JP2002512014A

JP2002512014A - 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作

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Publication number: JP2002512014A
Application number: JP2000544680A
Authority: JP
Inventors: パブロウマナ，; ジョエルジーン−マイレット，; ジェイムズイー．バイレイ，
Original assignee: パブロウマナ，; ジョエルジーン−マイレット，; ジェイムズイー．バイレイ，
Priority date: 1998-04-20
Filing date: 1999-04-20
Publication date: 2002-04-23
Anticipated expiration: 2019-04-20
Also published as: AU3657899A; JP2018038431A; US9068005B2; DE69942021D1; DK2180007T3; US9718885B2; EP2261229A3; JP2017108747A; ES2340112T3; US20110294984A1; US9139654B2; ES2434961T3; EP2180007B2; WO1999054342A1; JP6329061B2; EP1071700A4; JP2009100748A; JP2015051017A; US7906329B2; DK1071700T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、タンパク質のグリコシル化操作の分野に関する。より詳細には、本発明は、Ｆｃ媒介細胞傷害性の増強を伴う、改善された治療的特性を有するタンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、または免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を含む融合タンパク質）を提供するためのタンパク質のグリコシル化操作に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（Ｉ．他の出願との関連）本出願は、１９９８年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／０８２
，５８１号（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）の優先権
を主張する。

【０００２】（ＩＩ．発明の分野）本発明は、タンパク質のグリコシル化操作の分野に関する。さらに詳細には、
本発明は、改善された治療特性を有するタンパク質（増強された抗体依存性細胞
傷害性を有する抗体を含む）を生成するグリコシル化操作に関する。

【０００３】（ＩＩＩ．発明の背景）糖タンパク質は、ヒト、他の真核生物、およびいくつかの原核生物における多
くの必須の機能（触媒、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション、および分子
認識および分子会合を含む）を媒介する。それらは、真核生物において非細胞質
ゾルタンパク質の大部分を構成している。ＬｉｓおよびＳｈａｒｏｎ、１９９３
、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７。治療目的のために多くの糖
タンパク質が探索されており、そして最近２０年の間には、天然に存在する分泌
糖タンパク質の組換えバージョンが生物工学産業の主要な産物になった。例とし
ては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療的モノクローナル抗体（治療的ｍＡｂ
）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（
ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、お
よびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＨ）が挙げられる。Ｃｕｍｍｉｎｇら、１
９９１、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１：１１５−１３０。

【０００４】オリゴ糖成分は、治療的糖タンパク質の有効性（物理学的安定性、プロテアー
ゼの攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態、および特異的生物学的
活性を含む）に関する特性に、有意に影響を及ぼし得る。このような特性は、オ
リゴ糖の存在または非存在に依存し得るだけでなく、その特異的構造にも依存し
得る。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能との間のいくつかの一般化がなされ得る
。例えば、特定のオリゴ糖構造は、特定の糖質結合タンパク質との相互作用を介
した血流からのこの糖タンパク質の迅速なクリアランスを媒介する一方、他のオ
リゴ糖構造は、抗体に結合し、所望されない免疫応答を誘発し得る。Ｊｅｎｋｉ
ｎｓら、１９９６、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎ．１４：９７５−９８１。

【０００５】哺乳動物細胞は、ヒト適用のために最も適合した形態でタンパク質をグリコシ
ル化する能力のために、治療的糖タンパク質の生成のために好ましい宿主である
。Ｃｕｍｍｉｎｇ、１９９１、前出；Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９９６、前出。細菌
はタンパク質をほとんどグリコシル化しない。そして同様に他の型の一般的な宿
主（例えば、酵母、糸状菌、昆虫細胞および植物細胞）は、血流からの迅速なク
リアランス、所望されない免疫応答、およびいくつかの特定の場合では、減少し
た生物学的活性と関連したグリコシル化パターンを生じる。哺乳動物細胞の中で
も、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、最近２０年の間に最も一般
的に使用された。適切なグリコシル化パターンを与えることに加えて、これらの
細胞は、遺伝的に安定な、高度に生産的なクローン性細胞株の一貫した生成を可
能にする。それらは、無血清培地を使用して単純なバイオリアクター中で高密度
に培養され得、そして安全かつ再現可能な生物プロセスの開発を可能にする。他
の一般的に使用された動物細胞としては、新生仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞
、ＮＳ０マウスミエローマ細胞およびＳＰ２／０マウスミエローマ細胞が挙げら
れる。さらに最近、トランスジェニック動物からの生成もまた、試験されている
。Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９９６、前出。

【０００６】動物細胞で生成した組換え治療的タンパク質のグリコシル化は、宿主細胞中の
グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の過剰発現によって操作され得る。Ｂａｉ
ｌｅｙ、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１６６８−１６７５。しかし、こ
の分野の以前の研究では、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ遺伝
子の構成性発現が使用されてきたに過ぎず、発現レベルについては、ほとんど注
意が払われてこなかった。

【０００７】（ＩＶ．発明の要旨）本発明は、一般に、改善された治療価値を生じる改変されたグリコシル化パタ
ーンを有するタンパク質の生成のための宿主細胞および方法に関する。１つの特
定の実施態様において、本発明は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するＮ結
合型複合型オリゴ糖を増加する、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラー
ゼ活性の好ましい範囲を発現し得るように操作された宿主細胞に関する。他の実
施態様において、本発明は、糖タンパク質、例えば、抗体（抗体分子全体、抗体
フラグメント、または免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を含む融合タンパ
ク質を含み、増強されたＦｃ媒介細胞傷害性を有する）の改変された糖形態を生
成するための方法、およびそのように生成された糖タンパク質に関する。本発明
は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するＮ結合型複合型オリゴ糖の最大化の
ための糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ発現の最適な範囲が存在
するという本発明者らの発見に一部基づく。

【０００８】より詳細には、本発明は、改善した治療的価値を有する改変された糖形態のタ
ンパク質、例えば、増強された抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する抗体
を宿主細胞において生成する方法に関する。本発明は、目的のタンパク質（例え
ば、抗体）をコードする核酸、および糖タンパク質改変グリコシル化トランスフ
ェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸を有する宿主細胞を提供する。さら
に、本発明は、上記の目的のタンパク質（例えば、抗体依存性細胞傷害性を増強
した抗体）の発現を可能にする条件下でこのような宿主細胞を培養する方法およ
びプロトコルを提供する。さらに、このように生成された、改変されたグリコシ
ル化パターンを有するタンパク質（例えば、増強された抗体依存性細胞傷害性を
有する抗体）を単離する方法が記載される。

【０００９】さらに、本発明は、改善した治療特性を有するタンパク質の別の糖形態を提供
する。本発明のタンパク質は、増強された抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を
有する抗体を含み、これは、開示された方法および宿主細胞を使用して生成され
る。

【００１０】（ＶＩ．定義）用語は、以下に定義されなければ、当該分野で一般に使用されるように本明細
書中で使用される。

【００１１】本明細書中で使用される用語「抗体」は、抗体分子全体、抗体フラグメント、
または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質を含むこと
が意図される。

【００１２】本明細書中で使用される用語「糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラー
ゼ」とは、糖タンパク質のグリコシル化パターンの改変をもたらす酵素をいう。
糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼの例としては、例えば、ＧｎＴ
ＩＩＩ、ＧｎＴＶ、ＧａｌＴ、およびＭａｎＩＩのようなグリコシルトラン
スフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【００１３】本明細書中で使用される用語「グリコシル化操作」は、天然に存在するポリペ
プチドまたはそのフラグメントのグリコシル化パターンに対して任意の種類の変
化を含むとみなされる。グリコシル化操作としては、細胞のグリコシル化機構の
代謝的操作（細胞中で発現された糖タンパク質の改変されたグリコシル化を達成
する、オリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む）が挙げられる。さらに、グリコシ
ル化操作としては、グリコシル化に対する変異および細胞環境の効果が挙げられ
る。

【００１４】本明細書中で使用される用語「宿主細胞」は、タンパク質、タンパク質フラグ
メント、または目的のペプチド（抗体または抗体フラグメントを含む）の改変さ
れた糖形態を生成するように操作され得る任意の種類の細胞系を含む。代表的に
は、宿主細胞は、少なくとも１つの、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェ
ラーゼの最適化されたレベルを発現するように操作されており、これらのグリコ
シルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＶ、ＧａｌＴ、お
よびＭａｎＩＩ、ならびに／または少なくとも１つのグリコシダーゼが挙げられ
るが、これらに限定されない。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物
培養細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞また
はハイブリドーマ細胞）、酵母細胞および昆虫細胞が挙げられ、トランスジェニ
ック動物または培養組織内に含まれる細胞もまた挙げられる。

【００１５】本明細書中で使用される用語「Ｆｃ媒介細胞傷害性」は、抗体依存性細胞傷害
性（ＡＤＣＣ）、および免疫グロブリンＧのＦｃ領域またはそれに等価な領域を
その細胞表面で発現するように操作された細胞に対する細胞傷害性、ならびに免
疫グロブリンＧのＦｃ領域またはそれに等価な領域のＮ末端に融合された標的タ
ンパク質ドメインからなる可溶性融合タンパク質により媒介される細胞傷害性を
含むことが意図される。

【００１６】（ＶＩＩ．発明の詳細な説明）（Ａ．一般的な概要）本発明の目的は、タンパク質（特に抗体（抗体分子全体、抗体フラグメント、
または免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を含む融合タンパク質を含む））
の糖形態を提供して、治療的タンパク質の新たな改変体を生成することである。
本発明は、細胞のグリコシル化反応ネットワークが、その集団内での特定の糖形
態の割合を最大化するように操作され得、そして特定の糖形態が改善された治療
特性を有するという本発明者らの発見に一部基づく。本発明はさらに、改善され
た治療価値を有するタンパク質の糖形態を同定する方法、およびそれらを再現可
能に生成する方法の発見に一部基づく。本発明はさらに、バイセクティングＧｌ
ｃＮＡｃを保有するＮ結合型複合型オリゴ糖を増加させるために、抗体生成細胞
での糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ発現の好ましい範囲が存在
するという発見に一部基づく。

【００１７】そのように、本発明は、一般に、治療特性を改変し、そして改善するようにタ
ンパク質をグリコシル化操作するための方法に関する。より詳細には、本発明は
、改変されたグリコシル化パターンを有し、その結果、増強された抗体依存性細
胞傷害性（ＡＤＣＣ）を生じる抗体を宿主細胞において生成するための方法を記
載する。方法の実施のために、本発明は、抗体をコードする核酸および糖タンパ
ク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸を有
する宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、改変されたグリコシル化パターン
を有し、その結果、増強された抗体依存性細胞傷害性を生じる所望の抗体の発現
を可能にする条件下でこのような宿主細胞を培養する方法およびプロトコルを提
供する。さらに、増強された抗体依存性細胞傷害性を有する、そのように生成さ
れた抗体を単離する方法を記載する。

【００１８】本発明のさらに特定の実施態様において、２つのモノクローナル抗体（すなわ
ち、抗神経芽腫抗体ｃｈＣＥ７および抗ＣＤ２０抗体Ｃ２Ｂ８）はモデル治療糖
タンパク質として使用され、そして標的糖形態は、特定のクラスの糖質（すなわ
ち、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）で改変された
Ｎ結合型複合型バイアンテナリーオリゴ糖）を有する糖形態である。本発明によ
って提供されるモデル系においては、ＣＨＯ細胞が宿主細胞として使用されるが
、多くの他の細胞系が宿主細胞系として企図され得る。種々の型のＮ結合型オリ
ゴ糖にバイセクティングＧｌｃＮＡｃを付加するグリコシルトランスフェラーゼ
であるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）は、通常は、
ＣＨＯ細胞によって生成されない。ＳｔａｎｌｅｙおよびＣａｍｐｅｌｌ、１９
８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３３７０−１３３７８。

【００１９】ＧｎＴＩＩＩ過剰発現の効果を実験的に調査するために、ラットＧｎＴＩ
ＩＩｃＤＮＡのテトラサイクリン調節性過剰発現を有するＣＨＯ細胞株が樹立
された。この実験系を使用して、本発明者らは、高レベルへのＧｎＴＩＩＩの
過剰発現が増殖阻害を導き、そして細胞に対して毒性であることを発見した。Ｇ
ｎＴＶ（これは、異なるグリコシルトランスフェラーゼである）のテトラサイ
クリン調節性過剰発現を有する別のＣＨＯ細胞株は、同じ阻害効果を示した。こ
のことは、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼの過剰発現の一般的
特徴であり得ることを示す。細胞増殖に対する酵素発現の効果は、糖タンパク質
改変グリコシルトランスフェラーゼ過剰発現のレベルに上限を設定し、従って、
接近しにくいグリコシル化部位が、非調節性発現ベクターを使用するグリコシル
化経路およびグリコシル化パターンの操作によって改変され得る程度もまた制限
し得る。

【００２０】基本レベルと毒性レベルとの間の範囲でＧｎＴＩＩＩ発現を制御することに
よって糖形態分布が異なるｃｈＣＥ７ｍＡｂおよびＣ２Ｂ８サンプルのセット
の生成が開示される。ｃｈＣＥ７ｍＡｂサンプルのＡＤＣＣ活性の測定によっ
て、インビトロでの最大ｃｈＣＥ７生物学的活性についてのＧｎＴＩＩＩ発現
の最適範囲が示された。この活性は、Ｆｃと関連する複合型バイセクト型オリゴ
糖のレベルと相関した。実際の範囲内（すなわち、有意な増殖阻害も毒性も見ら
れない）でのＧｎＴＩＩＩの発現は、ｃｈＣＥ７サンプルのこのセットについ
て標的の複合型バイセクト型構造の増加を導いた。高レベルのＧｎＴＩＩＩで
産生されたｃｈＣＥ７サンプルのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分析におけるオリゴ糖
ピークのパターンは、潜在的なＧｎＴＩＩＩ基質の有意な割合が混成型バイセ
クト型オリゴ糖副生成物に転換されることを示す。従って、経路のさらなる操作
による、これらの副生成物の最小化は、有益であり得る。

【００２１】（Ｂ．グリコシル化パターンの改変を指向するタンパク質をコードする核酸の
同定および生成）本発明は、グリコシル化パターンの変化が指向される、目的の任意のタンパク
質、タンパク質フラグメントまたはペプチドの変化した糖形態の生成に適切な宿
主細胞系を、提供する。そのような目的のタンパク質、タンパク質フラグメント
またはペプチドをコードする核酸は、一般に当該分野において公知の方法によっ
て得られ得る。例えば、核酸は、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリ
ーから単離され得る。使用され得るクローニング戦略のための総説について、例
えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｓＨａｒｂ
ｏｒＰｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、（Ｇ
ｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。

【００２２】本発明の別の実施態様において、目的のタンパク質、タンパク質フラグメント
またはペプチドのコード配列は、当該分野において周知の化学的方法を使用して
、全体的にか、または部分的に、合成され得る。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら
、１９８０、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７：２１５〜２
３３；ＣｒｅａおよびＨｏｒｎ、１９８０、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．ＵＳ
Ａ９：２３３１；ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８０、
ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２１：７１９；ＣｈｏｗおよびＫｅ
ｍｐｅ、１９８１、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．９：２８０７〜２８１７を参
照のこと。あるいは、そのタンパク質自体が、そのアミノ酸配列の全体または部
分を合成する化学的方法を使用して生成され得る。例えば、ペプチドは、固相技
術によって合成され、樹脂から切断され、そして調製用高速液体クロマトグラフ
ィーによって精製され得る。例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐ
ｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．、Ｎ．Ｙ．，５０〜６０頁を
参照のこと。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはアミノ酸配列決定（例
えば、エドマン分解手順；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、
ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、
Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．、Ｎ．Ｙ．３４〜４９頁を参照のこと
）によって確認され得る。

【００２３】好ましい実施態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントあるいは
増強した抗体依存性細胞傷害性を有する抗体フラグメントを含有する融合タンパ
ク質の糖形態の産生のための宿主細胞系の生成および使用のための方法を提供す
る。標的エピトープの同定、およびグリコシル化パターンの改変が所望される、
可能性のある治療的価値を有する抗体の生成、ならびにその対応するコード核酸
配列の単離は、本発明の範囲内である。

【００２４】当該分野において公知の種々の手順が、目的の標的エピトープに対する抗体の
産生のために使用され得る。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ
発現ライブラリーによって産生されたフラグメントが挙げられるが、これらに限
定されない。そのような抗体は、例えば、診断剤および治療剤として有用であり
得る。治療剤として、中和抗体（すなわち、リガンド、基質またはアダプター分
子との結合に競合する抗体）が、特に好ましく興味深い。

【００２５】抗体の産生のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを含むが
これらに限定されない）が、目的の標的タンパク質を用いて、注射によって免疫
される。種々のアジュバント（宿主の種に依存して、フロイント（完全および不
完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面
活性剤、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリ
アニオン、ペプチド、懸濁オイル、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニト
ロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉ
ｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍのような可能性のあ
る有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して
、免疫応答を増加し得る。

【００２６】目的の標的に対するモノクローナル抗体が、培養物中の連続的細胞株による抗
体分子産生のために提供される任意の技術を使用して、調製され得る。この技術
には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ２５６
：４９５〜４９７）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞
ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏ
ｄａｙ、４：７２；Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８０：２０２６〜２０３０）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（
Ｃｏｌｅら、１９８５、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ
ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．７７〜９
６頁）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、適切な抗原特異性のマ
ウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子
とともに、スプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発
された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１〜６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４
、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４〜６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔ
ｕｒｅ３１４：４５２〜４５４）が、使用され得る。あるいは、単鎖抗体の産
生について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号）が、所望の特異
性を有する単鎖抗体の産生に適用され得る。

【００２７】目的の標的タンパク質の特異的結合部位を含有する抗体フラグメントが、公知
の技術によって生成され得る。例えば、そのようなフラグメントとしては、抗体
分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）₂フラグメント、および
Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって生成され得るＦ
ａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発
現ライブラリーが、構築され得（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
６：１２７５〜１２８１）、目的の標的タンパク質に対する所望の特異性を有す
るモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。

【００２８】一旦、グリコシル化パターンにおける改変が所望される抗体または抗体フラグ
メントが同定されると、コード核酸配列が、当該分野において周知の技術を用い
て、同定および単離される。上記を参照のこと。

【００２９】（Ｃ．変化したグリコシル化パターンを有するタンパク質の産生のための細胞
株の生成）本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有するタンパク質の生成のため
の宿主細胞発現系を提供する。具体的には、本発明は、改善された治療的価値を
有するタンパク質の糖形態を生成するための宿主細胞系を提供する。従って、本
発明は、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼの発現を増加するよう
に選択されるか、または操作された宿主細胞発現系を提供する。具体的には、そ
のような宿主細胞発現系を操作して、構成性プロモーター系または調節性プロモ
ーター系と作動可能に連結された、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラ
ーゼをコードする組換え核酸分子を含有し得る。あるいは、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼを、天然に産生する、産生する
ように誘導される、および／または産生するように選択される、宿主発現系が、
使用され得る。

【００３０】１つの特定の実施態様において、本発明は、糖タンパク質改変グリコシルトラ
ンスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された
宿主細胞を提供する。１つの局面において、宿主細胞は、糖タンパク質改変グリ
コシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含有する核酸
分子で、形質転換されるか、またはトランスフェクションされる。代替的な局面
において、この宿主細胞は、内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェ
ラーゼが活性化されるように、操作および／または選択される。例えば、宿主細
胞は、内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼの発現を誘発す
るような変異を含有するように選択され得る。この局面は、宿主細胞がＣＨＯ
ｌｅｃ１０変異株である１つの特定の実施態様において例示される。あるいは、
宿主細胞は、内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼが活性化
されるように操作され得る。再度別の代替物において、宿主細胞は、内因性の糖
タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼが宿主細胞染色体中に調節性プロ
モーターエレメントを挿入することによって活性化されるように操作される。さ
らなる代替物において、宿主細胞は、内因性の糖タンパク質改変グリコシルトラ
ンスフェラーゼが宿主細胞染色体中に構成性プロモーターエレメント、トランス
ポゾン、またはレトロウイルスエレメントを挿入することによって活性化される
ように操作される。

【００３１】一般に、任意のタイプの培養細胞株を、本発明の宿主細胞株を操作するバック
グラウンドとして使用し得る。好ましい実施態様において、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ
細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞またはハイブリドーマ細胞株を、本発明の操
作された宿主細胞を生成するための、バックグラウンド細胞株として使用する。

【００３２】本発明は、本明細書において規定される糖タンパク質改変グリコシルトランス
フェラーゼの任意のタイプを発現する操作された宿主細胞を包含することが意図
される。しかし、好ましい実施態様において、本発明の宿主細胞によって発現さ
れる少なくとも１つの糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼは、Ｇｎ
ＴＩＩＩであるか、あるいは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルト
ランスフェラーゼＶ（β（１，４）−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙ
ｌｔｒａｓｆｅｒａｓｅＶ）（ＧｎＴＶ）である。しかし、代表的にＧｎＴ
ＩＩＩまたはＧｎＴＶに加えて、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ（ＧａｌＴ）、およびマンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を含む、糖タン
パク質改変グリコシルトランスフェラーゼの別のタイプもまた、宿主系において
発現され得る。本発明の１つの実施態様において、ＧｎＴＩＩＩは、ＧａｌＴ
と同時に発現される。本発明の別の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩは、Ｍａ
ｎＩＩと同時に発現される。本発明のさらなる実施態様において、ＧｎＴＩＩ
Ｉは、ＧａｌＴおよびＭａｎＩＩと同時に発現される。しかし、糖タンパク質改
変グリコシルトランスフェラーゼの任意の他の変更は、本発明の範囲内である。
さらに、宿主細胞系内でのグリコシダーゼの発現が所望され得る。

【００３３】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸の１つまた
はいくつかは、構成性プロモーターの制御下、あるいは調節性発現系の制御下に
おいて発現され得る。適切な調節性発現系としては、テトラサイクリン−調節性
発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃスイッチ発現系、グルココルチコイド
誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系、およびメタロチオネイン金属誘導性
発現系が挙げられるが、これらに限定されない。糖タンパク質改変グリコシルト
ランスフェラーゼをコードするいくつかの異なる核酸が、宿主細胞系内に含有さ
れる場合、それらのいくつかは、構成性プロモーターの制御下において発現され
得るが、一方、その他は、調節性プロモーターの制御下で発現される。最適な発
現レベルは、目的の各タンパク質について異なり、そして慣用的な実験を使用し
て決定される。発現レベルは、当該分野において一般に公知の方法（グリコシル
トランスフェラーゼ特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析、グリコシル
トランスフェラーゼ特異的核酸プローブを使用するノザンブロット分析、または
酵素活性の測定を含む）によって決定される。あるいは、グリコシルトランスフ
ェラーゼの生合成産物と結合するレクチン（例えば、Ｅ₄−ＰＨＡレクチン）を
使用し得る。さらなる代替物において、核酸は、レポーター遺伝子と作動可能に
連結され得る；糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼの発現レベルは
、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルを測定することによって決
定される。このレポーター遺伝子は、この糖タンパク質改変グリコシルトランス
フェラーゼをコードする核酸とともに、単一のｍＲＮＡ分子として転写され得る
；その対応するコード配列は、内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはキャ
ップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかと連結され得る。このレ
ポーター遺伝子は、この糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコー
ドする少なくとも１つの核酸とともに翻訳され得、その結果単一のポリペプチド
鎖が形成される。糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードする
核酸は、単一のプロモーターの制御下のレポーター遺伝子に作動可能に連結され
得、その結果糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼおよびレポーター
遺伝子をコードする核酸は、２つの別のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子
に選択的スプライシングされるＲＮＡ分子に転写される；生じるＲＮＡの一方は
、そのレポータータンパク質に翻訳され、そして他方は糖タンパク質改変グリコ
シルトランスフェラーゼに翻訳される。

【００３４】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードするいくつかの異な
る核酸が発現する場合、これらの核酸は、１つかまたはいくつかのｍＲＮＡ分子
として転写されるように配列され得る。これらの核酸が、単一のｍＲＮＡ分子と
して転写される場合、その対応するコード配列は、内部リボゾーム進入部位（Ｉ
ＲＥＳ）またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかと連
結され得る。これらの核酸は、単一のプロモーターから１つのＲＮＡ分子に転写
され、いくつかの別々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に選択的スプラ
イシングされ得る。次いで、これらｍＲＮＡの各々は、対応するコードされた糖
タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼに翻訳される。

【００３５】他の実施態様において、本発明は、治療的タンパク質（例えば、増強された抗
体依存性細胞傷害性を有する抗体、およびＦｃ媒介細胞傷害性を促進する表面に
ＩｇＧＦｃ領域を提示する細胞）の生成のための宿主細胞発現系を提供する。
一般に、宿主細胞発現系は、操作および／または選択され、糖タンパク質改変グ
リコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸ともに、改変さ
れた糖形態の生成が所望されるタンパク質をコードする核酸を発現する。１つの
実施態様において、宿主細胞系は、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラ
ーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子でトランスフェクトされる。代表的に
は、トランスフェクトされた細胞を選択して、糖タンパク質改変グリコシルトラ
ンスフェラーゼを安定に発現するクローンを同定および単離する。別の実施態様
において、この宿主細胞は、内因性グリコシルトランスフェラーゼの発現につい
て選択された。例えば、そうでなければサイレントな糖タンパク質改変グリコシ
ルトランスフェラーゼの発現を誘発する変異を有する細胞が、選択され得る。例
えば、ＣＨＯ細胞は、特定の変異体において（例えば、変異体Ｌｅｃ１０におい
て）活性な、サイレントなＧｎＴＩＩＩ遺伝子を保有することが公知である。
さらに、サイレントな糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を
活性化するために、当該分野において公知の方法（調節性プロモーターまたは構
成性プロモーターの挿入、あるいはトランスポゾン、レトロウイルスエレメント
の使用などを含む）が使用され得る。遺伝子ノックアウト技術の使用、またはリ
ボザイム方法の使用を用いて、宿主細胞のグリコシルトランスフェラーゼおよび
／またはグリコシダーゼ発現レベルを適応させ得る。この使用も本発明の範囲内
である。

【００３６】培養細胞株の任意のタイプが、本発明の宿主細胞株を操作するためのバックグ
ラウンドとして使用され得る。好ましい実施態様において、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ
細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞である。代表的には、そのような細胞株は操
作され、抗体分子全体、抗体フラグメント、または免疫グロブリンのＦｃ領域と
等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つのトランスフェク
トされた核酸をさらに含む。別の実施態様において、目的の特定の抗体を発現す
るハイブリドーマ細胞株を、本発明の操作された宿主細胞を生成するためのバッ
クグラウンド細胞株として使用する。

【００３７】代表的には、宿主細胞系内の少なくとも１つの核酸は、ＧｎＴＩＩＩ、ある
いはＧｎＴＶをコードする。しかし、他のタイプの糖タンパク質改変グリコシ
ルトランスフェラーゼ（代表的にはＧｎＴＩＩＩまたはＧｎＴＶに加え、Ｇ
ａｌＴおよびＭａｎＩＩを含む）が、宿主系内で発現され得る。本発明の１つの
実施態様において、ＧｎＴＩＩＩは、ＧａｌＴと同時に発現される。本発明の
別の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩは、ＭａｎＩＩと同時に発現される。本
発明のさらなる実施態様において、ＧｎＴＩＩＩは、ＧａｌＴおよびＭａｎＩ
Ｉと同時に発現される。しかし、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラー
ゼの任意の他の変更は、本発明の範囲内である。さらに、宿主細胞系内でのグリ
コシダーゼの発現が所望され得る。

【００３８】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸の１つまた
はいくつかは、構成性プロモーターの制御下、あるいは調節性発現系の制御下に
おいて発現され得る。適切な調節性発現系としては、テトラサイクリン−調節性
発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃスイッチ発現系、グルココルチコイド
誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系、およびメタロチオネイン金属誘導性
発現系が挙げられるがこれらに限定されない。糖タンパク質改変グリコシルトラ
ンスフェラーゼをコードするいくつかの異なる核酸が、宿主細胞系内に含有され
る場合、それらのいくつかは、構成性プロモーターの制御下において発現され得
るが、一方、その他は、調節性プロモーターの制御下で発現される。最適な発現
レベルは、目的の各タンパク質について異なり、そして慣用的な実験を使用して
決定される。発現レベルは、当該分野において一般に公知の方法（グリコシルト
ランスフェラーゼ特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析、グリコシルト
ランスフェラーゼ特異的核酸プローブを使用するノザンブロット分析、または酵
素活性の測定を含む）によって決定される。あるいは、グリコシルトランスフェ
ラーゼの生合成産物と結合するレクチン（例えば、Ｅ₄−ＰＨＡレクチン）を使
用し得る。さらなる代替物において、核酸は、レポーター遺伝子と作動可能に連
結され得る；糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼの発現レベルは、
レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルを測定することによって決定
される。このレポーター遺伝子は、この糖タンパク質改変グリコシルトランスフ
ェラーゼをコードする核酸とともに、単一のｍＲＮＡ分子として転写され得る；
その対応するコード配列は、内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはキャッ
プ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかと連結され得る。このレポ
ーター遺伝子は、この糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコード
する少なくとも１つの核酸とともに翻訳され得、その結果単一のポリペプチド鎖
が形成される。糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードする核
酸は、単一のプロモーターの制御下のレポーター遺伝子に作動可能に連結され得
、その結果糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼおよびレポーター遺
伝子をコードする核酸は、２つの別々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子
に選択的スプライシングされるＲＮＡ分子に転写される；生じるＲＮＡの１つは
、そのレポータータンパク質に翻訳され、そして他方は糖タンパク質改変グリコ
シルトランスフェラーゼに翻訳される。

【００３９】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードするいくつかの異な
る核酸が発現する場合、これらの核酸は、１つかまたはいくつかのｍＲＮＡ分子
として転写されるように配列され得る。これらの核酸が、単一のｍＲＮＡ分子と
して転写される場合、その対応するコード配列は、内部リボゾーム進入部位（Ｉ
ＲＥＳ）またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかと連
結され得る。これらの核酸は、単一のプロモーターから１つのＲＮＡ分子に転写
され、いくつかの別々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に選択的スプラ
イシングされ得る。次いで、これらｍＲＮＡの各々は、対応するコードされた糖
タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼに翻訳される。

【００４０】（１．発現系）当業者に周知の方法を使用して、目的のタンパク質のコード配列および糖タン
パク質改変グリコシルトランスフェラーゼのコード配列、および適切な転写／翻
訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、
インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが
挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら
、１９８９、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．に記載される技
術を参照のこと。

【００４１】種々の宿主−発現ベクター系を使用して、目的のタンパク質のコード配列、お
よび糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼのコード配列を発現し得る
。好ましくは、哺乳動物細胞を、目的のタンパク質のコード配列、および糖タン
パク質改変グリコシルトランスフェラーゼのコード配列を含有する、組換えプラ
スミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主
細胞系として使用する。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞
、またはＳＰ２／０細胞あるいはハイブリドーマ細胞株を、宿主細胞系として使
用する。代替的な実施態様において、他の真核生物宿主細胞系（目的のタンパク
質のコード配列、および糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼのコー
ド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母細胞；目的のタンパ
ク質のコード配列、および糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼのコ
ード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感
染された昆虫細胞系；目的のタンパク質のコード配列、および糖タンパク質改変
グリコシルトランスフェラーゼのコード配列を含む、組換えウイルス発現ベクタ
ー（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイル
ス、ＴＭＶ）で感染されたか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、
Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは目的のタンパク質をコ
ードするＤＮＡ、および糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼのコー
ド配列の複数のコピー（安定に増幅された（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）か、もしくは二
重微小染色体中で不安定に増幅された（例えば、マウス細胞株））を含有するよ
うに操作された細胞株を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウ
イルス、ワクシニアウイルス）で感染された動物細胞系を含む）が意図され得る
。

【００４２】本発明の方法のために、安定な発現が、一般には一過性の発現よりも好ましい
。なぜなら、安定な発現は、代表的により再現性のある結果を達成し、そしてま
た、大スケール産生により適合しやすいからである。ウイルスの複製起点を含有
する発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレメン
ト（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデ
ニル化部位など）によって制御されるそれぞれのコード核酸、および選択マーカ
ーで形質転換し得る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を、富化された培地
中で１〜２日間増殖させ得、次に、選択培地に変更する。組換えプラスミド中の
選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そしてプラスミドをその染色体中
に安定に組み込み、そして増殖してコロニーを形成し、その結果クローン化され
、細胞株に拡大される細胞の選択を可能にする。

【００４３】それぞれ、ｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-、またはａｐｒｔ^-細胞において使用され得る
、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌ
ｌ１１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、１９６２、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２６）、およびアデニンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ２２：８１７
）遺伝子を含むが、これらに限定されない多数の選択系が使用され得る。抗代謝
産物耐性が、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ
ら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３５６
７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７８：１５２７）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付
与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１５０：１）；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙ
ｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ３０：１４７）遺伝子につ
いての選択の基礎として使用され得る。近年、細胞にトリプトファンの代わりに
インドールを利用させ得るｔｒｐＢ；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノール
を利用させ得るｈｉｓＤ（ＨａｒｔｍｅｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、１９８８、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８０４７）；グルタミ
ンシンターゼ系；およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−
（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯ
ＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ、１９８７、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
編）と称するさらなる選択遺伝子が記載されている。

【００４４】（２．改変グリコシル化パターンを有するタンパク質を発現するトランスフェ
クト体および形質転換体の同定）コード配列を含む宿主細胞および生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主
細胞は、少なくとも４つの一般的なアプローチにより同定され得る；（ａ）ＤＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーショ
ン；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在；（ｃ）宿主細胞におけ
るそれぞれのｍＲＮＡ転写物の発現により測定されるような、転写レベルの評価
；および（ｄ）イムノアッセイまたはその生物学的活性により測定されるような
、遺伝子産物の検出。

【００４５】第１のアプローチにおいて、発現ベクター中に挿入された目的のタンパク質の
コード配列および糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼのコード配列
の存在は、それぞれのコード配列、またはそれらのそれぞれの部分もしくは誘導
体に相同であるヌクレオチド配列を含むプローブを用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリダイゼーションまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションにより検出さ
れ得る。

【００４６】第２のアプローチにおいて、組換え発現ベクター／宿主系は同定され、そして
特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対
する耐性、メトトレキサートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス
中の封入体形成など）の存在または非存在に基づき、選択され得る。例えば、目
的のタンパク質のコード配列および糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラ
ーゼのコード配列が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、
それぞれのコード配列を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在により同
定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、コード配列の発現を制御するために
使用される同じプロモーターまたは異なるプロモーターの制御下で、コード配列
と縦列して配置され得る。誘導または選択に応じたマーカーの発現は、目的のタ
ンパク質のコード配列および糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼの
コード配列の発現を示す。

【００４７】第３のアプローチにおいて、目的のタンパク質のコード領域および糖タンパク
質改変グリコシルトランスフェラーゼのコード配列の転写活性は、ハイブリダイ
ゼーションアッセイにより評価され得る。例えば、ＲＮＡは、単離されそして目
的のタンパク質のコード配列および糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラ
ーゼのコード配列またはそれらの特定部分に相同なプローブを用いたノーザンブ
ロットにより分析され得る。あるいは、宿主細胞の全核酸が抽出され、そしてこ
のようなプローブへのハイブリダイゼーションについて評価され得る。

【００４８】第４のアプローチにおいて、目的のタンパク質のタンパク質産物および糖タン
パク質改変グリコシルトランスフェラーゼのコード配列の発現は、免疫学的に、
例えば、ウェスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、ラジオイムノ沈降、酵
素結合イムノアッセイなど）により評価され得る。しかし、発現系の最終的な試
験の成功は、生物学的に活性化な遺伝子産物の検出を含む。

【００４９】（Ｄ．変化したグリコシル化パターンを有するタンパク質およびタンパク質フ
ラグメントの生成および使用）（１．増強した抗体依存性細胞傷害性を有する抗体の生成および使用）好ましい実施態様において、本発明は、増強した抗体依存性細胞傷害性を有す
る抗体および抗体フラグメントの糖形態を提供する。

【００５０】いくつかの型の癌の処置のための非結合体化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の
臨床的試行は、近年進んだ結果を生じた。Ｄｉｌｌｍａｎ、１９９７、Ｃａｎｃ
ｅｒＢｉｏｔｈｅｒ．＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：２２３−２２５；Ｄｅ
ｏら、１９９７、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ１８：１２７。キメラの
非結合体化ＩｇＧ１が、低級なまたは小胞性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫につい
て認可されている（Ｄｉｌｌｍａｎ、１９９７、前出）が、一方別の非結合体化
ｍＡｂである、ヒト化ＩｇＧ１標的固形乳腫瘍もまた、第ＩＩＩ相臨床試験にお
いて有望な結果を示しつつあった。Ｄｅｏら、１９９７、前出。これらの２つの
ｍＡｂの抗原は、それらの各々の腫瘍細胞において高度に発現され、そしてそれ
らの抗体は、インビトロおよびインビボでエフェクター細胞により強力な腫瘍破
壊を媒介する。対照的に、良好な腫瘍特異性を有する多くの他の非結合体化ｍＡ
ｂは、臨床的に有用である程十分な効力のエフェクター機能を引き起こし得ない
。Ｆｒｏｓｔら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ８０：３１７−３３３；Ｓｕｒｆｕ
ｓら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９：１８４−１９１。これらの
より弱いｍＡｂのいくつかについて、補助的なサイトカイン治療が、現在も試験
されている。サイトカインの添加は、その活性および循環リンパ球の数を増加す
ることによって抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激し得る。Ｆｒｏｓｔら
、１９９７、前出；Ｓｕｒｆｕｓら、１９９６、前出。溶解物が抗体標的化細胞
に対して攻撃するＡＤＣＣは、リンパ球レセプターの、抗体の定常境域（Ｆｃ）
への結合の際、引き起こされる。Ｄｅｏら、１９９７、前出。

【００５１】非結合体化ＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を増大させる、異なるが相補的であるアプ
ローチは、抗体のＦｃ領域を、リンパ球レセプターに対する親和性（ＦｃγＲ）
を増大させるように操作することである。タンパク質工学研究は、ＦｃγＲが、
ＩｇＧＣＨ２ドメインのより低いヒンジ領域と相互作用することを示した。Ｌ
ｕｎｄら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−４９６９。しか
し、ＦｃγＲ結合はまた、ＣＨ２領域における保存されたＡｓｎ２９７で共有結
合的に付着したオリゴ糖の存在を必要とする。Ｌｕｎｄら、１９９６、前出；Ｗ
ｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、Ｔｉｂｔｅｃｈ１５：２６−
３１は、オリゴ糖およびポリペプチドの両方が直接相互作用部位に寄与するか、
またはオリゴ糖が活性なＣＨ２ポリペプチドコンフォメーションを維持するため
に必要とされるかのいずれかであることを示唆している。従って、オリゴ糖の構
造の改変は、相互作用の親和性を増大させるための手段として、探索され得る。

【００５２】ＩｇＧ分子は、そのＦｃ領域中に２つのＮ結合オリゴ糖を保有し、一つは、各
重鎖にある。任意の糖タンパク質と同様に、抗体は、糖形態の集団として産生さ
れる。この糖形態は、同じポリペプチド骨格を共有するが、グリコシル化部位に
付着した異なるオリゴ糖を有する。血清ＩｇＧのＦｃ領域中に通常見出されるオ
リゴ糖は、低いレベルの末端シアル酸およびバイセクティングＮ−アセチルグル
コサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ならびに程度が可変し得る末端ガラクトシル化およ
びコアフルコシル化を有する、バイアンテナリー複合型オリゴ糖である（Ｗｏｒ
ｍａｌｄら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３６：１３０−１３８０）
(図１）。いくつかの研究は、ＦｃγＲ結合を必要とする最小の糖質構造は、オ
リゴ糖コア内にあることを示唆する。Ｌｕｎｄら、１９９６、前出。末端ガラク
トースの除去は、ＡＤＣＣ活性において約２倍の減少をもたらす。このことは、
ＦｃγＲレセプター結合におけるこれらの残基についての役割を示す。Ｌｕｎｄ
ら、１９９６、前出。

【００５３】非結合体化治療用ｍＡｂの生成のために産業および教育において使用される
マウスまたはハムスター誘導細胞株は、通常、必要とされるオリゴ糖決定因子を
Ｆｃ部位に付着させる。しかし、これらの細胞株において発現されるＩｇＧは、
血清ＩｇＧにおいて低量で見出されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを欠く。Ｌ
ｉｆｅｌｙら、１９９５、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ３１８：８１３−８２２
。対照的には、ラット骨髄腫産生ヒト化ＩｇＧ１（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）が、
その糖形態のいくつかにおいてバイセクティングＧｌｃＮＡｃを保有することが
、最近観察された。Ｌｉｆｅｌｙら、１９９５、前出。ラット細胞誘導化抗体は
、標準的な細胞株において産生されるＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体と類似したイン
ビトロのＡＤＣＣ活性に、しかし有意により低い抗体濃度で、達した。

【００５４】ＣＡＭＰＡＴＨ抗原は、通常、リンパ腫細胞に高いレベルで存在し、そしてこ
のキメラｍＡｂは、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの非存在下で高いＡＤＣＣ活
性を有する。Ｌｉｆｅｌｙら、１９９５、前出。Ｌｉｆｅｌｙら、１９９５、前
出の研究において、たとえ最大のインビトロＡＤＣＣ活性が、グリコシル化パタ
ーンの変化により増大しなかったとしても、この活性レベルが、バイセクト型オ
リゴ糖を保有する抗体の比較的低い抗体濃度で得られたという事実は、バイセク
ト型オリゴ糖の重要な役割を示唆する。Ｆｃ領域においてバイセクト型オリゴ糖
を保有するこれらの抗体の糖形態を生成することによって、低い基底活性レベル
を有するＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を増大するようなアプローチが発達した。

【００５５】Ｎ結合グリコシル化経路において、バイセクティングＧｌｃＮＡｃは、酵素β
（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ
ＩＩＩ）により添加される。Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６４：１６３−１８１。Ｌｉｆｅｌｙら、１９９５、前出
は、内因的な一定のレベルでＧｎＴＩＩＩを発現するラット骨髄腫細胞株を含
む、異なるが非操作のグリコシル化機構を有する異なる細胞株において抗体を産
生することによって、同じ抗体の異なるグリコシル化パターンを得た。対照的に
、本発明者らは、単一の抗体産生ＣＨＯ細胞株を使用した。これは、外部調節し
た様式で、異なるレベルのクローン化ＧｎＴＩＩＩ遺伝子を発現するようにあ
らかじめ操作されていた。このアプローチにより、本発明者らは、ＧｎＴＩＩ
Ｉの発現と改変した抗体のＡＤＣＣ活性との間の厳密な相関を初めて確立し得た
。

【００５６】本明細書中に実証されるように（実施例４（後述）を参照のこと）、開示され
る方法に従って改変されたＣ２Ｂ８抗体は、同一の細胞培養および精製条件下で
産生された、標準的な非改変Ｃ２Ｂ８抗体よりも約１６倍高いＡＤＣＣ活性を有
した。簡単に言うと、ＧｎＴＩＩＩ発現を有さないＣＨＯ−ｔＴＡ−Ｃ２Ｂ８
細胞において発現されたＣ２Ｂ８抗体サンプルは、ヒトリンパ球によりＳＢ細胞
（ＣＤ２０＋）のインビトロ溶解として測定された、約３１％の細胞傷害性活性
を示した（１μｇ／ｍｌ抗体濃度で）。対照的に、基底の主な抑制レベルでＧｎ
ＴＩＩＩを発現するＣＨＯ細胞培養物由来のＣ２Ｂ８抗体は、１μｇ／ｍｌ抗
体濃度で、同じ抗体濃度でのコントロールに対してＡＤＣＣ活性の３３％増大を
示した。さらに、ＧｎＴＩＩＩの発現の増大は、同じ抗体濃度でのコントロー
ルと比較して、最大のＡＤＣＣ活性においてほぼ８０％の大きな増加を生じた（
１μｇ／ｍｌ抗体濃度で）。実施例４（後述）を参照のこと。

【００５７】増強した抗体依存性細胞傷害性を有する本発明のさらなる抗体は、以下を含む
が、これらに限定されない：本発明の方法により産生される抗ヒト神経芽腫モノ
クローナル抗体（ｃｈＣＥ７）、本発明の方法により産生されるキメラ抗ヒト腎
細胞癌腫モノクローナル抗体（ｃｈ−Ｇ２５０）、本発明の方法により産生され
るヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、本発明の方法により産生されるキメラ
抗ヒト結腸、肺および乳癌腫モノクローナル抗体（ＩＮＧ−１）、本発明の方法
により産生されるヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体（３６２２Ｗ
９４）、本発明の方法により産生されるヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３
）、本発明の方法により産生されるＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト骨髄腫
抗体（Ｒ２４）、ならびに本発明の方法により産生されるキメラ抗ヒト扁平上皮
細胞癌モノクローナル抗体（ＳＦ−２５）。さらに、本発明は、抗体フラグメン
ト、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価である領域を含む融合タンパク質に
対して指向される。後述を参照のこと。

【００５８】（２．Ｆｃ媒介細胞傷害性を促進する免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域
を含む融合タンパク質の生成および使用）上記で議論されるように、本発明は、治療用抗体のＡＤＣＣ活性を増強するた
めの方法に関する。これは、このような抗体のＦｃ領域のグリコシル化パターン
を操作することによって、特に、それらのＦｃ領域で変換されたグリコシル化部
位にＮ結合した複合型バイセクト型オリゴ糖を保有する抗体分子の割合を最大に
することによって達成される。この戦略は、治療用抗体によるのみならず、免疫
グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を保有する任意の分子により媒介される、望
ましくない細胞に対するＦｃ媒介性細胞細胞傷害を、増大させるために適用され
得る。なぜならば、グリコシル化の操作により導入された変化は、Ｆｃ領域のみ
に影響を与え、従って、エフェクター細胞の表面上のＦｃレセプターとのその相
互作用は、ＡＤＣＣ機構に関与したからである。現在開示される方法で適用され
得るＦｃ含有分子としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）
Ｆｃ領域のＮ末端に融合された標的タンパク質ドメインで作製された可溶性融合
タンパク質（ＣｈａｍｏｖおよびＡｓｈｋｅｎａｚｉ、１９９６、ＴＩＢＴＥＣ
Ｈ１４：５２）、および（ｂ）Ｆｃ領域のＮ末端に融合された原形質膜に局在
するＩＩ型膜貫通ドメインで作製された原形質膜固定化融合タンパク質（Ｓｔａ
ｂｉｌａ，Ｐ．Ｅ．、１９９８、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６：１３５
７）。

【００５９】可溶性融合タンパク質（ａ）の場合、標的ドメインは、融合タンパク質の望ま
しくない細胞（例えば、癌細胞）への結合、すなわち治療用抗体と類似した様式
で、指向させる。従って、これらの分子によって媒介されるＦｃ媒介細胞傷害性
活性を増強するための、近年開示された方法の適用は、治療用抗体に適用される
方法と同一である。米国特許仮出願番号第６０／０８２，５８１号（本明細書中
で参考として援用される）の実施例２を参照のこと。

【００６０】膜固定化融合タンパク質（ｂ）の場合、身体中の望ましくない細胞が、融合タ
ンパク質をコードする遺伝子を発現する必要がある。これは、遺伝子治療アプロ
ーチ、すなわち、融合タンパク質コード遺伝子の発現を望ましくない細胞に指向
させるプラスミドベクターもしくはウイルスベクターを用いて、インビボで細胞
をトランスフェクトすることによるか、または細胞表面上に融合タンパク質を発
現するように遺伝子的に操作された細胞の身体中への移植によるかのいずれかで
達成され得る。後者の細胞は、通常、それらの細胞が、Ｆｃ媒介細胞傷害性機構
によって破壊され得ないポリマーカプセルに内包されて身体内へ移植される（カ
プセル化細胞治療）。しかし、カプセル送達が失敗し、そして逸脱細胞が望まし
くないようになれば、それらはＦｃ媒介細胞傷害性により除去され得る。Ｓｔａ
ｂｉｌａら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１３５７。この
場合、現在開示される方法は、遺伝子治療用ベクターに、十分なもしくは最適な
ＧｎＴＩＩＩの発現レベルを指向するさらなる遺伝子発現カセットを組込むこ
とによってか、または十分なもしくは最適なレベルのＧｎＴＩＩＩを発現する
ように、移植されるべき細胞を操作することによってかのいずれかで適用され得
る。両方の場合において、開示される方法の目的は、複合型バイセクト型オリゴ
糖を保有する表面提示Ｆｃ領域の割合を増大または最大にすることである。

【００６１】以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。以下の調製物および実施例は
、当業者が本発明をより明瞭に理解し、そして実施することを可能にするために
、与えられる。しかし、本発明は、例示される実施態様および本発明の範囲内に
ある機能的に等価である方法によって範囲を限定されることなく、本発明の単な
る単一の局面の例証として意図される。実際、本明細書中に記載されるものに加
え、本発明の種々の改変は、前述の説明および添付している図面より当業者に明
らかである。このような改変は、添付された特許請求の範囲の範囲内に含まれる
ことが意図される。

【００６２】（ＶＩＩＩ．実施例）（Ａ．実施例１：チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるグリコシルトラン
スフェラーゼのテトラサイクリン調節過剰発現）ＧｎＴＩＩＩの発現が外部制御され得る細胞株を確立するために、テトラサ
イクリン調節発現系を使用した。Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．
、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−
５５５１。これらの細胞中のＧｎＴＩＩＩの量は、培養培地中のテトラサイク
リン濃度を単に操作することによって制御され得る。この系を用いて、高いレベ
ルまでのＧｎＴＩＩＩの過剰発現が増殖阻害を導き、そして細胞に対して毒性
であることを見出した。ＧｎＴＶ（異なる糖タンパク質改変グリコシルトラン
スフェラーゼ）のテトラサイクリン調節過剰発現を有する別のＣＨＯ細胞株は、
同様の阻害効果を示した。このことは、これが、糖タンパク質改変グリコシルト
ランスフェラーゼ過剰発現の一般的特徴であり得ることを示す。この現象は、以
前に報告されておらず、おそらく発明者は、一般的には、関連実験については構
成的なプロモーターを使用したという事実に起因する。増殖効果は、糖タンパク
質改変グリコシルトランスフェラーゼ過剰発現のレベルの上方制限を設定し、そ
れによってまた貧弱な到達可能な糖タンパク質部位の改変の最大範囲を制限し得
る。

【００６３】（１．材料および方法）グリコシルトランスフェラーゼのテトラサイクリン調節発現を有するＣＨＯ細
胞の樹立。第１の工程において、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター
（ｔＴＡ）を、調節系に十分なレベルで、構成的に発現する中間のＣＨＯ細胞株
（ＣＨＯ−ｔＴＡ）をまず生成した。リポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ，Ｅｇ
ｇｅｎｆｅｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＨＯ（ＤＵＫＸ）細胞を
、ｔＴＡ遺伝子の構成的発現のためのベクターであるｐＵＨＤ１５−１（Ｇｏｓ
ｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１）およびネオマイシン耐性遺伝子の構成的発
現のためのベクターであるｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌ
ｔｏ、ＣＡ）とともに同時トランスフェクトした。安定した薬物耐性クローンを
選択し、そしてテトラサイクリン調節β−ガラクトシダーゼ発現ベクターである
ｐＵＨＧ１６−３を用いた一過性トランスフェクションによる十分なレベルのｔ
ＴＡ発現についてスクリーニングした。ｃ−ｍｙｃエピトープコードＤＮＡを、
ＰＣＲ増幅によってラットＧｎＴＩＩＩｃＤＮＡ（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、
１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１８１９９−１８２０４）の３’
末端に付加した。Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９３、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２
０：５−１３。この産物を配列決定し、そしてテトラサイクリン調節発現のため
のベクターであるｐＵＨＤ１０−３（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、前出）
にサブクローニングし、ベクターｐＵＨＤ１０−３−ＧｎＴＩＩＩｍを生成し
た。ヒトＧｎＴＶｃＤＮＡ（Ｓａｉｔｏら、１９９５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２３３：１８−２６）を、ｐＵＨＤ１０−３に直接サブクローニング
し、プラスミドベクターｐＵＨＤ１０−３−ＧｎＴＶを生成した。ＣＨＯ−ｔ
ＴＡ細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション法（ＪｏｒｄａｎおよびＷ
ｕｒｍ．１９９６、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４：５９６−６０
１）を用いて、ピューロマイシン耐性の構成的発現のためのベクターであるｐＰ
ｕｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）、およびベクターｐＵＨ
Ｄ１０−３−ＧｎＴＩＩＩｍまたはベクターｐＵＨＤ１０−３−ＧｎＴＶの
いずれかで、同時トランスフェクトした。ピューロマイシン耐性クローンをテト
ラサイクリンの存在下で選択し、単離し、次いでウェスタンブロット分析により
ＧｎＴＩＩＩまたはＧｎＴＶのテトラサイクリン調節発現について分析した
。後述を参照のこと。

【００６４】ウェスタンブロッティングおよびレクチンブロッティング。ＧｎＴＩＩＩま
たはＧｎＴＶのウェスタンブロット分析のために、細胞溶解物を、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分離し、そしてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ
、ＭＡ）に電気ブロットした。抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０（Ｎｉ
ｌｓｓｏｎら、１９９３、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２０：５−１３）を用い
てＧｎＴＩＩＩを検出し、そして抗ＧｎＴＶウサギポリクローナル抗体（Ｃ
ｈｅｎら、１９９５、ＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＪ．１２：８１３−８２
３）を用いてＧｎＴＶを検出した。二次抗体として、抗マウスまたは抗ウサギ
ＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、
ＩＬ）を使用した。結合した二次抗体を、増強化学発光キット（ＥＣＬキット、
Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＩＬ）を使用して検出した。

【００６５】ＧｎＴＩＩＩ触媒反応またはＧｎＴＶ触媒反応のいずれかにより改変され
る糖タンパク質のレクチンブロット分析について、ビオチン化Ｅ−ＰＨＡ（Ｏｘ
ｆｏｒｄＧｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎ
ｇｄｏｍ）またはＬ−ＰＨＡ−ジゴキシゲニン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎ
ｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をそれぞれ使用した。Ｍｅｒ
ｋｌｅおよびＣｕｍｍｉｎｇｓ、１９８７、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．
１３８：２３２−２５９。

【００６６】（２．結果および考察）グリコシルトランスフェラーゼのテトラサイクリン調節過剰発現を有するＣＨ
Ｏ細胞株の樹立。グリコシルトランスフェラーゼ過剰発現細胞株の樹立のために
使用される戦略は、最初に、この系が働くのに十分なレベルで、テトラサイクリ
ン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡ）を構成的に発現する中間体ＣＨＯ細胞
株をまず生成することからなった。Ｙｉｎら、１９９６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．２３５：１９５−２０１。このレベルは、テトラサイクリン非存在下で、
グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の上流の最小プロモータからの転写の高い
レベルを活性化するのに十分高くなくてはいけなかった。ＣＨＯ細胞を、ｔＴＡ
の構成的発現のためのベクター（これは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ
）プロモーター／エンハンサーによって駆動される）、およびネオマイシン耐性
（Ｎｅｏ^R）遺伝子の発現のためのベクターとともに同時トランスフェクトした
。過剰なｔＴＡ発現ベクターを使用し、そしてネオマイシン耐性クローンを単離
した。

【００６７】哺乳動物細胞において、同時トランスフェクトされたＤＮＡは、染色体内のラ
ンダムな位置で隣接して組込まれ、そして発現は、組込み部位に大部分依存し、
そしてインタクトな発現カセットのコピー数にもまた依存する。トランスフェク
トされた遺伝子の異なる発現レベルを有するクローンの混合集団が生成される。
Ｙｉｎら、１９９６、前出。ネオマイシン耐性についての選択は、単に、インタ
クトなＮｅｏ^R発現カセットの組込みについて選択し、一方過剰なｔＴＡ発現ベ
クターの使用は、ｔＴＡの良好な発現を有するクローンを見出す確率を増大させ
る。クローンの混合集団は、ｔＴＡ発現についての機能的アッセイを用いてスク
リーニングされなければならない。ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９２
、前出；Ｙｉｎら、１９９６、前出。これは、ｔｅｔプロモーターの制御下でレ
ポーター遺伝子ｌａｃＺを保有する第２のベクターによる各クローンのトランス
フェクション、およびβ−ガラクトシダーゼ活性の、テトラサイクリン調節（ｔ
ｅｔ調節）一過的発現（すなわち、トランスフェクション後１〜３日後）につい
てのスクリーニングによりなされた。ＣＨＯｔ１７（これは、２０のスクリーニ
ングされたクローンの間で最も高いレベルのｔｅｔ調節β−ガラクトシダーゼ活
性を示した）を、さらなる研究のために選択した。

【００６８】ＣＨＯｔ１７細胞を、ベクターｐＵＨＤＩＯ−３−ＧｎＴＩＩＩｍで細胞を
トランスフェクトし、そしてテトラサイクリンの存在下または非存在下での３６
時間、細胞をインキュベートした後のＧｎＴＩＩＩの相対レベルを比較するこ
とにより、ＧｎｔＩＩＩのｔｅｔ調節発現について試験した。ＧｎＴＩＩＩ
レベルを、ＧｎＴＩＩＩのカルボキシ末端でｃ−ｍｙｃペプチドエピトープタ
グを認識するモノクローナル抗体（９Ｅ１０）を用いて、ウェスタンブロット分
析により比較した。このタグを、ＰＣＲ増幅を用いたグリコシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子の改変により導入した。種々の報告は、局在または活性を崩壊するこ
となく、同じトポロジーを共有する酵素群であるグリコシルトランスフェラーゼ
のカルボキシ末端へペプチドエピトープの付加することを実証した。Ｎｉｌｓｓ
ｏｎら、１９９３、前出；Ｒａｂｏｕｉｌｌｅら、１９９５、Ｊ．ＣｅｌｌＳ
ｃｉｅｎｃｅ１０８：１６１７−１６２７。図２は、クローンＣＨＯｔ１７に
おいて、ＧｎＴＩＩＩ蓄積が、テトラサイクリンの存在下よりも非存在におい
ての方が、有意に高いことを示す。β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイにおい
てより弱い転写活性化を与えるさらなるクローン、ＣＨＯｔ２を、並行して試験
した（図２）。ＧｎＴＩＩＩおよびβ−ガラクトシダーゼの発現レベルは、こ
れらの両方のクローンについて同じパターンのテトラサイクリン調節を伴う。Ｇ
ｎＴＩＩＩ発現が量的に制御され得るテトラサイクリン濃度の範囲は、０〜１
００ｎｇ／ｍｌと見出された（図３）。この結果は、異なる細胞株と遺伝子を用
いた前述の研究に一致する（Ｙｉｎら、１９９６、前出）。

【００６９】ＧｎＴＩＩＩのｔｅｔ調節発現を有する安定な細胞株を生成するために、Ｃ
ＨＯｔ１７細胞を、ベクターｐＵＨＤＩＯ−３−ＧｎＴＩＩＩｍおよびプロマ
イシン耐性遺伝子の発現のためのベクターｐＰＵＲで同時トランスフェクトした
。並行して、ＣＨＯｔ１７細胞を、ｐＵＨＤＩＯ−３−ＧｎＴＶベクターおよ
びｐＰＵＲベクターで同時トランスフェクトし、この他のグリコシルトランスフ
ェラーゼについて類似の細胞株を生成した。高度に効率的なリン酸カルシウムト
ランスフェクション方法を使用して、そして真核生物発現カセットの外側の唯一
の制限部位でＤＮＡを線状化し、組込みの際にこれらを崩壊する確率を減少させ
た。発現したｔＴＡのレベルが最初に十分であると証明されている宿主を用いる
ことによって、テトラサイクリン非存在下でグリコシルトランスフェラーゼの高
度な発現を有するクローンを見出す確率が増大する。

【００７０】安定な組込み体を、ピューロマイシン耐性により選択し、クローン選択を行っ
た培地中にテトラサイクリンを保ち、基底レベルでのグリコシルトランスフェラ
ーゼの発現を維持した。各グリコシルトランスフェラーゼについて、１６のピュ
ーロマイシン耐性クローンをテトラサイクリンの存在および非存在下で増殖し、
それぞれの８つをウェスタンブロット分析により分析した（図４）。大多数のク
ローンは、グリコシルトランスフェラーゼ発現の良好な調節を示した。ＧｎＴ
ＩＩＩ発現クローンのうちの１つは、テトラサイクリンの存在下で比較的高い基
底レベルを示した（図４Ｂ、クローン３）。このことは、発現カセットの組込み
が内因性ＣＨＯ細胞エンハンサーに近接することを示唆する；一方、２つのピュ
ーロマイシン耐性クローンは、テトラサイクリンの非存在下でＧｎＴＩＩＩの
発現を示さなかった（図４Ｂ、クローン６および８）。発現の良好な調節を示す
クローンの間で、異なる最大レベルのグリコシルトランスフェラーゼが観察され
た。これは、組込み部位または組込まれたコピー数におけるバリエーションに起
因し得る。グリコシルトランスフェラーゼの活性を、テトラサイクリンの存在お
よび非存在において増殖させた種々のクローン由来の内因性細胞糖タンパク質へ
のＥ−ＰＨＡおよびＬ−ＰＨＡレクチン結合により確認した（図５）。レクチン
は、特異的なオリゴ糖構造に結合するタンパク質である。Ｅ−ＰＨＡレクチンは
、ＧｎＴＩＩＩ触媒反応の産物であるバイセクト型オリゴ糖に結合し、そして
Ｌ−ＰＨＡは、ＧｎＴＶ触媒化反応により産生されるトリアンテナリー型オリ
ゴ糖およびテトラアンテナリー型オリゴ糖に結合する（ＭｅｒｋｌｅおよびＣｕ
ｍｍｉｎｇｓ、１９８７、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１３８：２３２−
２５９）。各グリコシルトランスフェラーゼについて、テトラサイクリンの非存
在において高度に発現し、しかしテトラサイクリン存在下では検出不可能である
クローン（クローン６、図４Ａ、ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＶおよびクローン４
、図４Ｂ、ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ）を、さらなる研究のために選択
した。

【００７１】（Ｂ．実施例２：グリコシルトランスフェラーゼ過剰発現によってもたらされ
る細胞増殖の阻害）テトラサイクリンの非存在下でのＧｎＴＩＩＩを発現するクローンおよびＧ
ｎＴＶを発現するクローンのスクリーニングの間（上記の実施例１を参照のこ
と）、クローンの各セットのおよそ半分が増殖の強力な阻害を示した。増殖阻害
の程度は、クローンにより変動し、そしてウェスタンブロット分析から見積もっ
た発現レベルとの比較（図４）は、増殖阻害の程度と、グリコシルトランスフェ
ラーゼ過剰発現との間の相関を示唆した。この相関は、最後のクローンＣＨＯ−
ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍおよびＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＶを、種々の濃度の
テトラサイクリンにおいて増殖させることによって強固に確立された。増殖の強
力な阻害は、低レベルのテトラサイクリンでの培養の２日後に明確になった（図
６）。増殖阻害した細胞は、接着性ＣＨＯ細胞の代表的な細長い形状の代わりに
小さく丸い形態を提示した。数日後、有意な細胞死が、増殖阻害された細胞の形
態から明らかであった。

【００７２】グリコシルトランスフェラーゼ過剰発現に起因する増殖阻害は、これまで、文
献には報告されていない。これはおそらく、構成性のプロモーターの広汎な使用
に起因する。増殖阻害レベルでのグリコシルトランスフェラーゼの構成性発現を
与えるこれらのクローンは、選択手順の間に消失する。これは、選択の間に、培
地中のテトラサイクリン（すなわち、基底発現レベル）を維持することによって
ここで回避された。選択前に、構成性ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサーに基
づく伝統的な哺乳動物ベクターを用いて増殖阻害レベルにまでグリコシルトラン
スフェラーゼを発現し得るクローンの頻度は、より低いと予測される。これは、
任意の所定の遺伝子について、高度の構成性レベルのｔＴＡについて選択された
ＣＨＯ細胞株におけるｐＵＨＤＩＯ−３ベクターが、他者らによって観察される
ような、構成性のｈＣＭＶプロモーター／エンハンサーに基づくベクターよりも
有意に高い発現レベルを与えるという事実に起因する。Ｙｉｎら、１９９６、前
出。

【００７３】細胞増殖の阻害は、それらのインビボでの触媒活性には非依存性の、膜結合型
の、ゴルジ体内在性グリコシルトランスフェラーゼの過剰発現の直接の効果（例
えば、小胞体（ＥＲ）における折り畳みの誤りを介し、ＥＲにおけるタンパク質
折り畳みを補助するエレメントの飽和を生じる）に起因し得る。これは、おそら
く、他の必須の細胞タンパク質の折り畳みおよび分泌に影響を与え得る。あるい
は、増殖阻害は、グリコシルトランスフェラーゼのインビボ活性の増加に関連し
得る。この活性増加は、機能を破壊する様式で、標準的なインビトロ培養条件下
での増殖にとって必要な１セットの内因性糖タンパク質のグリコシル化パターン
の変化をもたらす。

【００７４】根底をなす機構とは独立して、この増殖阻害効果は、動物細胞のグリコシル化
を操作することについて２つの結果を有する。第一に、この効果は、標的となる
糖タンパク質産物のためのベクターとともに構成性グリコシルトランスフェラー
ゼ発現ベクターを同時トランスフェクトすることは、貧弱な戦略であることを示
唆する。これらの２つのクラスのタンパク質の連結した発現の他の方法（例えば
、類似の強度の複数の構成性プロモーターの使用または複数シストロン性の構成
性発現ベクターの使用による）もまた、回避されるはずである。これらの場合、
経済的なバイオプロセスにとって必要である、標的糖タンパク質の非常に高度で
構成性の発現を有するクローンもまた、グリコシルトランスフェラーゼの高度な
発現を有し、そしてこの選択プロセスにおいて排除され得る。連結された誘導性
の発現もまた、産業的バイオプロセスについて問題であり得る。なぜなら、増殖
停止した細胞の生存性は、グリコシルトランスフェラーゼの過剰発現によって減
弱化されるからである。

【００７５】第二の結果は、これが、グリコシル化操作のアプローチについてグリコシルト
ランスフェラーゼ過剰発現に上限を課すことである。明らかに、細胞において、
グリコシルトランスフェラーゼの内因性レベルでの、多くのグリコシルトランス
フェラーゼ触媒性の反応の変換は、いくつかのグリコシル化部位について非常に
高い。しかし、そのオリゴ糖がいくらかアクセス不能であるか、または特定のグ
リコシルトランスフェラーゼについて有利でないコンホメーションにおいて安定
化されている、グリコシル化部位もまた存在する。例えば、バイセクティングＧ
ｌｃＮＡｃの添加は、ヒトＩｇＧ抗体の可変領域に配置されるオリゴ糖よりもそ
のＦｃ領域に付着するオリゴ糖に、より制限されることが観察されている。Ｓａ
ｖｖｉｄｏｕら、１９８４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２３：３７３６−３７
４０。これらの制限された部位のグリコシル化操作は、グリコシルトランスフェ
ラーゼ発現におけるそのような限定によって影響を受け得る。これは、糖形態の
「非天然の」分布について目的化することを示唆するが、これらは、糖タンパク
質の特定の治療適用について利益があり得る。

【００７６】（Ｃ．実施例３：チャイニーズハムスター卵巣細胞の抗ヒト神経芽腫抗体のグ
リコシル化の操作）そのグリコシル化パターンを改変することによって治療抗体を操作する概念を
確認するために、キメラ抗ヒト神経芽腫ＩｇＧ１（ｃｈＣＥ７）を選択した。こ
のＩｇＧ１は、ＳＰ２／０組換えマウスミエローマ細胞によって産生される場合
有意ではないＡＤＣＣ活性を有する。ｃｈＣＥ７は、腫瘍に会合する１９０ｋＤ
ａの膜糖タンパク質を認識し、そしてこれまでに試験されている神経芽腫腫瘍の
すべてと強力に反応する。ｃｈＣＥ７は、その抗原について高度の親和性（１０ ¹⁰ Ｍ^-1のＫ_d）を有し、そしてその高度の腫瘍特異性のために、ｃｈＣＥ７は、
臨床病理において診断ツールとして慣用される。Ａｍｓｔｕｔｚら、１９９３．
Ｉｎｔ．ＪＣａｎｃｅｒ５３：１４７−１５２。近年の研究において、放射
標識されたｃｈＣＥ７は、ヒト患者において良好な腫瘍局在を示している。Ｄｕ
ｒｒ、１９９３、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２０：８５８。抗神経芽腫治
療モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるｃｈＣＥ７のグリコシル化パターンをＣ
ＨＯ細胞において、ＧｎＴＩＩＩのテトラサイクリン調節発現を用いて操作し
た。その糖形態分布において異なる１セットのｍＡｂサンプルを、基底レベルと
毒性レベルとの間の範囲においてＧｎＴＩＩＩ発現を制御することによって産
生した。そして、そのグリコシル化プロフィールを中性オリゴ糖のＭＡＬＤＩ／
ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。これらのサンプルのＡＤＣＣ活性の測定によっ
て、インビトロ生物学的活性における最大のｃｈＣＥ７についてのＧｎＴＩＩ
Ｉ発現の最適範囲が示された。そして、この活性は、Ｆｃに関連し、複合型バイ
セクト型オリゴ糖のレベルと相関していた。

【００７７】（１．材料および方法）ｃｈＣＥ７発現ベクターの構築。抗ヒト神経芽腫キメラ抗体ｃｈＣＥ７の、重
鎖（ＩｇＧ１）および軽鎖（κ）の発現のための、それぞれ、プラスミドベクタ
ー１０ＣＥ７ＶＨおよび９８ＣＥ７ＶＬ（これらは、マウス免疫グロブリンプロ
モーター／エンハンサー、マウス抗体可変領域、およびヒト抗体定常領域を含む
キメラゲノムＤＮＡを含む）（Ａｍｓｔｕｔｚら、１９９３、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ５３：１４７−１５２）を、最終の発現ベクターｐｃｈＣＥ７Ｈおよ
びｐｃｈＣＥ７Ｌの構築のための出発材料として使用した。キメラ重鎖および軽
鎖ｃｈＣＥ７の遺伝子を、再アセンブリし、そしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベク
ター中にサブクローニングした。再アセンブリの間、全てのイントロンを除去し
、リーダー配列を、合成したものに置き換えた（Ｒｅｆｆら、１９９４、Ｂｌｏ
ｏｄ８３：４３５−４４５）。そして、可変領域および定常領域の配列を接合
する独特な制限部位を導入した。重鎖の定常領域からイントロンを、重複伸長Ｐ
ＣＲを用いてスプライシングすることによって除去した（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、
１９９１、ＧｅｎｅｒａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＰＣＲｔｏ
ＧｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、ｐ．１８７−
２１４、ｉｎ：ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（編）、ＰＣＲａＰｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、Ｏｘ
ｆｏｒｄ）。

【００７８】異なるレベルのＧｎＴＩＩＩを発現するｃｈＣＥ７のＣＨＯ細胞における産
生。ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ（前出を参照のこと）細胞を、リン酸カ
ルシウムトランスフェクション方法を使用して、ベクターｐｃｈＣＥ７Ｈ、ｐｃ
ｈＣＥ７Ｌ、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｚｅｏｃｉｎ耐性のため、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて同時
トランスフェクトした。Ｚｅｏｃｉｎ耐性クローンを、９６ウェル細胞培養プレ
ートに移した。そして、ヒトＩｇＧ定常領域について特異的なＥＬＩＳＡアッセ
イを用いてキメラ抗体発現についてアッセイした。Ｌｉｆｅｌｙら、１９９５、
前出。４つのｃｈＣＥ７抗体サンプルは、１０％ＦＣＳを補充したＦＭＸ‐８
細胞培養培地中で増殖させた選択したクローン（ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩ
Ｉｍ−ｃｈＣＥ７）の並行培養物に由来した；各培養物は、異なるレベルのテト
ラサイクリンを含み、従って、異なるレベルのＧｎＴＩＩＩを発現した。ＣＨ
Ｏ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ−ｃｈＣＥ７細胞を増大させ、そして７日間、異
なる濃度のテトラサイクリンに予備適合させた。テトラサイクリンのレベルは、
２０００ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、および１５ｎｇ／ｍｌ
であった。

【００７９】ｃｈＣＥ７抗体サンプルの精製。抗体を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２
０、１Ｍ尿素、ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）から緩衝液Ｂ（リン酸ナトリウムのな
い緩衝液Ａ、ｐＨ２．５）へのｐＨ線形勾配溶出を用いて、１ｍｌのＨｉＴｒ
ａｐプロテインＡカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌ
ａ、Ｓｗｅｄｅｎ）におけるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに
よって培養培地から精製した。アフィニティー精製したｃｈＣＥ７サンプルを、
１ｍｌのＲｅｓｏｕｒｃｅＳカチオン交換カラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏ
ｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）においてＰＢＳへと緩衝液交換した
。最終純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色から９５％より高
いと判断した。各サンプルの濃度を、２８０ｎｍでの吸光度から見積もった。

【００８０】抗体の神経芽腫細胞への結合。ヒト神経芽腫細胞への結合親和性を、ＣＨＯ産
生したサンプルによる¹²⁵Ｉ標識したｃｈＣＥ７の変位量から見積もった。Ａｍ
ｓｔｕｔｚら、１９９３、前出。

【００８１】ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによるオリゴ糖分析。ＣＥ７−２０００ｔ，ＣＥ７
−６０ｔ，ＣＥ７−３０ｔ、およびＣＥ７−１５ｔのサンプルを、Ａ．ｕｒｅｆ
ａｃｉｅｎｓシアリダーゼ（ＯｘｆｏｒｄＧｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘ
ｆｏｒｄ，ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）を、製造業者の指示に従って用いて
処理して、任意のシアル酸モノサッカリド残基を除いた。次いで、シアリダーゼ
消化物を、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ、ＯｘｆｏｒｄＧ
ｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）を
製造業者の指示に従って用いて処理して、Ｎ結合型オリゴ糖を放出させた。タン
パク質、界面活性剤および塩を、その消化物を上部から底部まで、２０ｍｌのＳ
ａｐＰａｋＣ１８逆相マトリクス（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を
含むマイクロカラム、２０ｍｌのＤｏｗｅｘＡＧ５０ＷＸ８カチオン交換
マトリクス（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含むマイクロカラム、
および２０ｍｌのＡＧ４Ｘ４アニオン交換マトリクス（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒ
ｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含むマイクロカラムに通すことによって除去した。これら
のマイクロカラムを、これらのマトリクスを、エタノールを満たしたＧｅｌＬ
ｏａｄｅｒチップ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
）中に充填すること、続いて水を用いて平衡化することによって作製した。Ｋｕ
ｓｔｅｒら、１９９７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：８２−１０１。フ
ロースルーの液体および３００ｍｌの水での洗浄物をプールし、濾過し、エバポ
レートして、室温で乾燥させ、そして２ｍｌの脱イオン水中に再懸濁した。１μ
ｌをＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプルプレート（ＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）に適用し、そしてアセトニトリル中の
１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌデヒドロ安息香酸（ＤＨＢ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗ
ａｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）溶液と混合した。これらのサンプルを風乾し、
そして得られた結晶を０．２ｍｌのエタノール中に溶解し、そして風乾により再
結晶させた。Ｈａｒｖｅｙ、１９９３、ＲａｐｉｄＭａｓｓ、Ｓｐｅｃｔｒｏ
ｍ．７：６１４−６１９。次いで、このオリゴ糖サンプルを、陽イオンおよび反
射様式で、２０ｋＶの加速電圧を用いて、遅延イオン抽出ＭＡＬＤＩイオン供給
源を装着したＥｌｉｔｅＶｏｙａｇｅｒ４００分光器（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用いるマトリクス支
持レーザー脱離イオン化／飛行時間重量スペクトル測定（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−
ＭＳ）によって分析した。１２８の走査を平均化した。バイアンテナリー複合型
バイセクト型オリゴ糖構造を、５つのＨｅｘＮＡｃに関連するピークに割り当て
た。代替の５つのＨｅｘＮＡｃを含むアイソマーであるＮ結合型トリアンテナリ
ー非バイセクト型オリゴ糖は、ＩｇＧのＦｃ領域においては決して見出されず、
そしてそれらの合成は、ＧｎＴＩＩＩとは別のグリコシルトランスフェラーゼ
によって触媒された。

【００８２】ＡＤＣＣ活性アッセイ。異なる濃度のｃｈＣＥ７サンプルの存在下で、１：１
９での標的：エフェクター比にて、３７℃１６時間のインキュベーションの間の
ＩＭＲ−３２ヒト神経芽腫細胞（標的）のヒトリンパ球（エフェクター）による
溶解を、蛍光色素の保持を介して測定した。Ｋｏｌｂｅｒら、１９８８、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１０８：２５５−２６４。ＩＭＲ−３２細胞を
、蛍光色素ＣａｌｃｅｉｎＡＭを用いて２０分間標識した（最終濃度３．３μ
Ｍ）。標識した細胞（８０，０００細胞／ウェル）を、１時間、異なる濃度のＣ
Ｅ７抗体とインキュベートした。次いで、単球を涸渇した単核細胞を添加した（
１，５００，０００細胞／ウェル）。そして、細胞混合物を、５％ＣＯ₂雰囲気
中で３７℃で１６時間インキュベートした。この上清を捨て、そしてその細胞を
ＨＢＳＳで一回洗浄し、そしてＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．１％）中で溶
解した。ＩＭＲ−３２細胞における蛍光色素の保持を、蛍光測定器（Ｐｅｒｋｉ
ｎＥｌｍｅｒ，ＬｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒＬＳ
５０Ｂ、（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ））を用いて測定し、そして特定の溶
解物を、その標的を抗体への曝露の代わりに界面活性剤に対する曝露から得られ
た総溶解物コントロールに対して相対的に算出した。抗体の非存在下でのシグナ
ルを、０％の細胞傷害性に設定した。各抗体濃度を、三連にて分析し、そしてそ
のアッセイを、３回の別個の回数反復した。

【００８３】（２．結果および考察）異なるレベルのＧｎＴＩＩＩを発現するＣＨＯ細胞におけるｃｈＣＥ７の産
生。ＣｈＣＥ７の重鎖および軽鎖の発現ベクターを、ヒトサイトメガロウイルス
（ｈＣＭＶ）プロモーター、ウシ成長ホルモン終結配列およびポリアデニル化配
列を組み込み、そして全ての重鎖および軽鎖のイントロンを除去して構築した。
このベクター設計は、ＣＨＯ細胞における組換えＩｇＧ遺伝子の再現性の良い高
レベル発現の報告に基づいた。Ｒｅｆｆら、１９９４、前出；Ｔｒｉｌｌら、１
９９５、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５５３
−５６０。さらに、独特な制限部位を、可変領域と定常領域との間の接合部にて
各鎖に導入した。これらの部位は、リーディングフレームを保存し、そしてアミ
ノ酸配列を変化させない。これらは、他のマウス−ヒトキメラ抗体の産生のため
の、マウス可変領域の単純な交換を可能にするはずである。Ｒｅｆｆら，１９９
４、前出。ＤＮＡ配列決定によって、所望の遺伝子が適切にアセンブルされてい
るかを確認した。そして、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるキメラ抗
体の産生を、ヒトＦｃ−ＥＬＩＳＡアッセイを用いて確認した。

【００８４】ＧｎＴＩＩＩの安定なテトラサイクリン制御された発現およびｃｈＣＥ７の
安定な構成的発現を伴うＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ−ｃｈＣＥ７細胞を
確立し、そして１セットのｃｈＣＥ７サンプルの産生のために規模拡大した。規
模拡大の間、同じＣＨＯクローンに由来する４つの並行培養物を、各々、異なる
レベルのテトラサイクリンおよびすなわちＧｎＴＩＩＩ遺伝子の発現レベルの
みにおいて異なるように増殖させた。この手順は、Ｎ結合型糖形態の生合成に影
響を与える他の可変物からの任意のクローン性効果を除去し、ＧｎＴＩＩＩ遺
伝子発現とグリコシル化抗体の生物学的活性との間の厳格な相関付けの確立を可
能にする。テトラサイクリンの濃度は、２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、ＧｎＴ
ＩＩＩ発現の基底レベル）から１５ｎｇ／ｍｌ（この濃度において、グリコシ
ルトランスフェラーゼの過剰発現に起因する有意な増殖阻害および毒性が観察さ
れた（前出を参照のこと））までに及んだ。実際、ほんのわずかの量の抗体が後
者の培養物から回収され得た。テトラサイクリンを３０ｎｇ／ｍｌの濃度で用い
た第二の最高レベルのＧｎＴＩＩＩ発現は、緩和な増殖阻害のみをもたらした
。この培養物から精製した抗体の収率は、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子過剰発現の残り
の２つのより低いレベル由来のものの約７０％であった。

【００８５】４つの抗体サンプルＣＥ７−２０００ｔ、ＣＥ７−６０ｔ、ＣＥ７−３０ｔ、
ＣＥ７−１５ｔ（数字は、テトラサイクリンの会合濃度を示す）を、プロテイン
Ａ上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてカチオン交換カ
ラムを用いてＰＢＳへと緩衝液交換した。純度は、クーマシーブルー染色を用い
たＳＤＳ−ＰＡＧＥから判断した場合９５％を超えた。ヒト神経芽腫細胞に対す
る結合アッセイは、細胞に対する高度の親和性および異なるサンプル間で抗原結
合が有意に相違しないことを示した（２．０Ｍと２．７×１０^-10Ｍとの間で変
動させた推定平衡解離定数）。このことは予測どおりであった。なぜならＣＥ７
可変領域には、推定Ｎ結合型グリコシル化部位が存在しないからである。

【００８６】異なるｃｈＣＥ７サンプルの複合型バイセクト型オリゴ糖の分布およびレベル
。オリゴ糖プロフィールを、飛行時間におけるマトリクス支持レーザ脱離／イオ
ン化質量測定（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ）によって得た。４つのＣＨＯ産生し
た抗体サンプルの各々およびＳＰ２／０マウスミエローマ由来のｃｈＣＥ７（Ｃ
Ｅ７−ＳＰ２／０）サンプルに由来する中性のＮ結合型オリゴ糖の混合物を、２
，５−デヒドロ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）を用いてマトリクスとして分析した
（図９）。これらの条件下で、中性のオリゴ糖は、本質的に単一の［Ｍ＋Ｎａ ⁺ ］イオンであるようであり、これは、ときに、そのマトリクスのカリウム含有
量に依存してより小さな［Ｍ＋Ｋ⁺］イオンを伴う。Ｂｅｒｇｗｅｆｆら、１
９９５、ＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＪ．１２：３１８−３３０。

【００８７】この型の分析は、異なる質量の中性オリゴ糖の相対比（これは、相対ピーク高
さに反映される）、および各ピークのモノサッカリドの荷電組成の両方を得た。
Ｋｕｓｔｅｒら、１９９７、前出；ＮａｖｅｎおよびＨａｒｖｅｙ、１９９６、
ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．１０：１３６１−１
３６６。一時的な構造を、そのモノサッカリドの組成、生合成経路の知識および
同じ宿主によって産生された同じ糖タンパク質由来のオリゴ糖についてのこれま
での構造データに基づくピークにより割り当てる。なぜなら、タンパク質バック
ボーンおよび細胞型は、オリゴ糖分布に対して強力な影響を有し得るからである
。Ｆｉｅｌｄら、１９９６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：９２−９８。
Ｆｃが会合するオリゴ糖の場合、バイアンテナリー複合型オリゴ糖のみがヒト血
清に存在するＩｇＧにおいて検出されるか、または正常条件下での哺乳動物細胞
培養物によって産生された。Ｗｏｒｍａｌｄら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ３６：１３７０−１３８０；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１
９９７，Ｔｉｂｔｅｃｈ１５：２６−３１。これらの化合物へ導く経路を、各
オリゴ糖に対応する［Ｍ＋Ｎａ⁺］イオンの質量を含めて図１０に示す。高マ
ンノースオリゴ糖もまた、バッチ細胞培養物の安定期および死期において産生さ
れた抗体において検出された。ＹｕＩｐら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ３０８：３８７−３９９。

【００８８】ＣＥ７−ＳＰ２／０サンプルにおける２つの主要なピーク（図９Ａ）は、４つ
のＮ−アセチルヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）を伴うフコシル化オリゴ糖の質量
に対応する（これらは、３つ（ｍ／ｚ１４８６）または４つ（ｍ／ｚ１６４８）
のいずれかのヘキソースを含む）。図１０を参照のこと。しかし、この図におけ
るオリゴ糖についてまとめた注記は、コアの２つのＧｌｃＮＡｃを計数していな
いことに注意されたい。この組成は、それぞれ、０個または１個のガラクトース
残基を有する、コアがフコシル化バイアンテナリー複合型オリゴ糖構造（これは
、Ｆｃが会合したオリゴ糖に代表的であり、そしてＳＰ２／０細胞において発現
されたキメラＩｇＧ１に由来するＦｃオリゴ糖のＮＭＲ分析においてこれまでに
観察されている通りである）と一致する。Ｂｅｒｇｗｅｆｆら、１９９５、前出
。

【００８９】ＧｎＴＩＩＩに触媒される、バイセクティングＧｌｃＮＡｃのこれらのバイ
アンテナリー化合物（この化合物は、好ましいＧｎＴＩＩＩアクセプターであ
る）への移入は、５つのＨｅｘＮＡｃを伴うオリゴ糖をもたらす（ｍ／ｚ１６８
９および１８５１、それぞれ、非ガラクトシル化およびモノガラクトシル化、図
１０）。これらのオリゴ糖は、ＣＥ７−ＳＰ２／０サンプルにおいては明らかに
存在しなかった。後者のピークは、ｃｈＣＥ７がＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ
ｍ細胞において発現される場合に現れる。ＣＨＯが発現する抗体において、４つ
のＨｅｘＮＡｃを含有するピークもまた、主にフコシル化されている。しかし、
少量のフコシル化されていない構造も、ｍ／ｚ１３３９でのピークから明らかで
ある（図１０を参照のこと）。ガラクトシル化のレベルはまた、ＣＨＯ由来材料
とＳＰ２／０由来材料との間であまり異ならない。ＧｎＴＩＩＩ発現の基底レ
ベルでは（ＣＥ７−２０００ｔサンプル．図９Ｂ）、５つのＨｅｘＮＡｃを伴う
分子は、４つのＨｅｘＮＡｃを伴うものよりも低い割合で存在する。より高いレ
ベルのＧｎＴＩＩＩ発現（ＣＥ７−６０ｔサンプル、図９Ｃ）は、５つのＨｅ
ｘＮＡｃを伴うオリゴ糖に有利に比の逆転をもたらした。この傾向に基づいて、
バイアンテナリー複合型バイセクト型オリゴ糖構造は、これらのサンプルにおい
て５つのＨｅｘＮＡｃを伴う化合物であると割り当てられた。三アンテナ性Ｎ結
合型オリゴ糖である別の５ＨｅｘＮＡｃ含有アイソマーは、ＩｇＧのＦｃ領域に
おいては決して見出されず、そしてその合成は、ＧｎＴＩＩＩとは異なるＧｌ
ｃＮＡｃトランスフェラーゼによって触媒される。

【００９０】ＧｎＴＩＩＩ発現におけるさらなる増加（ＣＥ７−３０ｔサンプル、図９Ｄ
）は、複合型バイセクト型オリゴ糖のレベルにおいてなんらの有意な変化をもも
たらさなかった。５つのＨｅｘＮＡｃを含む別のピーク（ｍ／ｚ１５４３）は、
ＣＨＯ−ＧｎＴＩＩＩサンプルにおいて低いが比較的安定なレベルで現れ、そし
て質量において非フコシル化複合型バイセクト型オリゴ糖質量に対応する（図１
０）。ｍ／ｚ１７０５およびｍ／ｚ１８６７での小さなピークもまた、５つのＨ
ｅｘＮＡｃ含有バイアンテナリー複合型オリゴ糖に対応する。それらは、ｍ／ｚ
１６８９およびｍ／ｚ１８５１でのピークのカリウム付加物（ナトリウム付加物
に関する１６Ｄａの質量の相違）（Ｋｕｓｔｅｒら、１９９７、前出）か、また
はフコースを伴わないモノガラクトシル化および二ガラクトシル化複合型バイセ
クト型オリゴ糖のいずれかに割り当てられ得る（図１０）。まとめると、複合型
バイセクト型オリゴ糖は、サンプルＣＥ７−２０００ｔにおける合計の約２５％
の量であり、そしてサンプルＣＥ７−６０ｔおよびＣＥ７−３０ｔにおいて約４
５％〜５０％に達する。

【００９１】ｃｈＣＥ７サンプルのオリゴ糖プロフィールからのさらなる情報。複合型バイ
セクト型オリゴ糖のレベルは、サンプルＣＥ７３０ｔにおいてより高くなかった
が、ＧｎＴＩＩＩの過剰発現の増加は、少量ではあるが、バイアンテナリー複
合型オリゴ糖基質の基質比を継続して減少させた。このことは、２つの異なる４
つのＨｅｘＮＡｃ含有ピーク（ｍ／ｚ１６６４およびｍ／ｚ１８１０）において
中程度の増加を伴った。後者の２つのピークは、ガラクトシル化バイアンテナリ
ー複合型オリゴ糖、または混成型バイセクト型化合物のいずれかに対応し得る（
図１１）。両方のクラスの構造の組合せもまた、可能である。これらのピークに
おける相対的な増加は、ＧｎＴＩＩＩ過剰発現の混成型バイセクト型の副産物
の蓄積と一致する。実際、ＧｎＴＩＩＩ過剰発現の最高レベルで産生されたサ
ンプルであるＣＥ７−１５ｔは、ｍ／ｚ１６６４におけるピークの大きな増加、
ｍ／ｚ１８１０におけるピークの減少、およびバイセクト型複合オリゴ糖の約２
５％のレベルへの同時減少を示した。図９Ｅにおけるｍ／ｚ１６８９およびｍ／
ｚ１８５１のピークならびに図１１における対応する構造を参照のこと。フコシ
ル化されたもの（ｍ／ｚ１８１０）に代わる、非フコシル化（ｍ／ｚ１６６４）
の混成型バイセクト型副産物のより高度な蓄積は、ＧｎＴＩＩＩによってまず
改変されているオリゴ糖がもはや、コアのα１，６−フコシルトランスフェラー
ゼについての生合成基質ではあり得ないという事実に一致する。Ｓｃｈａｃｈｔ
ｅｒ、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６４：１６３−１８１
。

【００９２】ｍ／ｚ１２５７でのピークは、ＣＨＯに由来するサンプルにおける合計の１０
〜１５％のレベルで、およびＣＥ７−ＳＰ２／０よりも低いレベルで存在する（
図９）。これは、５つのヘキソースおよび２つのＨｅｘＮＡｃに対応する。この
組成を有する唯一公知であるＮ結合型オリゴ糖構造は、高マンノース型の５つの
マンノースを含有する化合物である。別の高マンノースオリゴ糖である６マンノ
ースのもの（ｍ／ｚ１４２０）もまた、はるかに低いレベルで存在する。上記の
ように、このようなオリゴ糖は、バッチ細胞培養物の後期において発現されるＩ
ｇＧのＦｃにおいて検出されている。ＹｕＩｐら、１９９４、前出。

【００９３】ｃｈＣＥ７サンプルの抗体依存性細胞傷害性。ｃｈＣＥ７は、最小レベルのＧ
ｎＴＩＩＩ過剰発現をとともにＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ細胞中で発現さ
れるとき、ヒトリンパ球による神経芽腫細胞のインビトロ溶解として測定される
、ある程度のＡＤＣＣ活性を示す（図１２、サンプルＣＥ７−２０００ｔ）。Ｇ
ｎＴＩＩＩのレベルが上昇すると、ＡＤＣＣ活性における大きな増加が生じた（
図１２、サンプルＣＥ７−６０ｔ）。ＧｎＴＩＩＩのさらなる過剰発現は、活性
のさらなる増加をともなわず（図１２，サンプルＣＥ７−３０ｔ）、そして最高
レベルの発現は、実際に、減少したＡＤＣＣに至った（図１２、サンプルＣＥ７
−１５ｔ）。最高のＡＤＣＣ活性を示すことに加えて、ＣＥ７−６０ｔおよびＣ
Ｅ７−３０ｔの両方のサンプルの両方は、非常に低い抗体濃度で、有意なレベル
の細胞傷害性を示す。これらの結果は、ＡＤＣＣ活性についてＣＨＯ細胞におけ
る最適範囲のＧｎＴＩＩＩ過剰発現があることを示し、そしてオリゴ糖プロフィ
ールとの比較は、活性が、Ｆｃに結合した複合型バイセクト型オリゴ糖のレベル
と相関することを示す。

【００９４】ＡＤＣＣ活性についての複合型バイセクト型オリゴ糖の重要性を考慮すると、
これら化合物の比率をさらに増加させるために、この経路を操作することが有用
である。ＧｎＴＩＩＩの、サンプルＣＥ７−３０ｔについて用いられたレベルに
接近するレベルまでの過剰発現は、有意な傷害性および増殖阻害が観察されない
生物工学的に実施可能な範囲内にある。このレベルの発現では、非ガラクトシル
化された、バイアンテナリー複合型非バイセクト型オリゴ糖、すなわち、好適な
潜在的ＧｎＴＩＩＩ基質は、全体の１０％より少なくなるまで減少する。ｍ／ｚ
１４８６のピーク、図９Ｄを参照のこと。しかし、わずか５０％が、所望のバ
イアンテナリー複合型バイセクト型構造に転換されるだけである。残りは、混成
型バイセクト型オリゴ糖副産物に転用されるか、または競合酵素β１，４−ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、ＧａｌＴにより消費されるかのいずれかである（
図１１）。

【００９５】相補的構造分析による、混成型バイセクト型およびガラクトシル化複合型非バ
イセクト型オリゴ糖ピークの分離は、各々の潜在的な所望されない経路がいくら
消費されるかを決定する。高いＧｎＴＩＩＩ過剰発現レベルにおけるｍ／ｚ１
６６４および１８１０ピークの増大は、これらピークの少なくとも一部分は、混
成型バイセクト型オリゴ糖に対応することを示唆する（図１１）。理論的には、
混成型バイセクト型化合物に行くフラックスは、ＧｎＴＩＩＩと一緒のマンノシ
ダーゼＩＩのような経路中のより先の酵素の同時過剰発現により低減され得る。
その一方、ＧｎＴＩＩＩとＧａｌＴとの間の複合型バイセクト型オリゴ糖基質に
対する競合は、ＧｎＴＩＩＩを過剰発現する間に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのゴル
ジ体内濃度を増加させることにより、ＧｎＴＩＩＩ触媒反応に向かって潜在的に
片寄り得る。ＧｎＴＩＩＩは、ＧｌｃＮＡｃを、同時基質（ｃｏ−ｓｕｂｔｒａ
ｔｅ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから異なるオリゴ糖に転移させる。ＵＤＰ−Ｇｌｃ
ＮＡｃ同時基質のゴルジ体内濃度が、ＧｎＴＩＩＩに対して準飽和である場合、
それを、培養培地組成の操作によるか、またはゴルジ体中への糖−ヌクレオチド
輸送の遺伝的操作により増加させて、オリゴ糖についてＧａｌＴとの競合でＧｎ
ＴＩＩＩに有利にし得る。

【００９６】ＡＤＣＣ活性における増加が、ガラクトシル化および非ガラクトシル化の両方
の複合型バイセクト型オリゴ糖における増加から生じるか、またはこれらの形態
の１つのみにおける増加から生じるか否かは決定されるべきままである。図９に
おけるｍ／ｚ１６８９および１８５１のピークを参照のこと。ガラクトシル化
バイアンテナリー複合型バイセクト型オリゴ糖が、増加したＡＤＣＣ活性につい
て最適構造であることが見出される場合、Ｆｃ領域におけるこれら化合物の画分
を最大にすることは、ＧｎＴＩＩＩおよびＧａｌＴの両方の過剰発現を必要とす
る。先に論議された競合シナリオを考慮すると、両方の遺伝子の発現レベルは、
注意深く調節されなければならない。さらに、可能な限り、トランス−ゴルジ体
嚢の代わりにＴＧＮに向かって、過剰発現ＧａｌＴを再分配する試みは、価値が
ある。後者の戦略は、ＧａｌＴの膜貫通領域コード配列を、α２，６−シアリル
トランスフェラーゼの膜貫通領域（ＣｈｅｇｅおよびＰｆｅｆｆｅｒ、１９９０
、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：８９３〜８９９）と交換することにより実
現され得る。

【００９７】（Ｄ．実施例４：抗ＣＤ２０モノクローナル抗体Ｃ２Ｂ８のグリコシル化の操
作）Ｃ２Ｂ８は、抗ヒトＣＤ２０キメラ抗体である。Ｒｅｆｆ、Ｍ．Ｅ．ら、１９
９４、前述。Ｃ２Ｂ８は、１９９７年にＦＤＡ認可を受け、そして現在、合衆国
において、非ホジキンリンパ腫の処置のために、ＲｉｔｕｘａｎＴＭの商品名の
下で用いられている。Ｃ２Ｂ８は、ＣＨＯ細胞培養物に由来し、そしてそれ故、
バイセクト型オリゴ糖を保持しないはずである。前述を参照のこと。この抗体の
改良型を生成するために、ｃｈＣＥ７抗神経芽腫抗体について先に示された方法
が適用された。前述を参照のこと。開示された方法に従って改変されたＣ２Ｂ８
抗体は、同じ細胞培養物および精製条件の下で生成された、標準的な非改変Ｃ２
Ｂ８抗体よりも高いＡＤＣＣ活性を有していた。

【００９８】（１．材料および方法）キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（Ｃ２Ｂ８）の可変軽鎖領域および可変
重鎖領域の合成。Ｃ２Ｂ８抗体のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、ＰＣＲを用い
る１工程プロセス（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ２３：５００〜５０３）で、1セットの重複する一本鎖オリゴヌクレオチ
ド（プライマー）を用いて合成的にアセンブルした。抗ＣＤ２０抗体のマウス免
疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域（それぞれＶＬおよびＶＨ）をコード
する配列データを、公開された国際特許出願（国際公開番号：ＷＯ９４／１１
０２６）から得た。アセンブルされたＤＮＡフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＩＩＫＳ（＋）中にサブクローン化し、そしてＤＮＡサイクルシークエン
シングにより配列決定し、変異が導入されなかったことを確認した。

【００９９】キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（Ｃ２Ｂ８）の発現のためのベクターの
構築。Ｃ２Ｂ８モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのコード領域を、ｐｃｈＣ
Ｅ７ＨおよびｐｃｈＣＥ７Ｌ中にそれぞれサブクローン化した。このサブクロー
ニングでは、抗神経芽腫ＣＥ７の可変重鎖および可変軽鎖をコードする配列（前
述）を、Ｃ２Ｂ８の合成的にアセンブルされた可変重鎖領域および可変軽鎖領域
と交換した。

【０１００】Ｃ２Ｂ８抗体を発現するＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ細胞の生成。Ｃ２Ｂ
８抗体を発現するＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ細胞株の生成のための方法は
、ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ−ＣＥ７に対するのと正確に同じであった。
前述を参照のこと。さらなる作業のために選択されたクローンを、ＣＨＯ−ｔｅ
ｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ−Ｃ２Ｂ８と名づけた。

【０１０１】Ｃ２Ｂ８抗体を発現するＣＨＯ−ｔＴＡの生成。ＣＨＯ−ｔＴＡは、ＣＨＯ−
ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍの親細胞株である。前述を参照のこと。ＧｎＴＩＩＩを
発現せず、Ｃ２Ｂ８抗体を発現するＣＨＯ−ｔＴＡ細胞株の生成のための方法は
、ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ−Ｃ２Ｂ８およびＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩ
ＩＩｍ−ｃｈＣＥ７に対するのと正確に同じであった。前述を参照のこと。さら
なる作業のために選択されたクローンを、ＣＨＯ−ｔＴＡ−Ｃ２Ｂ８と名づけた
。

【０１０２】Ｃ２Ｂ８抗体サンプルの生成。２つのＣ２Ｂ８抗体サンプルは、平行なＣＨＯ
−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ−Ｃ２Ｂ８培養物に由来した；各培養物は、種々のレ
ベルのテトラサイクリンを含み、そしてそれ故ＧｎＴＩＩＩを種々のレベルで発
現すると予想される。テトラサイクリンのレベルは、２０００ｎｇ／ｍｌ、５０
ｎｇ／ｍｌ、および２５ｎｇ／ｍｌであった。これらの培養に由来するＣ２Ｂ８
抗体サンプルを、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ、およびＣ２Ｂ８−
２５ｔとそれぞれ称した。平行して、１つの抗体サンプル（Ｃ２Ｂ８−ｎｔ）を
、ＣＨＯ−ｔＴＡ−Ｃ２Ｂ８培養から作成した。この細胞株は、ＧｎＴＩＩＩを
発現しない。ＣＨＯ−ｔＴＡ−Ｃ２Ｂ８細胞を、テトラサイクリンなしで培養し
た。

【０１０３】ＧｎＴＩＩＩ発現の分析。ＧｎＴＩＩＩのウェスタンブロット分析については
、生産培養物の各々の細胞溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして
ポリビニリデンジフルオライド膜に電気ブロットした。抗ｃ−ｍｙｃモノクロー
ナル抗体９Ｅ１０および抗マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＩＬ）を、一次抗体および二次抗体としてそ
れぞれ用いた。結合抗体を、増感化学発光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉ
ｎｇｔｏｎ、ＩＬ）を用いて検出した。

【０１０４】Ｃ２Ｂ８抗体サンプルの精製。抗体サンプルを、ｃｈＣＥ７抗体サンプルにつ
いてと同じ手順を用いて精製した。前述を参照のこと。濃度を、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＰｒｏｂｅｓ（Ｌｅｉｄｅｎ、ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）からの
蛍光に基づくキットを用いて測定した。

【０１０５】特異的Ｃ２Ｂ８抗原結合の確認。Ｃ２Ｂ８抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の抗
原結合の特異性を、懸濁液中の細胞について間接免疫蛍光アッセイを用いて確認
した。この研究には、ＣＤ２０陽性細胞（ＳＢ細胞；ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ
ＣＣＬ１２０）およびＣＤ陰性細胞（ＨＳＢ細胞；ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ
ＣＣＬ１２０．１）を利用した。各タイプの細胞を、一次抗体としての、２５
ｎｇ／ｍｌテトラサイクリンで生成したＣ２Ｂ８抗体とともにインキュベートし
た。陰性のコントロールは、一次抗体の代わりにＨＢＳＳＢを含んだ。抗ヒトＩ
ｇＧＦｃ特異的なポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗体を、すべてのサンプル
について二次抗体として用いた（ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。細胞
を、Ｌｅｉｃａ（Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）蛍光顕微鏡を用いて調べ
た。

【０１０６】ＡＤＣＣ活性アッセイ。異なる濃度のＣ２Ｂ８サンプルの存在下の、ヒト単球
枯渇末梢血単核細胞（エフェクター細胞）によるＳＢ細胞（ＣＤ２０＋標的細胞
；ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣＣＣＬ１２０）の溶解を、Ｂｒｕｎｎｅｒら、１
９６８、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４：１８１−１８９に記載されるのと同じ手
順に基本的に従って実施した。エフェクター細胞の標的細胞に対する比率は、１
００：１であった。

【０１０７】（２．結果および考察）ＧｎＴＩＩＩは、種々の細胞株および培養物において種々のレベルで発現され
る。平行したＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ−Ｃ２Ｂ８培養物（各培養物は種
々のレベルのテトラサイクリン（２０００、５０、および２５ｎｇ／ｍｌ）を含
み、そしてそれ故、種々のレベルでＧｎＴＩＩＩを発現すると期待される）の細
胞を溶解し、そして細胞溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてウェ
スタンブロッティングにより検出した。２５ｎｇ／ｍｌテトラサイクリンで増殖
させた培養物の溶解産物は、ＧｎＴＩＩＩの対応する分子量に強いバンドを示し
、その一方、５０および２０００ｎｇ／ｍｌで増殖させた培養物は、図１３に示
されるように、ＧｎＴＩＩＩのかなりより少ない発現を有していた。

【０１０８】特異的Ｃ２Ｂ８抗原結合の確認。種々のレベルのＧｎＴＩＩＩを発現する細胞
の平行培養物から産生されたＣ２Ｂ８サンプルを、アフィニティークロマトグラ
フィーにより培養上清から精製し、そしてカチオン交換カラム上でＰＢＳに緩衝
液交換した。純度は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色から
９５％より高いと推定された。これらの抗体サンプルは、可変領域がＰＣＲアセ
ンブリ法により合成された抗体遺伝子の発現に由来した。この合成ｃＤＮＡフラ
グメントの配列決定は、先に公開された国際特許出願（国際公開番号ＷＯ９４／
１１０２６）中の元のＣ２Ｂ８可変領域配列とは差異を示さなかった。このサン
プルのヒトＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８の標的抗原である）への特異的結合は、その表面
上にＣＤ２０を発現するヒトリンパ芽球様細胞株ＳＢ、およびこの抗原を欠くＨ
ＳＢリンパ芽球様細胞株を用いる、間接免疫蛍光により証明された。抗体サンプ
ルＣ２Ｂ８−２５ｔは、ＳＢ細胞の陽性染色を与えたが（図１４Ａ）、同一の実
験条件下でＨＳＢ細胞の陽性染色は与えなかった（図１４Ｂを参照のこと）。Ｓ
Ｂ細胞からなるさらなる陰性コントロールを、Ｃ２Ｂ８−２５ｔ抗体の代わりに
ＰＢＳ緩衝液とともにインキュベートした。それは、染色が全くないことを示し
た。

【０１０９】Ｃ２Ｂ８サンプルのインビトロＡＤＣＣ活性。ＧｎｔＩＩＩ発現を有さないＣ
ＨＯ−ｔＴＡ−Ｃ２Ｂ８細胞（前述を参照のこと）中で発現した抗体サンプルＣ
２Ｂ８−ｎｔは、ヒトリンパ球によるＳＢ細胞（ＣＤ２０＋）のインビトロ溶解
で測定したとき、（１μｇ／ｍｌの抗体濃度で）３１％の細胞傷害性活性を示し
た（図１５、サンプルＣ２Ｂ８−ｎｔ）。２０００ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンで増殖したＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ培養物（すなわち、クローン化した
ＧｎＴＩＩＩ発現の基底レベル）由来のＣ２Ｂ８−２０００ｔ抗体は、同じ抗体
濃度におけるＣ２Ｂ８−ｎｔサンプルに関してＡＤＣＣ活性において、１μｇ／
ｍｌの抗体濃度で３３％の増加を示した。テトラサイクリンの濃度を２５ｎｇ／
ｍｌまで低減させると（サンプルＣ２Ｂ８−２５ｔ）、これはＧｎＴＩＩＩ発現
を有意に増大させ、同じ抗体濃度におけるＣ２Ｂ８−ｎｔ抗体サンプルに関して
最大ＡＤＣＣ活性において（１μｇ／ｍｌの抗体濃度で）ほぼ８０％の大きな増
加を生じた（図１５、サンプルＣ２Ｂ８−２５ｔ）。

【０１１０】最も高いＡＤＣＣ活性を示すことに加えて、Ｃ２Ｂ８−２５ｔは、非常に低抗
体濃度で、有意なレベルの細胞傷害性を示した。０．０６μｇ／ｍｌにおけるＣ
２Ｂ８−２５ｔサンプルは、１μｇ／ｍｌにおけるＣ２Ｂ８−ｎｔの最大ＡＤＣ
Ｃ活性に類似のＡＤＣＣ活性を示した。この結果は、サンプルＣ２Ｂ８−２５ｔ
が、Ｃ２Ｂ８−ｎｔより１６倍低い抗体濃度で、Ｃ２Ｂ８−ｎｔと同じＡＤＣＣ
活性に到達したことを示した。この結果は、ＧｎＴＩＩＩを活性に発現する細胞
株で生産されたキメラ抗ＣＤ２０抗体Ｃ２Ｂ８が、ＧｎＴＩＩＩを発現しなかっ
た細胞株で生産された同じ抗体より有意に活性であったことを示す。

【０１１１】本発明の方法を用いるこの抗体の１つの利点は、（１）同じ治療効果に到達す
るために注入されなけばならない抗体のより低い用量が、抗体産生の経済学で有
利なインパクトを有すること、または（２）同じ用量の抗体を用いてより良い治
療効果が得られることである。

【０１１２】（Ｅ．実施例５：最大ＡＤＣＣ活性に至る最適レベルでグリコシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子の構成的発現を有するＣＨＯ細胞株の確立）ＡＤＣＣを増大するための方法のいくつかの適用では、それ自体で、または他
のクローン化されたグリコシルトランスフェラーゼおよび／またはグリコシダー
ゼとともに、ＧｎＴＩＩＩの調節された発現よりも構成的発現を用いることが所
望され得る。しかし、本発明者らは、改変された抗体のＡＤＣＣ活性が、ＧｎＴ
ＩＩＩの発現レベルに依存することを証明した。前述を参照のこと。従って、Ｇ
ｎＴＩＩＩ単独の、またはその他のグリコシルトランスフェラーゼおよび／また
はグリコシダーゼ遺伝子とともに、最適レベルまたは最適レベル近傍でその構成
的発現を有するクローンを選択することが重要である。単独またはβ（１，４）
−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）のような他のグリコシルトラン
スフェラーゼとともにのいずれかで、ＧｎＴＩＩＩ発現の最適レベルは、グリコ
シルトランスフェラーゼの調節性発現を有する細胞株を用いて最初に決定される
。次いで、ＧｎＴＩＩＩおよび任意のその他のクローン化されたグリコシルトラ
ンスフェラーゼの構成的発現を有する安定クローンを、最適近傍の発現レベルに
ついてスクリーニングする。

【０１１３】（１．調節されたＧｎＴＩＩＩのためのベクターの最適近傍発現レベル構成の
決定）ＧＦＰ発現に連鎖する発現。各グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ＩＲ
ＥＳ配列を経由して、細胞中に保持されるタンパク質、例えば、グリーン蛍光タ
ンパク質（ＧＦＰ）または利用可能な抗体により認識され得るペプチドでタグ化
される原形質膜タンパク質をコードするレポーター遺伝子に連結される。１つよ
り多くのグリコシルトランスフェラーゼが試験されている場合、種々のマーカー
が各々のグリコシルトランスフェラーゼと連結される。例えば、ＧｎＴＩＩＩが
ＧＦＰに連結され得、そしてＧａｌＴがブルー蛍光タンパク質（ＢＦＰ）に連結
され得る。ＧＦＰｃＤＮＡの上流のＩＲＥＳエレメントの上流のＧｎＴＩＩＩ
ｃＤＮＡからなる真核生物発現カセットは、まず、標準的なサブクローニング
および／またはＰＣＲ工程によりアセンブルされる。次いでこのカセットを、テ
トラサイクリン調節発現ベクターｐＵＨＤ１０−３（前述を参照のこと）中、ｔ
ｅｔ−プロモーターの下流でかつ終止配列およびポリアデニル化配列の上流にサ
ブクローン化し、ベクターｐＵＨＤ１０−３−ＧｎＴＩＩＩ−ＧＦＰを得る。

【０１１４】ＧＦＰ発現に連鎖した調節されたＧｎＴＩＩＩ発現を持つＣＨＯ細胞の確立、
および構成的ｃｈＣＥ７抗体発現。テトラサイクリン応答性トランスアクチベー
ターを発現するＣＨＯ−ｔＴＡ細胞（前述を参照のこと）を、ベクターｐＵＨＤ
１０−３−ＧｎＴＩＩＩ−ＧＦＰおよびピューロマイシン耐性遺伝子の発現のた
めのベクターｐＰｕｒで同時トランスフェクトする。前述を参照のこと。ピュー
ロマイシン耐性クローンを、テトラサイクリンの存在下で選択する。個々のクロ
ーンを、テトラサイクリンの存在下（２μｇ／ｍｌ）または非存在下で２連で培
養する。グリコシルトランスフェラーゼ過剰発現に起因して（前述を参照のこと
）、テトラサイクリンの非存在下で増殖の阻害を示す６つのクローンを選択し、
そしてＧＦＰ関連シグナルの検出のために、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡ
ＣＳ）により分析する。最高の誘導比（テトラサイクリンの存在下の蛍光に対す
るテトラサイクリンの非存在下の蛍光の比として規定される）を与えるクローン
を、さらなる作業のために選択し、そしてＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ−ＧＦ
Ｐと称する。ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ−ＧＦＰを、抗体ｃｈＣＥ７につい
ての発現ベクターでトランスフェクトし、そしてこの抗体の高い構成的発現を有
するクローンは、選択されたＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ−ＧＦＰ−ｃｈＣＥ
７である。前述を参照のこと。

【０１１５】ｃｈＣＥ７サンプルの生産、ＡＤＣＣ活性の測定および最適ＧｎＴＩＩＩ発現
レベルの決定。ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ−ＧＦＰ−ｃｈＣＥ７の平行培養
物を、種々のレベルのテトラサイクリン、そしてそれ故、ＧＦＰとともにＧｎＴ
ＩＩＩを種々のレベルで発現して増殖させる。ｃｈＣＥ７抗体サンプルを、アフ
ィニティークロマトグラフィーにより培養上清から精製する。平行して、各培養
物からの細胞をＦＡＣＳにより分析して、各培養物の、ＧｎＴＩＩＩの発現レベ
ルに相関する、ＧＦＰ関連蛍光の平均レベルを決定する。各ｃｈＣＥ７抗体サン
プルのインビトロＡＤＣＣ活性を決定し（前述を参照のこと）、そして各サンプ
ルの最大インビトロＡＤＣＣ活性を、それを生成するために用いた細胞の平均蛍
光に対してプロットする。

【０１１６】（２．最適近傍レベルで構成的ＧｎＴＩＩＩ発現を持つＣＨＯ細胞株の確立）ＧｎＴＩＩＩ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰカセット（前述を参照のこと）を、構成的発
現ベクター中にサブクローン化する。ＣＨＯ細胞を、このベクターおよびピュー
ロマイシン耐性のためのベクターで安定に同時トランスフェクトする。ピューロ
マイシン耐性細胞を選択する。次いで、この安定にトランスフェクトされた細胞
の集団を、ＦＡＣＳによりソートし、そして最適または最適近傍のＡＤＣＣ活性
が達成される範囲内近傍のレポーターＧＦＰ遺伝子レベルを発現するクローンを
選択する。前述を参照のこと。この最終のトランスフェクション工程は、すでに
治療抗体を安定に発現するＣＨＯ細胞、または空のＣＨＯ細胞（例えば、ＤＵＫ
ＸまたはＤＧ４４ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞）のいずれかに対してなされ得る。後
者の場合には、上記の手順から得られたクローンは、最終の抗体産生細胞株を作
製するために、治療抗体発現ベクターでトランスフェクトされる。

【０１１７】（Ｆ．実施例６：最適化されたグリコシル化を有するヒトＩｇＧＦｃキメラ
の細胞表面発現）現在、カプセル化細胞治療が多くの疾患に対して試験されている。カプセル化
細胞インプラントを、身体内に外科的に配置されるように設計し、所望の治療物
質をそれが必要である場所に直接送達する。しかし、移植されたカプセル化デバ
イスが、一旦機械的破壊を有する場合、細胞は、逃れそして所望でなくなり得る
。身体内で、逃れた、所望でない細胞を破壊する１つの方法は、Ｆｃ媒介細胞傷
害性メカニズムを経由することである。この目的のために、カプセル化されるべ
き細胞を先に操作して、Ｆｃ領域のＮ末端に融合した原形質膜に局在化するＩＩ
型膜貫通ドメインからなる原形質膜係留融合タンパク質を発現し得る。Ｓｔａｂ
ｉｌａ、Ｐ．Ｆ．、１９９８、前述。カプセル内側の細胞は、Ｆｃ媒介細胞傷害
性に対してカプセルによって保護され、その一方、逃れた細胞は、表面に提示さ
れたＦｃ領域を認識するリンパ球による破壊、すなわち、Ｆｃ媒介細胞傷害性メ
カニズムによる破壊に接近可能である。この実施例は、このＦｃ媒介細胞傷害性
活性が、提示されたＦｃ領域のグリコシル化操作によってどのように増大するか
を説明する。

【０１１８】（１．Ｆｃキメラをその表面上に発現し、およびＧｎＴＩＩＩを発現する細胞
の確立）特定の治療のために移植されるべき細胞、例えば、表面に提示されたＦｃキメ
ラおよび分泌性治療タンパク質を既に生産する、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ
）細胞を、まず、ＩＲＥＳエレメントを経由してＧＦＰの発現に連鎖したＧｎＴ
ＩＩＩの構成的発現のためのベクターで安定にトランスフェクトする。前述を参
照のこと。安定なトランスフェクタントを、ベクター中に取り込んだマーカーに
より、例えば、薬物耐性マーカーにより選択し、そしてその薬物の存在下の生存
について選択する。

【０１１９】（２．種々のレベルのＧｎＴＩＩＩを発現する細胞のスクリーニングおよび測
定）安定なトランスフェクタントを、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）に
より分析し、そして種々の平均蛍光レベルを有する一連のクローンを、さらなる
研究のために選択する。各選択されたクローンを増殖させ、そしてＦＡＣＳによ
り再分析し、ＧＦＰの安定性、そしてそれ故、関連したＧｎＴＩＩＩ発現を確実
にする。

【０１２０】（３．提示されたＦｃ領域上の複合型バイセクト型オリゴ糖の種々のレベルの
確認）種々のレベルのＧＦＰ関連蛍光を有する３つのクローンから、およびＧｎＴＩ
ＩＩ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターでトランスフェクトしていない元のＢＨＫ細胞
からのＦｃ領域を、界面活性剤により膜から可溶化し、次いでアフィニティクロ
マトグラフィーにより精製する。次いで、オリゴ糖を取り出し、精製し、そして
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより分析する。前述を参照のこと。得られるＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳプロフィールは、改変された、蛍光クローンのＦｃ領域が、
種々の比率の複合型バイセクト型オリゴ糖を保持することを示す。改変されてい
ない細胞からのＭＡＬＤＩプロフィールは、バイセクト型オリゴ糖にともなう任
意のピークを示さない。提示されたＦｃ領域上で最高レベルの複合型バイセクト
型オリゴ糖を保持するクローンを、さらなる作業のために選択する。

【０１２１】（４．インビトロのＦｃに媒介される細胞の細胞傷害性活性アッセイ）次いで、Ｆｃに媒介される細胞の細胞傷害性活性アッセイを２つ、平行して実
施する。１つのアッセイでは、標的細胞は、上記で選択されたクローンに由来す
る。平行するアッセイでは、標的細胞は、カプセル化され、そしてＧｎＴＩＩＩ
を発現するように改変されていない元の細胞である。このアッセイを、先に記載
された手順を用いるが（前述を参照のこと）、任意のさらなる抗体の非存在下で
実施する。なぜなら、標的細胞は、既にＦｃ領域を提示しているからである。こ
の実験は、ＧｎＴＩＩＩを発現する細胞に対するＦｃ媒介細胞傷害性活性が、こ
のグリコシルトランスフェラーゼを発現しない細胞に対するＦｃ媒介細胞傷害性
活性よりも高いことを示す。

【０１２２】本明細書の本体内で引用されるすべての参考文献は、その全体が参考として本
明細書に援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、典型的なＦｃ関連オリゴ糖構造の代表を記載する。

【図２】図２は、２つの異なるｔＴＡ生成ＣＨＯクローンにおけるＧｎＴＩＩＩのテ
トラサイクリン調節性発現のウェスタンブロット分析を示す。ＣＨＯｔ２細胞（
レーンＡおよびＢ）およびＣＨＯｔ１７細胞（レーンＣおよびＤ）は、ｐＵＤＨ
１０−３ＧｎＴＩＩＩｍ発現ベクターでトランスフェクトされ、そしてテトラサ
イクリンの非存在下（レーンＡおよびＣ）または４００ｎｇ／ｍｌの濃度の存在
下（レーンＢおよびＤ）で３６時間培養した。次いで、細胞溶解物を、抗体（９
Ｅ１０）でプローブするウェスタンブロット分析のために調製した。この抗体は
、そのカルボキシ末端でＧｎＴＩＩＩに付加されたｃ−ｍｙｃタグを特異的に
認識する。

【図３】図３は、ｍｙｃタグ化ＧｎＴＩＩＩ発現が制御され得るテトラサイクリン濃
度の範囲の決定を示す。ＣＨＯｔ１７細胞を、ｐＵＤＨ１０−３−ＧｎＴＩＩＩ
ｍ発現ベクターでトランスフェクトし、次いで、示された濃度のテトラサイクリ
ンの存在下で４８時間培養した。これらの培養物の細胞溶解物のＧｎＴＩＩＩ
レベルは、ウェスタンブロット分析を使用して比較した。ＧｎＴＩＩＩを、９
Ｅ１０抗体を使用するｃ−ｍｙｃタグを介して検出した。

【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ＧｎＴＶ（図４Ａ）またはｍｙｃタグ化ＧｎＴＩＩＩ（
図４Ｂ）グリコシルトランスフェラーゼの安定な、テトラサイクリン調節性発現
についてのＣＨＯクローンのウェスタンブロット分析によるスクリーニングを示
す。ＣＨＯｔ１７細胞は、プロマイシン耐性（ｐＰＵＲ）の発現のためのベクタ
ーと、ｐＵＨＤ１０−３ＧｎＴＶ（図４Ａ）またはｐＵＤＨ１０−３ＧｎＴＩＩ
Ｉｍ（図４Ｂ）のいずれかとで同時トランスフェクトされ、そして安定なＣＨＯ
クローンを、テトラサイクリンの存在下（２μｇ／ｍｌ）で、プロマイシン（７
．５μｇ／ｍｌ）に対する耐性について選択した。各グリコシルトランスフェラ
ーゼについての８つのクローン（１〜８）を、テトラサイクリンの非存在下また
は存在下（＋）（２μｇ／ｍｌ）で４８時間培養し、そして抗ＧｎＴＶ抗体（
図４Ａ）または抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）抗体（図４Ｂ）のいずれかを用いてウ
ェスタンブロットによって分析した。

【図５】図５Ａおよび５Ｂは、レクチンブロット分析によるインビボでの異種ＧｎＴ
Ｖ（図５Ａ）およびＧｎＴＩＩＩ（図５Ｂ）のグリコシルトランスフェラーゼ
の活性の検証を示す。テトラサイクリン（２μｇ／ｍｌ）の非存在下または存在
下（＋）で培養した種々の安定なクローンからの細胞糖タンパク質（図４と同様
に番号付けした）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、膜にブロットし、そしてＬ−Ｐ
ＨＡレクチン（図５Ａ）およびＥ−ＰＨＡレクチン（図５Ｂ）のいずれかでプロ
ーブした。これらのレクチンは、それぞれ、ＧｎＴＶおよびＧｎＴＩＩＩに
よって触媒された反応のオリゴ糖生成物に対して、これらの反応物のオリゴ糖基
質に対するより、より高い親和性で結合する。分子量マーカー（ＭＷＭ）を、並
行して泳動した。図５Ａおよび５Ｂのレクチンブロットの比較によって、内因性
ＣＨＯ細胞糖タンパク質の中で、ＧｎＴＶ（図５Ａ）についてより、ＧｎＴ
ＩＩＩ（図５Ｂ）についてより広範囲の基質が示される。

【図６】図６Ａ〜６Ｄは、グリコシルトランスフェラーゼの過剰発現の際の細胞増殖の
阻害を示す、ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩｍ細胞を、５〜１０％コンフルエン
トで播種し、そしてテトラサイクリンの非存在下（図６Ａおよび６Ｂ）または存
在下（図６Ｃおよび６Ｄ）で培養した。培養物を播種して４５時間後（図６Ａお
よび６Ｃ）ならびに８５時間後（図６Ｂおよび６Ｄ）に写真を撮った。

【図７】図７は、ｃｈＣＥ７重鎖遺伝子の構築のためにＰＣＲで使用したオリゴヌクレ
オチドプライマーの配列を示す。正方向および逆方向プライマーは、それぞれ、
「．ｆｗｄ」および「．ｒｅｖ」を接尾辞としてつけることによって同定する。
テンプレートとして最初のＰＣＲ工程の産物を使用して、第２のＰＣＲ工程を行
うために必要な、異なるプライマー間の重複を示す。導入された制限部位、ＣＥ
７キメラゲノムＤＮＡにアニーリングする配列、および導入された合成リーダー
配列もまた示す。

【図８】図８は、ｃｈＣＥ７軽鎖遺伝子の構築のためにＰＣＲで使用したオリゴヌクレ
オチドプライマーの配列を示す。正方向プライマーおよび逆方向プライマーは、
それぞれ、「．ｆｗｄ」および「．ｒｅｖ」を接尾辞としてつけることによって
同定する。テンプレートとして最初のＰＣＲ工程の産物を使用して、第２のＰＣ
Ｒ工程を行うために必要な、異なるプライマー間の重複を示す。導入された制限
部位、ＣＥ７キメラゲノムＤＮＡにアニーリングする配列、および導入されたリ
ーダー配列もまた示す。

【図９Ａ】図９は、ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞（図９Ａ、５０μｇのＣＥ７−ＳＰ
２／０からのオリゴ糖）、または培地に添加したテトラサイクリンの濃度が異な
るため、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子を異なるレベルで発現するＣＨＯ−ｔｅｔＧｎＴ
ＩＩＩ−ｃｈＣＥ７細胞培養物のいずれかにより生成されたｃｈＣＥ７サンプル
からの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。テト
ラサイクリン濃度の大きさを低減する、すなわち、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子発現の
レベルを増加させることにおいて、後者のサンプルは、ＣＥ７−２０００ｔ（図
９Ｂ、３７．５μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−６０ｔ（図９Ｃ、３７．
５μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−３０ｔ（図９Ｄ、２５μｇの抗体から
のオリゴ糖）およびＣＥ７−１５ｔ（図９Ｅ、１０μｇの抗体からのオリゴ糖）
である。

【図９Ｂ】図９は、ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞（図９Ａ、５０μｇのＣＥ７−ＳＰ
２／０からのオリゴ糖）、または培地に添加したテトラサイクリンの濃度が異な
るため、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子を異なるレベルで発現するＣＨＯ−ｔｅｔＧｎＴＩ
ＩＩ−ｃｈＣＥ７細胞培養物のいずれかにより生成されたｃｈＣＥ７サンプルか
らの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。テトラ
サイクリン濃度の大きさを低減する、すなわち、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子発現のレ
ベルを増加させることにおいて、後者のサンプルは、ＣＥ７−２０００ｔ（図９
Ｂ、３７．５μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−６０ｔ（図９Ｃ、３７．５
μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−３０ｔ（図９Ｄ、２５μｇの抗体からの
オリゴ糖）およびＣＥ７−１５ｔ（図９Ｅ、１０μｇの抗体からのオリゴ糖）で
ある。

【図９Ｃ】図９は、ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞（図９Ａ、５０μｇのＣＥ７−ＳＰ
２／０からのオリゴ糖）、または培地に添加したテトラサイクリンの濃度が異な
るため、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子を異なるレベルで発現するＣＨＯ−ｔｅｔＧｎＴＩ
ＩＩ−ｃｈＣＥ７細胞培養物のいずれかにより生成されたｃｈＣＥ７サンプルか
らの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。テトラ
サイクリン濃度の大きさを低減する、すなわち、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子発現のレ
ベルを増加させることにおいて、後者のサンプルは、ＣＥ７−２０００ｔ（図９
Ｂ、３７．５μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−６０ｔ（図９Ｃ、３７．５
μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−３０ｔ（図９Ｄ、２５μｇの抗体からの
オリゴ糖）およびＣＥ７−１５ｔ（図９Ｅ、１０μｇの抗体からのオリゴ糖）で
ある。

【図９Ｄ】図９は、ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞（図９Ａ、５０μｇのＣＥ７−ＳＰ
２／０からのオリゴ糖）、または培地に添加したテトラサイクリンの濃度が異な
るため、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子を異なるレベルで発現するＣＨＯ−ｔｅｔＧｎＴＩ
ＩＩ−ｃｈＣＥ７細胞培養物のいずれかにより生成されたｃｈＣＥ７サンプルか
らの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。テトラ
サイクリン濃度の大きさを低減する、すなわち、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子発現のレ
ベルを増加させることにおいて、後者のサンプルは、ＣＥ７−２０００ｔ（図９
Ｂ、３７．５μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−６０ｔ（図９Ｃ、３７．５
μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−３０ｔ（図９Ｄ、２５μｇの抗体からの
オリゴ糖）およびＣＥ７−１５ｔ（図９Ｅ、１０μｇの抗体からのオリゴ糖）で
ある。

【図９Ｅ】図９は、ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞（図９Ａ、５０μｇのＣＥ７−ＳＰ
２／０からのオリゴ糖）、または培地に添加したテトラサイクリンの濃度が異な
るため、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子を異なるレベルで発現するＣＨＯ−ｔｅｔＧｎＴＩ
ＩＩ−ｃｈＣＥ７細胞培養物のいずれかにより生成されたｃｈＣＥ７サンプルか
らの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。テトラ
サイクリン濃度の大きさを低減する、すなわち、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子発現のレ
ベルを増加させることにおいて、後者のサンプルは、ＣＥ７−２０００ｔ（図９
Ｂ、３７．５μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−６０ｔ（図９Ｃ、３７．５
μｇの抗体からのオリゴ糖）、ＣＥ７−３０ｔ（図９Ｄ、２５μｇの抗体からの
オリゴ糖）およびＣＥ７−１５ｔ（図９Ｅ、１０μｇの抗体からのオリゴ糖）で
ある。

【図１０】図１０は、ＧｎＴＩＩＩ触媒された反応を介する、複合型バイセクト型オリ
ゴ糖を導く、Ｎ結合型オリゴ糖生合成経路を記載する。Ｍはマンノース；Ｇｎは
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；Ｇはガラクトース；Ｇｎ^bはバイ
セクティングＧｌｃＮＡｃ；ｆはフコースを示す。オリゴ糖命名法は、コアオリ
ゴ糖に結合されたＭ、ＧｎおよびＧ残基を数えること、およびＧｎ^bを含めるこ
とによってバイセクティングＧｌｃＮＡｃの存在を示すことからなる。オリゴ糖
コアは、それ自体が２つのＧｎ残基から構成され、そしてフコースを含んでも、
含まなくてもよい。オリゴ糖の主要なクラスは、破線で囲んだ枠の中に示す。Ｍ
ａｎＩはゴルジマンノシダーゼ；ＧｎＴはＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ；
およびＧａｌＴはガラクトシルトランスフェラーゼを表す。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ
−ＭＳ分析で観察される、主要なナトリウムと会合したオリゴ糖イオンに関連す
る質量は、各オリゴ糖の隣に示す。潜在的にコアがフコシル化され得るオリゴ糖
については、フコシル化形態（＋ｆ）および非フコシル化形態（−ｆ）の両方に
関連する質量を示す。

【図１１】図１１は、ＧｎＴＩＩＩ触媒反応を介して、複合型バイセクト型オリゴ糖お
よび混成型バイセクト型オリゴ糖を導くＮ結合型オリゴ糖生合成経路を示す。Ｍ
はマンノース；ＧｎはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；Ｇはガラク
トース；Ｇｎ^bはバイセクティングＧｌｃＮＡｃ；ｆはフコースを示す。オリゴ
糖命名法は、共通のオリゴ糖に結合されたＭ、ＧｎおよびＧ残基を数えること、
およびＧｎ^bを含めることによってバイセクティングＧｌｃＮＡｃの存在を示す
ことからなる。オリゴ糖コアは、それ自体が２つのＧｎ残基から構成され、そし
てフコースを含んでも、含まなくてもよい。オリゴ糖の主要なクラスは、破線で
囲んだ枠の中に示す。ＭａｎＩはゴルジマンノシダーゼ；ＧｎＴはＧｌｃＮＡ
ｃトランスフェラーゼ；およびＧａｌＴはガラクトシルトランスフェラーゼを表
す。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析で観察される、主要なナトリウムと会合した
オリゴ糖イオンと関連する質量は、各オリゴ糖の隣に示す。潜在的にコアがフコ
シル化され得るオリゴ糖については、フコシル化形態（＋ｆ）および非フコシル
化形態（−ｆ）の両方に関連する質量を示す。

【図１２】図１２は、異なるｃｈＣＥ７サンプルのＡＤＣＣ活性を示す。ヒトリンパ節に
よるＩＭＲ−３２神経芽腫細胞の溶解（標的：エフェクター比は１：１９、３７
℃で１６時間のインキュベーション）を、ｃｈＣＥ７サンプルの異なる濃度で媒
介し、蛍光色素の保持によって測定した。細胞傷害性の割合は、抗体の非存在下
でのシグナルを差し引いた後に、総溶解コントロール（界面活性剤による）に対
して算出した。

【図１３】図１３は、異なるテトラサイクリン濃度で増殖させた、ＣＨＯ−ｔｅｔ−Ｇｎ
ＴＩＩＩの異なる培養物のＧｎＴＩＩＩ発現を使用して、異なるＣ２Ｂ８抗
体サンプルを生成したことを記載する。２０００ｎｇ／ｍｌ（レーンＣ）および
２５ｎｇ／ｍｌ（レーンＤ）のテトラサイクリン濃度で増殖させた各培養物から
の細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、メンブラン上にブロットし、そして
１次抗体および２次抗体として、それぞれ、９Ｅ１０（前出を参照のこと）およ
び抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼを用いてプローブした。レーンＡは、陰
性コントロールを示す。

【図１４】図１４は、懸濁物中での細胞を用いた間接免疫蛍光アッセイを使用するＣ２Ｂ
８抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の抗原結合の特異性を示す。ＣＤ２０陽性細胞
（ＳＢ細胞；ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣＣＣＬ１２０）およびＣＤ２０陰性細
胞（ＨＳＢ細胞；ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣＣＣＬ１２０．１）（それぞれ、
図１４Ａおよび１４Ｂ）を使用した。各型の細胞を、１次抗体として２５ｎｇ／
ｍｌテトラサイクリンで生成したＣ２Ｂ８抗体とともにインキュベートした。陰
性コントロールは、１次抗体の代わりに、ＨＢＳＳＢを含めた。抗ヒトＩｇＧ
Ｆｃ特異的ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗体を２次抗体として全てのサンプ
ルで使用した。

【図１５】図１５は、異なる抗体濃度（０．０４〜５μｇ／ｍｌ）での異なるＣ２Ｂ８抗
体サンプルのＡＤＣＣ活性を示す。サンプルＣ２Ｂ８−ｎｔは、ＧｎＴＩＩＩ
発現なしの細胞株で生成されたＣ２Ｂ８抗体のＡＤＣＣ活性を表す。サンプルＣ
２Ｂ８−２０００ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔおよびＣ２Ｂ８−２５ｔは、漸減テトラ
サイクリン濃度（すなわち、漸増ＧｎＴＩＩＩ発現）で生成した３つの抗体サ
ンプルのＡＤＣＣ活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０４５ 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジーン−マイレット，ジョエルスイス国シーエイチ−8057 チューリッヒ，バーチシュトラーセ 59 (72)発明者バイレイ，ジェイムズイー．スイス国シーエイチ−8001 チューリッヒ，ウィンケルウィーズ６Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA41 CA04 CA07 DA02 EA04 FA02 FA18 GA11 HA01 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA03 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA25 CA44 4C057 MM04 MM09 4C085 AA14 CC03 DD62 EE03 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】調節されたレベルにおいて糖タンパク質改変グリコシルトラ
ンスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸を発現するために操作された
、宿主細胞。
【請求項２】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードす
る少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子が、前記宿主細胞に導入されている、
請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼが
活性化されるように、前記宿主細胞が操作されている、請求項１に記載の宿主細
胞。
【請求項４】前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓ
Ｐ２／０細胞、またはハイブリドーマ細胞である、請求項２または３に記載の宿
主細胞。
【請求項５】前記内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラー
ゼが、調節性プロモーターエレメントを前記宿主細胞染色体へ挿入することによ
って活性化されている、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項６】前記糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼが、Ｇ
ｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＶ、ＭａｎＩＩ、またはＧａｌＴである、請求項２
または３に記載の宿主細胞。
【請求項７】前記宿主細胞が、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＶ、ＭａｎＩ
Ｉ、およびＧａｌＴからなる群から選択される少なくとも２つの異なる、糖タ
ンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼを発現するために操作された、請求
項２または３に記載の宿主細胞。
【請求項８】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードす
る少なくとも１つの遺伝子が、構成性プロモーターエレメントに作動可能に連結
されている、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードす
る少なくとも１つの遺伝子が、調節性プロモーターエレメントに作動可能に連結
されている、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項１０】前記調節性プロモーターエレメントが、テトラサイクリン
に調節性プロモーター系、エクジソン誘導性プロモーター系、ｌａｃスイッチプ
ロモーター系、グルココルチコイド誘導性プロモーター系、温度誘導性プロモー
ター系、またはメタロチオネイン金属誘導性プロモーター系である、請求項５ま
たは９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコード
する少なくとも１つの核酸分子を発現するために操作された宿主細胞であって、
ここで該宿主細胞が、増強したＦｃ媒介細胞傷害性を有するタンパク質を産生し
得る、宿主細胞。
【請求項１２】前記タンパク質が、抗体分子全体、抗体フラグメント、ま
たは免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を含む融合タンパク質である、請求
項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコード
する少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子が、前記宿主細胞染色体へ導入され
ている、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】前記宿主細胞が、内因性の糖タンパク質改変グリコシルト
ランスフェラーゼの変異誘発発現を保有するために選択されている、請求項１２
に記載の宿主細胞。
【請求項１５】前記宿主細胞が、変異ｌｅｃ１０である、請求項１４に記
載の宿主細胞。
【請求項１６】内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ
が活性化されるように、前記宿主細胞が操作されている、請求項１２に記載の宿
主細胞。
【請求項１７】前記内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラ
ーゼが、調節性プロモーターエレメントを前記宿主細胞染色体へ挿入することに
よって活性化されている、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】前記内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラ
ーゼが、構成性プロモーターエレメント、トランスポゾン、またはレトロウイル
スエレメントを前記宿主細胞染色体へ挿入することによって活性化されている、
請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１９】抗体分子、抗体フラグメント、または免疫グロブリンのＦ
ｃ領域に等価な領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つのトラン
スフェクトされた核酸をさらに含む、請求項１１または１３に記載の宿主細胞。
【請求項２０】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコード
する少なくとも１つの遺伝子が、構成性プロモーターエレメントに作動可能に連
結される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項２１】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコード
する少なくとも１つの遺伝子が、調節性プロモーターエレメントに作動可能に連
結される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項２２】前記調節性プロモーターエレメントが、テトラサイクリン
に調節性プロモーター系、エクジソン誘導性プロモーター系、ｌａｃスイッチプ
ロモーター系、グルココルチコイド誘導性プロモーター系、温度誘導性プロモー
ター系、またはメタロチオネイン金属誘導性プロモーター系である、請求項２１
に記載の宿主細胞。
【請求項２３】前記宿主細胞がハイブリドーマ細胞である、請求項１１に
記載の宿主細胞。
【請求項２４】前記操作された宿主細胞が、操作されたＣＨＯ細胞、操作
されたＢＨＫ細胞、操作されたＮＳ０細胞、または操作されたＳＰ２／０細胞で
ある、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項２５】前記宿主細胞が、キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（
Ｃ２Ｂ８）をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を含む、
請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項２６】前記宿主細胞が、キメラ抗ヒト神経芽腫モノクローナル抗
体（ｃｈＣＥ７）をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を
含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項２７】前記宿主細胞が、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗
体（ｃｈ−Ｇ２５０）、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、キメラ抗ヒト結
腸癌、肺癌、および乳癌モノクローナル抗体（ＩＮＧ−１）、ヒト化抗ヒト１７
−１Ａ抗原モノクローナル抗体（３６２２Ｗ９４）、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍
抗体（Ａ３３）、ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体（Ｒ２４）、
またはキメラ抗ヒト扁平上皮癌モノクローナル抗体（ＳＦ−２５）をコードする
少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を含む、請求項１１に記載の宿主
細胞。
【請求項２８】少なくとも１つの核酸分子が、β（１，４）−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする、
請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項２９】 β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ
Ｔ）をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含む、請求項２８に記載の宿主
細胞。
【請求項３０】マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）をコードする少なく
とも１つの核酸をさらに含む、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３１】 β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ
Ｔ）をコードする少なくとも１つの核酸およびマンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩ
Ｉ）をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含む、請求項２８に記載の宿主
細胞。
【請求項３２】宿主細胞において、増強したＦｃ媒介細胞傷害性を有する
タンパク質化合物を産生するための方法であって、以下の工程：（ａ）調節されたレベルにおいて、目的のタンパク質化合物のグリコシル化を
改善するように選択された、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼを
発現するために操作された宿主細胞を提供する工程であって、ここで、該宿主細
胞が、抗体、抗体フラグメント、または免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域
を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を発現する、工程；（ｂ）増強したＦｃ媒介性依存性細胞傷害性を有する該タンパク質化合物の産
生を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する工程；および（ｃ）増強したＦｃ媒介細胞傷害性を有する該タンパク質化合物を単離する工
程、を包含する、方法。
【請求項３３】工程（ａ）において、前記宿主細胞が、抗体全体をコード
する少なくとも１つの核酸を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】工程（ａ）において、前記宿主細胞が、抗体フラグメント
をコードする少なくとも１つの核酸を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】工程（ａ）において、前記宿主細胞が、免疫グロブリンの
グルコシル化Ｆｃ領域に類似の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくと
も１つの核酸を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】前記宿主細胞が、キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（
Ｃ２Ｂ８）をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を含む、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】前記宿主細胞が、キメラ抗ヒト神経芽腫モノクローナル抗
体（ｃｈＣＥ７）をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を
含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】前記宿主細胞が、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗
体（ｃｈ−Ｇ２５０）、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、キメラ抗ヒト結
腸癌、肺癌、および乳癌モノクローナル抗体（ＩＮＧ−１）、ヒト化抗ヒト１７
−１Ａ抗原モノクローナル抗体（３６２２Ｗ９４）、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍
抗体（Ａ３３）、ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体（Ｒ２４）、
またはキメラ抗ヒト扁平上皮癌モノクローナル抗体（ＳＦ−２５）をコードする
少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を含む、請求項３２に記載の方法
。
【請求項３９】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコード
する少なくとも１つの遺伝子が、前記宿主細胞に導入されている、請求項３２に
記載の方法。
【請求項４０】前記宿主細胞が、内因性の糖タンパク質改変グリコシルト
ランスフェラーゼの変異誘発発現を保有するために選択されている、請求項３２
に記載の宿主細胞。
【請求項４１】前記宿主細胞が、変異ｌｅｃ１０である、請求項４０に記
載の宿主細胞。
【請求項４２】内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ
が活性化されるように、前記宿主細胞が操作されている、請求項３２に記載の宿
主細胞。
【請求項４３】前記グリコシルトランスフェラーゼが、β（１，４）−Ｎ
−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）である
、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】前記ＧｎＴＩＩＩが、構成性プロモーター系を使用して
発現される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】前記ＧｎＴＩＩＩが、調節性プロモーター系を使用して
発現される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】前記調節性プロモーター系が、テトラサイクリンに調節性
プロモーター系、エクジソン誘導性プロモーター系、ｌａｃスイッチプロモータ
ー系、グルココルチコイド誘導性プロモーター系、温度誘導性プロモーター系、
またはメタロチオネイン金属誘導性プロモーター系である、請求項４５に記載の
方法。
【請求項４７】前記グリコシルトランスフェラーゼが、β（１，４）−ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４８】前記ＧａｌＴが、構成性プロモーター系を使用して発現さ
れる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】前記ＧａｌＴが、調節性プロモーター系を使用して発現さ
れる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】前記調節性プロモーター系が、テトラサイクリンに調節性
プロモーター系、エクジソン誘導性プロモーター系、ｌａｃスイッチプロモータ
ー系、グルココルチコイド誘導性プロモーター系、温度誘導性プロモーター系、
またはメタロチオネイン金属誘導性プロモーター系である、請求項４９に記載の
方法。
【請求項５１】前記宿主細胞が、調節されたレベルにおいて、目的のタン
パク質化合物のグリコシル化を改善するように選択された、グリコシルトランス
フェラーゼをコードする複数の核酸を発現するために操作され、ここで、少なく
とも１つの核酸がＧｎＴＩＩＩをコードし、そして少なくとも１つの核酸がβ
（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）をコードする、請求
項３２に記載の方法。
【請求項５２】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコード
する少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子が、前記宿主細胞に導入されている
、請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５３】前記宿主細胞が、少なくとも１つの、内因性の糖タンパク
質改変グリコシルトランスフェラーゼの変異誘発発現を保有するために選択され
ている、請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５４】内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ
が活性化されるように、前記宿主細胞が操作されている、請求項５１、５２、ま
たは５３に記載の宿主細胞。
【請求項５５】前記宿主細胞が、調節されたレベルにおいて、目的のタン
パク質化合物のグリコシル化を改善するように選択された、糖タンパク質改変グ
リコシルトランスフェラーゼをコードする複数の核酸を含み、ここで、少なくと
も１つの核酸がＧｎＴＩＩＩをコードし、そして少なくとも１つの核酸がマン
ノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）をコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項５６】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコード
する少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子が、前記宿主細胞に導入されている
、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５７】前記宿主細胞が、少なくとも１つの、内因性の糖タンパク
質改変グリコシルトランスフェラーゼの変異誘発発現を保有するために選択され
ている、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５８】内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ
が活性化されるように、前記宿主細胞が操作されている、請求項５５、５６、ま
たは５７に記載の宿主細胞。
【請求項５９】前記宿主細胞が、調節されたレベルにおいて、目的のタン
パク質のグリコシル化を改善するように選択された、糖タンパク質改変グリコシ
ルトランスフェラーゼをコードする複数の核酸を含み、ここで、少なくとも１つ
の核酸がＧｎＴＩＩＩをコードし、少なくとも１つの核酸がβ（１，４）−ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）をコードし、そして少なくとも１つ
の核酸がマンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）をコードする、請求項３２に記載
の方法。
【請求項６０】糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコード
する少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子が、前記宿主細胞に導入されている
、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】前記宿主細胞が、少なくとも１つの、内因性の糖タンパク
質改変グリコシルトランスフェラーゼの変異誘発発現を保有するために選択され
ている、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６２】内因性の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ
が活性化されるように、前記宿主細胞が操作されている、請求項５９、６０、ま
たは６１に記載の宿主細胞。
【請求項６３】少なくとも１つの糖タンパク質改変グリコシルトランスフ
ェラーゼの発現レベルが、抗体分子、抗体フラグメント、または免疫グロブリン
のＦｃ領域に等価な領域を含む融合タンパク質を産生するように選択され、該糖
タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼが、異なる発現レベルの同一のグ
リコシルトランスフェラーゼ遺伝子から得られるＦｃ媒介細胞傷害性よりも、よ
り高いレベルにおいて増強したＦｃ媒介細胞傷害性を有する、請求項３２に記載
の方法。
【請求項６４】前記発現レベルが、グリコシルトランスフェラーゼ特異的
抗体を使用するウエスタンブロット分析によって決定される、請求項６３に記載
の方法。
【請求項６５】前記発現レベルが、グリコシルトランスフェラーゼ特異的
プローブを使用するノーザンブロット分析によって決定される、請求項６３に記
載の方法。
【請求項６６】前記発現レベルが、グリコシルトランスフェラーゼの酵素
活性を測定することによって決定される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】前記発現レベルが、糖タンパク質改変グリコシルトランス
フェラーゼの生合成産物に結合するレクチンを使用して決定される、請求項６３
に記載の方法。
【請求項６８】前記レクチンがＥ₄−ＰＨＡレクチンである、請求項６７
に記載の方法。
【請求項６９】前記糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコ
ードする前記核酸が、レポーター遺伝子に作動可能に連結され、そしてここで、
該グリコシルトランスフェラーゼの前記発現レベルが、該レポーター遺伝子の発
現レベルと相関するシグナルを測定することによって決定される、請求項６３に
記載の方法。
【請求項７０】前記レポーター遺伝子が、単一のＲＮＡ分子として、前記
糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの
核酸とともに転写され、そしてそれらの各コード配列が、内部リボソーム侵入部
位（ＩＲＥＳ）またはキャップ独立性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれか
によって連結される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】単一のポリペプチド鎖が形成されるように、前記レポータ
ー遺伝子が、前記糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコードする
少なくとも１つの核酸とともに翻訳される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】前記糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコ
ードする前記核酸が、単一のプロモーターの制御下でレポーター遺伝子に作動可
能に連結され、ここで該糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼをコー
ドする該核酸および該レポーター遺伝子が、２つの別個のメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）分子に選択的スプライスされるＲＮＡ分子へ転写され、ここで得ら
れたｍＲＮＡの一方が該レポータータンパク質に翻訳され、そして他方が該糖タ
ンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼに翻訳される、請求項６３に記載の
方法。
【請求項７３】前記宿主細胞が、グリコシダーゼをコードする核酸をさら
に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項７４】請求項１１に記載の宿主細胞によって産生された、増強し
た抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、抗体。
【請求項７５】請求項２５に記載の宿主細胞によって産生された、増強し
た抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、キメラ抗ＣＤ２０モノクローナ
ル抗体（Ｃ２Ｄ８）。
【請求項７６】請求項２６に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、キメラ抗ヒト神経芽腫モノク
ローナル抗体（ｃｈＣＥ７）。
【請求項７７】請求項２７に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノク
ローナル抗体（ｃｈ−Ｇ２５０）。
【請求項７８】請求項２７に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクロー
ナル抗体。
【請求項７９】請求項２７に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、キメラ抗ヒト結腸癌、肺癌、
および乳癌モノクローナル抗体（ＩＮＧ−１）。
【請求項８０】請求項２７に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、ヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原
モノクローナル抗体（３６２２Ｗ９４）。
【請求項８１】請求項２７に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、キメラ抗ヒト扁平上皮癌モノ
クローナル抗体（ＳＦ−２５）。
【請求項８２】請求項２７に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗
体（Ａ３３）。
【請求項８３】請求項２７に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する、ＧＤ３ガングリオシドに対す
る抗ヒト黒色腫抗体（Ｒ２４）。
【請求項８４】請求項１１に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
したＦｃ媒介細胞傷害性を有する、免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を含
む、抗体フラグメント。
【請求項８５】請求項１１に記載の宿主細胞を使用して産生された、増強
したＦｃ媒介細胞傷害性を有する、免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を含
む、融合タンパク質。