KR20120071379A - 항-노치-1 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 노치-1에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체에 관한 것이다. 한 태양에서, 상기 항체는 적어도 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프에 결합하며, 여기서 제 1 에피토프는 노치-1 음성 조절 영역(NRR)의 Lin-A 도메인에 존재하며 제 2 에피토프는 노치-1 NRR의 HD-C 도메인내에 존재한다.

Description

항-노치-1 항체{ANTI NOTCH-1 ANTIBODIES}
본 출원은 본원에 전체로 참고로 인용된, 2009년 6월 18일자로 출원된 미국 가출원 제 61/218,193 호를 우선권 주장한다.
본 발명은 노치-1(Notch-1)의 활성에 길항작용하는 항체, 상기 항체의 제조 방법, 상기 항체의 분석 방법 및 암의 치료에 상기 항체를 이용하는 방법에 관한 것이다.
노치 단백질은 경막(transmembrane) 수용체 단백질이다. 포유동물에는 4개의 상기 노치 수용체가 존재한다. 수용체 돌연변이시에, 포유동물의 노치 수용체의 세포외도메인(ectodomain)들이 S1 부위에서 퓨린-유사 프로테아제에 의해 분열되어, 헤테로이량체화(heterodimerization, HD) 도메인에 의해 함께 유지되는 세포외 서브유닛 및 경막 서브유닛이 생성된다. 세포외 서브유닛과 결합되는 HD 도메인 부분은 HD-N으로 지칭되고, HD의 다른 부분인 경막 서브유닛의 세포외 잔기는 HD-C로 지칭된다. 세포외 서브유닛은 거대 상피 성장 인자(EGF)-유사 반복 영역 및 3개의 Lin12 반복부를 함유한다. EGF-반복 영역의 리간드 결합은 HD-C 도메인내의 S2 부위에서 ADAM-유형 메탈로프로테아제에 의한 단백질분해성 분열을 포함하며, 이것은 S3 부위에서 γ-세크레타제에 의한 후속 분열을 유발하여 막으로부터 노치의 세포내 부분을 방출시켜 이 부분을 핵 내로 이동시키며 유전자 전사를 조절하게 한다[Gordon, W.R., et al., Nature Structural & Molecular Biology, volume 14, 295-300 (2007)].
리간드 유도 활성화 이전에, 노치는 3개의 Lin12 반복부 및 HD 도메인으로 이루어진 보존된 음성 조절 영역(NRR)에 의해 휴지 메탈로프로테아제-내성 구조로 유지된다[Vardar et al., Biochemistry, 41:7061-7067 (2003); Sanchez-Irizarry et al., Mol. Cell. Biol., 24:9265-9273 (2004); Gordon, W.R., et al., Nature Structure & Molecular Biology, volume 14, 295-300 (2004)]. 노치 단백질의 NRR은 또한 때때로 S1 부위에서 단백질분해성 분열후에 오직 Lin12 반복부 및 N 말단 HD 도메인(HD-N)으로 이루어지는 것으로 정의된다[Weng, A.P., et al, Science, 9265-9273 (2004)]. NRR 도메인은 노치 경로의 리간드-비의존적 단백질분해를 방지한다.
노치 경로는 날벌레 및 척추동물에서 신경발생에 영향을 미치는 것들을 포함하여 다양한 발달 및 생리학적 과정동안 작용한다. 일반적으로, 노치 신호는 측면 억제, 계통 결정, 및 세포 군 사이 경계 확립에 관련된다[Bray, S.J., Nature Reviews, 678-688 (2006)].
그러나, 노치 활성은 또한 암을 포함하여 다양한 인간 질환과 관련된다. 예를 들면, 노치-1의 돌연변이는 T-세포 급성 림프구성 백혈병의 50% 이상에서 검출되었다[Radtke, F., Nature Review, Cancer, 756-767 (2003)]. 암 치료의 용도로 노치-1 신호 경로를 조절하는 치료제를 찾을 필요가 있다.
한 태양에서, 본 발명은 노치-1에 결합하는 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 적어도 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프에 결합하고, 제 1 에피토프는 노치-1의 Lin-A 도메인내에 존재하고, 제 2 에피토프는 노치-1의 HD-C 도메인내에 존재한다. 바람직하게, 노치-1은 인간 노치-1이다.
본 발명의 한 측면에서, 제 1 에피토프가 주 에피토프이다. 바람직하게, 제 1 에피토프의 임의의 아미노산 잔기의 비-보존적 치환은 인간 노치-1에 대한 항체 또는 항원 결합 부분의 결합 친화도의 60% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 90% 초과의 손실을 야기한다.
또 다른 측면에서는, 제 2 에피토프가 주 에피트포이다. 바람직하게, 제 2 에피토프의 임의의 아미노산 잔기의 비-보존적 치환은 인간 노치-1에 대한 항체 또는 항원 결합 부분의 결합 친화도의 60% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 90% 초과의 손실을 야기한다.
또 다른 측면에서, 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프가 둘 다 주 에피트포이다. 바람직하게, 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프의 임의의 아미노산 잔기의 비-보존적 치환은 인간 노치-1에 대한 항체 또는 항원 결합 부분의 결합 친화도의 60% 이상, 보다 바람직하게는 80% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 90% 초과의 손실을 야기한다.
상기 태양의 또 다른 측면에서, 노치-1은 인간 노치-1이다. 상기 태양의 또 다른 양태에서, 노치-1은 마우스 노치-1이다.
상기 태양의 또 다른 측면에서, 항체 또는 항원 결합 부분은 추가의 1 내지 4개의 에피토프에 결합하며, 이때 상기 추가의 에피토프 각각은 인간 노치-1의 Lin-A 도메인 또는 HD-C 도메인내에 존재한다.
상기 태양의 또 다른 측면으로, 항체 또는 항원 결합 부분이 결합하는 유일한 주 에피토프는 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프이다. 보다 특히, 제 1 에피토프는 인간 노치-1의 Lin-A 도메인의 1463V, 1465S, 1466L 및 1467Q로부터 선택된 1 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 주 에피토프이다. 바람직하게, 제 1 에피토프는 인간 노치-1의 Lin-A 도메인의 1463V, 1465S, 1466L 및 1467Q로부터 선택된 4개의 아미노산 잔기로 이루어진 주 에피토프이다. 또한 보다 특히, 제 2 에피토프는 인간 노치-1의 HD-C 도메인의 1705G, 1706A, 1707L, 1709S 및 1710L로부터 선택된 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 주 에피토프이다. 바람직하게, 제 2 에피토프는 인간 노치-1의 HD-C 도메인의 1705G, 1706A, 1707L, 1709S 및 1710L로부터 선택된 1 내지 5개의 아미노산 잔기로 이루어진 주 에피토프이다. 보다 더 특히, 제 1 에피토프 또는 제 2 에피토프의 임의의 아미노산 잔기의 비-보존적 치환은 인간 노치-1에 대한 항체 또는 항원 결합 부분의 결합 친화도의 70% 이상, 80% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과의 손실을 야기한다.
상기 태양의 또 다른 측면에서, 항체 또는 항원 결합 부분은 인간화된, 인간 또는 키메라 항체이다. 바람직하게, 항체 또는 항원 결합 부분은 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다. 보다 바람직하게, 항체 또는 항원 결합 부분은 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다.
상기 태양의 또 다른 측면으로, 항체 또는 항원 결합 부분은 마우스 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다.
상기 태양의 또 다른 측면에서, 항체 또는 항원 결합 부분은 인간 노치-1에 1 x 10-5 M 이하의 KD로 결합한다. 바람직하게, 항체 또는 항원 결합 부분은 인간 노치-1에 1 x 10-6 M 이하, 5 x 10-7 M 이하, 2 x 10-7 M 이하, 1 x 10-7 M 이하, 5 x 10-8 M 이하, 2 x 10-8 M 이하, 또는 1 x 10-8 M 이하의 KD로 결합한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는, 인간 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다:
(i) 서열번호: 18에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 18의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(ii) 서열번호: 19에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 19의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
(iii) 서열번호: 20에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 20의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3.
상기 태양의 한 측면에서, 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 12개의 가능한 아미노산 잔기 변형(상기 태양에서 전술한 바와 같이) 중에서, 6개 이하의 변형을 제외하고, 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 바람직하게는, 5개 이하의 변형을 제외하고, 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 상기 변형들 중 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 보다 바람직하게는, 4개 이하의 변형을 제외하고, 3개 이하의 변형을 제외하고, 2개 이하의 변형을 제외하고, 또는 1개의 변형을 제외하고, 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 상기 변형중 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 보다 더 바람직하게는, 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 임의의 아미노산 잔기 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다.
상기 태양의 또 다른 측면에서, 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 어느 것도 변형되지 않는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는, 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다:
(i) 서열번호: 12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 12의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(ii) 서열번호: 13에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 13의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(iii) 서열번호: 14에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 14의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
상기 태양의 한 측면에서, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 12개의 가능한 아미노산 잔기 변형(상기 태양에서 전술한 바와 같이) 중에서, 6개 이하의 변형을 제외하고, 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 바람직하게는, 5개 이하의 변형을 제외하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 상기 변형들 중 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 보다 바람직하게는, 4개 이하의 변형을 제외하고, 3개 이하의 변형을 제외하고, 2개 이하의 변형을 제외하고, 또는 1개의 변형을 제외하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 상기 변형중 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 보다 더 바람직하게는, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 임의의 아미노산 잔기 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다.
상기 태양의 또 다른 측면에서, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 어느 것도 변형되지 않는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하기 (i) 내지 (vi)를 포함하는, 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다:
(i) 서열번호: 18에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 18의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(ii) 서열번호: 19에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 19의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(iii) 서열번호: 20에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 20의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3.
(iv) 서열번호: 12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 12의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(v) 서열번호: 13에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 13의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(vi) 서열번호: 14에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 14의 1 내지 4개 잔기가 변형되고, 바람직하게는 3개 잔기만 변형되고, 보다 바람직하게는 2개 잔기만 변형되고, 보다 더 바람직하게는 1개 잔기만이 변형된 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
상기 태양의 한 측면에서, 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 24개의 가능한 아미노산 잔기 변형(상기 태양에서 전술한 바와 같이) 중에서, 12개 이하의 변형을 제외하고, 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 바람직하게는, 11개 이하의 변형을 제외하고, 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 상기 변형들 중 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 보다 바람직하게는, 10개 이하의 변형을 제외하고, 9개 이하의 변형을 제외하고, 8개 이하의 변형을 제외하고, 7개 이하의 변형을 제외하고, 6개 이하의 변형을 제외하고, 5개 이하의 변형을 제외하고, 4개 이하의 변형을 제외하고, 3개 이하의 변형을 제외하고, 2개 이하의 변형을 제외하고, 또는 1개의 변형을 제외하고, 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 상기 변형중 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 보다 더 바람직하게는, 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 상기 변형중 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다.
상기 태양의 또 다른 측면에서, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR 중 어느 것도 변형되지 않는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 항체 또는 항원 결합 부분이 인간 노치-1에 결합하기 위해 교차-경쟁 또는 경쟁하는, 다음을 포함하는 분리된 단클론성 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다:
(a) 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 태양에서, 본 발명은 항체 또는 항원 결합 부분이 인간 노치-1에 결합하기 위해 교차-경쟁 또는 경쟁하는, 다음을 포함하는 분리된 단클론성 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다:
(i) 서열번호: 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
(ii) 서열번호: 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
(iii) 서열번호: 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,
(iv) 서열번호: 12를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
(v) 서열번호: 13을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
(vi) 서열번호: 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
상기에서, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR 각각의 1 내지 4개의 아미노산 잔기가 변형될 수 있다. 바람직하게, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR의 변형중 임의의 변형은 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 보다 바람직하게는, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR 중 어느 것도 변형되지 않는다.
CDR 영역의 결정은 당해 분야의 기술내에서 잘 이루어진다. 일부 태양에서, CDR은 카밧(Kabat) 및 초티아(Chothia) CDR("복합 CDR" 또는 "연장 CDR"로도 지칭됨)의 조합일 수 있는 것으로 이해된다. 일부 태양에서, CDR은 카밧 CDR이다. 다른 태양에서, CDR은 초티아 CDR이다. 즉, 하나보다 많은 CDR이 존재하는 태양에서, CDR은 카밧, 초티아, 복합 CDR 또는 그의 조합 중 어느 하나일 수 있다.
상기 태양의 한 측면에서, 항체는 인간화된 항체이다. 상기 태양의 또 다른 측면에서, 항체는 완전 인간 항체이다. 상기 태양의 또 다른 측면에서, 항체는 키메라 항체이다.
상기 태양의 또 다른 측면에서, 항체 또는 항원 결합 부분은 인간 노치-1에 1x10-5 M 미만, 바람직하게는 1x10-6 M 미만, 바람직하게는 5x10-7 M 미만, 바람직하게는 2x10-7 M 미만, 바람직하게는 1x10-7 M 미만, 또는 보다 바람직하게는 1x10-8 M 미만의 평형 해리 상수 KD로 결합한다.
상기 태양의 또 다른 측면에서, 항체는 마우스 항체이다. 상기 태양의 또 다른 측면에서, 항체는 인간화된, 인간 또는 키메라 항체이다. 바람직하게, 항체는 인간화된 항체이다. 보다 바람직하게, 항체는 완전 인간 항체이다.
상기 태양의 또 다른 측면으로, 항체는 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 전장 항체이다. 상기 태양의 또 다른 측면에서, 항체는 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간화된 항체이다. 또 다른 태양에서, 항체는 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 키메라 항체이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체 또는 항원 결합 부분을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체 또는 항원 결합 부분을 재조합적으로 생산하는 세포주를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 치료 효과량의 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분, 또는 그의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 부분을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 암 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 부분의 용도를 제공한다.
도 1은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 인간 노치-1 면역원 플라스미드 N1-NRR-TM(-)의 cDNA의 PCR 합성을 예시한 것이다.
도 2는 또한 실시예 1에 기술된 바와 같이, 인간 노치-1 면역원 플라스미드 N1-NRR-TM(+)의 cDNA의 PCR 합성을 예시한 것이다.
도 3은 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 2개의 단클론성 항체: mAb N248A 및 mAb-C의 노치-1 의존성 루시퍼라제 리포터 분석 결과를 예시한 것이다.
도 4는 루시퍼라제 리포터 분석에 의해 mAb N248A가 재기드(Jagged)-1 유도된 노치-1 신호를 억제하는 것으로 나타난 것을 예시한 것이다. Hela/재기드1 세포 및 N1dP-c16 세포를 루시퍼라제 리포터 분석을 위해 공-배양하였다. MlgG는 대조군 마우스 항체이다. y-축의 숫자는 루시퍼라제 리포터 활성 판독치이다.
도 5는 인간 노치-1 및 인간 노치-2 사이의 EFG, Lin-A, Lin-B, Lin-C, HD-N 및 HD-C 도메인의 서열 정렬이다.
도 6a는 NICD(노치-1 세포내 도메인)이 HPB-ALL 세포중 mAb N248A에 의해 감소되었음을 예시하는 웨스턴 블롯 상이다.
도 6b는 HPB-All 세포의 성장이 mAb N248A에 의해 억제됨을 예시한 것이다.
도 7a 및 7b는 mAb N248A가 Hes1 mRNA 및 Hes4 mRNA 각각의 발현을 차단하는 것을 예시한 것이다.
도 8은 mAb N248A에 의한 HBP-ALL 이종이식 종양의 성장 억제를 예시한 것이다. 마우스에게 종양이 150 내지 300 mm3까지 자란 후에 도면에 나타낸 바와 같이 mAb를 투여하였다. 각 군은 불규칙 종양 크기를 갖는 10 마리의 마우스를 포함한다.
도 9는 마우스에서 5 mg/kg의 단일 용량 주입후에 혈장내 mAb N248A 농도의 변화를 예시한 것이다. 각 데이터 포인트는 3 마리의 마우스를 기준으로 계산하였다. T1/2는 마우스 혈청에서 N248A의 반감기이다.
도 10은 마우스에서 5 mg/kg의 단일 용량 주입후 HBP-ALL 이종이식 종양의 억제를 예시한 것이다. 대조군 항체 D16A로 처리된 종양의 웨스턴 블롯 밴드는 0% 억제에 해당하는 100% 강도로 설정되었다.
본 개시내용은 고 친화도로 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론성 항체, 특히 인간 단클론성 항체 및 마우스 단클론성 항체, 및 인간/마우스 키메라 항체에 관한 것이다. 개시내용은 분리된 항체, 상기 항체의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 면역접합체 및 이중특이성 분자, 및 개시된 상기 항체, 면역접합체 또는 이중특이성 분자를 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 개시내용은 또한 노치-1 활성화을 억제하는 것 뿐 아니라, 노치-1의 과활성화 또는 과발현과 관련된 질환, 예를 들면, 비정상 세포 성장(예, 암)을 치료하는 것과 같이 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 개시내용은 또한 암과 같은 다양한 유형의 비정상적 세포 성장을 치료하기 위해 항-노치-1 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 사용하는 방법을 제공한다.
정의
용어 "노치-1" 또는 "노치-1"은 상호교환적으로 사용되며, 인간 노치-1 단백질의 변이체, 이소형태(isoform) 및 종 동족체를 포함한다. 천연 인간 노치-1 단백질은 예를 들면, 리더 펩티드, 거대 상피 성장 인자(EGF)-유사 반복 영역, 3개의 Lin12 반복부, N 말단 헤테로이량체화 도메인(HD-N), C 말단 헤테로이량체화 도메인(HD-C), 경막(TM) 서열 및 세포내 도메인(NICD)으로 구성된다. 전장 인간 노치-1의 NCBI/진뱅크 등록 번호는 NM_017617.2이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "노치-1 음성 조절 영역" 또는 "노치-1 NRR"은 달리 언급하지 않는 한, 3개의 Lin12 도메인, 및 노치-1의 3개의 Lin12 도메인과 경막 도메인 사이에 위치한 아미노산 서열 또는 서열들로 이루어진 노치-1의 임의의 천연 또는 합성 폴리펩티드 영역을 말한다. 한 태양에서, "노치-1 NRR"은 3개의 Lin12 도메인 및 2개의 헤테로이량체화 도메인 HD-N 및 HD-C를 포함하며, 여기서 노치-1의 HD-N 및 HD-C 도메인은 공유 결합되며 퓨린-유사 프로테아제에 의해 분열되지 않는다(S1 분열전). 또 다른 태양에서, "노치-1 NRR"은 3개의 Lin12 도메인 및 2개의 헤테로이량체화 HD-N 및 HD-C를 포함하며, 이때 HD-N 및 HD-C 도메인은 비공유 결합된다(S1 분열후). 상기 태양의 한 측면에서, HD-C 도메인내의 S2 부위는 ADAM-유형 메탈로프로테아제에 의해 분열되지 않았다. 상기 태양의 또 다른 특정 측면에서, HD-C 도메인내 S2 부위는 ADAM-유형 메탈로프로테아제에 의해 분열되고 있거나 또는 이미 분열되었다[Gordon, W.R., et al., Nature Structural & Molecular Biology, volume 14, 295-300 (2007)].
용어 "면역 반응"은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적 손상, 이들의 파괴 또는 인체로부터 이들의 제거를 야기하는, 예를 들면, 림프구, 항원 제공 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생성된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용을 말한다.
"신호 전달 경로"는 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로 신호의 전달에 관여하는 다양한 신호 전달 분자 간의 생화학적 관계를 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "세포 표면 수용체"란 어구는, 예를 들면, 신호, 및 세포의 원형질막을 가로질러 상기 신호의 전달을 수용할 수 있는 분자 또는 분자 복합체를 포함한다. 본 개시내용의 "세포 표면 수용체"의 한 예는 노치-1 수용체이다.
본원에 언급된 바와 같은 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. "항체"는 다이설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개 이상의 중쇄(H) 및 2개 이상의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질 또는 그의 항원 결합 부분을 말한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 보다 보존되는 영역들이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역들로 더 세분될 수 있다. CDR 영역은 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 카밧 또는 초티아 번호 시스템을 사용하여 결정할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)] 참조). 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예, 이펙터 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제 1 성분(Clq)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")이란 용어는 항원(예를 들면, 노치-1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편[Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)]; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일쇄 Fv(ScFv)로 알려짐)를 형성하는 단일 단백질 쇄로 생성되게 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 결합될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Bird et al., Science 242:423-426 (1988); and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)] 참조). 상기 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어에 포함되는 것이다. 이들 항체 단편은, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지된 통상적인 기술을 포함하여 임의의 적합한 기술을 이용하여 수득될 수 있으며, 상기 단편들은 비손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 선별될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 말하는 것이다(예를 들면, 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 노치-1 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터의 노치-1 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체는 실질적으로 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질을 함유하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단클론성 항체" 또는 "단클론성 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 말한다. 단클론성 항체 조성물은 단일 결합 특이성 및 특정 에피토프에 대한 친화도를 나타낸다.
용어 "인간화된 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식계로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열상에 그래프트된 항체를 말하는 것이다. 또 다른 프레임워크 영역 변형이 인간 프레임워크 서열내에서 이루어질 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유도되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유도된 항체, 예를 들면, 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유도되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유도된 항체를 말하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것이다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 개시된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간 생식계 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들면, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식계로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열상에 그래프트된 항체를 포함하는 것이 아니다.
용어 "인간 단클론성 항체" 또는 "완전 인간 단클론성 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 한 태양에서, 인간 단클론성 항체는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 전이유전자 및 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 유전자전이 비-인간 동물, 예를 들면, 유전자전이 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
용어 "인간 항체 유도체"는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들면, 항체 및 또 다른 약제 또는 항체의 접합체를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 방법에 의해 제조되거나 발현되거나 생성되거나 분리된 모든 인간 항체, 예를 들면, (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마에 대해 유전자전이 또는 염색체전이성(transchromosomal)인 동물(예, 마우스)로부터 분리된 항체, (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들면, 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합체, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함한다. 상기 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 태양에서, 상기 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대해 유전자전이 동물을 사용하는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있으므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 그와 관련되지만 천연적으로는 생체내에서 인간 항체 생식계 레퍼토리 내에 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 항체에 관해 사용된 바와 같은 용어 "경쟁하다"는 제 1 항원 또는 그의 항원-결합 부분이 제 2 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 결합에 대해 경쟁하는 경우를 말하는 것으로, 이때 제 1 항체와 그의 동족 에피토프와의 결합은 제 2 항체의 부재하에서의 제 1 항체의 결합에 비해 제 2 항체의 존재하에서 검출가능할 정도로 감소된다. 제 2 항체의 그의 에피토프에 대한 결합이 또한 제 1 항체의 존재하에서 검출가능할 정도로 감소되는 다른 상황도 가능할 수 있으나, 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 즉, 제 2 항체가 제 1 항체의 그 각각의 에피토프에 대한 결합을 억제하는 것 없이, 제 1 항체는 제 2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체가 그의 동족 에피토프 또는 리간드에 결합하는 것을 검출가능할 정도로 억제하는 경우, 동일한 정도거나 더 큰 정도거나 더 덜한 정도거나 관계없이, 항체는 그의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로와 "교차-경쟁한다"고 한다. 예를 들면, 교차-경쟁하는 항체는 본원에 개시된 바와 같은 항체가 결합하는 에피토프 또는 에피트포의 부분에 결합할 수 있다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 모두의 사용은 본 발명에 포함된다. 상기 경쟁 또는 교차-경쟁이 일어나는 메카니즘(예를 들면, 입체 장애, 입체형태적 변화, 또는 공통 에피토프 또는 그의 부분에 대한 결합 등)과 무관하게, 숙련된 전문가라면, 본원에 제공된 기술을 기초로, 상기 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 본원에 개시된 방법에 포함되며 유용할 수 있음을 인지할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주 에피토프"는 에피토프의 아미노산 잔기 중 어느 하나가 알라닌 또는 비-보존적 치환에 의해 치환되는 경우, 에피토프가 속하는 항원에 대한 항체의 결합 친화도가 50% 이상 감소되는 에피토프를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이소형태" 또는 "부류"는 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류(예를 들면, IgM 또는 IgG)를 말한다. 항체의 불변 도메인은 항원에 결합될 때 수반되지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라서, 주어진 인간 항체 또는 면역글로불린은 면역글로불린의 1 내지 5개의 주요 부류로 지정될 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 다양한 부류의 면역글로불린의 구조 및 3차원 입체형태가 공지되어 있다. 다양한 인간 면역글로불린 부류중에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM 만이 보체를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 인간 IgG1 및 IgG3은 인간에서 ADCC를 매개하는 것으로 알려져 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "서브클래스"는, 예를 들면, IgG 이소형태 내에서 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스와 같이, 중쇄 불변 영역 유전자의 이소형태 내의 또 다른 특정화를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "화합물" 또는 "약학 화합물"은 항체, 그의 항원-결합 부분, 면역접합체 및 이중특이성 분자를 말한다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"란 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 예를 들면, FcR은 천연 서열 인간 FcR일 수 있다. 또한, FcR은 IgG 항체에 결합하는 것(감마 수용체)일 수 있으며, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcγRIV 서브클래스의 수용체(이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 달리 스플라이싱된 형태를 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-계 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다(문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-341 (1995)]에 개관되어 있다. 앞으로 확인될 것들을 포함하여, 다른 FcR도 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 또한 태아로의 모계 IgG의 전달을 담당하는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다[Guyer et al., Immunol., 117:587 (1976); and Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)].
본원에서 사용된 바와 같이, "인간 노치-1에 특이적으로 결합하는" 항체는 1 x 10-5 M 이하의 KD로 인간 노치-1에 결합하는 항체를 말하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "kon"은 특정 항체-항원 상호작용의 온-속도(on-rate) 또는 결합 속도를 말하는 것인 반면, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "koff"는 특정 항체-항원 상호작용의 오프-속도(off-rate) 또는 해리 속도를 말하는 것이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "KD"는 koff 대 kon의 비(즉, koff/kon)로부터 수득되고 몰 농도(M)로 표시되는 평형 해리 상수를 말하는 것이다. 항체에 대한 KD 값은 당해 분야에 잘 확립되어 있는 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 한 방법은, 전형적으로 비아코어(Biacore, 등록상표) 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하여 표면 플라스몬 공명을 사용하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체에 대한 용어 "고 친화도"는 1 x 10-6 M 이하의 KD를 갖는 항체를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이. 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들면, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
인간 노치-1 수용체
인간 노치-1 cDNA는 리더 펩티드, 36개 EGF-유사 반복부, 음성 조절 영역(NRR), 경막(TM) 서열 및 세포내 도메인으로 이루어지는 2556개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화한다[Vardar et al., Biochemistry, 41:7061-7067 (2003); Sanchez-Irizarry et al., Mol. Cell. Biol., 24:9265-9273 (2004); Gordon, W.R., et al., Nature Structural & Molecular Biology, volume 14, 295-300 (2007)]. 노치-1 NRR은 아미노산 잔기 1447에서 시작되어 1734에서 종료된다. 노치-1 NRR은 LNR-A(노치-1 AA 잔기 1447-1483), LNR-B(노치-1 AA 잔기 1484-1525), LNR-C(노치-1 AA 잔기 1526-1565), N-말단 헤테로이량체화 도메인(HD-N, 노치-1 AA 잔기 1566-1665) 및 C-말단 헤테로이량체화 도메인(HD-C, 노치-1 AA 잔기 1666 내지 1734)으로 이루어진다.
개시된 항체는 항체의 특정 기능적 특징 또는 성질에 의해 특징지워진다. 예를 들면, 항체는 1 x 10-5 M 이하의 KD로 인간 노치-1에 특이적으로 결합한다. 바람직하게, 개시된 항체는 고 친화도, 예를 들면, 1 x 10-6 M 이하의 KD로, 보다 바람직하게는 1 x 10-7 M 이하의 KD로, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하의 KD로 노치-1에 결합한다.
노치-1에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 분석은 ELISA, 웨스턴 블롯, RIA 및 유세포측정 분석을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 항체의 결합 역학(예를 들면, 결합 친화도)은 또한 비아코어 분석과 같이 당해 분야에 공지된 분석법에 의해 평가될 수 있다.
단클론성 항체 mAb N248A
개시된 한 예시적인 항체는 실시예 1 내지 3 및 8에 기술된 바와 같이 생성되고 분리되고 검사되고 구조적으로 특성화된 마우스 단클론성 항체 N248A이다. 표 1은 mAb N248A의 다양한 영역들의 아미노산 서열 및 본원에 개시된 다른 서열들을 열거한 것이다.
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실시예 4에 나타낸 바와 같이, mAb N248A는 0.33 x 10-6 M 미만의 KD를 갖는다.
실시예 5에 나타낸 바와 같이, mAb N248A는 2개 이상의 식별가능한 노치-1 에피토프에 결합하며, 한 에피토프는 Lin-A 도메인내에 존재하고 다른 에피토프는 HD-C 도메인내에 존재하는 것으로 나타났다.
실시예 6에 나타낸 바와 같이, mAb N248A는 세포 배양물중에서 T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL) 및 유방암 세포 성장을 억제한다.
실시예 7에 나타낸 바와 같이, mAb N248A는 또한 뮤린 이종이식 종양 모델에서 T-세포 림프구성 백혈병을 억제한다.
노치 -1 Lin -A 도메인 및 노치 -A HD -C 도메인에서 2개 이상의 구별된 에피토프에 결합하는 항- 노치 -1 항체
고 친화도로 노치-1 Lin-A 및 HD-C 도메인에 결합하는 항체가 노치-1 신호 전달을 감소시키므로, 시험관내 및 생체내에서 암 세포 성장, 특히 T-ALL 암 세포 성장을 억제하는 생물학적 능력을 입증할 수 있음은 본 발명이 고려한 것이다. 상기 항체는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 일반 방법에 따라 생성될 수 있다. 한 태양에서, 상기 항체는, 실시예 1 및 2에서 나타난 바와 같이 노치-1 Lin-A 도메인 및 노치-1 HD-C 도메인을 포함하는 면역원으로 마우스를 면역화시킨 후, 상기와 같이 생성된 항체를 하이브리도마 클로닝시키고, 클로닝된 항체를 실시예 2에 나타낸 바와 같이 ELISA 분석에 의해 분석하는 것을 통해 제조될 수 있다. ELISA 분석법에 따라 선택된 항체의 노치-1 결합 친화도는 실시예 4에 나타낸 바와 같이 표면 플라스마 공명 비아코어3000 기기상에서 측정할 수 있다.
노치-1 Lin-A 도메인 및 노치-1 HD-C 도메인에 결합하는 본 발명의 항 노치-1 항체는 상기 단락에서 기술한 것 이외의 다른, 당해 분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 생성될 수 있다. 숙주 동물의 면역화 경로 및 스케줄은 일반적으로 본원에 더 기술되는 바와 같이, 항체 자극 및 생성을 위해 확립된 통상적인 기술을 따른다. 인간 및 마우스 항체를 제조하기 위한 일반적인 기술은 당해 분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 기술되어 있다.
하이브리도마 기술에 의해 생성된 항 노치-1 항체
인간을 포함한 임의의 포유동물 대상체 또는 그로부터의 항체 생산 세포를 인간을 포함한 포유동물의 하이브리도마 세포주 생성을 위한 기초로 작용하도록 조작할 수 있음은 본 발명이 고려한 것이다. 전형적으로, 숙주 동물은 복강내, 근육내, 경구, 피하, 족부내 및/또는 피내로 본원에 기술된 것을 포함하여 상당량의 면역원을 접종한다.
하이브리도마는 문헌 [Kohler, B. and Milstein, C., Nature 256:495-497 (1975)]의 일반적 체세포 하이브리드화 기술 또는 문헌 [Buck, D.W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)]에 의해 변형된 바와 같은 기술을 사용하여 림프구 및 불멸화 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 솔크 연구소 세포 분포 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)의 것들을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 이용가능한 골수종 계통을 하이브리드화에 사용할 수 있다. 일반적으로, 상기 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합원을 사용하여 또는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 전기적 방법에 의해 골수종 세포 및 림프 세포를 융합시키는 것을 포함한다. 융합후에, 세포를 융합 배지로부터 분리하고, 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지와 같은 선택성 성장 배지에서 성장시켜 미하이브리드화 모세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 보충되지 않은 본원에 기술된 임의의 배지를 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하기 위해 사용할 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로, EBV 불멸화 B 세포를 사용하여 본 발명의 노치-1 단클론성 항체를 생성할 수 있다. 하이브리도마는, 경우에 따라, 확장되고 서브클로닝되며, 상등액은 통상적인 면역분석 절차(예를 들면, 방사능면역분석, 효소 면역분석 또는 형광 면역분석)에 의해 항-면역원 활성에 대해 분석된다.
항체 공급원으로 사용될 수 있는 하이브리도마는 노치-1에 특이적인 단클론성 항체 또는 그의 일부분을 생성하는 모 하이브리도마의 모든 유도체, 후손 세포를 포함한다.
상기 항체를 생성하는 하이브리도마는 공지된 절차를 이용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 단클론성 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 경우에 따라 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 분리될 수 있다. 바람직하지 않은 활성이 존재하는 경우, 상기 활성은, 예를 들면, 고체상에 부착된 면역원으로 이루어진 흡착제 위로 제제를 흘려보내고 면역원으로부터 목적 항체를 용출 또는 유리시킴으로써 제거할 수 있다. 이작용성 약제 또는 유도체화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스터(시스테인 잔기 통해 접합), N-하이드록시숙신이미드(라이신 잔기 통해), 글루타르알데하이드, 숙신 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR(여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 인간 노치-1으로, 또는 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편으로 숙주 동물을 면역화시키면 항체(예를 들면, 단클론성 항체) 집단을 수득할 수 있다.
숙주 동물에서 면역화에 의해 생성된 항 노치 -1 항체의 인간화된
숙주 동물에서 면역화에 의해 생성된 본 발명의 항 노치-1 항체를 다양한 방법으로 조작하여 그의 생물 활성 및 약학적 성질을 증대시킬 수 있음은 본 발명이 고려한 것이다. 상기 조작의 한 방법은 인간화이다.
단클론성 항체를 인간화시키기 위한 일반적인 4 단계가 존재한다. 상기 단계는 (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예상되는 아미노산 서열 결정, (2) 인간화된 항체 설계, 즉, 인간화 과정동안 사용하기 위한 항체 프레임워크 영역 결정, (3) 실제적인 인간화 방법/기술, 및 (4) 인간화된 항체의 형질감염 및 발현이다(예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; 및 6,180,370 호 참조).
인간 불변 도메인에 융합된 설치류 또는 변형된 설치류 V 영역 및 그의 결합 CDR을 갖는 키메라 항체를 포함하여, 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 항원-결합 부위를 포함하는 많은 "인간화된" 항체 분자가 기술되었다(예를 들면, 문헌 [Winter et al., Nature 349:293-299 (1991); Lobuglio et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989); Shaw et al., J. Immunol. 138:4534-4538 (1987); and Brown et al., Cancer Res. 47:3577-3583 (1987)] 참조). 다른 참조문헌들은 적절한 인간 항체 불변 도메인과 융합되기 전에 인간 지지 프레임워크 영역(FR)내에 그래프트된 설치류 CDR을 기술하고 있다(예를 들면, 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-237 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); and Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)] 참조). 또 다른 참조문헌은 재조합 처리된 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지된 설치류 CDR을 기술하고 있다(예를 들면, 유럽 특허 공개 제 0519596 호 참조). 이들 "인간화된" 분자들은 인간 수용자에서 상기 잔기의 치료적 용도의 지속기간 및 효능을 제한하는 설치류 항-인간 항체 분자에 대한 원치않는 면역학적 반응을 최소화하도록 설계된다. 예를 들면, 항체 불변 영역은 면역학적으로 불활성이도록(예를 들면, 보체 용해를 유발하지 않도록) 조작될 수 있다(예를 들면, PCT 공개공보 PCT/GB99/01441 호; UK 특허출원 제 9809951.8 호 참조). 또한 사용될 수 있는 항체를 인간화하는 다른 방법은 문헌 [Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991)] 및 미국 특허 제 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671; 및 6,350,861 호; 및 PCT 공개공보 WO 01/27160 호에 개시되어 있다.
인간 항 노치-1 항체
특정 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 시판하는 마우스를 사용하여 완전 인간 항 노치-1 항체를 수득할 수 있음은 본 발명이 고려한 것이다. 보다 바람직하거나(예를 들면, 완전 인간 항체) 또는 보다 강력한 면역 반응을 발생하도록 설계된 유전자전이 동물도 또한 인간화된 또는 인간 항체의 생성에 사용될 수 있다. 상기 기술의 예는 앱제닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc. 캘리포니아주 프리몬트)의 제노마우스(Xenomouse, 등록상표) 및 메다렉스 인코포레이티드(Medarex, Inc. 뉴저지주 프린스턴)의 휴맵-마우스(HuMAb-Mouse, 등록상표) 및 TC 마우스(등록상표)이다.
완전 인간 항 노치-1 항체가 파지 디스플레이 기술의 일반적인 방법에 따라 재조합적으로 수득될 수 있음도 또한 본 발명이 고려한 것이다(예를 들면, 미국 특허 제 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150 호; 및 문헌 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)] 참조).
또는, 파지 디스플레이 기술[McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]은 비면역화 공여체로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터, 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 상기 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자를 인-프레임(in-frame)으로 섬유상 박테리오파지의 주 또는 부 외피 단백질 유전자, 예를 들면, M13 또는 fd 내에 클로닝시키고, 파지 입자의 표면상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이시킨다. 섬유상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 복사체를 함유하기 때문에, 항체의 기능성을 기초로 한 선택은 또한 상기 성질을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 제공한다. 따라서, 파지는 B 세포의 성질의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다(검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조하시오). V-유전자 절편의 여러 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서는 면역화 마우스의 비장으로부터 유도된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 분리하였다. 면역화 인간 공여체로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구성될 수 있으며, 다양한 배열의 항원(자가-항원 포함)에 대한 항체는 문헌 [Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 91993)]에 기술된 기술에 따라 필수적으로 분리될 수 있다. 자연적 면역 반응에서, 항체 유전자는 고비율로 돌연변이를 축적한다(체세포 초돌연변이). 도입된 변화의 일부는 보다 높은 친화도를 제공하며, 고-친화성 표면 면역글로불린을 나타내는 B 세포는 후속 항원 자극시에 우선적으로 복제되고 분화된다. 상기 자연적 과정은 "쇄 셔플링(chain shuffling)"으로 알려진 기술을 이용하여 모방될 수 있다[Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)]. 상기 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화도는, 비면역화 공여체로부터 수득된 V 영역 유전자의 천연 변이체(레퍼토리)의 레퍼토리로 중쇄 및 경쇄 V 도메인 유전자를 순차적으로 치환시킴으로써 개선될 수 있다. 상기 기술은 pM-nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생성을 가능케 한다. 매우 거대한 항체 레퍼토리("라이브러리중 최대"로도 알려져 있음)의 제조 방법이 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)]에 기술되었다.
유전자 셔플링은 또한 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있는데, 이때 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인"으로도 지칭되는 상기 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자는 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 치환되어 설치류-인간 키메라를 생성한다. 항원상의 선별에 의해 기능성 항원-결합 부위를 복원할 수 있는 인간 가변 영역의 분리가 이루어진다, 즉, 에피토프가 상대짝의 선택을 결정한다(각인시킨다). 상기 과정을 남은 설치류 V 도메인을 치환시키기 위해 반복하는 경우, 인간 항체가 수득된다(PCT 공개공보 WO 93/06213 호 참조). CDR 그래프팅에 의한 설치류 항체의 전통적 인간화와 달리, 상기 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기를 갖지 않는, 완전 인간 항체를 제공한다.
상기 논의는 인간화된 항체 및 인간 항체에 관한 것이지만, 논의된 일반적 원리는, 예를 들면, 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에 사용하기 위한 제작 항체에 적용가능하다. 본원에 기술된 항체를 인간화시키는 하나 이상의 양태들, 예를 들면, CDR 그래프팅, 프레임워크 돌연변이 및 CDR 돌연변이는 조합될 수 있다.
재조합적으로 제조된 조작되고 변형된 항 노치-1 항체
일반적으로, 항체는 목적 항체의 DNA 서열을 발현 벡터내에 위치시킨 후, 이. 콜라이(E. coli) 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포를 포함하나 이로 한정되지는 않는 숙주 세포에서 형질감염 및 발현시킴으로써 재조합적으로 제조될 수 있다(PCT 특허 공개공보 WO 87/04462 호 참조). 유전자전이 식물 세포 또는 유전자전이 유세포와 같은 다른 숙주 세포도 또한 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Peeters, et al., Vaccine 19:2756 (2001); Longberg, N and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65 (1995); and Pollock et al., J. Immunol Methods 231:147 (1999)] 참조).
항체는 또한 재조합적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 DNA는 뮤린 항체 DNA의 상동성 뮤린 서열 대신에[Morrision et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984)], 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 암호화 서열에 공유 결합시킴으로써 사용될 수 있다. 유사한 방법으로, 본 발명의 항 노치-1 단클론성 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조될 수 있다.
항체 가변 영역은 또한 CDR 그래프팅에 의해 변형될 수 있다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하므로, 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열상에 그래프트된 특이적 천연 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써 특이적 천연 항체의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(예를 들면, 문헌 [Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327 (1998); Jones, P. et al., Nature 321:522-525 (1986); Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033 (1989)]; 윈터(Winter)의 미국 특허 제 5,225,539 호; 및 퀸(Queen) 등의 미국 특허 제 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 호 참조).
따라서, 개시내용의 또 다른 측면은 서열번호: 18, 19 및 20으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 12, 13 및 14로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론성 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 따라서, 상기 항체는 단클론성 항체 N248A의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체로부터의 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다. 상기 프레임워크 서열은 생식계 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 발표된 표준서열로부터 수득될 수 있다.
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 해당 항체의 하나 이상의 결합 성질(예를 들면, 친화도)을 개선하는 것이다. 부위-지향 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)을 도입할 수 있으며, 항체 결합 또는 해당하는 다른 기능성에 대한 영향은 본원에 기술된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 분석법으로 평가할 수 있다. 전형적으로, 보존적 변형(하기에서 논의하는 바와 같이)을 도입한다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 또한, 전형적으로 CDR 영역내 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변이된다.
보존적 치환 및 항체 친화도 성숙은 뒤의 단락에서 보다 상세히 논의될 것이다.
항체가 결합하는 항원 에피토프의 지도작성
항원상의 단클론성 항체의 결합 에피토프는 항원-항체 상호작용의 유형에 따라 많은 방법에 의해 지도화될 수 있다.
항체가, 그 결합이 통상적으로 항원 입체형태적 변화에 의해 영향받지 않는 항원에서 연속 아미노산 서열로 이루어진 단일 에피토프에 결합하는 경우, 상기 결합 에피토프는 선형 에피토프로 불린다. 펩티드 스캐닝 방법이 선형 결합 에피토프를 확인하기 위해 통상적으로 사용되는데(문헌 [Journal of Immunological Methods, Volume 315, Issues 1-2, pages 11-18 (August 2006)] 참조), 상기 방법은 전체 길이의 항원 서열을 포함하는 일련의 중복되는 10 내지 15량체 펩티드의 합성을 요한다. 상기 펩티드는 이중 점 포맷으로 단백질-가교-결합 막 상에 배열된다. 펩티드 배열에 대한 항체 결합 친화도는 ELISA에 유사하게 분석된다. 펩티드-배열된 막을 먼저 5% 소 태아 혈청을 함유하는 1 X PBST 중에서 배양하여 비특이적 결합을 차단한 후, 시험 항체 또는 비특이적 대조군 항체와 함께 배양한 후 HRP-표지된 제 2의 항체와 함께 배양한다. 항체 결합 강도는 화학발광 영상화 기기를 사용하여 판독한다.
또는, 선형 결합 에피토프는, 효모 세포 표면상에 디스플레이된 항원 단백질 도메인을 이용하거나(문헌 [Journal of Molecular Biology, 365(1), 196-200 (January 2007)] 참조), 또는 세균 세포 표면상에 디스플레이된 항원 단백질 단편을 이용(문헌 [FEMS Micorbiol. Lett., 226(2), 347-353 (September 2003); Nature Methods, 5(12), 1039-1045 (November 2008)] 참조)한 후, 유세포측정 분류 또는 FACS에 의해 확인할 수 있다.
질량 분광분석과 함께, 펩티드 항원 및 항체 복합체의 제한된 단백질분해는 선형 결합 에피토프를 위치시키기 위한 또 다른 접근방법을 제공할 수 있다(문헌 [Methods Mol. Biol., 524, 87-101 (2009)] 참조). 항원 및 항체는 혼합되어 결합 복합체를 형성하기에 적절한 조건에서 배양되며, 상기 결합 복합체는 온도 및 시간 제어하에 프로테아제에 의해 분해된다. 이어서, 결합된 반응 혼합물을 단백질-A 친화 컬럼에 통과시켜 항원 에피토프 단편과 결합된 항체를 보유하고, 이것은 컬럼으로부터 용출시킨 후에 질량 분광분석으로 분석한다.
입체형태적 에피토프의 지도작성은 그의 천연 입체형태의 항원에 대한 항체의 상호작용에 따라 달라진다. 입체형태 에피토프를 측정하는데 유용한 많은 기술이 보고되었다. 통상적으로 사용되는 방법중 하나는 아미노산 돌연변이유발이다. 항체와 결합하는 것으로 추정되는 항원 단백질 중 개개 아미노산 잔기를 돌연변이시키고, 이어서 돌연변이된 항원 단백질을 발현시키고 항체 결합 분석에 적용하여 결합 친화도가 손상되었는지를 측정한다. 그러나, 완전 항원 단백질 서열 전체에 걸쳐 조직적 아미노산 돌연변이유발은 까다롭다. 항체와 상호작용하는 항원 단백질의 영역을 좁히기 위해, 개개의 항원 도메인을 밀접하게 관련된 단백질 도메인으로 치환시키는 것이 유용한 방법일 수 있다(문헌 [J. Biol. Chem., 274(14):9617-9625 (April 1999)] 참조).
숏건(shotgun) 돌연변이유발 지도작성은 통상적인 아미노산 돌연변이의 단점을 해결하기 위해 개발되었다(문헌 [J. American Chem. Soc, 131, 6952-6954 (2009)] 참조). 상기 방법은 항원 암호화 영역의 모든 아미노산을 포함하는 유일 점 돌연변이 및 전체 돌연변이 라이브러리를 함유하는 각 플라스미드 클론과 함께 항원 cDNA로부터 제조된 포괄적 돌연변이 라이브러리를 사용한다. 플라스미드 클론의 라이브러리는 HEK-293T 또는 다른 인간 세포에 형질감염시키고, 이어서 세포를 384-웰 마이크로플레이트에 배열시킨다. 항체 결합 활성은 마이크로플레이트 상에 세포의 고정 후에 분석한다. 아미노산 돌연변이가 반응성의 손실을 야기한 경우, 항체 결합 에피토프로 확인된다.
항원-항체 복합체의 공결정화, X-선 회절 및 구조적 분석에 의해 항원-항체 상호작용의 방향 가시화가 이루어진다. 아미노산 돌연변이유발과 조합되는 경우, 상기 기술은 항체 결합 에피토프에 대한 강력한 증거 및 명확한 파악을 제공한다. 그러나, 공결정화 및 구조적 분석은 기술적으로 쉽지않으며, 다량의 정제된 항원 및 항체를 필요로 하고, 시간-소모적 시행착오 과정일 수 있다.
에피토프 또는 에피토프의 특정 세트에 결합하는 항 노치-1 항체를 제조하기 위해, 항 노치-1 항체를 제조한 후, 일반적으로 당해 분야에 공지된 상기 지도작성 방법에 따라 상기 항체 각각이 결합하는 에피토프 또는 에피트포의 세트를 결정할 수 있다. 이어서, 특정 에피토프 또는 에피토프의 특정 세트에 결합하는 항 노치-1 항체를 선택할 수 있다.
보존적 치환
앞에서 논의한 바와 같이, 항체는 또한 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기의 보존적 치환에 의해, 또는 항체에 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 부가에 의해 재조합적으로 변형될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 수백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합, 뿐 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환에서 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
치환 변이체는 제거된 항체 분자중 하나 이상의 아미노산 잔기 및 그 위치에 삽입된 상이한 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이유발에 가장 유리한 부위는 초가변 영역을 포함하나, FR 변형도 또한 고려된다. 보존적 치환은 표 2에 나타내었다. 상기 치환이 생물 활성에 변화를 야기하면, 표 2에 "예시적 치환"으로 지칭되거나 또는 아미노산 부류에 관해 하기에 더 기술된 보다 실질적인 변화가 도입되고 생성물이 선별될 수 있다.
아미노산 치환
원래 잔기 보존적 치환 예시적 치환
Ala(A) Val Val; Leu; Ile
Arg(R) Lys Lys; Gln; Asn
Asn(N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg
Asp(D) Glu Glu; Asn
Cys(C) Ser Ser; Ala
Gln(Q) Asn Asn; Glu
Glu(E) Asp Asp; Gln
Gly(G) Ala Ala
His(H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg
Ile(I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신
Leu(L) Ile 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys(K) Arg Arg; Gln; Asn
Met(M) Leu Leu; Val; Ile
Phe(F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Try
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr Tyr; Phe
Tyr(Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser
Val(V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신
항체의 생물학적 성질에서의 실질적인 변형은, (a) 예를 들면, 시트 또는 나선형 입체형태로서, 치환 영역중 폴리펩티드 주쇄의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄 부피를 유지하는데 그의 영향이 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 잔기는, 공통적 측쇄 성질을 기준으로 군으로 분류된다:
(1) 비극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 전하없이 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성(음으로 하전): Asp, Glu;
(4) 염기성(양으로 하전): Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
비-보존적 치환은 상기 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함으로써 이루어진다.
항체의 적절한 입체형태를 유지하는데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기도 또한, 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적 가교-결합을 방지할 수 있다. 반대로, 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 그의 안정성을 개선시킬 수 있다.
친화도 성숙 항 노치-1 항체
본 발명은 친화도 성숙 태양을 포함한다. 예를 들면, 친화도 성숙 항체는 당해 분야에 공지된 절차에 의해 생성될 수 있다(문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-3319 (1995); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)]; 및 PCT 공개공보 WO 2004/058184 호).
하기의 방법들을 항체의 친화도를 조정하고 CDR을 특성화하기 위해 사용할 수 있다. 항체의 CDR을 특성화하고/하거나 항체와 같은 폴리펩티드의 결합 친화도를 변화(예를 들면, 개선)시키는 한 방법은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭된다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 다음과 같이 진행된다. CDR중 하나 이상의 아미노산을 당해 분야에 인지된 방법을 이용하여 2개 이상(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 아미노산으로 치환시킨다. 이에 의해 클론의 소형 라이브러리(일부 태양에서, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 1개)가 생성되며, 이 각각은 2개 이상의 구성원의 복잡성을 갖는다(모든 위치에서 2개 이상의 아미노산이 치환되는 경우). 일반적으로, 라이브러리는 또한 천연(비치환) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각 라이브러리로부터 소수의 클론, 예를 들면, 약 20 내지 80개 클론(라이브러리의 복잡성에 따라)을 표적 폴리펩티드(또는 다른 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 대해 검색하고, 증가되거나, 동일하거나, 감소되거나 또는 결합하지 않는 후보를 확인한다.
일부 태양에서는, CDR중 모든 아미노산 위치가 당해 분야에 인지된 돌연변이유발 방법을 이용하여, 일부 태양에서, 모든 20개 천연 아미노산으로 차례로 치환된다. 이에 의해 클론의 소형 라이브러리, 일부 태양에서, 모든 20개 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우, 각각 20개 구성원의 복잡성하에, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 하나의 라이브러리가 생성된다.
일부 태양에서, 검색될 라이브러리는 동일 CDR이거나 2개 이상의 CDR일 수 있는 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함한다. 따라서, 상기 라이브러리는 한 CDR중 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR에서 2개 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR에서 발견되는 3, 4, 5개 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 상기 치환은 낮은 중복성(redundancy) 코돈을 사용하여 제조할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Balint et al., Gene 137(1):109-118 (1993)]의 표 2 참조). 각각의 CDR은 카밧 CDR, 초티아 CDR 또는 연장 CDR일 수 있다.
개선된 결합을 나타내는 후보를 서열분석함으로써 개선된 친화도를 제공하는 CDR 치환 돌연변이체를 확인할 수 있으며, 상기 치환은 또한 "개선된" 치환으로 지칭될 수 있다. 결합하는 후보도 또한 서열분석함으로써 결합을 보유하는 CDR 치환을 확인할 수 있다.
여러회의 검색을 수행하였다. 예를 들면, 각각 개선된 결합하에 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 후보는 또한, 각각의 개선된 CDR 위치(즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타낸 CDR에서의 아미노산 위치)에 적어도 원래 및 치환된 아미노산을 함유하는 제 2의 라이브러리의 설계에 유용하다. 상기 라이브러리의 제조 및 검색 또는 선별은 하기에서 더 논의한다.
라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 또한, 개선된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합을 가지거나 또는 결합을 갖지 않는 클론의 빈도가 항체-항원 복합체의 안정성을 위해 각각의 아미노산 위치의 중요성에 관한 정보를 제공하는 한, CDR을 특성화하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들면, CDR의 위치가 모든 20개 아미노산으로 변화될 때 결합을 보유하는 경우, 상기 위치는 항원 결합에 필요하지 않을 것 같은 위치로 확인된다. 반대로, CDR의 한 위치가 단지 적은 비율의 치환에서 결합을 보유하는 경우, 상기 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 방법은 많은 상이한 아미노산(20개 아미노산 전부를 포함하여)으로 변화될 수 있는 CDR에서의 위치, 및 변화될 수 없거나 몇개의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR에서의 위치에 관한 정보를 제공한다.
개선된 친화도를 갖는 후보는 그 위치에서 원래 아미노산인 개선된 아미노산을 포함하는 제 2의 라이브러리에서 조합될 수 있으며, 또한 목적하는 라이브러리의 복잡성에 따라 상기 위치에서 추가의 치환을 포함할 수 있거나 또는 바람직한 검색 또는 선별 방법을 사용하여 허용될 수 있다. 또한, 경우에 따라, 인접 아미노산 위치는 2개 이상의 아미노산에 무작위배정될 수 있다. 인접 아미노산의 무작위배정은 돌연변이 CDR에서 추가의 입체형태 유연성을 허용할 수 있으며, 이것은 차례로 보다 많은 수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 촉진할 수 있다. 라이브러리는 또한 1차 주기의 검색에서 개선된 친화도를 나타내지 않은 위치에서 치환을 포함할 수 있다.
제 2의 라이브러리는, 비아코어 표면 플라스몬 공명 분석을 사용한 검색, 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이를 포함하여 선별을 위한 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용한 선별을 포함하여, 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 개선되고/되거나 변형된 결합 친화도를 갖는 라이브러리 구성원에 대해 검색 또는 선별된다.
항 노치-1 항체의 번역후 변형
항체는 또한 다양한 당에 의한 글리코실화, 아세틸화 및 포스포릴화를 포함하나 이로 한정되지는 않는 번역후 변형에 의해 변형될 수 있다. 항체는 그의 불변 영역에서 보존된 위치에서 글리코실화된다. 면역글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능[Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 (1996); Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180 (1990)], 및 당단백질의 입체형태 및 제공된 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있는, 당단백질의 위치들 간의 분자내 상호작용[Jefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416 (1996)]에 영향을 미친다. 올리고사카라이드는 또한 주어진 당단백질을 특이적 인식 구조를 기초로 주어진 당단백질을 특정 분자에 표적화하는 역할을 할 수 있다. 항체의 글리코실화는 또한 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에도 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 생성을 촉진하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포가 개선된 ACDD 활성을 갖는 것으로 보고되었다[Umane et al., Mature Biotech. 17:176-180 (1999)].
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-결합되거나 O-결합된다. N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 잔기의 결합을 말한다. 삼중펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 효소적 결합의 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드중 상기 삼중펩티드 서열의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-결합된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 흔히는 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 결합을 말하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 4-하이드록시라이신도 또한 사용될 수 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열이 하나 이상의 전술한 삼중펩티드 서열을 함유하도록 상기 아미노산 서열을 변이시킴으로써(N-결합 글리코실화 부위의 경우) 편리하게 수행된다. 변이는 또한 원래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌의 부가에 의해 또는 그에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다(O-결합 글리코실화 부위의 경우).
항체의 글리코실화 패턴은 또한 밑줄 친 뉴클레오티드 서열을 변이시키지 않고 변이될 수 있다. 글리코실화는 항체를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 따라 크게 달라진다. 잠재적 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들면, 항체의 발현에 사용되는 세포 유형은 천연 세포가 드물기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴에서의 변화가 예상될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070 (1997)] 참조).
숙주 세포의 선택이외에, 항체의 재조합 생산시 글리코실화에 영향을 미치는 요인으로는 성장 방식, 배지 배합, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 방법 등이 포함된다. 올리고사카라이드 생성에 수반되는 특정 효소를 도입하거나 과발현시키는 것을 포함하여, 특정 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변이시키기 위한 다양한 방법들이 제안되었다(미국 특허 제 5,047,335; 5,510,261 및 5,278,299 호). 글리코실화 또는 특정 유형의 글리코실화는, 예를 들면, 엔도글리코시다제 H(엔도 H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 사용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 폴리사카라이드를 가공하는데 결함이 있도록 유전자 조작될 수 있다. 상기 기술 및 유사한 기술들이 당해 분야에 공지되어 있다.
번역후 변형의 다른 방법들은 효소적 방법, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하나 이로 한정되지는 않는, 당해 분야에 공지된 커플링 기술들을 이용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들면, 면역분석용 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다.
변형된 불변 영역을 갖는 항 노치-1 항체
본 발명의 일부 태양에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예를 들면, 면역학적으로 불활성 또는 부분적으로 불활성인, 예를 들면, 보체 매개 용해를 유발하지 않거나 또는 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않거나 또는 미세아교세포를 활성화시키지 않거나; 또는 보체 매개 용해를 유발하거나 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하거나 또는 미세아교세포를 활성화시키는 것 중 임의의 하나 이상에서 감소된 활성(비변형 항체에 비해)을 갖는 불변 영역을 포함한다. 불변 영역의 다양한 변형을 이용하여 이펙터 기능의 최적 수준 및/또는 조합을 달성할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Morgan et al., Immunology 86:319-324 (1995); Lund et al., J. Immunology 157:4963-4969 (1996); Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Tae et al., J. Immunology 143:2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998)] 참조). 일부 태양에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol. 29:2613-2624 (1999)]; PCT 출원 PCT/GB99/01441 호; 및/또는 UK 특허출원 제 9809951.8 호에 기술된 바와 같이 변형된다. 다른 태양에서, 항체는 다음의 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역을 포함한다: A330P331에서 S330S331로(야생형 IgG2 서열에 관한 아미노산 번호)[Eur. J. Immunol. 29:2613-2624 (1999)]. 또 다른 태양에서, 불변 영역은 N-결합 글리코실화시 비글리코실화된다. 일부 태양에서, 불변 영역은, 불변 영역중 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 글리코실화된 아미노산 잔기 또는 인접 잔기를 돌연변이시킴으로써 N-결합 글리코실화시 비글리코실화된다. 예를 들면, N-글리코실화 부위 N297은 A, Q, K 또는 H로 돌연변이될 수 있다(문헌 [Tao et al., J. Immunology 143:2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998)] 참조). 일부 태양에서, 불변 영역은 N-결합 글리코실화시 비글리코실화된다. 불변 영역은 N-결합 글리코실화시 효소적으로(예를 들면, 효소 PNG아제에 의해 탄수화물을 제거함으로써) 또는 글리코실화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 비글리코실화될 수 있다.
Fc 영역 내에서의 변형은 전형적으로 항체의 하나 이상의 작용성, 예를 들면, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변화시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 개시된 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예를 들면, 하나 이상의 화학 잔기가 항체에 결합될 수 있다) 또는 그의 글리코실화 패턴을 변화시키기 위해, 또한 항체의 하나 이상의 작용성을 변화시키기 위해 변형될 수 있다. 상기 측면들 각각은 하기에서 더 상세히 기술한다. Fc 영역중 잔기의 번호는 카밧의 EU 지침의 번호이다.
한 경우에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역중 시스테인 잔기의 수가 변화, 예를 들면, 증가 또는 감소되도록 변형된다. 상기 접근방법은 미국 특허 제 5,677,425 호에 더 기술되어 있다. CH1의 힌지 영역중 시스테인 잔기의 수는, 예를 들면, 경쇄 및 중쇄의 구성을 촉진하도록 또는 항체의 안정성을 감소시키도록 변화된다.
또 다른 경우에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 특히, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 스태필로코킬( Staphylococcyl) 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역내에 도입된다. 상기 접근방법은 미국 특허 제 6,165,745 호에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 경우에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근방법이 가능하다. 예를 들면, 다음 돌연변이중 하나 이상이 도입될 수 있다: 미국 특허 제 6,277,375 호에 기술된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 또는, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는, 미국 특허 제 5,869,046 및 6,121,022 호에 기술된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취한 재사용(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역내에서 변이될 수 있다.
또 다른 경우에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능(들)을 변화시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 치환시킴으로써 변이된다. 예를 들면, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변화된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 그에 대한 친화도가 변화되는 이펙터 리간드는, 예를 들면, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 상기 접근방법은 미국 특허 제 5,624,821 및 5,648,260 호에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 경우에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 변화된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 배제된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 상기 접근방법은 미국 특허 제 6,194,551 호에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 예로, 아미노산 위치 231 및 239내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변이되어 보체를 고정시키는 항체의 능력이 변화된다. 상기 접근방법은 PCT 공개공보 WO 94/29351 호에 더 기술되어 있다.
또 다른 예에서, Fc 영역은, 다음 위치에서의 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/시키거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 상기 접근방법은 PCT 공개공보 WO 00/42072 호에 더 기술되어 있다. 또한, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위를 지도화하였으며, 개선된 결합을 갖는 변이체를 기술하였다(문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)] 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특정 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선하는 것으로 나타났다. 또는, 다음의 조합 돌연변이체가 FcγRIII 결합을 개선하는 것으로 나타났다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
또 다른 예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들면, 비글리코실화 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화가 결여된다). 글리코실화는, 예를 들면, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형될 수 있다. 상기 탄수화물 변형은, 예를 들면, 항체 서열내 하나 이상의 글리코실화 부위를 변화시킴으로서 수행될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 야기함으로써 그 부위에서 글리코실화를 배제시키는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 상기 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 상기 접근방법은 미국 특허 제 5,714,350 및 6,350,861 호에 더 상세히 기술되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변형된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예를 들면, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체, 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 상기 변형된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 상기 탄수화물 변형은, 예를 들면, 변형된 글리코실화 기전을 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 수행될 수 있다. 변형된 글리코실화 기전을 갖는 세포는 당해분야에서 기술되었으며, 개시된 재조합 항체를 발현시킴으로써 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자 FUT8(알파 (1,6) 푸코실트랜스퍼라제)가 결여되어, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 그의 탄수화물상에 푸코스가 결여된다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 치환 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화 파괴에 의해 생성되었다(미국 특허 공개 제 2004-0110704 호, 및 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng 87:614-622 (2004)] 참조). 또 다른 예로서, 유럽 특허 공개 EP 1,176,195 호는 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기술하고 있는데, 상기 세포주에서 발현된 항체는 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소 또는 제거시킴으로써 저푸코실화를 나타낸다. EP 1,176,195 호는 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가시키기 위한 낮은 효소 활성을 가지거나 또는 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예를 들면, 래트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)을 기술하고 있다. PCT 공개공보 WO 03/035835 호는 푸코스를 Asn(297)-결합된 탄수화물에 결합시키는 능력이 감소되어, 또한 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 야기하는 변이 CHO 세포주 Lec13 세포를 기술하고 있다(또한 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740 (2002)] 참조). PCT 공개공보 WO 99/54342 호는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제[예를 들면, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)]를 발현하도록 조작되어, 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 증가된 ADCC 활성을 제공하는 세포주를 기술하고 있다(또한 문헌 [Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180 (1999)] 참조). 또는, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들면, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다[Tarentino et al., Biochem. 14:5516-5523 (1975)].
개시내용에 포함되는 본 발명의 항체의 또 다른 변형은 PEG화(pegylation)이다. 항체는, 예를 들면, 항체의 생물학적(예를 들면, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해, 항체 또는 그의 단편을 전형적으로, 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 결합되게 하는 조건하에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들면, PEG의 반응성 에스터 또는 알데하이드 유도체와 반응시킨다. 전형적으로, PEG화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질, 예를 들면, 모노(C1 내지 C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용된 PGE의 임의의 형태를 포함하는 것이다. 특정 경우에서, PEG화될 항체는 비글리코실화 항체이다. 단백질을 PEG화시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 개시내용의 항체에 적용될 수 있다(예를 들면, 유럽 특허 EP 0154316 B1 및 EP 0401384 B1 호 참조).
다른 항체 변형은 PCT 공개공보 WO 99/58572 호에 기술된 바와 같인 변형된 항체를 포함한다. 이들 항체는, 표적 분자에 대한 결합 도메인 이외에, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부와 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이들 항체는 표적의 상당한 보체 의존성 용해 또는 세포-매개 파괴를 유발하지 않고 표적 분자에 결합될 수 있다. 일부 태양에서, 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유도된 키메라성 도메인을 기초로 한다. 상기 방식으로 변형된 항체는 통상적인 항체 치료에 염증 및 다른 부작용을 배제하기 위해 만성 항체 치료에 사용하기에 특히 적합하다.
융합 단백질
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 태양에서, 본 발명의 항체의 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 태양에서, 가변 경쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산, 및/또는 가변 중쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 태양에서, 융합 폴리펩티드는 본 발명 항체의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 태양에서, 융합 폴리펩티드는 본 발명 항체의 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다. 본 발명에 있어서, 융합 단백질은 하나 이상의 항체, 및 천연 분자에서는 그에 결합되지 않는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들면, 또 다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 상동 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열로는 FLAG 태그 또는 6His 태그와 같은 "태그"가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
융합 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다.
이중특이성 분자
개시된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 또 다른 작용성 분자, 예를 들면, 또 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들면, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도체화되거나 그에 결합되어, 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이성 분자를 생성할 수 있다. 개시된 항체는 실제로 하나보다 많은 다른 작용성 분자로 유도체화되거나 그에 결합되어 2개 이상의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이성 분자를 생성할 수 있으며; 상기 다중특이성 분자는 또한 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이중특이성 분자"에 포함된다. 개시된 이중특이성 분자를 생성하기 위해, 개시된 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들면, 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 작용적으로 결합되어(예를 들면, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 등에 의해), 이중특이성 분자가 생성될 수 있다.
항 노치-1 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물을 제공한다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 태양에서, 상기 조성물은 본 발명의 임의의 항체 또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.
임의의 상기 서열에 상보성인 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있으며, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는, 인트론을 함유하고 1 대 1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 또 다른 코딩 또는 비-코딩 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나 반드시 그렇지는 않으며, 상기 폴리뉴클레이티드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 결합될 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, 항체 또는 그의 일부를 암호화하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 상기 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는, 암호화된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 암호화된 폴리펩티드의 면역반응성의 효과는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 항체 또는 그의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 약 70% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성을 나타낸다.
하기에 기술하는 바와 같이 최대 상응성으로 배열될 때 2개 서열중 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 동일한 경우, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 "동일하다"고 한다. 두 서열간의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역들을 확인하고 비교하는 비교 창에 대해 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같은 "비교 창"은 두 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열에 대해 서열을 비교할 수 있는, 약 20개 이상의 인접 위치, 통상적으로 30 내지 약 75개 또는 40 내지 약 50개의 인접 위치의 절편을 말한다.
바람직하게, "서열 동일성 퍼센트"는 20개 이상의 위치의 비교창에 대해 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되는데, 이때 비교창에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않는)에 비해 20% 이하, 통상적으로는 5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 퍼센트는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 측정하여 부합되는 위치의 수를 얻고, 부합되는 위치의 수를 기준 서열중 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 퍼센트를 수득함으로써 산출된다.
변이체는 또한, 또는 대안적으로, 천연 유전자 또는 그의 일부분 또는 보체에 실질적으로 상동성이다. 상기 폴리뉴클레오티드 변이체는 중간정도의 엄격한 조건하에서 천연 항체를 암호화하는 천연 DNA 서열(또는 상보성 서열)에 하이브리드화될 수 있다.
적합한 "중간정도로 엄격한 조건"은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액으로 미리 세척하고; 50 내지 60 ℃에서 5X SSC 중에서 밤새 하이브리드화시킨 후; 65 ℃에서 20 분동안 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각으로 2회 세척하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "고도로 엄격한 조건" 또는 "고도의 엄격성 조건"은 다음과 같은 조건이다: (1) 세척에 저이온 농도 및 고온, 예를 들면, 50 ℃에서 0.015M 염화나트륨/0.0015M 나트륨 시트레이트/0.1% 나트륨 도데실 설페이트를 사용하거나; (2) 하이브리드화시, 42 ℃에서 750mM 염화나트륨, 75mM 나트륨 시트레이트와 함께 pH 6.5에서 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 나트륨 포스페이트 완충제와 함께, 폼아미드, 예를 들어, 50%(v/v) 폼아미드와 같은 변성제를 사용하거나; 또는 (3) 42 ℃에서 0.2X SSC(염화나트륨/나트륨 시트레이트) 및 55 ℃에서 50% 폼아미드로 세척한 후 55 ℃에서 EDTA를 함유하는 0.1X SSC로 이루어지는 고-엄격성 세척하에, 42 ℃에서 50% 폼아미드, 5X SSC(0.75M NaCl, 0.075M 나트륨 시트레이트), 50mM 나트륨 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 5X 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA(50 ㎍/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용한다. 숙련된 전문가라면 프로브 깊이 등과 같은 요인들을 조절하기 위해 필요한 대로 온도, 이온 농도 등을 조정하는 방법을 인지할 것이다.
당해 분야의 통상의 기술을 가진 자라면 유전자 코드의 변성의 결과로서 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재함을 인지할 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드의 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용빈도의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드는 특히 본 발명에 포함된다. 또한, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자도 본 발명의 범위에 포함된다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 결실, 부가 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이의 결과로서 변이되는 내인성 유전자이다. 그 결과 수득되는 mRNA 및 단백질은 변이된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 반드시 그렇지는 않다. 대립유전자는 표준 기술(예를 들면, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 수득할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우, 본원에서 더 논의되는 바와 같이, 목적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 벡터내에 삽입할 수 있고, 상기 벡터는 차례로 복제 및 증폭을 위해 적당한 숙주 세포내에 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포내에 삽입될 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드를 직접 흡수, 내포작용(endocytosis), 형질감염, F-교배 또는 전기천공에 의해 도입함으로써 세포를 형질전환시킨다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포내에 비-통합 벡터(예를 들면, 플라스미드)로서 유지되거나 또는 숙주 세포 게놈내에 통합될 수 있다. 그렇게 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 분리될 수 있다(예를 들면, 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌(1989) 참조).
또는, PCR은 DNA 서열의 재생산을 가능케한다. PCR 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며, 미국 특허 제 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202 호, 및 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., Birkauswer Press, Boston (1994)]에 기술되어 있다.
RNA는 적절한 벡터에 분리된 DNA를 사용하고 적당한 숙주 세포내에 삽입함으로써 수득될 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 이어서 RNA는, 예를 들면, 샘브룩 등의 상기 문헌(1989)에 나타낸 바와 같이, 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 방법을 이용하여 분리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구성될 수 있거나, 또는 당해 분야에서 이용가능한 많은 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 한 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제 능력을 가지며, 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대해 단일 표적을 가질 수 있으며/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커를 위한 유전자를 가질 수 있다. 적합한 예로는 플라스미드 및 세균 바이러스, 예를 들면, pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluscript)(예를 들면, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예를 들어, pSA3 및 pAT28이 포함된다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터가 바이오래드(BioRad), 스트레이트진(Strategene) 및 인비트로겐(Invitrogen)과 같은 상업적 판매회사로부터 입수가능하다.
발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물(construct)이다. 발현 벡터는 에피좀으로서 또는 염색체 DNA의 필수 부분으로서 숙주 세포에서 복제가능해야 함이 시사된다. 적합한 발현 벡터로는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스를 포함하여 바이러스 벡터, 코스미드, 및 PCT 공개공보 WO 87/04462 호에 개시된 발현 벡터(들)이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 벡터 성분들은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 조절 요소(에를 들면, 프로모터, 인핸서 및 터미네이터). 발현(즉, 번역)을 위해, 하나 이상의 번역 조절 요소, 예를 들면, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 종료 코돈이 또한 통상적으로 필요하다.
해당 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 기타 물질을 사용한 형질감염; 미세발사 충격(microprojectile bombardment); 리포펙틴; 및 감염(예를 들면, 벡터가 백신 바이러스와 같은 감염성 약제인 경우)을 포함하여 임의의 많은 적절한 방법에 의해 숙주 세포내에 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 달라진다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 해당 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비-제한 예로는 COS, HeLa 및 CHO 세포가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다(또한 PCT 공개공보 WO 87/04462 호 참조). 적당한 비-포유동물 숙주 세포로는 원핵생물(예를 들면, 이. 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스(B. subtillis)) 및 효모(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae, 쉬조사카로마이세스 폼베(S. pombe) 또는 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis))가 포함된다. 바람직하게, 숙주 세포는, 숙주 세포에서, 존재하는 경우, 상응하는 해당 외인성 항체 또는 단백질보다 약 5배, 보다 바람직하게는 10배, 보다 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현시킨다. 노치-1 또는 노치-1 도메인에 대한 특이적 결합에 대한 숙주 세포의 검색은 면역분석법 또는 FACS에 의해 수행된다. 해당 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포를 확인할 수 있다.
약학 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 약학적으로 허용되는 담체와 배합된, 본 개시내용의 단클론성 항체 또는 그의 항원-결합 부분(들) 중 하나 또는 그 혼합물을 함유하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 개시된 (2개 이상의 상이한) 항체 또는 면역접합체 또는 이중특이성 분자중 하나 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 개시된 약학 조성물은 표적 항원상의 상이한 에피토프에 결합하거나 또는 상보성 활성을 갖는 항체(또는 면역접합체 또는 이중특이성 분자)의 혼합물을 포함할 수 있다.
개시된 약학 조성물은 또한 병용 요법으로 투여될 수 있다, 즉, 다른 약제와 병용될 수 있다. 예를 들면, 병용 요법은 하나 이상의 다른 항-염증성 또는 면역억제제와 혼합된 본 발명의 항-노치-1 항체를 포함할 수 있다. 병용 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예는 하기에, 개시된 항체의 사용에 관한 부분에서 더 상세히 기술된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용가능한 임의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 전형적으로, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여(예를 들면, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉, 항체, 그의 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 이중특이성 분자는, 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 천연적 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질중에 코팅될 수 있다.
특정 태양에서, 본 개시내용의 항체는 중성 형태로(양쪽이온성 이온 형태) 또는 양 또는 음으로 하전된 종으로서 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 항체는 상대이온과 결합되어 약학적으로 허용되는 염을 생성할 수 있다. 따라서, 개시된 약학 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물 활성을 보유하고 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 말한다(예를 들면, 문헌 [Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977)] 참조). 예를 들면, 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 상대이온을 포함하는 복합체를 포함하며, 이때 상대이온은 약학적으로 허용되는 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된다.
상기 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염은 무독성 무기산, 예를 들면, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터, 및 무독성 유기산, 예를 들면, 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알카노산, 하이드록시 알카노산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유도된 염을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터, 및 무독성 유기 아민, 예를 들면, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등으로부터 유도된 염을 포함한다.
또한, 약학적으로 허용되는 무기 염기는 금속 이온을 포함한다. 금속 이온은 적절한 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염 및 다른 생리학적으로 허용되는 금속 이온을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 무기 염기로부터 유도된 염은, 그의 통상적인 원자가의 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 코발트, 니켈, 몰리브덴, 바나듐, 망간, 크롬, 셀레늄, 주석, 구리, 제 2 철, 제 1 철, 리튬, 마그네슘, 망간염, 제 1 망간, 칼륨, 루비듐, 나트륨 및 아연을 포함한다.
본 개시내용의 항체의 악학적으로 허용되는 산 부가염은 제한하지 않고 다음을 포함하는 하기의 산들로부터 제조될 수 있다: 폼산, 아세트산, 아세트아미도벤조산, 아디프산, 아스콜브산, 붕산, 프로피온산, 벤조산, 캄포산, 탄산, 시클람산, 디하이드로콜산, 말론산, 에데트산, 에틸황산, 펜디조산, 메타인산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 주석산, 시트르산, 질산, 아스콜브산, 글루쿠론산, 말레산, 폴산, 퓨마르산, 프로피온산, 피루브산, 아스파트산, 글루탐산, 벤조산, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 라이신, 이소시트르산, 트라이플루오로아세트산, 파모산, 프로피온산, 아트라닐산, 메실산, 오로트산, 옥살산, 옥살아세트산, 올레산, 스테아르산, 살리실산, 아미노살리실산, 실리케이트, p-하이드록시벤조산, 니코틴산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산, 설폰산, 메탄설폰산, 인산, 포스폰산, 에탄설폰산, 에탄다이설폰산, 암모늄, 벤젠설폰산, 판토텐산, 나프탈렌설폰산, 톨루엔설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 설파닐산, 황산, 질산, 아질산, 황산 모노메틸 에스터, 사이클로헥실아미노설폰산, β-하이드록시부티르산, 글리신, 글리실글리신, 글루탐산, 카코딜레이트, 다이아미노헥사노산, 캄포설폰산, 글루콘산, 티오시안산, 옥소글루타르산, 피리독살 5-포스페이트, 클로로페녹시아세트산, 운데카노산, N-아세틸-L-아스파트산, 갈락타르산 및 갈락투론산.
약학적으로 허용되는 유기 염기로는 다음이 포함된다: 트라이메틸아민, 다이에틸아민, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, 클로로프로카인, 콜린, 다이벤질아민, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 메글루민 (N-메틸글루카민), 프로카인, 사이클릭 아민, 4급 암모늄 양이온, 아르기닌, 베타인, 카페인, 클레미졸, 2-에틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 2-다이메틸아미노에탄올, 에탄다이아민, 부틸아민, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, N-에틸모폴린, N-에틸피페리딘, 에틸글루카민, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이미다졸, 이소프로필아민, 메틸글루카민, 모폴린, 피페라진, 피리딘, 피리독신, 네오디뮴, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 트라이에탄올아민, 트로메타민, 메틸아민, 타우린, 콜레이트, 6-아미노-2-메틸-2-헵탄올, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판다이올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알카노산, 하이드록시 알카노산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산, 스트론튬, 트리신, 하이드라진, 페닐사이클로헥실아민, 2-(N-모폴리노)에탄설폰산, 비스(2-하이드록시에틸)아미노트리스(하이드록시메틸)메탄, N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산, 1,4-피페라진다이에탄설폰산, 3-모폴리노-2-하이드록시프로판설폰산, 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]프로판, 4-모폴린프로판설폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산, 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산, 4-(N-모폴리노)부탄설폰산, 3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산, 2-하이드록시-3-[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판설폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-(2-하이드록시프로판설폰산), 피페라진-1,4-비스(2-하이드록시프로판설폰산)다이하이드레이트, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설폰산, N-트리스(하이드록시메틸)메틸-4-아미노부탄설폰산, N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산, 2-(사이클로헥실아미노)에탄설폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산, N-(2-아세트아미도)이미노다이아세트산, 4-(사이클로헥실아미노)-1-부탄설폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신, 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판다이올 및 트로메타몰.
개시된 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 산화방지제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 산화방지제의 예로는 다음이 포함된다: (1) 수용성 산화방지제, 예를 들면, 아스콜브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설페이트, 나트륨 메타바이설페이트, 나트륨 설파이트 등; (2) 유용성 산화방지제, 예를 들면, 아스코빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들면, 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라산(EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산 등.
개시된 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성유, 예를 들면, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스터, 예를 들면, 에틸 올리에이트가 포함된다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해서, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 적절한 유동성이 유지될 수 있다.
상기 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 상기 멸균 절차에 의해서 및 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 솔브산 등의 혼입에 의해서 보장될 수 있다. 등장화제, 예를 들면, 당, 염화나트륨 등을 조성물에 혼입하는 것도 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학 형태의 지연된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 약제의 혼입에 의해 이루어질 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위해 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 상기 매질 및 약제의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약제가 활성 화합물과 비상용성인 한이 아니면, 개시된 약학 조성물에 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물도 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 멸균되고 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 미세유화액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해서, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해서 및 계면활성제의 사용에 의해서, 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들면, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 혼입시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 혼입시킴으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사액은 필요한 양의 활성 화합물을 필요한 대로 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 그의 혼합물과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 후 멸균 미세여과에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 기본 분산 매질 및 상기 열거한 것들로부터 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클내에 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분 및 미리 멸균-여과시킨 그의 용액으로부터의 임의의 추가의 바람직한 성분들의 분말을 제공하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 처리되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 제공하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 상기 양은, 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 약 0.01 내지 약 99%의 활성성분, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 30%의 활성 성분의 범위일 것이다.
투여법은 최적의 목적 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들면, 단일 볼루스(bolus)를 투여할 수 있거나, 수회 분할 용량을 시간에 따라 투여할 수 있거나, 또는 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 나타나는 대로 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위형으로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같은 투여 단위형은 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 말하며; 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 미리결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 개시된 투여 단위형에 대한 특정화는 (a) 활성 화합물 및 달성될 치료 효과의 독특한 특성, 및 (b) 개개인에서 민감성의 처리를 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 분야에서 원래의 한계에 의해서 및 이들에 따라 지시된다.
항체의 투여시, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/숙주 체중 kg, 보다 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/숙주 체중 kg이다. 예를 들면, 투여량은 0.3 mg/체중 kg, 1 mg/체중 kg, 3 mg/체중 kg, 5 mg/체중 kg 또는 10 mg/체중 kg, 또는 1 내지 10 mg/kg의 범위일 수 있다. 예시적인 치료법은 1주일에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 포함한다. 개시된 항-노치-1 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 대한 투여법은, 예를 들면, 정맥내 투여에 의해 1 mg/체중 kg 또는 3 mg/체중 kg을 포함하며, 상기 항체는 다음의 투여 스케줄 중 하나를 사용하여 제공된다: (i) 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/체중 kg 1회 투여후 3주마다 1 mg/체중 kg.
일부 방법에서는, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 단클론성 항체를 동시에 투여하며, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 나타낸 범위내에 속한다. 항체는 통상적으로 여러 회로 투여된다. 단일 투여 사이의 간격은, 예를 들면, 1주일에 한번, 1개월에 한번, 3개월마다 1번 또는 1년에 1번일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈중 수준을 측정함으로써 나타낸 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1 내지 1000 ㎍/ml, 및 일부 방법에서는 약 25 내지 300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
또는, 항체는 서방성 제형으로 투여될 수 있으며, 이 경우 보다 적은 빈도의 투여가 필요하다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체는 최장 반감기를 나타내며, 그 다음 인간화된 항체, 키메라 항체 및 비-인간 항체로 이어진다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 아니면 치료적인 것인지에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서는, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그의 남은 수명동안 치료를 계속 받는다. 치료적 용도에서는, 질환의 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 및 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량이 종종 필요하다. 그 다음에, 환자는 예방 요법을 투여받을 수 있다.
본 개시내용의 약학 조성물중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은, 본 개시내용에 사용된 특정 조성물 또는 그의 에스터, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설률, 치료 기간, 다른 약물, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용된 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태, 일반적 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에 공지된 유사 요인들을 포함하여, 다양한 약동학적 요인들에 따라 달라질 것이다.
개시된 항-노치 항체의 "치료 효과적 투여량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도의 감소, 무증상 시기의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 야기하는 것이다. 예를 들면, 노치-1-양성 종양의 치료를 위해, "치료 효과적 투여량"은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 미치료 대상체에 비해 약 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 40% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 60% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 80% 이상 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예측할 수 있는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 또는, 조성물의 상기 성질은 숙련된 개업의에게 공지된 분석법에 의해 시험관내에서의 억제와 같이 억제하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가될 수 있다. 치료 효과량의 치료 화합물은 종양 크기를 감소시킬 수 있거나, 그렇지 않으면 대상체에서 증상을 개선시킬 수 있다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 대상체의 체격, 대상체 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인들을 기준으로 상기 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 숙련된 전문가에 의해 인지되듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 다라 달라질 것이다. 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로, 예를 들면, 주사 또는 주입을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "비경구 투여"란 어구는, 통상적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 제한하지 않고 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
또는, 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 비-비경구 경로, 예를 들면, 국소, 상피 또는 점막 투여 경로, 예를 들면, 비강내, 경구, 질내, 직장내, 설하 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 화합물을 급속한 방출로부터 보호하는 담체와 함께, 예를 들면, 이식물, 경피 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함하여 방출 조절 제형으로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체를 사용할 수 있다. 상기 제형을 제조하기 위한 많은 방법들이 특허출원되거나, 일반적으로 당해 분야에 숙련된 자들에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978)] 참조).
개시된 용도 및 방법
본 발명의 항체, 특히 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 노치-1 매개 질병의 진단 및 치료를 포함하여, 많은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 용도를 갖는다. 예를 들면, 이들 분자는, 다양한 질병의 치료, 예방 및 진단을 위해, 배양중 세포에 시험관내 또는 생체외로, 또는 인간 대상체에게, 예를 들면, 생체내로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것이다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들면, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들면, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직한 대상체는 노치-1 활성에 의해 매개된 질병을 갖는 인간 환자를 포함한다. 상기 방법은 비정상적 노치-1 발현 또는 활성화와 관련된 질병을 갖는 인간 환자를 치료하는데 특히 적합하다. 노치-1에 대한 항체가 또 다른 약제와 함께 투여되는 경우, 상기 두가지는 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다.
노치-1에 대해 개시된 항체의 특이적 결합을 이용하여, 개시된 항체는 세포 표면상에서 노치-1 발현을 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있으며, 또한 면역친화성 정제에 의해 노치-1을 정제하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 비정상적 세포 성장, 예를 들면, 암을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 한 특정 태양에서, 암은 T-ALL이다. 또 다른 특정 태양에서, 암은 유방암이다.
본 발명의 항체에 의해 치료될 수 있는 비정상적 세포 상정의 다른 유형으로는, 예를 들면, 중피종, 간담즙(간 및 담관)종양, 1차 및 2차 CNS 종양, 1차 또는 2차 뇌종양, 폐암(NSCLC 및 SCLC), 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 난소암, 대장암, 직장암, 항문부암, 위암, 위장관(위, 결장직장 및 십이지장)암, 유방암, 자궁암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신세포암, 신우암, 중추신경계(CNS) 신생물, 1차 CNS 림프종, 비호지킨성 림프종, 척추 종양, 뇌간 교세포종, 뇌하수체 선종, 부신피질암, 담낭암, 다발성 골수종, 담관암, 섬유육종, 신경아세포종, 망막아세포종, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합이 포함된다.
개시된 항체 조성물(예를 들면, 인간 단클론성 항체, 다중특이성 및 이중특이성 분자 및 면역접합체) 또는 그의 항원 결합 부분을 생체내 및 시험관내로 투여하는 적합한 경로는 당해 분야에 공지되어 있으며, 통상의 기술을 가진 자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들면, 항체 조성물은 주사(예, 정맥내 또는 피하)에 의해 투여될 수 있다. 사용되는 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중, 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 따라 달라질 것이다.
전술한 바와 같이, 개시된 인간 항-노치-1 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들면, 세포독성제, 방사능독성제 또는 면역억제제와 함께 공-투여될 수 있다. 항체는 상기 약제에 결합(면역복합체로서)될 수 있거나 또는 약제와 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우(별도 투여), 항체는 약제보다 먼저, 후에 또는 동시에 투여될 수 있거나, 또는 다른 공지된 치료법, 예를 들면, 항암 치료법, 예를 들면, 방사선과 공-투여될 수 있다. 상기 치료제로는, 특히, 자체로 환자에게 독성 또는 저독성인 수준에서 단지 효과적인, 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 설페이트, 카무스틴, 클로람부실 및 사이클로포스파미드 하이드록시우레아와 같은 항종양제가 포함된다. 시스플라틴은 100 mg/ml 용량으로 4주마다 1회 정맥내 투여될 수 있고, 아드리아마이신은 60 내지 75 mg/ml 용량으로 21일마다 1회 정맥내 투여된다. 화학치료제와 본 발명의 인간 항-노치-1 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 공-투여는 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 제공하는 상이한 기전으로 작용하는 2개의 항암제를 제공한다. 상기 공-투여는 약물에 대한 내성의 발생, 또는 이들을 항체와 비반응성이 되게 만드는 종양 세포의 항원성의 변화로 인한 문제들을 해결할 수 있다.
키트
개시된 항체 조성물(예를 들면, 인간 항체, 이중특이성 또는 다중특이성 분자 또는 면역접합체) 및 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 키트는 또한 하나 이상의 추가의 시약, 예를 들면, 면역억제 시약, 세포독성제 또는 방사능독성제, 또는 하나 이상의 추가의 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 부분(예를 들면, 1차 인간 항체와 다른 노치-1 항원중의 에피토프에 결합하는 상보 활성을 갖는 인간 항체)을 함유할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료된 환자는, 인간 항체의 치료 효과를 향상 또는 증대시키는 또 다른 치료제, 예를 들면, 세포독성제 또는 방사능독성제를 투여(개시된 인간 항체의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에)받을 수 있다.
본 발명은 또한 하기의 실시예에 의해 더 예시되며, 이들 실시예는 더 제한하는 것으로 간주되서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허출원들의 내용은 본원에 특별히 참고로 인용된다.
실시예
실시예 1: 노치-1 면역원의 제조 및 발현
노치-1 면역원 발현 구축물의 제조
단클론성 항체(mAb) 생성을 위한 다중화 PCR(도 1)에 의해 면역원 구축물을 제조하였다. 도 1에 예시된 바와 같이, 주형으로서 노치-1 전장 cDNA 클론(오리진(OriGene), Cat. No. TC308883, 미들랜드주 로크빌) 및 고성능(High Fidelith) PCR 시얄 시스템을 제조사의 프로토콜(로슈(Roche), 인디애나주 인디애나폴리스)에 따라 사용하여 다중 중복 PCR에 의해 노치-1 면역원 cDNA를 합성하였다. N-말단 리더 펩티드, EGF-유사 반복부 35-36, NRR(Lin A, B 및 C 도메인 및 HD 도메인 포함) 및 세포내 서열의 소부분을 함유하는 재조합 노치-1 면역원 cDNA를 Fc 서열의 N-말단에 융합된 노치-1 면역원을 갖는 Fc-융합 단백질 벡터에 클로닝하였다. N1-NRR-TM(-)으로 지칭된 노치-1 면역원 플라스미드는 도 11에 서열 1(서열번호: 1)로 나타낸 cDNA 삽입물을 함유하며, 이것은 도 11에 서열 2(서열번호: 2)로 나타낸 면역원 단백질을 암호화한다.
N1-NRR-TM(-)의 세포내 서열(서열 2에서 마지막 44개 아미노산 잔기)을 치환시키기 위해 경막(TM) 서열(서열 4에서 마지막 24개 아미노산 잔기)을 사용한 것을 제외하고, N1-NRR-TM(-)로서 동일한 서열을 함유하는 유사한 플라스미드를 도 2에 나타낸 바와 같이 동시에 제작하였다. 상기 PCR-증폭된 노치-1 면역원 cDNA를 pcDNA3.1D/V5-His(인비트로겐)에 클로닝하였다. 상기 플라스미드를 N1-NRR-TM(+)로 지칭하였다. N1-NRR-TM(+)의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 도 12에 서열 3(서열번호: 3) 및 4(서열번호: 4)로 나타내었다.
노치-1 면역원 단백질의 발현 및 정제
N1-NRR-TM(-)를 프리스타일(Freestyle, 등록상표) 맥스 시약(인비트로겐) 및 제조사의 프로토콜을 사용하여 일시 형질감염에 의해 프리스타일(등록상표) 293-F 세포(인비트로겐, 인코포레이티드, 캘리포니아주 칼스배드)에서 발현시키고, 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다. 간략하게, 1 x 107 세포를 30 밀리리터(ml)의 293-F 세포 성장 배지(인비트로겐)를 함유하는 조직 배양 진탕 플라스크에 접종하였다. 형질감염후 제 2 일부터 제 7일까지 24시간마다 0.5 ml 분취량의 조정 배지를 취하여 분비된 단백질을 분석하였다. 20 마이크로리터(㎕)의 조정 배지 및 2X 단백질 샘플 부하 완충제(바이오래드, 헤르큘레스(Hercules), 캘리포니아주)를 혼합하고, 100 ℃에서 5 분간 가열하였다. 4 내지 12% 구배 SDS-PAGE(인비트로겐)에서 전기영동을 통해 샘플을 분리하였다. 건조 블롯팅 장치(인비트로겐)를 사용하여 단백질을 겔로부터 블롯팅막으로 옮긴 다음, PBST(0.05% 트윈-20을 함유한 PBS)중 5% 탈지분유 중에서 1 시간동안 막을 차단하였다. N1-MRRHD-TM(-)/Fc 융합 단백질의 검출은 인간 γFc-특이적, HRP-접합 항체(베틸 래버러토리즈 인코포레이티드(Bethyl Lab. Inc.), 텍사스주 몽고메리)와 함께 배양하여 수행하였다. 막을 PBST에서 3회 세척한 후, 과신호 화학발광 기질(Supersignal Chemiluminescent Substrate, 피어스(Pierce), 일리노이주 록포드)로 전개시켰다. 단백질 발현 경시적 연구 결과 5 내지 6일 배양물의 조정 배지가 대부분의 분비된 N1-NRR-TM(-)/Fc 융합 단백질을 함유하는 것으로 나타났다. 그러므로, N1-NRR-TM(-)/Fc 단백질 발현을 10 리터의 배양 부피로 규모를 확대시키고, 단백질 G 친화성 컬럼(인비트로겐)을 통해 단백질을 정제하였다.
노치-1 면역원을 발현하는 세포주의 확립
N1-NRR-TM(+)을 마우스 세포주, L-929(ATCC, CCL-1, 버지니아주 매너서스)에서 안정하게 형질감염시키고, 세포 표면 막-고정 단백질로서 발현시켰다. 리포펙타민(LipoFectamine, 등록상표) 2000(인비트로겐)을 사용하여 형질감염시킴으로써 안정한 세포주를 확보하고, 개개 콜로니를 눈으로 확인하고 클론 성장을 위해 취할 때까지 약 9 내지 15일동안 1 mg/ml의 네오마이신(G418)에 대해 세포를 선별하였다. N1-NRR-TM(+)/V5 단백질의 발현 수준은 각각의 안정한 형질감염 클론으로부터 제조된 단백질 추출물을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 보다 특히, 각 클론의 세포를 배양 용기로부터 꺼내어, 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 헹구고, 전술한 바와 같은 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 단백질은 HRP-접합 항-V5 항체(인비트로겐)에 의해 검출하였다. 최고 수준의 N1-NRR-TM(+) 단백질을 발현하는 세포 클론을 면역화 및 세포-기본 항체 결합 분석의 이용을 위해 선별하였다.
실시예 2: 노치-1 mAb의 제조
면역화 및 하이브리도마 클로닝
Balb/c 마우스를 인간 노치-1 면역원, N1-NRR-TM(-) 및 긴 면역화 프로토콜을 사용하여 면역화시켰다. 1차 면역화는 완전 프로인트 보조제(Complete Freunds Adjuvant, CFA) 유화액에 혼합된 20 마이크로그램(㎍)의 항원으로 피하(sc) 주사에 의해 제공한 후, 불완전 프로인트 보조제(IFA) 유화액에 혼합된 각각의 전달 20 ㎍ 항원으로 격주로 3회 sc 주사에 의해 제공하였다. 4 번째 항원 주사 일주일후에 혈청을 취하여 ELISA에 의해 항체의 역가를 검사하였다. 고반응 역가를 갖는 마우스를 안락사시키고, 하이브리도마 클로닝을 위해 비장을 수술적으로 제거하였다.
비장을 100-마이크론 스테인리스 스틸 체에 통과시킨 후, 세포 스트레이너에 통과시키고 30 ml RPMI에서 2회 세척하여 비장세포(spleenocyte)의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 비장세포를 Sp2/0-Ag14 세포(시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스)와 3:1 비로 혼합하고, 50% PEG-1500을 첨가하고 약하게 교반하여 세포 융합을 촉진하였다. 세포 혼합물을 원심분리에 의해 침전시키고, RPMI로 약하게 세척한 후, 37 ℃에서 20% 소 태아 혈청(FCS)을 함유한 RPMI-1640에서 30 분간 배양하였다. 세포를 20% FCS, 표준 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘), 25% 비장-조정 배지, 2mM 글루타메이트 및 100 ㎍/ml 펜-스트립(Pen-Strip)(인비트로겐; 캘리포니아주 칼스배드)을 함유한 RPMI-1640에 현탁시키고, 96-웰 플레이트에 분산시키고, 37 ℃/5% CO2 배양기에서 8 내지 20 일동안 배양시켜 HAT-내성 하이브리도마 클론을 확립시켰다. 각 하이브리도마 클론으로부터의 조정 배지를 ELISA 검색에 적용하였다.
단클론성 항체(mAb)의 ELISA 검색
효소-결합 면역흡수 분석(ELISA)을 Nunc(등록상표) 맥시소프(MaxiSorp) 96-웰 플레이트(터모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 뉴욕주 로체스터)를 사용하여 수행하였으며, 상기 플레이트는 두 세트: 각 웰에서 100 ng의 N1-NRR-TM(-)/Fc 단백질로 밤새 코팅된 양성 시험 플레이트 및 100 ng의 인간 Fc 단백질로 코팅된 음성 대조군 플레이트로 제조되었다. 하이브리도마 클론으로부터의 조정 배지를 N1-NRR-TM(-)/Fc 단백질에 결합하는 그의 능력에 대해 검색하였다. 100 ㎕의 각 하이브리도마 상등액을 코팅된 플레이트에 가하고, 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 웰을 PBST(1 x 0.05% 트윈-20 함유 PBS)로 3회 세척하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합된 염소-항-마우스 Fc 항체를 첨가하여 항원에 결합된 mAb를 검출하였다. 각 세척시 웰당 200 ㎕의 PBST로 3회 세척하여 과량의 HRP를 씻어내었다. 이어서, ABTS(2,2'-아지노-비스-[3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산]) 용액을 HRP 발색용 기질로서 첨가하였다. 반응을 중단하고, 405 nm에서 플레이트 판독기에 의해 플레이트를 검색하였다. 양성 웰을 N1-NRR-TM(-)/Fc 단백질-코팅된 플레이트로 재검색하고, 전술한 바와 동일한 방식으로 인간 Fc-코팅된 플레이트로 역-검색하였다. N1-NRR-TM(-)/Fc 단백질에만 결합하고 인간 Fc에는 결합하지 않는 하이브리도마 mAb가 순수한 노치-1-결합 항체이며, 이것을 기능 검색을 진행하기 위해 선택하였다.
실시예 3: 노치-1-길항제 mAb의 확인 및 특성화
루시퍼라제 리포터 분석 세포주 확립
다양한 환경에서 노치-1 수용체-매개 신호 및 전사 활성을 평가하기 위해 루시퍼라제 리포터 분석을 통상적으로 사용하였다[Weng, A.P., et al., Science, 9265-9273 (2004); Osipo et al., Oncogene, 27(37):5019-5032 (2008)]. 리간드-유도된 노치-1 활성화 및 mAb 억제를 분석하기 위해, 노치 신호를 증대시키도록 도구 세포주를 발육시켰다. 세포내 도메인으로 이루어진 노치 수용체의 활성 형태가 핵으로 전좌되어, CSL[CBF1, Su(H) 및 LAG-1의 이름을 따서 명명] 결합 인자 1과 복합체를 형성하고, 이것은 유전자 프로모터 영역에서 CSL-결합 모티프로 불리는 코어 서열에 결합하여 후속 유전자 전사를 활성화시키는 것으로 확증되었다[Bray, S.J., Nature Reviews, 678-688 (2006)]. 상기 발견을 기초로, 노치-1-매개 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 생성하였다. 간략하게, 문헌 [Tun et al., Nucleic Acids Res. 22(6):965-971 (1994)]에 기술된 바와 같은 8개 CSL 결합 모티프의 연쇄체(concatamer)를 pTA-Luc(BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주 팔로 알토)의 다중 클로닝 부위에 삽입하였다. 하이그로마이신 선택 마커(다음 단락 참조)를 루시퍼라제 유전자의 하위에 부가시켰다. 이에 의해 루시퍼라제 리포터 플라스미드, CSLuc가 수득되었다.
전장 노치-1 발현 구축물을 오리진(미들랜드주 로크빌)에서 입수하여 NM_017617.2(NCBI/진뱅크 등록 번호)에 동일한 것으로 서열분석에 의해 확인하였다. SV40 프로모터를 갖는 하이그로마이신 선택 마커를 pcDNA3.1/하이그로마이신(인비트로겐)으로부터 PCR-합성하고, 표준 PCR 결합 방법에 의해 pcDNA5/RFT/V5-His(인비트로겐)로부터 성장 호르몬 3' 폴리-A 신호 서열에 연결시켰다. 완성된 하이그로마이산 마커를 노치-1 발현 플라스미드의 Cla I 부위에 삽입하였다. 상기 플라스미드는 노치-1/Hyg로 재명명된다. 노치-1 활성을 증대시키기 위해, PEDT 도메인[Weng, A.P., et al., Science, 9265-9273 (2004)]을 부위-지향 돌연변이유발(젠위즈(Genewiz), 뉴저지주 사우스 플레인필드)에 의해 노치-1/Hyg로부터 결실시켰다. 생성된 플라스미드는 노치-1-dPEST로 명명하였다. 인간 재기드1 cDNA 플라스미드를 오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems, 앨라배마주 헌츠빌)에서 입수하였다. 재기드1 암호화 영역을 PCR-합성하고, pcDNA3.3-TOPO 발현 벡터(인비트로겐)내에 삽입하였다.
제조사의 프로토콜(인비트로겐)에 따라 리포펙타민 2000을 사용하여 노치-1/hyg 및 CSLuc 플라스미드를 U2-OS(ATCC 번호 HTB-96, 버지니아주 매너서스) 세포내에 공-형질감염시키거나, 또는 노치-1-dPEST 및 CSLuc를 293T(ATCC 번호 CRL-11268, 버지니아주 매너서스) 세포에 공-형질감염시킴으로써 노치-1-의존성 분석 세포주를 생성하였다. 안정하게 형질감염된 세포를 DMEM 성장 배지(인비트로겐)에서 200 내지 800 ㎍/ml 하이그로마이신에 대해 클론적으로 선택하고, 세포 클론을 실시예 1에서 기술한 바와 같이 웨스턴 블롯 분석에 의해서 및 다음 부분에 기술된 루시퍼라제 리포터 분석에 의해 검색하였다. 비교적 높은 수준의 노치-1 발현(웨스턴 블롯을 기준으로) 및 델타 유사-4(Dll4)-유도된 루시퍼라제 활성을 갖는 세포주를 기능 분석에 사용하기 위해 선택하였다. 2개의 상기 실시예 세포주는 U2-OS/노치-1-CSLuc(별칭: N1CU3) 및 293/노치-1-dPEST-CSLuc(별칭: N1dP-c16)이다. 유사한 절차를 통해, 인간 재기드1을 안정하게 발현하는 세포주를 모세포주, Hela(ATCC 번호 CCL-2)로부터 생성하였다. 상기 세포주는 Hela/JAG1으로 명명하였다.
노치-1-길항제 하이브리도마 클론의 루시퍼라제 리포터 분석 및 확인
노치-1-억제 하이브리도마 클론을 확인하기 위해, 루시퍼라제 리포터 분석을 수행하여 N1CU3 세포에서 Dll4-유도된 노치-1 활성을 평가하였다. 96-웰 조직 배양 플레이트(BD 바이오사이언스)를 50 내지 100 나노그램(ng)의 재조합 Dll4(R&D 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)로 코팅하였다. N1CU3 세포를 Dll4- 또는 BSA-코팅된 플레이트에서 웰 당 50,000 세포로 접종하고, 하이브리도마 클론으로부터 30 내지 50 ㎕의 조정 배지를 동시에 첨가하고, 24 내지 40 시간동안 배양하였다. 배양 마지막에, 모든 배지를 제거한 후 세포를 1x 수동 용해 완충제(Passive Lysis Buffer, 프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)에서 직접 용해시키고, 제조사의 프로토콜(프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 따라 브라이트-글로(Bright-Glo, 등록상표) 루시퍼라제 분석 시스템 및 마이크로루매트 플러스(MicroLumat Plus) LB 96V q발광측정기(버트홀드 테크놀로지스(Berthhold Technologies), 독일 바트 빌드바트)를 사용하여 루시퍼라제 리포터 활성을 분석하였다. Dll4-유도된 노치 리포터 활성에 대해 통계적으로 의미있는 억제를 갖는 하이브리도마 상등액을 제조사의 프로토콜에 따라 단백질-G 컬럼(피어스, 일리노이주 록포드)을 통해 친화도 정제에 적용하였다. 정제된 mAb를 루시퍼라제 리포터 분석에 의해 다시 더 분석하여 노치-1-의존성 신호에 대한 억제 기능을 확인하였다.
루시퍼라제 리포터 분석에 의한 항-노치-1 mAb의 특성화
노치-1-매개 신호를 억제하는 mAb 중에서, 하나의 mAb(N248A)가 가장 강한 억제 활성을 나타내었으며, 이것을 여러 상이한 루시퍼라제 리포터 분석을 통해 상세히 특성화하였다. 도 3은, Dll4가 노치 신호를 유도하기 위해 배양 플레이트 표면상에 코팅된 경우, mAb N248A가 동반 mAb인 mAb-C보다 D114 리간드-유도된 노치-1 신호를 억제하는 훨씬 더 높은 효력을 가졌음을 보여준다. 293/노치-1-dPEST-CSLuc 세포를 분석에 사용하였다. y-축의 숫자는 루시퍼라제 리포터 활성 판독치이다.
mAb N248A가다른 노치 리간드-유도된 신호를 억제할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, Hela/재기드1 세포 및 N1dP-c16 세포를 공-배양하고, 전술한 바와 같은 루시퍼라제 리포터 분석을 수행하였다. mAb N248A는 사실상 재기드1-유도된 노치-1 신호를 완전히 억제하였다(도 4).
실시예 4: 항체 결합 친화도 측정
노치-1 항원에 대한 항-노치-1 mAb N248A의 물리적 결합 친화도는, HBSP 유동 완충제(비아코어 AB, 스웨덴 웁살라 - 현재 GE 헬쓰케어) 및 1mM CaCl2를 사용하여, 연구용 센서 칩(칩 유형: CM5)이 장착된 표면 플라스몬 공명 비아코어 3000 기기 상에서 측정하였다. 표준 N-하이드록시숙신이미드/에틸다이메틸아미노프로필 카보디이미드(NHS/EDC) 화학을 이용하여 단백질 A를 칩 상에 포화 수준으로 아민-커플링시켰다. N1-NRR-TM(-)Fc 단백질(실시예 1에서 기술)을, 40, 13, 4 ㎍/ml에서 3개의 유동 세포 모두에서 단백질 A에 의해 칩 표면에 포획하였다. 항-노치-1 mAb N248A를 3배 연속으로 희석하고, 100 ㎕/분으로 1 분동안 주입하였다. 해리는 20분동안 모니터하였다. 칩은 100mM 인산의 2번의 30초 펄스하에 각 적정의 마지막 주입후에 재생시켰다. 완충제 주기는 이중-참조 데이터에 대해 블랭크를 제공하였으며, 상기 데이터는 이어서 비아이밸류에이션(Biaevaluation) 소프트웨어 ㅍ.4.1을 사용하여 단순한 결합 모델에 전반적으로 적합화시켰다. 친화도는 동역학적 속도 상수(KD = koff/kon)의 몫으로부터 추정하였다. 상기 데이터는 mAb N248A가 5.19e-5(Ms)의 Kon, 1.7e-4(1/s) 미만의 Koff 및 0.33 nM 미만의 KD를 가짐을 나타낸다. 엄격한 KD는 빠른 Kon 및, 우리의 분석(5% 규정 참조, 비아코어 3000 매뉴얼)에 의해 분해될 수 있는 것보다 더 느린, 매우 느린 Koff 둘 다에 의해 제공된다.
실시예 5: 노치-1-길항체 mAb 결합 에피토프의 분석
인간 노치-2 를 사용한 도메인 치환에 의한 mAb 결합 에피토프 지도작성
노치-1-길항제 mAb에 의한 작용 메카니즘을 이해하기 위해, 노치-1-길항제 mAb의 결합 에피토프를 도메인 치환 및 ELISA 결합 분석에 의해 분석하였다. 노치-1-NRR-TM(-)/Fc 단백질을 6개 도메인으로 분할하였다: EGF(EGF35-36 포함), Lin12-A(또는 Lin-A), Lin-B, Lin-C, 헤테로이량체화 도메인-N(또는 HD-N) 및 HD-C(도 5). 상기 도메인들 각각을 일련의 키메라 노치-1-NRR-TM(-)/Fc 발현 구축물에서 PCR 합성에 의해 인간 노치-2에 상응하는 영역으로 치환시켰다. 도메인 치환 플라스미드를, 실시예 1에서 전술한 바와 같이 프리스타일(등록상표) 맥스 시약(인비트로겐)을 사용하여 프리스타일(등록상표) 293-F 세포(인비트로겐, 인코포레이티드, 캘리포니아주 칼스배드)에서 형질감염시켰다. 3일간 배양한 후, 조정 배지를 웨스턴 블롯 분석 및 노치-1 mAb에 의한 ELISA 결합 분석에 적용하였다. 웨스턴 블롯(실시예 1에서와 같은 방법) 결과, Lin-B/노치-2 치환물이 잘 발현되지 않은 것을 제외하고, 6개 도메인 치환 구축물 중 5개가 잘 발현된 것으로 나타났다.
ELISA 분석에서, 상기 항원 플라스미드-형질감염된 세포 배양물로부터 100 ㎕의 조정 배지를 96-웰 플레이트의 각 웰에 부하시키고, 플레이트를 실온에서 4 시간동안 또는 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 조정 배지를 코팅된 플레이트에서 제거하였다. 1차 항체 결합을 위해, 100 ㎕의 PBS 중의 300 ng의 각 mAb(표 3)를 코팅된 웰에 가하였다. ELISA 절차의 나머지는 실시예 2에서 기술한 바와 동일하다. 노치-1에 결합하는 단클론성 항체인 mAb N99A, N326A 및 N440A를 생성하고, mAb N248A와 동일한 절차에 의해 분리하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 키메라 항원에 대한 mAb N248A의 결합은, Lin-A 또는 HD-C 도메인이 상응하는 노치-2 도메인으로 치환되었을 때 완전히 제거되었다. 다른 한편으로, EGF, Lin-C 또는 HD-C 도메인의 치환은 그 결합에 영향을 미치지 않았다. mAb N326A 및 N440A는 mAb N248A와 명백히 상이하였다. 이들 두 mAb는 그의 결합 활성에 HD-N 및 HD-C를 필요로 한다. N99A는 그 결합에 Lin-A 및 HD-C 도메인을 필요로 한다는 점에서 mAb N248A와 다소 유사하다. 그러나, HD-N 도메인의 치환은 또한 N99A 결합 활성을 감소시켰다. 이들 데이터는 mAb N248A가 2개 이상의 식별가능한 결합 에피토프 세트를 Lin-A 도메인에 하나 및 HD-C 도메인에 다른 하나를 갖는다는 결론을 뒷받침하였다. Lin-B 도메인에 또 다른 에피토프가 존재하는지 여부는 별도의 실험에서 해결하였다. 유사하게, 다른 3개의 노치-1-길항제 mAb는 모두 2개의 확인가능한 결합 에피토프 세트를 갖는데, HD-C 도메인에서 하나의 에피토프를 갖고 노치-1 N-말단 서브유닛의 도메인에서 나머지 하나의 에피토프를 갖는다. 최근에 발표된 노치-1[Gordon, WR et al., Blood, Volume 113, 4381-4390 (2009)] 및 노치-2[Gordon et al., Nature Structure Molecular Biology, Volume 14, 295-300 (2007)] NRR 영역의 결정 구조를 근거로, 3개의 Lin12 도메인이 HD 도메인 주위로 둘러싸고 있어서 ADAM 프로테아제에 의한 무작위 분열 및 활성화를 차단하므로, 수용체를 비활성 또는 침묵 상태로 유지시킨다. mAb N248A는 2개의 별개의 에피토프 세트에서 노치-1에 결합하여, 노치-1이 침묵 형태에 고정되게 하므로, 따라서 수용체가 그의 리간드에 의해 활성화되는 것을 방지한다.
노치-1 유전자 돌연변이, 주로 점 돌연변이 및 일부의 작은 결실 및 삽입은 T-ALL의 50% 이상에서 보고되었다[Weng, A.P., et al., Science, 9265-9273 (2004); Malecki et al., Molecular Cell Biology, 26(12):4642-4651 (2006)]. 돌연변이는 하기 두 영역에서 집중발생하였다: 세포내 잔기의 C-말단에 위치하는 한 영역 및 HD-N 영역에 위치하는 다른 한 영역. 이러한 발견은 mAb N248A가 표 3에 열거된 다른 3개의 mAb보다 T-ALL에서 보다 우수한 치료 유용성을 갖는다는 생각을 뒷받침하는데, 그 이유는 HD-N 도메인 치환이 노치-1에 대한 mAb N248A의 결합에 영향을 미치지 않는 반면, 다른 3개의 결합은 영향을 받았기 때문이다(표 3 참조).
키메라 항원에 대한 노치-1 mAb 결합의 ELISA 판독결과
mAbs → N248A N99A N326A N440A

상응하는 노치-2
도메인으로 치환된 노치-1 키메라 항원		 EGF 3.51 3.20 3.48 2.85
Lin-A 0.05 0.04 3.47 3.28
Lin-B n/a n/a n/a n/a
Lin-C 3.48 3.17 3.50 2.83
HD-N 3.52 1.25 0.10 0.12
HD-C 0.04 0.04 0.05 0.07
N248A는 인간 노치-1에는 결합하지만, 마우스 노치-1에는 결합하지 않는다.
N248A1의 결합 에피토프의 위치를 결정하기 위해, 뉴클레오티드 1 내지 99 및 뉴클레오티드 4327 내지 5169(NCBI 등록번호, NM_008714)로부터 마우스 노치-1 cDNA 암호화 영역을 함유하는 뮤린 노치-1-NRRHD 발현 플라스미드를 생성하고, 일시적 형질감염 및 ELISA 결합 분석(이전 부분, 실시예 1 및 5에 기술된 방법)을 수행하였다. 결과는 N248A1이 마우스 노치-1에는 결합하지 않고, 인간 노치-1에만 결합함을 나타내었다(표 4). 또한, 프레임워크로서 인간 노치-1-NRRHD 서열(뉴클레오티드 1 내지 129 및 4338 내지 5202, NCBI 등록번호 NM_017617)을 사용하여 도메인 치환 키메라 노치-1-NRRHD 발현 구축물을 제조하고, 인간 Lin-A, Lin-B 또는 HD-C 도메인을 상응하는 마우스 도메인으로 조직적으로 치환시켰다. 베이트(bait)로서 상기 인간/마우스 도메인 치환 단백질을 사용한 ELISA 결합 분석은, Lin-A 도메인이 마우스 서열로 교환되는 경우 인간 노치-1 항원에 대한 N248A1의 결합이 제거된 반면, Lin-B 또는 HD-C 도메인 교환은 결합에 영향을 미치지 않았음을 입증하였다. 대조적으로, 다른 대조군 mAb, 22F7은 Lin-B가 마우스 서열로 교환된 경우에만 결합이 소실되었다. 그러므로, N248A1이 인간 노치-1에만 결합하고 마우스에는 결합하지 않는 지 여부를 결정하는 결합 에피토프는 Lin-A 도메인에 위치한다.
인간, 마우스 및 키메라 항원에 결합하는 노치-1 mAb의 ELISA 판독결과
항원 N248A 22F7
huN1-NRRHD 3.13 3.19
MuN1-NRRHD 0.17 0.09
노치-1 키메라 항원은 뮤린 서열로 치환된 도메인을 표시함 Mu/Lin-A 0.33 3.27
Mu/Lin-B 3.37 0.38
Mu/HD-C 3.17 3.19
Lin -A 도메인에서 N248A1 의 결합 에피토프 확인
Lin-A 도메인에서 N248A1의 결합 에피토프를 확인하기 위해, 인간과 마우스 Lin-A 도메인 간에 상이한 2개의 아미노산, 즉 1457E/A 및 1465S/N을 돌연변이시켰다(표 5). ELISA 결과는 돌연변이 1457E/A는 결합에 영향을 미치지 않았지만, 돌연변이 1465S/N은 결합을 제거한 것으로 나타나, 마우스 Lin-A에서의 아미노산 Asn(N)이 마우스 노치-1에 대한 N248A1 결합을 차단하는 원인이 되는 유일한 아미노산 잔기임을 시사한다. 1465S 주위의 여러 아미노산을 차례로 알라닌으로 돌연변이시켰다(표 5). 1463V/A, 1466L/A 또는 1467Q/A의 돌연변이도 또한 N248A1 결합을 제거시켰다. 그러나, 대조군 mAb A2는 돌연변이 1463V/A 또는 1465S/N에 의해 영향받지 않았다(표 5). 상기 실험들은 Lin-A에서 N248A1의 결합 에피토프가 1463V, 1465S, 1466L 및 1467Q를 포함함을 입증하였다.
Figure pct00009
HD-C 도메인에서 N248A1의 결합 에피토프 확인
노치-1 서열로부터 노치-2 서열로 일군의 아미노산을 차례로 치환시켜 일련의 5개 서브도메인 치환 키메라 항원(표 6)을 생성하였다. ELISA 결과는 서브도메인 치환-1이 N248A1 결합을 상당히 감소시킨 반면, 다른 4개의 서브도메인 치환 항원은 N248A1에 영향을 미치지 않음을 보여주었다. 다른 한편으로, 병행 대조군 mAb 19H7은 서브도메인 치환 1, 3 및 5에서 상당한 결합 친화도 감소를 나타내었다(표 6). 조정 배지중에서의 모든 서브도메인 치환 항원 발현 및 분비는 웨스턴 블롯 분석(상기에서와 같은 방법)에 의해 확인하였다. 서브도메인 치환 5를 제외한 모든 서브도메인 치환 항원은 인간 노치-1-NRRHD(huN1-NRRHD) 단백질과 동일하거나 보다 높은 발현을 갖는다. 서브도메인 치환 5는 웨스턴 블롯 밴드 강도 비교(데이터 나타내지 않음)를 기준으로 huN1-NRRHD의 약 50% 수준으로 발현되었다. 상기 실험들은 HD-C에서 N248A1의 결합 에피토프가 표 6에 강조된 바와 같은 5개의 아미노산, 1705G, 1706A, 1707L, 1709S 및 1710L(인간 노치-1 암호화 cDNA 서열, NCBI 등록번호 NM_017617)을 포함함을 보여주었다.
Figure pct00010
실시예 6: 노치-1 mAb는 세포 배양중 암세포 성장을 억제한다
mAb N248A에의한 HPB-ALL 백혈병 세포 성장의 억제 및 NICD의 감소
T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL) 세포주, HPB-ALL을 아동기 T-ALL[Morikawa et al., Int J. Cancer, 21(2):166-170 (1978)]로부터 유도하고, DSMZ(독일 브라운슈바이크)로부터 수득하였다. 상기 세포주는 증대된 감마 세크레타제 분열의 결과로, 노치-1의 활성 형태인 노치-1 세포내 도메인(NICD)을 높은 수준으로 유도하는 노치-1 돌연변이를 갖는다. 성장 억제 분석을 위해, HPB-ALL 세포를 10% FBS(인비트로겐)으로 보충된 RPMI1640 배지중 10,000 세포/웰로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 연속 희석된 mAb N248A 또는 D16A를 초기에 첨가하고, 세포를 37 ℃에서 7 일간 배양하였다. 배양 마지막에, 0.1 mg/ml의 레사주린(Resazurin, 시그마-앨드리치, 미주리주 세인트 루이스)을 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 세포에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 4 시간동안 배양하였다. 형광 신호는 560 nm의 여기 및 590 nm의 방출하에 이중 필터를 통해 판독하였다. IC50 값은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(그래프패드 소프트웨어, 인코포레이티드, 캘리포니아주 라 졸라)에서 S자 용량-반응(가변 기울기)을 이용하여 계산하였다.
시험관내 NICD 분석을 위해, HPB-ALL 세포를 웰 당 2 x 106 세포로 6-웰 플레이트에 접종하고, 10% FCS(인비트로겐)를 갖는 RPMI1640에서 배양하였다. mAb N248A 또는 대조군 항체 D16A를 도 16에 나타낸 바와 같은 가변 농도에서 배양물에 첨가하였다. 세포를 37 ℃에서 항체의 존재하에 24 시간동안 배양하였다. 이어서, 이들을 수거하고 차가운 1X 세포 용해 완충제(셀 시그널링 테크놀리지스(Cell Signalling Technologies), 몬타나주 보스턴)에서 용해시켰다. 4 ℃에서 13,000 rpm으로 10 분간 원심분리하여 세포 용해물로부터 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 BCA 분석(피어스, 일리노이주 록포드)을 이용하여 측정하였다. 각 샘플중 NICD의 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다.
각각의 웨스턴 블롯 분석에서, 약 50 ㎍의 용해물을 폴리아크릴아미드 겔(바이오래드 래버러토리즈, 헤르큘레스, 캘리포니아주)을 통해 전기영동에 의해 분해하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 토끼 항-NICD 항체(셀 시그널링 테크놀로지, 인코포레이티드, 매사추세츠주 댄버스) 및 마우스 α 액틴 항체(시그마-앨드리치, 미주리주 세인트 루이스)를 사용하여 면역블롯 분석에 적용하였다. IR염료 680 또는 800 접합된 2차 항체(LI-COR 바이오사이언시즈, 네브래스카주 링컨)를 사용하여 웨스턴 블롯 밴드를 가시화시켰다. 상은 오딧세이(Odyssey) 적외선 영상화 시스템(LI-COR 바이오사이언시즈, 네브래스카주 링컨)을 사용하여 분석하였다.
결과는 mAb N248A에 의한 HPB-ALL 세포 성장의 억제가 NICD 수준의 감소와 상관됨을 입증하였다. 처리한지 24시간째에, mAb N248A는 용량 의존성 방식으로 NICD 수준을 감소시켰으며, 30 ㎍/ml에서 최고 감소가 관찰되었다. 7 일간 처리한 후, mAb N248A는 세포 성장의 상당한 억제를 야기하였다. 세포 성장 억제에 대한 IC50 값은 약 0.78 ㎍/ml 또는 약 5.2 nM이다.
유방암 세포 성장의 억제
노치-1의 발현은 유방암에서 비정상적으로 증가되었으며[Reedijk et al., Cancer Research, 65(18):8530-8537 (2005); Klinakis et al., (2006); Efstratiadis et al., Cell Cycle, 6(4):418-429 (2007)], 이것은 불량한 생존율과 관련되었음[Reedijk et al., Cancer Research, 65(18):8530-8537 (2005)]이 잘 입증되었다. 포유동물 조직에서 노치-1의 활성화 형태를 발현하는 유전자전이 마우스에서, 거의 모든 마우스가 1년동안에 유방암에 걸렸다[Hu et al., American Journal of Pathology, 168(3):973-990 (2006)]. 노치-1-매개 신호를 차단하는 것이 유방암 세포 성장을 억제한다는 가설을 검증하기 위해, 여러개의 유방암 세포주를 10 ㎍/ml mAb N248A 항체, 허셉틴(Herceptin)(제넨테크(Genentech)/로슈, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코) 또는 대조군 마우스 면역글로불린 G(mlgG)의 존재하에 배양하였다. 모든 세포를 1% FCS 함유 RPMI 1640(인비트로겐)에서 2 내지 3 일간 배양하였다. 생존 세포를 세포 적정 글로우(Cell Titer Glow, 등록상표)(프로메가)에 의해 정량화하고, 마이크로루매트 플러스 LB 96V 발광측정기(버트홀드 테크놀로지스, 독일 바트 빌드바트)로 스캐닝하였다. 유방암 세포의 동일 패널에 대해, 세포 표면상에서 노치-1 및 재기드1의 발현을 FACS로 분석하였다. 결과는 mAb N248A에 의한 유방암 세포의 성장 억제가 노치-1 및 재기드1 발현 수준과 거의 상관됨을 입증하였다. mAb N248A는 MDA-MB-231 세포에 대해 가장 강한 억제를 나타내어, 비교적 높은 수준의 노치-1 및 재기드1을 발현한다. 흥미롭게, BT475 세포-유도된, 허셉틴-내성 세포주 BT475HR은 모 BT475 세포주에 비해 노치-1 및 재기드1의 증가된 발현을 나타내었다. mAb N248A는 BT475HR 세포 성장을 억제한 반면, 허셉틴은 그렇지 않았다. 데이터는 노치-1의 증가된 발현을 가지거나 또는 현행 약물 허셉틴에 대해 내성인 유방암의 치료적 처치에서 mAb N248A의 잠재적 유용성을 시사하였다.
항-노치-1 mAb N248A의 종양 세포 성장 억제 분석. 발현율은 유방암 세포를 항-노치-1 또는 항-재기드1 항체로 면역-염색시킨 후 FACS 기하 평균의 증가 배수를 나타낸다. 상대 세포 증식율은 임의의 약제를 첨가하지 않고 동시에 배양된 대조군 세포의 비율을 나타낸다. BT-474HR은 BT-474(ATCC)로부터 유도된 허셉틴-내성 세포주이다.
세포주 발현율 상대 세포 증식율
노치-1 재기드1 N248A 허셉틴 mlgG
MDA-MB-231 1.7 4.4 69 96 103
BT-474HR 2.5 3.0 80 97 99
HCC38 1.5 1.8 86 97 99
HCC1954 1.5 1.8 88 94 99
SKBR3 1.6 1.2 97 84 107
BT-474 1.4 1.0 98 68 98
MCF7 1.2 1.1 98 101 95
BT549 1.1 1.1 115 103 112
N248A에의한 유방암 세포의 성장 억제가 노치 신호를 차단함으로써 매개되는지를 확인하기 위해, 2개의 공지된 노치 하위 표적 유전자의 발현을 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응(QRT-PCR)에 의해 평가하였다. MDA-MB-231 세포를 N248A 또는 대조군 mAb의 존재하에서 2 일간 배양한 후, 수확하여 RNAeasy 시약 키트 및 프로토콜(키아겐(Qiagen))을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 결과는 mAb N248A가실제로 HES1 및 HES4 발현을 차단함을 입증하여(도 7), N248A에의한 작용 메카니즘을 확인하였다.
실시예 7: 노치-1 mAb는 뮤린 이종이식 종양 모델에서 T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL)을 억제한다
노치 -1 mAb 에 의한 T- ALL 종양 성장 억제
마우스 모델 T-ALL 이종이식 모델을 확립하기 위해, 면역약화된 무흉선 암컷 누드(Nude)(Nu/Nu) 마우스(평균 20 g, 6 내지 8주됨)를 찰스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories, 매사추세츠주 윌밍턴)로부터 입수하였으며, 국제 실험실 동물 보호를 위한 평가 및 승인(the Assessment and Accreditation for Laboratory Animal Care, International)의 지침에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 수용하였다. 동물에게 멸균 설치류 먹이 및 물을 무제한으로 제공하였다. 모든 생체내 연구는 인가된 기관 실험 동물 보호 및 이용 프로토콜 하에서 수행하였다.
HBP-ALL 세포를 신선한 배양물로부터 수확한 후, 숙주 세포에 이식하고, 1회 세척하고, 멸균 무혈청 배지에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 적절한 밀도로 조정하고, 종양 포획을 촉진하기 위해 50% 마트리겔(Matrigel)(BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주 산 호세)로 보충하였다. 200 ㎕중 총 5 내지 10 x 106 세포를 마우스의 뒷옆구리 부분에 피하로 이식하고, 지정된 크기까지 성장시킨 후 각 실험을 위한 항체를 투여하였다.
항-종양 효과 연구를 위해, 150 내지 300 mm3 크기의 HPB-All 종양을 갖는 동물을 무작위배정하고, N248A를 킬로그램(kg) 당 1 mg, 3 mg 및 10 mg 각각 및 대조군 항체 D16A를 5 mg/kg 수용한 4개의 군으로 나누었다. mAb는 2주동안 1주일에 1회 피하 주사하였다. 동물 체중 및 종양 측정치는 2 내지 3 일마다 취하였다. 종양 부피(mm3)는 베니어(Vernier) 캘리퍼로 측정하였으며, 다음 식을 사용하여 계산하였다: 길이(mm) x 폭(mm) x 폭(mm) x 0.4. 연구 최종일에 약물-처리 및 비히클-처리 마우스의 종양 부피를 사용하여 억제 퍼센트(%) 값을 100-(1-[(처리군최종일-처리군제1일)/(대조군최종일-대조군제1일)])로서 계산하였다. 모든 종양 성장 억제(TGI) 실험에, 용량 군 당 8 내지 10 마리의 마우스를 사용하였다. 스튜던트 t 검증을 이용하여 P를 결정하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 노치-1 mAb, N248A는 11일 처리후, 즉, 2주 투여후 상기 모델에서 강항 항종양 활성을 나타내었다. 10 mg/kg 군 대 대조군 mAb 군에서 평균 종양 성장 억제(TGI)는 77% 이상으로, 통계적 관점에서 매우 중요하다(P<0.01). TGI는, 보다 낮은 용량의 두 군, 1 mg/kg 및 3 mg/kg이 차별되기에는 너무 밀접한 것을 제외하고, 거의 용량-의존성이었다. 이러한 관찰의 정확한 원인은 불분명하지만, 상기 모델의 종양 크기에서의 높은 가변성에 기인하기 쉽다. 인간 노치-1-특이적 억제제로서 N248A는 마우스에서 어떤 처리군에서도 심각한 체중 손실, 유병률 또는 사망률을 야기하지 않고 잘 허용되었다.
마우스에서 노치-1 mAb의 약동학 및 약력학(PK/PD)
PK/PD 연구를 위해, 300 내지 800 mm3 범위의 크기의 종양을 갖는 마우스에 단일 용량의 N248A를 5 mg/kg으로 피하 주사에 의해 투여하였다. N248A의 투여후에, 6, 16 시간 및 1, 2, 3, 5 일의 시점에서 마우스를 안락사시켰다. 주사기를 사용하여 왼쪽 심실에서 혈액 샘플을 취하고 헤파린 설페이트로 프라이밍된 튜브로 옮겼다. 그 동안에, 종양을 절제에 의해 꺼내어, 순간-냉동시키고 차가운 1X 세포 용해 완충제(셀 시그널링 테크놀로지스, 매사추세츠주 보스턴)에 균질화시켰다. 단백질을 종양 용해물로부터 추출하고, 각 종양 샘플중 NICD의 수준을 전술한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 측정하였다. 혈액 샘플을 원심분리하여 혈액 세포로부터 혈청을 분리하였다. N248A의 혈청 수준은 실시예 2에서 기술한 바와 같은 ELISA 방법에 의해 평가하였다. ELISA 플레이트를 먼저, 노치-1-NRR-TM(-)/fc 항원을 포획하는 인간 Fc-특이적 mAb로 코팅하였다. 이어서, 노치-1 항원은 혈청중에서 노치-1 mAb, N248A에 결합한다.
PK 곡선은 N248A mAb가 주사한지 24시간후에 마우스 혈청중 최대 농도(약 235 nM)에 도달함을 나타내었다. 평가된 반감기는 약 4.5일이다(도 9). 노치-1 활성화(즉, NICD)에 대한 직접적 마커의 평가는 N248A로 처리된 마우스로부터 수확된 종양 샘플이 강한 NICD 감소를 가지며, 이것이 투여후 5일까지 지속됨을 나타내었다(도 10). 대조적으로, 대조군 mAb, D16A는 NICD 수준을 감소시키지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 5 mg/kg에서 N248A에 의한 NICD의 최대 억제는 약 80%이었다.
실시예 8: 노치-1 mAb, N248A의 클로닝 및 서열
mAb N248A의 가변 영역의 서열을 결정하였다. 항체 IgG 아형을 이소스트립(Isostrip) 마우스 단클론성 항체 키트(로슈 다이아그노스틱스, 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 먼저 평가하였다. 결과는 N248A가 IgG1 중쇄 및 람다 경쇄를 갖는 것으로 나타났다. mAb N248A의 클로닝 및 서열분석을 위해, 1 x 106 하이브리도마 세포를 수확하고 용해시켜 RNeasy 미니 시약 키트 및 제조사의 프로토콜(키아겐, 캘리포니아주 발렌시아)을 이용하여 전체 세포 RNA를 분리하였다. 1차 가닥 cDNA를 슈퍼스크립트(Superscript) III 역전사효소(인비트로겐)를 사용하여 RNA 주형상에서 합성하였다. 마우스 람다 쇄 암호화 서열의 5'-말단에 상보성인 변성 정방향 프라이머 및 가변 영역의 3'-말단에 인접한 불변 영역에 부합되는 역방향 프라이머를 사용하여, 또는 마우스 IgG1 중쇄 암호화 서열의 5'-말단에 상보성인 변성 정방향 프라이머 및 각각의 IgG1 불변 영역 역방향 프라이머를 사용하여, 1차 가닥 cDNA로부터 PCR에 의해 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 cDNA를 증폭시켰다. PCR 주기 조건은 다음과 같았다: 96 ℃에서 1 분동안 1 주기 후, 95 ℃에서 20 초, 50 ℃에서 20 초 및 72 ℃에서 30초 동안으로 40 주기. 생성된 PCR 산물을 pCR-4-TOPO 벡터(인비트로겐) 내에 클로닝하고, 통상적인 방법에 의해 서열분석하고, 벡터 NTI 어드밴스 소프트웨어(인비트로겐)를 사용하여 분석하였다. 클로닝된 항체 서열은, 질량 분광분석계(캘리포니아 대학, 데이비스, 분자 구조 시설(Univ. of CA, Davis, Molecular Structure Facility))로 측정한 바와 같이, 정제된 하이브리도마-유도된 항체로부터 수득된 N-말단 서열과의 직접 비교에 의해 확인하였다. 수집된 서열 결과는 mAb N248A 중쇄의 가변 영역이 121개 아미노산 잔기를 함유하고, 경쇄가 109개 아미노산 잔기를 함유함을 나타내었다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 사용한 48A mAb VH 서열 및 VL 서열의 추가의 분석은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3의 설계를 유도하였다. mAb N248A의 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 14에 서열 15 내지 20(서열번호: 15 내지 20)으로 나타내었다. mAb N248A의 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR 2 및 CDR3의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 14에 서열 9 내지 14(서열번호: 9 내지 14)로 나타내었다. mAb N248A의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 13에 서열 5 내지 8(서열번호: 5 내지 8)로 나타내었다.
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aggccagtgc 600 aaccccctgt acgaccagta ctgcaaggac cacttcagcg acgggcactg cgaccagggc 660 tgcaacagcg cggagtgcga gtgggacggg ctggactgtg cggagcatgt acccgagagg 720 ctggcggccg gcacgctggt ggtggtggtg ctgatgccgc cggagcagct gcgcaacagc 780 tccttccact tcctgcggga gctcagccgc gtgctgcaca ccaacgtggt cttcaagcgt 840 gacgcacacg gccagcagat gatcttcccc tactacggcc gcgaggagga gctgcgcaag 900 caccccatca agcgtgccgc cgagggctgg gccgcacctg acgccctgct gggccaggtg 960 aaggcctcgc tgctccctgg tggcagcgag ggtgggcggc ggcggaggga gctggacccc 1020 atggacgtcc gcggctccat cgtctacctg gagattgaca accggcagtg tgtgcaggcc 1080 tcctcgcagt gcttccagag tgccaccgac gtggccgcat tcctgggagc gctcgcctcg 1140 ctgggcagcc tcaacatccc ctacaagatc gaggccgtgc agagtgagac cgtggagccg 1200 cccccgccgg cgcagaagcg ccggcggcag catggccagc tctggttccc tgagggcttc 1260 aaagtgtctg aggccagcaa gaagaagcgg cgggagcccc tcggcgagga ctccgtgggc 1320 ctcaagcccc tgaagaacgc ttcagac 1347 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Met Pro Pro Leu Leu 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Lys Lys Lys Arg Arg Glu 420 425 430 Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser 435 440 445 Asp <210> 3 <211> 1287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 atgcctccgc tcctggcacc tctgctctgc ctggcactgc tacccgctct cgctgcacga 60 ggtccgcgat gctcccaacc aggtgagacc tgcctgaatg gaggtaagtg tgaagcagcc 120 aatggcacgt gcctgtgcct gggccccttc acgggccccg aatgccagtt cccggccagc 180 agcccctgcc tgggcggcaa cccctgctac aaccagggga cctgtgagcc cacatccgag 240 agccccttct accgttgcct gtgccccgcc aaattcaacg ggctcttgtg ccacatcctg 300 gactacagct tcgggggtgg ggccgggcgc gacatccccc cgccgctgat cgaggaggcg 360 tgcgagctgc ccgagtgcca ggaggacgcg ggcaacaagg tctgcagcct gcagtgcaac 420 aaccacgcgt gcggctggga cggcggtgac tgctccctca acttcaatga cccctggaag 480 aactgcacgc agtctctgca gtgctggaag tacttcagtg acggccactg tgacagccag 540 tgcaactcag ccggctgcct cttcgacggc tttgactgcc agcgtgcgga aggccagtgc 600 aaccccctgt acgaccagta ctgcaaggac cacttcagcg acgggcactg cgaccagggc 660 tgcaacagcg cggagtgcga gtgggacggg ctggactgtg cggagcatgt acccgagagg 720 ctggcggccg gcacgctggt ggtggtggtg ctgatgccgc cggagcagct gcgcaacagc 780 tccttccact tcctgcggga gctcagccgc gtgctgcaca ccaacgtggt cttcaagcgt 840 gacgcacacg gccagcagat gatcttcccc tactacggcc gcgaggagga gctgcgcaag 900 caccccatca agcgtgccgc cgagggctgg gccgcacctg acgccctgct gggccaggtg 960 aaggcctcgc tgctccctgg tggcagcgag ggtgggcggc ggcggaggga gctggacccc 1020 atggacgtcc gcggctccat cgtctacctg gagattgaca accggcagtg tgtgcaggcc 1080 tcctcgcagt gcttccagag tgccaccgac gtggccgcat tcctgggagc gctcgcctcg 1140 ctgggcagcc tcaacatccc ctacaagatc gaggccgtgc agagtgagac cgtggagccg 1200 cccccgccgg cgcagctgca cttcatgtac gtggcggcgg ccgcctttgt gcttctgttc 1260 ttcgtgggct gcggggtgct gctgtcc 1287 <210> 4 <211> 429 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Met Pro Pro Leu Leu Ala Pro Leu Leu Cys Leu Ala Leu Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Gly Pro Arg Cys Ser Gln Pro Gly Glu Thr Cys Leu 20 25 30 Asn Gly Gly Lys Cys Glu Ala Ala Asn Gly Thr Cys Leu Cys Leu Gly 35 40 45 Pro Phe Thr Gly Pro Glu Cys Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Leu 50 55 60 Gly Gly Asn Pro Cys Tyr Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Pro Phe Tyr Arg Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu 85 90 95 Cys His Ile Leu Asp Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile 100 105 110 Pro Pro Pro Leu Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Glu 115 120 125 Asp Ala Gly Asn Lys Val Cys Ser Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys 130 135 140 Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys 145 150 155 160 Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly His 165 170 175 Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly Phe Asp 180 185 190 Cys Gln Arg Ala Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr Cys 195 200 205 Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly Cys Asn Ser Ala 210 215 220 Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu His Val Pro Glu Arg 225 230 235 240 Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Val Val Val Leu Met Pro Pro Glu Gln 245 250 255 Leu Arg Asn Ser Ser Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser Arg Val Leu 260 265 270 His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg Asp Ala His Gly Gln Gln Met Ile 275 280 285 Phe Pro Tyr Tyr Gly Arg Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys 290 295 300 Arg Ala Ala Glu Gly Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu Gly Gln Val 305 310 315 320 Lys Ala Ser Leu Leu Pro Gly Gly Ser Glu Gly Gly Arg Arg Arg Arg 325 330 335 Glu Leu Asp Pro Met Asp Val Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu Ile 340 345 350 Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ala Ser Ser Gln Cys Phe Gln Ser Ala 355 360 365 Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu 370 375 380 Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Gln Ser Glu Thr Val Glu Pro 385 390 395 400 Pro Pro Pro Ala Gln Leu His Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe 405 410 415 Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser 420 425 <210> 5 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt aactactgga tggagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaaggggtag aactaactac 180 aatgagaact tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagtctac 240 atgcaactca acagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagattccac 300 agctcggcct attactatac tatggactac tggggtcaaa gaacctcggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 6 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe His Ser Ser Ala Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Arg Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 327 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 caggctgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60 acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca actagtaact atgccaactg ggtccaagaa 120 aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc tccaggtatt 180 cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240 cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaacca ctgggtgttc 300 ggtggaggaa ccaaactgac tgtccta 327 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Ile Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 cgctcaagta ctggggctgt tacaactagt aactatgcca ac 42 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 ggtaccaaca accgagctcc a 21 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 gctctatggt acagcaacca ctgggtg 27 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val 1 5 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 aactactgga tggag 15 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 gagattttac ctggaagggg tagaactaac tacaatgaga acttcaaggg c 51 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 ttccacagct cggcctatta ctatactatg gactac 36 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asn Tyr Trp Met Glu 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Glu Ile Leu Pro Gly Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Phe His Ser Ser Ala Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 864 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gaggaggcgt gcgagctgcc cgagtgccag gaggacgcgg gcaacaaggt ctgcagcctg 60 cagtgcaaca accacgcgtg cggctgggac ggcggtgact gctccctcaa cttcaatgac 120 ccctggaaga actgcacgca gtctctgcag tgctggaagt acttcagtga cggccactgt 180 gacagccagt gcaactcagc cggctgcctc ttcgacggct ttgactgcca gcgtgcggaa 240 ggccagtgca accccctgta cgaccagtac tgcaaggacc acttcagcga cgggcactgc 300 gaccagggct gcaacagcgc ggagtgcgag tgggacgggc tggactgtgc ggagcatgta 360 cccgagaggc tggcggccgg cacgctggtg gtggtggtgc tgatgccgcc ggagcagctg 420 cgcaacagct ccttccactt cctgcgggag ctcagccgcg tgctgcacac caacgtggtc 480 ttcaagcgtg acgcacacgg ccagcagatg atcttcccct actacggccg cgaggaggag 540 ctgcgcaagc accccatcaa gcgtgccgcc gagggctggg ccgcacctga cgccctgctg 600 ggccaggtga aggcctcgct gctccctggt ggcagcgagg gtgggcggcg gcggagggag 660 ctggacccca tggacgtccg cggctccatc gtctacctgg agattgacaa ccggcagtgt 720 gtgcaggcct cctcgcagtg cttccagagt gccaccgacg tggccgcatt cctgggagcg 780 ctcgcctcgc tgggcagcct caacatcccc tacaagatcg aggccgtgca gagtgagacc 840 gtggagccgc ccccgccggc gcag 864 <210> 22 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Glu Asp Ala Gly Asn Lys 1 5 10 15 Val Cys Ser Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys Asn Cys Thr Gln Ser 35 40 45 Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Ser Gln Cys 50 55 60 Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly Phe Asp Cys Gln Arg Ala Glu 65 70 75 80 Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser 85 90 95 Asp Gly His Cys Asp Gln Gly Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp 100 105 110 Gly Leu Asp Cys Ala Glu His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr 115 120 125 Leu Val Val Val Val Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser 130 135 140 Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser Arg Val Leu His Thr Asn Val Val 145 150 155 160 Phe Lys Arg Asp Ala His Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly 165 170 175 Arg Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ala Ala Glu Gly 180 185 190 Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu Gly Gln Val Lys Ala Ser Leu Leu 195 200 205 Pro Gly Gly Ser Glu Gly Gly Arg Arg Arg Arg Glu Leu Asp Pro Met 210 215 220 Asp Val Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys 225 230 235 240 Val Gln Ala Ser Ser Gln Cys Phe Gln Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala 245 250 255 Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys 260 265 270 Ile Glu Ala Val Gln Ser Glu Thr Val Glu Pro Pro Pro Pro Ala Gln 275 280 285

Claims (31)

  1. 인간 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분으로서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 적어도 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프에 결합하고, 제 1 에피토프가 인간 노치-1(Notch-1)의 Lin-A 도메인 내에 존재하고, 제 2 에피토프가 인간 노치-1의 HD-C 도메인 내에 존재하는, 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프 둘 다에 결합하고, 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프가, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 결합하는 유일한 주(major) 에피토프인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  3. 제 2 항에 있어서,
    제 1 에피토프가 1463V, 1465S, 1466L 및 1467Q로부터 선택된 1 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 주 에피토프인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 에피토프가 1705G, 1706A, 1707L, 1709S 및 1710L로부터 선택된 1 내지 5개의 아미노산 잔기로 이루어지는 주 에피토프인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    제 1 에피토프의 아미노산 잔기 중 임의의 아미노산 잔기의 비-보존적 치환이 인간 노치-1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 결합 친화도의 80% 초과의 손실을 야기하는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 인간화된, 인간 또는 키메라 항체 또는 그의 항원 결합 부분인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 마우스 항체 또는 그의 항원 결합 부분인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  8. 제 6 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 1 x 10-4 M 이하의 KD로 인간 노치-1에 결합하는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  9. (i) 서열번호: 18에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 18의 1 내지 4개 잔기가 변형된 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (ii) 서열번호: 19에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 19의 1 내지 4개 잔기가 변형된 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (iii) 서열번호: 20에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 20의 1 내지 4개 잔기가 변형된 그의 변이체를 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는, 인간 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론성 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  10. 제 9 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 변형 중 임의의 변형이 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  11. 제 9 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 어느 것도 변형되지 않는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  12. (i) 서열번호: 12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 12의 1 내지 4개 잔기가 변형된 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (ii) 서열번호: 13에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 13의 1 내지 4개 잔기가 변형된 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (iii) 서열번호: 14에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 14의 1 내지 4개 잔기가 변형된 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는, 인간 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론성 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  13. 제 12 항에 있어서,
    경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 변형 중 임의의 변형이 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  14. 제 12 항에 있어서,
    경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 어느 것도 변형되지 않는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  15. (i) 서열번호: 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
    (ii) 서열번호: 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
    (iii) 서열번호: 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3.
    (iv) 서열번호: 12를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
    (v) 서열번호: 13을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
    (vi) 서열번호: 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하고, 여기서 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR 각각의 1 내지 4개 아미노산 잔기가 변형될 수 있는, 인간 노치-1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  16. 제 15 항에 있어서,
    경쇄 CDR 및 중쇄 CDR의 변형 중 임의의 변형이 그의 아미노산 잔기의 보존적 치환인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  17. 제 15 항에 있어서,
    경쇄 CDR 및 중쇄 CDR 중 어느 것도 변형되지 않는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  18. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 마우스 항체 또는 마우스 항체의 항원 결합 부분인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  19. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 인간화된, 인간 또는 키메라 항체인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  20. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 1 x 10-5 M 미만의 평형 해리 상수 KD로 인간 노치-1에 결합하는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  21. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 2 x 10-6 M 미만의 평형 해리 상수 KD로 인간 노치-1에 결합하는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  22. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 1 x 10-6 M 미만의 평형 해리 상수 KD로 인간 노치-1에 결합하는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  23. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원 결합 부분이 2 x 10-6 M 미만의 평형 해리 상수 KD로 인간 노치-1에 결합하는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  24. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 전장 항체인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  25. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간화된 항체인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  26. 제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 키메라 항체인, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 약학 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 재조합적으로 생산하는 세포주.
  29. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 올리고뉴클레오티드.
  30. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분 또는 그의 약학 조성물을 치료 효과량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
  31. 암 치료에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 그의 약학 조성물.
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