CN102686610A - 抗刻缺蛋白-1抗体 - Google Patents

抗刻缺蛋白-1抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN102686610A
CN102686610A CN2010800367326A CN201080036732A CN102686610A CN 102686610 A CN102686610 A CN 102686610A CN 2010800367326 A CN2010800367326 A CN 2010800367326A CN 201080036732 A CN201080036732 A CN 201080036732A CN 102686610 A CN102686610 A CN 102686610A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
antigen
binding portion
albumen
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800367326A
Other languages
English (en)
Inventor
Z·霍斯托姆斯基
K·李
J·A·利平科特
Q·彭
D·M·斯通
P·韦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Rinat Neuroscience Corp
Original Assignee
Pfizer Inc
Rinat Neuroscience Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42575817&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102686610(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer Inc, Rinat Neuroscience Corp filed Critical Pfizer Inc
Publication of CN102686610A publication Critical patent/CN102686610A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明涉及特异性结合刻缺蛋白1的单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体结合至少第一表位和第二表位，其中所述第一表位位于刻缺蛋白1负调节区(NRR)的LinA结构域内，并且所述第二表位位于刻缺蛋白1NRR的HD-C结构域内。

Description

抗刻缺蛋白-1抗体
本申请要求享有2009年6月18日申请的美国临时专利申请号61/218,193的权益，其内容以其全文援引加入本文。
发明领域
本发明涉及拮抗刻缺蛋白(Notch)-1活性的抗体，产生这类抗体的方法，测定这类抗体的方法以及使用这类抗体治疗癌症的方法。
背景
刻缺蛋白是跨膜受体蛋白。哺乳动物中存在4种这类刻缺蛋白受体。在受体成熟期间，哺乳动物刻缺蛋白受体的胞外域被弗林蛋白酶类蛋白酶在S1位点切割，产生胞外亚单位和跨膜亚单位，它们被异二聚化(HD)结构域结合在一起。与胞外亚单位结合的HD结构域的部分被称作HD-N，而HD的其他部分(跨膜亚单位的胞外部分)被称作HD-C。胞外亚单位包含大表皮生长因子(EGF)样重复区域和3个Lin12重复。EGF重复区域的配体结合诱导ADAM型金属蛋白酶在HD-C结构域内S2位点的蛋白水解切割，这触发γ-分泌酶在位点S3的后续切割，从膜释放刻缺蛋白的胞内部分，允许它进入细胞核并调节基因转录。(Gordon，W.R.，et.al，Nature Structural& Molecular Biology，2007，volume 14，295-300)。
在配体诱导的活化之前，刻缺蛋白保持保守负调节区域(NRR)的静止金属蛋白酶-抗性构像，所述NRR由3个Lin12重复和HD结构域组成。(Vardaret al.，Biochemistry 2003，41：7061-7067；Sanchez-Irizarry et al.，Mol.Cell.Biol.2004，24：9265-9273；Gordon，W.R.，et.al，Nature Structural & MolecularBiology，2007，volume 14，295-300)。刻缺蛋白的NRR有时还被限定为只由Lin12重复以及在S1位点蛋白水解切割后的N端HD结构域(HD-N)组成。(Weng，A.P.，et.al，Science，2004，9265-9273.)NRR结构域阻止刻缺蛋白途径不依赖配体的蛋白水解。
刻缺蛋白途径在多种发育和生理过程(包括影响蝇类和脊椎动物中神经发生的那些过程)中起作用。通常，刻缺蛋白信号转导参与侧抑制，谱系决定，以及细胞群之间边界的建立。(Bray，S.J.，Nature Reviews，2006，678-688)。
但是，刻缺蛋白活性还与各种人类疾病(包括癌症)有关。例如，在超过50％的T细胞急性淋巴母细胞性白血病中检测到刻缺蛋白1的突变。(Radtke，F，Nature Review，Cancer，2003，756-767)。需要鉴定调节刻缺蛋白-1信号转导途径以用于治疗癌症的治疗剂。
概述
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合部分，其结合刻缺蛋白-1，其中所述抗体或抗原结合部分结合至少第一表位和第二表位，其中第一表位位于刻缺蛋白-1的Lin-A结构域内，第二表位位于刻缺蛋白-1的HD-C结构域内。优选刻缺蛋白-1是人刻缺蛋白-1。
在该实施方案的一个方面，第一表位是主要表位。优选地，第一表位任意氨基酸残基的非保守取代导致所述抗体或抗原结合部分与人刻缺蛋白1的结合亲和力损失超过60％，更优选超过80％，甚至更优选超过90％。
在另一个方面，第二表位是主要表位。优选地，第二表位任意氨基酸残基的非保守取代导致所述抗体或抗原结合部分与人刻缺蛋白-1的结合亲和力损失超过60％，更优选超过80％，甚至更优选超过90％。
在另一个方面，第一表位和第二表位都是主要表位。优选地，第一表位和第二表位的任意氨基酸残基的非保守取代导致所述抗体或抗原结合部分与人刻缺蛋白-1的结合亲和力损失超过60％，更优选超过80％，甚至更优选超过90％。
在该实施方案的另一个方面，刻缺蛋白-1是人刻缺蛋白-1。在该实施方案的另一个方面，刻缺蛋白-1是小鼠刻缺蛋白-1。
在该实施方案的另一个方面，所述抗体或抗原结合部分结合额外1-4个表位，其中所述额外表位的每一个均位于人刻缺蛋白-1的Lin-A结构域或HD-C结构域内。
在该实施方案的另一个方面，抗体或抗原结合部分结合的仅有主要表位是第一表位和第二表位。更具体地，第一表位是主要表位，包含选自人刻缺蛋白-1的LinA结构域的1463V，1465S，1466L和1467Q的1到4个氨基酸残基。优选地，第一表位是主要表位，由选自人刻缺蛋白-1的LinA结构域的1463V，1465S，1466L和1467Q的4个氨基酸残基组成。更具体地，第二表位是主要表位，包含选自人刻缺蛋白-1的HD-C结构域的1705G，1706A，1707L，1709S和1710L的1到5个氨基酸残基。优选地，第二表位是主要表位，由选自人刻缺蛋白-1的HD-C结构域的1705G，1706A，1707L，1709S和1710L的1到5个氨基酸残基组成。甚至更具体地，第一表位或第二表位的任意氨基酸残基的非保守取代导致所述抗体或抗原结合部分与人刻缺蛋白-1的结合亲和力损失超过70％，超过80％，超过90％或超过95％。
在该实施方案的另一个方面，抗体或抗原结合部分是人源化的，人的，或嵌合的。优选地，抗体或抗原结合部分是人源化抗体或其抗原结合部分。更优选地，抗体或抗原结合部分是人抗体或其抗原结合部分。
在该实施方案的另一个方面，抗体或抗原结合部分是小鼠抗体或其抗原结合部分。
在该实施方案的另一个方面，抗体或抗原结合部分以1×10-5M或更低的KD结合人刻缺蛋白-1。优选地，抗体或抗原结合部分以以下KD结合人刻缺蛋白-1：1×10-6M或更低，5×10-7M或更低，2×10-7M或更低，1×10-7M或更低，5×10-8M或更低，2×10-8M或更低，或1×10-8M或更低。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人刻缺蛋白-1，包含
(i)包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的重链可变区CDR1或其变体，所述变体中SEQ ID NO：18的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰；
(ii)包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的重链可变区CDR2或其变体，所述变体中SEQ ID NO：19的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰；和
(iii)具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的重链可变区CDR3或其变体，所述变体中SEQ ID NO：20的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰。
在该实施方案的一个方面，在重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的12个可能的氨基酸残基修饰中(如该实施方案中上文所述的)，任意修饰(除了所述修饰中的直至6个以外)是其氨基酸残基的保守取代。优选地，重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰，除了所述修饰中直至5个以外，是其氨基酸残基的保守取代。更优选地，重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰，除了所述修饰中直至4个以外，除了所述修饰中直至3个以外，除了所述修饰中直至2个以外，或除了1个修饰以外，是其氨基酸残基的保守取代。甚至更优选地，重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意氨基酸残基修饰均是其氨基酸残基的保守取代。
在该实施方案的另一个方面，重链可变区CDR1、CDR2和CDR3中没有一个被修饰。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合刻缺蛋白-1，包含
(i)包含SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1或其变体，所述变体中SEQ ID NO：12的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰；
(ii)包含SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2或其变体，所述变体中SEQ ID NO：13的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰；和
(iii)包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3或其变体，所述变体中SEQ ID NO：14的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰。
在该实施方案的一个方面，在轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的12个可能的氨基酸残基修饰中(如该实施方案中上文所述的)，任意修饰，除了所述修饰中的直至6个以外，是其氨基酸残基的保守取代。优选地，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰，除了所述修饰中的直至5个以外，是其氨基酸残基的保守取代。更优选地，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰，除了所述修饰中的直至4个以外，除了所述修饰中的直至3个以外，除了所述修饰中的直至2个以外，或除了1个修饰以外，是其氨基酸残基的保守取代。甚至更优选地，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰均是其氨基酸残基的保守取代。
在该实施方案的另一个方面，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3中没有一个被修饰。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合刻缺蛋白-1，包含：
(i)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR1或其变体，所述变体中SEQID NO：18的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰；
(ii)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR2或其变体，所述变体中SEQ ID NO：19的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰；
(iii)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3或其变体，所述变体中SEQ ID NO：20的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰；
(iv)包含SEQ ID NO：12的轻链可变区CDR1或其变体，所述变体中SEQ ID NO：12的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰；
(v)包含SEQ ID NO：13的轻链可变区CDR2或其变体，所述变体中SEQ ID NO：13的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰；和
(vi)包含SEQ ID NO：14的轻链可变区CDR3或其变体，所述变体中SEQ ID NO：14的1-4个残基被修饰，优选只有3个残基被修饰，更优选只有两个残基被修饰，甚至更优选只有一个残基被修饰。
在该实施方案的一个方面，在重链可变区CDR1、CDR2和CDR3和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的24个可能的氨基酸残基修饰中(如该实施方案中上文所述的)，任意修饰，除了所述修饰中直至12个以外，是其氨基酸残基的保守取代。优选地，重链可变区CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰，除了所述修饰中直至11个以外，是其氨基酸残基的保守取代。更优选地，重链可变区CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰，除了所述修饰中直至10个以外，除了所述修饰中直至9个以外，除了所述修饰中直至8个以外，除了所述修饰中直至7个以外，除了所述修饰中直至6个以外，除了所述修饰中直至5个以外，除了所述修饰中直至4个以外，除了所述修饰中直至3个以外，除了所述修饰中直至2个以外或除了1个修饰以外，是其氨基酸残基的保守取代。甚至更优选地，重链可变区CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰均是其氨基酸残基的保守取代。
在该实施方案的另一个方面，轻链CDR和重链CDR没有一个被修饰。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分与包含下列重链可变区和轻链可变区的抗体交叉竞争或竞争结合人刻缺蛋白-1：
(a)包含SEQ ID NO：6氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO：8氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分与包含下列重链可变区和轻链可变区的抗体交叉竞争或竞争结合人刻缺蛋白-1：
(i)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR1，
(ii)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR2，
(iii)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的轻链可变区CDR1，
(v)包含SEQ ID NO：13的轻链可变区CDR2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的轻链可变区CDR3，
其中轻链CDR和重链CDR的每一个的1-4个氨基残基可以被修饰。优选地，轻链CDR和重链CDR的任意修饰是其氨基酸残基的保守取代。更优选地，轻链CDR和重链CDR没有一个被修饰。
CDR区域的确定属于本领域技术范围内。应理解在一些实施方案中，CDR可以是Kabat和Chothia CDR的组合(也称为″组合CDR″或″延伸CDR″)。在一些实施方案中，CDR是Kabat CDR。在其他实施方案中，CDR是Chothia CDR。换句话说，在具有不止一个CDR的实施方案中，CDR可以是任意Kabat，Chothia，组合CDR，或其组合。
在实施方案的一个方面，抗体是人源化抗体。在实施方案的另一个方面，抗体是完全人抗体。在实施方案的另一个方面，抗体是嵌合抗体。
在实施方案的另一个方面，抗体或抗原结合部分以下列平衡解离常数KD结合人刻缺蛋白-1：小于1x10-5M，优选小于1x10-6M，优选小于5X10-7M，优选小于2X10-7M，优选小于1X10-7M，或甚至更优选小于1x10-8M。
在实施方案的另一个方面，抗体是小鼠抗体。在该实施方案的另一个方面，抗体是人源化的、人的、或嵌合的。优选地，抗体是人源化的。更优选地，抗体是完全人抗体。
在该实施方案的另一个方面，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的人全长抗体。在该实施方案的另一个方面，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的人源化抗体。在另一实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的嵌合抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包括本文公开的任意抗体或抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种细胞系，其重组产生本文公开的任意抗体或抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供一种寡核苷酸，其编码本文公开的任意抗体或抗原结合部分的重链或轻链。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，包括给对象施用治疗有效量的本发明抗体或抗原结合部分或其药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供本文公开的抗体或抗原结合部分用于治疗癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供本文公开的抗体或抗原结合部分在制备治疗癌症的药物中的用途。
附图简述
图1显示人刻缺蛋白1免疫原质粒N1-NRR-TM(-)的cDNA的PCR合成，如实施例1所述。
图2显示另一种人刻缺蛋白1免疫原质粒N1-NRR-TM(+)的cDNA的PCR合成，也如实施例1所述。
图3显示两种单克隆抗体：mAb N248A和mAb-C的刻缺蛋白-1依赖性荧光素酶报道分子测定结果，如实施例3所示。
图4显示荧光素酶报道分子测定表明，mAb N248A抑制Jagged-1诱导的刻缺蛋白1信号转导。共培养Hela/Jagged1细胞和N1dP-c16细胞用于荧光素酶报道分子测定。MIgG是对照小鼠抗体。y轴数字是荧光素酶报道分子活性读数。
图5是人刻缺蛋白1和人刻缺蛋白2之间EFG，Lin-A，Lin-B，Lin-C，HD-N和HD-C结构域的序列比对。
图6A是Western印迹图像，显示HPB-ALL细胞中NICD(刻缺蛋白1胞内结构域)的水平被mAb N248A降低。
图6B显示HPB-All细胞的生长被mAb N248A抑制。
图7A和7B显示mAb N248A分别阻断Hes1mRNA和Hes4mRNA的表达。
图8显示mAb N248A对HBP-ALL异种移植肿瘤的生长抑制。在肿瘤长到150-300mm3后，如图所示给小鼠施用mAb。每组包含具有随机肿瘤大小的10只小鼠。
图9显示给小鼠单剂注射5mg/kg后，血浆mAb N248A浓度的变化。每个数据点是基于3只小鼠计算的。T1/2是小鼠血清中N248A的半衰期。
图10显示给小鼠单剂注射5mg/kg后，HBP-ALL异种移植肿瘤中NICD的抑制。用对照抗体D16A处理的肿瘤的Western印迹条带被设定为100％强度，其等于0％抑制。
发明详述
本文内容涉及分离的单克隆抗体，尤其是人单克隆抗体和小鼠单克隆抗体以及人/小鼠嵌合抗体，其以高亲和力特异性结合刻缺蛋白-1。本文内容提供分离的抗体，制备这类抗体的方法，包括这类抗体的免疫缀合物和双特异性分子以及包含本文所述抗体，免疫缀合物和双特异性分子的药物组合物。本文内容还涉及使用抗体的方法，如用于抑制刻缺蛋白-1活化以及用于治疗与刻缺蛋白-1的过活化或过表达有关的疾病，如异常细胞生长(例如癌症)。因此，本文内容还提供使用抗刻缺蛋白-1抗体或其抗原结合部分治疗各种类型的异常细胞生长(如癌症)的方法。
定义
术语“刻缺蛋白-1”或“刻缺蛋白1”可互换使用，包括人刻缺蛋白-1蛋白的变体，同种型和种同系物。天然人刻缺蛋白-1蛋白，例如，由以下组成：前导肽，大表皮生长因子(EGF)-样重复区，3个Lin12重复，N端异二聚化结构域(HD-N)，C端异二聚化结构域(HD-C)，跨膜(TM)序列和胞内结构域(NICD)。全长人刻缺蛋白-1的NCBI/GenBank登录号是NM_017617.2。
本文使用的术语“刻缺蛋白-1负调节区”或“刻缺蛋白-1NRR”，除非另外指出，是指任何天然或合成的刻缺蛋白-1多肽区，由3个Lin12结构域以及位于刻缺蛋白-1的3个Lin12结构域和跨膜结构域之间的一或多个氨基酸序列组成。在一个实施方案中，“刻缺蛋白-1NRR”包含3个Lin12结构域和2个异二聚化结构域HD-N和HD-C，其中刻缺蛋白-1的HD-N和HD-C结构域是共价键合的，而且还未被弗林蛋白酶样蛋白酶切割(在S1切割之前)。在另一个实施方案中，“刻缺蛋白-1NRR”包含3个Lin12结构域和2个异二聚化结构域HD-N和HD-C，其中HD-N和HD-C结构域是非共价键合的(在S1切割后)。在该实施方案的一个方面，位于HD-C结构域内的S2位点没有被ADAM型金属蛋白酶切割。在该实施方案的另一个具体方面，位于HD-C结构域内的S2位点正在被或已经被ADAM型金属蛋白酶切割。(Gordon，W.R.，et.al，Nature Structural & Molecular Biology，2007，volume 14，295-300)。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞，抗原呈递细胞，吞噬细胞，粒细胞以及上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体，细胞因子和补体)的作用，其导致对侵入病原体，受病原体感染的细胞或组织，癌细胞，或(在自身免疫性或病理性炎症的情况下)正常人细胞或组织的选择性损伤，破坏，或从人体清除。
“信号转导途径”是指各种信号转导分子之间的生化关系，其在信号从细胞的一部分到细胞另一部分的传递中起作用。如本文所用，短语“细胞表面受体”包括例如能够接收信号并将这类信号传递穿过细胞质膜的分子以及分子复合物。本文中“细胞表面受体”的实例是刻缺蛋白-1受体。
本文所称的术语“抗体”包括全抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包括通过二硫键链间连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(本文简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链包含轻链可变区(本文简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步再分成高变区，称作互补决定区(CDR)，散布于更保守的区域，称为构架区(FR)。CDR区可以使用Kabat或Chothia编号系统确定，这两者都是本领域技术人员公知的。参见例如Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如刻缺蛋白-1)的能力。已经证明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段行使。术语抗体的“抗原结合部分”包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过绞链区的二硫键连结的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward et al.(1989)Nature 341：544-546)，由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可以利用重组方法通过合成接头将它们连接，所述合成接头使它们能够被制备为单条蛋白链，其中VL和VH区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这类单链抗体还意在包括于术语抗体的“抗原结合部分”。这些抗体片段可以使用任何合适的技术获得，包括本领域技术人员已知的常规技术，并且可以筛选与完整抗体以同样方式使用的片段。
本文使用的“分离的抗体”旨在表示基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合刻缺蛋白-1的分离的抗体基本上不含特异性结合除了刻缺蛋白-1以外的抗原的抗体)。但是，特异性结合刻缺蛋白-1的分离的抗体可以具有与其他抗原(如来自其他种类的刻缺蛋白-1分子)的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物。
本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
术语“人源化抗体”旨在表示其中衍生自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人构架序列的抗体。可以在人构架序列内进行额外的构架区修饰。
术语“嵌合抗体”旨在表示其中可变区序列来源于一个物种以及恒定区序列来源于另一个物种的抗体，如一种抗体，其中可变区序列来源于小鼠抗体以及恒定区序列来源于人抗体。
本文使用的术语“人抗体”或“完全人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本文的人抗体或其抗原结合部分可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机或体外定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”旨在不包括其中来源于另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人构架序列的抗体。
术语“人单克隆抗体”或“完全人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的具有可变区的抗体，其中构架和CDR区域均来源于人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括获自转基因非人类动物(例如转基因小鼠)的B细胞，具有与永生化细胞融合的包括人重链转基因和轻链转基因的基因组。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任意修饰形式，例如抗体与另一物质或抗体的缀合物。
本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如(a)从动物例如小鼠(其对于人免疫球蛋白基因来说是转基因或转染色体的)或由其制备的杂交瘤(将在下文描述)分离的抗体，(b)从被转化以表达人抗体的宿主细胞(例如转染瘤)分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有可变区，其中构架和CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列。但是，在一些实施方案中，这类重组人抗体可用于体外诱变(或，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是以下序列：当来源于人种系VH和VL序列并与其相关时，可以不是天然存在于体内人抗体种系全部组分内。
本文中术语“竞争”涉及抗体时，是指当第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分竞争结合时，其中与不存在第二抗体情况下第一抗体的结合相比，存在第二抗体情况下第一抗体与其同源表位的结合是可检测地降低。或者，存在第一抗体情况下，第二抗体与其表位的结合也是可检测地降低，但不必需是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而无需第二抗体抑制第一抗体与其相应表位的结合。但是，当每种抗体可检测地抑制其他抗体与其同源表位或配体的结合时，无论达到相同、更高或更低的程度，所述抗体都被称为彼此“交叉竞争”结合它们的相应表位。例如，交叉竞争抗体可以结合本文公开的抗体结合的表位或表位的一部分。本文包括竞争和交叉竞争抗体的用途。无论这类竞争或交叉竞争发生的机制(例如位阻，构象变化，或与共同表位或其部分结合等等)，技术人员将理解，基于本文提供的教导，这类竞争和/或交叉竞争抗体包括在内并可用于本文公开的方法。
本文使用的“主要表位”是指一种表位，其中如果所述表位的任一个氨基酸残基被丙氨酸置换或非保守取代，抗体与表位所属抗原的结合亲和力降低超过50％。
本文使用的“同种型”或“类型”是指抗体类型(例如IgM或IgG)，其由重链恒定区基因编码。抗体恒定区不参与结合抗原，但显示各种效应物功能。取决于重链恒定区的氨基酸序列，给定的人抗体或免疫球蛋白可以划分为5种主要免疫球蛋白类型之一：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。不同免疫球蛋白类型的结构和三维构型是公知的。在各种人免疫球蛋白类型中，已知只有人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和IgM活化补体。已知人IgG1和IgG3介导人的ADCC。
本文使用的“亚型”是指重链恒定区基因的同种型内的进一步描述，如例如IgG同种型内的IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型。
本文使用的术语“化合物”或“药物化合物”包括抗体，其抗原结合部分，免疫缀合物，和双特异性分子。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。例如，FcR可以是天然序列人FcR。此外，FcR可以是结合IgG抗体的一个(gamma受体)，并包括FcγRI，FcγRII，FcγRIII和FcγRIV亚型的受体，包括这些受体的等位基因变体和可选剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列，区别主要在其细胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daeron，Annu.Rev.Immunol.，15：203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)；Capel et al.，Immunomethods，4：25-34(1994)；和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41(1995)。其他FcR，包括那些将来被鉴定的，也包括在本文术语“FcR”中。该术语还包括新生受体FcRn，其导致母体IgG转移到胎儿(Guyer et al.，Immunol.，117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.，24：249(1994))。
本文使用的“特异性结合人刻缺蛋白-1”的抗体旨在表示以1×10-5M或更低的KD结合人刻缺蛋白-1的抗体。
本文使用的术语“Kon”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的on-rate或缔合速率，而本文使用的术语“Koff”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的off-rate或解离速率。本文使用的术语“KD”旨在表示平衡解离常数，其获自koff与kon的比值(即koff/kon)，表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域明确建立的方法确定抗体的KD值。一种确定抗体KD的方法是使用表面等离子体共振，通常使用生物传感器系统如
Figure BPA00001514555100131
系统。
本文使用的术语抗体的“高亲和力”是指具有1×10-6M或更低的KD的抗体。
本文使用的术语“对象”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物，绵羊，狗，猫，马，牛，鸡，两栖动物，爬行动物等等。
人刻缺蛋白-1受体
人刻缺蛋白1cDNA编码2556个氨基酸残基的蛋白，由前导肽、36个EGF样重复、负调节区(NRR)、跨膜(TM)序列和胞内结构域组成。(Vardar etal.，Biochemistry 2003，41：7061-7067；Sanchez-Irizarry et al.，Mol.Cell.Biol.2004，24：9265-9273；Gordon，W.R.，et.al，Nature Structural & MolecularBiology，2007，volume 14，295-300)。刻缺蛋白-1NRR起始于氨基酸残基1447，终止于1734。刻缺蛋白-1NRR由LNR-A(刻缺蛋白-1AA残基1447-1483)、LNR-B(刻缺蛋白-1AA残基1484-1525)、LNR-C(刻缺蛋白-1AA残基1526-1565)、N端异二聚化结构域(HD-N，刻缺蛋白-1AA残基1566-1665)和C端异二聚化结构域(HD-C，刻缺蛋白-1AA残基1666到1734)组成。
本文的抗体其特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，抗体以1x10-5M或更低的KD特异性结合人刻缺蛋白-1。优选地，本文的抗体以高亲和力结合刻缺蛋白-1，例如1x10-6M或更低的KD，更优选1x10-7M或更低的KD，甚至更优选1x10-8M或更低的KD。
鉴定抗体对刻缺蛋白-1的结合能力的测定包括但不限于ELISA，Western印迹，RIA和流式细胞术分析。还可以通过本领域已知的测定法来评价抗体的结合动力学(例如结合亲和力)，如通过Biacore分析。
单克隆抗体mAb N248A
本文的一种示例性抗体是小鼠单克隆抗体N248A，如实施例1-3和8所述产生、分离、检测和结构表征。表1列出本文公开的mAb N248A各种区域的氨基酸序列和其他序列。
表1
Figure BPA00001514555100141
Figure BPA00001514555100151
Figure BPA00001514555100161
Figure BPA00001514555100171
Figure BPA00001514555100191
如实施例4所示，mAb N248A具有低于0.33x10-6M的KD。
如实施例5所示，表明mAb N248A结合至少两个可区分的刻缺蛋白-1表位，一个表位位于Lin-A结构域内，另一个表位位于HD-C结构域内。
如实施例6所示，在细胞培养物中mAb N248A抑制T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)和乳腺癌细胞生长。
如实施例7所示，在鼠异种移植肿瘤模型中mAb N248A还抑制T细胞淋巴母细胞性白血病。
结合至少刻缺蛋白-1Lin-A结构域和刻缺蛋白-1HD-C结构域内两个可 区分表位的抗刻缺蛋白-1抗体
在本发明预期之中，以高亲和力结合刻缺蛋白-1Lin-A和HD-C结构域的抗体将减弱刻缺蛋白-1信号转导，因此可以在体外和体内显示抑制癌细胞生长(具体来说，T-ALL癌细胞生长)的生物学活性。可以按照本领域普通技术人员已知的常规方法产生这类抗体。在一个实施方案中，可以如下产生这类抗体：用包括刻缺蛋白-1LinA结构域和刻缺蛋白-1HD-C结构域的免疫原免疫小鼠，如实施例1和2所示，然后杂交瘤克隆如此产生的抗体，并通过ELISA测定来检测克隆的抗体，如实施例2所示。如实施例4所示，可以在表面等离子共振Biacore 3000装置上测量根据ELISA测定选择的抗体的刻缺蛋白-1结合亲和力。
本发明的抗刻缺蛋白-1抗体还可以通过上述段落描述以外的本领域已知的任意其他方法来产生结合刻缺蛋白-1LinA结构域和刻缺蛋白-1HD-C结构域的抗体。宿主动物的免疫途径和方案通常应遵循用于抗体刺激和产生的确定的和常规的技术，如本文进一步所述。用于产生人和小鼠抗体的常规技术是本领域已知的和/或在本文描述。
通过杂交瘤技术产生的抗刻缺蛋白-1抗体
在本发明的预期之中，可以操作任意哺乳动物对象包括人或由其而来的抗体生成细胞以作为产生哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系的基础。通常，给宿主动物腹膜内，肌内，口服，皮下，足底(intraplantar)和/或皮内接种一定量的免疫原(包括如本文所述的)。
杂交瘤可以从淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备，使用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature 256：495-497的常规体细胞杂交技术或如Buck，D.W.，et al.，In Vitro，18：377-381(1982)修改的方法。可用的骨髓瘤系包括但不限于X63-Ag8.653和来自Salk Institute，Cell Distribution Center，San Diego，Calif.，USA的那些可用于杂交。通常，该技术涉及使用促融剂如聚乙二醇或通过本领域技术人员公知的电学手段将骨髓瘤细胞和淋巴样细胞融合。在融合后，从融合培养基分离细胞并在选择性生长培养基(如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基)中生长，以去除未杂交的亲代细胞。本文描述的任意培养基(添加或不添加血清)可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一替代，可以使用EBV永生化B细胞产生本发明的刻缺蛋白-1单克隆抗体。如果需要，将杂交瘤扩增和亚克隆，并通过常规免疫测定法(例如放射免疫测定，酶免疫测定或荧光免疫测定)检测上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤包括亲本杂交瘤(产生对刻缺蛋白-1特异的单克隆抗体或其一部分)的所有衍生物，后代细胞。
可以使用已知的方法在体外或体内生长产生这类抗体的杂交瘤。如果需要，可以通过常规免疫球蛋白纯化方法如硫酸铵沉淀，凝胶电泳，透析，层析和超滤，从培养基或体液分离单克隆抗体。可以去除不想要的活性(如果存在的话)，例如通过将制备物通过由粘附到固相上的免疫原制得的吸附剂并将所需抗体从免疫原上洗脱或释放。利用人刻缺蛋白-1或包含利用双功能剂或衍生剂(例如马来酰亚胺苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基))与蛋白(在待免疫的物种中是免疫原性的，例如匙孔血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合的靶氨基酸序列的片段免疫宿主动物，可以产生抗体群(例如单克隆抗体)。
宿主动物中通过免疫产生的抗刻缺蛋白-1抗体的人源化
在本发明的预期之中，可以以很多方式操作本发明的抗刻缺蛋白-1抗体(其中所述抗体通过在宿主动物中免疫产生)以增加其生物学活性和药学特性。这类操作的一种方式是人源化。
存在4个常规步骤以人源化单克隆抗体。这些步骤是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变区的核苷酸及预测的氨基酸序列(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程期间使用哪个抗体构架区(3)实际的人源化方法/技术和(4)人源化抗体的转染和表达。参见例如美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089和6,180,370。
已经描述了包括来源于非人免疫球蛋白的抗原结合位点的大量“人源化”抗体分子，包括具有啮齿类或修饰的啮齿类V区以及其与人恒定区融合的相关CDR的嵌合抗体。参见例如Winter et al.Nature 349：293-299(1991)，Lobuglio et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224(1989)，Shaw et al.JImmunol.138：4534-4538(1987)和Brown et al.Cancer Res.47：3577-3583(1987)。其他参考文献描述了在与合适的人抗体恒定区融合之前，移植到人支持构架区(FR)的啮齿类CDR。参见例如Riechmann et al.Nature332：323-327(1988)，Verhoeyen et al.Science 239：1534-1536(1988)和Jones etal.Nature 321：522-525(1986)。另一参考文献描述了通过重组工程化的啮齿类构架区支持的啮齿类CDR。参见例如欧洲专利公开号0519596。这些“人源化”分子被设计为将不需要的针对啮齿类抗人抗体分子的免疫应答(其限制这些部分在人受体中治疗应用的持续时间和有效性)最小化。例如，抗体恒定区可以被工程化，由此它是免疫学惰性的(例如不触发补体裂解)。参见例如PCT公开号PCT/GB99/01441；英国专利申请号9809951.8。还可以使用的人源化抗体的其他方法公开于Daugherty et al.，Nucl.Acids Res.19：2471-2476(1991)和美国专利号6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671；和6,350,861；和PCT公开号WO 01/27160。
人抗刻缺蛋白-1抗体
在本发明的预期之中，可以使用商品化供应的小鼠(其已经被工程化以表达特异性人免疫球蛋白)来获得完全人抗刻缺蛋白-1抗体。还可以使用转基因动物(被设计为产生更需要的(例如完全人抗体)或更有效的免疫应答)来产生人源化的或人抗体。这类技术的实例是Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的Xenomouse TM以及Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的HuMAb-和TCMouseTM。
本发明还预期，可以按照噬菌体展示技术的常规方法重组获得完全人抗刻缺蛋白-1抗体。参见例如美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743和6,265,150；和Winter et al.，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)。
或者，可以使用噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348：552-553(1990))从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因全部组分体外产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V结构域基因框内克隆入丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要壳蛋白基因，并作为功能抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还导致选择出编码显示所述特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以采用各种形式进行；综述参见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3：564-571(1993)。可以使用V基因片段的数种来源用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)从来源于免疫小鼠脾的V基因小随机组合文库分离出不同阵列的抗恶唑酮抗体。可以构建来自未免疫人供体的V基因全部组分并基本上按照Mark et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)描述的技术分离针对不同阵列抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高速率累积突变(体细胞超突变)。导入的一些变化将提供更高的亲和力，在后续抗原攻击期间展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优先复制和分化。可以使用称为“链转换(chain shuffling)”的技术模拟这种自然过程(Marks et al.，Bio/Technol.10：779-783(1992))。在这种方法中，通过噬菌体展示获得的“初始”人抗体的亲和力可以被改良，通过用获自未免疫供体的V结构域基因天然存在的变体(全部组分)的所有组分相继置换重链和轻链V区基因进行。这种技术允许产生具有pM-nM范围亲和力的抗体和抗体片段。用于制备非常大的噬菌体抗体全部组分(亦称为“文库之源(mother-of-alllibraries)”)的策略已经由Waterhouse et al.，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)描述。
还可以使用基因改组从啮齿类抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿类抗体的类似亲和力和特异性。根据这种方法(还被称为“表位印迹(epitope imprinting)”)，获自噬菌体展示技术的啮齿类抗体的重链或轻链V结构域基因被人V结构域基因的全部组分置换，产生啮齿类-人嵌合体。对抗原的选择产生能够恢复功能性抗原-结合位点的人可变区的分离物，即表位控制(印记)配偶体的选择。当重复该过程以置换剩余啮齿类V结构域时，获得人抗体(参见PCT公开号WO 93/06213)。不同于通过CDR移植的经典啮齿类抗体人源化，这种技术提供完整的人抗体，其没有啮齿类来源的构架或CDR残基。
虽然上述讨论涉及人源化和人抗体，但是讨论的一般原理适用于例如在狗，猫，灵长类动物，马和牛中定制抗体。可以将本文描述的人源化抗体的一或多个方面组合，例如CDR移植，构架突变和CDR突变。
重组制备的工程化和修饰的抗刻缺蛋白-1抗体
通常，可以通过如下方式重组制备抗体：将所需抗体的DNA序列置入表达载体，然后转染入宿主细胞并表达，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌细胞，猿猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。PCT专利公开号WO 87/04462。也可以使用其他宿主细胞如转基因植物细胞或转基因乳细胞。参见例如Peeters，et al.Vaccine19：2756(2001)；Lonberg，N.and D.Huszar Int.Rev.Immunol 13：65(1995)和Pollock，et al.，J Immunol Methods 231：147(1999)。
也可以将抗体重组修饰。例如，人重链和轻链恒定区的DNA可用于替换鼠抗体DNA的同源鼠序列，Morrison et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851(1984)，或非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列通过共价连接到免疫球蛋白编码序列。以类似方式，可以制备具有本文抗刻缺蛋白-1单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂种”抗体。
还可以通过CDR移植修饰抗体可变区。因为CDR序列决定大部分抗体-抗原相互作用，有可能表达模拟特定天然存在抗体特性的重组抗体，通过构建包括移植到构架序列(来自具有不同特性的不同抗体)的CDR序列(来自特定天然存在的抗体)的表达载体进行(参见例如Riechmann，L.et al.(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.et al.(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539以及Queen et al.的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本文的另一个方面涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括分别包含选自SEQID NO：18、19和20的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包括分别包含选自SEQ ID NO：12、13和14的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。因此，这类抗体包含单克隆抗体N248A的VH和VLCDR序列，也可以包含来自这些抗体的不同构架序列。这类构架序列可以获自公共DNA数据库或公开的参考文献(包括种系抗体基因序列)。
可变区修饰的另一类型是突变VH和/或VLCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基以改良感兴趣抗体的一或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入一或多个突变，并采用本文描述的体外或体内测定法来鉴定对抗体结合或其他感兴趣的功能特性的作用。通常，引入保守修饰(如下文所述)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，CDR区内通常不超过1，2，3，4或5个残基被改变。
将在后面的段落中更详细地描述保守取代和抗体亲和力成熟。
抗体结合的抗原表位作图
根据抗原-抗体相互作用类型，可以通过大量方法对抗原上的单克隆抗体的结合表位作图。
如果抗体结合由抗原的相继的氨基酸残基组成的单一表位(其结合通常不受抗原构象变化的影响)，该结合表位被称为线性表位。通常使用肽扫描法来鉴定线性结合表位(参见Journal of Immunological Methods，Volume 315，Issues 1-2，pages 11-18，August 2006)，这需要合成一系列重叠10-15聚体肽(覆盖抗原序列的全长)。以一式两份的打点形式将所述肽排列于蛋白交联膜上。与ELISA类似，分析针对肽阵列的抗体结合亲和力。首先将肽排列膜在含5％胎牛血清的1X PBST中温育以阻断非特异性结合，然后与检测抗体或非特异性对照抗体温育，随后与HRP标记的二抗温育。使用化学发光成像装置读取抗体结合强度。
或者，使用在酵母细胞表面展示的抗原蛋白结构域(参见Journal ofMolecular Biology，365(1)，196-200，January 2007)或使用在细菌细胞表面展示的抗原蛋白片段(参见FEMS Microbiol.Lett.，226(2)，347-353，September，2003；也可参见Nature Methods，5(12)，1039-1045，November 2008)，然后通过流式细胞分选或FACS鉴定线性结合表位。
肽抗原和抗体复合物的有限蛋白水解组合质谱可以提供定位线性结合表位的另一种方法(参见Methods Mol.Biol.，524，87-101，2009)。将抗原和抗体混合并在合适条件下温育以形成结合复合物，其在受控温度和时间下被蛋白酶消化。然后将结合的反应混合物通过蛋白A亲和柱以保留与抗原表位片段结合的抗体，其在从柱洗脱后通过质谱进行分析。
构象表位的作图取决于抗体与处于其天然构象的抗原的相互作用。已经报道了大量技术可用于确定构象表位。常用的方法之一是氨基酸诱变。抗原蛋白中推测与抗体结合的各个氨基酸残基被突变，然后表达突变的抗原蛋白并进行抗体结合分析以确定结合亲和力是否受损。但是，跨越完整抗原蛋白序列的系统性氨基酸诱变是费力的。为了将与抗体相互作用的抗原蛋白区缩小，用密切相关的蛋白结构域取代各个抗原结构域可能是有效的方法(参见J.Biol.chem.，274(14)9617-9626，April 1999)。
开发出鸟枪诱变作图以克服常规氨基酸诱变的缺点(参见J.AmericanChem.Soc，131，6952-6954，2009)。这种方法使用由抗原cDNA制备的全面突变文库，其中每个质粒克隆包含唯一的点突变并且整个突变文库覆盖抗原编码区的每个氨基酸。将质粒克隆的文库转染HEK-293T或其他人细胞，然后将细胞排列于384孔微板。将细胞固定在微板上后，测定抗体结合活性。如果氨基酸突变造成反应性的丧失，则其被鉴定为抗体结合表位。
抗原抗体复合物的共结晶，X射线衍射和结构分析给出抗原-抗体相互作用的方向显示。当结合氨基酸诱变时，该技术将为抗体结合表位提供有力证据和逼真图像。但是，共结晶和结构分析在技术上是有挑战的，需要大量纯化的抗原和抗体，可能是费时的反复试验过程。
为了制备结合表位或特定表位组的抗刻缺蛋白-1抗体，可以产生抗刻缺蛋白-1抗体，然后根据本领域通常已知的上述作图法来确定这些抗体中的每一个结合的表位或表位组。然后可以选择结合特定表位或特定表位组的那些抗刻缺蛋白-1抗体。
保守取代
如上所述，抗体还可以被重组修饰，通过一或多个抗体氨基酸残基的保守取代或通过对抗体氨基酸残基的一或多个氨基酸缺失或添加进行。
氨基酸序列插入包括长度范围从1个残基到包含100个或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括增加抗体在血液循环中的半衰期的酶或多肽与抗体的N或C端的融合物。
取代变体在抗体分子中去除至少1个氨基酸残基并在该处插入不同的残基。用于取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但也预期FR改变。保守取代显示于表2。如果这类取代导致生物学活性的变化，则可以引入更实质的变化，称为表2的“示例性取代”，或如下关于氨基酸类型所述的，并筛选产物。
表2：氨基酸取代
Figure BPA00001514555100261
抗体生物学特性的实质修饰通过选择取代来实现，所述取代在它们对维持以下作用方面区别明显：(a)多肽主链在取代区的结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。基于常规的侧链特性，将天然存在的残基分成：
(1)非极性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)不带电荷极性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的(带负电荷的)：Asp，Glu；
(4)碱性的(带正电荷的)：Lys，Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly，Pro；和
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe，His。
非保守取代是将这些类型之一的成员替换为另一类型来完成的。
未参与维持抗体正确构象的任意半胱氨酸残基也可以被替代，通常是用丝氨酸，以改良分子的氧化稳定性并阻止异常交联。相反，可以向抗体中添加半胱氨酸键以提高其稳定性，尤其当抗体是抗体片段如Fv片段时。
亲和力成熟的抗刻缺蛋白-1抗体
本发明包括亲和力成熟的实施方案。例如，可以通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体(Marks et al.(1992)Bio/Technology，10：779-783；Barbas et al.(1994)Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813；Schier et al.(1995)Gene，169：147-155；Yelton et al.(1995)J.Immunol.，155：1994-2004；Jackson etal.(1995)J.Immunol.，154(7)：3310-9；Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.，226：889-896；和PCT公开号WO2004/058184)。
可以使用下列方法调节抗体的亲和力和表征CDR。一种表征抗体的CDR和/或改变(如改良)多肽(如抗体)的结合亲和力的方式被称为“文库扫描诱变”。通常，如下进行文库扫描诱变。使用本领域已知的方法，CDR中一或多个氨基酸位置被两个或更多个(如3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)个氨基酸置换。这产生小克隆文库(在一些实施方案中，被分析的每个氨基酸位置是一个)，每个均具有两个或更多个成员的复杂度(如果每个位置取代两个或更多个氨基酸)。通常，所述文库还包括包含天然(未取代)氨基酸的克隆。筛选来自每个文库的少量克隆例如约20-80个克隆(取决于文库的复杂度)对靶多肽(或其他结合靶)的结合亲和力并鉴定具有增加的、相同的、降低的结合或没有结合的候选物。
在一些实施方案中，CDR的每个氨基酸位置都被置换，在一些实施方案中，一次一个，通过本领域已知的诱变方法利用所有20个天然氨基酸进行。这产生小克隆文库，在一些实施方案中，被分析的每个氨基酸位置是一个，每个均具有20个成员的复杂度，如果每个位置取代全部20个氨基酸。
在一些实施方案中，待筛选的文库包括在两个或更多个位置的取代，所述位置可以在相同的CDR或两个或更多个CDR中。因此，文库可以包括在一个CDR的两个或更多个位置上的取代。文库可以包括在两个或更多个CDR的两个或更多个位置上的取代。文库可以包括在3，4，5或更多个位置上的取代，发现所述位置位于2，3，4，5或6个CDR中。可以使用低冗余度密码子制备所述取代。参见例如Balint et al.，(1993)Gene137(1)：109-18的表2。每个CDR可以是Kabat CDR，Chothia CDR或延伸CDR。
可以测序具有改良结合的候选物，从而鉴定出导致亲和力改良的CDR取代突变体，这种取代也被称为“改良的”取代。也可以测序结合的候选物，从而鉴定出保留结合的CDR取代。
可以进行多轮筛选。例如，具有改良结合的候选物(每个在一或多个CDR的一或多个位置包括氨基酸取代)可以用来设计第二文库，其在每个改良的CDR位置(即CDR中取代突变体显示改良结合的氨基酸位置)包含至少初始和取代的氨基酸。这种文库的制备和筛选或选择在下文描述。
文库扫描诱变也提供一种表征CDR的方法，就具有改良的结合、相同的结合、降低的结合或没有结合的克隆频率来说还提供有关每个氨基酸位置对于抗体-抗原复合物稳定性的重要性的信息。例如，如果当CDR的一个位置改变为所有20个氨基酸时都保持结合，则该位置被鉴定为不可能是抗原结合需要的位置。相反，如果CDR的一个位置只在小百分比的取代中保持结合，则该位置被鉴定为对CDR功能重要的位置。因此，文库扫描诱变法产生有关CDR中可以改变为许多不同的氨基酸(包括所有20种氨基酸)的位置以及CDR中不能改变或只能改变为少数几种氨基酸的位置的信息。
可以将具有改良亲和力的候选物组合第二文库，其在该位置包括改良的氨基酸，初始氨基酸，还可以在该位置包括额外的取代，取决于使用所需筛选或选择方法所需或允许的文库复杂度。此外，如果需要，可以将相邻氨基酸位置随机化为至少两个或更多个氨基酸。相邻氨基酸的随机化允许突变CDR的额外构象柔性，这进而允许或便于引入更大数目的改良突变。该文库还可以包括在第一轮筛选中不显示改良亲和力的位置上的取代。
使用本领域已知的任何方法(包括利用Biacore表面等离子体共振分析的筛选以及利用本领域用于选择的已知任何方法的选择，包括噬菌体展示，酵母展示和核糖体展示)筛选或选择第二文库的具有改良的和/或改变的结合亲和力的文库成员。
抗刻缺蛋白-1抗体的翻译后修饰
抗体还可以通过翻译后修饰进行修饰，包括但不限于利用不同糖的糖基化，乙酰化和磷酸化。抗体在其恒定区的保守位置被糖基化。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白功能(Boyd et al.，1996，Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe and Howard，1990，Biochem.29：4175-4180)以及糖蛋白部分之间的分子内相互作用，这影响糖蛋白的构象和呈现的三维表面(Jefferis and Lund，如前；Wyss and Wagner，1996，Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡糖还可以基于特定识别结构将指定糖蛋白靶向某些分子。抗体的糖基化据报道还影响抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。具体来说，具有β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)(催化二等分GlcNAc形成的糖基转移酶)的四环素调节表达的CHO细胞据报道具有改良的ADCC活性(Umana et al.，1999，MatureBiotech.17：176-180)。
抗体的糖基化通常是N连接或O连接的。N连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸，天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶连接的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。因此，这些三肽序列中任一种在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一与羟氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，虽然还可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸)的连接。
向抗体上添加糖基化位点可以通过改变氨基酸序列(使其包含一或多个上述三肽序列(用于N连接的糖基化位点))方便地实现。还可以通过向初始抗体的序列添加一或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用其取代来实现改变(用于O连接的糖基化位点)。
抗体的糖基化模式也可以被改变而不改变根本的核苷酸序列。糖基化主要取决于用于表达抗体的宿主细胞。因为用于表达重组糖蛋白(例如抗体)作为潜在治疗剂的细胞类型很少是天然细胞，所以抗体糖基化模式的变化是可预见的(参见例如Hse et al.(1997)J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除了宿主细胞的选择以外，在重组产生抗体期间影响糖基化的因素包括生长模式，培养基配方，培养密度，充氧，pH，纯化方案等等。各种方法已经被建议用于改变特定宿主生物体的糖基化模式，包括引入或过表达参与寡糖产生的某些酶(美国专利号5,047,335；5,510,261和5.278,299)。例如，使用内切糖苷酶H(Endo H)，N-糖苷酶F，内切糖苷酶F1，内切糖苷酶F2，内切糖苷酶F3，利用酶法从糖蛋白酶去除糖基化或某些类型的糖基化。此外，可以将重组宿主细胞遗传工程化为在处理某些类型的多糖中是缺陷的。这些和类似技术是本领域公知的。
翻译后修饰的其他方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括但不限于酶法，氧化取代和螯合。修饰可以例如用于免疫测定的标记的连接。
具有修饰的恒定区的抗刻缺蛋白-1抗体
在本发明的一些实施方案中，抗体包括修饰的恒定区，如免疫学惰性或部分惰性的恒定区，例如不触发补体介导的裂解，不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或不活化小胶质细胞；或具有下列一或多种降低的活性(与未修饰的抗体相比)：触发补体介导的裂解，刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或活化小胶质细胞。可以使用恒定区的不同修饰来实现效应功能的最佳水平和/或组合。参见例如Morgan et al.，Immunology86：319-324(1995)；Lund et al.，J.Immunology 157：4963-9 157：4963-4969(1996)；Idusogie et al.，J.Immunology 164：4178-4184(2000)；Tao et al.，J.Immunology 143：2595-2601(1989)；和Jefferis et al.，Immunological Reviews163：59-76(1998)。在一些实施方案中，按照以下描述修饰恒定区：Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请号PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请号9809951.8。在其他实施方案中，抗体包括人重链IgG2恒定区，包含下列突变：A330P331到S330S331(按照野生型IgG2序列进行氨基酸编号)。Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624。仍在其他实施方案中，恒定区对于N连接糖基化来说是无糖基化。在一些实施方案中，恒定区对于N连接糖基化来说是无糖基化的，通过将糖基化的氨基酸残基突变或在恒定区侧翼放置N糖基化识别序列的一部分残基。例如，可以将N糖基化位点N297突变为A，Q，K或H。参见Tao et al.，J.Immunology 143：2595-2601(1989)；和Jefferis et al.，Immunological Reviews 163：59-76(1998)。在一些实施方案中，恒定区对于N连接糖基化来说是无糖基化的。恒定区对于N连接糖基化来说可以是无糖基化的，通过酶法(如通过酶PNGase去除碳水化合物)或通过在糖基化缺陷型宿主细胞中表达进行。
Fc区域内的修饰通常可用于改变抗体的一或多种功能特性，如血清半衰期，补体固定，Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。此外，本文的抗体可以被化学修饰(例如将一或多种化学物部分连接到抗体)或被修饰以改变其糖基化模式，再改变抗体的一或多种功能特性。这些方面的每一个将在下文进一步详细描述。Fc区域的残基编号是根据Kabat的EU标准。
一种情况下，将CH1的铰链区修饰，由此铰链区半胱氨酸残基的数目被改变，例如增加或降低。这种方法进一步描述于美国专利号5,677,425。CH1铰链区的半胱氨酸残基数目被改变，例如便于轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
在另一种情况下，抗体的Fc铰链区被突变以降低抗体的生物学半衰期。更具体地，将一或多个氨基酸突变导入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，由此相对于天然Fc-铰链结构域葡萄球菌A蛋白(SpA)结合，抗体具有减弱的SpA结合。这种方法进一步描述于美国专利号6,165,745。
在另一种情况下，将抗体进行修饰以增加其生物学半衰期。各种方法都是可能的。例如，可以引入一或多种下列突变：T252L，T254S，T256F，如美国专利号6,277,375所述。或者，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区域内改变抗体以包含补救受体结合表位(取自IgG Fc区的CH2结构域的两个环)，如美国专利号5,869,046和6,121,022所述。
仍在其他情况下，通过用不同氨基酸残基取代至少一个氨基酸残基以改变抗体的效应功能来改变Fc区。例如，可以用不同氨基酸残基取代选自氨基酸残基234，235，236，237，297，318，320和322的一或多个氨基酸，由此抗体对于效应配体具有改变的亲和力，但保留亲代抗体的抗原结合能力。与其亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1成分。这种方法进一步描述于美国专利号5,624,821和5,648,260。
在另一种情况下，可以用不同氨基酸残基取代选自氨基酸残基329，331和322的一或多个氨基酸，由此抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法进一步描述于美国专利号6,194,551。
在另一个实例中，氨基酸位置231和239内的一或多个氨基酸残基被改变，从而改变抗体固定补体的能力。这种方法进一步描述于PCT公开WO 94/29351。
在另一个实例中，Fc区被修饰以增加抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力，通过修饰下列位置的一或多个氨基酸进行：238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。这种方法进一步描述于PCT公开WO00/42072。此外，人IgG1上针对FcγR1，FcγRII，FcγRIII和FcRn的结合位点已经被作图，具有改良的结合的变体也已经被描述(参见Shields et al.，J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001))。在位置256，290，298，333，334和339的特定突变显示改良对FcγRIII的结合。此外，下列组合突变体显示改良与FcγRIII的结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
仍在另一个实例中，抗体的糖基化被修饰。例如，可以产生无糖基化的抗体(即缺少糖基化的抗体)。可以改变糖基化，例如为了增加抗体对抗原的亲和力。可以通过例如改变抗体序列内的一或多个糖基化位点来实现这类碳水化合物修饰。例如，可以进行一或多个氨基酸取代，其导致一或多个可变区构架糖基化位点的消除，从而消除在该位点的糖基化。这类无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这种方法更进一步详细描述于美国专利号5,714,350和6,350,861。
此外或可选地，可以制备具有糖基化类型改变的抗体，如低岩藻糖化抗体(具有降低量的岩藻糖残基)或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。这类改变的糖基化模式已经显示增加抗体的ADCC能力。可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现这类碳水化合物修饰。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域中描述并被用做宿主细胞，在所述宿主细胞中表达本文的重组抗体从而产生糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704，Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因，FUT8(alpha(1，6)岩藻糖基转移酶)，由此在Ms704，Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物中缺少岩藻糖。使用两个置换载体，通过CHO/DG44细胞中FUT8基因的靶向破坏来产生Ms704，Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系(参见美国专利公开号2004-0110704和Yamane-Ohnuki et al.，BiotechnolBioeng 87：614-22(2004))。作为另一个实例，欧洲专利公开号EP1,176,195描述了一种具有功能被破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，由此在这类细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖化，通过减少或消除alpha1，6键相关的酶实现。EP1,176,195也描述了对于将岩藻糖添加到N-乙酰葡糖胺(其结合抗体的Fc区)来说具有低酶活性或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开WO 03/035835描述了一种变体CHO细胞系，Lec13细胞，对于将岩藻糖连接到Asn(297)连接的碳水化合物具有降低的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖化(还参见Shields et al.，J.Biol.Chem.277：26733-26740(2002))。PCT公开WO 99/54342描述了被工程化以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如beta(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIID)的细胞系，由此在该工程化的细胞系中表达的抗体显示增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana et al.，Nat.Biotech.17：176-180(1999))。或者，可以利用岩藻糖苷酶来切掉抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶alpha-L-岩藻糖苷酶从抗体去除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23(1975))。
本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。抗体可以被聚乙二醇化，以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了将抗体聚乙二醇化，通常在一或多个PEG基团可以连接抗体或抗体片段的条件下，将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(如PEG的活性酯或醛衍生物)反应。通常，通过与活性PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应来进行聚乙二醇化。如本文使用的术语“聚乙二醇”旨在包括已经用于衍生化其他蛋白的任意PEG形式，如单(C1到C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些情况下，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。用于将蛋白聚乙二醇化的方法是本领域已知的并可用于本文的抗体。参见例如欧洲专利号EP 0154316B1和EP 0401384B1。
其他抗体修饰包括如PCT公开号WO 99/58572所述修饰的抗体。除了针对靶分子的结合结构域，这些抗体包括效应结构域，其具有与全部或部分人免疫球蛋白重链恒定区基本上同源的氨基酸序列。这些抗体能够结合靶分子，而不触发显著的补体依赖性裂解，或靶的细胞介导的破坏。在一些实施方案中，效应结构域能够特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。这些通常基于源自两种或更多种人免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以这种方式修饰的抗体尤其适用于慢性抗体疗法，以避免常规抗体疗法的炎性和其他不良反应。
融合蛋白
本发明还包括融合蛋白，其包括来自本发明抗体或多肽的一或多个片段或区域。在一个实施方案中，提供一种融合多肽，包含本发明抗体的轻链可变区的至少10个连续氨基酸和/或重链可变区的至少10个氨基酸。在其他实施方案中，提供一种融合多肽，包含轻链可变区的至少约10个，至少约15个，至少约20个，至少约25个或至少约30个连续氨基酸和/或包含重链可变区的至少约10个，至少约15个，至少约20个，至少约25个或至少约30个连续氨基酸。在另一个实施方案中，融合多肽包含本发明抗体的轻链可变区和/或重链可变区。在另一个实施方案中，融合多肽包含本发明抗体的一或多个CDR。对于本发明来说，融合蛋白包含一或多种抗体以及另一氨基酸序列(在天然分子中不是与其连接的)，例如异源序列或来自另一区域的同源序列。示例性的异源序列包括但不限于“标签”，如FLAG标签或6His标签。
可以通过本领域已知的方法(例如合成或重组)产生融合多肽。
双特异性分子
本文的抗体或其抗原结合部分可以被衍生为或连接到另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白(例如针对受体的另一种抗体或配体)以产生结合至少两种不同结合位点或靶分子的双特异性分子。本文的抗体实际上可以被衍生为或连接到一种以上其他功能分子以产生结合超过两种的不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；这类多特异性分子还旨在被本文使用的术语“双特异性分子”所包括。为了产生本文的双特异性分子，可以将本文的抗体功能性连接(例如通过化学偶联，遗传融合，非共价结合或其他)到一或多种其他结合分子，如另一种抗体，抗体片段，肽或结合模拟物，由此产生双特异性分子。
编码抗刻缺蛋白-1抗体的多核苷酸
本发明还提供编码本发明抗体和肽的分离的多核苷酸以及包括所述多核苷酸的载体和宿主细胞。
在一个方面，本发明提供组合物，如药物组合物，包括本发明的任一种多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合物包括表达载体，其包括编码本发明抗体的多核苷酸。在其他实施方案中，所述组合物包括表达载体，其包括编码本发明任意抗体或多肽的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供一种制备本文描述的任一多核苷酸的方法。
本发明还包括与任意这类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组，cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其包含内含子，以一对一方式对应于DNA分子)和mRNA分子(其不包含内含子)。本发明的多核苷酸内可以存在额外的编码或非编码序列(但不是必需的)，多核苷酸可以(但无需)连接到其他分子和/或支持材料。
多核苷酸可以包含天然序列(即编码抗体或其部分的内源序列)或可以包含这类序列的变体。多核苷酸变体包含一或多个取代，添加，缺失和/或插入，由此编码多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应分子不降低。如本文所述通常评价对编码多肽的免疫反应性的影响。变体优选显示与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列至少约70％相同性，更优选至少约80％相同性，仍然更优选至少约90％相同性，并且最优选至少约95％相同性。
如果当如下所述针对最大对应性进行比对时两条序列的核苷酸或氨基酸序列是相同的，则这两条多核苷酸或多肽序列被称为“相同的”。通常通过在比较窗口比较序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行两条序列的比较。本文使用的“比较窗口”是指至少约20个连续位置的片段，通常30到约75个，或40到约50个，其中在两条序列被最优比对后将序列与具有相同数目连续位置的参照序列进行比较。
优选地，通过在至少20个位置的比较窗口比较两条最优比对的序列来确定“序列相同性百分比”，其中与用于两条序列最优比对的参照序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分可以包括20％或更低的、通常5％到15％或10％到12％的添加或缺失(即缺口)。如下计算百分比：确定两条序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以参照序列的位置总数(即窗口大小)并将结果乘以100得到序列相同性百分比。
变体也可以或可选地与天然基因或其部分或互补序列基本上同源。这类多核苷酸变体能够在中等严格条件下与天然存在的编码天然抗体的DNA序列(或互补序列)杂交。
合适的“中等严格条件”包括在5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃，5X SSC杂交过夜；然后在65℃清洗两次20分钟，每次用包含0.1％SDS的2X，0.5X和0.2X SSC。
本文使用的″高度严格条件″是以下条件：(1)使用低离子强度和高温进行清洗，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)杂交期间使用变性剂，如甲酰胺，例如含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficol1/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，42℃；或(3)使用50％甲酰胺，5xSSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt′s溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸葡聚糖，42℃，在42℃用0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和在55℃用50％甲酰胺清洗，然后是在55℃用含EDTA的0.1xSSC进行高度严格性清洗。技术人员清楚如何根据需要调节温度，离子强度等以适应如探针长度等因素。
本领域普通技术人员应理解，作为遗传密码简并性的结果，存在许多编码本文所述多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些具有与任意天然基因的核苷酸序列最小的同源性。尽管如此，本发明特别预期由于密码子使用差异而不同的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因也在本发明的范围内。等位基因是作为一或多个突变(如核苷酸的缺失，添加和/或取代)结果的被改变的内源基因。所获mRNA和蛋白可以具有(但不是必须的)改变的结构或功能。可以使用标准技术(如杂交，扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。
本发明的多核苷酸可以使用化学合成，重组方法或PCR获得。
为了使用重组方法制备多核苷酸，可以将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体，进而将载体导入用于复制和扩增的合适宿主细胞，如本文进一步所述。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞。通过直接摄取，胞吞作用，转染，F-交配或电穿孔引入外源多核苷酸来转化细胞。一旦引入，外源多核苷酸可以作为非整合的载体(如质粒)在细胞内维持或整合入宿主细胞基因组。可以通过本领域公知的方法从宿主细胞分离如此扩增的多核苷酸。参见例如Sambrook et al.(1989)。
或者，PCR能够复制DNA序列。PCR技术是本领域公知的，描述于美国专利号4,683,195，4,800,159，4,754,065和4,683,202以及PCR：ThePolymerase Chain Reaction，Mullis et al.eds.，Birkauswer Press，Boston(1994)。
通过使用合适载体中的分离DNA并将其插入合适的宿主细胞可以获得RNA。当细胞复制和DNA转录为RNA时，然后可以使用本领域技术人员公知的方法分离RNA，例如Sambrook et al.，(1989)所述，如前。
合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或选自本领域可用的大量克隆载体。尽管选择的克隆载体可以根据预期使用的宿主细胞而变化，但有效的克隆载体通常具有自我复制的能力，具有针对特定限制性核酸内切酶的单一靶，和/或携带可用于筛选包含所述载体的克隆的标记基因。合适的实例包括质粒和噬菌体，例如pUC18，pUC19，Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物，mp18，mp19，pBR322，pMB9，ColE1，pCR1，RP4，噬菌体DNA，以及穿梭载体如pSA3和pAT28。这些和许多其他克隆载体可以获自商业供应商如BioRad，Strategene和Invitrogen。
表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其包含本发明的多核苷酸。这意味着表达载体在宿主细胞中作为附加体或作为染色体DNA的整合部分必须是可复制的。合适的表达载体包括但不限于PCT公开号WO87/04462公开的质粒，病毒载体，包括腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，粘粒和表达载体。载体组分通常包括但不限于下列的一或多个：信号序列；复制起点；一或多个标记基因；合适的转录控制元件(如启动子，增强子和终止子)。为了表达(即翻译)，通常还需要一或多个翻译控制元件，如核糖体结合位点，翻译起始位点和终止密码子。
包含感兴趣多核苷酸的载体可以通过大量合适方法中的任一种导入宿主细胞，包括电穿孔，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂转染；和感染(例如其中载体是感染性物质如痘苗病毒)。导入载体或多核苷酸的选择经常取决于宿主细胞的特征。
本发明还提供包括本文所述任一多核苷酸的宿主细胞。为了分离编码感兴趣抗体、多肽或蛋白的基因，可以使用能够过表达异源DNA的任意宿主细胞。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS，HeLa和CHO细胞。还可参见PCT公开号WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))和酵母(如酿酒酵母(S.cerevisae)，裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。优选地，宿主细胞表达cDNA的水平比宿主细胞中相应感兴趣的内源抗体或蛋白(如果存在的话)的cDNA水平高约5倍，更优选高10倍，甚至更优选高20倍。通过免疫测定或FACS筛选与刻缺蛋白-1或刻缺蛋白-1结构域特异性结合的宿主细胞。可以鉴定过表达感兴趣抗体或蛋白的细胞。
药物组合物
在另一个方面，本文提供了组合物，例如药物组合物，包含本文的单克隆抗体或其抗原结合部分之一或组合，与药学上可接受的载体一起配制。这类组合物可以包括本文的(例如两种或更多种不同的)抗体，或免疫缀合物或双特异性分子之一或组合。例如，本文的药物组合物可以包括结合靶抗原上不同表位或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性物)的组合。
本文的药物组合物还可以采用组合疗法施用，即与其他药剂组合。例如，组合疗法可以包括本文的抗刻缺蛋白1抗体与至少一种其他抗炎剂或或免疫抑制剂组合。可用于组合疗法的治疗剂的实例将在下文的抗体用途部分更详细地描述。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何及所有溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等等。通常，载体适合于静脉内，肌内，皮下，肠胃外，脊椎或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，可以用材料包被活性化合物即抗体、其抗原结合部分、免疫缀合物或双特异性分子以保护化合物免受酸和其他自然条件(可以使所述化合物失活)的作用。
在一些实施方案中，本文的抗体可以中性形式(包括两性离子形式)存在或作为带正电荷或负电荷的物质存在。一些情况下，抗体可以与平衡离子复合以形成药学上可接受的盐。因此，本文的药物化合物可以包括一或多种药学上可接受的盐。
“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物(例如抗体)所需生物学活性并且不具有不想要的毒理学作用的盐(参见例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。例如，术语“药学上可接受的盐”包括一种复合物，其包括一或多种抗体以及一或多种平衡离子，其中所述平衡离子来源于药学上可接受的无机和有机酸和碱。
这类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的那些，所述无毒无机酸如盐酸，硝酸，磷酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，含磷的等等，以及来源于无毒有机酸的那些，所述无毒有机酸如脂肪族单羧酸和二羧酸，苯基取代的链烷酸，羟基链烷酸，芳香族酸，脂肪族和芳族硫酸等等。碱加成盐包括来源于碱土金属的那些以及来源于无毒有机胺的那些，所述碱土金属如钠，钾，镁，钙等等，所述无毒有机胺如N，N′-二苄乙二胺，N-甲基葡糖胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺，普鲁卡因等等。
此外，药学上可接受的无机碱包括金属离子。金属离子包括但不限于合适的碱金属盐，碱土金属盐和其他生理学可接受的金属离子。来源于无机碱的盐包括铝，铵，钙，钴，镍，钼，钒，锰，铬，硒，锡，铜，铁，亚铁，锂，镁，三价锰盐，二价锰，钾，铷，钠和锌，并且采用它们的常见化合价。
本文抗体的药学上可接受的酸加成盐可以从下列酸制备，包括但不限于蚁酸，醋酸，乙酰氨基苯甲酸，脂肪酸，抗坏血酸，硼酸，丙酸，苯甲酸，樟脑酸，碳酸，环拉酸，脱氢胆酸，丙二酸，依地酸，乙基硫酸，芬地柞酸(fendizoic acid)，偏磷酸，琥珀酸，乙醇酸，葡萄糖酸，乳酸，苹果酸，酒石酸，鞣酸，柠檬酸，硝酸，抗坏血酸，葡糖醛酸，马来酸，叶酸，富马酸，丙酸，丙酮酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯甲酸，盐酸，氢溴酸，氢碘酸，赖氨酸，异柠檬酸，三氟醋酸，扑酸，丙酸，邻氨基苯甲酸，甲磺酸，乳清酸，草酸，草酰乙酸，油酸，硬脂酸，水杨酸，氨基水杨酸，硅酸盐，p-羟基苯甲酸，烟酸，苯乙酸，扁桃酸，双羟萘酸，磺酸，甲磺酸，磷酸，膦酸，乙磺酸，乙二磺酸，铵酸，苯磺酸，泛酸，萘磺酸，甲苯磺酸，2-羟乙磺酸，对氨基苯磺酸，硫酸，硝酸，亚硝酸，硫酸一甲基酯，环己基氨基磺酸，β-羟基丁酸，甘氨酸，甘氨酰甘氨酸，谷氨酸，二甲基胂酸，二氨基己酸，樟脑磺酸，葡糖酸，硫氰酸，酮戊二酸，吡哆醛5-磷酸，氯苯氧乙酸，十一酸，N-乙酰-L-天冬氨酸，半乳糖二酸和半乳糖醛酸。
药学上可接受的有机碱包括三甲胺，二乙胺，N，N′-二苄乙二胺，氯普鲁卡因，胆碱，二苄基胺，二乙醇胺，乙二胺(ethylenediamine)，葡甲胺(N-甲基葡糖胺)，普鲁卡因，环胺，季铵阳离子，精氨酸，甜菜碱，咖啡因，克立咪唑(clemizole)，2-乙氨基乙醇，2-二乙氨基乙醇，2-二甲氨基乙醇，乙二胺(ethanediamine)，丁胺，乙醇胺，乙二胺(ethylenediamine)，N-乙基吗啉，N-乙基哌啶，乙基葡萄糖胺，葡萄糖胺，葡糖胺，组氨酸，海巴明(hydrabamine)，咪唑，异丙胺，甲基葡萄糖胺，吗啉，哌嗪，吡啶，吡哆醇，钕，哌啶，多胺树脂，普鲁卡因，嘌呤，可可碱，三乙胺，三丙胺，三乙醇胺，缓血酸胺，甲胺，牛磺酸，胆酸盐，6-氨基-2-甲基-2-庚醇，2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇，2-氨基-2-甲基-1-丙醇，脂肪族单羧酸和二羧酸，苯基取代的链烷酸，羟基链烷酸，芳香族酸，脂肪族和芳族磺酸，锶，三甲基甘氨酸，肼，苯基环己胺，2-(N-吗啉代)乙磺酸，双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，1，4-哌嗪二乙磺酸，3-吗啉代-2-羟基丙磺酸，1，3-双[三(羟甲基)甲氨基]丙烷，4-对氧氮己环丙磺酸，4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸，2-[(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸，N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸，4-(N-吗啉代)丁磺酸，3-(N，N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸，2-羟基-3-[三(羟甲基)甲氨基]-1-丙磺酸，4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)，哌嗪-1，4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸，N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)，N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸，N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸，N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸，2-(环己基氨基)乙磺酸，3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸，3-(环己基氨基)-1-丙磺酸，N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸，4-(环己基氨基)-1-丁磺酸，N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇，和缓血酸胺。
本文的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸，半胱氨酸盐酸盐，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯，丁羟茴醚(BHA)，丁羟甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸等等。
可用于本文的药物组合物的合适水性和非水性载体的实例包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等等)及其合适混合物，植物油，如橄榄油，和注射用有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，就分散剂来说通过维持需要的粒径以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物还可以包含佐剂如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。可以通过灭菌法(上文)和包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸，氯丁醇，苯酚山梨酸等等)来确保预防微生物的存在。还希望在组合物中包括等渗剂，如糖，氯化钠等等。此外，可以通过包括延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶来实现注射用药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散剂和用于无菌注射溶液或者分散剂的临用前制备的无菌粉剂。用于药学活性物质的这类介质和药剂的使用是本领域已知的。除非任何常规培养基或药剂与活性化合物不相容，其在本文药物组合物中的使用是可预期的。所述组合物中还可以掺入辅助活性化合物。
在制备和保存条件下，治疗组合物通常必须是无菌和稳定的。可以将组合物配制为溶液，微乳剂，脂质体，或其他适于高药物浓度的有序结构。所述载体可以是溶剂或者分散介质，包含例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液态聚乙二醇等等)和其合适的混合物。例如，通过使用包衣例如卵磷脂，就分散剂来说通过维持要求的粒径以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。多数情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或者氯化钠。通过在组合物中包括延缓吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶可以实现注射组合物的延长吸收。
根据需要，通过将所需量的活性化合物以及上面列举的成分之一或组合掺入合适的溶剂可以制备无菌的注射溶液，然后灭菌微量过滤。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体来制备分散剂，所述载体包含碱性分散介质和来自那些上面列举的所需其他成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂来说，制备方法包括但不限于真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这从先前其无菌滤液产生活性成分以及任意其他所需成分的粉剂。
根据接受治疗的对象和施用的具体方式，可以与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量将可以变化。与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量通常是产生治疗作用的组合物的量。通常，就100％来说，所述量的范围从约0.01％到约99％的活性成分，优选从约0.1％到约70％，最优选从约1％到约30％的活性成分组合药学上可接受的载体。
调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单个丸剂，数个分开的剂量可以随时间施用或者剂量可以按照治疗情况需要所示按比例减少或增加。特别有利的是配制剂量单位形式的肠胃外组合物，以便于施用和剂量的统一。本文使用的剂量单位形式是指适合作为待治疗对象的单位剂量的物理分离单位；每个单位包含预定量的活性化合物(计算为产生所需的治疗作用)组合所需的药物载体。本文剂量单位形式的规格由以下因素确定并直接取决于它们：(a)活性化合物的独特性质和待实现的特定治疗作用，和(b)将这类活性化合物制成复方物用于治疗个体敏感性领域的固有限制。
为了施用抗体，剂量范围从约0.0001到100mg/kg，更常见是0.01到5mg/kg的宿主体重。例如剂量可以是0.3mg/kg体重，1mg/kg体重，3mg/kg体重，5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1到10mg/kg的范围内。示例性的治疗方式需要施用每周一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每3个月一次或每3到6个月一次。用于本文抗刻缺蛋白-1抗体或其抗原结合部分的给药方案包括例如1mg/kg体重或3mg/kg体重，通过静脉内施用指定抗体，利用下列给药方案之一：(i)每四周6次剂量，然后每3个月；(ii)每3周；(iii)3mg/kg体重一次，然后是1mg/kg体重每3周。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下施用的每种抗体的剂量属于指明范围内。抗体通常施用多次。单次剂量之间的间隔可以是例如周，月，每3个月或年。间隔也可以是不规律的，根据测量患者中针对靶抗原的抗体血液水平来确定。在一些方法中，调节剂量以实现约1到1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中是约25到300μg/ml。
或者，抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下需要频率较低的施用。剂量和频率根据患者中抗体的半衰期而改变。通常，人抗体显示最长的半衰期，然后是人源化抗体，嵌合抗体，和非人抗体。施用剂量和频率可以改变，这取决于治疗是预防还是治疗性的。在预防性应用中，在长时间内以相对低频率的时间间隔施用相对低剂量。一些患者在他们的余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短的时间间隔内给药相对高的剂量直到疾病进展被减轻或者终止，优选直到患者显示疾病症状的部分或者完全改善。此后，患者可以采用预防方式施用。
本文的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以是不同的，以便获得能有效实现针对特定患者、组合物和施用方式的所需治疗应答并且对患者没有毒性的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括使用的本文特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，使用的特定化合物的排出率，治疗持续时间，其他药物，与使用的特定组合物联用的化合物和/或材料，被治疗患者的年龄，性别，体重，病症，全身健康状况和既往病史，以及医药领域公知的类似因素。
本文抗刻缺蛋白抗体的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状严重性的减轻，无疾病症状周期频率和持续时间的增加，或防止疾病折磨造成的损害或失能。例如，为了治疗刻缺蛋白-1阳性肿瘤，“治疗有效剂量”优选相对于未接受治疗对象抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，和仍然更优选至少约80％。可以在预测对人肿瘤功效的动物模型系统中鉴定化合物抑制肿瘤生长的能力。或者，组合物的这种性质可以利用技术人员已知的测定法检查化合物抑制(如体外抑制)能力来鉴定。治疗有效量的治疗化合物可以减少肿瘤大小，或另外改善对象的症状。本领域普通技术人员将能够基于如下因素确定所述量：对象的大小，对象症状的严重性，以及具体组合物或选择的施用途径。
可以使用本领域已知的一或多种众多方法通过一或多种施用途径来施用本文的组合物。技术人员将理解，施用途径和/或模式将根据所需结果而改变。用于本文抗体或其抗原结合部分的施用途径包括静脉内，肌内，皮内，腹膜内，皮下，脊椎或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。本文使用的短语“肠胃外施用”表示除了肠和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内，肌内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，可以通过非肠胃外途径如局部，表皮或粘膜施用途径，例如鼻内，口服，阴道，直肠，舌下或局部施用本文的抗体或其抗原结合部分。
活性化合物可以与防止化合物快速释放的载体(如控释剂，包括植入物、透皮片和微囊输送系统)一起制备。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚正酯和聚乳酸。制备这类制剂的许多方法是授予专利的并为本领域技术人员公知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
本文的用途和方法
本文的抗体，尤其是人抗体，抗体组合物和方法具有众多体外和体内诊断和治疗应用，涉及刻缺蛋白-1介导病症的诊断和治疗。例如，可以给培养细胞(体外或离体)，或给人类对象(例如体内)施用这些分子以治疗、预防和诊断各种病症。本文使用的术语“对象”旨在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物，绵羊，狗，猫，牛，马，鸡，两栖动物和爬行动物。优选对象包括患有刻缺蛋白-1活性介导的病症的人患者。所述方法尤其适于治疗患有与异常刻缺蛋白-1表达或活化有关的病症的人患者。当施用针对刻缺蛋白-1的抗体以及另一药剂时，这两种可以顺序或同时施用。
考虑到本文抗体对刻缺蛋白-1的特异性结合，本文的抗体可用于特异性检测细胞表面刻缺蛋白-1表达，此外，可用于通过免疫亲和纯化来纯化刻缺蛋白-1。
此外，本文的抗体，抗体组合物和方法可用于治疗具有异常细胞生长(例如癌症)的对象。在一个具体实施方案中，癌症是T-ALL。在另一个具体实施方案中，癌症是乳腺癌。
可以通过本发明抗体治疗的异常细胞生长的其他类型包括例如间皮瘤，肝胆管(肝和胆管)，原发或继发CNS肿瘤，原发或继发脑瘤，肺癌(NSCLC和SCLC)，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内黑色素瘤，卵巢癌，结肠癌，直肠癌，肛区癌症，胃癌，胃肠的(胃的，结肠直肠的，和十二指肠的)，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，Hodgkin′s病，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，睾丸癌，慢性或急性白血病，慢性髓样白血病，淋巴细胞性淋巴瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)的肿瘤，原发CNS淋巴瘤，非hodgkins′s淋巴瘤，脊椎轴肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，肾上腺皮质癌，胆囊癌，多发性骨髓瘤，胆管癌，纤维肉瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，或一或多种上述癌症的组合。
体内和体外施用本文的抗体组合物(例如人单克隆抗体，多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)或其抗原结合部分的合适途径是本领域公知的，可以由普通技术人员选择。例如，可以通过注射(例如静脉内或皮下)施用抗体组合物。所用分子的合适剂量将取决于对象的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或配方。
如先前所述，本文的人抗刻缺蛋白-1抗体或其抗原结合部分可以与一或多种其他治疗剂(例如细胞毒剂，放射性毒剂或免疫抑制剂)共施用。抗体可以与药剂连接(作为免疫复合物)或可以与药剂分开施用。就后一情况来说(分开施用)，可以在所述药剂之前，之后或与其同时施用抗体，或与其他已知疗法(例如抗癌疗法，例如放疗)共施用抗体。这类治疗剂包括抗肿瘤剂如多柔比星(阿霉素)，顺铂硫酸博来霉素，亚硝脲氮芥，苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲，它们自身只在对患者有毒性或亚毒性的水平才有效。顺铂可以100mg/剂量静脉内施用，每4周1次，而阿霉素可以60到75mg/ml剂量静脉内施用，每21天1次。本文的人抗刻缺蛋白-1抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共施用提供两种通过不同机制起作用的抗癌剂，这产生针对人肿瘤细胞的细胞毒作用。这类共施用可以解决抗药性的产生或肿瘤细胞抗原性的变化(使得它们对抗体不反应)导致的问题。
试剂盒
还属于本文范围的是试剂盒，包括本文的抗体组合物(例如人抗体，双特异性或多特异性分子，或免疫缀合物)和使用说明。试剂盒可以进一步包含一或多种额外试剂，如免疫抑制剂，细胞毒剂或放射性毒剂，或一或多种本文的额外抗体或其抗原结合部分(例如具有互补活性的人抗体，其结合刻缺蛋白-1抗原的表位，不同于第一人抗体)。
因此，用本文的抗体组合物治疗的患者可以额外施用(在施用本文人抗体之前，同时或之后)另一治疗剂，如细胞毒剂或放射性毒剂，其加强或增强人抗体的治疗作用。
通过下列实施例进一步说明本文内容，其不应被理解为进一步的限制。所有附图以及在整个申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容明确援引加入本文。
实施例
实施例1：刻缺蛋白1免疫原的产生和表达
刻缺蛋白1免疫原表达构建体的产生
通过用于单克隆抗体(mAb)产生的多重PCR来产生免疫原构建体(图1)。如图1所示，使用刻缺蛋白1全长cDNA克隆作为模板(OriGene，Cat.No.TC308883，Rockville，MD)并按照制造商的方案使用高保真PCR试剂系统(Roche，Indianapolis，IN)通过多重重叠PCR合成刻缺蛋白1免疫原cDNA。将重组刻缺蛋白1免疫原cDNA(包含N端前导肽，EGF样重复35-36，NRR，(包括LinA，B和C结构域以及HD结构域)和胞内序列的小部分)克隆入Fc融合蛋白载体，其中刻缺蛋白1免疫原融合到Fc序列的N端。刻缺蛋白1免疫原质粒，被称为N1-NRR-TM(-)，包含图11序列1所示的cDNA插入物(SEQ ID NO：1)，其编码图11序列2所示的免疫原蛋白(SEQ ID NO：2)。
如图2所示平行构建类似的质粒，其包含与N1-NRR-TM(-)相同的序列，除了使用跨膜(TM)序列(序列4中最后24个氨基酸残基)置换N1-NRR-TM(-)的胞内序列(序列2中最后44个氨基酸残基)。将这个PCR扩增的刻缺蛋白1免疫原cDNA克隆入pcDNA3.1D/V5-His(Invitrogen)。该质粒称作N1-NRR-TM(+)。N1-NRR-TM(+)的核酸序列和氨基酸序列示于图12的序列3(SEQ ID NO：3)和4(SEQ ID NO：4)。
刻缺蛋白1免疫原蛋白的表达和纯化
使用FreestyleTM Max Reagent(Invitrogen)和制造商的方案，通过瞬时转染在FreestyleTM 293-F细胞(Invitrogen，Inc.，Calsbad，CA)中表达N1-NRR-TM(-)，并通过Western印迹分析验证。简单来说，将1X107个细胞种于包含30毫升(ml)293-F细胞生长培养基(Invitrogen)的组织培养摇瓶。通过在转染后第2到7天每24小时取0.5ml条件培养基的等分分析分泌的蛋白。将20微升(ul)条件培养基和2X蛋白上样缓冲液(BioRad，Hercules，CA)混合，在100℃加热5分钟。通过在4-12％梯度SDS-PAGE(Invitrogen)中电泳来分离样品。通过使用干印迹装置(Invitrogen)将蛋白从凝胶转移到印迹膜，然后用溶于PBST的5％脱脂奶粉(PBS，含0.05％tween-20)将膜封闭1小时。通过与人γFc-特异性的、HRP缀合抗体(Bethyl Lab.Inc.Montgomery，TX)温育来进行N1-MRRHD-TM(-)/Fc融合蛋白的检测。在用SupersignalChemiluminescent Substrate(Pierce，Rockford，IL)显色前，将膜用PBST清洗3次。蛋白表达时程研究显示，5-6天培养的条件培养基包含最多的分泌的N1-NRR-TM(-)/Fc融合蛋白。因此，将N1-NRR-TM(-)/Fc蛋白表达放大到10升培养体积，并通过G蛋白亲和柱(Invitrogen)来纯化蛋白。
建立表达刻缺蛋白1免疫原的细胞系
将N1-NRR-TM(+)稳定转染小鼠细胞系L-929(ATCC，CCL-1，Manassas，VA)，表达为细胞表面膜锚定蛋白。使用LipoFectamineTM 2000(Invitrogen)通过转染建立稳定的细胞系，并使用1mg/ml新霉素(G418)来选择细胞约9-15天，直至肉眼可见单个集落并挑选用于克隆生长。使用从每个稳定转染克隆制备的蛋白提取物通过Western印迹来评价N1-NRR-TM(+)/V5蛋白的表达水平。更具体地，从培养容器取出每个克隆的细胞，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗并且如上所述进行Western印迹分析。通过HRP缀合的抗V5抗体(Invitrogen)检测蛋白。选择表达最高水平N1-NRR-TM(+)蛋白的细胞克隆用于基于免疫和细胞的抗体结合测定。
实施例2：刻缺蛋白1mAb的产生
免疫和杂交瘤克隆
使用人刻缺蛋白1免疫原N1-NRR-TM(-)和长期免疫方案来免疫Balb/c小鼠。通过皮下(sc)注射20微克(μg)混入完全弗氏佐剂(CFA)乳液的抗原进行第一次免疫，然后是两周一次的sc注射共3次，每次输送20μg混入不完全弗氏佐剂(IFA)乳液的抗原。在第四次抗原注射后一周抽取血清，通过ELISA检验抗体效价。处死具有高应答效价的小鼠并手术取出脾用于杂交瘤克隆。
通过将脾通过100微米不锈钢筛，然后通过细胞滤过器，并用30mlRPMI清洗两次，制备脾细胞的单细胞悬液。将脾细胞与Sp2/0-Ag14细胞(Sigma，St.Louis，MO)按照3∶1的比例混合，并通过添加50％PEG-1500和温和搅拌来促进细胞融合。通过离心沉淀细胞混合物，并用RPMI温和清洗，然后在含20％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基中37℃温育30分钟。将细胞悬浮于RPMI-1640(包含20％FCS，标准HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷)，25％脾条件培养基，2mM谷氨酸和100ug/ml Pen-Strip，(Invitrogen；Calsbad，CA))，分配到96孔板，并在37℃/5％CO2培养箱中培养8到20天以允许建立HAT抗性杂交瘤克隆。来自每个杂交瘤克隆的条件培养基被用于ELISA筛选。
单克隆抗体(mAb)的ELISA筛选
酶联免疫吸附测定(ELISA)利用NuncTM MaxiSorp 96孔板(ThermoFisherScientific，Rochester，NY)进行，其制备为两组：阳性测试板和阴性对照板，阳性测试板用每孔100ng的N1-NRR-TM(-)/Fc蛋白包被过夜，阴性对照板用100ng人Fc蛋白包被。针对来自杂交瘤克隆的条件培养基筛选它们结合N1-NRR-TM(-)/Fc蛋白的能力。将100微升每种杂交瘤上清液添加到包被的板，并在室温下温育1小时。用PBST(1X PBS，含0.05％Tween-20)将孔清洗3次。添加偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠Fc抗体来检测与抗原结合的mAb。用PBST清洗3次(每次清洗200μl每孔)来洗掉过量的HRP。然后添加ABTS(2，2′-连氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸])溶液作为HRP显色的底物。终止反应并通过板读数器在405nm扫描板。阳性孔用包被N1-NRR-TM(-)/Fc蛋白的板再次筛选并按照如上所述的相同方式用包被人Fc的板进行反筛选。只结合N1-NRR-TM(-)/Fc蛋白但不结合人Fc的杂交瘤mAb是真正的刻缺蛋白1结合抗体，选择其以进行功能筛选。
实施例3：刻缺蛋白1拮抗剂mAb的鉴定和表征
建立荧光素酶报道分子测定细胞系
荧光素酶报道分子测定通常用于评价各种环境下刻缺蛋白1受体介导的信号转导和转录活性(Weng，A.P.，et.al，Science，2004，9265-9273；Osipo etal.，Oncogene，2008，27(37)：5019-5032)。为了测定配体诱导的刻缺蛋白1活化和mAb抑制，开发出工具细胞系来增强刻缺蛋白信号转导。已经明确由胞内结构域组成的刻缺蛋白受体的活性形式易位到细胞核，并与CSL[以CBF1，Su(H)和LAG-1命名]结合因子1(其结合基因启动子区中被称为CSL结合基序的核心序列)形成复合物，活化下游基因转录(Bray，2006)。基于这些发现，产生刻缺蛋白1介导的荧光素酶报道分子质粒。简单来说，将Tun等描述的8个CSL结合基序的多联体(Tun et al.，Nucleic Acids Res.1994m22(6)：965-971)插入pTA-Luc(BD Biosiences，Palo Alto，CA)的多克隆位点。将潮霉素选择标记(见下段)添加到荧光素酶基因下游。这产生荧光素酶报道分子质粒CSLuc。
全长刻缺蛋白1表达构建体获自OriGene(Rockville，MD)，通过测序证实与NM_017617.2(NCBI/GenBank登录号)相同。从pcDNA3.1/Hygromycin(Invitrogen)PCR合成具有SV40启动子的潮霉素选择标记，并通过标准PCR连接法连接到来自pcDNA5/RFT/V5-His(Invitrogen)的生长激素3′poly-A信号序列。将完整的潮霉素标记插入刻缺蛋白1表达质粒的Cla I位点。该质粒被重命名为刻缺蛋白1/Hyg。为了增强刻缺蛋白1活性，通过定点诱变(Genewiz，South Plainfield，NJ)从刻缺蛋白1/Hyg上缺失PEDT结构域(Weng，A.P.，et.al，Science，2004，9265-9273 et.al.)。所获质粒被命名为刻缺蛋白1-dPEST。人Jagged1 cDNA质粒获自Open Biosystems(Huntsville，AL)。Jagged1编码区是PCR合成的，并插入pcDNA3.3-TOPO表达载体(Invitrogen)。
根据制造商的方案使用LipoFectamine 2000(Invitrogen)，通过将刻缺蛋白1/hyg和CSLuc质粒共转染U2-OS(ATCC Number HTB-96，Manassas，VA)细胞或将刻缺蛋白1-dPEST和CSLuc共转染293T(ATCC NumberCRL-11268，Manassas，VA)细胞产生刻缺蛋白1依赖性测定细胞系。通过在DMEM生长培养基(Invitrogen)中针对200～800μg/ml潮霉素来克隆选择稳定转染的细胞，按照实施例1描述的Western印迹分析和下面部分描述的荧光素酶报道分子测定来筛选细胞克隆。选择具有相对高水平的刻缺蛋白1表达(基于Western印迹)和Delta样-4(Dll4)诱导的荧光素酶活性的细胞系用于功能测定。两种这类示例细胞系是U2-OS/刻缺蛋白1-CSLuc(绰号：N1CU3)和293/刻缺蛋白1-dPEST-CSLuc(绰号：N1dP-c16)。通过类似方法，从亲代细胞系Hela(ATCC编号CCL-2)产生稳定表达人Jagged1的细胞系。该细胞系被称为Hela/JAG1。
刻缺蛋白1拮抗性杂交瘤克隆的荧光素酶报道分子测定和鉴定
为了鉴定刻缺蛋白1抑制性杂交瘤克隆，进行荧光素酶报道分子测定以评价N1CU3细胞中Dll4诱导的刻缺蛋白1活性。用每孔50到100纳克(ng)重组Dll4(R&D Systems，Minneapolis，MN)包被96孔组织培养板(BDBioscience)。以50,000个细胞每孔将N1CU3细胞种于包被Dll4或BSA的板，同时添加30到50ul来自杂交瘤克隆的条件培养基，培养24到40小时。培养结束时，在去除全部培养基后将细胞在1X Passive Lysis Buffer(Promega，Madison，WI)中直接裂解，按照制造商的方案使用Bright-GloTM荧光素酶测定系统(Promega，Madison，WI)和MicroLumat Plus LB 96V光度计(Berthhold Technologies，Bad Wildbad，Germany)测定荧光素酶报道分子活性。将对Dll4诱导的刻缺蛋白报道分子活性具有统计上显著抑制的杂交瘤上清液按照制造商的方案通过G蛋白柱(Pierce，Rockford，IL)进行亲和纯化。将纯化的mAb再次通过荧光素酶报道分子测定进一步分析以证实对刻缺蛋白1依赖性信号转导的抑制功能。
通过荧光素酶报道分子测定表征抗刻缺蛋白1mAb
在抑制刻缺蛋白1介导的信号转导的mAb中，一种mAb(N248A)显示最有效的抑制活性，其通过数种不同的荧光素酶报道分子测定来详细表征。图3显示当在培养板表面包被Dll4以诱导刻缺蛋白信号转导时，mAbN248A具有比同类mAb(mAb-C)高得多的抑制Dll4配体诱导的刻缺蛋白1信号转导的功效。测定中使用293/刻缺蛋白1-dPEST-CSLuc细胞。y轴数字是荧光素酶报道分子活性读数。
为了鉴定mAb N248A是否可以抑制其他刻缺蛋白配体诱导的信号转导，将Hela/Jagged1细胞和N1dP-c16细胞共培养并进行如上所述的荧光素酶报道分子测定。mAb N248A实际上完全抑制Jagged1诱导的刻缺蛋白1信号转导(图4)。
实施例4：确定抗体结合亲和力
使用HBSP运行缓冲液(Biacore AB，Uppsala，Sweden-现在GEHealthcare)加1mM CaCl2，在装备研究级传感器芯片(芯片类型：CM5)的表面等离子体共振Biacore 3000装置上测量抗刻缺蛋白1mAb N248A与刻缺蛋白1抗原的物理结合亲和力。使用标准N-羟基琥珀酰亚胺/乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺(NHS/EDC)化学法，将A蛋白以饱和水平胺偶联于芯片上。在所有3个流动池中，以40，13，4ug/ml的A蛋白将N1-NRR-TM(-)Fc蛋白(描述于实施例1)捕获于芯片表面。将抗刻缺蛋白1mAb N248A按3倍系列稀释，以100μl/分钟注射1分钟。监测解离共20分钟。在每次滴定的最后一次注射后，用100mM磷酸进行两次30秒脉冲来再生芯片。缓冲液循环为双参比数据提供空白对照，然后使用Biaevaluation软件v.4.1将其整体拟合到简单结合模型。从动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推导出亲和力。数据显示mAb N248A具有Kon＝5.19e-5(Ms)，Koff＜1.7e-4(1/s)和KD＜0.33nM。紧密结合(tight)的KD由快的Kon和非常慢的Koff造成，所述Koff比我们测定法可分辨的(参照5％规则，Biacore 3000手册)还慢。
实施例5：刻缺蛋白1拮抗性mAb结合表位的分析
通过与人刻缺蛋白2的结构域交换对mAb结合表位作图
为了理解刻缺蛋白1拮抗性mAb的作用机制，通过结构域交换和ELISA结合测定来分析刻缺蛋白1拮抗性mAb的结合表位。刻缺蛋白1-NRR-TM(-)/Fc蛋白被分成6个结构域：EGF(包含EGF35-36)，Lin12-A(或Lin-A)，Lin-B，Lin-C，异二聚化结构域-N(或HD-N)和HD-C(图)。在一系列嵌合刻缺蛋白1-NRR-TM(-)/Fc表达构建体中，通过PCR合成将每个结构域交换为对应于人刻缺蛋白2的。如上文实施例1所述，利用FreestyleTM MaxReagent(Invitrogen)，将结构域交换质粒转染FreestyleTM 293-F细胞(Invitrogen，Inc.，Calsbad，CA)。培养3天后，将条件培养基用于通过刻缺蛋白1mAb的Western印迹分析和ELISA结合测定。Western印迹(如实施例1所述方法)显示6个结构域交换构建体中的5个表达良好，除了Lin-B/刻缺蛋白2交换表达较差。
在ELISA测定中，将来自上述抗原质粒-转染细胞培养物的100微升条件培养基加到96孔板的每孔，将板在室温下温育4小时或4℃过夜。然后从包被的板去除条件培养基。为了进行一抗结合，将溶于100微升PBS的300ng每种mAb(表3)添加到包被的孔。ELISA方法的剩余步骤与实施例2描述的相同。mAb N99a，N326A和N440A是结合刻缺蛋白-1的单克隆抗体，通过与mAb N248A相同的步骤产生和分离。如表3所示，当Lin-A或HD-C结构域被交换为相应刻缺蛋白2结构域时，mAb N248A与嵌合抗原的结合被完全消除。另一方面，EGF，Lin-C或HD-C结构域的交换不影响其结合。mAb N326A和N440A明显不同于mAb N248A。这两种mAb需要HD-N和HD-C结构域用于它们的结合活性。N99A有点类似于mAb N248A，因为其结合需要Lin-A和HD-C结构域。但是，HD-N结构域的交换也降低N99A结合活性。这些数据支持以下结论，mAb N248A具有至少两组可区分的结合表位，一个位于Lin-A结构域，另一个位于HD-C结构域。在单独的实验中解析Lin-B结构域中是否存在另一个表位。类似地，所有其他3个刻缺蛋白1拮抗性mAb具有两组可鉴别的结合表位，一个位于HD-C结构域，另一个位于刻缺蛋白1N端亚单位的结构域。基于最近公开的刻缺蛋白1(Gordon，WR et al.，Blood，2009，Volume 113，4381-4390)和刻缺蛋白2(Gordon et al.，Nature Structure Molecular Biology，2007，Volume 14，295-300)NRR区域的晶体结构，3个Lin12结构域环绕HD结构域，阻断ADAM蛋白酶的随机切割和活化，因此将受体维持在非活性或沉默状态。mAb N248A在两个不同的表位组结合刻缺蛋白1，造成刻缺蛋白1被锁定在沉默构象，因此防止受体被其配体活化。
已经报道了在超过50％的T-ALL中的刻缺蛋白1基因突变，主要是点突变和一些小的缺失和插入(Weng，A.P.，et.al，Science，2004，9265-9273；Malecki et al.，Molecular Cell Biology，2006，26(12)：4642-4651)。所述突变聚集在两个区域：一个在胞内部分的C端，另一个在HD-N结构域。这些发现支持以下观点，mAb N248A在T-ALL中应当比表3所列其他3种mAb具有更好的治疗应用，因为HD-N结构域交换不影响mAb N248A与刻缺蛋白1的结合，而其他3种的结合受到影响(参见表3)。
表3.刻缺蛋白1mAb结合嵌合抗原的ELISA读数
Figure BPA00001514555100521
N248A结合人刻缺蛋白1，但不结合小鼠刻缺蛋白1
为了定位N248A1的结合表位，我们产生鼠刻缺蛋白1-NRRHD表达质粒，其包含核苷酸1-99和核苷酸4327到5169(NCBI登录号NM_008714)的小鼠刻缺蛋白1cDNA编码区，并进行瞬时转染和ELISA结合测定(方法描述于前面部分，实施例1和5)。结果显示N248A1不结合小鼠刻缺蛋白1，只结合人刻缺蛋白1(表4)。我们进一步制备结构域交换的嵌合刻缺蛋白1-NRRHD表达构建体，使用人刻缺蛋白1-NRRHD序列(核苷酸1-129和4338-5202，NCBI登录号NM_017617)作为构架，系统地用相应的小鼠结构域替换人Lin-A，Lin-B或HD-C结构域。使用这种人/小鼠结构域交换蛋白作为诱饵的ELISA结合测定显示，当Lin-A结构域被替换为小鼠序列时，N248A1与人刻缺蛋白1抗原的结合被消除，而Lin-B或HD-C结构域替换不影响结合。相反，其他对照mAb，22F7，只有当Lin-B被替换为小鼠序列时才丧失结合。因此，决定N248A1只结合人刻缺蛋白1而不结合小鼠的结合表位位于Lin-A结构域。
表4.刻缺蛋白1mAb结合人，小鼠和嵌合抗原的ELISA读数
Figure BPA00001514555100531
鉴定Lin-A结构域中N248A1的结合表位
为了鉴定Lin-A结构域中N248A1的结合表位，我们突变了在人和小鼠Lin-A结构域之间不同的两个氨基酸，即1457E/A和1465S/N(表5)。ELISA结果显示，突变1457E/A不影响结合，但突变1465S/N消除结合，表明小鼠Lin-A的氨基酸Asn(N)是负责阻断N248A1结合小鼠刻缺蛋白1的唯一氨基酸残基。相继将1465S周围的数个氨基酸突变为丙氨酸(表5)。1463V/A，1466L/A或1467Q/A突变也消除N248A1结合。但是，对照mAbA2不受突变1463V/A或1465S/N的影响(表5)。这些实验显示，Lin-A中N248A1的结合表位包含1463V，1465S，1466L和1467Q。
表5.N248A1点突变和ELISA结合活性的分析
Figure BPA00001514555100532
Figure BPA00001514555100541
鉴定HD-C结构域中N248A1的结合表位
通过相继交换刻缺蛋白1序列与刻缺蛋白2序列的氨基酸簇来产生一系列5个亚结构域交换嵌合抗原(表6)。ELISA结果显示，亚结构域交换-1显著降低N248A1结合，而其他4个亚结构域交换抗原不影响N248A1结合。另一方面，平行对照mAb 19H7显示对亚结构域交换1，3和5的显著结合亲和力降低(表6)。通过Western印迹分析(上文方法)证实条件培养基中所有亚结构域交换抗原表达和分泌。所有亚结构域交换抗原(除了亚结构域交换5以外)具有与人刻缺蛋白1-NRRHD(huN1-NRRHD)蛋白相等或比其更高的表达。基于Western印迹条带强度比较(数据未显示)，亚结构域交换5表达大约50％水平的huN1-NRRHD。这些实验显示，HD-C中N248A1的结合表位包含5个氨基酸，1705G，1706A，1707L，1709S和1710L(人刻缺蛋白1编码cDNA序列，NCBI登录号NM_017617)，如表6突出显示。
表6.刻缺蛋白1mAb结合人刻缺蛋白1-NRRHD和具有与刻缺蛋白2序列交换的亚结构域的嵌合抗原的ELISA读数
Figure BPA00001514555100551
实施例6：细胞培养时刻缺蛋白1mAb抑制癌细胞生长
mAb N248A抑制HPB-ALL白血病细胞生长和降低NICD
T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)细胞系，HPB-ALL，来源于儿童期T-ALL(Morikawa et al.，Int J.Cancer，1978，21(2)：166-70)，获自DSMZ(Braunschweig，Germany)。该细胞系携带刻缺蛋白1突变，其导致高水平的刻缺蛋白1胞内结构域(NICD)，刻缺蛋白1的活性形式，这是增强的gamma分泌酶切割的结果。为了进行生长抑制测定，在添加10％FBS(Invitrogen)的RPMI1640培养基中将HPB-ALL细胞以10,000个细胞/孔种于96孔板。在开始时添加系列稀释的mAb N248A或D16A，将细胞在37℃培养7天。培养结束时，向细胞中添加含0.1mg/ml刃天青(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，将板在37℃温育4小时。利用激发＝560nm和发射＝590nm的对偶滤波器读取荧光信号。利用GraphPad Prism(GraphPadSoftware，Inc.，La Jolla，CA)中的S剂量-反应(变斜率)计算IC50值。
为了进行体外NICD分析，将HPB-ALL细胞按照2×106个细胞每孔种于6孔板并在含10％FCS(Invitrogen)的RPMI1640中培养。按照图6所示的不同浓度向培养物中添加mAb N248A或对照抗体D16A。在存在抗体的条件下将细胞在37℃培养24小时。然后收集细胞并在冷的1X细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technologies，Boston MT)中裂解。通过在4℃以13,000rpm离心10分钟从细胞裂解物提取蛋白。使用BCA测定法(Pierce，Rockford，IL)确定蛋白浓度。通过western印迹分析确定每个样品的NICD水平。
在每次western印迹分析中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(BioRadLaboratories，Hercules，CA)来解析约50μg裂解物，转移到硝酸纤维素膜，其进行免疫印迹分析，利用兔抗NICD抗体(Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA)和小鼠α肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。使用IRDye 680或800偶联二抗(LI-COR Biosciences，Lincoln，NE)来显示Western印迹条带。使用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences，Lincoln，NE)分析图像。
结果显示，mAb N248A对HPB-ALL细胞生长的抑制与NICD水平的降低有关。在治疗24小时时，mAb N248A以剂量依赖性方式降低NICD水平，在30μg/mL观察到最高的降低。治疗7天后，mAb N248A引起显著的细胞生长抑制。细胞生长抑制的IC50值是大约0.78μg/ml或～5.2nM。
乳腺癌细胞生长的抑制
文献明确记载了刻缺蛋白1的表达在乳腺癌中异常增加(Reedijk et al.Cancer Research，2005，65(18)：8530-8537；Klinakis et al.，2006；Efstratiadis etal.，Cell Cycle，2007，6(4)：418-429)，这与较差存活率有关(Reedijk et al.Cancer Research，2005，65(18)：8530-8537)。在乳腺组织中表达刻缺蛋白1活化形式的转基因小鼠中，几乎所有小鼠在一年内患有乳腺癌(Hu et al.，American Journal of Pathology，2006，168(3)：973-990)。为了验证阻断刻缺蛋白1介导的信号转导将抑制乳腺癌细胞生长的假设，在存在10μg/ml mAbN248A抗体，赫赛汀(Genentech/Roche，South San Francisco，CA)或对照小鼠免疫球蛋白G(mIgG)的条件下，培养数种乳腺癌细胞系。所有细胞在含1％FCS的RPMI 1640(Invitrogen)中培养2-3天。通过Cell Titer GlowTM(Promega)定量活细胞，并用MicroLumat Plus LB 96V光度计(Berthhold Technologies，Bad Wildbad，Germany)进行扫描。对于同组乳腺癌细胞，通过FACS分析细胞表面上刻缺蛋白1和Jagged1的表达。结果显示，mAb N248A对乳腺癌细胞的生长抑制与刻缺蛋白1和Jagged1表达水平大致相关。mAb N248A显示对MDA-MB-231细胞的最强抑制，所述细胞表达相对高水平的刻缺蛋白1和Jagged1。有趣地是，与亲代BT475细胞系相比，BT475细胞来源的Heceptin抗性的细胞系BT475HR显示增加的刻缺蛋白1和Jagged1表达。mAb N248A抑制BT475HR细胞生长，而Heceptin不抑制。该数据显示mAbN248A在乳腺癌(其具有增加的刻缺蛋白1表达或对现有药物Heceptin具有抗性)的治疗性治疗中的潜在应用。
表7.抗刻缺蛋白1mAb，N248A的肿瘤细胞生长抑制测定。表达指数表示在乳腺癌细胞用抗刻缺蛋白1或抗Jagged1抗体免疫染色后FACS几何平均值的倍数增加。相对细胞增殖指数表示未添加任何试剂的平行培养的对照细胞的百分比。BT-474HR是来源于BT-474(ATCC)的赫赛汀抗性细胞系。
表7
Figure BPA00001514555100571
为了证实N248A对乳腺癌细胞的生长抑制是通过阻断刻缺蛋白信号转导来介导的，通过定量逆转录酶-聚合酶链反应(QRT-PCR)评价两种公知的刻缺蛋白下游靶基因的表达。在N248A或对照mAb存在条件下培养MDA-MB-231细胞两天，然后使用RNAeasy试剂盒和方案(Qiagen)收集细胞以分离总RNA。结果显示，mAb N248A确实阻断HES1和HES4表达(图7)，证实了N248A的作用机制。
实施例7：在鼠异种移植肿瘤模型中刻缺蛋白1mAb抑制T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)
刻缺蛋白1mAb对T-ALL肿瘤生长的抑制
为了建立小鼠模型T-ALL异种移植模型，从Charles River Laboratories(Wilmington，MA)获得免疫受损的无胸腺雌性裸鼠(Nu/Nu)(平均20克，6-8周龄)，根据国际实验动物评估与认证委员会(Association for the Assessmentand Accreditation for Laboratory Animal Care，International)的指南，置于特定的不含病原体的条件下。给动物提供可以随意获得的无菌啮齿类食物和水。所有体内研究都在获准的机构实验动物管理和使用方案下进行。
在植入宿主小鼠之前从新鲜培养物收集HBP-ALL细胞，清洗一次，用无菌不含血清的培养基重悬。将细胞悬液调节到合适密度并添加50％Matrigel(BD Biosciences，San Jose，CA)以便于肿瘤提取。将200μL总共5-10×106个细胞皮下植入小鼠后肋区，在施用用于每次实验的抗体前允许长到规定尺寸。
为了进行抗肿瘤功效研究，将载有150-300mm3HPB-All肿瘤的动物随机分为4组，分别接受1mg，3mg和10mg每千克(kg)的N248A或接受5mg每kg的对照抗体D16A。每周一次皮下注射mAb，共2周。每2-3天获得动物体重和肿瘤测量值。用游标卡尺测量肿瘤体积(mm3)并使用以下公式计算：长度(mm)×宽度(mm)×宽度(mm)×0.4。使用研究最后一天药物治疗和载体治疗小鼠的肿瘤体积来计算5％抑制值，为100-{1-[(治疗的最后一天-治疗的第一天)/(对照的最后一天-对照的第一天)]}。对于所有肿瘤生长抑制(TGI)实验，每个剂量组使用8到10只小鼠。使用Student′s t检验确定P。
如图8所示，刻缺蛋白1mAb，N248A，在11天治疗后(即两周剂量)在该模型中显示明显的抗肿瘤活性。与对照mAb组相比，10mg/kg组中平均肿瘤生长抑制(TGI)大于77％，其在统计学意义上是高度显著的(P＜0.01)。TGI是大致剂量依赖性的，除了以下例外：两个较低剂量组，1mg/kg和3mg/kg，非常接近以致无法区分。这种现象的确切原因是不清楚的，尽管有可能归因于该模型肿瘤大小的高变异性。N248A，作为人刻缺蛋白1特异性抑制剂，在小鼠中良好耐受，在任意治疗组中都没有引起显著的体重减轻，发病或死亡。
小鼠中刻缺蛋白1mAb的药物代谢动力学和药物动力学(PK/PD)
为了进行PK/PD研究，给载有300-800mm3大小范围肿瘤的小鼠通过皮下注射施用单剂量的5mg/kgN248A。在施用N248A后，在6，16小时，和1，2，3，5天的时间点安乐死小鼠。使用注射器从左心室抽取血液样品并转移到用硫酸肝素预处理的管中。同时，通过切除术取出肿瘤，速冻并在冷的1X细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technologies，Boston MT)中匀浆。从肿瘤裂解物提取蛋白，使用如上所述的western印迹分析确定每个肿瘤样品的NICD水平。将血液样品进行离心以从血细胞分离血清。通过实施例2描述的ELISA方法评价N248A的血清水平。首先用人Fc特异性mAb(其捕获刻缺蛋白1-NRR-TM(-)/Fc抗原)包被ELISA板。刻缺蛋白1抗原进而结合血清中的刻缺蛋白1mAb，N248A。
PK曲线表明，注射后24小时小鼠血清中的N248A mAb达到最大浓度(～235nM)。估算的半衰期是约4.5天(图9)。刻缺蛋白1活化直接标记(即NICD)的鉴定显示，从用N248A治疗的小鼠收集的肿瘤样品具有明显的NICD降低，其保持不变直至给药后5天(图10)。相反，对照mAb，D16A，没有降低NICD水平(数据未显示)。5mg/kg N248A对NICD的最大抑制是大约80％。
实施例8：刻缺蛋白1mAb，N248A的克隆和序列
测定mAb N248A可变区的序列。首先使用Isostrip小鼠单克隆抗体试剂盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)鉴定抗体IgG亚型。结果显示，N248A具有IgG1重链和lambda轻链。为了克隆和测序mAb N248A，使用RNeasy Mini Reagent试剂盒和制造商的方案(Qiagen，Valencia，CA)收集1×106个杂交瘤细胞并裂解以分离总细胞RNA。使用Superscript III逆转录酶(InVitrogen)在RNA模板上合成第一链cDNA。使用与小鼠lambda链编码序列的5′端互补的简并正向引物以及与邻近可变区3′端的恒定区匹配的反向引物，或使用与小鼠IgG1重链编码序列的5′端互补的简并正向引物以及相应的IgG1恒定区反向引物，从所述第一链cDNA通过PCR扩增轻链和重链可变区的cDNA。PCR循环条件如下：1个循环96℃1分钟，然后是40个循环95℃20秒，50℃20秒和72℃30秒。将获得的PCR产物克隆入pCR-4-TOPO载体(Invitrogen)，通过常规方法测序，并使用Vector NTIAdvance软件(InVitrogen)进行分析。通过与质谱确定的获自纯化杂交瘤来源抗体的N端序列(Univ.of CA，Davis，Molecular Structure Facility)进行直接比较证实克隆的抗体序列。编译的序列结果显示，mAb N248A重链的可变区含有121个氨基酸残基，轻链含有109个氨基酸残基。利用用于CDR区域确定的Kabat系统对N248A mAb VH序列和VL序列的进一步分析产生对重链CDR1，CDR2和CDR3以及轻链CDR1，CDR2和CDR3的描绘。mAbN248A重链可变区CDR1，CDR2和CDR3的核苷酸和氨基酸序列在图15中显示为序列15-20(SEQ ID NO：15-20)。mAb N248A的轻链可变区CDR1，CDR2和CDR3的核苷酸和氨基酸序列在图14中显示为序列9-14(SEQ IDNO：9-14)。mAb N248A的重链可变区和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列在图13中显示为序列5-8(SEQ ID NO：5-8)。
Figure IPA00001514554500011
Figure IPA00001514554500021
Figure IPA00001514554500031
Figure IPA00001514554500041
Figure IPA00001514554500051
Figure IPA00001514554500071
Figure IPA00001514554500081
Figure IPA00001514554500091
Figure IPA00001514554500101

Claims (31)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人刻缺蛋白-1，其中所述抗体或抗原结合部分结合至少第一表位和第二表位，其中所述第一表位位于人刻缺蛋白-1的Lin-A结构域内，并且所述第二表位位于人刻缺蛋白-1的HD-C结构域内。
2.权利要求1的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分结合所述第一表位和第二表位二者，并且所述第一表位和第二表位是所述抗体或抗原结合部分结合的仅有主要表位。
3.权利要求2的抗体或抗原结合部分，其中所述第一表位是包含选自1463V、1465S、1466L和1467Q的1到4个氨基酸残基的主要表位。
4.权利要求1、2和3任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述第二表位是包含选自1705G、1706A、1707L、1709S和1710L的1到5个氨基酸残基的主要表位。
5.权利要求3或权利要求4的抗体或抗原结合部分，其中所述第一表位的任意氨基酸残基的非保守取代导致所述抗体或抗原结合部分与人刻缺蛋白-1的结合亲和力损失超过80％。
6.权利要求1到5任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分是人源化的、人的或嵌合的。
7.权利要求1-5任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分是小鼠抗体。
8.权利要求6的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分以1×10-4M或更低的KD结合人刻缺蛋白-1。
9.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人刻缺蛋白-1，包含
(i)包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的重链可变区CDR1或其变体，所述变体中SEQ ID NO：18的1-4个残基被修饰；
(ii)包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的重链可变区CDR2或其变体，所述变体中SEQ ID NO：19的1-4个残基被修饰；和
(iii)包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的重链可变区CDR3或其变体，所述变体中SEQ ID NO：20的1-4个残基被修饰。
10.权利要求9的抗体或抗原结合部分，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰是其氨基酸残基的保守取代。
11.权利要求9的抗体或抗原结合部分，其中所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3中没有一个被修饰。
12.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人刻缺蛋白-1，包含
(i)包含SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1或其变体，所述变体中SEQ ID NO：12的1-4个残基被修饰；
(ii)包含SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2或其变体，所述变体中SEQ ID NO：13的1-4个残基被修饰；和
(iii)包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3或其变体，所述变体中SEQ ID NO：14的1-4个残基被修饰。
13.权利要求12的抗体或抗原结合部分，其中所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的任意所述修饰是其氨基酸残基的保守取代。
14.权利要求12的抗体或抗原结合部分，其中所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3中没有一个被修饰。
15.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人刻缺蛋白-1，包含
(i)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR1，
(ii)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR2，
(iii)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的轻链可变区CDR1，
(v)包含SEQ ID NO：13的轻链可变区CDR2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的轻链可变区CDR3，
其中每个轻链CDR和重链CDR的1-4个氨基残基可以被修饰。
16.权利要求15的抗体或抗原结合部分，其中轻链CDR和重链CDR的任意所述修饰是其氨基酸残基的保守取代。
17.权利要求15的抗体或抗原结合部分，其中轻链CDR和重链CDR中没有一个被修饰。
18.权利要求8到17任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分是小鼠抗体或小鼠抗体的抗原结合部分。
19.权利要求8-17任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分是人源化的、人的或嵌合的。
20.权利要求8到17任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分以小于1×10-5M的平衡解离常数KD结合人刻缺蛋白-1。
21.权利要求8到17任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分以小于2×10-6M的平衡解离常数KD结合人刻缺蛋白-1。
22.权利要求8到17任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分以小于1×10-6M的平衡解离常数KD结合人刻缺蛋白-1。
23.权利要求8到17任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分以小于2×10-6M的平衡解离常数KD结合人刻缺蛋白-1。
24.权利要求8-17任一项的抗体，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的人全长抗体。
25.权利要求8-17任一项的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的人源化抗体。
26.权利要求8-17任一项的抗体，其中所述抗体是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型的嵌合抗体。
27.一种药物组合物，其包括权利要求1-26任一项的抗体或抗原结合部分。
28.一种细胞系，其重组产生权利要求1-26任一项的抗体或抗原结合部分。
29.一种寡核苷酸，其编码权利要求1-26任一项的抗体或抗原结合部分的重链或轻链。
30.一种治疗癌症的方法，包括给对象施用治疗有效量的权利要求1-26任一项的抗体或抗原结合部分或其药物组合物。
31.权利要求1-26任一项的抗体或其抗原结合部分或其药物组合物，其用于治疗癌症。
CN2010800367326A 2009-06-18 2010-06-16 抗刻缺蛋白-1抗体 Pending CN102686610A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21819309P 2009-06-18 2009-06-18
US61/218,193 2009-06-18
PCT/IB2010/052711 WO2010146550A1 (en) 2009-06-18 2010-06-16 Anti notch-1 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102686610A true CN102686610A (zh) 2012-09-19

Family

ID=42575817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800367326A Pending CN102686610A (zh) 2009-06-18 2010-06-16 抗刻缺蛋白-1抗体

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9090690B2 (zh)
EP (2) EP3431501A1 (zh)
JP (2) JP6059985B2 (zh)
KR (1) KR101570898B1 (zh)
CN (1) CN102686610A (zh)
AU (1) AU2010261364B2 (zh)
BR (1) BRPI1011805A2 (zh)
CA (1) CA2765989C (zh)
CO (1) CO6480924A2 (zh)
IL (1) IL217066A0 (zh)
MX (1) MX337468B (zh)
NZ (1) NZ597611A (zh)
PE (1) PE20121494A1 (zh)
RU (1) RU2011151287A (zh)
SG (1) SG176731A1 (zh)
WO (1) WO2010146550A1 (zh)
ZA (1) ZA201109282B (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2011002928A (es) * 2008-10-01 2011-04-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch2 y metodos de uso.
US9090690B2 (en) 2009-06-18 2015-07-28 Pfizer Inc. Anti Notch-1 antibodies
PE20120998A1 (es) * 2009-09-30 2012-08-14 Genentech Inc Metodos para el tratamiento del cancer usando antagonistas de notch
CA2821130C (en) * 2010-12-15 2017-11-07 Wyeth Llc Anti-notch1 antibodies
WO2012080891A1 (en) * 2010-12-15 2012-06-21 Rinat Neuroscience Corp. Anti-notch-1 antibodies
TW201726746A (zh) 2012-11-07 2017-08-01 輝瑞股份有限公司 抗切口３（ａｎｔｉ-ｎｏｔｃｈ３）抗體及抗體-藥物共軛體
US20170022289A1 (en) * 2014-03-07 2017-01-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer with notch1 antiboides
BR112017000130A2 (pt) 2014-07-11 2018-01-09 Genentech Inc método para atenuar a toxicidade associada à inibição da via de notch e método de tratamento do câncer
WO2017205651A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Human notch1 based fusion proteins as decoy inhibitors of jagged-notch signaling and dll-notch signaling
EP3532091A2 (en) 2016-10-29 2019-09-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-mic antibidies and methods of use
CN112703200A (zh) 2018-08-31 2021-04-23 布鲁姆科技株式会社 针对糖化终产物的抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002059285A1 (en) * 2000-10-27 2002-08-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for immortalizing cells
US20030148954A1 (en) * 2001-11-02 2003-08-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Agents and methods for modulating activator protein-1-mediated cellular processes
US20070007222A1 (en) * 2005-07-07 2007-01-11 Jui-Chien Kao Hanger rack for hand tools

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8421551D0 (en) 1984-08-24 1984-09-26 Ici Plc Water-soluble dye
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
DE68925966T2 (de) 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5786158A (en) 1992-04-30 1998-07-28 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
JP2698529B2 (ja) 1993-04-06 1998-01-19 浜松ホトニクス株式会社 イメージインテンシファイア装置
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
JP2002526109A (ja) 1998-10-02 2002-08-20 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッドステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ ザ ナショナル インステ アポトーシス誘導物質と方法
US20030035798A1 (en) 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
CN1763097B (zh) 1999-01-15 2011-04-13 杰南技术公司 具有改变的效应功能的多肽变体
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
WO2003042246A2 (en) 2001-11-14 2003-05-22 Lorantis Limited Inhibitors of the notch signalling pathway for use in the treatment of cancer
WO2003085107A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
WO2004009617A1 (ja) 2002-07-18 2004-01-29 Osaka Industrial Promotion Organization Ｎｏｔｃｈ由来新規ポリペプチドおよびそれを用いたバイオマーカー並びに試薬
SI1575517T1 (sl) 2002-12-24 2012-06-29 Rinat Neuroscience Corp Protitelesa proti ĺ˝iväśnemu rastnemu dejavniku in metode njihove uporabe
AU2004294563B2 (en) 2003-11-26 2009-03-26 Health Research, Inc. Use of notch pathway interfering agents for treatment of plasma cell disorders
WO2006001956A2 (en) 2004-05-20 2006-01-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Compositions for inhibiting cell growth and inducing apoptosis in cancer cells and methods of use thereof
US20070077245A1 (en) 2004-08-04 2007-04-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. NOTCH mutations leading to increased receptor signaling
WO2006053063A2 (en) 2004-11-05 2006-05-18 The Regents Of The University Of California Notch-1 assay to detect neurodegenerative diseases
AU2005319382B2 (en) 2004-12-21 2011-04-07 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
CA2600908A1 (en) 2005-03-04 2006-09-08 The Hospital For Sick Children Methods for cancer prognosis
US20070072222A1 (en) 2005-09-23 2007-03-29 Franziska Boess FABP4 as biomarker for toxic effect
WO2007061988A2 (en) 2005-11-22 2007-05-31 University Of Vermont And State Agricultural College Methods for determining notch signaling and uses thereof
WO2008057144A2 (en) 2006-05-15 2008-05-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Functional negative regulatory domain sequences from human notch1 and 2 and isolated lnr domains from human notch1
JP2009539403A (ja) 2006-06-13 2009-11-19 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 癌を診断および処置するための組成物および方法
EP2134356A2 (en) 2007-03-05 2009-12-23 Board of Regents, The University of Texas System Negative genetic regulation of cancer cell renewal in synergy with notch- or numb-specific immunotherapy
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
US8119366B2 (en) 2007-10-05 2012-02-21 Trojan Technologies, Ltd. Antennapedia-dominant negative mastermind-like construct
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
US8435513B2 (en) 2008-07-08 2013-05-07 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. NOTCH1 receptor antibodies and methods of treatment
WO2010059543A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation and characterization of anti-notch antibodies for therapeutic and diagnostic use
US9090690B2 (en) 2009-06-18 2015-07-28 Pfizer Inc. Anti Notch-1 antibodies
PE20120998A1 (es) 2009-09-30 2012-08-14 Genentech Inc Metodos para el tratamiento del cancer usando antagonistas de notch
WO2011088215A2 (en) 2010-01-13 2011-07-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch1 binding agents and methods of use thereof
WO2012080891A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Rinat Neuroscience Corp. Anti-notch-1 antibodies
CA2821130C (en) 2010-12-15 2017-11-07 Wyeth Llc Anti-notch1 antibodies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002059285A1 (en) * 2000-10-27 2002-08-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for immortalizing cells
US20030148954A1 (en) * 2001-11-02 2003-08-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Agents and methods for modulating activator protein-1-mediated cellular processes
US20070007222A1 (en) * 2005-07-07 2007-01-11 Jui-Chien Kao Hanger rack for hand tools

Also Published As

Publication number Publication date
MX2011013717A (es) 2012-05-29
US9090690B2 (en) 2015-07-28
BRPI1011805A2 (pt) 2016-10-11
US20120093813A1 (en) 2012-04-19
CA2765989A1 (en) 2010-12-23
CO6480924A2 (es) 2012-07-16
ZA201109282B (en) 2012-08-29
EP2443151A1 (en) 2012-04-25
MX337468B (es) 2016-03-02
AU2010261364B2 (en) 2015-05-07
CA2765989C (en) 2016-11-29
WO2010146550A1 (en) 2010-12-23
SG176731A1 (en) 2012-01-30
JP6059985B2 (ja) 2017-01-11
JP2012530487A (ja) 2012-12-06
NZ597611A (en) 2014-03-28
RU2011151287A (ru) 2013-07-27
EP3431501A1 (en) 2019-01-23
AU2010261364A1 (en) 2012-01-19
KR20120071379A (ko) 2012-07-02
JP2016121162A (ja) 2016-07-07
PE20121494A1 (es) 2012-11-01
IL217066A0 (en) 2012-02-29
KR101570898B1 (ko) 2015-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102686610A (zh) 抗刻缺蛋白-1抗体
AU2019214183B2 (en) Fully human anti-B cell maturation antigen (BCMA) single chain variable fragment, and application thereof
TWI757499B (zh) 對flt3具特異性之抗體及其用途
RU2610688C2 (ru) Антигенсвязывающие молекулы, которые связывают egfr, кодирующие их векторы и их применение
CN102333542B (zh) Pcsk9拮抗剂
CN103275227B (zh) Axl抗体
DK2635604T3 (en) PAN-HER-ANTIBODY COMPOSITION
KR101509874B1 (ko) 길항제 항-ｉｌ-7 수용체 항체 및 방법
CA2601858A1 (en) Antigen binding molecules directed to mcsp and having increased fc receptor binding affinity and effector function
KR20140113912A (ko) Her3에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
JP2022519118A (ja) 抗クローディン１８抗体及びそれらの使用の方法
KR20100115360A (ko) 알파 ５-베타 １ 항체 및 이의 용도
US20220193237A1 (en) Ipilimumab variants with enhanced specificity for binding at low ph
TW201934580A (zh) 對cd70具特異性抗體及其用途
CN102482353A (zh) 特异于钙粘素-17的抗体
TW200829602A (en) Novel antiproliferation antibodies
EP3383497A1 (en) Novel antibodies for the treatment of cancers
US20140234308A1 (en) Treatment of breast cancer with companion diagnostic
WO2012080891A1 (en) Anti-notch-1 antibodies
KR101432474B1 (ko) 항-연장된 ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체, 이의 유도체 및 용도
KR20220113790A (ko) 항-ly6g6d 항체 및 사용 방법
CN116059341A (zh) 药物组合物及用途
NZ625046B2 (en) Binding molecules specific for her3 and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1176624

Country of ref document: HK

C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120919

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1176624

Country of ref document: HK