WO2004009617A1 - Ｎｏｔｃｈ由来新規ポリペプチドおよびそれを用いたバイオマーカー並びに試薬 - Google Patents

Ｎｏｔｃｈ由来新規ポリペプチドおよびそれを用いたバイオマーカー並びに試薬 Download PDF

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polypeptide
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Masayasu Okochi
Masatoshi Takeda
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    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide derived from a novel intracellular proteolysis of Notch protein, a biomarker and a reagent using the same.
  • the proteolytic portion of Notch is abbreviated as Site-1; S1, Site-2; S2, Site-3; S3, Site-4; S4.
  • Site-4 (S4) is a novel proteolytic site in the membrane discovered by the present inventors as described later. Background art
  • Notc li is a type 1 transmembrane protein present on the cell surface. It has EGF repeats in the extracellular part and is a transcriptional regulatory element containing ankyrin hyperphosphate in the intracellular part.
  • Notch is known to be involved in intercellular communication of cell differentiation. For example, during the development of the cerebral nervous system, some ectodermal cells differentiate into neural progenitor cells (stem cells). In addition, it differentiates into neurons and Darier cells. In this process, intercellular communication via Noteh is important.
  • the mechanism of cell-to-cell communication via Notch is as follows. First, Notch is expressed as a receptor in cells receiving Noteh signaling. Notch transported to the cell surface is cleaved into two molecules by the protease such as furin in the extracellular partial region (S1). It is present as it is on the cell surface in a state bound by one S bond.
  • a Notch ligand such as the DSL family of Delta, Serrate, and Lag-2
  • DSL family of Delta, Serrate, and Lag-2 a Notch ligand
  • Notch is cleaved near the cell membrane surface (S 2), and this cleavage triggers cleavage in the cell membrane or very close to the cell membrane inside the cell (S 3), and the resulting intracellular part
  • One NICD is released into the cell, translocates into the nucleus, and regulates the transcription of the target gene by binding to the CSL family (CPB, SuH, Lag-1; a transcription factor).
  • Cleavage at the S3 site described above involves presenilin associated with Alzheimer's disease.
  • Notch is extremely important for cell-to-cell communication in cell differentiation, but is also involved in cell neoplasia, apoptosis, Alzheimer's disease, etc., in addition to the above-mentioned differentiation of the brain nervous system.
  • Okochi et al. “Biology of Alzheimer's disease and presenilin” Molecular Psychiatry Vol.1 No.3 2001
  • Kageyama et al. “Control of neural differentiation by Notch” Proteins Enzymes Nucleic acid Vol. 45 No.
  • Notch signal transmission is a very important technique for research and diagnosis of cell differentiation, tumorigenesis of cells, apoptosis, Alzheimer's disease, etc., and its early establishment is required. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and it is an object of the present invention to provide a substance that can act as an extracellular secretory for detecting Notch signal transmission.
  • the present inventors make a hypothesis that the polypeptide remaining in the cell membrane will be released outside the cell during cleavage at the S3 site during a series of Notch proteolytic processes, and will investigate the hypothesis. It was to be. That is, if the remaining polypeptide in the cell membrane is released outside the cell, this can be a marker for Notch signaling.
  • the fourth cleavage occurred at a site (in the transmembrane region) different from the site where S3 was degraded.
  • the novel polypeptide of the present invention is a novel polypeptide derived from a Notch protein.
  • NICD Notch It is a polypeptide that is released extracellularly when the intracellular cytoplasmic domain translocates into the nucleus. Since this polypeptide can be detected by an antibody or the like, it can be used as a marker for detecting Notch signal transduction.
  • Notch signaling is associated with cell differentiation, tumorigenicity of cells, Alzheimer's disease, apoptosis, etc., the novel polypeptide of the present invention can be used as a marker for detection thereof.
  • novel polypeptide of the present invention there are a plurality of types of polypeptides having different C-termini.
  • the following in the above, the novel polypeptide of the present invention is also referred to as "Notch- / 3 (N / 3)".
  • the proteolysis in the membrane is not limited to the cell membrane but also includes the organelle membrane of other cells.
  • FIG. 1 (A) is a diagram showing the structure of ⁇ , F—NEXT and NICD
  • FIGS. 1 (B) and (C) are diagrams showing a novel FLAG-tagged polypeptide (N / N) of the present invention.
  • 3 is a photograph of electrophoresis showing an example of the production of 3).
  • FIGS. 2 (A) and (B) are photographs of electrophoresis showing an example of the production of the novel polypeptide ( ⁇ ] 3) of the present invention.
  • FIG. 3 ( ⁇ ) is a mass spectrometry chart of the novel polypeptide group of the present invention, and FIG. 3 ( ⁇ ) shows the main site of the novel Notch protein cleavage site (S4) and Alzheimer's disease amyloid jS (h ] 3 AP P) The major cleavage sites of the protein precursor are indicated.
  • FIG. 4 (A) is a diagram showing an example of the amino acid sequence of a novel polypeptide which is the main body of the present invention.
  • FIG. 4 (B) compares the intracellular amino acid sequences of Notch-1 to 4 and hi3APP.
  • FIGS. 5 (A) and 5 (B) are electrophoresis photographs showing an example of the effect of inhibition of the function of presenilin (PS) on extracellular release of the novel polypeptide (N / 3) of the present invention.
  • FIG. 6 (A) is an example of a mass spectrometry chart showing an example of the effect of the Alzheimer's pathogenic presenilin mutant on N] 3 release.
  • Figure 6 (B) shows N / 3 species whose secretion is relatively increased by the effect of the Alzheimer's pathogenic Presenilin mutant.
  • Figure 6 (C) shows the semi-quantitative increase in secretion.
  • FIG. 7 shows an example of extracellular release of the novel polypeptide (Ni3) of the present invention
  • FIG. 4 is a diagram for explaining that the C-terminus of a peptide and its release peptide is changed by the Alzheimer's pathogenic presenilin mutant.
  • FIG. 8 (A) shows the mechanism of cutting at the transmembrane portion of Notch_1 and i3APP.
  • FIG. 8 (B) specifically shows the F-NEXT V1744G and F-NEXT V1744L mutants in a schema.
  • Fig. 8 (C) shows the mechanism of cutting at the transmembrane portion of Notch_1 and i3APP.
  • FIG. 8 (E) shows the measurement of the efficiency of S 3ZS 4 cleavage in cells.
  • Fig. 9 (A) shows the release from wild-type F-NEXT
  • Fig. 9 (B) shows the release from the F-NEXT VI 744 G mutant
  • Fig. 9 (C) shows the release from the F-NEXT V1 744 L mutant.
  • 4 is a mass spectrometry chart of the obtained FN / 3 peptide.
  • FIG. 10 (A) shows the generated S4 cleavage site mutant specifically in a schema.
  • Figures 10 (B) and (C) show the molecular weights of FN3 released from wild-type F-NEXT, F-NEXT G1733-1733 mutant and L17330-17333 mutant, respectively.
  • 4 is a photograph of electrophoresis showing an example of the above.
  • FIG. 10 (D) shows the measurement of the efficiency of S 3 / S 4 cleavage in cells.
  • Figure 11 (A) shows the release from the F-NEXT G 1730-1733 mutant
  • Figure 11 (B) shows the release from the F-NEXT L 1730-173 3 mutant.
  • This is a mass spectrometry chart of the FN jS peptide.
  • the polypeptide of the present invention is extracellular in proportion to Noteh signaling. Will be released.
  • novel proteolysis which is the proteolysis that occurs immediately before the release to the outside of the cell, is dependent on presenilin, and if the function of presenilin is inhibited, the release of the polypeptide of the present invention also decreases.
  • the novel polypeptide of the present invention occurs in the N 0 tch protein simultaneously with or before or after proteolysis at the S 3 cleavage site, and proteolysis at the N-terminal transmembrane portion of the S 3 cleavage site (S 4 cuts) and is released.
  • the amino acid sequence of the novel polypeptide (N / 3) of the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 18.
  • SEQ ID NOs: 1 to 18 are mouse sequences
  • SEQ ID NOs: 10 to 18 are human sequences.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 18 may be an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added.
  • the polypeptide having such an amino acid sequence is also derived from the Note protein, and in a series of proteolysis of the Notch protein, NI CD is translocated into the nucleus by extracellular proteolysis followed by intracellular membrane proteolysis.
  • the polypeptide is released outside the cell.
  • This polypeptide is also released out of the cell in proportion to the Noteh signal, and is released out of the cell in a presenilin-dependent manner.
  • the novel polypeptide of the present invention may be obtained from an organism or artificially synthesized.
  • the type of the organism is not limited, and may be, for example, human, mouse, rat, rabbit, goat, swine, pig, fly, nematode, and the like.
  • the type of tissue or cell from which the novel polypeptide of the present invention is derived is not limited, that is, somatic cells and tissues regardless of undifferentiated or differentiated. For example, it may be nerve, bone marrow, cancer cells and tissues.
  • the biomarker of the present invention includes the novel polypeptide of the present invention, and can be used for detection of Notch signaling, cell differentiation, tumor, apoptosis, Alzheimer's disease and the like.
  • the biopolymer of the present invention may contain other components, or may be the novel polypeptide itself (alone).
  • This biomarker can be detected with a reagent containing an antibody capable of recognizing the new polypeptide.
  • the antibody capable of recognizing the novel polypeptide can be prepared by an ordinary method, and may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the reagent may contain, in addition to the antibody capable of recognizing the novel polypeptide, a labeled antibody using the body as an antigen or a labeled body capable of recognizing the novel polypeptide.
  • the labeling can be performed using a carrier such as a fluorescent substance, an enzyme (eg, a substance whose substrate develops color by an enzyme reaction), a radioactive substance, or agarose.
  • the gene of the present invention is a gene encoding the novel polypeptide of the present invention, and is DNA or RNA.
  • the vector of the present invention has the gene incorporated therein, and the transformant of the present invention is a transformant using the vector.
  • the right side of the figure shows an example of extracellular release of amyloid beta (A ⁇ ) in Alzheimer's disease.
  • a ⁇ amyloid beta
  • the amino terminus of NEXT (Notch Extracellular Truncation) is generated by extracellular cleavage by TACE (TNF j3 -Converting Enzyme). S at two sites Further, the cleaved NEXT is further transformed into the nucleus of NI CD by the cleavage of the S3 site, and at or around the same time, the cleavage of the S4 site (the fourth No. which was first discovered by the present inventors).
  • the proteolytic site of tch releases Ni3 (the novel polypeptide of the invention) out of the cell.
  • FIG. 4 An example of the amino acid sequence at the C-terminus of the novel polypeptide (Ni3) of the present invention is shown in FIG. 4 (B).
  • the figure shows N
  • the sequence around the C-terminus of the release fragment is shown.
  • the major S4 cleavage site is located a few amino acid residues N-terminal to the putative transmembrane domain (TM) region (indicated by the left arrow in the figure).
  • the amino acid sequence around the main cleavage site was not conserved between mNotchl ⁇ 4, but the S3 cleavage site valine 1743 was conserved (in the figure, the right side). Indicated by triangle arrows).
  • the S 4 cleavage site is characterized by having diversity, unlike S 3. This diversity is presumed to reflect the special mechanism of recognition of the cleavage sequence of S4 secretase.
  • Notch hAE-M1727V ( ⁇ ) having six consecutive c-my c sequences added to the C-terminus and cDNA encoding NICD inserted into plasmid pcDNA3 hygro were prepared by the method of Schroeter et al. , EH, isslinger, JA, Kopan, R. (1998). Notch-1 signaling requires 1 igand- induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393, 382-386. The cDNA used was provided by Dr. R. Kopan. NEXT having a FLAG sequence added to the N-terminus, ie, FLAG-NEXT (F-NEXT), was prepared by two-step site-directed mutagenesis.
  • F-NEXT M1727V F-NEXT Ml727V
  • ⁇ was used as type ⁇ , and the following two primers 1 and 2 (SEQ ID NOs: 19 and 20) were prepared.
  • F-NEXT was obtained by site-directed mutagenesis using a site-directed mutagenesis kit (Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene). Prepared. At that time, F-NEXT M1727V was used as type II, and the following two primers 3 and 4 (SEQ ID NOS: 21 and 22) ) was prepared. Primer 1; 5-CCTCGCAGCTGCACCTCATGTACGTGGCAGCG-3 '
  • the polyclonal antibody (L652) is an antibody against a polypeptide having an amino acid sequence between V1722 and G1743 (sequence between S2 and S3 sites) of human Notch-1.
  • This antibody (L652) was prepared as follows. First, the polypeptide serving as an antigen was prepared. This polypeptide is characterized by being rich in hydrophobic amino acids. For this reason, antibodies were prepared in the same manner as used when preparing antibodies against Alzheimer's disease amyloid) 3 protein.
  • Human fetal kidney 293 cells (K293 cells), N2a cells and COS cells were purified from 10% fetal serum, 1% penicillin / streptomycin,
  • K293 cells stably express PS1 wild-type, PS1L286V and PS1D385N (Okochi et al, 2000, Kulic et al, 2000, Wolfe et al,
  • ⁇ and F-NEXT were introduced into cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
  • N-terminal fragment of ⁇ (NTF: N) 3) is released from ⁇ -expressing cells
  • ⁇ 293 cells into which ⁇ and NICD have been stably transfected are placed in a 10 cm dish. And cultured to a confluent state. Then, the cells were placed in a balanced salt solution of a MEM vitamin solution (Gibco) and an eagle to which unlabeled amino acid was added at 300 iCi [] amino acid (tritiated amino acid mixture; Amersham ) was metabolically pulse-labeled for 2 hours in the culture medium to which was added, and then chased with 10% FCS / DMEM for 6 hours.
  • MEM vitamin solution Gibco
  • the medium was collected and immediately placed on ice. Then, centrifugation was performed at 300,000 ⁇ g to remove cell debris. Next, a protease inhibitor cocktail (l: 1000; Sigma) and 0.025% sodium azide were added. The sample was subjected to immunoprecipitation using L652 or M2-agamouth (Sigma), followed by 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid and 1% Triacid. The plate was washed three times with RIPA buffer containing tonX-100. After that, SDS-PAGE was performed using Tris-Toricin 10-20% gradient gel (Invitrogen).
  • the cells were scraped in ice-cold PBS, separated and collected by centrifugation at 1500 ⁇ g, and lysed with a 10-fold concentration of the above RIPA 1001.
  • 9001 PBS containing a protease inhibitor mixture (1: 500; Sigma) was added to the lysed cells.
  • the insoluble fraction was separated by centrifugation at 1500 xg, and the supernatant was used for immunoprecipitation.
  • Samples for immunoprecipitation were pretreated with protein A sepharose (Sigma) and immunoprecipitated with 9E10 or M2-agarose. Next, the washed protein samples were separated by 8% or Tris-Tricine SDS-PAGE. After the gel was fixed, it was shaken in amplified fluorescence photography reagent (Amplify Fluorographic Reagent, Amersham), dried, and finally subjected to autoradiography.
  • the culture medium was replaced with fresh 10% FC SZDMEM. After 3 hours incubation in C0 2 incubator primary, placed on ice immediately the culture supernatant was collected, and the cells remaining in centrifugation Debris was removed. After addition of the protease inhibition mixture (1: 1000) and 0.025% sodium azide, the medium was immunoprecipitated using M2-agarose for 4 hours at 4 ° C. . The sample was then purified using an MS wash buffer containing 0.1% n-octylglucoside, 140 mM NaC and 10 mM Tris (pH 8.0) and 0.025% sodium azide.
  • NVF N-terminal fragment
  • F-NEXT FLAG-NEXT
  • Figure 1 (A) shows the configuration of ⁇ , NICD and F-NEXT.
  • F-NEXT a signal peptide followed by a FLAG sequence and two methionines are inserted at the N-terminal of NEXT.
  • the amino acid residue at position 172 was not mutated, but in ⁇ ⁇ (mouse Notch-1 (mNote-1)), as shown by the inverted triangle in the figure, Methionine 17 27 has been artificially mutated to valine (Schroeter, EH, Kiss linger, JA, Kopan, R. (1998). No tch h-1 signaling required)
  • the NICD generation efficiency was not different when ⁇ E or F-NEXT was expressed.
  • the culture supernatant was immunoprecipitated with M2-agarose and analyzed by 8% SDS-PAGE.
  • a band of about 4 kDa F-N / 3 (an aggregate of the novel polypeptide group of the present invention) was used to chase cells that stably express F-NEXT for 2 hours. Identified only from depleted media. This indicates a completely new finding that the opposite amino terminal fragment is secreted extracellularly during NICD generation.
  • NTF Nj3
  • K293 cells stably expressing ⁇ or NICD were pulse-labeled with [] for 2 hours and chased for 6 hours.
  • Chase medium and cell lysates were immunoprecipitated with L652, an anti- ⁇ 6 antibody, and the samples were separated by Tris-Tricine SDS-PAGE.
  • the NTF band of ⁇ E with a molecular weight of 3 to 4 kDa was detected from the culture supernatant of ⁇ ⁇ ⁇ -expressing cells, but was cultured in NICD-expressing cells. It was not found in the supernatant or cell lysate. This suggested that this band was a wild-type N / 3 that was not tagged with FLAG.
  • FIG. 3 (B) shows the outline of the transmembrane cleavage of mouse N 0 tc h-1 (mN otc h-1) and human; 3APP (hjSAPP).
  • mNotch-1 produces NICD and N / 3 by intramembrane cleavage.
  • # 3 and a novel protein cleavage site at its C-terminus were identified.
  • 3AP And intracellular fragment CTFa 50 Base, M., Steiner, H., Fuchs, K., Capell, A., Multhaup, G., Condron, MM, Teplow, DB, Haass, C. (2001).
  • the culture supernatant of cells stably expressing F-NEXT was immunoprecipitated with M2-agarose, and the molecular weight of N) 3 was analyzed using MALDI-TOF / MS according to the above-described experimental method.
  • the result is shown in Fig. 3 (A) graph (large).
  • many peaks were observed around the molecular weight of 4000, but no remarkable peak having a molecular weight of more than 450 was not confirmed.
  • the details of the peaks having a molecular weight of 300000 to 4500 are shown in the graph (small) in FIG. The same major peak was confirmed when CH0, COS and N2a were used as host cells (not shown).
  • Fig. 4 (A) shows the amino acid sequence of N) S corresponding to the MALDI-TOF / MS peak shown in the graph (small) of Fig. 3 (A).
  • the major NjS C-terminus is alanine 1731.
  • Bold letters indicate the amino acid sequence of the main peak.
  • a molecular weight peak near 560 which coincides with the S3 cleavage site, was not confirmed.
  • FIG. 4 (B) lists the amino acid sequences of the Notch-1 to 4 protein transmembrane portions of human (h) and mouse (m). Since S1, S2, and S3 cleavage are common phenomena in Notch 1-4, and are a common signal transduction mechanism regardless of species, S4 cleavage also involves all N It can be assumed that this is a phenomenon common to otch-related proteins. As shown in the figure, since the S4 site is partially conserved in the same manner as the S3 site, it can be inferred that this S4 cleavage is a phenomenon common to the Notl hl ⁇ 4 proteins. (Example 4)
  • FAD familial Alzheimer's disease
  • PS presenilin
  • PS-dependent S4 proteolysis was also related to FAD-related PS mutation.
  • PS 1 that is a wild-type (wt) PS 1 or FAD-related PS 1 mutation K293 cells expressing C92S, PS1L166P and PS1L286V were stably infected with F-NEXT. Then, culture supernatants of cells expressing the PS1 derivative and F-NEXT were analyzed by MALDI-TOF / MS to confirm the change in the C-terminal of F-N / 3. As shown in FIG.
  • An F-NEXT expression construct with or without a mutation at the S3 cleavage site was expressed in a K2 constitutively overexpressing wild-type PS1 or PS1D385N lacking the function of secretase.
  • 93 cells were stably infected.
  • Metabolic labeling experiments with 35 S-methionine were performed on the cells, and the radiolabeled novel and NICD in the cell sedimentation and corresponding cell culture supernatants were separated by immunoprecipitation and electrophoresis. It was detected by a combination of radiation dose measurement (IP-autoradiography). A pulse stimulation was applied to the cell sediment for 30 minutes, and IP-autoradiography was performed with an anti-c-myc antibody (9E10).
  • Familial Alzheimer's disease (FAD) variants of PS affect the accuracy of proteolysis by PS / ⁇ -secretase and also increase the production of extended AiS, A342. It is thought to be the cause of the onset of FAD.
  • PS FAD mutants affect the accuracy of Notch cleavage by PS / R-secretase and increase the production of extended FN) 3.
  • S3 cleavage efficiency has been reported to reduce S3 cleavage efficiency.
  • F-NEXT V1744G mutant expressing cells or F-NEXT VI7444L mutant expressing cells was converted to M2-agarose Was immunoprecipitated using and analyzed by MALDI-TOF / MS.
  • FIGS. 9 (B) and (C) in the F-NEXT V1744G mutant and V1744L mutant, as in the wild type, alanine 1731 and The major cleavage site was between alanine 1 732 and had no effect on the distribution of secondary S 4 cleavages distributed over several. That is, mutations that reduce S3 cleavage did not affect the accuracy of the S4 cleavage site in any way. Was done. This suggests that the FAD-type PS mutation indirectly affected the accuracy of S4 cleavage.
  • the S4 cleavage site mutant may have the same effect as the above-mentioned artificial point mutant of S3, and replace the four alanine residues around the S4 cleavage site with glycine residues or leucine.
  • F-NEXT G173-1733 mutant and L17330-17333 mutant (Fig. 10 (A)) mutated to residues The effect of the decrease on the S3 cutting efficiency was examined. As a result, among the S4 cleavage site mutants, the L17330—1733 mutant that inhibited the S4 cleavage activity had reduced S3 cleavage efficiency.
  • the G17330—17333 mutant expressing cells showed similar NICD generation to the wild-type F-NEXT expressing cells, whereas the L17330—1733 mutant NI CD production in somatic cells was reduced compared to wild type (Fig. 10 (C), upper panel). From this, it was considered that S3 cleavage was inhibited in the L1730-1733 mutant. To prove this result, S 4ZS 3 efficiency was calculated in the same way as in Fig. 8 (E). As a result, among the S4 mutants, the G173-0-1733 mutant, which hardly affected the S4 activity, had no effect on the S3 cleavage activity (Fig. 10 (D)).
  • the novel polypeptide of the present invention is derived from a Notch protein.
  • NICD In a series of proteolysis of the Notch protein, NICD translocates into the nucleus by intracellular proteolysis following extracellular proteolysis. Is a polypeptide that is released extracellularly.
  • Notch signal transmission can be detected, for example, cell differentiation, tumorigenicity of cells, apoptosis, etc. It can also detect cis, Alzheimer's disease and the like.

Abstract

Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を検出できる細胞外マーカーを提供する。　Ｎｏｔｃｈタンパク質由来の新規ペプチド群であり、前記Ｎｏｔｃｈタンパク質の一連のタンパク質分解において、細胞外部分における分解に続く膜内でのタンパク質分解によりNICD(Ｎｏｔｃｈ intracellular cytoplasmic domain)が核内に移行する際に、細胞外に放出されるポリペプチド（Ｎβ）をマーカーとする。このペプチド群（Ｎβ）は、Ｎｏｔｃｈシグナルに比例して細胞外に放出され、プレセニリン（presenilin）依存である。このペプチド群を検出することにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達、細胞分化、細胞の腫瘍化、アポトーシス及びアルツハイマー病等をモニターできる。

Description

明 細 書
No t c h由来新規ポリべプチドおよびそれを用いたバイオマーカ一並 びに試薬 技 分野
本発明は、 No t c hタンパク質の新規膜内タンパク質分解に由来す る新規ポリべプチドおよびそれを用いたバイオマーカー並びに試薬等に 関する。 なお、 本発明の説明において、 N o t c hのタンパク質分解部 分については、 Site - 1;S1、 Site- 2;S2、 Site-3;S3、 Si te- 4;S4と略記す る。 なお、 Site - 4 (S 4) は、 後述のように、 本発明者等が発見した膜 内の新規タンパク質分解部位である。 背景技術
No t c liは、 細胞表面に存在するタイプ 1膜貫通型タンパク質であ り、 細胞外部分に EGFリピートを持ち、 細胞内部分にアンキリンひピ —トを含む転写調節因子である NICD (N o t c h Intracellular
Cytoplasmic Domain) を持つ。 N o t c hは、 細胞の分化に関する細胞 間情報伝達に関与することが知られており、 例えば、 脳神経系の発生過 程では、 外胚葉系の細胞の一部が神経前駆細胞 （幹細胞） に分化し、 さ らにニューロン細胞やダリァ細胞へと分化するが、 この過程において、 No t e hを介した細胞間情報伝達が重要である。 No t c hを介した 細胞間情報伝達のメカニズムは、 つぎの通りである。 まず、 No t c h は、 No t e hシグナル伝達の受け手側細胞のレセプ夕一として発現さ れる。細胞表面に輸送された N o t c hは、 furin等のプロテア一ゼで細 胞外部分領域 （S 1) で切断されて 2分子になっているが、 これらは S 一 S結合で結合した状態で、 そのまま細胞表面に存在する。 次に、 No t c hシグナル伝達の送り手側の細胞が近接して存在した場合、 その細 胞表面には N o t c hリガンド （Delta, Serrate, Lag- 2の DSLファミリ 一等） が発現されている。 これら 2つの条件が整い、 細胞表面で No t c hリガンドがレセプターである No t c hと相互作用すると、 段階的 なタンパク質分解が誘導されシグナル伝達が開始される。 即ち、 No t c hは細胞膜表面付近 （S 2) で切断され、 さらにこの切断が引き金に なって細胞膜内あるいは細胞内側の細胞膜の極めて近傍 （S 3) で切断 が起こり、 その結果生ずる細胞内部分である NICDが細胞内に放出され、 これが核内に移行し、 CSLファミリー （CPB、 SuH、 Lag- 1；転写因子） と 結合することで標的遺伝子の転写を調節する。 上記の S 3部位での切断 には、 アルツハイマー病に関連するプレセニリンが関与している。 このように、 N o t c hは、 細胞分化における細胞間情報伝達に極め て重要であるが、 前記脳神経系の分化の他に、 細胞の腫瘍化、 アポトー シス、 アルツハイマー病等にも関係していることが最近明らかになり注 目を集めている (例えば、 大河内等 「アルツハイマー病とプレセニリン の生物学」 分子精神医学 Vol.1 No.3 2001、 影山等 「No t c hによ る神経分化制御」 タンパク質 酵素 核酸 Vol.45 No.3 2000、 Brian et. al. , 「A carboxy - terminal deletion mutant of No t c h 1 accelerates lymphoid oncogenes is in E2A-PBX1 transgenic mice」 Blood Vol.96 No.5 2000 Sep.1 l906-1913) 。 したがって、 No t c hシグナ ル伝達の検出は、 細胞分化、 細胞の腫瘍化、 アポトーシス、 ァルツハイ マー病等の研究や診断に極めて重要な技術であり、 その早期確立が求め られている。 発明の開示
本発明は、 このような事情に鑑みなされたもので、 No t c hシグナ ル伝達を検出するための細胞外分泌マ一力一となり得る物質の提供を、 その目的とする。 本発明者等は、 No t c hの一連のタンパク質分解過程で、 S 3部位 での切断の際、 細胞膜中に残されたポリペプチドが、 細胞外に放出され るという仮説を立て、 その検討を行うことにした。 すなわち、 細胞膜中 の残されたポリペプチドが細胞外に放出されるとすれば、 これが No t c hシグナル伝達のマーカーになり得るからである。 本発明者等による No t e hシグナル伝達の一連の研究の結果、 S 3の分解箇所とは別の 部位 （膜貫通部分内にある） で第 4番目の切断が生じ、 この切断により 生じたポリべプチドが細胞外に放出することを突き止め、 本発明に至つ た。 すなわち、 本発明の新規ポリペプチドは、 No t c hタンパク質由来 の新規ポリペプチドであり、 前記 No t c hタンパク質の一連のタンパ ク質分解において、 細胞外タンパク質分解に続き膜内タンパク質分解に より NICD(N o t c h intracel lular cytoplasmic domain)が核内に移行 する際に、 細胞外に放出されるポリペプチドである。 このポリペプチド は、 抗体等で検出できることから、 N o t c hシグナル伝達を検出する ためのマ一カーとして使用できる。 また、 N o t c hシグナル伝達は、 細胞分化、 細胞の腫瘍化、 アルツハイマー病、 アポトーシス等に関連し ているため、 本発明の新規ポリペプチドは、 これらの検出用マーカーと しても使用できる。 また、 後述するように、 本発明の新規ポリペプチド において、 C末端が異なる複数種類のポリペプチドがある。 なお、 以下 において、 本発明の新規ポリペプチドを、 「No t c h- /3 (N/3) 」 と も言う。 また、 前記膜内のタンパク質分解は、 細胞膜に限定されず、 そ の他の細胞のオルガネラ膜も含まれる。 図面の簡単な説明
図 1 (A) は、 ΝΔΕ、 F— NE XTおよび NICDの構成を示す図であ り、 図 1 (B) および （C) は、 本発明の FLAGタグされた新規ポリぺプ チド （N/3) の生成の一例を示す電気泳動の写真である。
図 2 (A) および （B) は、 本発明の新規ポリペプチド （Ν]3) の生 成の一例を示す電気泳動の写真である。
図 3 (Α) は、 本発明の新規ポリペプチド群の質量分析チャートであ り、 図 3 (Β) は新規の N o t c hタンパク質切断部位 （S 4) の主要 な部位およびアルツハイマー病アミロイド jS (h ]3 AP P) タンパク質 前駆体の主要な切断部位を、 それぞれ示す。
図 4 (A) は、 本発明の本体である新規ポリペプチドのアミノ酸配列 の例を示す図である。 図 4 (B) は N o t c h- 1〜4および h i3 AP P の膜内アミノ酸配列を比較したものである。
図 5 (A) および （B) は、 本発明の新規ポリペプチド （N/3) の細胞 外放出におけるプレセ二リン （P S) の機能阻害の影響の一例を示す電 気泳動の写真である。
図 6 (A) は、 N ]3放出におけるアルツハイマー病原性プレセ二リン 突然変異体の影響の一例を示す質量分析チャートの一例である。' 図 6 ( B) は、 アルツハイマー病原性プレセ二リン突然変異体の影響により分 泌量が相対的増加する N /3種を示したものである。 図 6 (C) は、 分泌 量の相対的増加を半定量したものである。
図 7は、 本発明の新規ポリペプチド （Ni3) の細胞外放出の一例およ びその放出べプチドの C末端がアルツハイマー病原性プレセニリン突然 変異体により変化することを説明する図である。
図 8 (A) は、 N o t c h _ 1および i3APPの膜貫通部分での切断の機 構を示したものである。図 8 (B)は、 F- NEXT V 1 744 Gおよび F- NEXT V 1 744 L変異体を具体的にシェーマで示したものである。 図 8 (C
) は、 V 1 744を変異させたことによる、 NICD産生の阻害の一例を示 す電気泳動の写真である。 図 8 (D) は、 対応する細胞培養上清中の F-N
|3の分泌の一例を示す電気泳動の写真である。 図 8 (E) は、 細胞内で の S 3ZS 4切断の効率を測定したものである。
図 9 (A) は、 野生型 F- NEXT、 図 9 (B) は、 F- NEXT V I 744 G突 然変異体、 図 9 (C) は、 F- NEXT V 1 744 L突然変異体から放出され た F-N/3ペプチドの質量分析チャートである。
図 1 0 (A) は、 作成した S 4切断部位突然変異体を具体的にシエー マで示したものである。 図 1 0 (B) および （C) は、 野生型 F-NEXT、 F-NEXT G 1 730 - 1 7 3 3変異体および L 1 7 30— 1 7 33変異 体から放出された F-N 3の分子量の一例を示す電気泳動の写真である。 図 1 0 (D) は、 細胞内での S 3 /S 4切断の効率を測定したものであ る。
図 1 1 ( A) は、 F- NEXT G 1 7 30 - 1 73 3突然変異体、 図 1 1 ( B) は、 F - NEXT L 1 7 3 0 - 1 7 3 3突然変異体から放出された F-N jS ぺプチドの質量分析チヤ一トである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について、 さらに詳しく説明する。 本発明のポリペプチドは、 No t e hシグナル伝達に比例して細胞外 に放出される。 しかも、 この細胞外への放出の直前におこるタンパク質 分解である新規タンパク質分解は、 プレセ二リン依存的であり、 プレセ ニリン機能が阻害されれば、 本発明のポリべプチドの放出も減少する。 本発明の新規ポリペプチドは、 N 0 t c hタンパク質において、 S 3 切断部位でのタンパク質分解と同時若しくはこれと前後しておこり、 S 3切断部位より N末端側の細胞膜貫通部分でのタンパク質分解 （S 4切 断） により、 生じて放出される。 本発明の新規ポリペプチド （N /3 ) のアミノ酸配列は、 配列番号 1から 1 8のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。 配列番号 1から 1 8 において、 配列番号 1から 9までが、 マウスの配列であり、 配列番号 1 0から 1 8までがヒトの配列である。 また、 配列番号 1から 1 8のアミ ノ酸配列は、 1個若し.くは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加さ れたアミノ酸配列であってもよい。 このようなアミノ酸配列からなるポ リペプチドも、 N o t e hタンパク質由来であり、 前記 N o t c hタン パク質の一連のタンパク質分解において、 細胞外タンパク質分解に続き 細胞膜内タンパク質分解により NI CDが核内に移行する際に、 細胞外に放 出されるポリペプチドである。 そして、 このポリペプチドも、 N o t e hシグナルに比例して細胞外に放出され、 プレセ二リン依存的に細胞外 への放出される。 なお、 本発明の新規ポリペプチドは、 生物から得られ たものであってもよく、 また人工的に合成したものであってもよい。 ま た、 前記生物の種類も限定されず、 例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ャギ、 ブタ、 ゥシ、 ショウジヨウバエ、 線虫等であってもよい。 また、 本発明の新規ポリペプチドの由来となる組織や細胞の種類も限定 されず、 即ち、 未分化、 分化を問わない体細胞および組織であり、 例え ば神経、 骨髄、 癌細胞および組織等であってもよい。 本発明のバイオマーカーは、 前記本発明の新規ポリペプチドを含むも のであり、 N o t c hシグナル伝達、 細胞分化、 腫瘍、 アポト一シスお よびアルツハイマー病等の検出に使用できる。 なお、 本発明のバイオマ 一力一は、 その他の成分を含有していても良く、 また前記新規ポリぺプ チドそのもの （単独） であってもよい。 このバイオマーカーは、 前記新 規ポリべプチドを認識可能な抗体を含む試薬で検出できる。 前記新規ポ リペプチドを認識可能な抗体は、 通常の方法で作成でき、 モノクローナ ル抗体若しくはポリクローナル抗体であってもよい。 前記試薬は、 前記 新規ポリペプチドを認識可能な抗体の他に、 この坊体を抗原とする標識 化抗体若しくは前記新規ポリぺプチドを認識可能な標識化坊体を含んで いてもよい。 前記標識化は、 例えば、 蛍光物質、 酵素 （その基質が酵素 反応で発色するもの等） 、 放射性物質、 ァガロースなどの担体等で行う ことができる。 本発明の遺伝子は、 前記本発明の新規ポリペプチドをコードする遺伝 子であり、 DNA若しくは RNAである。 また、 本発明のベクターは、 前記遺伝子を組み込んだものであり、 本発明の形質転換体は、 前記べク ターを用いた形質転換体である。 つぎに、 本発明の新規ポリペプチドが細胞外放出される一例を、 図 7 の左側に示す。 なお、 同図右側は、 アルツハイマー病におけるアミロイ ドベータ (A β) の細胞外放出の一例を示している。 同図左側に示すよ うに、 NEXT (Notch Extracellular Truncat ion)のアミノ末端は、 TACE (TNF j3 -Converting Enzyme)による細胞外切断により生成される。 S 2部位で 切断された NEXTは、 さらに、 S 3部位の切断により、 N I CDが核内に 移行し、 これと同時若しくは前後して、 S 4部位の切断 （本発明者等が 初めて見出した第 4の No t c hのタンパク質分解部位） により、 Ni3 (本発明の新規ポリペプチド） が、 細胞外に放出される。 つぎに、 本発明の新規ポリペプチド （Ni3) の C末端のアミノ酸配列 の例を、 図 4 (B) に示す。 同図には、 マウスの 4種類の N o t c h ( mNo t c h- 1〜4) 、 ヒトの 4種類の No t c h (hNo t c h- 1〜4 ) および hjSAPPにおける、 それぞれの N |8若しくは細胞外放出フラグメ ントの C末端周辺の配列を示している。 図示のように、 主要な S 4切断 部位は、 推定膜貫通ドメイン （TM) 領域において、 数アミノ酸残基ほ ど N末端側に位置する （図において、 左側の三角矢印で示す） 。 図示の ように、 主要な切断部位周辺のアミノ酸配列は、 mNo t c h-l〜4の間 で保存されていなかったが、 S 3切断部位であるバリン 1 743は保存 されていた （図において、 右側の三角矢印で示す） 。 このように、 S 4 切断部位は、 S 3と異なり多様性があるのが特徴である。 この多様性は 、 S 4セクレ夕一ゼの切断配列認識機構が特殊であることを反映してい ると推察される。 実施例
以下、 本発明の実施例について説明する。 なお、 実施例における試薬 、 材料および実験手法は、 以下のとおりである。
(試薬）
ァーセクレターゼ （ァ -Secretase) 阻害剤である、 [(2R, 4R,
5S) -2-Benzyl-5-(Boc-amino)-4- ydroxy-6-phenyl-hexanoyl]-Leu-Phe - NH2は、 Bachem社から購入した。 (プラスミド）
C末端に 6回連続する c—my c配列を付加した No t c hAE-M1727V (ΝΔΕ)および NICDをコードする c DNAを、 プラスミド pcDNA3 hygroに 挿入したものは、 Schroeter等の方法により調製した （Schroeter, E.H. , isslinger, J. A. , Kopan, R. (1998) . N o t c h -1 signalling requires 1 igand- induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393, 382-386. ) 。 なお、 前記 c DNAは、 R. Kopan 博士から提供されたものを使用した。 N末端に FLAG配列を付加した NEXT 、即ち FLAG- NEXT (F - NEXT)は、 2段階の部位特異的突然変異誘発 (2-step site- directed mutagenesis) により調製した。第一段階では、 F-NEXT M 1 7 2 7 V (F-NEXT M l 7 2 7 V)を、 部位特的突然変異誘発キット （ ExSite PCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit、 Stratagene¾; ¾ 用いて製造した。 その際、 ΝΔΕを铸型として使用し、 また、 下記の 2つ のプライマー 1、 2 (配列番号 1 9、 2 0) を調製した。 プライマー 1 ：
5-P-ATCGTCGTCCTTGTAGTCTCTCAAGCCTCTTGCGCCGAGCGCGGGCAGCAGCGTTAG-3' プライマー 2 ：
5-P-GACAAGATGGTGATGAAGAGTGAGCCGGTGGAGCCTCCGCTGCCCTCGCAGCTG-3' 第二段階では、 F- NEXTを、部位特異的突然変異誘発キット（Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene社） を使用して、 部位特 異的突然変異誘発により調製した。 その際、 F- NEXT M1727Vを铸型とし て使用し、 また、 下記の 2つのプライマー 3、 4 (配列番号 2 1， 2 2 ) を調製した。 プライマ一 3 ； 5-CCTCGCAGCTGCACCTCATGTACGTGGCAGCG-3'
プライマ一 4 ； 5-CGCTGCCACGTACATGAGGTGCAGCTGCGAGG-3' これらの変異体について、 塩基配列を決定 （シーケンス） し、 突然変 異誘発が成功したことを確認した。
(抗体）
ポリクローナル抗体 (L 6 52 ) は、 ヒト No t c h- 1の V 1 722 から G 1 743の間のアミノ酸配列 （ S 2部位から S 3部位の間の配列 ) のポリペプチドに対する抗体である。 この抗体 （L 6 52) は、 次の ようにして作製した。 まず、 抗原となる前記ポリペプチドを準備した。 このポリペプチドは、 疎水性アミノ酸を多く含んでいることが特徴であ る。 このため、 アルツハイマー病アミロイド )3タンパク質に対する抗体 作成時に利用したのと同じ方法で抗体を作成した。 即ち、 キャリアタン パク質と結合させずに直接水溶し、 同容積のリン酸バッファー （2倍濃 度） を加え、 アジュバントと共に乳化し、 この乳化物をゥサギに注射し た (Wi ld-Bode, C. , Yamazaki, Τ.， Capel 1, A.， Leimer, U. , Steiner, H. , Ihara, Y. , Haass, C. (1997) . Intracellular generation and accumulation of amyloid beta- peptide terminating at amino acid 42. J Biol Chem 272, 16085-16088) 。 抗 c— my cモノクローナル抗体 （ 9E10) および抗 F LAGモノクローナル抗体をァガロースに共有結合さ せた試薬 （M 2-ァガロース） は、 市販品を使用した。
(培養細胞および細胞株） ヒト胎児腎臓 2 9 3細胞 (K 2 9 3細胞） 、 N2 a細胞および COS細 胞を、 1 0 %ゥシ胎仔血清、 1 %ペニシリン/ストレプトマイシン、 2
0 0 β g/m 1ゼォシン （zeocin； P S 1発現を選択するため） および 1 0 0 g/m 1ハイクロマイシン (hygromycin； N Δ Eおよび F- NEXT 発現を選択するため） を添加した DMEM培地にて培養した。 K 2 9 3 細胞は P S 1 野生型、 P S 1 L 2 8 6 Vおよび P S 1 D 3 8 5 Nを 安定に発現する（Okochi et al， 2000, Kulic et al, 2000, Wolfe et al,
1999)。 ΝΔΕおよび F- NEXTの細胞への導入は、 商品名 Lipofectamine 2000 (Invitrogen社）を用いて行った。
(パルス-チェイス実験）
ΝΔΕを発現する細胞から、 ΝΔΕの N末端フラグメント （NTF： N )3 ) が放出されるかを判断するために、 ΝΔΕおよび NICDを安定的に導入した Κ 2 9 3細胞を、 1 0 cmディッシュ中で、 コンフルェントな状態まで 培養した。 そして、 その細胞を、 MEMビタミン溶液（Gibco社）と非標識ァ ミノ酸を添加したイーグルとの平衡塩溶液中に 300 iCiの [ ] アミノ酸 (トリチウム化アミノ酸混合液； tritiated amino acid mixture, Amersham社） を加えた培養液中で、 代謝的にパルスラベルを 2時間行い 、 その後、 1 0 %FCS/DMEMで 6時間チェイスした。 N/3が放出されるか どうか判断するため、 F-NEXTを発現する細胞を、 最初に、 メテオニン 非含有培地で 40分間メチォニン飢餓状態で培養し、 ついで、 メチォ二 ン非含有 DMEMにおいて、 400 Ciの [35S]アミノ酸混合液（RedivuePromix, Amersham社）で 1時間パルスラベルをし、 つづいて、 過剰量の非標識メ チォニンを添加した 1 0 %FCS/DMEMを含むチェイス培地で、 種々の時間 、 チェ- (免疫沈降/ SDS- PAGE)
チェイス期間の終了後、 培地を集めて直ちに氷上においた。 ついで、 3 0 00 X gで遠心分離を行い、 細胞残屑を排除した。 次に、 プロテア —ゼ阻害剤カクテル（l:1000;Sigma社）および 0. 02 5 %のアジ化ナト リウムを加えた。 その試料を、 L 6 52または M 2-ァガ口一ス（Sigma 社）を用いて、 ー晚免疫沈降を行い、 ついで、 0. 1 % SDS、 0. 5 %deoxycholic acidおよび 1 % Tr i tonX- 100を含む RIPAバッファーで三 回洗浄した。 そのあとに、 トリスートリシン 1 0〜20 %勾配ゲル (Invitrogen社）を使用して SDS-PAGEを行った。 細胞は、 氷冷 PBS中でか き集め、 1 5 0 0 X gの遠心分離によって分離収集し、 1 0倍濃度の前 記 RIPA 1 0 0 1で溶解した。 そして、 プロテア一ゼ阻害混合液（1 ： 50 0； Sigma社）を含む 9 00 1の PB Sを、 前記溶解した細胞に加え た。 不溶画分は、 1 5 0 0 0 X gの遠心分離で分離し、 その上清を免疫 沈降に使用した。 免疫沈降用の試料は、 プロテイン Aセファロ一ス (protein A sepharose; Sigma社）で前処理し、 9 E 1 0または M2-ァ ガロースで免疫沈降した。 次に、 洗浄したタンパク質試料を、 8 %若し くはトリス—トリシン SDS— PAGEにて分離した。 ゲルを固定した後、 増 幅蛍光写真撮影法試薬 （Amplify Fluorographic Reagent, Amersham社 ) 中で振とうし、 ついで乾燥し、 最後にオートラジオグラフィーを行つ た。
(免疫沈降/ MALDI- T0F/MS解析）
F- NEXTおよびその派生物を安定に発現する細胞をコンフルェントな状 態まで 20 cmディッシュで培養した後、 培養培地を新しい 1 0 % F C SZDMEMと取り替えた。 C02インキュベータ一中で 3時間培養し た後、 培養上清を集めてすぐに氷上におき、 そして、 遠心分離で細胞残 屑を除去した。 プロテアーゼ阻害混合液 （ 1 ： 1 0 0 0 ) および 0. 0 2 5 %アジ化ナトリウムを添加した後、 その培地を、 M 2-ァガロース を使用して、 4時間、 4°Cで免疫沈降した。 そして、 試料を、 0.1% n-octylglucoside, 1 40 mM N a C し 1 0 mM T r i s (p H 8 . 0) および 0. 0 2 5 % アジ化ナトリウムを含む MS洗浄バッファ —を使用して、 1 0分間、 4°Cで 3回洗浄した。 そして、 さらにもう一 回、 0. 0 2 5 % アジ化ナトリゥムを含む 1 0 mM T r i s (pH 8 . 0) で洗浄した。 その結果得られた沈殿に結合したペプチドを、 α -cyano-4hydroxy cinnamic acidで飽和した T F AZァセトニトリル Z 水 （TF A：ァセトニトリル：水 = 1 ： 2 0 ： 2 0) で溶出した。 可溶 化した試料を、 ステンレスプレート上で乾燥させ、 MALDI-TOF/MS解析に かけた。 MSピークは、 アンギオテンシン (Sigma社） およびインシュ リン /3鎖 （Sigma社） で較正した。 (実施例 1 )
培養上清中における、 FLAG-NEXT (F-NEXT)の N末端フラグメント （ NTF;F- j3 ) の検出
図 1 (A) に、 ΝΔΕ、 NICDおよび F-NEXTの構成を示す。 図示のように 、 F-NEXTでは、 NEXTの Ν末端にシグナルペプチドとそれに続く FLAG配列 および 2つのメチォニンが揷入されている。 F-NEXTでは 1 7 2 7番目の アミノ酸残基に変異を加えていないが、 ΝΔΕ (マウス N o t c h- 1 (m N o t e -1) ) 中では、 図中の逆三角で示すように、 メチォニン 1 7 2 7をバリンへ人為的に変異させてある（Schroeter, E.H.， Kiss linger, J. A. , Kopan, R. (1998) . No t c h-1 signalling requires
1 igand- induced proteolytic release of intracel lular domain. Nature. 393, 382-386. )o 三角矢印は、 S 3タンパク質分解部位を示す。 ΝΔΕおよび F- NEXTを安定に発現する細胞を、 1時間 [35S] でパルスラ ベルし、 図 1 (B) に示す時間チェイスした。 その結果得た細胞の溶解 物を 9E10で免疫沈降し、 8 %SDS-PAGEで解析した。 図 1 (B) の上パネ ルに示すように、 2時間チェイスした後、 ΝΔΕ (パネル中央）および F- NEXT ひ°ネル右） においてタンパク質分解が観察され、 ΝΔΕおよび F-NEXTの バンドよりも速く移動する NICDパンドの生成が認められた。 NICD生成効 率は、 ΝΔ Eまたは F— NEXTを発現させた場合で違いがなかった。 つぎに、前記培養上清を、 M 2-ァガロースで免疫沈降し、 8 %SDS-PAGE で解析した。 図 1 (B) の下パネルに示すように、 約 4kDaの F- N/3 (本 発明の新規ポリペプチド群の集合体） のバンドが、 F-NEXTを安定に発現 する細胞を 2時間チェイスした培地からのみ同定された。 このことは、 NICD生成時にその反対側のァミノ末端フラグメントが細胞外に分泌され ているという全く新しい知見を示す。
F - NEXTを発現する細胞を、 [35S] で 1時間パルスラベルし、 図 1 (c ) に示した時間チェイスした。 培地および溶解物中の F- N/3を、 上記の 実験手法により調べた。 図 1 (C) に示すように、 F- N)S (本発明の新 規ポリペプチド群の集合体） の蓄積が、 培地中ではチェイス時間の延長 に応じて観察されたが、 細胞溶解物中では殆ど検出できなかった。 なお 、 電気泳動ゲルの写真撮影の露光時間を長くすると、 培地中と同じ分子 量の F-N )3バンドが溶解物中でも検出できた （図示せず） 。 図 1 (B)および （C) に示した結果は、 F- NEXT M 1 7 2 7 V変異体 を使用した場合、 または発現細胞として CH0、 COS, N2aを用いた場合に 再現できた （図示省略） 。
(実施例 2 )
培養培地中における、 ΝΔΕの N末端フラグメント （NTF : Nj3) の検 m
ΝΔΕまたは NICDを安定に発現する K 2 9 3細胞を、 [ ] で 2時間パ ルスラベルし、 6時間チェイスした。 チェイス培地および細胞溶解物を 抗 ΝΔΕ抗体である L 6 5 2で免疫沈降し、 その試料をトリス—トリシン SDS- PAGEで分離した。 図 2 (A) に示すように、 分子量 3〜4kDaの ΝΔ Eの NTFバンド （三角矢印） は、 ΝΔΕを発現する細胞の培養上清からは検 出されたが、 NICDを発現する細胞の培養上清および細胞溶解物中には認 められなかった。 このことから、 このバンドは FLAGタグされていない野 生型の N/3であると考えられた。 上記と同じ培地および溶解物を、 抗 c一 my c抗体（9E10)を使用して 、 免疫沈降した。 図 2 (B) の下パネルに示すように、 約 l O O kD a の ΝΔΕおよび NICDのバンドが、 溶解物中では検出されたが （三角矢印） 、 培地中では検出されなかった。 この結果は、 ΝΔΕおよび NICDがほぼ同 じ速度で各細胞に発現していることを示している。
(実施例 3 )
培養上清に放出された Nj3の C末端の決定
図 3 (B) に、 マウス N 0 t c h-1 (mN o t c h-1) およびヒト；3 APP (hjSAPP) の膜内切断の概略を示す。 mN o t c h- 1は、 膜内切断により 、 NICDと N/3を生じる。 この実施例では、 Ν3の分泌およびその C末端に 新規のタンパク質切断部位を確認した。 一方、 h|3AP ま、 膜内切断によ り、 細胞内フラグメント CTFァ 50 (Sastre, M.， Steiner, H. , Fuchs, K. , Capell, A.， Multhaup, G. , Condron, M.M. , Teplow, D. B. , Haass, C. (2001) . Preseni 1 in- dependent gamma-secretase processing of beta-amyloid precursor protein at a site corresponding to the S3 cleavage of N o t e h . EMBO Rep. 2, 835-841.) と、 数種類の A )3フ ラグメントを生じる。
F - NEXTを安定に発現する細胞の培養上清を、 M 2-ァガロースで免疫沈 降し、 上記の実験手法により、 N)3の分子量を MALDI- T0F/MSを使用して 解析した。 その結果を、 図 3 (A) グラフ （大） に示す。 図示のように 、 分子量 40 0 0を中心に、 多数のピークが観察されたが、 4 5 0 0よ り多い分子量の顕著なピークは確認されなかった。 分子量 3 0 0 0から 45 0 0のピークの詳細を図 3 (A) のグラフ （小） に示す。 同じ主要 なピークは、 CH0、 COSおよび N2aを宿主細胞として使用した場合でも確 認された（図示せず）。 また、 これらのピークは、 F- NEXT M 1 7 2 7 V 変異体を感染させた場合でも確認された（図示せず）。 図 4 (A)に図 3 (A) グラフ （小） に示した MALDI-TOF/MSのピークに 一致する N)Sのアミノ酸配列を示す。 主要な NjSの C末端は、 ァラニン 1 7 3 1である。 太文字は、 主要ピークのアミノ酸配列を示す。 図示のよ うに、 S 3切断部位に一致する 5 0 6 0付近の分子量のピークは、 確認 されなかった。 この結果から、 N)Sは細胞外に放出され、 その放出の直 前に起こるタンパク質の分解部位はこれまで報告された 3つのタンパク 質分解部位 （S l、 S 2、 S 3) とは異なる、 新規の第 4のタンパク質 分解部位 （S 4) であると結論できる。 図 4 (B) はヒト （h) とマウス （m) の N o t c h- 1〜4タンパク 質膜貫通部分のアミノ酸配列を列挙したものである。 S l、 S 2、 S 3 切断が No t c h- 1〜4に共通した現象であり、 また、 種によらない共 通したシグナル伝達機構であることから、 S 4切断もすベての N o t c h関連タンパク質に共通する現象であると推測できる。 図示のように S 4部位は S 3部位と同じように部分的に保存されていることから、 この S 4切断が、 No t e h-l〜 4タンパク質に共通する現象であると推察 できる。 (実施例 4)
N/3細胞外放出のプレセ二リン （PS) 機能依存性の確認
P S 1野生型およびプレセニリン機能を人工的に消失させた突然変異 体 （P S 1 dominant negative mutant) である P S 1 D 38 5 Nを発 現する細胞に、 F- NEXTを安定的に感染させた。 そして、 これらの P S 1 派生物と F-NEXTとを同時に発現する細胞から放出される Nj6のレベルを 、 [35S] で 1時間パルスし、 ついで、 2時間チェイスした培養上清およ び細胞溶解物を解析することにより調べた。 まず、 チェイス培地を M 2 -ァガロースで免疫沈降し、 NiS放出を検出した。 図 5 (a) の上パネル に示すように、 P S 1 D 3 8 5 N発現細胞からの N jSの放出が、 P S 1 野生型発現細胞と比較して著しく減少した。 即ち、 プレセ二リン機能を 人工的に消失させた突然変異体発現細胞では S 4切断効率が著しく減少 することが確認できた。 また、 同時に採取した細胞溶解物を、 9E10を使 用して免疫沈降した。 図 5 (A) の下パネルに示すように、 2時間のチ ェイス期間後の NICDバンドが、 P S 1 D 3 8 5 N発現細胞ではほとん ど見ることができなかった。 即ち、 プレセ二リン機能を人工的に消失さ せた突然変異体発現細胞では、 S 3切断効率が著しく減少するという報 告を同時に再現することができた。 つぎに、 F-NEXTを安定に発現する細胞を、 プレセ二リンの活性中心に 結合するァーセクレターゼ阻害剤 （L 6 8 5 , 4 5 8 ) を加えた場合と 、 加えない場合とで、 1時間ラベルし、 2時間チェイスした。 すなわち 、 I Mの L 6 8 5， 4 5 8を、 メチォニン飢餓状態にする 2時間前に 培養培地に加えると同時に、 パルス一チェイス期間中、 使用する各培地 に同濃度の L 6 8 5 , 45 8を含ませた。 チェイス培地を M 2 -ァガロ ースで免疫沈降し、 Νι3放出を検出した。 図 5 (B) の上パネルに示す ように、 ァ—セクレターゼ阻害剤により、 の細胞から放出が著しく 減少した。 また、 それに相当する溶解物を 9E10で免疫沈降した。 図 5 ( b) 下パネルに示すように、 2時間のチェイス期間後の NICDバンドが、 S 3切断阻害によって、 ほとんど確認できなかった。 これらの結果から 、 jSの細胞外への放出はプレセニリン依存性タンパク質分解の働きに よるものであり、 プレセ二リンの機能が阻害されると、 S 4切断および それに引き続く NiSの放出も阻害されるといえる。
(実施例 5 )
家族性アルツハイマー病 （FAD) 関連プレセ二リン （P S) 突然変 異体の S 4切断への影響
これまで FADに関連する P Sの突然変異が分析された結果、 すべて の例で Ai34 2分泌の増加が確認されている。 この実施例では、 P S依 存的 S 4タンパク質分解も、 FAD関連 P S突然変異に関係しているこ とを確認した。 野性型 （wt) P S 1若しくは FAD関連 P S 1突然変異である P S 1 C 92 S、 P S 1 L 1 6 6 Pおよび P S 1 L 2 8 6 Vを発現する K 2 93細胞に、 F—NEXTを安定的に感染させた。そして、 MALDI- TOF/MS により、 F— N/3の C末端の変化を確認するために、 P S 1派生物およ び F— NEXTを発現する細胞の培養上清を分析した。 図 6 (A) に示 すように、 N iSの C末端タンパク質分解パターンの特徴的変化が、 野性 型 P S 1に比較して FAD突然変異 P S 1発現細胞で確認できた。 特に 、 A ]342生成が極めて増加している P S 1 L 1 6 6 P突然変異では 、 F—N /3ペプチドを長くする傾向が見られ、 F— N/3 1 7 3 1より 2 および 4アミノ酸残基長い F— N )3種 （F— Ν/3 1 7 3 3、 1 7 3 5 ) の生成の増加が確認できた （図 6 (Β) 参照） 。 また、 図 6 (Α) に示 すように、 P S 1 C 92 Sでは、 F— Ν /3 1 7 34のレベルが増加し 、 P S 1 L 286 Vでは、 F—N 16 1 7 3 5のレベルが増加し、 かつ F_Nj8 1 7 34のレベルが減少した。 これらの結果から、 FAD突然 変異により、 S 4切断部位のパターンは影響を受け、 C末端側にぺプチ ド長が伸びる傾向があることが確認された。 Α]342と同様に、 ァグレ ッシブな P S 1 L 1 66 P突然変異が、 F— N i3のペプチド長に最も 影響を与える。 なお、 P S 1 L 1 66 Pは、 成人初期の FADを引き 起こすことが知られている。 これらの効果は、 K29 3細胞に限られず 、 Neuro2a細胞においても、 F A D関連 P S突然変異の同様の効果が確 認できた （データ図示せず） 。 以上のことから、 全ての FAD突然変異 は、 F— Ni3の C末端に対し、 影響を及ぼすといえる （図 6 (C) 参照
(実施例 6 )
S 3部位でのタンパク質分解の S 4部位でのタンパク質分解効率への 膜内での二箇所の切断のうち、 N o t c h— ペプチドを産生する S 4部位でのタンパク質分解と、 シグナル伝達量を規定する NICDを産生す る S 3切断との関係について検討を行うために、 この実施例では、 S 3 部位でのタンパク質分解を阻害する突然変異体を作成し、 人工的に S 3 部位での切断効率を減少させた場合でも、 S 4での切断効率は変化しな いことを確認した。
No t c h_lの S 3切断部位の C末端側にある V 1 744を変異させ ると、 S 3での切断が部分的に阻害されることが報告されている
(Schroeter et al. , Nature, 1998)。 このことから、 まず、 S 3部位で の切断を阻害した場合における、 S 4切断活性の変化について検討を行 つた。膜内タンパク質分解による生成物を効率よく認識するために、 NEXT 類縁体の N末端側に FLAGタグを、そして C末端側に mycタグをつけ、 つい で、 前記類縁体を発現するプラスミド（F-NEXT; Okochi, 2002)のバリン 1 744をグリシンまたはロイシンに変異させた（以下、 F-NEXT V 1 7 44 Gおよび F- ΝΕΠ V 1 744 Lという）（図 8 (B) )。 S 3切断部位 の突然変異を持つあるいは持たない F- NEXT発現コンストラクトを、 野生 型 P S 1またはァ-セクレ夕一ゼ機能を欠いた P S 1 D 38 5 Nを恒常 的に過剰発現させた K 2 9 3細胞に安定的に感染させた。 そしてそれら の細胞を35 Sメチォニンでのメタポリック ' ラベル実験を行い、 その細胞 沈査中およびそれに対応する細胞培養上清中の放射線標識された新規の および NICDを、免疫沈降法および電気泳動による分離後の放射線量 測定を組み合わせて検出した （IP-autoradiography) 。 前記細胞沈査に 3 0分間パルス刺激を与え、 抗 c一 my c抗体 （9E10 ) で IP- autoradiographyを行ったところ、 F-NEXTの発現が認められた。 さらにその細胞を 2時間チェイスしたところ、 F-NEXTの分解による NICD 生成が認められたが、 V 1 744 Gおよび V 1 744 L変異体では有意 に阻害されていた （図 8 (C) の上パネル） 。 この結果は、 今までの報 告と同一であった。 プロテアゾーム阻害薬であるラクタシスチンを加え ることで NICDの分解を阻害した場合においても、 V 1 744 G変異体発 現細胞および V 1 744 L変異体発現細胞における 2時間チェイス後の 放射線標識された NICD量は、 有意に少なかった。 この F-NEXTによる膜内 タンパク質分解および NICD生成は、 P S 1 D 38 5 N発現細胞では完全 に消失した （図 8 (C) の下パネル） 。 これらのことより、 図 8 (C) の上パネルで認められたタンパク質分解が、 PS/ァ-セクレ夕一ゼにより 生じたといえる。 つぎに、 2時間チェイス後の細胞培養上清を、 抗 FLAG抗体 （M2) を 用いて解析した。 F-NEXT V 1 744 G変異体発現細胞および F- NEXT V 1 744 L変異体発現細胞から分泌された F-N/3は、野生型 F- NEXT発現細 胞からのそれとほぼ同じレベルであった（図 8 (D) )。 また、 P S 1 D 3 8 5 N変異体発現細胞からは F-N )3の生成は認められなかった。以上の ことから、 PS/ァ-セクレタ一ゼが、 この切断に影響を及ぼすといえる。 これらの結果をさらに強固にするために、 S 3および S 4切断の効率 を算出した。 細胞沈査中の F- NEXT類縁体に対する NICDの割合、 および細 胞沈查中の F-NEXT類縁体に対する細胞培養上清中の F-N/3の量比を測定 した。 その結果、 野生型に比較して V 1 744 G変異体および V 1 74 4 L変異体は、 共に S 3切断活性を低下させるが、 S 4切断活性には影 響を及ぼさないことが確認された （図 8 (E) ) 。 (実施例 7 )
S 3切断効率の低下と S 4切断の正確さとの関係
アルツハイマー病の原因となる P S 1の突然変異体では、 S 4切断の 正確さの変化と共に S 3切断の活性の減少が起こる。 S 3切断が S 4切 断の前提条件であるならば、 P S 1の突然変異体による S 3切断効率の 減少が S 4切断の正確さに影響を及ぼすと考えた。 そこで、 この実施例 では、 S 3切断部位の突然変異体を作成し、 人工的に S 3での切断効率 を減少させた場合においても、 S 4での切断の正確さが変化しないこと を確認した。
PSの家族性アルツハイマー病 （FAD) 型変異体が、 PS/ァ-セクレ夕一 ゼによるタンパク質分解の正確さに影響を及ぼし、 さらに延長型 A iSで ある A 3 42の産生を増大させることが、 FAD発症の原因となっていると考 えられている。 同様に、 PSの FAD変異体は、 PS/了-セクレターゼによる N o t c hの切断の正確さに影響を及ぼし、 延長型 F-N )3の産生を増大 させる。 さらに、 いくつかの PS変異体が、 S 3切断効率を減少させるこ とが報告されている。 そこで、 S 3切断効率を減少させる S 3変異体の S 4切断の正確さへの影響について検討を行った。 野生型 F- NEXT発現細 胞、 F- NEXT V 1 7 4 4 G変異体発現細胞または F- NEXT V I 7 4 4 L変 異体発現細胞の細胞培養上清中の F-N i3を、 M 2—ァガロースを用いて 免疫沈降し、 MALDI-TOF/MSで解析した。 この結果、 図 9 ( B ) および （ C ) に示したとおり、 F-NEXT V 1 7 4 4 G変異体および V 1 7 4 4 L 変異体では、 野生型と同じく、 ァラニン 1 7 3 1とァラニン 1 7 3 2と の間が主な切断部位であって、 幾つかに分散する副次的な S 4切断のパ 夕一ンにはなんら影響を及ぼさなかった。 すなわち、 S 3切断を減少さ せる変異は、 S 4切断部位の正確さに何ら影響を及ぼさないことが確認 された。 このことより、 FAD型の P S変異が、 間接的に S 4切断の正 確さに影響を与えていると考えられた。
(実施例 8 )
S 4切断効率の減少の S 3切断効率への影響
S 4切断部位変異体が、 前述の S 3の人工的点突然変異体と同様の効 果を発揮するのではないかと考え、 S 4切断部位周辺の 4つのァラニン 残基をグリシン残基またはロイシン残基に変異させた F- NEXT G 1 7 3 0 - 1 7 3 3変異体および L 1 7 3 0 - 1 7 33変異体 （図 1 0 (A) ) を作成し、 S 4切断効率の減少の S 3切断効率への影響について検討 を行った。 その結果、 S 4切断部位変異体のうち S 4切断活性を阻害し た L 1 7 30— 1 7 3 3変異体では、 S 3切断効率が減少した。 この結 果は、 N o t c h _ 1の膜内タンパク質分解において、 S 4切断に依存 的な S 3タンパク質分解により NICDが産生されるタンパク質分解経路が 存在することを示している。 つぎに、 S 4切断についても S 4切断部位変異体が同様の効果を発揮 するのではないかと考えた。 図 1 0 (A) 中の三角矢印で示すように、 No t c hの S 4切断部位は 4つの連続するァラニン残基のちようど中 間に位置する。 この 4つのァラニン残基をグリシン残基またはロイシン 残基に変異させた F-ΝΕΠ G 1 730 - 1 733および L 1 730 - 1 7 3 3を作成した。 S 3変異体の場合と同様に、 パルス一チェイス実験を 行った。 2時間チェイス後の細胞培養上清中の放射線標識された F-N/3に ついて検討を行った。 野生型および S 4変異型 F- NEXTを発現させた細胞 から、 F- Ni3の分泌が観察された （図 1 0 (B) ) 。 しかしながら、 新規 の F- Νι3産生量は、 野生型に比較して F- NEXT G 1 7 30— 1 7 3 3変異 体では殆ど変化がなかったが、 F- NEXT L 1 7 3 0 - 1 7 3 3変異体では 減少しているように見えた （図 1 0 (B) ) 。 つぎに、 対応する細胞沈査中に含まれる F- NEXTからの放射線標識され た NICD生成について検討を行った。 その結果、 G 1 7 3 0— 1 7 33変 異体発現細胞では、 野生型 F-NEXT発現細胞と同程度の NICD生成が認めら れたのに対し、 L 1 7 30— 1 7 3 3変異体発現細胞での NI CD生成は、 野生型に比較して減少した （図 1 0 (C) の上パネル） 。 このことから 、 L 1 7 30— 1 7 3 3変異体では、 S 3切断が阻害されていることが 考えられた。 この結果を立証するために図 8 (E) と同様の方法で S 4ZS 3効率 を計算した。 その結果、 S 4変異体のうち、 S 4活性にほとんど影響を 与えなかった G 1 7 3 0 - 1 7 3 3変異体は、 S 3切断活性に何の影響 も与えなかった （図 1 0 (D) ) 。 ところが、 S 4活性を阻害した L 1 7 30 - 1 7 3 3変異体は、 S 3切断効率を減少させることが確認され た （図 1 0 (D) ) 。 また、 PS/τ一セクレタ一ゼ機構は、 S 3 ZS 4の どちらの部位でも切断し、 膜貫通部分の細胞膜近傍での切断である S 3 切断とそのほぼ中央部分での切断である S 4切断との間の中間分解物が 見つかつていないことから、 S 3部位と S 4部位とが、 ほぼ同時に切断 されることが考えられた。 これらのことから、 No t c h— 1の膜内タ ンパク質分解において、 S 4切断に依存的な S 3タンパク質分解により NICDが産生されるタンパク質分解経路が存在すると考えられる。 (実施例 9 )
S 4切断部位と活性との関係 続いて、 F-N 3 G 1 7 3 0— 1 73 3および F - N 3 L 1 7 3 0 - 1 7 3 3の C末端を決定した。 F-NEXT G 1 7 3 0— 1 7 3 3から放出される F-Nj3量は、 野生型 F - NEXT発現細胞からのそれとほぼ同等であった（図 1 0 (B) ) が、 図 1 1 (A) の逆三角で示すように、 G 1 7 30— 1 7 33変異体の S 4切断部位は、 グリシン 1 7 3 1とグリシン 1 732の 間ではなかった。 この変異体の主な S 4切断部位は、 4つ連続するグリ シン残基の C末端側に移動し、 フエ二ルァラニン 1 7 34とバリン 1 7 3 5の間、 ノ リン 1 7 3 5とロイシン 1 7 36の間、 フエ二ルァラニン 1 738とバリン 1 7 3 9の間に位置していた。 すなわち、 S 4切断は 、 グリシン残基の前後で起こらず、 副次的な切断部位が、 4つのグリシ ンの N末端側に分布し、 F- NEXT G 1730 - 1 733から放出される F- N βの分子量は増加した （図 1 0 (Β) ) 。 また、 F- NEXT L 1 7 30 - 1 7 33変異体の主要な S 4切断部位は、 図 1 1 (B) の逆三角で示すよ うに、 野生型 F- NEXTと同様のトポロジーの 4つの連続するロイシン残基 の中間、 すなわちロイシン 1 7 3 1とロイシン 1 7 3 2の間であり、 副 次的な切断部位は、 殆ど認められなかった。 また、 F- NEXT L 1 730— 1 733変異体から放出される F-N/3の分子量は減少した （図 1 0 (B)
産業上の利用可能性
以上のように、 本発明の新規ポリペプチドは、 N o t c hタンパク質 由来であり、 前記 N o t c hタンパク質の一連のタンパク質分解におい て、細胞外におけるタンパク質分解に続く膜内タンパク質分解により NICD が核内に移行する際に、 細胞外に放出されるポリペプチドである。 この 新規ポリペプチドをマーカ一とすることにより、 N o t c hシグナル伝 達を検出することができ、 例えば、 細胞分化、 細胞の腫瘍化、 アポトー シス、 アルツハイマー病等を検出することもできる。

Claims

請求の範囲
1. No t c hタンパク質由来の新規ポリペプチドであり、 前記 No t c hタンパク質の一連のタンパク質分解において、 細胞外タンパク質 分解に続き膜内タンパク質分解により NICD(N o t c h intracellular cytoplasmic domain)が核内に移行する際に、 細胞外に放出されるポリべ プチド。
2. No t c hシグナル伝達に比例して細胞外に放出される請求の範 囲 1記載のポリペプチド。
3. 細胞外への放出が、 プレセ二リン依存的タンパク質分解により生 ずる請求の範囲 1または 2記載のポリべプチド。
4. N o t c hタンパク質において、 S 3でのタンパク質分解と同時 若しくはこれと前後しておこる、 S 3より N末端側の細胞膜貫通部分で のタンパク質分解 （S 4切断） により、 生じて放出される請求の範囲 1 から 3のいずれかに記載のポリべプチド。
5. No t c hタンパク質において、 S 3より N末端側の部分での夕 ンパク質分解部位 （S 4) が、 細胞膜貫通部分のアミノ酸残基部分であ る請求の範囲 4記載のポリべプチド。
6. 配列番号 1から配列番号 1 8の少なくとも一つの配列番号のアミ ノ酸配列からなるポリペプチド。
7. 配列番号 1から配列番号 1 8の少なくとも一つの配列番号のアミ ノ酸配列において、 1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは 付加されたアミノ酸配列からなり、 N o t e hタンパク質由来であり、 前記 No t c hタンパク質の一連のタンパク質分解において、 細胞外夕 ンパク質分解に続き膜内タンパク質分解により NICDが核内に移行する際 に、 細胞外に放出されるポリペプチド。
8. No t c hシグナルに比例して細胞外に放出される請求の範囲 7 記載のポリペプチド。
9. 細胞外への放出が、 プレセ二リン （Presenilin) 依存的タンパク 質分解により生じる請求の範囲 7または 8記載のポリべプチド。
1 0. 請求の範囲 1カゝら 9のいずれかに記載のポリべプチドを含むバ ィォマーカ一。
1 1. No t c hシグナル伝達、 細胞分化、 腫瘍、 アポトーシスおよ びアルツハイマー病からなる群から選択される少なくとも一つを検出す るための請求の範囲 1 0記載のバイオマ一カー。
1 2. 請求の範囲 1から 9のいずれかに記載のポリべプチドを認識可 能な抗体。
1 3. モノクロ一ナル抗体若しくはポリクロ一ナル抗体である請求の 範囲 1 2記載の抗体。
14. No t c hシグナル伝達、 細胞分化、 腫瘍、 アポトーシスおよ びアルツハイマー病からなる群から選択される少なくとも一つを検出す る試薬であって、 請求の範囲 1 2または 1 3記載の抗体を含む試薬。
1 5. 請求の範囲 1から 9に記載のポリペプチドをコードする遺伝子
1 6. DN A若しくは RN Aである請求の範囲 1 5記載の遺伝子 c 1 7. 請求の範囲 1 5または 1 6記載の遺伝子を組み込んだベクタ一
1 8. 請求の範囲 1 7記載のベクターにより形質転換された形質転換 体。
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