定義
如本文所使用,重鏈及輕鏈之所有恆定區及恆定域中之胺基酸位置均根據Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國國家衛生研究院公眾健康服務中心(Public Health Service, National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)中所描述之Kabat編號系統編號且在本文中稱為「根據Kabat編號」。特定言之,Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國國家衛生研究院公眾健康服務中心, Bethesda, MD (1991)之Kabat編號系統(參見第647-660頁)用於κ及λ同型之輕鏈恆定域CL。特定言之,Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)用於恆定重鏈域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3,其在本文中在此情況下進一步藉由指代「根據Kabat EU索引」編號來闡明)。 亦必須注意,除非上下文另有明確規定,否則如在本文中及在隨附申請專利範圍中所使用,單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此,舉例而言,提及「一細胞」包括複數個此類細胞及熟習此項技術者已知之其等效物等。同樣,術語「一(a)」(或「一(an)」)、「一或多種(個)」及「至少一種(個)」在本文中可互換使用。亦應注意,術語「包含」、「包括」及「具有」可互換使用。 對於熟習此項技術者,將例如多肽之胺基酸序列轉化為編碼此胺基酸序列之對應核酸序列之步驟及方法為熟知的。因此,核酸表徵為由個別核苷酸組成之其核酸序列及同樣表徵為從而編碼之多肽之胺基酸序列。 術語「約」表示其後所跟數值之+/- 20%之範圍。在一個實施例中,術語約表示其後所跟數值之+/- 10%之範圍。在一個實施例中,術語約表示其後所跟數值之+/- 5%之範圍。 術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構,包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段,只要其呈現所需抗原結合活性即可。 術語「抗體依賴性細胞毒性(ADCC)」為藉由Fc受體結合調節之功能,且係指在效應細胞存在下藉由如本文所揭示之抗體裂解靶細胞。在一個實施例中,在效應細胞存在下(諸如,新鮮分離的PBMC (周邊血液單核細胞)或自白血球層之純化效應細胞(如單核或NK (自然殺手)細胞)),藉由用如本文所揭示之抗體處理表現紅血球系細胞(例如表現重組人CD19之K562細胞)之CD19配製物來量測ADCC。將靶細胞用Cr-51標記,且隨後與抗體一起培育。將標記細胞與效應細胞一起培育,且分解上清液以釋放Cr-51。對照包括靶標內皮細胞與效應細胞(但不含抗體)之培育。藉由量測該等結合Fcγ受體表現細胞,諸如以重組方式表現FcγRI及/或FcγRIIA或NK細胞(基本上表現FcγRIIIA)之細胞,來研究引起調節ADCC之最初步驟的抗體含量。在一個較佳實施例中,量測對於NK細胞上FcγR之結合。 「抗體片段」係指不同於完整抗體,包含完整抗體之一部分,結合完整抗體所結合之抗原的分子。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')
2
;雙功能抗體;線性抗體;單鏈抗體分子(例如scFv);及由抗體片段形成之多特異性抗體。 術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種,而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。 抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五個主要類別之抗體:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且此等抗體中之若干者可進一步分成子類(同型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。 術語「補體依賴性細胞毒性(CDC)」係指在互補序列存在下由如本文所揭示之抗體誘導之細胞裂解。在一個實施例中,在互補序列存在下,藉由用如本文所揭示之抗體處理表現CD19之人類內皮細胞來量測CDC。在一個實施例中,細胞用鈣黃綠素標記。在抗體在30 µg/ml濃度下誘導20%或更多之靶細胞裂解時發現CDC。可在ELISA中量測對於補體因子C1q之結合。在此分析中,向大體上塗覆一系列濃度之抗體的ELISA盤添加純化人類C1q或人類血清。藉由針對C1q之抗體,隨後過氧化物酶標記之結合物來偵測C1q結合。偵測結合(最大結合Bmax)量測為在405 nm (OD405)下過氧化酶受質ABTS® (2,2'-次偶氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸])之光密度。 「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性,其隨抗體類別變化。抗體效應功能之實例包括:C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合性;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調;及B細胞活化。 可藉由抗體之Fc區與Fc受體(FcR)相互作用來調節Fc受體結合依賴性效應功能,該等Fc受體為造血細胞上之特異的細胞表面受體。Fc受體屬於免疫球蛋白超家族,且已顯示其介導藉由免疫複合體吞噬作用來排除包覆抗體之病原體,及經由抗體依賴性介導之細胞毒性(ADCC)來裂解紅血球及包覆相對應抗體的各種其他細胞靶標(例如腫瘤細胞)等兩種作用(參見例如,Van de Winkel, J.G.及Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524)。FcR係依其針對免疫球蛋白同型之特異性定義:針對IgG抗體之Fc受體被稱為FcγR。例如於Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492;Capel, P.J.等人, Immunomethods 4 (1994) 25-34;de Haas, M.等人., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341;及Gessner, J.E.等人, Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248中描述Fc受體結合性。 IgG抗體之Fc區(FcγR)之受體之交聯觸發廣泛多種效應功能,包括吞噬作用、抗體依賴性細胞毒性及炎性介質釋放,以及免疫複合物清除及抗體產量之調節。在人類中,已表徵三種類別之FcγR,其為: - FcγRI (CD64)以高親和性結合單體IgG,且表現在巨噬細胞、單核球、嗜中性白血球及嗜酸性球上。在Fc區IgG內在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327及P329 (根據Kabat之EU索引編號)中至少一者之修飾會降低與FcγRI之結合性。位置233-236處之IgG2殘基經取代為IgG1及IgG4會使與FcγR之結合性降低10³倍,且消除人類單核球對受抗體敏化之紅血球之反應(Armour, K.L.等人, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。 - FcγRII (CD32)以中等至低親和性結合複合的IgG,且進行廣泛地表現。此受體可分為兩種子型:FcγRIIA及FcγRIIB。在許多涉及殺滅之細胞(例如,巨噬細胞、單核球、嗜中性白血球)上發現FcγRIIA,且其似乎能夠活化殺滅程序。FcγRIIB似乎在抑制程序中起一定作用,且在B細胞、巨噬細胞上及肥大細胞及嗜酸性球球上發現FcγRIIB。在B細胞上,其似乎起到抑止進一步產生免疫球蛋白及同型轉換為(例如)IgE類別之功能。在巨噬細胞上,當經由FcγRIIA介導時,FcγRIIB用以抑制吞噬作用。在嗜酸性球及肥大細胞上,經由IgE結合至其獨立受體,B形態可有助於抑止此等細胞之活化。發現FcγRIIA結合減小,例如對於包含至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292及K414 (根據Kabat之EU索引編號)中之一者處具有突變之IgG Fc區的抗體。 - FcγRIII (CD16)以中等至低親和性結合IgG,且以兩個類型存在。在NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性球及一些單核球及T細胞上發現FcγRIIIA,且介導ADCC。FcγRIIIB在嗜中性白血球上高度表現。發現FcγRIIIA結合減小,例如對於包含至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338及D376 (根據Kabat之EU索引編號)中之一者處具有突變之IgG Fc區的抗體。 人類IgG1上之對於Fc受體之結合位點之定位、以上所提及之突變位點及量測結合FcγRI及FcγRIIA之方法描述於Shields, R.L.等人. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604中。 如本文所使用,術語「Fc受體」係指表徵為存在與該受體相關的細胞質ITAM序列之活化受體(參見例如,Ravetch, J.V.及Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290)。此類受體為FcγRI、FcγRIIA及FcγRIIIA。術語「無FcγR結合」表示在10 µg/ml之抗體濃度下,如本文所揭示之抗體與NK細胞之結合為如WO 2006/029879揭示之抗OX40L抗體LC.001之結合實驗值之10%或更低。 當IgG4展示經減低的FcR結合時,其他IgG子類別之抗體則會展示強烈結合。然而,Pro238;Asp265;Asp270;Asn297 (丟失Fc碳水化合物);Pro329及234、235、236、及237;Ile253;Ser254;Lys288;Thr307;Gln311;Asn434及His435是就算改變也會提供減低FcR結合之殘基(Shields, R.L.等人 J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604;Lund, J.等人, FASEB J. 9 (1995) 115-119;Morgan, A.等人, Immunology 86 (1995) 319-324;及EP 0 307 434)。 本文中之術語「Fc區」用於定義含有至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈的C端區。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一個實施例中,人類IgG重鏈Fc區係自Cys226或自Pro230或自Ala 231延伸至重鏈之羧基端。然而,Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或不存在。 如本文所揭示之抗體包含如Fc區,在一個實施例中,來源於人源之Fc區。在一個實施例中,Fc區包含人類恆定區之所有部分。抗體之Fc區直接涉及補體活化、C1q結合、C3活化及Fc受體結合。雖然抗體對於補體系統之影響取決於特定條件,但C1q結合係由Fc區內之限定結合位點造成。此類結合位點在目前技術中已知且由以下描述:例如 Lukas, T.J.等人, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560;Brunhouse, R.及Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917;Burton, D.R.等人, Nature 288 (1980) 338-344;Thommesen, J.E.等人, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004;Idusogie, E.E.等人, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184;Hezareh, M.等人, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168;Morgan, A.等人, Immunology 86 (1995) 319-324;以及EP 0 307 434。此類結合位點為例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329 (根據Kabat之EU索引編號)。子類別IgG1、IgG2及IgG3之抗體通常展示補體活化、C1q結合及C3活化,而IgG4並不活化補體系統、並不結合C1q且並不活化C3。「抗體之Fc區」為熟習此項技術者熟知之術語且界定於抗體之木瓜蛋白酶裂解之基體上。在一個實施例中,Fc區為人類Fc區。在一個實施例中,Fc區屬於包含突變體S228P及/或L235E及/或P329G (根據Kabat之EU索引編號)之人類IgG4子類別。在一個實施例中,Fc區屬於包含突變L234A及L235A及視情況P329G (根據Kabat之EU索引編號)之人類IgG1子類別。 術語「野生型Fc區」表示與在自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。野生型人類Fc區包括天然人類IgG1 Fc區(非A異型及A異型)、天然人類IgG2 Fc區、天然人類IgG3 Fc區及天然人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變體。野生型Fc區在以下中表示:SEQ ID NO: 01 (IgG1,高加索人異型)、SEQ ID NO: 02 (IgG1,非裔美國人異型)、SEQ ID NO: 03 (IgG2)、SEQ ID NO: 04 (IgG3)及SEQ ID NO: 05 (IgG4)。 由含有胺基酸突變來限定變體(人類)Fc區。因此,舉例而言,術語P329G表示相對於親本(野生型) Fc區在胺基酸位置329 (根據Kabat之EU索引編號)處脯胺酸突變為甘胺酸之變體Fc區。野生型胺基酸之一致性可為非特定的,在此情況下前述變體被稱作329G。 IgG1子類別之野生型人類Fc區之多肽鏈具有以位置227處之半胱胺酸殘基開始且以位置446處之甘胺酸殘基結束的以下胺基酸序列:
。 具有突變T366S、L368A及Y407V之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變T366W之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A及L235A之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A、L235A、T366S、L368A及Y407V之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A、L235A及T366W之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A、L235A及P329G之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A、L235A、P329G、T366S、L368A及Y407V之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A、L235A、P329G及T366W之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A及Y407V之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A、L235A、P329G、S354C及T366W之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A、L235A、P329G、S354C、T366S、L368A及Y407V之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變L234A、L235A、P329G、Y349C及T366W之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變I253A、H310A及H435A之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變H310A、H433A及Y436A之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變M252Y、S254T及T256E之IgG1子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 IgG4子類別之野生型人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變S228P及L235E之IgG4子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變S228P、L235E及P329G之IgG4子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變S228P、L235E、P329G、T366S、L368A及Y407V之IgG4子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 具有突變S228P、L235E、P329G及T366W之IgG4子類別之變異人類Fc區之多肽鏈具有以下胺基酸序列:
。 術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用來指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。 術語「聚糖」表示多糖或寡醣。聚醣在本文中亦用於指醣結合物之碳水化合物部分,諸如醣蛋白、醣脂、醣肽、醣蛋白質組、肽聚醣、脂多醣或蛋白聚醣。聚醣通常僅由單醣之間的
β -
糖苷鍵組成。聚醣可為單醣殘基之均聚物或雜聚物,且可為直鏈或分支鏈。 術語「糖基轉移酶」表示能夠自核苷酸糖將單醣部分轉移至受體分子(諸如寡醣中之糖分子)的酶。此類糖基轉移酶之實例包括(但不限於)半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶。 術語「鉸鏈區」表示抗體重鏈多肽之一部分,其連接野生型抗體重鏈CH1域及CH2域,例如根據Kabat之EU編號系統自約位置216至約位置230或根據Kabat之EU編號系統自約位置226至約位置230。可藉由與IgG1子類別序列之鉸鏈區半胱胺酸殘基進行比對來判定其他IgG子類之鉸鏈區。 鉸鏈區通常為由具有相同胺基酸序列之兩個多肽組成的二聚分子。鉸鏈區一般包含約25個胺基酸殘基,且為可撓性的,從而允許相關靶標結合位點獨立地移動。鉸鏈區可再分為三個域:上部、中間及下部鉸鏈域(參見例如Roux等人, J. Immunol. 161 (1998) 4083)。 「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中,人類化抗體將包含至少一個且典型地兩個可變域之實質上所有者,其中所有或實質上所有HVR (例如CDR)均對應於非人類抗體之彼等HVR,且所有或實質上所有FR均對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。 如本文所使用,術語「高變區」或「HVR」係指包含序列上高變的胺基酸殘基延伸(「互補決定區」或「CDR」)及/或結構上形成定義之環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之抗體可變域的每一域。一般而言,抗體包含六個HVR;三個在VH (H1、H2、H3)中,且三個在VL (L1、L2、L3)中。 HVR包括 (a) 胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處存在之高變環(Chothia, C.及Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917); (b) 胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處存在之CDR(Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.); (c) 胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處存在之抗原觸點(MacCallum 等人 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));及 (d) (a)、(b)及/或(c)之組合,包括胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)及94-102 (H3)。 除非另外指示,否則在本文中,係根據Kabat等人( 同前文獻)對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。 「經分離之」抗體為已與其天然環境之組分分離的抗體。在一些實施例中,抗體純化至大於95%或99%純度,如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評定抗體純度之方法之綜述,參見例如,Flatman, S. 等人, J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87。 「經分離之」核酸係指已與其天然環境之組分分離的核酸分子。經分離之核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子,但該核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置之染色體位置處。 術語「輕鏈」表示天然IgG抗體之較短多肽鏈。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩個類型中之一者,稱為κ (kappa)及λ (lambda),參見人類κ輕鏈恆定域之SEQ ID NO: 27及人類λ輕鏈恆定域之SEQ ID NO: 28。 如本文所使用,術語「單株抗體」係指獲自實質上同質抗體之群體的抗體,亦即包含相同及/或結合相同抗原決定基之群體的個別抗體,除例如含有天然存在之突變或在製備單株抗體配製物期間產生之可能變體抗體以外,此類變體一般以少量存在。相比於典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體配製物,單株抗體配製物之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此,修飾語「單株」指示抗體之特性為自實質上均質之抗體群體獲得,且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言,根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得,包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體顯示方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法、本文所描述的製備單株抗體之此類方法及其他例示性方法。 「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言,天然IgG抗體為約150,000道爾頓之雜四聚體醣蛋白,其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。從N端至C端,各重鏈具有可變區(VH),亦稱為可變重域或重鏈可變域,隨後三個恆定域(CH1、CH2及CH3),其中鉸鏈區位於第一恆定域與第二恆定域之間。類似地,自N端至C端,各輕鏈具有可變區(VL),亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域,隨後為恆定輕鏈(CL)域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一者,稱為κ (kappa)及λ (lambda)。 術語「N-連接寡醣」表示藉助於天冬醯胺-N-乙醯基葡糖胺連接連接至肽主鏈天冬醯胺胺基酸殘基處之寡糖。N-連接寡糖亦稱為「N-聚醣」。所有N-連接寡核苷酸醣類均具有Man3GlcNAc2之常見五碳醣核心。其不同之處在於,周邊糖之存在及周邊糖之分支(亦稱為觸角)數目,該等周邊糖諸如N-乙醯基葡糖胺、半乳糖、N-乙醯基半乳糖胺、海藻糖及唾液酸。視情況,此結構亦可含有核心海藻糖分子及/或木糖分子。 術語「O-連接寡醣」表示連接至肽主鏈蘇胺酸或絲胺酸胺基酸殘基處之寡糖。 術語「唾液酸」表示九-碳羧化糖家族之任何成員。唾液酸家族之最常見成員為N-乙醯基-神經胺糖酸(2-酮-5-乙醯胺基-3,5-二去氧基-D-甘油-D-半乳糖壬酮糖吡喃糖-1-酮酸(通常縮寫為Neu5Ac、NeuAc、NeuNAc或NANA)。該家族之第二成員為N-羥乙醯基-神經胺糖酸neuraminic(Neu5Gc或NeuGc),其中NeuNAc之N-乙醯基經羥基化。第三唾液酸家族成員為2-酮-3-去氧-尤羅索尼克酸(nonulosonic acid) (KDN)(Nadano等人(1986) J. Biol. Chem. 261:11550-11557;Kanamori等人, J. Biol. Chem. 265:21811-21819 (1990))。亦包括9-取代的唾液酸,諸如9-O-C
1
-C
6
醯基-NeuSAc,如9-O-乳醯-Neu5Ac或9-O-乙醯基-NeuSAc、9-去氧-9-氟-Neu5Ac及9-疊氮基-9-去氧-Neu5Ac。關於唾液酸家族之綜述,參見例如Varki, Glycobiol. 2 (1992) 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer編 (Springer-Verlag, New York (1992))。唾液酸化合物在唾液酸化步驟中之合成及用途揭示於WO 92/16640中,該揭示內容係以其全文併入本文中。 關於抗體,術語「實質上」表示個別產物(抗體)具有單一糖基化狀態,無論此狀態是否包括單一位點或多個位點處之糖基化。通常,當抗體按重量計構成至少60%之配製物中之抗體時,該抗體為實質上純的。舉例而言,按重量計,配製物中之抗體為至少約75%;在某些實施例中,至少約80%;在某些實施例中,在至少約85%;在某些實施例中,至少約90%;在某些實施例中,至少約95%、96%、97%、98%,且最佳至少約99%之所需抗體。 術語「糖基化狀態」表示抗體之特異性或所需糖基化模式。「糖型」為包含特定糖基化狀態之抗體。此類糖基化模式包括例如連接抗體之Fc區之位置N-297 (根據Kabat編號)處之一或多個糖,其中該等糖天然地、以重組方式、合成地或半合成地製備。可藉由此項技術中已知之許多方法來測定糖基化模式。舉例而言,分析蛋白質上之碳水化合物之方法已在US 2006/0057638及US 2006/0127950中揭示(其揭露內容以全文引用之方式併入本文中)。 術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗體與抗原結合的域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域通常具有類似的結構,其中各域包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如,Kindt, T.J.等人 Kuby Immunology,第6版, W.H. Freeman及Co., N.Y. (2007),第91頁),單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外,可使用來自結合抗原之抗體的VH或VL域來分離結合特定抗原之抗體以分別篩選互補VL或VH域之集合庫。參見例如,Portolano, S.等人, J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T.等人, Nature 352 (1991) 624-628)。 術語「N-糖基化位點」表示連接或可連接至聚糖之N-糖基化位點共同序列內之胺基酸殘基。一般而言,N-連接聚醣連接至天冬醯胺胺基酸(Asn,N)側鏈之醯胺氮原子。N-糖基化位點共同序列為Asn-X-Ser/Thr,其中X可為除脯胺酸外之任何胺基酸殘基。術語「N-連接糖基化」表示糖分子寡醣(表示為聚糖)連接至例如天冬醯胺之醯胺氮原子之結果。
抗體糖基化
人類抗體主要在重鏈CH2域或在Fab區中之約位置297處之天冬醯胺殘基(Asn297)處用大體上海藻糖基化雙觸角複合寡醣進行糖基化(根據Kabat進行抗體胺基酸殘基編號,前述)。雙觸角糖結構可藉由各臂中之至多兩個連續半乳糖(Gal)殘基封端。根據結合至中央甘露糖殘基之糖苷表示臂(1,6)及(1,3)。表示為G0之糖結構不包含半乳糖殘基。表示為G1之糖結構在一個臂中含有一或多個半乳糖殘基。表示為G2之糖結構在各臂中含有一或多個半乳糖殘基(Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53)。人類恆定重鏈區由Kabat,前述及由Brueggemann, M.等人, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361;Love, T.W.等人, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527詳細報導。抗體Fc區之CHO型糖基化例如由Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207所描述。 術語「抗體」表示及涵蓋各種形式之抗體,諸如人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體或T細胞抗原消耗抗體(參見例如WO 98/33523、WO 98/52976及WO 00/34317)。在一個實施例中,如本文所揭示之方法中之抗體為人類或人類化抗體。抗體之基因工程例如描述於以下中:Morrison, S.L.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855;US 5,202,238及US 5,204,244;Riechmann, L.等人, Nature 332 (1988) 323-327;Neuberger, M.S.等人, Nature 314 (1985) 268-270;Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125。 一般而言,抗體包含兩個所謂全長輕鏈多肽(輕鏈)及兩個所謂全長重鏈多肽(重鏈)。全長重鏈及輕鏈多肽中之每一者含有包含與抗原相互作用之結合區之可變域(可變區) (一般而言,全長多肽鏈之胺基端部分)。全長重鏈及輕鏈多肽中之每一者包含恆定區(一般而言,羧基端部分)。全長重鏈之恆定區介導抗體結合至以下:i)攜帶Fcγ受體(FcγR)之細胞,諸如吞噬細胞,或ii)攜帶新生Fc受體(FcRn) (亦稱為Brambell受體)之細胞。其亦介導與一些因子之結合,該等因子包括經典補體系統之因子,諸如組分(C1q)。全長抗體之輕鏈或重鏈之可變域轉而包含不同片段,亦即四個構架區(FR)及三個高變區(CDR)。在子類別IgE之抗體之情況下,「全長抗體」重鏈為在N端至C端方向上由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體鉸鏈區、抗體恆定域2 (CH2)、抗體恆定域3 (CH3)及視情況抗體恆定域4 (CH4)組成的多肽。「全長抗體輕鏈」為在N端至C端方向上由抗體輕鏈可變域(VL)及抗體輕鏈恆定域(CL)組成的多肽。全長抗體鏈經由CL域與CH1域之間及全長抗體重鏈之鉸鏈區之間的多肽間二硫鍵連接在一起。 近年來已報導,抗體之糖基化模式,亦即糖組合物及多個所連接糖結構,對於生物特性具有強烈影響(參見例如Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16)。由哺乳動物細胞產生之抗體含有2-3質量%寡糖(Taniguchi, T.等人, Biochem. 24 (1985) 5551-5557)。例如在抗體類別G (IgG)中,此等效於小鼠源IgG中之2.3寡醣殘基(Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394)及人源IgG中之2.8寡醣殘基(Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457),其中一般而言,兩個係位於Fc區Asn297處,且剩下的位於可變區(Saba, J.A.等人, Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31)。 如本申請案內所使用,術語「糖結構」表示在規定胺基酸殘基處之單一、限定N-或O-連接寡醣。因此,術語「具有G1糖結構之抗體」表示在根據Kabat編號方案約胺基酸位置297處之天冬醯胺胺基酸殘基處包含或在FAB區雙觸角寡醣中在寡醣之非還原性末端處僅包含一個末端半乳糖殘基的抗體。如本申請案內所使用,術語「寡醣」表示包含兩個或更多個共價連接單醣單位之聚合醣。 對於本發明中之不同N-或O-連接寡糖之記法,個別糖殘基係自寡醣分子之非還原端至還原端列舉。將最長糖鏈選擇作為記法之基礎鏈。N-或O-連接寡醣之還原端為單醣殘基,其直接結合至抗體之胺基酸主鏈之胺基酸,而N-或O-連接寡醣之末端(其位於作為基礎鏈之還原端之相反端處)稱為非還原端。 所有寡糖在本文中均用以下進行描述,非還原糖(亦即,Gal)之名稱或縮寫,隨後糖苷鍵之組態(
α
或
β
),環鍵(1或2),涉及該鍵之還原糖之環位置(2、3、4、6或8),且接著還原糖之名稱或縮寫(亦即,GlcNAc)。各糖較佳地為哌喃醣。對於標準糖生物學命名法之綜述參見Essentials of Glycobiology Varki等人編, 1999, CSHL Press。 術語「限定之糖結構」在本申請案內表示糖結構之非還原端處之單醣殘基為特異性種類之糖結構。術語「限定之糖結構」在本申請案內表示醣結構之非還原端處之單醣殘基為限定的且為特異性種類之糖結構。
抗體純化
如在本申請案內所使用,術語「親和性層析」表示採用「親和性層析材料」之層析方法。在親和性層析中,基於抗體生物活性或化學結構,視對於層析材料之層析官能基之靜電相互作用之形成、疏水性鍵及/或氫鍵而定,來分離抗體。為了自親和性層析材料回收特異性結合的抗體,可添加競爭配位體或可改變層析條件,諸如緩衝液之pH值、極性或離子強度。例示性「親和性層析材料」為金屬螯合劑層析材料,諸如Ni(II)-NTA或Cu(II)-NTA;或抗體親和性層析材料,諸如包含與其共價連接之蛋白A或蛋白G的層析材料;或酶結合親和性層析材料,諸如包含作為層析官能基之與其共價之結合酶受質類似物、酶輔因子或酶抑制劑的層析材料;或凝集素結合層析材料,諸如包含作為層析官能基之與其共價連接之多醣、細胞表面受體、醣蛋白或完整細胞的層析材料。 在一個實施例中,抗體輕鏈親和配位體使用輕鏈恆定域特異性捕捉試劑,其例如視κ或λ輕鏈是否包含於抗體中而定,對κ或λ恆定輕鏈具有特異性。此類輕鏈恆定域特異性捕捉試劑之實例為例如KappaSelect
TM
及LambdaFabSelect
TM
(獲自GE Healthcare/BAC),其係基於在大規模允許高流動速率及低反壓力之高度剛性瓊脂糖基質。此等材料分別含有結合至κ或λ輕鏈之恆定區之配位體(缺乏輕鏈恆定區之抗體或其片段將不結合)。因此兩者均能夠結合含有輕鏈恆定區之其他靶標分子,例如IgG、IgA及IgM。經由長親水性間隔臂使配體連接至基質,使得其輕易地可用於結合至靶標分子。其係基於篩選人類Ig κ或λ之單鏈抗體片段。 術語「輕鏈」表示天然IgG抗體之較短多肽鏈。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩個類型中之一者,稱為κ (kappa)及λ (lambda),參見人類κ輕鏈恆定域之SEQ ID NO: 27及人類λ輕鏈恆定域之SEQ ID NO: 28。 如在本申請案內所使用,術語「施加至」及其文法等效物表示純化方法之一部分步驟,其中,使含有所關注之物質之溶液與固定相接觸。待純化之含有所關注之物質之溶液穿過固定相,提供固定相與溶液中之物質之間的相互作用。視諸如pH、傳導性、鹽濃度、溫度及/或流動速率之條件而定,溶液之一些物質結合至固定相且自溶液移除與其固定的物質。其他物質殘留在溶液中。可在流過物中找到殘餘在溶液中之物質。「流過物」表示在穿過層析器件後獲得之溶液,其可為含有所關注之物質之所施加溶液或緩衝液,其用於沖洗管柱或使得結合至固定相之一或多個物質溶離。可藉由熟習此項技術者熟悉之方法自在純化步驟後之溶液回收所關注之物質,該等方法諸如沈澱、鹽析、超過濾、透濾、凍乾、親和性層析或溶劑體積減少,以獲得實質上同質形式之物質。 可藉由重組手段來製備其糖結構可以如本文所揭示之方法修飾之抗體或抗體片段。用於重組製備之方法在目前先進技術中廣泛地已知,且包含在真核細胞中表現與後續分離抗體或抗體片段且純化至醫藥學上可接受之純度的蛋白質。對於抗體或抗體片段之表現,使用融合瘤細胞或真核細胞,其中已引入編碼該抗體或抗體片段之一或多種核酸。在一個實施例中,真核細胞選自CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、BHK細胞、兔細胞或綿羊細胞。在另一實施例中,真核細胞選自CHO細胞、HEK細胞或兔細胞。在表現後,自細胞(自上清液或自裂解後之細胞)回收抗體或抗體片段。用於重組製備抗體之一般方法在目前先進技術中熟知且揭示於(例如)以下之綜述文章中:Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202;Geisse, S.等人,Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282;Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160;Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880。 可藉由標準技術進行抗體純化以消除細胞組分或其他摻雜物,例如其他細胞核酸或蛋白質,該等標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl條帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術(參見例如Ausubel, F.M等人(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (2005))。良好確立不同方法且廣泛用於蛋白質純化,諸如用微生物蛋白質(例如蛋白A或蛋白G親和性層析)之親和性層析、離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式交換)、親硫吸附(例如用β巰基乙醇及其他SH配位體)、疏水相互作用或芳族吸附層析法(例如用苯基-瓊脂糖、氮雜-親脂性樹脂或間胺基苯硼酸)、金屬螯合劑親和性層析(例如用Ni(II)-及Cu(II)-親和性材料)、尺寸排外層析法及電泳法(諸如凝膠電泳、毛細管電泳),以及其組合,諸如用微生物蛋白質之親和性層析、陽離子交換層析及陰離子交換層析(參見例如Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。一般層析方法及其用途為熟習此項技術者已知。參見例如Heftmann, E. (編), Chromatography, 第5版, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York (1992);Deyl, Z. (編), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998);Poole, C. F.及Poole, S. K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982);Sambrook, J.等人(編), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989);或Ausubel, F.M.等人(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (2005)。 對於已例如藉由細胞培養方法來製備之抗體或抗體片段之純化,一般可採用不同層析步驟之組合。通常(蛋白A)親和性層析之後為一或兩個額外分離步驟。在一個實施例中,額外層析步驟為陽離子及陰離子交換層析步驟或反之亦然。最終純化步驟為用於移除痕量雜質及摻雜物之所謂「拋光步驟」,該等雜質及摻雜物如凝集的免疫球蛋白、殘餘HCP(宿主細胞蛋白質)、DNA (宿主細胞核酸)、病毒或內毒素。在一個實施例中,最終純化步驟為呈流過模式之陰離子交換層析。
如本文所揭示之方法
將藉由所採用細胞株及所採用培養條件來測定以重組方式製備之抗體或抗體片段之糖結構。利用習知後續處理技術,不大可能選擇性移除特異性醣結構。 更詳細地,以重組方式製備之單株抗體一般在糖基化位點處包含糖型之異質混合物。此糖基化特性受重組製備期間之不同因素影響,該等因素諸如宿主細胞以及培養介質中呈現之酶活性,及培養條件。 需要製備一種具有普遍或甚至預定糖基化,諸如尤其治療效果的抗體。 藉由在N-糖基化位點處酶促性修飾聚糖,隨後自培養物收集抗體且在同時允許修飾中使用之酶再循環且再利用若干次中,如本文所揭示之方法提供一種在N-糖基化位點處,例如在Fab區或Fc區中之N-糖基化位點處具有限定糖基化之抗體,亦即基本上含有連接至Fc區糖基化位點(例如Fc區中之Asn297處)之單一糖型。可以所要方式修飾抗體之糖基化,且因此如本文所揭示之方法具有可輕易地併入至自培養上清液純化抗體中使用之標準操作步驟中的優點。 術語「具有限定糖基化之抗體」或「具有限定糖結構之抗體」表示抗體分子群體,其中有限數目之不同聚醣連接至例如Fc區中Asn297 (根據Kabat之EU索引編號)處之(預定) N-糖基化位點。在一個實施例中,聚醣中之一者佔G0F、G1F及G2F糖型之50%或更多,或佔G0F、G1F、G2F、G1S1F、G2S1F及G2S2F糖型之30%或更多。 如本文所使用,術語「實質上」表示40%或更多(在一個實施例中50 %或更多)之化合物具有相同糖基化,亦即在Fc區中之N-糖基化位點處,例如Asn297處,包含相同聚糖(根據Kabat編號)。 用如本文所揭示之方法,抗體,無關於類型及大小,可經修飾以包含限定糖型。更特定言之,例如Fc區中之N-糖基化位點之糖基化可例如對於抗體之預期治療性應用為特製的。舉例而言,抗體之Fc區之半乳糖基化適用於治療癌症。另外舉例而言,抗體之Fc區之唾液酸化為限定糖型適用於治療自體免疫病症。對於不同應用,可能需要去半乳糖基化及/或Fc區之去唾液酸化。又在其他實施例中,可實現具有GlcNAc及甘露糖殘基之核心之雜合結構之製備,諸如N-乙醯基葡糖胺,GlcNAc;或甘露糖-N-乙醯基葡糖胺-N-乙醯基葡糖胺,Man-GlcNAc-GlcNAc。可使用如本文所揭示之方法來製備前述中之任一者,因為任何抗體及該抗體之任何糖結構可藉由用不同糖基化酶,重複一系列如本文所揭示之方法逐步地進行修飾,以產生所需限定糖型抗體。 舉例而言,可使用如本文所揭示之方法從單株抗體之異質群體來製備具有G2糖型之抗體。可使用相同方法將以糖基化工程方法所製備之非海藻糖基化異質抗體轉化為同質G2糖型。另外,抗體之半乳糖基化之批次與批次之間的變化性亦可藉由使用如本文所揭示之方法調節半乳糖基化至所需程度來解決。 簡言之,如本文所揭示之方法包含以下步驟:將在例如Fc區中之N-糖基化位點處具有糖基化之抗體與一或多種糖基化修飾酶一起培育。此培育可在溶液中或在管柱上。可藉由添加所選擇二級酶、視情況選用之輔因子及視情況選用之核苷酸糖來使反應緩衝液進一步最佳化。接著,在室溫下或在約37℃之提高的溫度下培育混合物。其後分離經修飾抗體及修飾酶。舉例而言,若修飾已在溶液中進行,則抗體或酶或兩者結合至層析材料且依序溶離而彼此分離。 在一個實施例中,如本文所揭示之方法包含以下步驟:將包含在例如Fc區中之N-糖基化位點處具有糖基化之抗體之溶液施加至固定至固相/支持物之抗體(輕鏈或Fc區)親和配位體。支持物包含管柱,該管柱用洗滌緩衝液洗滌且接著用適合於對應所需酶促管柱上糖結構修飾之反應緩衝溶液洗滌。可藉由添加所選擇二級酶、視情況選用之輔因子及視情況選用之核苷酸糖來使反應緩衝液進一步最佳化。接著,在室溫下或在約37℃之提高的溫度下培育管柱。其後用洗滌緩衝液洗滌該管柱,且使用溶離緩衝液,自固體支持物溶離出具有限定糖型之經修飾單株抗體。接著,可使用中和緩衝液對所溶離抗體進行中和。 在一個實施例中,如本文所揭示之方法包含以下步驟:將包含在例如Fc區中之N-糖基化位點處具有糖基化之抗體之溶液與反應緩衝液中之一或多種糖基化修飾酶一起培育。可藉由添加所選擇二級酶、視情況選用之輔因子及視情況選用之核苷酸糖來使反應緩衝液進一步最佳化。培育可在室溫下或在約37℃之提高的溫度下。其後使用層析步驟分離抗體及修飾酶。 用於反應緩衝液中之核苷酸糖選自由以下組成之群:UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GalNAc、UDP-GlcNAc、UDP-GlcUA、UDP-Xyl、GDP-Man、GDP-Fuc、CMP-NeuSAc、CMP-NeuSGc及其組合。反應緩衝液中使用之濃度係在約0.5 mM至約5 mM,在態樣中約1 mM至約1.5 mM之範圍內。用於反應緩衝液中之輔因子可選自由以下組成之群:Mn
2 +
、Ca
2 +
、Mg
2 +
、Na
+
、K
+
、
α
乳白蛋白及其組合。用於反應緩衝液中之輔因子之濃度可在約2 mM至約10 mM之範圍內。 抗體(輕鏈或Fc區)親和配位體固定在純化及修飾過程期間保持在管柱中之固相上。固相包括(但不限於)瓊脂糖、瓊脂糖、聚丙烯酸、聚苯乙烯及其他合成的聚合物,其提供非目標蛋白質及修飾之酶之可忽略的非特異性吸附。藉由例如對於固相之各種化學中之任一者使親和配位體共價結合至固相,諸如N-羥基丁二醯亞胺(NHS)酯、環氧化物、醛或溴化氰。此類結合化學為此項技術中熟知的,如在Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (Amsterdam, the Netherlands, 2008版)及Wong, S., Chemistry of Protein Conjugation and CrossLinking, CRC Press (Boca Raton, Fla., 1991)中所例示。 洗滌緩衝液確保在洗滌步驟期間維持抗體與親和配位體之間的高親和性。舉例而言,pH約7.2之磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS)可用作洗滌緩衝液,然而,熟習此項技術者應理解,pH在一定程度上可能會變化。洗滌緩衝液及反應緩衝液確保維持抗體與親和配位體之間的高親和性,且同時維持個別酶之活性。在約25℃至約40℃之溫度及其間之任何溫度下使用洗滌緩衝液及反應緩衝液。通常使用約37℃之溫度。對於抗體與輕鏈親和配位體之高親和性之最佳pH範圍為約6.0至約8.0。在此pH範圍內,緩衝液與可在如本文所揭示之方法中使用之親和配位體之最佳pH範圍重疊。此等包括(但不限於)TRIS緩衝液、BIS-TRIS緩衝液、MES緩衝液、BES緩衝液、MOPS緩衝液及HEPES緩衝液。 親和管柱之洗滌條件可最小化非特異性結合,且因此影響酶反應,且因此影響抗體修飾。洗滌條件係使得其不破壞抗體輕鏈親和配位體與靶標單株抗體之間的結合的條件。 可視修飾而定由以下各者組成之群來選擇適用於如本文所揭示之方法之酶:甘露糖基-葡糖胺轉移酶(MGAT1、MGAT2及MGAT3);半乳糖基轉移酶(
β
4GalT1、
β
4GalT2、
β
4GalT3、
β
4GalT4、
β
4GalT5、
β
4GalT6、
β
4GalT7)、唾液酸轉移酶(ST6Gal1、ST6Gal2);甘露糖苷酶(
α
甘露糖苷酶-I、
α
甘露糖苷酶-II、
α
(1-2)甘露糖苷酶、
α
(1-6)甘露糖苷酶、
α
(1-2,3)甘露糖苷酶、
α
(1-2,3,6)甘露糖苷酶);己糖苷酶(
β -
N-乙醯基己糖苷酶、
β -
N-乙醯基胺基葡糖苷酶、
α
-N-乙醯基胺基葡糖苷酶);半乳糖苷酶(
β
-半乳糖苷酶、
β
(l-4)半乳糖苷酶、
α
(1-3,6)半乳糖苷酶);唾液酸酶(
α
(2-3,6,8)唾液酸酶、
α
(2-3)唾液酸酶)、海藻糖苷酶(
α
-L-海藻糖苷酶、
α
(1-6)海藻糖苷酶、
α
(1-2)海藻糖苷酶、
α
(1-3,4)海藻糖苷酶、
α
(l-2,3,4)海藻糖苷酶)及其任何組合。 如本文所揭示之方法可用於自半乳糖移除末端唾液酸或添加末端唾液酸,以用於產生例如在Fc區中具有同質G2糖結構的抗體。因此,舉例而言,可使用非特異性神經胺糖酸苷酶,其自任何連接或添加個別唾液酸之特異性唾液酸酶移除唾液酸。可結合半乳糖基轉移酶來使用此酶以同時實現半乳糖基化及移除或添加唾液酸。從而可自在Fc區中具有糖基化之包含至少糖型G0、G1、G2、G1S1及G2S2之抗體獲得在Fc區中具有限定G2糖型的抗體。 可使用以下來進行根據如本文所揭示之方法對抗體之糖基化之修飾:與個別酶一起依序培育或半依序培育,其中添加第一酶,且在某一時間段後添加第二酶但不移除第一酶,或同時與一起存在之兩個酶一起培育。相比於完全於溶液反應中之修飾或藉由固定在蛋白A上之抗體之修飾,此等方案中之任一者產生經改良的修飾。 藉由利用使用對應轉移酶提供在Fc區中具有限定半乳糖基化及唾液酸化之抗體,如本文所揭示之方法中使用之酶促性修飾步驟例示如下。
管柱上半乳糖基化
將IgG1子類別之純化人類化抗體施加至蛋白A親和性層析材料及抗體輕鏈親和配位體層析材料(來自GE Healthcare之κ選擇)。將結合的抗體與包含半乳糖基轉移酶(GalT1)及UDP-GAL之緩衝溶液一起在管柱上培育。結果呈現於下表。可看出,當抗體結合至包含抗體輕鏈親和配位體之管柱時,達成較高量之半乳糖基化。
G0F = 具有兩個末端N-乙醯基葡糖胺殘基與海藻糖之複合N-聚糖 G1F = 具有一個末端N-乙醯基葡糖胺殘基及一個末端半乳糖殘基與海藻糖之複合N-聚糖 G2F = 具有兩個末端半乳糖殘基與海藻糖之複合N-聚糖 將在Fc區中具有同質糖基化(同質G2F糖型)之IgG1子類別之純化人類化抗體施加至蛋白A親和性層析材料及抗體輕鏈親和配位體層析材料(來自GE Healthcare之κ選擇)。將結合的抗體與包含唾液酸基轉移酶(ST6)及CMP-NANA之緩衝溶液一起在管柱上培育。結果呈現於下表。可看出,當抗體結合至包含抗體輕鏈親和配位體之管柱時,達成較高量之唾液酸化。
存在或不存在鹼性磷酸酶並不改變蛋白A管柱上之產率(19% G2F、56% G2S1F、25% G2S2F)。在溶液中,可獲得以下結果:
G2F = 具有兩個末端半乳糖殘基與海藻糖之複合N-聚糖 G2S1F = 具有兩個末端半乳糖殘基(一個唾液酸化)與海藻糖之複合N-聚糖 G2S2F = 具有兩個末端半乳糖殘基(兩個均唾液酸化)與海藻糖之複合N-聚糖 將IgG4子類別之人類抗體施加至蛋白A親和性層析材料及抗體輕鏈親和配位體層析材料(來自GE Healthcare之κ選擇)。將結合的抗體與包含半乳糖基轉移酶(GalT1)及UDP-GAL之緩衝溶液一起在管柱上培育。結果呈現於下表。可看出,當抗體結合至包含抗體輕鏈親和配位體之管柱時,達成較高量之半乳糖基化。
G0F = 具有兩個末端N-乙醯基葡糖胺殘基與海藻糖之複合N-聚糖 G1F = 具有一個末端N-乙醯基葡糖胺殘基及一個末端半乳糖殘基與海藻糖之複合N-聚糖 G2F = 具有兩個末端半乳糖殘基與海藻糖之複合N-聚糖 將具有Fc區中之同質糖基化(同質G2F糖型)之IgG4子類別之人類抗體施加至蛋白A親和性層析材料及抗體輕鏈親和配位體層析材料(來自GE Healthcare之κ選擇)。將結合的抗體與包含唾液酸基轉移酶(ST6)及CMP-NANA之緩衝溶液一起在管柱上培育。結果呈現於下表。可看出,當抗體結合至包含抗體輕鏈親和配位體之管柱時,達成較高量之唾液酸化。
n.d. =未測定 將具有Fab中之額外糖基化位點之IgG1子類別之人類化抗體施加至蛋白A親和性層析材料及抗體輕鏈親和配位體層析材料(來自GE Healthcare之κ選擇)。將結合的抗體與包含唾液酸基轉移酶(ST6)及CMP-NANA之緩衝溶液一起在管柱上培育。結果呈現於下表。在此實例中,Fab中之N-糖基化位點之糖基化經修飾。可看出,當抗體結合至包含抗體輕鏈親和配位體之管柱時,達成改良的反應動力學。
G2 = 具有兩個末端半乳糖殘基之複合N-聚糖 G2S1 = 具有兩個末端半乳糖殘基(一個唾液酸化)之複合N-聚糖 G2S2 = 具有兩個末端半乳糖殘基(兩個均唾液酸化)之複合N-聚糖 將包含IgG1子類別之人類化抗體之無細胞培養上清液施加至蛋白A親和性層析材料及抗體輕鏈親和配位體層析材料(來自GE Healthcare之κ選擇)。將結合的抗體在管柱上依序首先與包含半乳糖基轉移酶(GalT1)及UDP-GAL之緩衝溶液及其次與包含唾液酸基轉移酶(ST6)及CMP-NANA之緩衝溶液一起培育。結果呈現於下表。在6小時培育時間後,添加唾液酸基轉移酶。 蛋白A
κ選擇
用純化散裝材料重複相同實驗。 蛋白A
κ選擇
藉由在24小時後添加唾液酸基轉移酶之經κ選擇方法
當在管柱上使用時之酶再循環
在其中抗體結合至親和性層析材料之條件下,將IgG1子類別之重組人類化抗體施加至該材料。將結合的抗體與包含半乳糖基轉移酶(GalT1)及UDP-GAL之緩衝溶液一起在管柱上培育。在培育後,藉由濃縮及緩衝液交換其他酶促性修飾反應物來回收此溶液且進行再調節。結果呈現於下表(24 h時間點)。
可看出,可再利用半乳糖基轉移酶一次而無酶轉化效率缺失,且在第二次時酶轉化效率缺失約50%。 在其中抗體結合至親和性層析材料之條件下,將IgG1子類別之重組人類化抗體施加至該材料。將結合的抗體與包含唾液酸基轉移酶(ST6)及CMP-NANA之緩衝溶液一起在管柱上培育。藉由濃縮及緩衝液交換其他酶促性修飾反應物,在培育後回收此溶液且進一步進行再調節。結果呈現於下表(6 h時間點)。 酶濃度4 mg/ml
酶濃度1 mg/ml
可看出,可再利用唾液酸基轉移酶至少三次而無酶轉化效率缺失。
當用於溶液中時之酶再循環 與 GalT 及 ST6 一起共培育
在UDP-GAL及CMP-NANA之反應緩衝液中,將IgG1子類別之人類化抗體、半乳糖基轉移酶(GalT1)及唾液酸基轉移酶(ST6)一起進行共培育。其後,使用陽離子交換層析(S-瓊脂糖)將酶經修飾抗體及酶進行分離。測定在各使用循環後之所回收酶之特定酶活性。結果呈現於下表。
反應條件:25 mg抗體,2.5 mg GalT,2.5 mg ST6,50 mM MES,pH 6.4,10 ml反應體積 S-瓊脂糖層析條件:0.5 × 10 cm S-瓊脂糖凝膠管柱;用引起GalT溶離之20管柱體積40 mM TRIS pH 7.4之Tris-HCl洗滌;用30 mM MES、95 mM NaCl、5.6之步驟對抗體進行溶離;用50 mM MES、pH 6.4、1 M NaCl之線性梯度對ST6進行溶離 SDS-PAGE凝膠分析展示無降解或GalT ST6之聚集產物及良好分離(參見圖1)。 可在陽離子交換管柱上分離GalT、經修飾抗體及ST6。
與 GalT 一起培育
在包含UDP-GAL之反應緩衝液中,將IgG1子類別之人類化抗體及半乳糖基轉移酶(GalT1)一起共培育。其後,使用陽離子交換層析(S-瓊脂糖)分離酶經修飾抗體及酶。再使用半乳糖基轉移酶三次。結果呈現於下表。
與 ST6 一起培育
在包含CMP-NANA之反應緩衝液中,將IgG1子類別之人類化抗體及唾液酸基轉移酶(ST6)一起共培育。其後,使用陽離子交換層析(S-瓊脂糖)分離酶經修飾抗體及酶。再利用唾液酸基轉移酶三次。結果呈現於下表。
如本文所揭示之方法中使用之抗體 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中,如本文所揭示之方法中之經修飾抗體為嵌合抗體。 某些嵌合抗體描述於例如US 4,816,567;及Morrison, S.L.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)中。在一個實例中,嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中,嵌合抗體為「類別轉換」抗體,其中類別或子類別已自親本抗體之類別或子類別改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段,只要此等結合至如本文所揭示之方法中使用之抗體輕鏈親和配位體即可。 在某些實施例中,嵌合抗體為人類化抗體。通常,對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性,同時保留親本非人類抗體之特異性及親和性。一般而言,人類化抗體包含一或多個可變域,其中HVR (例如CDR (或其一部分))來源於非人類抗體,且FR (或其一部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中,人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如,衍生HVR殘基之抗體)之對應殘基取代,以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和性。 人類化抗體及製備其之方法綜述於例如Almagro, J.C.及Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633中,且進一步描述於例如Riechmann, I.等人, Nature 332 (1988) 323-329;Queen, C.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033;US 5, 821,337、US 7,527,791、US 6,982,321及US 7,087,409;Kashmiri, S.V.等人, Methods 36 (2005) 25-34 (描述特異性決定區(SDR)移植);Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (描述「表面再塑」);Dall'Acqua, W.F.等人, Methods 36 (2005) 43-60 (描述「FR改組」);及Osbourn, J. 等人, Methods 36 (2005) 61-68及Klimka, A.等人, Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (描述FR改組之「導引選擇」方法)中。 可用於人類化之人類構架區包括(但不限於):使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims, M.J. 等人, J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308);來源於輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體共同序列的構架區(參見例如Carter, P.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;及Presta, L.G.等人, J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632);人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro, J.C.及Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633);及來源於篩選FR集合庫之構架區(參見例如Baca, M.等人, J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及Rosok, M.J.等人, J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618))。
人類抗體
在某些實施例中,如本文所揭示之方法中之經修飾抗體為人類抗體。 可使用此項技術中已知之各種技術來製備人類抗體。人類抗體一般描述於van Dijk, M.A.及van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459中。 人類抗體可藉由將免疫原投與已經修飾可因應抗原攻毒而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座的全部或一部分,其置換內源性免疫球蛋白基因座,或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因小鼠中,內源性免疫球蛋白基因座一般已失活。對於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法之綜述,參見N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125。亦參見例如描述XENOMOUSETM技術之US 6,075,181及US 6,150,584;描述HUMAB®技術之US 5,770,429;描述K-M MOUSE®技術之US 7,041,870;描述VELOCIMOUSE®技術之US 2007/0061900;及描述免疫重築小鼠之WO 2007/131676。可進一步修飾由此類動物產生之完整抗體之人類可變區,例如藉由與不同人類恆定區組合。 人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法來製備。已描述用於製備人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株(參見例如Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005;Brodeur, B.R.等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), 第51-63頁;以及Boerner, P.等人, J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li, J.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562中。額外方法包括描述於例如US 7,189,826 (描述由融合瘤細胞株製備單株人類IgM抗體)及Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (描述人類-人類融合瘤)中之彼等方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術)亦描述於Vollmers, H.P.及Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及Vollmers, H.P.及Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191中。 人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體展示庫之Fv純系可變域序列來產生。接著,此類可變域序列可與所需人類恆定域組合。下文描述用於自抗體集合庫選擇人類抗體之技術。
集合庫衍生之抗體
如本文所揭示之方法中之經修飾抗體亦可藉由針對具有一或多種所需活性之抗體篩選組合集合庫來分離。舉例而言,此項技術中已知多種方法用於產生噬菌體展示庫及針對具有所需結合特徵之抗體篩選此類集合庫。此類方法綜述於例如Hoogenboom, H.R.等人, Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37中,且進一步描述於例如McCafferty, J.等人, Nature 348 (1990) 552-554;Clackson, T.等人, Nature 352 (1991) 624-628;Marks, J.D.等人, J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597;Marks, J.D.及Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175;Sidhu, S.S.等人, J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310;Lee, C.V.等人, J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093;Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;及Lee, C.V.等人, J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132中。 在某些噬菌體顯示方法中,VH及VL基因之譜系係分開藉由聚合酶鏈式反應(PCR)選殖且在噬菌體集合庫中隨機重組,其可接著如Winter, G.等人, Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455中所描述,篩選抗原結合性噬菌體。噬菌體通常以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段形式顯示抗體片段。來自經免疫來源之集合庫向免疫原提供高親和性抗體而無需構築融合瘤。或者,可選殖原始譜系(例如自人類)來提供針對各種非自體抗原以及自體抗原之單一來源抗體,無需任何免疫接種,如由Griffiths, A.D.等人, EMBO J. 12 (1993) 725-734所描述。最終,亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高可變CDR3區且完成活體外重排,以合成方式製備原始集合庫,如由Hoogenboom, H.R.及Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388所描述。描述人類抗體噬菌體集合庫之專利公開案包括例如:US 5,750,373及US 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936及US 2009/0002360。 自人類抗體集合庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
多特異性抗體
在某些實施例中,如本文所揭示之方法中之經修飾抗體為多特異性抗體,例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製備。涵蓋多特異性(雙特異性)抗體之片段,只要此等結合至如在如本文所揭示之方法中所使用之抗體輕鏈親和配位體即可。 用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein, C.及Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829;及Traunecker, A.等人, EMBO J. 10 (1991) 3655-3659)及「杵-臼結構(knob-in-hole)」工程(參見例如US 5,731,168)。多特異性抗體亦可藉由以下來製備:製備抗體Fc-雜二聚分子之工程靜電轉向效應(WO 2009/089004);交聯兩個或更多個抗體或片段(參見例如US 4,676,980及Brennan, M.等人, Science 229 (1985) 81-83);使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny, S.A.等人, J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553);使用製備雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Holliger, P.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448);及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如Gruber, M等人, J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374);及如例如Tutt, A.等人 J. Immunol. 147 (1991) 60-69中所描述製備三特異性抗體。 具有三個或更多個功能性抗原結合位點之工程化抗體(包括「章魚抗體」)亦包括在本文中(參見例如US 2006/0025576)。 如本文所揭示之方法中之經修飾抗體或片段亦包括「雙作用Fab」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。 本文中之抗體或片段亦包括描述:WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2010/145793中之多特異性抗體。
重組方法及組合物
可使用例如,如:US 4,816,567中所描述之重組方法及組合物來製備抗體。對於此等方法,提供一或多個編碼抗體之分離核酸。 在天然抗體或天然抗體片段之情況下,需要兩個核酸,一個用於輕鏈或其片段及一個用於重鏈或其片段。此類核酸編碼包含VL之胺基酸序列及/或包含抗體VH之胺基酸序列(例如抗體之輕及/或重鏈)。此等核酸可在相同表現載體上或在不同表現載體上。 在具有雜二聚重鏈之雙特異性抗體之情況下,需要四個核酸,一個用於第一輕鏈,一個用於包含第一雜單體Fc區多肽之第二輕鏈,一個用於第二輕鏈,及一個用於包含第二雜單體Fc區多肽之第二重鏈。舉例而言,雜二聚重鏈中之一者包含所謂的「杵突變(knobs mutations)」(T366W及視情況S354C或Y349C中之一者),且其他的包含所謂的「臼突變(hole mutations)」(T366S、L368A及Y407V以及視情況Y349C或S354C) (參見例如Carter, P.等人, Immunotechnol. 2 (1996) 73)。此類核酸編碼包含第一VL之胺基酸序列;及/或包含第一VH之胺基酸序列(其包括第一雜單體Fc區);及/或包含第二VL之胺基酸序列;及/或包含第二VH之胺基酸序列(其包括抗體之第二雜單體Fc區)(例如抗體之第一及/或第二輕鏈及/或第一及/或第二重鏈)。此等核酸可在相同表現載體上或在不同表現載體上,通常此等核酸位於兩個或三個表現載體上,亦即一個載體可包含超過一個之此等核酸。此等雙特異性抗體之實例為CrossMab及T細胞雙特異性抗體(參見例如Schaefer, W.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-1191)。 在一個實施例中,提供編碼如在如本文所揭示之方法中所使用之抗體的經分離核酸。 在另一實施例中,提供包含此類核酸之一或多個載體(例如表現載體)。 在另一實施例中,提供一種包含此類核酸之宿主細胞。 在一個此類實施例中,宿主細胞包含(例如已經用以下進行轉化): -在天然抗體或天然抗體片段之情況下: (1) 載體,其包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列的核酸,或 (2) 第一載體,其包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列的核酸;及第二載體,其包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列的核酸。 -在具有雜二聚重鏈之雙特異性抗體之情況下: (1) 第一載體,其包含編碼以下中之一者之胺基酸序列的第一對核酸,包含抗體之第一VL之序列及包含第一VH之其他序列;及第二載體,其包含編碼以下中之一者之胺基酸序列的第二對核酸,包含抗體之第二VL之序列及包含第二VH之其他序列,或 (2) 第一載體,其包含編碼包含可變域(較佳地輕鏈可變域)中之一者之胺基酸序列的第一核酸;第二載體,其包含編碼以下中之一者之胺基酸序列的一對核酸,包含輕鏈可變域之序列及包含第一重鏈可變域之其他序列;及第三載體,其包含編碼以下中之一者之胺基酸序列的一對核酸,包含如第二載體中之個別其他輕鏈可變域之序列及包含第二重鏈可變域之其他序列,或 (3) 第一載體,其包含編碼包含抗體之第一VL之胺基酸序列的核酸;第二載體,其包含編碼包含抗體之第一VH之胺基酸序列的核酸;第三載體,其包含編碼包含抗體之第二VL之胺基酸序列的核酸;及第四載體,其包含編碼包含抗體之第二VH之胺基酸序列的核酸。 在一個實施例中,宿主細胞為真核細胞,例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中,提供一種製備抗體之方法,其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養宿主細胞,該宿主細胞包含編碼如上文所提供之抗體之核酸,視情況自宿主細胞(宿主細胞培養基)回收抗體,及用如本文所揭示之方法修飾抗體的糖基化。 對於重組製備抗體,分離編碼例如如上文所描述之抗體之核酸,且將其插入至一或多個載體中以用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類核酸可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性地結合至編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)輕易地進行分離及定序,或藉由重組方法來製備或藉由化學合成來獲得。 適合用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所描述之原核或真核細胞。舉例而言,抗體可於細菌中產生,在不需要糖基化及Fc效應功能時尤其如此。關於在細菌中表現抗體片段及多肽,參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523 (亦參見Charlton, K.A., 於: Methods in Molecular Biology, 第248卷, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第245-254頁, 其描述在大腸桿菌中表現抗體片段)。在表現之後,可以可溶性溶離份自細菌細胞糊狀物分離抗體且其可進一步經純化。 除原核生物外,諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主,包括糖基化路徑已經「人類化」,從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414;及Li, H.等人, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。 適用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用,尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。 植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429 (其描述在轉殖基因植物中製備抗體之PLANTIBODIES
TM
技術)。 脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言,適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40 (COS-7)轉化之猴腎CV1細胞株;人類胚腎細胞株(如例如在Graham, F.L.等人, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74中所描述之293或293細胞);幼倉鼠腎細胞(BHK);小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell) (如例如在Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252中所描述之TM4細胞);猴腎細胞(CV1);非洲綠猴腎細胞(VERO-76);人類子宮頸癌細胞(HELA);犬腎細胞(MDCK;水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell) (BRL 3A);人類肺細胞(W138);人類肝細胞(Hep G2);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562);如例如在Mather, J.P.等人, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68中所描述之TRI細胞;MRC 5細胞;及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,其包括DHFR-CHO細胞(Urlaub, G.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220);及骨髓瘤細胞株,諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適合於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述,參見例如Yazaki, P.及Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, 第248卷, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 第255-268頁。
醫藥調配物
具有用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體的醫藥調配物係藉由將具有所需純度之此類抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A. (編) (1980)),來製備呈凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑在所採用劑量及濃度下對於接受者一般為無毒性的,且包括(但不限於):緩衝液,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;抗氧化劑,其包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨;氯化六羥季銨;氯化苯甲烴銨;氯化苯索銨;苯酚、丁醇或苯甲醇;對羥基苯甲酸烷基酯,諸如對對羥基苯甲酸甲酯或羥基苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;以及間甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚(乙烯吡咯啶酮);胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單糖、雙糖及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成鹽反離子,諸如鈉;金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物);及/或非離子型界面活性劑,諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑,諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP),例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白,諸如rhuPH20 (HYLENEX?, Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP (包括rhuPH20)及使用方法描述於US 2005/0260186及US 2006/0104968中。在一個態樣中,sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。 例示性凍乾抗體調配物描述於US 6,267,958中。抗體調配物水溶液包括US 6,171,586及WO 2006/044908中所描述之彼等抗體調配物水溶液,WO 2006/044908中所描述之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。 本文中之調配物亦可含有為所治療之特定適應症所必需之多於一種活性成分,較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的彼等活性成分。此類活性成分宜以有效達成預期目的之量的組合存在。 可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分包覆於所製備之微囊中,例如分別包覆於膠狀藥物遞送系統(例如,脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)或巨乳液中之羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版, Osol, A. (編) (1980)中。 可製備持續釋放配製物。持續釋放配製物之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質,該等基質呈成形物品形式,例如膜或微囊。 用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可輕易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。
治療方法及組合物
如本文所揭示之任一方法所修飾之任一抗體可使用於治療方法中。 在一個態樣中,提供一種以如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體,其用作藥物。在其他態樣中,提供一種以如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體,其用於治療疾病。在某些實施例中,提供一種以如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體,其用於治療方法中。在某些實施例中,本發明提供一種以如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體,其用於治療患有疾病之個體之方法中,該方法包含向個體投與有效量的用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體。在一個此類實施例中,該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑。在某些實施例中,本發明提供一種用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體,其用於治療個體之方法中,該方法包含向個體投與有效量的用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體。根據以上實施例中之任一者的「個體」較佳為人類。 在另一態樣中,本發明提供一種如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體的用途,其用於製造或製備藥物。在一個實施例中,藥物用於治療疾病。在另一實施例中,藥物係用於治療疾病之方法中,該方法包含向患有疾病之個體投與有效量之藥物。在一個此類實施例中,該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑。在另一實施例中,藥劑用於治療個體之方法中,該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之藥物。根據任一以上實施例之「個體」為人類。 在另一態樣中,本發明提供一種治療疾病之方法。在一個實施例中,該方法包含向患有此類疾病之個體投與有效量之用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體。在一個此類實施例中,該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑。根據任一以上實施例之「個體」為人類。 在另一態樣中,本發明提供包含用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體中之任一者的醫藥調配物,其例如用於以上治療方法中之任一者中。在一個實施例中,醫藥調配物包含用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中,醫藥調配物包含用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體中之任一者及至少一種額外治療劑。 本發明之抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言,本發明抗體可與至少一種額外治療劑共投與。 上文提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩個或更多個治療劑包括於同一或單獨調配物中)及單獨投與,在此情況下,可在投與一或多種額外治療劑之前、同時及/或之後,進行用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體的投與。在一個實施例中,用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體的投與及額外治療劑的投與在彼此之約一個月內,或在約一、二或三週內,或在約一、二、三、四、五或六天內進行。用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體亦可與放療組合使用。 用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體(及任何額外治療劑)可藉由任何適合之方式,包括非經腸、肺內及鼻內且必要時針對局部治療,病灶內投與來投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。部分視投藥之短期或長期性而定,可藉由任何適合途徑(例如藉由注射,諸如靜脈內或皮下注射)給藥。本文中涵蓋各種給藥時程,包括(但不限於)單次投藥或在不同時間點的多次投藥、快速投藥及脈衝式輸注。 將以與良好醫學實踐一致之方式來調配、給藥及投與用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送位點、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。抗體並非必須,而視情況與一或多種當前用於預防或治療病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。此等藥劑一般以相同劑量且以如本文所描述之投與途徑使用,或以本文所描述之劑量之約1%至99%使用,或以任何劑量且以憑經驗/臨床上判定為適當之任何途徑使用。 為了預防或治療疾病,用如本文所揭示之任一方法所修飾之抗體的適當劑量(當單獨或與一或多種額外治療劑組合使用時)將視待治療疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重程度及病程、是出於預防還是出於治療目的投與抗體、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷而定。一次性或歷經一系列治療向患者適當地投與抗體。視疾病之類型及嚴重程度而定,約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.5 mg/kg-10 mg/kg)之抗體可為向患者投與的初始候選劑量,無論是藉由一或多個獨立投與還是藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定,一個典型的日劑量可介於約1 μg/kg至100 mg/kg之範圍內或更多。對於歷經數日或更長時間之重複投藥,視病狀而定,治療通常將持續至疾病症狀之所需抑止發生為止。抗體之一種例示性劑量將介於約0.05 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。因此,可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多個劑量。可間歇地投與此類劑量,例如每一週或每三週(例如使得患者接受約兩個至約二十個或例如約六個劑量之抗體)。可投與初始較高起始劑量,接著可投與一或多個較低劑量。然而,其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析法來監測。 本文所引用之每一專利、專利申請案及公開案之揭示內容均以全文引用的方式併入本文中。 提供如下實例及圖示以幫助理解本發明,其真實範疇陳述於隨附申請專利範圍中。應理解,可在不偏離本發明精神之情況下對所闡述之程序進行修正。
實例 GalT 反應溶液
(5 mM MnCl
2
,10 mM UDP-Gal,100 mM MES,0.05 mg/ml GalT,pH 6.5):153 mg UDP-Gal (MW=610.27 g/mol)32 mg MnCl
2
(MW=125.84 g/mol)單次使用:460 µL GalT (c=5.43 mg/mL;10 µg/2 mg抗體-->10 µg於300 µL中=0.033 mg/ml)多次使用:460 µL GalT (c=5.43 mg/mL;15 µg/1 mg AK--> 15 µg於300 µL中=0.05 mg/mL)於100 mM MES緩衝液pH 6.5中
ST6 反應溶液
(0.1 mM ZnCl
2
,200 nM AP,50 mM MES,1.7 mg/ml CMP-NANA,0.7 mg/ml ST6,pH 6.5):50 µL ZnCl (100 mM溶液:13.6 mg於1 mL 50 mM MES中)28 µL鹼性磷酸酶(AP) (c = 20 mg/mL,MW = 56,000 g/mol)單次使用:167 mg CMP-NANA (1000 µg/2 mg抗體--> 1000 µg pro 300 µL = 3.34 mg/mL)多次使用:83.5 mgCMP-NANA (500 µg/1 mg AK--> 500 µg pro 300 µL = 1.67 mg/mL)單次使用:6 mL ST6 (c=5.45 mg/mL,靶標:200 µg於300 µL中(2 mg AK) = 0.67 mg/mL)多次使用:6 mL ST6 (c=5.45 mg/mL,靶標:200 µg於300 µL中(1 mg AK) = 0.67 mg/mL)於50 mM MES緩衝液pH 6.5中
緩衝液:
再生緩衝液1 (0.1 M磷酸)再生緩衝液2 (3 M胍-HCl)平衡緩衝液(25 mM Tris,25 mM NaCl,5mM EDTA,pH 7.1)洗滌緩衝液1 (100 mM MES,pH 6.5):含21.3 mg MES之1000 mL H
2
O,pH 6.5 (用50% (w/v) NaOH調整)洗滌緩衝液2 (1 M Tris,pH 7.2)洗滌緩衝液3 (50 mM MES,pH 6.5):洗滌緩衝液100 mM MES 1:1蒸餾H
2
O溶離緩衝液κ選擇(0.1 M甘胺酸,pH 2.7):含750 mg甘胺酸之100 mL H
2
O,pH 2.7 (用25% (w/v) HCl調整)溶離緩衝液蛋白A (25 mM 檸檬酸Na,pH 2.8)
實例 1 管柱上散裝材料之半乳糖基化
• 分別藉由施加2管柱體積再生緩衝液1、10管柱體積平衡緩衝液及4管柱體積洗滌緩衝液1對蛋白A κ選擇管柱進行再生、平衡及洗滌 • 將2 mg IgG (散裝材料)施加至管柱上 • 用10管柱體積洗滌緩衝液1洗滌 • 施加2 mL半乳糖基化反應溶液(具有0.033 mg/ml GalT),使0.8 mL流過 • 分別在25℃下培育(2、7或24 h) • 用8管柱體積洗滌緩衝液1洗滌 • 用個別溶離緩衝液(蛋白A為2管柱體積;κ選擇為8管柱體積)進行溶離且使用1 M Tris緩衝液(pH 9.0)用於pH調整
實例 2 管柱 ( 蛋白 A ) 上 IgG1 散裝材料之唾液酸化
• 分別藉由施加2管柱體積再生緩衝液1、10管柱體積平衡緩衝液及10管柱體積洗滌緩衝液3對蛋白A κ選擇管柱進行再生、平衡及洗滌 • 將2 mg IgG (散裝材料)施加至管柱上 • 施加2 mL唾液酸化反應溶液(改為3.3 mg/ml來替代1.7 mg/ml CMP-NANA,+/- AP),使0.8 mL流過 • 分別在37℃ (2、7、24或48小時)及25℃ (48 h)下培育 • 用4管柱體積洗滌緩衝液3洗滌 • 用2管柱體積溶離緩衝液(檸檬酸鈉)溶離且使用1 M Tris緩衝液(pH 9.0)用於pH調整
管柱 ( κ 選擇 ) 上 IgG1 散裝材料之唾液酸化
• 分別藉由施加2管柱體積平衡緩衝液、3管柱體積再生緩衝液2、4管柱體積平衡緩衝液及2管柱體積洗滌緩衝液3對蛋白A κ選擇管柱進行再生、平衡及洗滌 • 將2 mg IgG (散裝材料)施加至管柱上 • 用3管柱體積洗滌緩衝液3洗滌 • 施加2 mL唾液酸化反應溶液(3.3 mg/ml CMP-NANA,+/- AP),使0.8 mL流通 • 分別在37℃下(2、7及24 h)及在25℃下(24 h)培育 • 用3管柱體積洗滌緩衝液3洗滌 • 用8管柱體積溶離緩衝液κ選擇進行溶離且使用1 M Tris緩衝液(pH 9.0)用於pH調整
實例 3 細胞培養物上清液之依序半乳糖基化及唾液酸化
• 分別藉由施加2管柱體積再生緩衝液1、10管柱體積平衡緩衝液對蛋白A κ選擇管柱進行再生及平衡 • 將1 mg IgG (於上清液中)施加至管柱上 • 用10管柱體積平衡緩衝液,接著2管柱體積洗滌緩衝液2及6管柱體積洗滌緩衝液1進行洗滌 • 施加2 mL半乳糖基化反應溶液,使0.8 mL流過 • 在25℃下培育約6至24 h (以使得足夠的半乳糖基化) • 用8管柱體積洗滌緩衝液1、10管柱體積平衡緩衝液、2管柱體積洗滌緩衝液2及6管柱體積洗滌緩衝液3進行洗滌 • 施加2 mL唾液酸化反應溶液,使0.8 mL流過 • 培育(例如在25℃分別培育2、7或24 h或甚至更長) • 用8管柱體積洗滌緩衝液1洗滌 • 用個別溶離緩衝液(蛋白A為2管柱體積;κ選擇為8管柱體積)進行溶離且使用1 M Tris緩衝液(pH 9.0)用於pH調整
實例 4 散裝材料之依序半乳糖基化及唾液酸化
• 分別藉由施加2管柱體積再生緩衝液1、10管柱體積平衡緩衝液及4管柱體積洗滌緩衝液1對蛋白A κ選擇管柱進行再生、平衡及洗滌 • 將1 mg IgG (散裝材料)施加至管柱上 • 用10管柱體積洗滌緩衝液1洗滌 • 施加2 mL半乳糖基化反應溶液,使0.8 mL流過 • 在25℃下培育約6至24 h (以使得足夠的半乳糖基化) • 用8管柱體積洗滌緩衝液1、10管柱體積平衡緩衝液、2管柱體積洗滌緩衝液2及6管柱體積洗滌緩衝液3進行洗滌 • 施加2 mL唾液酸化反應溶液,使0.8 mL流過 • 培育(例如在25℃分別培育2、7或24 h或甚至更長) • 用8管柱體積洗滌緩衝液1洗滌 • 用個別溶離緩衝液(蛋白A為2管柱體積;κ選擇為8管柱體積)進行溶離且使用1 M Tris緩衝液(pH 9.0)用於pH調整
實例 5 在溶液中 , 半乳糖基化及唾液酸化與酶回收
• 對含25 mg抗體、2.5 mg半乳糖基轉移酶及2.5 mg唾液酸基轉移酶之10 mL 50 mM MES緩衝液pH 6.4進行培育 • 在反應之後,將反應溶液施加至用50 mM MES pH 6.4平衡之S-瓊脂糖凝膠管柱(0.5 × 10 cm) • 用5管柱體積50 mM MES pH 6.4洗滌以移除未結合材料 • 用20管柱體積40 mM Tris緩衝液pH 7.4對管柱進行洗滌,且由此溶離出半乳糖基轉移酶 • 用50 mM MES pH 6.4進行再平衡 • 用包含30 mM MES pH 5.6及95 mM NaCl (40管柱體積)之緩衝溶液溶離出抗體 • 用10管柱體積至50 mM MES pH 6.4及1 M NaCl之線性梯度溶離出唾液酸基轉移酶 • 使用超過濾器件(Amicon Ultra-15,10 kDa)將含有靶標酶或人類化抗體之分液合併且濃縮
實例 6 酶再利用測試
• 半乳糖基轉移酶:將含500 µg抗體之78.5 µL反應緩衝液(100 mM MES,10 mM UDP-Gal,5 mM MnCl
2
,pH 6.5)與2.5 µg半乳糖基轉移酶一起在37℃下培育限定時段,例如6.5 h或24 h • 唾液酸基轉移酶:將含500 µg抗體之61.8 µl水、250 µg溶解於水中之CMP-NANA、50 µg唾液酸基轉移酶、200 nM鹼性磷酸酶、0.1 mM ZnCl
2
在37℃下培育限定時段,例如6.5或24小時 • 藉由qTOF-ESMS對半乳糖基化之分析:使樣本(大致250 µg抗體、4 M鈲、TCEP)進行變性及還原;緩衝液交換為具有1%甲酸之20%乙腈;ESMS分析