルされる酵素を生産する工程、ならびに
（c）工程（b）の1つまたは複数のリサイクルされる酵素を用いて、工程（a）を少なくとも1回繰り返す工程
を含む。

したがって、一態様において、改変された（実質的に均一な）グリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体の酵素的調製/生産のための本明細書において報告する方法は、
（a）N-グリコシル化部位におけるグリコシル化を規定の（実質的に均一な）形態（均一なグリコシル化）へと改変するための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で、N-グリコシル化部位に（非改変）グリコシル化を有する抗体を1つまたは複数の酵素と共に溶液中でインキュベートする工程、
（b）改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体を、アフィニティークロマトグラフィーにおいて1つまたは複数の酵素から分離し、かつそれによって、改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体、および1つまたは複数のリサイクルされる酵素を生産する工程、ならびに
（c）工程（b）の1つまたは複数のリサイクルされる酵素を用いて、工程（a）を少なくとも1回繰り返す工程
を含む。

したがって、一態様において、改変された（実質的に均一な）グリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体の酵素的調製/生産のための本明細書において報告する方法は、
（a）N-グリコシル化部位におけるグリコシル化を規定の（実質的に均一な）形態（均一なグリコシル化）へと改変するための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で、N-グリコシル化部位に（非改変）グリコシル化を有する抗体を2つまたはそれ以上の酵素と共に溶液中でインキュベートする工程、
（b）改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体を、アフィニティークロマトグラフィーにおいて2つまたはそれ以上の酵素から分離し、かつそれによって、改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体を生産する工程、
（c）工程（b）において抗体から分離した2つまたはそれ以上の酵素をカチオン交換クロマトグラフィーにおいて分離する工程、および
（d）工程（c）の分離された2つまたはそれ以上の酵素を用いて工程（a）を少なくとも1回繰り返す工程
を含む。

一態様において、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホプロピルカチオン交換基を有する架橋アガロースのマトリックス（SP-Sepharose）を有する。本方法は架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）のマトリックスでは奏効しないことがわかった。

一態様において、1つまたは複数の酵素は1つの酵素である。一態様において、1つの酵素はガラクトシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼである。

一態様において、2つまたはそれ以上の酵素は2つの酵素である。一態様において、2つまたはそれ以上の酵素はガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼである。

一態様において、ガラクトシルトランスフェラーゼはβ4GalT1である。

一態様において、シアリルトランスフェラーゼはST6である。

一態様において、シアリルトランスフェラーゼはST6Gal1またはST6Gal2である。

すべての局面の一態様において、N-グリコシル化部位はFab中またはFc領域中に存在する。

一態様において、カチオン交換クロマトグラフィーは、
（i）ガラクトシルトランスフェラーゼおよび/またはシアリルトランスフェラーゼと改変されたN-グリコシル化部位を有する抗体とを含む溶液を、（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
（ii）（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料を任意で洗浄する（結合していない化合物を（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料から除去するため）工程、
（iii）第1の溶液を（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、かつそれによって、（ガラクトシルトランスフェラーゼが存在する場合には）ガラクトシルトランスフェラーゼを、（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収する工程、
（iv）第2の溶液を（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、かつそれによって、改変されたN-グリコシル化部位を有する抗体を（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収する工程、ならびに
（v）（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料に直線勾配を適用し、かつそれによって、（シアリルトランスフェラーゼが存在する場合には）シアリルトランスフェラーゼを、（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収する工程
を含む。

一態様において、工程（i）の溶液は、pH5.0〜pH6.5のpH値を有する2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液である。一態様において、工程（i）の溶液は、約50mMのMESを含み、約pH6.4のpH値を有する。

一態様において、工程（ii）の溶液は、pH5.0〜pH6.5のpH値を有する2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液である。一態様において、工程（ii）の溶液は、約50mMのMESを含み、約pH6.4のpH値を有する。

一態様において、工程（iii）の溶液は、pH6.6〜pH8.0のpH値を有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）緩衝溶液である。一態様において、工程（iii）の溶液は、約40mMのTRISを含み、約pH7.4のpH値を有する。

一態様において、工程（iv）の溶液は、pH5.0〜pH6.5のpH値を有し約75mM〜約125mMの塩化ナトリウム（NaCl）を含む、2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液である。一態様において、工程（iv）の溶液は、約30mMのMESおよび約90mMのNaClを含み、約pH5.6のpH値を有する。

pH値を7.4からpH6未満に、例えばpH5.6に下げると、凝集したガラクトシルトランスフェラーゼの溶出が起こることがわかった。

一態様において、直線勾配は、工程（iv）の溶液から、pH5.0〜pH6.5のpH値を有し約750mM〜約1250mMの塩化ナトリウム（NaCl）を含む2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液までの勾配である。一態様において、直線勾配は、工程（iv）の溶液から、約50mMのMESおよび約1000mMのNaClを含み約pH 6.4のpH値を有する溶液までの勾配である。

一態様において、繰り返す工程は1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回である。一態様において、繰り返す工程は1〜5回である。一態様において、繰り返す工程は1〜3回である。

一態様において、本明細書において報告する方法は、抗体のN-グリコシル化部位におけるグリコシル化の（実質的に均一なグリコシル化への）酵素的改変のための方法であり、酵素的改変中、抗体は、抗体軽鎖アフィニティーリガンドに結合している。

すべての局面の一態様において、本方法は、
- N-グリコシル化部位におけるグリコシル化を規定の（実質的に均一な）形態（均一なグリコシル化）へと改変するための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で、抗体軽鎖アフィニティーリガンドに結合した、N-グリコシル化部位にグリコシル化を有するモノクローナル抗体を1つまたは複数の酵素と共にインキュベートする工程
を含む。

すべての局面の一態様において、本方法は、インキュベーション工程前に、
- N-グリコシル化部位にグリコシル化を有するモノクローナル抗体を、抗体軽鎖アフィニティーリガンドに結合させる工程
を含み、インキュベーション工程後に、
- N-グリコシル化部位に規定の（実質的に均一な）グリコシル化を有する抗体を、抗体軽鎖アフィニティーリガンドから遊離させる工程
を含む。

すべての局面の一態様において、本方法は、以下の順序で、
- N-グリコシル化部位にグリコシル化を有する抗体を含む（緩衝）溶液を、固相に結合された抗体軽鎖アフィニティーリガンド（抗体軽鎖アフィニティーリガンドクロマトグラフィー材料）に適用し、それによって抗体をリガンドに結合させる（結果としてリガンドに結合した抗体が得られる）工程、
- 固相を緩衝溶液で任意で洗浄する工程、
- 抗体のN-グリコシル化部位におけるグリコシル化を、
- 第1のグリコシル化改変酵素（および第1の活性化された糖残基）を含む第1の（緩衝）溶液を、リガンドに結合した抗体に対する酵素的改変のための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で適用し、改変されリガンドに結合した抗体を任意で洗浄し、第2のグリコシル化改変酵素（および第2の活性化された糖）を含む第2の（緩衝）溶液を、改変されリガンドに結合した抗体に対する酵素的改変のための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で適用し、2回改変されリガンドに結合した抗体を任意で洗浄すること、
または
- 第1のグリコシル化改変酵素（および第1の活性化された糖）を含む第1の（緩衝）溶液を、リガンドに結合した抗体に対する少なくとも部分的な酵素的改変のための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で適用し、規定の期間後に、第2のグリコシル化改変酵素（および第2の活性化された糖）を含む第2の（緩衝）溶液を、改変されリガンドに結合した抗体に対する酵素的改変のための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で適用し、2回改変されリガンドに結合した抗体を任意で洗浄すること、
または
- 第1および第2のグリコシル化改変酵素（ならびに第1および第2の活性化された糖）を含む（緩衝）溶液を、リガンドに結合した抗体の酵素的改変のための十分な時間かつ適切な条件下で適用し、改変されリガンドに結合した抗体を任意で洗浄すること
のいずれかによって、酵素的に改変する工程、
- N-グリコシル化部位に規定のグリコシル化を有する抗体を、抗体軽鎖アフィニティーリガンドから遊離させる工程
を含む。

本明細書において報告する方法において使用される抗体は、任意の抗体または抗体断片、例えばFab断片、一本鎖抗体、多重特異性抗体、および抗体融合物であることができる。

したがって、本明細書において報告するすべての局面の一態様において、抗体は、抗体Fab断片、完全長抗体、二価単一特異性抗体、二重特異性抗体、二価二重特異性抗体、三価二重特異性抗体、四価二重特異性抗体、三価三重特異性抗体、および四価四重特異性抗体からなる抗体の群より選択される。

一態様において、抗体は二価単一特異性抗体である。

一態様において、抗体は二価または三価または四価二重特異性抗体である。

一態様において、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体またはヒト抗体である。

一態様において、抗体はポリクローナル抗体調製物である。

一態様において、抗体はモノクローナル抗体である。

本明細書において報告するすべての局面の一態様において、抗体（調製物）は、ヒトIgGクラスの抗体（調製物）である。一態様において、抗体はヒトIgG1またはIgG4サブクラスの抗体である。

本明細書において報告するすべての局面の一態様において、規定のグリコシル化は、G2グリコフォーム、G0グリコフォーム、M3グリコフォーム、S2グリコフォーム、A2Bグリコフォーム、A2BG2グリコフォームおよびS1グリコフォームからなる群より選択されるグリコシル化である。

本明細書において報告するすべての局面の一態様において、規定のグリコシル化は、末端糖としてのガラクトース、末端糖としてのGlcNAc、末端糖としてのマンノースおよび末端糖としてのシアル酸からなる群より選択されるグリコシル化である。

一態様において、抗体は組換え生産抗体である。

本明細書において報告する一局面は、本明細書において報告する方法を用いて生産される抗体である。

本明細書において報告する一局面は、本明細書において報告する方法によって生産される規定のグリコシル化を有する抗体を含む薬学的製剤である。

本発明の別の局面は、
（a）（IgG1アイソタイプの）抗体またはその断片を、抗体またはその断片をコードする核酸を含む（哺乳類またはCHO）細胞中で組換え生産することで、N-グリコシル化部位にグリコシル化を有する抗体またはその断片を得る工程、
（b）N-グリコシル化部位に不均一なグリコシル化を有する抗体またはその断片を単離する（回収し、かつ任意で精製する）工程、
（c）N-グリコシル化部位にグリコシル化を有する抗体またはその断片を、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび/またはシアリルトランスフェラーゼで酵素的に改変することで、N-グリコシル化部位に少なくとも70％の相対量（ここで100％がG0F、G1F、およびG2Fグリコフォームの量に相当する）で二ガラクトシル化（bi-galactosylated）抗体（G2Fグリコフォーム）を含みN-グリコシル化部位において定義された抗体またはその断片を得て、かつ次に、改変された抗体を本明細書において報告する方法を用いて酵素から分離する工程、
（d）改変された抗体またはその断片を、1つまたは複数のクロマトグラフィー工程によって任意で精製する工程、
を含み、かつそれによって、N-グリコシル化部位に規定のグリコシル化を有する抗体またはその断片を生産する、N-グリコシル化部位に規定のグリコシル化を有する抗体またはその断片の組換え生産のための方法である。

本明細書において報告するすべての局面の一態様において、第1のグリコシル化改変酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである。

本明細書において報告するすべての局面の一態様において、第1のグリコシル化改変酵素はガラクトシルトランスフェラーゼであり、第2のグリコシル化改変酵素はシアリルトランスフェラーゼである。

一態様において、ガラクトシルトランスフェラーゼはβ4GalT1である。

一態様において、シアリルトランスフェラーゼはST6である。

一態様において、シアリルトランスフェラーゼはST6Gal1またはST6Gal2である。

一態様において、（第1の）緩衝溶液はUDP-Galを含む。

一態様において、（第2の）緩衝溶液はCMP-NANAを含む。

一態様において、インキュベーションは室温（20〜25℃、好ましくは約22℃）で行われる。

一態様において、インキュベーションは25℃で行われる。

一態様において、インキュベーションは37℃で行われる。

一態様において、インキュベーションは7〜48時間行われる。

本明細書において報告するすべての局面の一態様において、溶液はクロマトグラフィー的に純粋な抗体を含み、（第1の）グリコシル化改変酵素はGalT1であり、（第1の）グリコシル化改変酵素とのインキュベーションは、20〜27℃または37℃で24時間行われる。一態様において、インキュベーションは室温（約22℃）で行われる。

本明細書において報告するすべての局面の一態様において、溶液はクロマトグラフィー的に純粋な抗体を含み、（第2の）グリコシル化改変酵素はST6であり、（第2の）グリコシル化改変酵素とのインキュベーションは、20〜27℃または37℃で24時間行われる。一態様において、インキュベーションは室温（約22℃）で行われる。

本明細書において報告するすべての局面の一態様において、溶液は抗体を含む緩衝無細胞培養上清であり、第1のグリコシル化改変酵素はGalT1であり、第2のグリコシル化改変酵素は、第1のグリコシル化改変酵素の6〜24時間後、好ましくは24時間後に加えられるST6であり、総インキュベーション時間は20〜27℃または37℃で24時間〜48時間、好ましくは30時間である。一態様において、インキュベーションは室温（約22℃）で行われる。

本明細書において報告する一局面は、以下の順序で、
- 抗体または少なくとも抗体軽鎖を含むその断片をコードする核酸を含む細胞を提供する工程、
- N-グリコシル化部位にグリコシル化を有する抗体またはその断片の発現に適した条件下で、細胞を培養する（断片が、次の工程の1つにおいて使用される抗体軽鎖アフィニティークロマトグラフィー材料によって特異的に結合されうる軽鎖を少なくとも1つ含む）工程、
- 抗体またはその断片を細胞または培養培地から回収する工程、
- 抗体またはその断片のアフィニティークロマトグラフィー材料への結合に適した条件下で、抗体またはその断片を含む溶液を抗体軽鎖アフィニティークロマトグラフィーカラムに任意で適用する工程、
- N-グリコシル化部位における抗体またはその断片のグリコシル化を、本明細書において報告する方法を用いて改変する工程、および
- N-グリコシル化部位に規定のグリコシル化を有する改変された抗体またはその断片を回収する工程
を含み、かつそれによって抗体を生産する、抗体の生産のための方法である。

一態様において、本方法は、最終工程として、
- 改変された抗体またはその断片を1〜3つのクロマトグラフィー工程で精製する工程
を含む。

本明細書において報告する一局面は、
（i）ガラクトシルトランスフェラーゼおよび/またはシアリルトランスフェラーゼと抗体とを含む溶液を、（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
（ii）（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料を任意で洗浄する（結合していない化合物を（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料から除去するため）工程、
（iii）第1の溶液を（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、かつそれによって、（ガラクトシルトランスフェラーゼが存在する場合には）ガラクトシルトランスフェラーゼを、（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収する工程、
（iv）第2の溶液を（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、かつそれによって、抗体を（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収する工程、ならびに
（v）（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料に直線勾配を適用し、かつそれによって、（シアリルトランスフェラーゼが存在する場合には）シアリルトランスフェラーゼを、（強）カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収する工程
を含む、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび/またはシアリルトランスフェラーゼと抗体とを含む混合物をカチオン交換クロマトグラフィー材料を使用して分離するためのクロマトグラフィー法である。

この方法では、分離されたガラクトシルトランスフェラーゼおよび分離されたシアリルトランスフェラーゼは、酵素活性および/または選択性に有意な喪失を伴うことなく、複数回にわたって、すなわち少なくとも3回にわたって、酵素的変換に再使用できることがわかった。

一態様において、工程（i）の溶液は、pH5.0〜pH6.5のpH値を有する2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液である。一態様において、工程（i）の溶液は、約50mMのMESを含み、約pH6.4のpH値を有する。

一態様において、工程（ii）の溶液は、pH5.0〜pH6.5のpH値を有する2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液である。一態様において、工程（ii）の溶液は、約50mMのMESを含み、約pH6.4のpH値を有する。

一態様において、工程（iii）の溶液は、pH6.6〜pH8.0のpH値を有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）緩衝溶液である。一態様において、工程（iii）の溶液は、約40mMのTRISを含み、約pH7.4のpH値を有する。

一態様において、工程（iv）の溶液は、pH5.0〜pH6.5のpH値を有し約75mM〜約125mMの塩化ナトリウム（NaCl）を含む、2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液である。一態様において、工程（iv）の溶液は、約30mMのMESおよび約90mMのNaClを含み、約pH5.6のpH値を有する。

pH値を7.4から5.6に下げると、凝集したガラクトシルトランスフェラーゼの溶出が起こることがわかった。

一態様において、直線勾配は、工程（iv）の溶液から、pH5.0〜pH6.5のpH値を有し約750mM〜約1250mMの塩化ナトリウム（NaCl）を含む2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液までの勾配である。一態様において、直線勾配は、工程（iv）の溶液から、約50mMのMESおよび約1000mMのNaClを含み約pH 6.4のpH値を有する溶液までの勾配である。

すべての局面の一態様において、N-グリコシル化部位はFab中またはFc領域中に存在する。

発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域および定常ドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）に記載のKabat番号付けシステムに従って番号付けされ、これを本明細書では「Kabatに従う番号付け」という。具体的に述べると、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLには、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）のKabat番号付けシステム（647〜660頁参照）を使用する。具体的に述べると、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）には、Kabat EUインデックス番号付けシステム（661〜723頁参照）を使用する（この場合、本明細書では、「Kabat EUインデックスに従う番号付け」ということによって、これをさらに明確にする）。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって例えば、「細胞（a cell）」と書いた場合、それは、複数のそのような細胞および当業者に公知のそれらの等価物を包含する、などとなる。同様に、「1つの（a）」（1つの（an））、「1つまたは複数の」および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書では、相互可換的に使用されうる。「を含む（comprising）」、「を包含する（including）」および「を有する（having）」という用語が、相互可換的に使用されうることにも留意されたい。

アミノ酸配列、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するための手順および方法は、当業者には周知である。したがって核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列を特徴とし、また同様に、それがコードするポリペプチドのアミノ酸配列も特徴とする。

「約」という用語は、その後ろに続く数値の±20％の範囲を表す。一態様において、約という用語は、その後ろに続く数値の±10％の範囲を表す。一態様において、約という用語は、その後ろに続く数値の±5％の範囲を表す。

本明細書において「抗体」という用語は、最も広義に使用され、さまざまな抗体構造、例えば限定するわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体断片を、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、包含する。

「抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）」という用語は、Fc受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下での本明細書において報告する抗体による標的細胞の溶解を指す。ADCCは、一態様では、新鮮単離PBMC（末梢血単核球）などのエフェクター細胞の存在下または単球もしくはNK（ナチュラルキラー）細胞のようなバフィーコートからの精製したエフェクター細胞の存在下で、CD19を発現する赤血球系細胞（例えば組換えヒトCD19を発現するK562細胞）の調製物を本明細書において報告する抗体で処理することによって測定される。標的細胞をCr-51で標識してから、抗体と共にインキュベートする。標識された細胞をエフェクター細胞と共にインキュベートし、放出されたCr-51について上清を分析する。対照には、標的内皮細胞をエフェクター細胞と共に、ただし抗体なしで、インキュベートすることを含める。ADCCを媒介する初期段階を誘導する抗体の能力は、FcγRIおよび/またはFcγRIIAを組換え発現する細胞または（本質的にFcγRIIIAを発現する）NK細胞などといったFcγ受容体発現細胞へのそれらの結合を測定することによって調べられる。好ましい一態様では、NK細胞上のFcγRへの結合が測定される。

「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子を表す。抗体断片の例として、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）₂、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばscFv）、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来し、重鎖および/または軽鎖の残りの部分は異なる供給源または種に由来する抗体を指す。

抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要クラス、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分類することができる。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

「補体依存性細胞傷害（CDC）」という用語は、補体の存在下で、本明細書において報告する抗体によって誘導される細胞の溶解を指す。CDCは、一態様では、CD19を発現するヒト内皮細胞を、補体の存在下で、本明細書において報告する抗体で処理することによって測定される。一態様において、細胞はカルセインで標識される。抗体が30μg/mlの濃度で20％またはそれ以上の標的細胞の溶解を誘導すれば、CDCが見いだされる。補体因子C1qへの結合はELISAにおいて測定することができる。そのようなアッセイでは、原則として、ある濃度範囲の抗体でELISAプレートをコーティングし、そこに精製したヒトC1qまたはヒト血清を加える。C1q結合は、C1qに対する抗体とそれに続くペルオキシダーゼ標識コンジュゲートとによって検出される。結合の検出（最大結合Bmax）は、ペルオキシダーゼ基質ABTS（登録商標）（2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホネート]）の場合、405nmにおける光学密度（OD405）として測定される。

「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域に起因する生物学的活性を指し、抗体クラスによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例として、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、貪食、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）の下方制御、ならびにB細胞活性化が挙げられる。

Fc受容体結合依存的エフェクター機能は、抗体のFc領域と、造血細胞上の特殊化した細胞表面受容体であるFc受容体（FcR）との相互作用によって媒介されうる。Fc受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の貪食による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）による、対応する抗体で覆われた赤血球および他のさまざまな細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解とを、どちらも媒介することが示されている（例えばVan de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 （1991） 511-524参照）。FcRは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれぞれの特異性によって規定され、IgG抗体に対するFc受容体はFcγRと呼ばれる。Fc受容体結合は、例えばRavetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 （1991） 457-492、Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 （1994） 25-34、de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 （1995） 330-341、およびGessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 （1998） 231-248に記載されている。

IgG抗体のFc領域に対する受容体（FcγR）の架橋は、貪食、抗体依存性細胞性細胞傷害、および炎症性メディエーターの放出、ならびに免疫複合体クリアランスおよび抗体生産の調節を含む、多種多様なエフェクター機能の引き金を引く。ヒトでは、3つのFcγRクラスが特徴決定されており、それらは以下のとおりである。
- FcγRI（CD64）は、単量体型IgGに高いアフィニティーで結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上に発現する。アミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327、およびP329（KabatのEUインデックスに従う番号付け）のうちの少なくとも1つにおけるIgGのFc領域中の改変は、FcγRIへの結合を低減する。IgG2の233〜236番目の残基でIgG1中およびIgG4中の残基を置換すると、FcγRIへの結合は10³分の1に低減し、抗体感作赤血球細胞に対するヒト単球応答は排除された（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 （1999） 2613-2624）。
- FcγRII（CD32）は、複合体化したIgGに、中〜低アフィニティーで結合し、広く発現している。この受容体は2つのサブタイプFcγRIIAおよびFcγRIIBに分類することができる。FcγRIIAは、死滅に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）に見いだされ、死滅プロセスを活性化することができるようである。FcγRIIBは、阻害プロセスにおいて役割を果たすと思われ、B細胞、マクロファージならびに肥満細胞および好酸球上に見いだされる。これは、B細胞上では、さらなる免疫グロブリン生産および例えばIgEクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制する機能を果たすようである。FcγRIIBは、マクロファージ上では、FcγRIIAによって媒介される貪食を阻害するように作用する。好酸球および肥満細胞上では、IgEがその別個の受容体に結合することによって起こるこれらの細胞の活性化を抑制するのに、このB型が役立ちうる。FcγRIIAに対する結合の低減は、例えばアミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292、およびK414（KabatのEUインデックスに従う番号付け）のうちの少なくとも1つに突然変異を有するIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。
- FcγRIII（CD16）は中〜低アフィニティーでIgGに結合し、2つのタイプが存在する。FcγRIIIAはNK細胞、マクロファージ、好中球ならびに一部の単球およびT細胞上に見いだされ、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは好中球に高発現している。FcγRIIIAへの結合の減少は、例えばアミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338、およびD376（KabatのEUインデックスに従う番号付け）のうちの少なくとも1つに突然変異を有するIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。

Fc受容体に対するヒトIgG1上の結合部位のマッピング、上述の突然変異部位ならびにFcγRIおよびFcγRIIAへの結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 （2001） 6591-6604に記載されている。

本明細書において使用する「Fc受容体」という用語は、受容体に付随する細胞質ITAM配列の存在を特徴とする活性化受容体を指す（例えばRavetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 （2001） 275-290参照）。そのような受容体はFcγRI、FcγRIIAおよびFcγRIIIAである。「FcγRの結合がない」という用語は、10μg/mlの抗体濃度において、NK細胞への本明細書において報告する抗体の結合が、WO2006/029879に報告されている抗OX40L抗体LC.001について見いだされる結合の10％またはそれ未満であることを表す。

IgG4は低減したFcR結合を示すが、他のIgGサブクラスの抗体は強い結合を示す。ただし、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc糖質の喪失）、Pro329ならびに234、235、236および237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、およびHis435は、変化すると、やはり低減したFcR結合を与える残基である（Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 （2001） 6591-6604、Lund, J., et al., FASEB J. 9 （1995） 115-119、Morgan, A., et al., Immunology 86 （1995） 319-324、およびEP0307434）。

「Fc領域」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Fc領域およびバリアントFc領域を包含する。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226からまたはPro230からまたはAla231からカルボキシル末端までにわたる。ただしFc領域のC末端リジン（Lys447）は存在しても存在しなくてもよい。

本明細書において報告する抗体は、Fc領域を含み、一態様ではヒト由来のFc領域を含む。一態様において、Fc領域は、ヒト定常領域のすべてのパーツを含む。抗体のFc領域は、補体活性化、C1q結合、C3活性化、およびFc受容体結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響はある特定の条件に依存するが、C1qへの結合は、Fc領域中の規定の結合部位が引き起こす。そのような結合部位は、現在の技術水準では公知であり、例えばLukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 （1981） 2555-2560、Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 （1979） 907-917、Burton, D.R., et al., Nature 288 （1980） 338-344、Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 （2000） 995-1004、Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 （2000） 4178-4184、Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 （2001） 12161-12168、Morgan, A., et al., Immunology 86 （1995） 319-324、およびEP0307434に記載されている。そのような結合部位は、例えばL234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、およびP329KabatのEUインデックスに従う番号付け）である。サブクラスIgG1、IgG2、およびIgG3の抗体が、通常、補体活性化、C1q結合、およびC3活性化を示すのに対し、IgG4は補体系を活性化せず、C1qに結合せず、C3を活性化しない。「抗体のFc領域」は、当業者には周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて規定される。一態様において、Fc領域はヒトFc領域である。一態様において、Fc領域は、突然変異S228Pおよび/またはL235Eおよび/またはP329G（KabatのEUインデックスに従う番号付け）を含むヒトIgG4サブクラスのものである。一態様において、Fc領域は、突然変異L234AおよびL235Aを含み、任意でP329Gを含む（KabatのEUインデックスに従う番号付け）、ヒトIgG1サブクラスのものである。

「野生型Fc領域」という用語は、自然に見いだされるFc領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を表す。野生型ヒトFc領域としては、ネイティブヒトIgG1 Fc領域（非AおよびAアロタイプ）、ネイティブヒトIgG2 Fc領域、ネイティブヒトIgG3 Fc領域およびネイティブヒトIgG4 Fc領域、ならびにそれらの天然に存在するバリアントが挙げられる。野生型Fc領域を、SEQ ID NO:01（IgG1、コーカサス人アロタイプ）、SEQ ID NO:02（IgG1、アフリカ系アメリカ人アロタイプ）、SEQ ID NO:03（IgG2）、SEQ ID NO:04（IgG3）、およびSEQ ID NO:05（IgG4）に示す。

バリアント（ヒト）Fc領域は、含まれているアミノ酸突然変異によって規定される。したがって、例えばP329Gという用語は、親（野生型）Fc領域との比較でアミノ酸位置329にプロリンからグリシンへの突然変異を有するバリアントFc領域を表す（KabatのEUインデックスに従う番号付け）。野生型アミノ酸の実体は明記されていなくてもよく、その場合、上述のバリアントは329Gと呼ばれる。

IgG1サブクラスの野生型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、227番目のシステイン残基で始まり446番目のグリシン残基で終結する以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異T366S、L368A、およびY407Vを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異T366Wを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234AおよびL235Aを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234A、L235A、T366S、L368A、およびY407Vを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234A、L235A、およびT366Wを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234A、L235A、およびP329Gを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234A、L235A、P329G、T366S、L368A、およびY407Vを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234A、L235A、P329G、およびT366Wを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234A、L235A、P329G、S354C、およびT366Wを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234A、L235A、P329G、S354C、T366S、L368A、およびY407Vを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異L234A、L235A、P329G、Y349C、およびT366Wを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異I253A、H310A、およびH435Aを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異H310A、H433A、およびY436Aを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異M252Y、S254T、およびT256Eを有するIgG1サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

IgG4サブクラスの野生型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異S228PおよびL235Eを有するIgG4サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異S228P、L235E、およびP329Gを有するIgG4サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異S228P、L235E、P329G、T366S、L368A、およびY407Vを有するIgG4サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

突然変異S228P、L235E、P329G、およびT366Wを有するIgG4サブクラスのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列:

を有する。

「完全長抗体」、「インタクト抗体」、および「抗体全体」という用語は、本明細書では相互可換的に使用され、ネイティブ抗体構造と実質的に類似する構造を有する抗体または本明細書に規定するFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。

「グリカン」という用語は多糖またはオリゴ糖を表す。グリカンは、本明細書では、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、グリコプロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖またはプロテオグリカンなどの複合糖質の糖質部分を指すためにも使用される。グリカンは、通常、単糖間のβ-グリコシド結合だけからなる。グリカンは、単糖残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーであることができ、線状または分岐状であることができる。

「グリコシルトランスフェラーゼ」という用語は、ヌクレオチド糖からオリゴ糖中の糖分子などのアクセプター分子に単糖部分を転移させる能力を有する酵素を表す。そのようなグリコシルトランスフェラーゼの例として、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖中でCH1ドメインとCH2ドメインとを接合している部分、例えばKabatのEUナンバーシステムで約216番目から約230番目まで、またはKabatのEUナンバーシステムで約226番目から約230番目までを表す。他のIgGサブクラスのヒンジ領域は、IgG1サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基との整列によって決定することができる。

ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を有する2つのポリペプチドからなる二量体型分子である。ヒンジ領域は一般的には、約25個のアミノ酸残基を含み、かつフレキシブルであり、付随する標的結合部位が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は3つのドメイン、すなわち上部、中央、および下部ヒンジドメインに細分することができる（例えばRoux, et al., J. Immunol. 161 （1998） 4083参照）。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRからのアミノ酸残基とヒトFRからのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質上すべてを含み、その可変ドメインでは、HVR（例えばCDR）のすべてまたは実質上すべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質上すべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含みうる。抗体の、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。

本明細書において使用する「超可変領域」または「HVR」という用語は、抗体可変ドメインのうち、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」）、かつ/または構造上明確なループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ/または抗原接触残基（「抗原接触部」）を含有する領域のそれぞれを指す。一般に、抗体は6つのHVRを含んでいて、3つはVH中であり（H1、H2、H3）、3つはVL中である（L1、L2、L3）。

HVRは、
（a）アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）および96〜101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 （1987） 901-917）、
（b）アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）および95〜102（H3）に存在するCDR（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）, NIH Publication 91-3242）、
（c）アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）および93〜101（H3）に存在する抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 （1996））、ならびに
（d）アミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）および94〜102（H3）を含む（a）、（b）および/または（c）の組み合わせ
を含む。

別段の表示がある場合を除き、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えばFR残基）は、本明細書では、前掲のKabatらに従って番号付けされる。

「単離された」抗体とは、その自然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば電気泳動（例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えばイオン交換または逆相HPLC）による決定で、純度95％超または99％超まで精製される。抗体純度の評価方法を概観するには、例えばFlatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 （2007） 79-87を参照されたい。

「単離された」核酸とは、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、その核酸分子を通常含有する細胞に含まれている核酸分子であるが、染色体外に存在するか、その自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が包含される。

「軽鎖」という用語は、ネイティブIgG抗体の短い方のポリペプチド鎖を表す。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てることができる。ヒトカッパ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:27を、またヒトラムダ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:28を参照されたい。

本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、例えば天然の突然変異を含有するバリアント抗体、またはモノクローナル抗体調製物の生産時に生じるバリアント抗体などといった考えうるバリアント抗体を除けば、該集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ/または同じエピトープに結合し、そのようなバリアントの存在量は一般に少量である。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、何か特定の方法による抗体の生産を必要とするとみなしてはならない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定するわけではないがハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を用いる方法など、さまざまな技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的方法は、本明細書において説明する。

「ネイティブ抗体」とは、さまざまな構造を有する天然の免疫グロブリン分子を指す。例えばネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合された2本の同一軽鎖および2本の同一重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体型糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインともいう、可変領域（VH）と、それに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）とを有し、第1の定常ドメインと第2の定常ドメインとの間にヒンジ領域が位置する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインともいう、可変領域（VL）と、それに続く定常軽鎖（CL）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てることができる。

「N結合型オリゴ糖」という用語は、アスパラギンアミノ酸残基においてアスパラギン-N-アセチルグルコサミン結合によってペプチドバックボーンに連結されているオリゴ糖を表す。N結合型オリゴ糖は「N-グリカン」とも呼ばれる。すべてのN結合型オリゴ糖はMan3GlcNAc2の共通五糖コアを有する。これらは、N-アセチルグルコサミン、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、フコース、およびシアル酸などの周辺糖（peripheral sugar）の存在ならびに周辺糖の分岐（アンテナとも呼ばれる）の数が相違する。任意で、この構造は、コアフコース分子および/またはキシロース分子も含有しうる。

「O結合型オリゴ糖」という用語は、スレオニンアミノ酸残基またはセリンアミノ酸残基においてペプチドバックボーンに連結されるオリゴ糖を表す。

「シアル酸」という用語は、カルボキシル化九炭糖のファミリーの任意のメンバーを表す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーはN-アセチル-ノイラミン酸（2-ケト-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノース-1-オン酸である（Neu5Ac、NeuAc、またはNANAと略記されることが多い）。このファミリーの第2のメンバーは、NeuAcのN-アセチル基がヒドロキシル化されているN-グリコリルノイラミン酸（Neu5GcまたはNeuGc）である。第3のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸（KDN）である（Nadano et al. （1986） J. Biol. Chem. 261:11550- 11557、Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265:21811-21819 （1990））。また、9-O-ラクチル-Neu5Acまたは9-O-アセチル-NeuSAcのような9-O-C1〜C6アシル-NeuSAc、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Acおよび9-アジド-9-デオキシNeu5Acなどの9-置換シアル酸も挙げられる。シアル酸ファミリーについて概観するには、例えばVarki, Glycobiol. 2 （1992） 25-40、Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed.（Springer-Verlag, New York （1992））を参照されたい。シアリル化手法におけるシアル酸化合物の合成および使用はWO92/16640において報告されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

抗体に関して「実質的に」という用語は、各産物（抗体）が、単一のグリコシル化状態を有することを意味し、その状態が単一部位または複数部位でのグリコシル化を含むかどうかは問わない。通例、抗体は、それが調製物中の抗体の少なくとも60重量％を構成する場合には、実質的に純粋である。例えば調製物中の抗体は、重量で、少なくとも約75％、ある特定の態様では少なくとも約80％、ある特定の態様では約85％、ある特定の態様では少なくとも約90％、ある特定の態様では少なくとも約95％、96％、97％、98％、最も好ましくは少なくとも約99％が、所望の抗体である。

「グリコシル化状態」という用語は、抗体の具体的なまたは所望のグリコシル化パターンを表す。「グリコフォーム」とは、ある特定のグリコシル化状態を含む抗体である。そのようなグリコシル化パターンとして、例えば、天然に生産されるか、組換え的、合成的、または半合成的に生産された1つまたは複数の糖の、抗体のFc領域の位置N-297における付加が挙げられる（Kabatに従う番号付け）。グリコシル化パターンは、当技術分野において公知の数多くの方法によって決定することができる。例えば、タンパク質上の糖質を分析する方法はUS 2006/0057638およびUS 2006/0127950において報告されている（これらの文献の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる）。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体重鎖または抗体軽鎖のうち、抗原への抗体の結合に関与するドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含んでいる。（例えばKindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. （2007） 91頁参照）。抗原結合特異性を付与するには単一のVHドメインまたはVLドメインで十分でありうる。さらにまた、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのVHドメインまたはVLドメインを使用してそれぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって、単離することができる。例えばPortolano, S., et al., J. Immunol. 150 （1993） 880-887、Clackson, T., et al., Nature 352 （1991） 624-628を参照されたい。

「N-グリコシル化部位」という用語は、グリカンが付加されているかまたはグリカンが付加されることができる、N-グリコシル化部位コンセンサス配列内のアミノ酸残基を表す。一般にN結合型グリカンは、アスパラギンアミノ酸（Asn、N）側鎖のアミド窒素原子に付加される。N-グリコシル化部位コンセンサス配列はAsn-X-Ser/Thrであり、ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができる。「N結合型グリコシル化」という用語は、例えばアスパラギンのアミド窒素原子に糖分子オリゴ糖（グリカンという）が付加された結果を表す。

抗体グリコシル化
ヒト抗体は主に、重鎖CH2ドメインの約297番目の位置のアスパラギン残基（Asn297）またはFab領域中のアスパラギン残基において、多かれ少なかれフコシル化されたバイアンテナ型複合型オリゴ糖でグリコシル化される（抗体アミノ酸残基は前掲のKabatに従って番号付けている）。バイアンテナ型糖鎖構造は、各アーム中において最大2つの連続したガラクトース（Gal）残基で終結することができる。アームは、中心マンノース残基へのグリコシド結合に応じて、（1,6）および（1,3）と表される。G0と表される鎖構造はガラクトース残基を含まない。G1と表される糖鎖構造は一方のアーム中に1つまたは複数のガラクトース残基を含有する。G2と表される糖鎖構造は各アーム中に1つまたは複数のガラクトース残基を含有する（Raju, T.S., Bioprocess Int.1 （2003） 44-53）。ヒト定常重鎖領域はKabatの前掲書およびBrueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 （1987） 1351-1361、Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 （1989） 515-527において詳細に報告されている。抗体Fc領域のCHO型グリコシル化は例えばRoutier, F.H., Glycoconjugate J. 14 （1997） 201-207に記載されている。

「抗体」という用語は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはT細胞抗原枯渇抗体など、さまざまな形態の抗体を表し、包含する（例えばWO98/33523、WO98/52976、およびWO00/34317参照）。一態様において、本明細書において報告する方法における抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。抗体の遺伝子工学は、例えばMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 （1984） 6851-6855、US 5,202,238およびUS 5,204,244、Riechmann, L., et al., Nature 332 （1988） 323-327、Neuberger, M.S., et al., Nature 314 （1985） 268-270、Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 （2005） 1117-1125に記載されている。

抗体は、一般に、2つのいわゆる完全長軽鎖ポリペプチド（軽鎖）と2つのいわゆる完全長重鎖ポリペプチド（重鎖）とを含む。完全長重鎖および軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、抗原と相互作用する結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般に完全長ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有している。完全長重鎖および軽鎖ポリペプチドのそれぞれは定常領域（一般にカルボキシル末端部分）を含む。完全長重鎖の定常領域は、（i）Fcガンマ受容体（FcγR）を持つ細胞、例えば食細胞への、または（ii）ブランベル（Brambell）受容体とも呼ばれる新生児型Fc受容体（FcRn）を持つ細胞への、抗体の結合を媒介する。これは、古典的補体系の因子、例えば成分（C1q）などといったいくつかの因子への結合も媒介する。また、完全長抗体の軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、すなわち4つのフレームワーク領域（FR）および3つの超可変領域（CDR）を含む。「完全長抗体重鎖」は、サブクラスIgEの抗体の場合、N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常ドメイン1（CH1）、抗体ヒンジ領域、抗体定常ドメイン2（CH2）、抗体定常ドメイン3（CH3）、および任意で抗体定常ドメイン4（CH4）からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）および抗体軽鎖定常ドメイン（CL）からなるポリペプチドである。完全長抗体鎖は、CLドメインとCH1ドメインの間および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合によって1つに連結されている。

近年、抗体のグリコシル化パターン、すなわち付加された糖鎖構造の糖組成および数の多さは、生物学的特性に強い影響を有することが報告されている（例えばJefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 （2005） 11-16参照）。哺乳動物細胞が生産する抗体は質量で2〜3％のオリゴ糖を含有する（Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 （1985） 5551-5557）。これは、例えばクラスGの抗体（IgG）の場合、マウス由来のIgGで2.3個のオリゴ糖残基（Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 （1987） 387-394）およびヒト由来のIgGで2.8個のオリゴ糖残基（Parekh, R.B., et al., Nature 316 （1985） 452-457）に相当し、一般的にはそのうちの2個はFc領域中のAsn297に位置し、残りは可変領域に位置する（Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 （2002） 16-31）。

本願において使用する「糖鎖構造」という用語は、指定されたアミノ酸残基における単一の規定のN結合型またはO結合型オリゴ糖を表す。したがって、「G1糖鎖構造を有する抗体」という用語は、Kabat番号付けスキームでアミノ酸位置297前後のアスパラギンアミノ酸残基に、またはFAB領域に、オリゴ糖の非還元末端に末端ガラクトース残基を1つだけ含んでいるバイアンテナ型オリゴ糖を含む抗体を表す。本願において使用する「オリゴ糖」という用語は、共有結合された単糖単位を2つまたはそれ以上含む多糖を表す。

本発明では、さまざまなN結合型オリゴ糖またはO結合型オリゴ糖を表記するために、個々の糖残基を、オリゴ糖分子の非還元末端から還元末端に向かって列挙する。最も長い糖鎖を表記のための基本鎖として選ぶ。N結合型またはO結合型オリゴ糖の還元末端は、抗体のアミノ酸バックボーンのアミノ酸に直接結合している単糖残基であり、一方、基本鎖の還元末端とは反対の末端に位置するN結合型またはO結合型オリゴ糖の末端を、非還元末端と呼ぶ。

すべてのオリゴ糖は、本明細書では、非還元糖の名称または略号（すなわちGal）、それに続いてグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合（1または2）、結合に関与する還元糖の環位置（2、3、4、6、または8）、次に還元糖の名称または略号（すなわちGlcNAc）で記載される。各糖は好ましくはピラノースである。標準的な糖鎖生物学の命名法を概観するには、Essentials of Glycobiology Varki et al. eds., 1999, CSHL Pressを参照されたい。

「規定の糖鎖構造」という用語は、本願では、糖鎖構造の非還元末端における単糖残基がある特定種類のものである糖鎖構造を表す。「規定の糖鎖構造」という用語は、本願では、糖鎖構造の非還元末端における単糖残基が規定されていて、ある特定種類のものである糖鎖構造を表す。

抗体精製
本願において使用する「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、「アフィニティークロマトグラフィー材料」を使用するクロマトグラフィー法を表す。アフィニティークロマトグラフィーにおいて、抗体は、それらの生物学的活性または化学構造に基づき、クロマトグラフィー材料のクロマトグラフィー官能基への静電相互作用、疎水結合および/または水素結合の形成に応じて分離される。特異的に結合した抗体をアフィニティークロマトグラフィー材料から回収するには、競合リガンドを加えるか、緩衝液のpH値、極性またはイオン強度などのクロマトグラフィー条件を変化させることができる。例示的な「アフィニティークロマトグラフィー材料」は、Ni（II）-NTAもしくはCu（II）-NTAなどの金属キレートクロマトグラフィー材料、またはプロテインAもしくはプロテインGが共有結合で連結されているクロマトグラフィー材料などの抗体アフィニティークロマトグラフィー材料、またはクロマトグラフィー官能基として酵素基質類似体、酵素コファクターもしくは酵素阻害剤が共有結合されているクロマトグラフィー材料などの酵素結合アフィニティークロマトグラフィー材料、またはクロマトグラフィー官能基として多糖、細胞表面受容体、糖タンパク質もしくはインタクトな細胞が共有結合で連結されているクロマトグラフィー材料などのレクチン結合クロマトグラフィー材料である。

一態様において、抗体軽鎖アフィニティーリガンドは、例えば、抗体にカッパ軽鎖か含まれているかラムダ軽鎖が含まれているかに応じてカッパ定常軽鎖またはラムダ定常軽鎖に特異的な、軽鎖定常ドメイン特異的捕捉試薬を使用する。そのような軽鎖定常ドメイン特異的捕捉試薬の例は、例えば大スケールでの高い流速と低い背圧を可能にする剛性の高いアガロースベースマトリックスに基づくKappaSelect（商標）およびLambdaFabSelect（商標）（GE Healthcare/BACから入手可能）である。これらの材料は、それぞれカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖の定常領域に結合する（軽鎖の定常領域を欠く抗体またはその断片は結合しない）リガンドを含有する。それゆえに、どちらも、軽鎖の定常領域を含有する他の標的分子、例えばIgG、IgAおよびIgMを結合する能力を有する。リガンドは、それらを標的分子への結合に容易に使用できるようにするために、長い親水性スペーサーアームを介してマトリックスに取り付けられる。それらは、ヒトIgカッパまたはヒトIgラムダのどちらかに対してスクリーニングされた一本鎖抗体断片に基づく。

「軽鎖」という用語は、ネイティブIgG抗体の短い方のポリペプチド鎖を表す。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てることができる。ヒトカッパ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:27を、またヒトラムダ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:28を参照されたい。

本願において使用される「に適用する」という用語および文法上それと等価な用語は、関心対象の物質を含有する溶液を固定相と接触させる、精製方法の部分工程を表す。精製しようとする関心対象の物質を含有する溶液は、固定相を通過して、固定相と溶液中の物質との間の相互作用をもたらす。例えばpH、伝導率、塩濃度、温度および/または流量などの条件に応じて、溶液の一部の物質が固定相に結合し、それと共に溶液から除去される。他の物質は溶解したままである。溶解したままの物質は素通り画分に見いだすことができる。「素通り画分」とは、クロマトグラフィー装置の通過後に得られる溶液を表し、これは、関心対象の物質を含有する適用された溶液であるか、カラムをフラッシュするために使用される緩衝液または固定相に結合している1つまたは複数の物質の溶出を引き起こすために使用される緩衝液でありうる。関心対象の物質は、その物質が実質的に均一な形態で得られるように、例えば沈殿、塩析、限外濾過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィーまたは溶媒体積低減など、当業者にはよく知られる方法によって、精製工程後に溶液から回収することができる。

本明細書において報告する方法においてその糖構造が改変されることができる抗体または抗体断片は、組換え手段によって生産することができる。組換え生産のための方法は、当技術分野では広く公知であり、真核細胞におけるタンパク質発現と、それに続く抗体または抗体断片の単離および薬学的に許容される純度までの精製を含む。抗体または抗体断片の発現には、抗体または抗体断片をコードする1つまたは複数の核酸が導入されたハイブリドーマ細胞または真核細胞が使用される。一態様において、真核細胞は、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、BHK細胞、ウサギ細胞、またはヒツジ細胞から選択される。別の態様において、真核細胞は、CHO細胞、HEK細胞またはウサギ細胞から選択される。発現後に、抗体または抗体断片は、細胞から（上清からまたは溶解後の細胞から）回収される。抗体の組換え生産のための一般的方法は、当技術分野では周知であり、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 （1999） 183-202、Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 （1996） 271-282、Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 （2000） 151-160、Werner, R.G., Drug Res. 48 （1998） 870-880の総説において報告されている。

抗体の精製は、細胞構成要素または他の夾雑物、例えば他の細胞核酸または細胞タンパク質を除去するために、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、その他当技術分野において周知の方法など、標準的な技法によって行うことができる（例えばAusubel, F.M, et al.（eds.）, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York （2005））。タンパク質精製には、例えば微生物タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー）、 イオン交換クロマトグラフィー（例えばカチオン交換（カルボキシメチルレジン）、アニオン交換（アミノエチルレジン）および混合モード交換）、チオフィリック吸着（例えばベータ-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドによるもの）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えばphenyl-sepharose、アザ-アレノフィリック（aza-arenophilic）レジンまたはm-アミノフェニルボロン酸）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えばNi（II）およびCu（II）-アフィニティー材料）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）、ならびにそれらの組み合わせ、例えば微生物タンパク質によるアフィニティークロマトグラフィーとカチオン交換クロマトグラフィーとアニオン交換クロマトグラフィーなど、異なる方法も確立され、広く使用されている（例えばVijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 （1998） 93-102参照）。一般的なクロマトグラフィー法およびそれらの使用は当業者には公知である。例えばHeftmann, E.（ed.）, Chromatography, 5^th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York （1992）、Deyl, Z.（ed.）, Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands （1998）、Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York （1991）、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice （1982）、Sambrook, J., et al.（eds.）, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. （1989）またはAusubel, F.M., et al.（eds.）, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York （2005）を参照されたい。

細胞培養法などによって生産された抗体または抗体断片の精製には、一般に異なるクロマトグラフィー工程の組み合わせを使用することができる。通常は（プロテインA）アフィニティークロマトグラフィーの後に、1つまたは2つの追加分離工程を行う。一態様において、追加クロマトグラフィー工程は、カチオン交換クロマトグラフィー工程およびアニオン交換クロマトグラフィー工程またはその逆である。最終精製工程は、凝集した免疫グロブリン、残存HCP（宿主細胞タンパク質）、DNA（宿主細胞核酸）、ウイルス、またはエンドトキシンのような微量の不純物および夾雑物を除去するためのいわゆる「ポリッシング工程」である。一態様において、最終精製工程は、フロースルーモードのアニオン交換クロマトグラフィーである。

本明細書において報告する方法
組換え生産された抗体または抗体断片の糖鎖構造は、使用した細胞株および使用した培養条件によって決定される。従来の下流処理技法では、特定の糖鎖構造の選択的除去は不可能である。

より詳細には、組換え生産されたモノクローナル抗体は、一般に、グリコシル化部位にグリコフォームの不均一な混合物を含む。このグリコシル化プロファイルは、宿主細胞中および培養培地中に存在する酵素活性や培養条件など、組換え生産中のさまざまな因子による影響を受ける。

優勢なグリコシル化、さらには予め決定されたグリコシル化を有する抗体、例えば中でも治療効果を有する抗体を生産する必要がある。

本明細書において報告する方法は、抗体を培養物から収集した後にN-グリコシル化部位のグリカンを酵素的に改変することによって、N-グリコシル化部位、例えばFab領域中またはFc領域中のN-グリコシル化部位に、規定のグリコシル化を有する抗体、すなわちFc領域グリコシル化部位に付加された、例えばFc領域中のAsn297に付加された、本質的に単一のグリコフォームを含有する抗体を提供すると同時に、改変に使用された酵素をリサイクルし、数回にわたって再使用することを可能にする。抗体のグリコシル化は所望の様式で改変することができるので、本明細書において報告する方法には、培養上清からの抗体精製に使用される標準的な作業手順に容易に組み込むことができるという利点がある。

「規定のグリコシル化を有する抗体」または「規定の糖鎖構造を有する抗体」という用語は、限られた数の異なるグリカンが（予め決定された）N-グリコシル化部位に、例えばFc領域においてAsn297に、付加されている抗体分子の集団を表す（KabatのEUインデックスに従う番号付け）。一態様では、グリカンの1つが、G0F、G1F、およびG2Fグリコフォームのうちの50％もしくはそれ以上、またはG0F、G1F、G2F、G1S1F、G2S1F、およびG2S2Fグリコフォームのうちの30％もしくはそれ以上を占める。

本明細書において使用する「実質的に」という用語は、化合物のうちの40％またはそれ以上、一態様では50％またはそれ以上が、同じグリコシル化を有すること、すなわちN-グリコシル化部位に、例えばFc領域中のAsn297（Kabatに従う番号付け）に同じグリカンを含むことを表す。

本明細書において報告する方法により、抗体はそのタイプおよびサイズにかかわりなく、規定のグリコフォームを含むように改変することができる。より具体的には、N-グリコシル化部位のグリコシル化、例えばFc領域中のN-グリコシル化部位のグリコシル化は、例えば抗体の意図した治療的応用のために、テーラーメイドすることができる。例えば、抗体のFc領域のガラクトシル化はがんの処置に有用である。さらに例えば、抗体のFc領域の、規定のグリコフォームへのシアリル化は、自己免疫障害の処置において有用である。異なる応用例では、Fc領域の脱ガラクトシル化および/または脱シアリル化が望ましい場合もある。さらに別の態様では、N-アセチルグルコサミン、GlcNAc、またはマンノース-N-アセチルグルコサミン-N-アセチルグルコサミン、Man-GlcNAc-GlcNAcなどの、GlcNAc残基とマンノース残基のコアを有するハイブリッド型構造の生産を達成しうる。前記はいずれも、本明細書において報告する方法を使用して生産しうる。というのも、所望する規定のグリコフォーム抗体を生産するために、本明細書において報告する方法を異なるグリコシル化酵素を用いて繰り返すことにより、任意の抗体および該抗体の任意の糖構造を段階的に改変することができるからである。

例えば、本明細書において報告する方法を使用して、モノクローナル抗体の不均一な集団から、G2グリコフォームを有する抗体を生産することができる。同じ方法を使用して、糖鎖工学的方法によって生産することができる不均一な非フコシル化抗体を、均一なG2グリコフォームに変換することができる。加えて、本明細書において報告する方法を使用してガラクトシル化を所望のレベルに調整することによって、抗体のガラクトシル化のバッチ間のばらつきにも対処することができる。

簡単に述べると、本明細書において報告する方法は、N-グリコシル化部位に、例えばFc領域中のN-グリコシル化部位にグリコシル化を有する抗体を、1つまたは複数のグリコシル化改変酵素と共にインキュベートする工程を含む。このインキュベーションは溶解した状態でまたはオンカラムで行うことができる。反応緩衝液は、選択された二次的酵素、任意でコファクターおよび任意でヌクレオチド糖の添加によって、さらに最適化することができる。次に、その混合物を室温で、または約37℃の高温でインキュベートする。その後、改変された抗体と改変酵素とを分離する。例えば、改変が溶液中で実行された場合は、抗体もしくは酵素またはその両方を、クロマトグラフィー材料に結合させ、連続的溶出によって、互いに分離させる。

一態様において、本明細書において報告する方法は、N-グリコシル化部位に、例えばFc領域中のN-グリコシル化部位にグリコシル化を有する抗体を含む溶液を、固相/支持体に固定化された抗体（軽鎖またはFc領域）アフィニティーリガンドに適用する工程を含む。支持体はカラムを構成し、そのカラムは洗浄緩衝液で洗浄された後、対応する所望の酵素的オンカラム糖構造改変に適した反応緩衝溶液で洗浄される。反応緩衝液は、選択された二次的酵素、任意でコファクターおよび任意でヌクレオチド糖の添加によって、さらに最適化することができる。次にカラムを室温または約37℃の高温でインキュベートする。その後、カラムを洗浄緩衝液で洗浄し、規定のグリコフォームを有する改変されたモノクローナル抗体を、溶出緩衝液を用いて固形支持体から溶出させる。次に、溶出した抗体を、中和緩衝液を使用して中和しうる。

一態様において、本明細書において報告する方法は、N-グリコシル化部位に、例えばFc領域中のN-グリコシル化部位にグリコシル化を有する抗体を含む溶液を、反応緩衝液中の1つまたは複数のグリコシル化改変酵素と共にインキュベートする工程を含む。反応緩衝液は、選択された二次的酵素、任意でコファクターおよび任意でヌクレオチド糖の添加によって、さらに最適化することができる。インキュベーションは、室温または約37℃の高温で行うことができる。抗体と改変酵素は、その後、クロマトグラフィー工程を使用して分離される。

反応緩衝液中で使用するためのヌクレオチド糖は、UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GalNAc、UDP-GlcNAc、UDP-GlcUA、UDP-Xyl、GDP-Man、GDP-Fuc、CMP-NeuSAc、CMP-NeuSGc、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。反応緩衝液中で使用される濃度は約0.5mM〜約5mMの範囲、諸局面では約1mM〜約1.5mMである。反応緩衝液中で使用するためのコファクターは、Mn^2＋、Ca^2＋、Mg^2＋、Na^＋、K^＋、α-ラクトアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されうる。反応緩衝液中で使用するためのコファクターの濃度は、約2mM〜約10mMの範囲内でありうる。

固相に固定化された抗体（軽鎖またはFc領域）アフィニティーリガンドは、精製および改変プロセス中はカラムに保持される。固相としては、非標的タンパク質および改変酵素の非特異的吸着が無視できる程度でしかないアガロース、sepharose、ポリアクリル系ポリマー、ポリスチレンおよび他の合成ポリマーが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。アフィニティーリガンドは、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル、エポキシド、アルデヒドまたは臭化シアンなど、固相へのさまざまな化学のいずれかによって、固相に共有結合される。そのようなコンジュゲーション化学は、Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press（Amsterdam, the Netherlands, Ed. 2008）およびWong, S., Chemistry of Protein Conjugation and CrossLinking, CRC Press（Boca Raton, Fla., 1991）に例示されているように、当技術分野では周知である。

洗浄緩衝液は、洗浄工程中に抗体とアフィニティーリガンドの間の高いアフィニティーが維持されることを確実にする。例えば、約7.2のpHを有するリン酸緩衝食塩水溶液（PBS）を洗浄緩衝液として使用することができるが、pHがある程度異なってもよいことは、当業者には理解される。洗浄緩衝液および反応緩衝液は、抗体とアフィニティーリガンドの間の高いアフィニティーが維持されると同時に、各酵素の活性も維持されることを確実にする。洗浄緩衝液および反応緩衝液は約25℃〜約40℃の温度およびその間の任意の温度で使用される。約37℃の温度が使用されることが多い。軽鎖アフィニティーリガンドに対する抗体の高いアフィニティーにとっての至適pH範囲は約6.0〜約8.0である。このpH範囲内で、緩衝液は、本明細書において報告する方法において使用することができるアフィニティーリガンドの至適pH範囲とオーバーラップする。それらには、TRIS緩衝液、BIS-TRIS緩衝液、MES緩衝液、BES緩衝液、MOPS緩衝液およびHEPES緩衝液などがあるが、それらに限定されるわけではない。

アフィニティーカラムの洗浄条件は非特異的結合を最小限にし、よって酵素反応に、よって抗体改変に、影響を及ぼす。洗浄条件は、抗体軽鎖アフィニティーリガンドと標的モノクローナル抗体の間の結合を破壊しないような条件である。

本明細書において報告する方法における使用に適した酵素は、改変に応じて、マンノシル-グルコサミントランスフェラーゼ（MGAT1、MGAT2およびMGAT3）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（β4GalT1、β4GalT2、β4GalT3、β4GalT4、β4GalT5、β4GalT6、β4GalT7）、シアリルトランスフェラーゼ（ST6Gal1、ST6Gal2）、マンノシダーゼ（αマンノシダーゼ-I、αマンノシダーゼ-II、α（1-2）マンノシダーゼ、α（1-6）マンノシダーゼ、α（1-2,3）マンノシダーゼ、α（1-2,3,6）マンノシダーゼ）、ヘキソサミニダーゼ（β-Ν-アセチルヘキソサミニダーゼ、β-Ν-アセチルグルコサミニダーゼ、α-N-アセチルグルコサミニダーゼ）、ガラクトシダーゼ（β-ガラクトシダーゼ、β（1-4）ガラクトシダーゼ、α（1-3,6）ガラクトシダーゼ）、シアリダーゼ（α（2-3,6,8）シアリダーゼ、α（2-3）シアリダーゼ）、フコシダーゼ（α-L-フコシダーゼ、α（1-6）フコシダーゼ、α（1-2）フコシダーゼ、α（1-3,4）フコシダーゼ、α（1-2,3,4）フコシダーゼ）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択することができる。

本明細書において報告する方法を使用して、例えばFc領域中に均一なG2糖鎖構造を有する抗体を生成させるために、ガラクトースから末端シアル酸を除去すること、またはガラクトースに末端シアル酸を付加することができる。したがって例えば、あらゆる結合からシアル酸を除去する非特異的ノイラミニダーゼ酵素、またはそれぞれのシアル酸を付加する特異的シアリダーゼを用いることができる。ガラクトシル化とシアル酸の除去または付加とを同時に達成するために、この酵素をガラクトシルトランスフェラーゼと併用することができる。これにより、少なくともグリコフォームG0、G1、G2、G1S1、およびG2S2を含む、Fc領域中にグリコシル化を有する抗体から、Fc領域中に規定のG2グリコフォームを有する抗体を得ることができる。

本明細書において報告する方法による抗体のグリコシル化の改変は、個々の酵素との連続的インキュベーションを使用して行うか、第1の酵素を加え、ある特定の期間後に第1の酵素を除去せずに第2の酵素を加える半連続的インキュベーションを使用して行うか、または両酵素が一緒に存在する状態での同時インキュベーションを使用して行うことができる。これらのプロトコールはいずれも、完全に溶液反応における改変と比較して、またはプロテインA上に固定化させた抗体を用いた改変と比較して、改良された改変をもたらす。

以下に、対応するトランスフェラーゼ酵素を用いて、Fc領域中に規定のガラクトシル化およびシアリル化を有する抗体を得ることにより、本明細書において報告する方法において使用される酵素的改変の工程を例示する。

オンカラムでのガラクトシル化
IgG1サブクラスの精製したヒト化抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー材料および抗体軽鎖アフィニティーリガンドクロマトグラフィー材料（GE HealthcareのKappa select）に適用した。結合した抗体を、オンカラムで、ガラクトシルトランスフェラーゼ（GalT1）とUDP-GALとを含む緩衝溶液と共に、インキュベートした。結果を以下の表に提示する。抗体軽鎖アフィニティーリガンドを含むカラムに抗体を結合させた場合の方が、達成されるガラクトシル化の量は多いことがわかる。

G0F＝2つの末端N-アセチルグルコサミン残基とフコースとを有する複合型N-グリカン
G1F＝1つの末端N-アセチルグルコサミン残基と1つの末端ガラクトース残基とフコースとを有する複合型N-グリカン
G2F＝2つの末端ガラクトース残基とフコースとを有する複合型N-グリカン

Fc領域中に均一なグリコシル化を有するIgG1サブクラスの精製したヒト化抗体（均一なG2Fグリコフォーム）を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー材料および抗体軽鎖アフィニティーリガンドクロマトグラフィー材料（GE HealthcareのKappa select）に適用した。結合した抗体を、オンカラムで、シアリルトランスフェラーゼ（ST6）とCMP-NANAとを含む緩衝溶液と共に、インキュベートした。結果を以下の表に提示する。抗体軽鎖アフィニティーリガンドを含むカラムに抗体を結合させた場合の方が、達成されるシアリル化の量は多いことがわかる。

アルカリホスファターゼの有無によってはプロテインAカラムでの収率が変化しなかった（19％G2F、56％G2S1F、25％G2S2F）。溶液中では、以下の結果を得ることができる。

G2F＝2つの末端ガラクトース残基とフコースとを有する複合型N-グリカン
G2S1F＝1つがシアル化されている2つの末端ガラクトース残基とフコースとを有する複合型N-グリカン
G2S2F＝どちらもシアル化されている2つの末端ガラクトース残基とフコースとを有する複合型N-グリカン

IgG4サブクラスのヒト抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー材料および抗体軽鎖アフィニティーリガンドクロマトグラフィー材料（GE HealthcareのKappa select）に適用した。結合した抗体を、オンカラムで、ガラクトシルトランスフェラーゼ（GalT1）とUDP-GALとを含む緩衝溶液と共に、インキュベートした。結果を以下の表に提示する。抗体軽鎖アフィニティーリガンドを含むカラムに抗体を結合させた場合の方が、達成されるガラクトシル化の量は多いことがわかる。

G0F＝2つの末端N-アセチルグルコサミン残基とフコースとを有する複合型N-グリカン
G1F＝1つの末端N-アセチルグルコサミン残基と1つの末端ガラクトース残基とフコースとを有する複合型N-グリカン
G2F＝2つの末端ガラクトース残基とフコースとを有する複合型N-グリカン

Fc領域中に均一なグリコシル化を有するIgG4サブクラスのヒト抗体（均一なG2Fグリコフォーム）をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー材料および抗体軽鎖アフィニティーリガンドクロマトグラフィー材料（GE HealthcareのKappa select）に適用した。結合した抗体を、オンカラムで、シアリルトランスフェラーゼ（ST6）とCMP-NANAとを含む緩衝溶液と共に、インキュベートした。結果を以下の表に提示する。抗体軽鎖アフィニティーリガンドを含むカラムに抗体を結合させた場合の方が、達成されるシアリル化の量は多いことがわかる。

n.d.＝未測定

Fab中に追加のグリコシル化部位を有するIgG1サブクラスのヒト化抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー材料および抗体軽鎖アフィニティーリガンドクロマトグラフィー材料（GE HealthcareのKappa select）に適用した。結合した抗体を、オンカラムで、シアリルトランスフェラーゼ（ST6）とCMP-NANAとを含む緩衝溶液と共に、インキュベートした。結果を以下の表に提示する。この例では、Fab中のN-グリコシル化部位のグリコシル化が改変された。抗体軽鎖アフィニティーリガンドを含むカラムに抗体を結合させた場合の方が、反応速度は向上することがわかる。

G2＝2つの末端ガラクトース残基を有する複合型N-グリカン
G2S1＝1つがシアル化されている2つの末端ガラクトース残基を有する複合型N-グリカン
G2S2＝どちらもシアル化されている2つの末端ガラクトース残基を有する複合型N-グリカン

IgG1サブクラスのヒト化抗体を含む無細胞培養上清をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー材料および抗体軽鎖アフィニティーリガンドクロマトグラフィー材料（GE HealthcareのKappa select）に適用した。結合した抗体を、オンカラムで連続的に、まず、ガラクトシルトランスフェラーゼ（GalT1）とUDP-GALとを含む緩衝溶液と共にインキュベートし、次にシアリルトランスフェラーゼ（ST6）とCMP-NANAとを含む緩衝溶液と共にインキュベートした。結果を以下の表に提示する。シアリルトランスフェラーゼは6時間のインキュベーション時間後に加えた。

精製したバルク材料を用いて同じ実験を繰り返した。

24時間後にシアリルトランスフェラーゼを添加する改良型kappa select法

オンカラムで使用した場合の酵素リサイクリング
IgG1サブクラスの組換えヒト化抗体を、アフィニティークロマトグラフィー材料に、抗体が該材料に結合する条件下で適用した。結合した抗体を、オンカラムで、ガラクトシルトランスフェラーゼ（GalT1）とUDP-GALとを含む緩衝溶液と共に、インキュベートした。インキュベーション後に、この溶液を回収し、さらなる酵素的改変反応のために、濃縮および緩衝液交換器によって再調整した。結果を以下の表に提示する（24時間時点）。

ガラクトシルトランスフェラーゼは、酵素的変換効率を喪失することなく1回再使用することができ、2回目は酵素的変換効率が約50％喪失するものの再使用できることがわかる。

IgG1サブクラスの組換えヒト化抗体を、アフィニティークロマトグラフィー材料に、抗体が該材料に結合する条件下で適用した。結合した抗体を、オンカラムで、シアリルトランスフェラーゼ（ST6）とCMP-NANAとを含む緩衝溶液と共に、インキュベートした。インキュベーション後に、この溶液を回収し、さらなる酵素的改変反応のために、濃縮および緩衝液交換によって再調整した。結果を以下の表に提示する（6時間時点）。

シアリルトランスフェラーゼは、酵素的変換効率を喪失することなく、少なくとも3回再使用できることがわかる。

溶液中で使用した場合の酵素リサイクリング
GalTおよびST6との共インキュベーション
UDP-GALとCMP-NANAとを含む反応緩衝液中で、IgG1サブクラスのヒト化抗体、ガラクトシルトランスフェラーゼ（GalT1）およびシアリルトランスフェラーゼ（ST6）を共インキュベートした。その後、酵素的に改変された抗体と酵素とを、カチオン交換クロマトグラフィー（S-sepharose）を使用して分離した。回収された酵素の比酵素活性を各使用サイクル後に測定した。結果を以下の表に提示する。

反応条件: 抗体25mg、GalT 2.5mg、ST6 2.5mg、50mM MES、pH6.4、反応体積10ml。
S-Sepharoseクロマトグラフィー条件: 0.5×10cm S-Sepharoseカラム; 20カラム体積の40mM TRIS pH7.4で洗浄。Tris-HClはGalTの溶出をもたらした; 30mM MES、95mM NaCl、pH5.6までの工程による抗体の溶出; 50mM MES、pH6.4、1M NaClまでの直線勾配によるST6の溶出。

SDS-pageゲル分析により、GalTまたはST6の分解生成物または凝集生成物はいずれもなく、分離は良好であることが明らかになった（図1参照）。

GalT、改変された抗体、およびST6はカチオン交換カラムにおいて分離することができた。

GalTとのインキュベーション
UDP-GALを含む反応緩衝液中で、IgG1サブクラスのヒト化抗体およびガラクトシルトランスフェラーゼ（GalT1）を共インキュベートした。その後、酵素的に改変された抗体と酵素とを、カチオン交換クロマトグラフィー（S-sepharose）を使用して分離した。ガラクトシルトランスフェラーゼを3回再使用した。結果を以下の表に提示する。

ST6とのインキュベーション
CMP-NANAを含む反応緩衝液中で、IgG1サブクラスのヒト化抗体およびシアリルトランスフェラーゼ（ST6）を共インキュベートした。その後、酵素的に改変された抗体と酵素とを、カチオン交換クロマトグラフィー（S-sepharose）を使用して分離した。シアリルトランスフェラーゼを3回再使用した。結果を以下の表に提示する。

本明細書において報告する方法において使用される抗体
キメラ抗体およびヒト化抗体
ある特定の態様において、本明細書において報告する方法において改変される抗体はキメラ抗体である。

例えばUS 4,816,567およびMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 （1984） 6851-6855にはある特定のキメラ抗体が記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる一例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合性断片も、それらが本明細書において報告する方法において使用される抗体軽鎖アフィニティーリガンドに結合する限り、包含される。

ある特定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。通例、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティーを保ちつつヒトに対する免疫原性を低減するために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、HVR、例えばCDR（またはその一部分）が非ヒト抗体に由来し、FR（またはその一部分）がヒト抗体配列に由来する、1つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はヒト定常領域の少なくとも一部分も任意で含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば抗体の特異性またはアフィニティーを回復または改良するために、非ヒト抗体（例えばHVR残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。

ヒト化抗体およびそれらの作製方法については、例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 （2008） 1619-1633に総説があり、例えばRiechmann, I. et al., Nature 332 （1988） 323-329、Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 （1989） 10029-10033、US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321、およびUS 7,087,409、Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 （2005） 25-34（特異性決定領域（SDR）移植に関する記載がある）、Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 （1991） 489-498（「リサーフェイシング（resurfacing）」に関する記載がある）、Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 （2005） 43-60（「FRシャフリング」に関する記載がある）、ならびにOsbourn, J. et al., Methods 36 （2005） 61-68およびKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 （2000） 252-260（FRシャフリングへの「誘導選択」アプローチに関する記載がある）にも、さらに記載されている。

ヒト化に使用しうるヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えばSims, M.J. et al., J. Immunol. 151（1993）2296-2308参照）、軽鎖可変領域または重鎖可変領域が特定サブグループであるヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えばCarter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289およびPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151（1993）2623-2632参照）、ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13（2008）1619-1633参照）およびFRライブラリーのスクリーニングによって得られるフレームワーク領域（例えばBaca, M. et al., J. Biol. Chem. 272（1997）10678-10684およびRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271（19969 22611-22618参照）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

ヒト抗体
ある特定の態様において、本明細書において報告する方法において改変される抗体はヒト抗体である。

ヒト抗体は、当技術分野において公知のさまざまな技法を使用して生産することができる。ヒト抗体はvan Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 （2001） 368-374およびLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 （2008） 450-459に概説されている。

ヒト抗体は、抗原による攻撃に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製しうる。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含有しており、それらは内在性免疫グロブリン遺伝子座と置き換わっているか、または染色体外に存在するか、もしくはその動物の染色体にランダムに組み込まれている。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法を概観するには、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 （2005） 1117-1125を参照されたい。例えばXENOMOUSE（商標）技術が記載されているUS 6,075,181およびUS 6,150,584、HUMAB（登録商標）技術が記載されているUS 5,770,429、K-M MOUSE（登録商標）技術が記載されているUS 7,041,870、VELOCIMOUSE（登録商標）技術が記載されているUS 2007/0061900、および免疫再構築マウスが記載されているWO2007/131676も参照されたい。そのような動物が生成させるインタクト抗体のヒト可変領域は、例えば異なるヒト定常領域と組み合わせることなどによって、さらに改変しうる。

ヒト抗体はハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、既に記載されている（例えばKozbor, D., J. Immunol. 133 （1984） 3001-3005、Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York （1987） , pp.51-63およびBoerner, P. et al., J. Immunol. 147 （1991） 86-95参照）。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって生成させたヒト抗体も、Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 （2006） 3557-3562に記載されている。さらなる方法として、例えばUS 7,189,826（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の生産に関する記載がある）およびNi, J., Xiandai Mianyixue 26 （2006） 265-268（ヒト-ヒトハイブリドーマに関する記載がある）に記載されているものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 （2005） 927-937およびVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 （2005） 185-191にも記載されている。

ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成させることもできる。そのような可変ドメイン配列は、次に、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法を以下に説明する。

ライブラリー由来の抗体
本明細書において報告する方法において改変された抗体は、1つまたは複数の所望の活性を有する抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離しうる。例えば当技術分野では、ファージディスプレイライブラリーを作成し、所望の結合特徴を持つ抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするために、さまざまな方法が公知である。そのような方法については、例えばHoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 （2001） 1-37に総説があり、例えばMcCafferty, J. et al., Nature 348 （1990） 552-554、Clackson, T. et al., Nature 352 （1991） 624-628、Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 （1992） 581-597、Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 （2003） 161-175、Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 （2004） 299-310、Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 （2004） 1073-1093、Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 （2004） 12467-12472およびLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 （2004） 119-132には、さらに詳しく記載されている。

ある特定のファージディスプレイ法では、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 （1994） 433-455に記載されているように、VH遺伝子とVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって個別にクローニングし、それらをファージライブラリーでランダムに組み換えた後、そのライブラリーを抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には、抗体断片を、一本鎖Fv（scFv）断片として、またはFab断片として、ディスプレイする。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に対する高アフィニティー抗体を与える。あるいは、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 （1993） 725-734に記載されているように、免疫化を一切行わずに、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングすることで、広範な非自己抗原に対する抗体、そしてまた自己抗原に対する抗体の、単一の供給源とすることもできる。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 （1992） 381-388に記載されているように、幹細胞から非再編成V遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するPCRプライマーを使用して高度に可変なCDR3領域をコードすると共に、インビトロで再編成を行うことにより、ナイーブライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーが記載されている特許公報として、例えばUS 5,750,373、ならびにUS 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936、およびUS 2009/0002360が挙げられる。

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書では、ヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。

多重特異性抗体
ある特定の態様において、本明細書において報告する方法において改変される抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体断片として調製することができる。多重特異性（二重特異性）抗体の断片は、それらが本明細書において報告する方法において使用される抗体軽鎖アフィニティーリガンドに結合する限り、包含される。

多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 （1983） 537-540、WO93/08829、およびTraunecker, A. et al., EMBO J.10 （1991） 3655-3659参照）、および「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」工学（例えばUS 5,731,168参照）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。多重特異性抗体は、抗体Fcヘテロ二量体型分子を作製するために静電ステアリング効果を工作すること（WO2009/089004）、2つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋すること（例えばUS 4,676,980およびBrennan, M. et al., Science 229 （1985） 81-83参照）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を生産すること（例えばKostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 （1992） 1547-1553参照）、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えばHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 （1993） 6444-6448参照）、および一本鎖Fv（sFv）二量体を使用すること（例えばGruber, M et al., J. Immunol. 152 （1994） 5368-5374参照）、および例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 （1991） 60-69に記載されているように三重特異性抗体を調製することによって作製してもよい。

「オクトパス（Octopus）抗体」など、3つまたはそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、ここに包含される（例えばUS 2006/0025576参照）。

本明細書において報告する方法において改変される抗体または断片には、「二重作用性Fab」、すなわち「DAF」も包含される（例えばUS 2008/0069820参照）。

本明細書における抗体または断片には、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792、およびWO2010/145793に記載の多重特異性抗体も包含される。

組換え法および組成物
抗体は、例えばUS 4,816,567に記載されている組換え法および組成物を使用して生産されうる。これらの方法のために、抗体をコードする1つまたは複数の単離された核酸が提供される。

ネイティブ抗体またはネイティブ抗体断片の場合、2つの核酸、すなわち軽鎖またはその断片用に1つと、重鎖またはその断片用に1つが必要である。そのような核酸は抗体のVLを含むアミノ酸配列および/または抗体のVHを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖および/または重鎖）をコードする。これらの核酸は同じ発現ベクター上または異なる発現ベクター上に存在することができる。

ヘテロ二量体型重鎖を有する二重特異性抗体の場合、4つの核酸、すなわち第1の軽鎖用に1つ、第1のヘテロ単量体Fc領域ポリペプチドを含む第2の軽鎖用に1つ、第2の軽鎖用に1つ、および第2のヘテロ単量体Fc領域ポリペプチドを含む第2の重鎖用に1つが必要になる。例えば、ヘテロ二量体型重鎖の一方は、いわゆる「ノブ突然変異」（T366Wおよび任意でS354CまたはY349Cのうちの1つ）を含み、他方はいわゆる「ホール突然変異」（T366S、L368A、およびY407V、ならびに任意でY349CまたはS354C）を含む（例えばCarter, P. et al., Immunotechnol. 2 （1996） 73参照）。そのような核酸は、抗体の第1のVLを含むアミノ酸配列および/または抗体の第1のヘテロ単量体Fc領域を含んでいる第1のVHを含むアミノ酸配列および/または抗体の第2のVLを含むアミノ酸配列および/または抗体の第2のヘテロ単量体Fc領域を含んでいる第2のVHを含むアミノ酸配列（例えば抗体の第1および/もしくは第2の軽鎖ならびに/または第1および/もしくは第2の重鎖）をコードする。

これらの核酸は同じ発現ベクター上または異なる発現ベクター上に存在することができ、通常これらの核酸は2つまたは3つの発現ベクター上に位置する。すなわち、1つのベクターはこれらの核酸のうちの2つまたはそれ以上を含みうる。これらの二重特異性抗体の例はCrossMabおよびT細胞二重特異性抗体である（例えばSchaefer, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 （2011） 11187-1191参照）。

一態様では、本明細書において報告する方法において使用される抗体をコードする単離された核酸が提供される。

さらなる一態様では、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。

さらなる一態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。

そのような一態様において、宿主細胞は以下のベクターを含む（例えば以下のベクターを用いて形質転換されている）。
- ネイティブ抗体またはネイティブ抗体断片の場合、
（1）抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む、ベクター、または
（2）抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター、
- ヘテロ二量体型重鎖を有する二重特異性抗体の場合、
（1）一方が「抗体の第1のVLを含み他方が抗体の第1のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸の第1の対を含む第1のベクター、および一方が抗体の第2のVLを含み他方が抗体の第2のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸の第2の対を含む第2のベクター、または
（2）可変ドメインのうちの1つ（好ましくは軽鎖可変ドメイン）を含むアミノ酸配列をコードする第1の核酸を含む第1のベクター、一方が軽鎖可変ドメインを含み他方が第1の重鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列をコードする核酸の対を含む第2のベクター、および一方が、第2のベクターの場合と同様に、それぞれ他の軽鎖可変ドメインを含み他方が第2の重鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列をコードする核酸の対を含む第3のベクター、または
（3）抗体の第1のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、抗体の第1のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター、抗体の第2のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第3のベクター、および抗体の第2のVHを含むアミノ酸配列をコードする第4のベクター。

一態様において、宿主細胞は真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ球系細胞（例えばY0、NSO、Sp20細胞）である。一態様では、上記で提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養する工程、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から任意で回収する工程、および、本明細書において報告する方法を用いて抗体のグリコシル化を改変する工程を含む、抗体を作製する方法が提供される。

抗体の組換え生産の場合は、抗体をコードする核酸、例えば上述のものを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定すること、または組換え法によって生産すること、または化学合成によって得ることができる。

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のための適切な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば抗体は、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要でない場合は特に、細菌中で生産しうる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えばUS 5,648,237、US 5,789,199およびUS 5,840,523を参照されたい。（大腸菌における抗体断片の発現が記載されているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology、Vol. 248, Lo, B.K.C. （ed.）, Humana Press, Totowa, NJ （2003）, pp.245-254も参照されたい）。 発現後に、抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離して、さらに精製することができる。

原核生物だけでなく、糸状菌または酵母などの真核微生物も、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の生産をもたらす真菌株および酵母株を含めて、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 （2004） 1409-1414およびLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 （2006） 210-215参照。

グリコシル化された抗体を発現させるための適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎生物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎生物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と一緒に使用しうる、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用することができる、バキュロウイルス株は、数多く同定されている。

植物細胞培養も宿主として用いることができる。例えばUS 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978、およびUS 6,417,429（トランスジェニック植物における抗体生産のためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）を参照されたい。

脊椎動物細胞も宿主として使用しうる。例えば、懸濁液中での成長に適応した哺乳動物細胞株は役立ちうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 （1977） 59-74などに記載の293または293細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）、マウスセルトリ細胞（Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 （1980） 243-252などに記載のTM4細胞）、サル腎臓細胞（CV1）、アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）、ヒト子宮頸がん細胞（HELA）、イヌ腎臓細胞（MDCK）、バッファローラット肝臓細胞（BRL3A）、ヒト肺細胞（W138）、ヒト肝臓細胞（Hep G2）、マウス乳房腫瘍（MMT060562）、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 （1982） 44-68などに記載のTRI細胞、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、DHFR-CHO細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 （1980） 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体生産に適したある特定の哺乳動物宿主細胞株を概観するには、例えばYazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.（ed.）, Humana Press, Totowa, NJ （2004）, pp.255-268を参照されたい。

薬学的製剤
本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような抗体を1種類または複数種類の随意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. （ed.）（1980））と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度において受容者にとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール; 3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン;単糖、二糖、および他の糖質、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;および/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）などがあるが、それらに限定されるわけではない。本明細書における、例示的な薬学的に許容される担体としては、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えばヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）が、さらに挙げられる。rhuPH20を含むある特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は、US 2005/0260186およびUS 2006/0104968に記載されている。一局面では、sHASEGPが、1種類または複数種類の追加グリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。

例示的な凍結乾燥抗体製剤はUS 6,267,958に記載されている。水性抗体製剤としてはUS 6,171,586およびWO2006/044908に記載されているものが挙げられ、後者の製剤はヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。

本明細書における製剤は、処置される特定適応症の必要に応じて、複数種類の活性成分、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有しうる。そのような活性成分は、適宜、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。

活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入するか、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に封入するか、またはマクロエマルションに封入することができる。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. （ed.）（1980）に開示されている。

徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形物の形態である、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられる。

インビボ投与に使用される製剤は一般に無菌である。無菌は例えば滅菌濾過膜による濾過などによって容易に達成することができる。

治療方法および組成物
本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体はいずれも治療方法に使用しうる。

一局面では、医薬として使用するための、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体が提供される。さらなる局面では、疾患の処置において使用するための、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体が提供される。ある特定の態様では、処置方法において使用するための、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体が提供される。ある特定の態様において、本発明は、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体の有効量を個体に投与する工程を含む、疾患を有する個体を処置する方法において使用するための、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体を提供する。そのような一態様において、本方法は、個体に、有効量の少なくとも1つの追加治療剤を投与する工程をさらに含む。ある特定の態様において、本発明は、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体の有効量を個体に投与する工程を含む、個体を処置する方法において使用するための、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体を提供する。上記の態様のいずれにおいても「個体」は好ましくはヒトである。

さらなる一局面において、本発明は、医薬の製造または調製における、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体の使用を提供する。一態様において、医薬は疾患を処置するための医薬である。さらなる一態様において、医薬は、疾患を有する個体に有効量の医薬を投与する工程を含む疾患を処置する方法において使用するための医薬である。そのような一態様において、本方法は、個体に、有効量の少なくとも1つの追加治療剤を投与する工程をさらに含む。さらなる一態様において、医薬は、個体に有効量の医薬を投与する工程を含む個体における治療方法において使用するための医薬である。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。

さらなる一局面において、本発明は、疾患を処置するための方法を提供する。一態様において、本方法は、そのような疾患を有する個体に本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体の有効量を投与する工程を含む。そのような一態様において、本方法は、個体に、有効量の少なくとも1つの追加治療剤を投与する工程をさらに含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。

さらなる一局面において、本方法は、例えば上記の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一態様において、薬学的製剤は、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体のいずれかと、少なくとも1つの追加治療剤とを含む。

本発明の抗体は、単独でまたは他の作用物質と組み合わせて、治療に使用することができる。例えば本発明の抗体は、少なくとも1つの追加治療剤と共投与しうる。

上記のそのような併用療法は、併用投与（この場合は2つまたはそれ以上の治療剤が同じ製剤または別個の製剤に含まれている）を包含すると共に、個別投与も包含し、その場合は、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体の投与を、1種類または複数種類の追加治療剤の投与の前に、1種類または複数種類の追加治療剤の投与と同時に、および/または1種類または複数種類の追加治療剤の投与の後に、行うことができる。一態様において、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体の投与と追加治療剤の投与は、互いに約1ヶ月以内、または約1、2、もしくは3週間以内、または約1、2、3、4、5、もしくは6日以内に行われる。本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体は、放射線治療と組み合わせて使用することもできる。

本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体（および任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与、そして局所処置にとって望ましい場合は、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短期間であるか慢性的であるかにも一部依存して、任意の適切な経路で、例えば静脈内注射または皮下注射などの注射によって、行うことができる。限定するわけではないが、単回投与、またはさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む、さまざまな投薬スケジュールが、ここでは考えられる。

本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体は、優良医療規範（good medical practice）に合致する様式で、製剤化され、調合され、かつ投与される。この文脈において考慮すべき因子としては、処置される特定障害、処置される特定哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に公知の他の因子が挙げられる。抗体は、問題の障害を防止または処置するために現在使用されている1種類または複数種類の作用物質と共に製剤化する必要があるわけではないが、任意でそのようにしてもよい。そのような他の作用物質の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または処置のタイプ、および上記で述べた他の因子に依存する。これらは、一般に、上述したものと同じ投薬量および投与経路で使用されるか、本明細書に記載する投薬量の約1〜99％で、または実験的/臨床的に適切であると決定された任意の投薬量および任意の経路で使用される。

疾患の防止または処置に関して、本明細書において報告する方法のいずれかを用いて改変された抗体の適切な投薬量（単独で使用する場合、または1つもしくは複数の他の追加治療剤と併用する場合）は、処置すべき疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体を防止のために投与するのか治療のために投与するのか、治療歴、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存することになる。抗体は、患者に1回で、または一連の処置で、適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば1回または複数回の独立した投与によるか、または持続注入によるかを問わず、約1μg/kg〜15mg/kg（例えば0.5mg/kg〜10mg/kg）の抗体を、患者に投与するための初回候補投薬量とすることができる。典型的な1日量は、上述の因子に依存して約1μg/kgから100mg/kgまで、またはそれ以上に及びうる。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、持続される。抗体の例示的投薬量の1つは約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲内である。したがって約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、もしくは10mg/kg（またはそれらの任意の組み合わせ）の1つまたは複数の用量を患者に投与することができる。そのような用量は（例えば患者が抗体の投与を約2回〜約20回、または例えば約6回受けることになるように）間欠的に、例えば毎週または3週ごとに投与することができる。高用量の初回負荷量を投与した後に、それより低い用量を1回または複数回投与してもよい。ただし他の投薬レジメンも役立ちうる。この治療の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニタリングされる。

本明細書において言及した特許、特許出願、および刊行物の開示はいずれもすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

以下の実施例および図面は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。記載した手順には、本発明の要旨から逸脱することなく、変更を加えることができると理解される。

本明細書において報告され実施例5によるS-Sepharose分離の溶出画分のSDS-page。

GalT反応溶液（5mM MnCl2、10mM UDP-Gal、100mM MES、0.05mg/ml GalT、pH6.5）:
153mgのUDP-Gal（MW＝610.27g/mol）
32mgのMnCl2（MW＝125.84g/mol）
1回用: 460μLのGalT（c＝5.43mg/mL; 10μg/2mg抗体→300μL中10μg＝0.033mg/ml）
複数回用: 460μLのGalT（c＝5.43mg/mL; 15μg/1mg AK→300μL中15μg＝0.05mg/mL）
100mM MES緩衝液pH6.5中

ST6反応溶液（0.1mM ZnCl2、200nM AP、50mM MES、1.7mg/ml CMP-NANA、0.7mg/ml ST6、pH6.5）:
50μLのZnCl（100mM溶液: 1mLの50mM MES中13.6mg）
28μLのアルカリホスファターゼ（AP）（c＝20mg/mL、MW＝56,000g/mol）
1回用: 167mgのCMP-NANA（1000μg/2mg抗体→300μLあたり1000μg＝3.34mg/mL）
複数回用: 83.5mgのCMP-NANA（500μg/1mg AK→300μLあたり500μg＝1.67mg/mL）
1回用: 6mLのST6（c＝5.45mg/mL、目標: 300μL（2mg AK）中200μg＝0.67mg/mL）
複数回用: 6mLのST6（c＝5.45mg/mL、目標:300μL（1mg AK）中200μg＝0.67mg/mL）
50mM MES緩衝液pH6.5中

緩衝液:
再生緩衝液1（0.1Mリン酸）
再生緩衝液2（3Mグアニジン-HCl）
平衡化緩衝液（25mM Tris、25mM NaCl、5mM EDTA、pH7.1）
洗浄緩衝液1（100mM MES、pH6.5）: 1000mLのH2O中21.3mgのMES、pH6.5（50％（w/v）NaOHで調節）
洗浄緩衝液2（1M Tris、pH7.2）
洗浄緩衝液3（50mM MES、pH6.5）:洗浄緩衝液100mM MESを蒸留H2Oと1:1
溶出緩衝液Kappa select（0.1Mグリシン、pH2.7）: 100mLのH2O中750mgのグリシン、pH2.7（25％（w/v）HClで調節）
溶出緩衝液プロテインA（25mM Na-クエン酸、pH2.8）

実施例1
オンカラムでのバルク材料のガラクトシル化
・2カラム体積の再生緩衝液1、10カラム体積の平衡化緩衝液および4カラム体積の洗浄緩衝液1を適用することによって、プロテインAカラムまたはKappa selectカラムを再生し、平衡化し、洗浄する。
・2mgのIgG（バルク材料）をカラムに適用する。
・10カラム体積の洗浄緩衝液1で洗浄する。
・2mLのガラクトシル化反応溶液（0.033mg/ml GalTを含有）を適用し、0.8mLを流す。
・それぞれ25℃で（2、7、または24時間）インキュベートする。
・8カラム体積の洗浄緩衝液1で洗浄する。
・各溶出緩衝液（プロテインAの場合は2カラム体積、kappa selectの場合は8カラム体積）で溶出させ、pH調節には1M Tris緩衝液（pH9.0）を使用する。

実施例2
オンカラム（プロテインA）でのIgG1バルク材料のシアリル化
・2カラム体積の再生緩衝液1、10カラム体積の平衡化緩衝液および10カラム体積の洗浄緩衝液3を適用することによって、プロテインAカラムまたはkappa selectカラムを再生し、平衡化し、洗浄する。
・2mgのIgG（バルク材料）をカラムに適用する。
・2mLのシアリル化反応溶液（1.7mg/mlではなく3.3mg/mlのCMP-NANA、±AP）を適用し、0.8mLを流す。
・37℃（2、7、24、または48時間）および25℃（48時間）でそれぞれインキュベートする。
・4カラム体積の洗浄緩衝液3で洗浄する。
・2カラム体積の溶出緩衝液（クエン酸ナトリウム）で溶出させ、pH調節には1M Tris緩衝液（pH9.0）を使用する。

オンカラム（Kappa select）でのIgG1バルク材料のシアリル化
・2カラム体積の平衡化緩衝液、3カラム体積の再生緩衝液2、4カラム体積の平衡化緩衝液および2カラム体積の洗浄緩衝液3を適用することによって、プロテインAカラムまたはkappa Selectカラムを再生し、平衡化し、洗浄する。
・2mgのIgG（バルク材料）をカラムに適用する。
・3カラム体積の洗浄緩衝液3で洗浄する。
・2mLのシアリル化反応溶液（3.3mg/mlのCMP-NANA、±AP）を適用し、0.8mLを流す。
・37℃（2、7、および24時間）および25℃（24時間）でそれぞれインキュベートする。
・3カラム体積の洗浄緩衝液3で洗浄する。
・8カラム体積の溶出緩衝液Kappa selectで溶出させ、pH調節には1M Tris緩衝液（pH9.0）を使用する。

実施例3
細胞培養上清の連続的なガラクトシル化およびシアリル化
・2カラム体積の再生緩衝液1、10カラム体積の平衡化緩衝液を適用することによって、プロテインAカラムまたはKappa selectカラムを再生し、平衡化する。
・1mgのIgG（上清中）をカラムに適用する。
・10カラム体積の平衡化緩衝液、次に2カラム体積の洗浄緩衝液2および6カラム体積の洗浄緩衝液1で洗浄する。
・2mLのガラクトシル化反応溶液を適用し、0.8mLを流す。
・25℃で約6〜24時間（十分なガラクトシル化を可能にするように）インキュベートする。
・8カラム体積の洗浄緩衝液1、10カラム体積の平衡化緩衝液、2カラム体積の洗浄緩衝液2および6カラム体積の洗浄緩衝液3で洗浄する。
・2mLのシアリル化反応溶液を適用し、0.8mLを流す。
・インキュベートする（例えば、25℃でそれぞれ2、7、もしくは24時間またはそれ以上）。
・8カラム体積の洗浄緩衝液1で洗浄する。
・各溶出緩衝液（プロテインAの場合は2カラム体積、Kappa selectの場合は8カラム体積）で溶出させ、pH調節には1M Tris緩衝液（pH9.0）を使用する。

実施例4
バルク材料の連続的なガラクトシル化およびシアリル化
・2カラム体積の再生緩衝液1、10カラム体積の平衡化緩衝液および4カラム体積の洗浄緩衝液1を適用することによって、プロテインAカラムまたはKappa selectカラムを再生し、平衡化し、洗浄する。
・1mgのIgG（バルク材料）をカラムに適用する。
・10カラム体積の洗浄緩衝液1で洗浄する。
・2mLのガラクトシル化反応溶液を適用し、0.8mLを流す。
・25℃で約6〜24時間（十分なガラクトシル化を可能にするように）インキュベートする。
・8カラム体積の洗浄緩衝液1、10カラム体積の平衡化緩衝液、2カラム体積の洗浄緩衝液2および6カラム体積の洗浄緩衝液3で洗浄する。
・2mLのシアリル化反応溶液を適用し、0.8mLを流す。
・インキュベートする（例えば、25℃でそれぞれ2、7、もしくは24時間またはそれ以上）。
・8カラム体積の洗浄緩衝液1で洗浄する。
・各溶出緩衝液（プロテインAの場合は2カラム体積、Kappa selectの場合は8カラム体積）で溶出させ、pH調節には1M Tris緩衝液（pH9.0）を使用する。

実施例5
溶液中でのガラクトシル化およびシアリル化と酵素回収
・25mgの抗体、2.5mgのガラクトシルトランスフェラーゼおよび2.5mgのシアリルトランスフェラーゼを10mLの50mM MES緩衝液pH6.4中でインキュベートする。
・反応後に、反応溶液を、50mM MES pH6.4で平衡化したS-Sepharoseカラム（0.5×10cm）に適用する。
・結合していない材料を除去するために、5カラム体積の50mM MES pH6.4で洗浄する。
・20カラム体積の40mM Tris緩衝液pH7.4でカラムを洗浄し、かつそれによってガラクトシルトランスフェラーゼを溶出させる。
・50mM MES pH6.4で再平衡化する。
・30mM MES pH5.6および95mM NaClを含む緩衝溶液（40カラム体積）で抗体を溶出させる。
・10カラム体積で50mM MES pH6.4および1M NaClまでの直線勾配により、シアリルトランスフェラーゼを溶出させる。
・標的酵素またはヒト化抗体を含有するフラクションをプールし、限外濾過装置（Amicon Ultra-15、10kDa）を使用して濃縮する。

実施例6
酵素再使用試験
・ガラクトシルトランスフェラーゼ: 反応緩衝液（100mM MES、10mM UDP-Gal、5mM MnCl2、pH6.5）78.5μL中の抗体500μgを、ガラクトシルトランスフェラーゼ2.5μgと共に、37℃で規定の期間、例えば6.5時間または24時間、インキュベートする。
・シアリルトランスフェラーゼ: 水61.8μl中の抗体500μg、水に溶解したCMP-NANA 250μg、シアリルトランスフェラーゼ50μg、200nMアルカリホスファターゼ、0.1mM ZnCl2を、37℃で規定の期間、例えば6.5時間または24時間、インキュベートする。
・qTOF-ESMSによるガラクトシル化の分析: 試料の変性および還元（およそ250μgの抗体、4Mグアニジニウム、TCEP）;1％ギ酸を含む20％アセトニトリルへの緩衝液交換; ESMS分析。

Claims (16)

1. 以下の工程を含む、改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体の酵素的生産のための方法:
   （a）N-グリコシル化部位におけるグリコシル化を（規定の形態へと）改変するための十分な時間にわたってかつ適切な条件下で、N-グリコシル化部位にグリコシル化を有する抗体を、1つまたは複数の酵素（および1つまたは複数の活性化された糖残基）と共にインキュベートする工程、
   （b）改変されたグリコシル化を該N-グリコシル化部位に有する該抗体を、1つまたは複数のクロマトグラフィー工程において該1つまたは複数の酵素から分離し、かつそれによって、（i）改変されたグリコシル化を該N-グリコシル化部位に有する該抗体を生産し、かつ（ii）1つまたは複数のリサイクルされる酵素を得る工程、ならびに
   （c）工程（b）の1つまたは複数のリサイクルされる酵素を用いて、工程（a）を少なくとも1回繰り返す工程。
2. 前記インキュベートする工程が、溶液中であるか、または、抗体（軽鎖もしくはFc領域）アフィニティーリガンドに結合した前記抗体を用いる、請求項1に記載の方法。
3. 工程（b）において、前記改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体の、前記1つまたは複数の酵素からの分離が、カチオン交換クロマトグラフィーによる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記1つまたは複数の酵素が、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ガラクトシルトランスフェラーゼがβ4GalT1である、請求項4に記載の方法。
6. 前記シアリルトランスフェラーゼがST6である、請求項4または5に記載の方法。
7. 前記カチオン交換クロマトグラフィーが、
   （i）ガラクトシルトランスフェラーゼおよび/またはシアリルトランスフェラーゼと前記改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体とを含む溶液を、カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
   （ii）該カチオン交換クロマトグラフィー材料を任意で洗浄する（該改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体を溶出させることなく、結合していない化合物を該カチオン交換クロマトグラフィー材料から除去するため）工程、
   （iii）第1の溶液を該カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、かつそれによって、（該ガラクトシルトランスフェラーゼが存在する場合には）該ガラクトシルトランスフェラーゼを、該カチオン交換クロマトグラフィー材料から溶出させる工程、
   （iv）第2の溶液を該カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、かつそれによって、該改変されたグリコシル化をN-グリコシル化部位に有する抗体を、該カチオン交換クロマトグラフィー材料から溶出させる工程、ならびに
   （v）該カチオン交換クロマトグラフィー材料に直線（塩）勾配を適用し、かつそれによって、（該シアリルトランスフェラーゼが存在する場合には）該シアリルトランスフェラーゼを、該カチオン交換クロマトグラフィー材料から溶出させる工程
   を含む、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
8. - 工程（i）の溶液が、pH5.0〜pH6.5のpH値を有する2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液であり、
   - 工程（ii）の溶液が、pH5.0〜pH6.5のpH値を有する2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液であり、
   - 工程（iii）の溶液が、pH6.6〜pH8.0のpH値を有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）緩衝溶液であり、
   - 工程（iv）の溶液が、pH5.0〜pH6.5のpH値を有し約75mM〜約125mMの塩化ナトリウム（NaCl）を含む2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液であり、かつ
   - 前記直線勾配が、工程（iv）の溶液から、pH5.0〜pH6.5のpH値を有し約750mM〜約1250mMの塩化ナトリウム（NaCl）を含む2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝溶液までの勾配である、
   請求項7に記載の方法。
9. 前記繰り返す工程が1〜3回である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記カチオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホプロピルカチオン交換基を有する架橋アガロースのマトリックスを有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記抗体が、二価単一特異性抗体または二価二重特異性抗体または抗体Fab断片である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記抗体がヒトIgG1またはIgG4サブクラスの抗体である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記N-グリコシル化部位が、Fab領域N-グリコシル化部位であるか、または、アスパラギン残基297（Kabatに従う番号付け）のFc領域N-グリコシル化部位である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
16. 請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法を用いて生産される抗体。

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