CN112703200A - 针对糖化终产物的抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

根据本发明，提供对于AGEs、尤其是对于甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs具有高选择性和亲和性的单克隆抗体和利用该单克隆抗体的分析方法。进一步，本发明的目的还在于，提供使用前述单克隆抗体的疾病的诊断方法、治疗方法和预防方法。

Description

针对糖化终产物的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及与糖化终产物(AGEs)、尤其是与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。

背景技术

糖化终产物(AGEs)是在生物体内氨基酸、主要是赖氨酸的氨基被还原糖非酶性修饰后，经过氧化、脱水、缩合等复杂的反应而生成的物质的统称。老龄化、高血糖状态下生成的AGEs被认为是与糖尿病并发症、动脉硬化等生活方式相关疾病相关联的。尤其是来源于糖代谢中间体甘油醛的AGEs(甘油-AGEs，Glycer-AGEs)在诊断、预防中作为有用的生物标志物而受到关注(非专利文献1～3)。

已经鉴定了一些AGEs所含的结构，作为其中之一的羧甲基赖氨酸(N^ε-(羧甲基)赖氨酸，CML)被鉴定为通过葡萄糖与赖氨酸的反应生成的阿马多利化合物的糖部分在过渡金属存在下氧化解裂而与赤糖酸一起生成的物质。根据AGEs的研究历史，AGEs的定量被结构已明确的CML的定量代替。In vitro(体外)CML的主要合成通路被认为是席夫碱或阿马多利化合物的氧化裂解导致的。此外，已知CML也会通过以乙二醛(GO)和乙醇醛为前体的分子内坎尼扎罗反应、葡萄糖的自氧化而生成。蛋白质中的CML在酸水解中是稳定的，可以通过高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱/质谱分析(GC/MS)法进行定量(非专利文献1)。关于AGEs所含的结构也有一些报告(专利文献1～3)。

作为利用酶免疫分析(EIA)法的AGEs定量，开始于以使用牛血清白蛋白(BSA)制作的AGEs(含有AGEs的牛血清白蛋白，AGEs-BSA)为抗原、使用抗AGEs-BSA抗体的竞争酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法，后来判明这些抗体是以CML结构为表位的抗CML抗体(非专利文献1)。另一方面，报告了以在兔血清白蛋白(RSA)中添加甘油醛、乙醇醛、甲基乙二醛或乙二醛而分别制作的AGEs为抗原制备抗血清，对得到的抗血清进行纯化而得到CML非结合性的组分(非专利文献4)。进行了使用作为该组分而得到的多克隆抗体的ELISA实验，用作CML以外的AGEs定量方法(非专利文献5和6)。

例如进行了不孕不育治疗的成功与否与甘油醛来源AGEs(甘油-AGEs)的相关性的研究，报告称，如果血中的甘油-AGEs量高，则持续妊娠率不良(非专利文献1～3、5和6)。此外，还报告了AGEs诱导内皮-间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition)、以及内皮-间质转化与心血管疾病、纤维性疾病的发生相关(非专利文献13和14)。这样的研究中，利用了使用上述多克隆抗体中的抗甘油醛来源AGEs抗体的ELISA实验(非专利文献5和6)。关于对AGEs有结合活性的抗体也有一些报告(专利文献4～6)。

关于各种AGEs的具体化学结构已有大量报告(例如非专利文献8～12和15)。此外，还报告了以甘油醛来源的AGEs为抗原来制作单克隆抗体(非专利文献7)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2001-316389号公报，

专利文献2：日本特开2003-300961号公报，

专利文献3：日本特开2004-250404号公报，

专利文献4：日本特开2006-312621号公报，

专利文献5：日本特开2017-043595号公报，

专利文献6：日本特开2019-041668号公报，

非专利文献

非专利文献1：金泽医科大学杂志，37(4)：141-161、2012，

非专利文献2：金泽医科大学杂志，40(2/3)：95-103、2015；

非专利文献3：Diagnostics 6(2),23,2016；doi:10.3390，

非专利文献4：Molecular Medicine,6(2):114-125,2000，

非专利文献5：HumanReproduction,26(3),604-610,2011，

非专利文献6：日本未病系统学会杂志，21(1)：93-96、2015，

非专利文献7：Immunology Letters 167(2),141-146,2015，

非专利文献8：Biosci.Biotechnol.Biochem.67(4),930-932,2003，

非专利文献9：J.Agric.Food Chem.47(2),379-390,1999，

非专利文献10:J.Agric.Food Chem.25(6),1282-1287,1977，

非专利文献11：Agric.Biol.Chem.49(11),3131-3137，

非专利文献12：Biochem.J.369(3),705-719,2003，

非专利文献13：Biomed.Res.Int.684242,2015，

非专利文献14：Int.J.Mol.Sci.18(10),2017；

非专利文献15：Free Radic.Biol.Med.29(6),557-567,2000。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，提供对于AGEs、尤其是对于甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs具有高选择性和亲和性的单克隆抗体和利用其的分析方法。本发明进一步的目的在于，提供以使生物体中发生障碍或作为疾病的原因的AGEs所含的化学结构为表位的单克隆抗体和利用其的分析方法。进一步，发明的目的还在于，提供使用前述单克隆抗体的疾病的诊断方法、治疗方法和预防方法、尤其是不孕不育或眼病的诊断方法、治疗方法和预防方法。

用于解决课题的方法

本发明人等进行了研究，结果发现，特定单克隆抗体具有良好的选择性和对抗原的高结合性，能够用于分析方法、诊断方法、治疗方法和预防方法，从而完成了本发明。

根据本发明，提供以下的发明。

[A1]一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位结合，且为：

1)重链可变区的互补决定区(VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)和轻链可变区的互补决定区(VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的氨基酸序列包含如下的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)的单克隆抗体或其抗原结合片段，

(a)VH CDR1：序列编号：1所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(b)VH CDR2：序列编号：2所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(c)VH CDR3：序列编号：3所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(d)VL CDR1：序列编号：5所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(e)VL CDR2：序列编号：6所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(f)VL CDR3：序列编号：7所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列

或者

2)关于与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合，为与前述抗体或其抗原结合片段交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。

[A2]一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其与式(I)或(II)：

[化1]

[式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化2]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基]的化合物、其阳离子自由基、或其二价阳离子结合。

[A3]根据[A1]所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其为：

1)重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为

序列编号：4的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列、和序列编号：8的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，或

2)关于与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合，为与前述抗体或其抗原结合片段交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。

[A4]根据[A1]～[A3]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，前述表位为甘油醛来源AGEs的表位。

[A5]根据[A1]～[A4]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体或sc(Fv)₂。

[A6]根据[A1]～[A5]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，为小鼠抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或其抗原结合片段。

[A7]根据[A1]～[A6]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以1×10^-5M以下的解离常数(K_d值)与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位结合。

[A8]一种医药组合物，含有[A1]～[A7]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

[A9]根据[A8]所述的医药组合物，用于选自肥胖、糖尿病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性神经病变、糖尿病性心肌病、糖尿病血管并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性肾脏病变、糖尿病足病変、糖尿病酮症酸中毒、牙周病、年龄相关性黄斑变性、肺纤维化、特发性肺纤维化、细支气管周围纤维化、间质性肺疾病、肺癌、癌症纤维性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、急性下肢动脉栓塞、周围动脉疾病、小气道疾病、肺气肿、肾盂肾炎、肾小球硬化症、肾小球肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、糖尿病性肾病变、肾源性系统性纤维化、慢性肾病、特发性腹膜后纤维化、肾病、硬皮病、肾间质纤维化、女性不孕、多囊卵巢综合征、卵巢功能障碍、早期卵巢功能障碍、卵巢癌、乳腺癌、子宫体癌、前列腺癌、男性不育、肝病、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎、肝癌、动脉粥样硬化血栓性脑梗塞、动脉粥样硬化性动脉硬化、颈内动脉狭窄、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、心血管疾病、心绞痛、充血性心力衰竭、急性心力衰竭、慢性心力衰竭、缺血性心脏病、扩张型心肌病、心脏结节病、高血压、肺动脉高血压、肺心病、心肌炎、血管狭窄心脏纤维化、心肌梗死后心脏纤维化、心肌梗死后左心室肥大、类风湿性关节炎、生活方式相关疾病、血脂异常、阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、脑梗塞、脑肿瘤、脑血管障碍、葡萄膜炎、内分泌疾病、骨质疏松症、舌癌、口腔癌、咽癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、胰腺癌的疾病的诊断、治疗或预防。

[A10]根据[A8]所述的医药组合物，用于选自糖尿病、糖耐量异常、视网膜病、肾病、伴随糖尿病的并发症、周围神经病变、下肢坏疽、动脉硬化、血栓、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、癌症、不孕不育、多囊卵巢综合征、卵巢功能障碍、中枢神经障碍、和包括阿尔茨海默氏病的神经变性疾病的疾病的诊断、治疗或预防。

[A11]根据[A8]所述的医药组合物，疾病为选自黑色素瘤、肺癌和肝癌的癌症。

[A12]一种核酸，编码[A1]～[A7]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

[A13]一种表达载体，包含[A12]所述的核酸。

[A14]一种宿主细胞，包含[A13]的表达载体。

[A15]式(I)或(II)的化合物、其阳离子自由基、或其二价阳离子、或其盐：

[化3]

[式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化4]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基]。

[A16]一种抗体的制造方法，包括：

1)使α位氨基被保护的赖氨酸与甘油醛反应而得到反应混合物，

2)对反应混合物进行分离，得到含有式(Ia)、(Ib)、(IIa)或(IIb)：

[化5]

[式中，R¹、R³和R⁶为保护基]

所表示的化合物的组分，

3)使用该组分对动物进行免疫而得到以该组分为抗原的抗体。

[B1]与式(XI)或(XII)的化合物、其阳离子自由基、或其二价阳离子结合的单克隆抗体或其抗原结合片段：

[化6]

[式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

Q¹表示氢原子或-CH₂-X¹-Y¹基，

Q²表示氢原子或-CH₂-X²-Y²基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化7]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基]。

[B2]根据[B1]所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，与式(I)或(II)：

[化8]

[式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化9]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基]的化合物、其阳离子自由基、或其二价阳离子结合。

[B3]一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs所含的表位结合，且为：

(1)重链可变区的互补决定区(VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)或轻链可变区的互补决定区(VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的氨基酸序列包含如下的(1-1H)、(1-1L)、(1-2H)或(1-2L)的单克隆抗体或其抗原结合片段，

(1-1H)

(a)VH CDR1：序列编号：1所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(b)VH CDR2：序列编号：2所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，和

(c)VH CDR3：序列编号：3所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(1-1L)

(d)VL CDR1：序列编号：5所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(e)VL CDR2：序列编号：6所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，和

(f)VL CDR3：序列编号：7所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(1-2H)

(g)VH CDR1：序列编号：15所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(h)VH CDR2：序列编号：16所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，和

(i)VH CDR3：序列编号：17所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，或

(1-2L)

(j)VL CDR1：序列编号：19所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(k)VL CDR2：序列编号：20所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(l)VL CDR3：序列编号：21所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

或者

(2)关于与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合，为与前述(1)的单克隆抗体或其抗原结合片段交叉竞争的单克隆抗体或其抗原结合片段。

[B4]根据[B1]～[B3]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs所含的表位结合，且为：

(1)重链可变区的互补决定区(VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)和轻链可变区的互补决定区(VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的氨基酸序列包含如下的(1-1)或(1-2)的单克隆抗体或其抗原结合片段，

(1-1)

(a)VH CDR1：序列编号：1所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(b)VH CDR2：序列编号：2所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(c)VH CDR3：序列编号：3所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(d)VL CDR1：序列编号：5所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(e)VL CDR2：序列编号：6所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，和

(f)VL CDR3：序列编号：7所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，或

(1-2)

(g)VH CDR1：序列编号：15所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(h)VH CDR2：序列编号：16所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(i)VH CDR3：序列编号：17所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(j)VL CDR1：序列编号：19所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(k)VL CDR2：序列编号：20所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(l)VL CDR3：序列编号：21所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

或者

(2)关于与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合，为与前述(1)的单克隆抗体或其抗原结合片段交叉竞争的单克隆抗体或其抗原结合片段。

[B5]根据[B1]～[B4]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs所含的表位结合，且为：

(1)重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为

序列编号：4的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列、和/或序列编号：8的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，或

序列编号：18的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列、和/或序列编号：22的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

或者

(2)关于与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合，为与前述(1)所述的抗体或其抗原结合片段交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。

[B6]根据[B1]～[B5]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，与甘油醛来源AGEs所含的表位结合。

[B7]根据[B1]～[B6]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体或sc(Fv)₂。

[B8]根据[B1]～[B7]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，为小鼠抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或其抗原结合片段。

[B9]根据[B1]～[B8]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以1×10^-5M以下的解离常数(K_d值)与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位结合。

[B10]一种医药组合物，含有[B1]～[B9]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

[B11]根据[B10]所述的医药组合物，用于选自肥胖、糖尿病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性神经病变、糖尿病性心肌病、糖尿病血管并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性肾脏病变、糖尿病足病変、糖尿病酮症酸中毒、牙周病、年龄相关性黄斑变性、肺纤维化、特发性肺纤维化、细支气管周围纤维化、间质性肺疾病、肺癌、癌症纤维性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、急性下肢动脉栓塞、周围动脉疾病、小气道疾病、肺气肿、肾盂肾炎、肾小球硬化症、肾小球肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、糖尿病性肾病变、肾源性系统性纤维化、慢性肾病、特发性腹膜后纤维化、肾病、硬皮病、肾间质纤维化、女性不孕、多囊卵巢综合征、卵巢功能障碍、早期卵巢功能障碍、卵巢癌、乳腺癌、子宫体癌、前列腺癌、男性不育、肝病、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎、肝癌、动脉粥样硬化血栓性脑梗塞、动脉粥样硬化性动脉硬化、颈内动脉狭窄、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、心血管疾病、心绞痛、充血性心力衰竭、急性心力衰竭、慢性心力衰竭、缺血性心脏病、扩张型心肌病、心脏结节病、高血压、肺动脉高血压、肺心病、心肌炎、血管狭窄心脏纤维化、心肌梗死后心脏纤维化、心肌梗死后左心室肥大、类风湿性关节炎、生活方式相关疾病、血脂异常、阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、脑梗塞、脑肿瘤、脑血管障碍、葡萄膜炎、内分泌疾病、骨质疏松症、舌癌、口腔癌、咽癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、胰腺癌、视网膜色素变性、莱伯氏先天性黑蒙、斯特格病、厄舍综合征、无脉络膜症、杆体锥体营养不良、锥体营养不良、进行性视网膜膜萎缩、黄斑营养不良、脉络膜硬化、全脉络膜萎缩、囊样黄斑水肿、葡萄膜炎、视网膜脱离、黄斑裂孔、黄斑部毛细血管扩张症、绿内障、视神经病变、缺血性视网膜疾病、早产儿视网膜病、视网膜血管堵塞病和视网膜小动脉瘤的疾病的诊断、治疗或预防。

[B12]根据[B10]所述的医药组合物，用于选自糖尿病、糖耐量异常、视网膜病、肾病、伴随糖尿病的并发症、周围神经病变、下肢坏疽、动脉硬化、血栓、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、癌症、不孕不育、多囊卵巢综合征、卵巢功能障碍、中枢神经障碍和包括阿尔茨海默氏病的神经变性疾病的疾病的诊断、治疗或预防。

[B13]根据[B12]所述的医药组合物，疾病为选自黑色素瘤、肺癌和肝癌的癌症。

[B14]根据[B10]所述的医药组合物，用于眼病的诊断、治疗或预防。

[B15]根据[B14]所述的医药组合物，眼病选自糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、视网膜色素变性、糖尿病性黄斑水肿、莱伯氏先天性黑蒙、斯特格病、厄舍综合征、无脉络膜症、杆体锥体营养不良、锥体营养不良、进行性视网膜膜萎缩、年龄相关性黄斑变性、黄斑营养不良、脉络膜硬化、全脉络膜萎缩、囊样黄斑水肿、葡萄膜炎、视网膜脱离、黄斑裂孔、黄斑部毛细血管扩张症、绿内障、视神经病变、缺血性视网膜疾病、早产儿视网膜病、视网膜血管堵塞病和视网膜小动脉瘤。

[B16]一种核酸，编码[B1]～[B9]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

[B17]一种表达载体，包含[B16]所述的核酸。

[B18]一种宿主细胞，包含[B17]的表达载体。

[B19]式(I)或(II)的化合物、其阳离子自由基、或其二价阳离子、或其盐：

[化10]

[式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化11]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基]。

[B20]一种抗体的制造方法，包括：

1)使α位氨基被保护的赖氨酸与甘油醛反应而得到反应混合物，

2)对反应混合物进行分离，得到含有式(Ia)、(Ib)、(IIa)或(IIb)：

[化12]

[式中，R¹、R³和R⁶为保护基]

所表示的化合物的组分，

3)使用该组分对动物进行免疫而得到以该组分为抗原的抗体。

发明效果

有报告称，AGEs中，甘油醛来源的AGEs(甘油-AGEs)与糖尿病、尤其是糖尿病血管并发症、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病和糖尿病大血管病变等相关。进一步有报告称，甘油-AGEs在高血压病、阿尔茨海默氏病等痴呆症、癌症(例如肝癌、胰腺癌、子宫癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤和肺癌)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、不孕不育等中是惯用的。因此，甘油-AGEs可以作为用于这些疾病的诊断的生物标志物使用，本发明的抗体可以在生物标志物的检测中使用。

进一步，本发明涉及的抗体可以为了中和生物体中甘油-AGEs的效果而使用，也可用于疾病的治疗等。

附图说明

[图1]图1为显示利用ELISA直接法对新的单克隆抗体(SJ-5)与抗甘油醛来源AGEs多克隆抗体的反应性进行比较的试验结果的图表。

[图2]图2为显示利用ELISA直接法确认抗甘油-AGEs多克隆抗体的反应性的试验结果的图表。

[图3]图3为显示利用ELISA直接法确认POD标记的SJ-5抗体的反应性的试验结果的图表。

[图4]图4为显示利用ELISA竞争法确认SJ-5的特异性的试验中，使用GAL13-BSA作为固相化抗原时的结果的图。

[图5]图5为显示利用ELISA竞争法确认SJ-5抗体的特异性的试验中，使用甘油-AGEs-BSA作为固相化抗原时的结果的图。

[图6]图6为显示利用HPLC得到的甘油-AGEs-Z-Lys的分析结果的图(二极管阵列检测(260nm))。

[图7]图7为显示利用HPLC得到的甘油-AGEs-Z-Lys的分析结果的图(荧光检测(Ex350nm、Em450nm))。

[图8]图8为显示GAL13的质谱分析结果的图谱。

[图9]图9为显示关于GAL13的电子自旋共振(ESR)测定结果的图。

[图10]图10为显示使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)的含有GAL13的样品的氧化活性确认试验的结果的图表。

[图11]图11为显示利用竞争ELISA的SJ-5抗体与GLAP的反应性评价试验的结果的图表。

[图12]图12为显示作为新的单克隆抗体的SJ-5的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的图。带有下划线的位置相当于CDR。

[图13]图13为显示实施例14的内皮细胞管腔形成抑制试验中培养8小时的HUVEC的形态的照片。

[图14]图14为显示使用实施例15的SJ-5、利用甘油-AGEs-BSA的内皮-间质转化转化阻碍试验中α-SMA的表达量的图表。

[图15]图15为显示使用实施例15的SJ-5、利用甘油-AGEs-BSA的内皮-间质转化转化阻碍试验中CD31的表达量的图表。

[图16]图16显示的是实施例16中制备的甘油-AGEs-Z-Lys反应液的LC/MS分析结果(二极管阵列检测(260nm))。

[图17]图17显示的是实施例16中制备的HPLC分离收集时的甘油-AGEs-Z-Lys的UV图谱。

[图18]图18显示的是实施例16中制备的HPLC分离收集时的甘油-AGEs-Z-Lys的MS图谱。

[图19]图19为显示利用实施例18的竞争ELISA评价新的单克隆抗体与GAL691、Lys-羟基-短杆菌酪肽(Lys-ヒドロキシ-トリオシジン)的反应性的结果的图表。

[图20A]图20A为显示实施例19中进行的GAL691的ESR图谱测定结果的图。

[图20B]图20B为显示添加有亚硫酸钠的GAL691的ESR图谱测定结果的图。

[图20C]图20C为显示GLAP的ESR图谱测定结果的图。

[图20D]图20D为显示Lys-羟基-短杆菌酪肽的ESR图谱测定结果的图。

[图21]图21为显示用于确认白色光照射对于GAL691对DAB的氧化活性的影响的试验结果的图表。

[图22]图22为显示实施例21中进行的用于利用GAL691的光敏作用确认单线态氧的生成的试验结果的图表。

[图23]图23为显示实施例22中进行的用于利用GAL691的光敏作用确认单线态氧的生成的试验结果的图表。

[图24]图24为显示实施例23中进行的用于利用GAL691的光敏作用确认超氧阴离子的生成的试验结果的图表。

[图25]图25为显示单克隆抗体PB-1的可变区的氨基酸序列的图。带有下划线的位置表示CDR序列。

[图26A]图26A为显示使用A-峰值-BSA作为固相化抗原时确认PB-1抗体的特异性的试验结果的图表。

[图26B]图26B为显示使用甘油-AGEs-BSA作为固相化抗原时确认PB-1抗体的特异性的试验结果的图表。

[图27]图27为显示利用竞争ELISA评价新的单克隆抗体PB-1与公知的AGEs的反应性的试验结果的图表。

[图28]图28为显示用于利用A-峰值-BSA确认PB-1抗体对DAB氧化活性的抑制效果的试验结果的图表。

[图29]图29为显示确认SJ-5抗体和抗GA-吡啶单克隆抗体对PB-1抗体的交叉竞争的试验结果的图表。

[图30]图30为显示视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)的紧密连接崩溃抑制试验结果的图表，是显示为了确认细胞间紧密连接的形成而进行孔底面阻抗测定的结果的图表。

[图31]图31为显示实施例35的内皮细胞管腔形成抑制试验中培养8小时的HUVEC的形态的照片。

[图32]图32为显示利用激光共聚焦显微镜对用PB-1抗体染色的小鼠的视网膜组织进行观察而得的结果的照片。

[图33]图33为显示使用实施例37中制作的PB-1抗体柱进行样品纯化、通过电泳(SDS-PAGE)对各组分进行分析而得的结果的图。

[图34]图34为显示使用实施例37中制作的PB-1抗体柱纯化的蛋白进行电泳(SDS-PAGE)、电转至PVDF膜而进行Western blotting(免疫印迹试验)的结果的图。

具体实施方式

在本发明的一个方面，本发明的抗体是分离的抗体。分离的抗体不包括天然存在而未实施任何外部操作(人为操作)的抗体、即在某一个体体内产生并留在原处的状态的抗体。典型地，本发明的抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明的一个方式中，提供与式(XI)或(XII)所示的化合物、其阳离子自由基、其二价阳离子、或其盐结合的抗体：

[化13]

[式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

Q¹表示氢原子或-CH₂-X¹-Y¹基，

Q²表示氢原子或-CH₂-X²-Y²基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化14]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基]。

本发明的另一方式中，提供与式(I)或(II)所示的化合物、其阳离子自由基、其二价阳离子、或其盐结合的抗体。

[化15]

[式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化16]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基]

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶为保护基的情况下，R¹、R³和R⁶为氨基的保护基，R²、R⁴和R⁵为羟基的保护基。X¹或X²为-O-的情况下，Y¹或Y²可以为羟基的保护基；X¹或X²为-NH-的情况下，Y¹或Y²可以为氨基的保护基。

作为羟基的保护基的例子，可列举C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、芳基C_1-6烷基、杂芳基C_1-6烷基、((氨基C_1-6烷基)羰氧基)C_1-6烷基、不饱和杂环羰氧基C_1-6烷基、芳基二(C_1-6烷基)甲硅烷基、三(C_1-6烷基)甲硅烷基等。作为优选的羟基的保护基，可列举C_1-6烷基等。

氨基的保护基的例子中，包括C_1-6烷基羰基、芳基C_1-6烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基、芳基C_1-6烷基、杂芳基C_1-6烷基、(芳基C_1-6烷基)氨基羰基等。作为优选氨基的保护基，可列举苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基等。此外，也可以通过氨基被保护而形成邻苯二甲酰亚胺、琥珀酰亚胺、戊二酰亚胺、1-吡咯啉等饱和或不饱和杂环基。

本说明书中的肽基没有特别限定，例如意思是氨基酸残基数1～10000、1～5000、1～3000、1～2000、1～1000、1～500、1～100的肽基。作为氨基酸残基，从天然氨基酸中来选择。

式(I)或(II)所表示的化合物可以使用侧链的氨基被保护的赖氨酸来制备。式(I)或(II)的结构式所表示的范围包含以下的结构式所表示的化合物。

[化17]

[化18]

式中，R¹、R³和R⁶为氨基的保护基。例如，上述式中，R¹、R³和R⁶为苄氧基羰基。

式(I)和式(II)所表示的化合物的阳离子自由基由以下的式(III)和式(IV)表示。

[化19]

式中，R¹、R²、R³、R⁴、X¹、X²、Y¹和Y²的定义如式(I)和式(II)中的定义所示。式(III)和式(IV)包括以下的结构式所表示的阳离子自由基。

[化20]

式(I)和式(II)所表示的化合物的二价阳离子由以下的式(V)和式(VI)表示。

[化21]

式中，R¹、R²、R³、R⁴、X¹、X²、Y¹和Y²的定义如式(I)和式(II)中的定义所示。式(V)和式(VI)包括以下的结构式所表示的二价阳离子。

[化22]

式(I)或(II)所表示的化合物的盐具体包括在该化合物的羧基中形成的盐和在肽基中形成的盐。

式(XI)和式(XII)所表示的化合物的阳离子自由基由以下的式(XIII)和式(XIV)表示。

[化23]

式中，R¹、R²、R³、R⁴、Q¹和Q²的定义如式(XI)和式(XII)中的定义所示。

式(XI)和式(XII)所表示的化合物的二价阳离子由以下的式(XV)和式(XVI)表示。

[化24]

式中，R¹、R²、R³、R⁴、Q¹和Q²的定义如式(XI)和式(XII)中的定义所示。

式(XI)或(XII)所表示的化合物的盐具体包括在该化合物的羧基中形成的盐和在肽基中形成的盐。本说明书记载的阳离子自由基和二价阳离子可以含有适当的阴离子。

关于氨基酸序列所使用的术语“实质上相同”的意思是，被比较的两条氨基酸序列间，序列上的差别比较小而且序列上的差别不会对对于抗原的特异性结合性产生实质上的影响。实质上相同的氨基酸序列可以包含一部分氨基酸序列的改变，例如氨基酸序列可以通过构成氨基酸序列的1～数个(例如1～3个)氨基酸的缺失、替换、或1～数个(例如1～3个)氨基酸的添加、插入、或它们的组合而改变。氨基酸序列的变异位置没有特别限定，可以在多个位置发生变异。氨基酸序列中改变的氨基酸的数量为给出的全部氨基酸的例如相当于10％以内的数量，优选为相当于全部氨基酸的5％以内的数量。进一步优选为相当于全部氨基酸的1％以内的数量。

对氨基酸进行替换时，可以与具有与替换的氨基酸的侧链有类似生化特性的侧链的氨基酸进行替换(保守氨基酸替换)。1个方式中，实质上相同的氨基酸序列例如可以包含1个或多个保守替换。保守氨基酸替换是本领域技术人员已知的，例如可列举以下的表中所示例子(例如WO2010/146550等)。

[表1]

1个方式中，具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的同一性的2条氨基酸序列是实质上相同的。另一方式中，具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的同一性的2条氨基酸序列在替换是上述表中所示保守替换、或使用例示性替换中所示氨基酸替换时是实质上相同的。进一步的其他方式中，具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的同一性的2条氨基酸序列在替换是为使用上述表中的保守的替换所示氨基酸来替换时是实质上相同的。

此外，天然存在的氨基酸基于共通的侧链特性分为以下的组：

(1)非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、

(2)极性、不带电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、

(3)酸性(负电荷)：Asp、Glu、

(4)碱性(正电荷)：Lys、Arg、His、

(5)对链的取向有影响的残基：Gly、Pro、和

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

作为1个方式，可以使用与替换的氨基酸属于同一组的氨基酸来替换。

1个方式中，具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的同一性的2条氨基酸序列是实质上相同的。另一方式中，具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的同一性的2条氨基酸序列在替换是使用氨基酸与上述组属于同一组的氨基酸来替换时是实质上相同的。

两条氨基酸序列是否实质上相同可以通过对包含各氨基酸序列的抗体(其他区域的序列相同)对抗原的结合特异性进行比较来判定。例如，将作为基准的抗体在生理盐水环境下的抗原相关解离常数(K_d值)设为A时，如果比较对象抗体的K_d值在A×10^-1～A×10的范围，则可认定实质上的同一性。

本发明涉及的核酸典型地是分离的核酸，例如cDNA分子等通过基因重组技术产生的核酸的情况下的“分离的核酸”优选是指实质上不含细胞成分、培养液等的状态的核酸。同样地，通过化学合成生产的核酸的情况下的“分离的核酸”优选是指实质上不含dNTP等前体(原材料)、合成过程中使用的化学物质等的状态的核酸。

本说明书中的术语“核酸”包括DNA(包括cDNA和基因组DNA)、RNA(包括mRNA)、DNA类似物和RNA类似物。本发明的核酸的形态没有限定，即可以为单链和双链中的任一种。优选为双链DNA。此外，也考虑了密码子的简并。即，为编码蛋白质的核酸时，只要可获得该蛋白质作为其表达产物即可，可以具有任意碱基序列。

AGEs是通过蛋白质的糖化反应形成的。葡萄糖、果糖等还原糖与蛋白质的游离氨基发生非酶性反应而由席夫碱生成阿马多利化合物，然后反复进行不可逆脱水、缩合，氧化、还原等反应，从而生成具有特有荧光的黄褐色复杂物质AGEs。另一方面，赖氨酸等氨基酸残基与糖反应而得的化合物被鉴定为AGEs的结构，没有荧光的吡咯啉、N^ε-羧甲基赖氨酸(CML)、N^ε-羧乙基赖氨酸(CEL)、和N^ω-羧甲基精氨酸(CMA)等也已知为AGEs。另外，具有芳香环的精氨酰嘧啶、戊糖素、交联素(Crossline)、GA-吡啶、Vesperlysine(吡啶类衍生物)、吡咯并吡啶(Pyrropyridine)等化合物也被鉴定为AGEs。以氨基酸残基形式含有这些化合物的肽、蛋白质也包括在AGEs中。

作为形成AGEs的蛋白质糖化反应的底物，除了葡萄糖、果糖等还原糖以外，还假设了通过生物体内的糖代谢等生成的甘油醛、乙醇醛、甲基乙二醛、乙二醛和3-脱氧葡萄糖醛酮等。使用这样的还原糖和醛，进行了与BSA等蛋白质反应形成AGEs的尝试。以这种方式制备的甘油醛来源AGEs(甘油-AGEs，甘油-AGEs)、葡萄糖来源AGEs(Glu-AGEs)、乙醇醛来源AGEs(乙二醇-AGEs，Glycol-AGEs)、果糖来源AGEs(Fru-AGEs)、甲基乙二醛来源AGEs(MGO-AGEs)、乙二醛来源AGEs(GO-AGEs)和3-脱氧葡萄糖醛酮来源AGEs(3-DG-AGEs)等各种AGEs中，甘油醛来源AGEs被报道是与糖尿病等各种疾病相关的，已知通过使用以甘油醛来源AGEs为抗原的多克隆抗体的分析方法来测定甘油-AGEs的血中浓度的方法。

本发明的单克隆抗体可以如下制作：对使α位氨基被保护基(Z基)保护的赖氨酸与甘油醛反应而得到的AGEs(甘油-AGEs-Z-Lys)进行分离，以得到的特定组分为抗原。此外，本发明的单克隆抗体具有与甘油醛来源AGEs(甘油-AGEs)和乙醇醛来源AGEs(乙二醇-AGEs)特异性结合的特性。

在本发明的一个方面，提供单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs(甘油-AGEs)和/或乙醇醛来源AGEs(乙二醇-AGEs)的表位结合，不与选自葡萄糖来源AGEs(Glu-AGEs)、果糖来源AGEs(Fru-AGEs)、甲基乙二醛来源AGEs(MGO-AGEs)、乙二醛来源AGEs(GO-AGEs)、和3-脱氧葡萄糖醛酮来源AGEs(3-DG-AGEs)的1种以上AGEs结合。更具体地，提供单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs(甘油-AGEs)和乙醇醛来源AGEs(乙二醇-AGEs)的表位结合，不与葡萄糖来源AGEs(Glu-AGEs)、果糖来源AGEs(Fru-AGEs)、甲基乙二醛来源AGEs(MGO-AGEs)、乙二醛来源AGEs(GO-AGEs)和3-脱氧葡萄糖醛酮来源AGEs(3-DG-AGEs)结合。进一步具体地，提供单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs和乙醇醛来源AGEs的表位结合，不与葡萄糖来源AGEs(Glu-AGEs)、果糖来源AGEs(Fru-AGEs)、甲基乙二醛来源AGEs(MGO-AGEs)、乙二醛来源AGEs(GO-AGEs)、3-脱氧葡萄糖醛酮来源AGEs(3-DG-AGEs)、N^ε-羧甲基赖氨酸(CML)和N^ε-羧乙基赖氨酸(CEL)结合。

在本发明的一个方面，提供与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。这里，甘油醛来源AGEs和乙醇醛来源AGEs是在甘油醛或乙醇醛存在下通过BSA、小鼠血清白蛋白(MSA)等的蛋白质糖化反应而产生的AGEs，是含有AGEs的蛋白质。本发明的单克隆抗体和其抗原结合片段具有以通过蛋白质糖化反应产生的化学结构为表位的特征。优选方式中，本发明的抗体和其抗原结合片段不与糖还原和糖代谢等中产生的醛、特别是葡萄糖来源AGEs、果糖来源AGEs、甲基乙二醛来源AGEs、乙二醛来源AGEs和3-脱氧葡萄糖醛酮来源AGEs结合。这些AGEs也通过将各还原糖或醛添加在BSA等蛋白质中并进行蛋白质糖化反应来制备。关于抗体的结合特异性，可以通过公知的方法、例如竞争ELISA法等来鉴定。

本发明提供与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体或片段能够用于AGEs相关疾病的治疗、预防和/或诊断。如本说明书所述，本发明中可使用的抗体可以呈多种形态，如本说明书中定义的那样，本发明提供包含6个CDR的组合(包括与其实质上相同的氨基酸序列、例如包含1～3个氨基酸残基的缺失、替换、添加的序列)的抗体结构。

典型地，以往的抗体结构单元包含4聚体。典型地，各4聚体包含2个相同的多肽链对，各个对具有1条“轻”链(典型地，具有约25kDa的分子量)和1条“重”链(典型地，具有约50～70kDa的分子量)。人轻链被分类为κ轻链和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，分别作为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE定义抗体同型。IgG有多个子类，作为子类，可列举IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，但不限于此。IgM有包括IgM1和IgM2的子类，但不限于此。因此，在本说明书中使用的情况下，“同型”的意思是，由其恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任意子类。已知的人免疫球蛋白同型为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。治疗用抗体中也可包含同型和/或子类的杂合体。一个方式中，本发明的抗体为IgG、IgA、IgM、IgD或IgE，优选为IgG。

各链中包含主要与抗原识别相关的约100～110以上个氨基酸的可变区。可变区中3个环集中在重链和轻链各自的V结构域，形成抗原结合部位。各环也被称为互补决定区(以下也称为“CDR”)，该部分中氨基酸序列的变异(variation)是最显著的。“可变”的意思是，可变区的特定片段在抗体的序列中在很大范围内不同的事实。可变区内的可变性并非均匀分布。而是，V区包含15～30个氨基酸的、被称为框架区(FR)的变化较小的肽段，它们分别被9～15个氨基酸长度以上的被称为“超变区”的可变性极高的短区域分离。

各VH和VL包括3个超变区(“互补决定区”、“CDR”)和4个FR，从氨基末端至羧基末端按以下的顺序配置：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

超变区一般包含：轻链可变区中的氨基酸残基24～34附近(VL CDR1，“VL”的意思是轻链的可变区)、50～56附近(VL CDR2)和89～97附近(VL CDR3)和重链可变区中的31～35附近(VH CDR1，“VH”的意思是重链的可变区)、50～65附近(VH CDR2)和95～102附近(VHCDR3)的氨基酸残基(Kabat等，免疫学意义的蛋白质的序列(SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST)第五版公共卫生服务国立卫生研究院Bethesda,Md.(1991))，和/或形成超变性环的这些残基(例如轻链可变区中的残基26～32(VL CDR1)、50～52(VLCDR2)和91～96(VL CDR3)和重链可变区中的26～32(VH CDR1)、53～55(VH CDR2)和96～101(VH CDR3)(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。

整个本说明书中，在提及可变结构域的残基(大约为轻链可变区的残基1～107和重链可变区的残基1～113)时，通常与Fc区域中使用的EU编号系统一起，使用Kabat编号系统(例如Kabat等，上述(1991))。利用Kabat编号的CDR的鉴定可以使用一般可用的软件(例如abYsis(http://www.abysis.org/)来鉴定。

CDR有助于抗原结合的形成，更详细地，有助于抗体的表位结合部位的形成。“表位”的意思是，抗体分子的可变区中与特异性抗原结合部位(抗体结合部位，paratope)相互作用的确定基。表位分为氨基酸、糖侧链等分子，通常具有特异性结构特性和特异性电荷特性。如本说明书所示，本发明涉及的“SJ-5”或“PB-1”和本说明书所称抗体被认为以上述式(XI)或(XII)、或者上述式(I)或(II)所示的结构的一部分或全部作为表位与抗原结合。

各种AGEs可以通过将蛋白质(例如牛血清白蛋白(BSA)、小鼠血清白蛋白(MSA)、兔血清白蛋白(RSA)等)与醛或还原糖混合使其反应来制备。例如，通过使甘油醛与BSA反应，可以制备含有甘油醛来源AGEs的BSA，可以将其用作AGEs的标准品。甘油醛来源AGEs中，本发明的抗体例如可以通过筛选对含有甘油醛来源AGEs的BSA具有结合性、对BSA不具有结合性的抗体来制备。在本发明的一个方面，本发明的抗体所结合的表位包括通过非酶性反应由甘油醛和蛋白质生成的结构。

在本发明的一个方面，提供重链可变区和轻链可变区的互补决定区包含由以下的(1-1)和(1-2)确定的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段：

(1-1)

(a)VH CDR1：序列编号：1所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(b)VH CDR2：序列编号：2所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(c)VH CDR3：序列编号：3所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(d)VL CDR1：序列编号：5所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(e)VL CDR2：序列编号：6所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，和

(f)VL CDR3：序列编号：7所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，或

(1-2)

(g)VH CDR1：序列编号：15所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(h)VH CDR2：序列编号：16所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(i)VH CDR3：序列编号：17所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(j)VL CDR1：序列编号：19所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(k)VL CDR2：序列编号：20所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(l)VL CDR3：序列编号：21所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列。

根据本发明的一个方面，提供单克隆抗体或其抗原结合片段，重链可变区的氨基酸序列为序列编号：4的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为序列编号：8的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列。作为其具体方式，本发明包括本说明书记载的作为单克隆抗体的SJ-5。根据本发明的另一方面，提供单克隆抗体或其抗原结合片段，重链可变区的氨基酸序列为序列编号：18的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为序列编号：22的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列。作为其具体方式，本发明包括本说明书记载的作为单克隆抗体的PB-1。

根据本发明的一个方面，这些抗体为小鼠来源的抗体，除了上述序列编号所示的重链可变区和轻链可变区以外，还具有小鼠抗体的恒定区。其中，作为与上述序列编号所示的重链可变区或轻链可变区实质上相同的氨基酸序列的例子，可列举N末端或C末端添加有1个或2个氨基酸的序列。例如，作为与上述序列编号所示的重链可变区实质上相同的氨基酸序列，可列举N末端或C末端添加有1个或2个氨基酸(例如从天然型氨基酸选择的氨基酸)、更具体地添加有从Glu和Gln选择的1个氨基酸的序列。

根据本发明的一个方面，提供抗体或其抗原结合片段，以由上述重链可变区和轻链可变区或它们的CDR确定的抗体或其抗原结合片段为参照抗体，在与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合中，与参照抗体交叉竞争。本发明的一个方式中，提供抗体或其抗原结合片段，以作为单克隆抗体的SJ-5为参照抗体，在与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合中，与参照抗体交叉竞争。

本发明的抗体例如可以通过以作为单克隆抗体的SJ-5为参照抗体，进行与甘油-AGEs或乙二醇-AGEs的标准结合实验，来确认交叉竞争相关的特性。交叉竞争的确认例如可以利用流式细胞仪、交叉竞争ELISA实验来确认。

在本发明的一个方面，提供一种用于疾病的治疗、预防或诊断的医药组合物，其含有上述抗体或其抗原结合片段。作为对象疾病，只要是甘油-AGEs或乙二醇-AGEs相关疾病，则没有特别限定，可列举例如糖尿病、糖尿病微血管并发症(糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病和糖尿病性神经病变)、和糖尿病大血管病变、高血压病、阿尔茨海默氏病等痴呆症、癌症(例如肝癌、胰腺癌、子宫癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤和肺癌)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、不孕不育等。根据本发明的另一方式，疾病可列举糖尿病、糖耐量异常、视网膜病、肾病、周围神经病变、下肢坏疽、动脉硬化、血栓、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、癌症(例如黑色素瘤、肺癌和肝癌等)、多囊卵巢综合征、卵巢功能障碍、中枢神经障碍和阿尔茨海默氏病。

在本发明的一个方面，本发明的医药组合物可以用于被AGEs促进的内皮-间质转化导致的疾病的治疗、预防或诊断。作为对象疾病，可例示癌症(例如卵巢癌、乳腺癌、子宫体癌、前列腺癌、舌癌、口腔癌、咽癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、脑肿瘤等)、肥胖、糖尿病、糖尿病性疾病(例如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性神经病变、糖尿病性心肌病、糖尿病血管并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性肾脏病变、糖尿病足病変、糖尿病酮症酸中毒、糖尿病性肾病变等)、牙周病、年龄相关性黄斑变性、肺疾病或呼吸器系疾病(例如肺纤维化、特发性肺纤维化、细支气管周围纤维化、间质性肺疾病、癌症纤维性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、小气道疾病、肺气肿等)、肾病(肾盂肾炎、肾小球硬化症、肾小球肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、肾源性系统性纤维化、肾间质纤维化、慢性肾病等)、特发性腹膜后纤维化、硬皮病、女性不孕、多囊卵巢综合征、卵巢功能障碍、早期卵巢功能障碍、男性不育、肝病(例如肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎等)、心血管疾病(例如急性下肢动脉栓塞、周围动脉疾病、动脉粥样硬化血栓性脑梗塞、动脉粥样硬化性动脉硬化、颈内动脉狭窄、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、心绞痛、充血性心力衰竭、急性心力衰竭、慢性心力衰竭、缺血性心脏病、扩张型心肌病、心脏结节病、高血压、肺动脉高血压、肺心病、心肌炎、血管狭窄心脏纤维化、心肌梗死后心脏纤维化、心肌梗死后左心室肥大、脑梗塞、脑血管障碍等)、类风湿性关节炎、生活方式相关疾病、血脂异常、阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、葡萄膜炎、内分泌疾病、骨质疏松症。更具体地，可列举糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病、动脉粥样硬化血栓性脑梗塞、动脉粥样硬化性动脉硬化、慢性肾病、慢性心力衰竭和缺血性心脏病。

本发明的医药组合物能够用于眼病的诊断、治疗和/或预防。一个方式中，该医药组合物可以用于眼病的进展程度的确认或眼病发病风险的预测。另一方式中，该医药组合物能够用于用来防止或延迟已发病的眼病的进展的治疗，例如可以长时期定期给药。进一步的其他方式中，该医药组合物能够对于疾病的发病风险高的对象进行预防性给药。进一步的其他方式中，该医药组合物能够用于用来在已发病的眼病中使疾病的发病部位恢复的治疗。

作为适合使用本发明的医药组合物的眼病，可列举例如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、视网膜色素变性、糖尿病性黄斑水肿、莱伯氏先天性黑蒙、斯特格病、厄舍综合征、无脉络膜症、杆体锥体营养不良、锥体营养不良、进行性视网膜膜萎缩、年龄相关性黄斑变性、黄斑营养不良、脉络膜硬化、全脉络膜萎缩、囊样黄斑水肿、葡萄膜炎、视网膜脱离、黄斑裂孔、黄斑部毛细血管扩张症、绿内障、视神经病变、缺血性视网膜疾病、早产儿视网膜病、视网膜血管堵塞病和视网膜小动脉瘤。作为尤其适合的眼病，可列举例如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜色素变性和年龄相关性黄斑变性。

本发明的医药组合物具有使血管内皮细胞的管腔形成中AGEs导致的抑制效果降低或消失、进一步抑制或阻碍被AGEs诱导的血管内皮细胞的内皮-间质转化的效果。利用这样的效果，管腔形成阻碍导致的血管通透性上升会降低或消失，癌的转移受到抑制。因此，一个方式中，本发明的医药组合物能够用于癌的转移的预防或抑制。

本发明的一个方式中提供一种疾病的诊断方法，包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段对对象组织(例如血液)中存在的甘油-AGEs和乙二醇-AGEs的量进行测定的工序。这里的诊断如前所述。本发明的另一方式中提供一种试样的分析方法，包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段对试样(例如通过采血得到的血液试样)中存在的甘油-AGEs和乙二醇-AGEs的量进行测定的工序。

本发明的抗体的抗原结合片段例如为Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体或sc(Fv)₂。本发明的抗体例如为小鼠抗体、人源化抗体、人抗体或嵌合抗体。这些抗体或其抗原结合片段可以通过本领域技术人员公知的方法来制备。

本发明的抗体的抗原结合片段例如以1×10^-4M以下、具体地1×10^-5M以下、更具体地1×10^-6M以下、进一步具体地1×10^-7M以下、优选为1×10^-8M以下的平衡解离常数K_d与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位结合。抗体的K_d值可以通过本技术领域已充分确立的方法来确定。用于确定抗体的K_d值的优选方法是，使用表面等离子体共振来进行，优选使用Biacore(注册商标)系统那样的生物传感器系统来进行。

在本发明的一个方面，提供一种与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制造方法。该方法包括对转染了编码本发明的抗体的核酸的宿主细胞进行培养的工序，可以基于公知技术通过各种方法来实施。

在本发明的一个方面，提供编码本发明的抗体的核酸。这样的多核苷酸例如编码重链和轻链各自的可变区和恒定区双方。多核苷酸可以为RNA的形态，也可以为DNA的形态。编码多肽的编码序列可以包括遗传密码的冗余或简并。

一些实施方式中，可以如下设计：编码本发明的抗体的1条以上核酸插入表达载体，该表达载体在导入的宿主细胞的染色体外，或者整合入其基因组中。表达载体可以包含任意数量的适当的控制序列(可列举转录和翻译调控序列、启动子、核糖体结合位点、增强子、复制起点等，但不限于此)或其他要素(选择基因等)，它们全部像本领域公知的那样以可操作的方式连接。一些情况下，可以使用2条核酸，分别插入不同的表达载体(例如第一表达载体中插入编码重链的核酸、第二表达载体中插入编码轻链的核酸)，或者将它们插入同一表达载体。1个以上表达载体的设计、包括控制序列的选择可以通过宿主细胞的选择、希望的蛋白质表达水平等因素来决定。

一般，使用适合于所选择的宿主细胞的任意方法(例如转化、转染、电穿孔、感染等)，以1条以上核酸以可操作方式连接于1个以上表达调控要素的方式(例如载体中，通过细胞内的过程制作的构建物中，整合入宿主细胞的基因组)导入至适合于核酸和/或表达的宿主细胞，制作出重组宿主细胞。得到的重组宿主细胞可以在适合于表达的条件下(例如在诱导物存在下、在合适的非人动物中、在添加有合适的盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的培养基中等)维持，由此制造被编码的1条以上多肽。一些情况下，重链在1种细胞中制造，轻链在另一细胞中制造。

可作为用于表达的宿主使用的哺乳动物细胞株在本领域是已知的，包括可从美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)、马纳萨斯、VA获得的多种永生细胞株，其中，可列举中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、NSO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(例如Hep G2)和多种其他细胞株，但不限于此。也可以使用包括细菌、酵母、昆虫和植物的(但不限于此)非哺乳动物细胞来表达重组抗体。一些实施方式中，抗体可以在牛、鸡等转基因动物中制造。

在本发明的一个方面，提供一种以式(XI)或式(XII)、或者式(I)或式(II)的化合物为抗原对动物进行免疫而制作抗体的方法。式(XI)或式(XII)、或者式(I)或式(II)的化合物的制造方法没有特别限定，例如可以对使α位氨基被保护的赖氨酸与甘油醛反应得到的反应混合物进行纯化而制备。作为免疫中使用的抗原，例如可以使用对上述反应混合物进行分离而得到的组分中含有式(Ia)或式(Ib)所表示的化合物的组分。分离可以通过通常的方法来进行，例如，可以通过HPLC分离收集而使用含有确定的峰的组分。

关于免疫，可以使用抗体的制作中通常进行的方法。动物可以使用人以外的哺乳类、例如小鼠、大鼠、兔、狗、猪、仓鼠等。

实施例

[实施例1]AGEs的制备

AGEs可以通过公知的方法来制备(非专利文献5和非专利文献6等)。具体地，通过以下的方法来制备各种AGEs。

(1)含有甘油醛来源AGEs的牛血清白蛋白(甘油-AGEs-BSA)

牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)、DL-甘油醛(DL-GLA，Nacalai Tesque)、二亚乙基三胺-N,N,N’,N”,N”-五乙酸(DTPA，同仁化学研究所)通过购买获得。

称取DL-GLA(180mg)和DTPA(39mg)，移入50mL的培养用管。在管中加入磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4，20mL)，用涡旋混合器搅拌直至DL-GLA溶解。然后，加入BSA(500mg)，搅拌至溶解(溶液中的BSA的浓度：25mg/mL)。

在超净工作台内使得到的混合物通过0.2μm过滤器制成无菌溶液。用Parafilm(商标)等膜将管的盖子密封，以使管内的液体不会蒸发，37℃温育1周。

将得到的反应溶液(各2.5mL)上样于PD-10柱(GE医疗，8根)，按照PD-10柱的实验方案，用磷酸缓冲液生理盐水(PBS)(pH7.4，各3.5mL)洗脱。

收集4根柱的洗脱液(合计14mL)，放入截留分子量6～8kDa的透析管(Spectra/PorDialysis Membrane(Spectra/Por透析膜)，宽度：23mm)，将2根14mL的管放入预冷的2L PBS中，搅拌，透析。透析在低温室内(5℃)进行，每24小时更换透析液(PBS)，透析3天。

透析结束后，将2根透析管内的液体合并，放入50mL的培养用管，作为含有甘油醛来源AGEs的BSA(甘油-AGEs-BSA)而测定蛋白质量，用培养用PBS调整至所需的蛋白质浓度。

除了未添加DL-GLA以外，通过与实施例1同样的方法，制备对照BSA。

(2)含有甘油醛来源AGEs的小鼠血清白蛋白(甘油-AGEs-MSA)和含有甘油醛来源AGEs的兔血清白蛋白(甘油-AGEs-RSA)

制备在0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)中含有25mg/mL的小鼠血清白蛋白(MSA，Sigma-Aldrich)或兔血清白蛋白(RSA，Sigma-Aldrich)、DL-甘油醛(0.1M，Nacalai Tesque)和二亚乙基三胺5乙酸(5mM，DTPA，同仁化学研究所)的溶液。通过0.2μm过滤器灭菌使该溶液形成无菌状态，37℃温育1周。低分子量的未反应物等用PD-10凝胶过滤柱(GE医疗)除去，进一步在低温室内(5℃)用PBS(磷酸缓冲生理盐水)进行3天透析(其间每天更换PBS)。

(3)含有葡萄糖来源AGEs的BSA(Glu-AGEs-BSA)和含有果糖来源AGEs的BSA(Fru-AGEs-BSA)

制备在0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)中含有25mg/mL牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)、D-葡萄糖(0.5M，和光纯药)或D-果糖(0.5M，和光纯药)、以及DTPA(5mM，同仁化学研究所)的溶液，通过0.2μm过滤器灭菌使该溶液形成无菌状态，37℃温育8周。低分子量的未反应物等用PD-10凝胶过滤柱除去，进一步，在低温室内(5℃)用PBS进行3天透析(其间每天更换PBS)。

(4)含有乙醇醛来源AGEs的BSA(乙二醇-AGEs-BSA)、含有甲基乙二醛来源AGEs的BSA(MGO-AGEs-BSA)和含有乙二醛来源AGEs的BSA(GO-AGEs-BSA)

制备在0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)中含有0.1M的乙醇醛(Sigma-Aldrich)、甲基乙二醛(Sigma-Aldrich)、或乙二醛(Sigma-Aldrich)、以及BSA(25mg/mL)和DTPA(5mM)的溶液。通过0.2μm过滤器灭菌使该溶液形成无菌状态，37℃温育1周。无菌条件下，37℃温育1周，然后，低分子量的未反应物等用PD-10凝胶过滤柱除去，进一步，在低温室内(5℃)用PBS进行3天透析(其间每天更换PBS)。

(5)含有3-脱氧葡萄糖醛酮来源AGEs的BSA(3-DG-AGEs-BSA)

制备在0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)中含有BSA(25mg/mL，Sigma-Aldrich)、3-脱氧葡萄糖醛酮(0.2M，同仁化学研究所)和DTPA(5mM)的溶液。通过0.2μm过滤器灭菌使该溶液形成无菌状态，37℃温育2周。然后，低分子量的未反应物等用PD-10凝胶过滤柱除去，进一步，在低温室内(5℃)用PBS进行3天透析(其间每天更换PBS)。

(6)含有N^ε-羧甲基赖氨酸的BSA(CML-BSA)

制备在0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)中含有BSA(50mg/mL，Sigma-Aldrich)、乙醛酸(45mM，和光纯药)和氰基硼氢化钠(150mM，Sigma-Aldrich)的溶液。通过0.2μm过滤器灭菌使该溶液形成无菌状态，37℃温育24小时。然后，低分子量的未反应物等用PD-10凝胶过滤柱除去，进一步，在低温室内(5℃)用PBS进行3天透析(其间每天更换PBS)。

[实施例2]抗原的制备

(1)甘油醛来源AGEs化赖氨酸(甘油-AGEs-Z-Lys)的制备

N^α-苄氧羰基-L-赖氨酸(Z-Lys-OH，东京化成工业)、DL-甘油醛(DL-GLA，NacalaiTesque)通过购买获得。称取DL-GLA(675.6mg)，移入50mL容量的离心管。在离心管中加入磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4，25mL)，用涡旋混合器搅拌直至DL-GLA溶解。然后，加入Z-Lys-OH(700.8mg)，搅拌至溶解(溶液中的DL-GLA浓度：300mM，Z-Lys-OH浓度：100mM)。然后，用Parafilm(商标)等膜将管的盖子密封，以使离心管内的液体不会蒸发，37℃静置1周以上。

对于5mL得到的反应溶液，加入1mL10％三氟乙酸(TFA，富士胶片和光纯药)水溶液，颠倒混和。然后，室温离心分离10分钟(12,000×g)，将上清除去。在含有得到的沉淀物的离心管中加入超纯水(5mL)，再次进行离心分离，将上清除去。将该操作合计实施3次，从而对沉淀进行洗涤。洗涤后的沉淀风干后，测定干重(200mg)，冷藏保存。

(2)甘油-AGEs-Z-Lys的分离纯化

将甘油-AGEs-Z-Lys的沉淀物溶解在磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4)中，制备0.5mg/mL(分析用)或者50mg/mL(分离用)的试样溶液。然后，用孔径0.2μm的针头过滤器(Millex-LG，默克)过滤，将滤液作为高效液相色谱(HPLC)的试样。HPLC装置使用1260Infinity II系统(安捷伦科技)，由以下的模块构成：四分泵(Quarterly pump)(G7111B)、多点采样器(Multisampler)(G7167A)、多列恒温器(Multi-column thermostat)(G7116A)、二极管阵列检测器(G7115A)、荧光检测器(G7121B)、级分收集器(Fraction collector)(G1364F)、OpenLABCDS ChemStation软件。移动相由富士胶片和光纯药的HPLC溶剂制备。移动相A设为10mL 1M乙酸铵溶液与990mL蒸馏水混合而成的10mM乙酸铵水溶液，移动相B设为乙腈。在分析时间0-10分钟时，移动相以A:B＝75:25流下；在10.1-20分钟，移动相以A:B＝65:35流下；在20.1-25分钟时，移动相以A:B＝10:90流下。分析柱使用YMC-Triart C18(150×4.6mm，YMC)，将流速设为0.8mL/分钟。将5μL过滤后的分析用试样溶液(0.5mg/mL)注入HPLC装置，用二极管阵列检测器(260nm)和荧光检测器(激发波长350nm，荧光波长450nm)检测甘油-AGEs-Z-Lys的峰。将HPLC的结果示于图6(二极管阵列检测(260nm))和图7(荧光检测(Ex350nm，Em450nm))。

结果，在分析时间为13.5分钟时确认到显著的峰。以后，将该峰称为GAL13。然后，将YMC-Triart C18(150×10mm，YMC)安装于HPLC装置，将流速设为2.5mL/分钟。将50μL过滤后的分离用试样溶液(50mg/mL)注入HPLC装置，用二极管阵列检测器(260nm)检测GAL13。然后，利用将UV的峰设为扳机的级分收集器分离收集GAL13。

分离收集溶液所含的乙腈用旋转蒸发仪(东京理化器械)除去。对于5mL残渣溶液，加入1mL 10％TFA水溶液，颠倒混和。然后，室温下离心分离10分钟(12,000×g)，将上清除去。在得到的沉淀物中加入超纯水(5mL)，再次进行离心分离，将上清除去。将该操作合计实施3次，从而对沉淀进行洗涤。洗涤后的沉淀风干后，测定干重(1mg)，冷藏保存。

(3)GAL13与载体蛋白的结合

将分离收集纯化后的GAL13的干燥粉末溶解在磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4)中，使终浓度为40mg/mL。进一步将该溶液用磷酸缓冲生理盐水(PBS，pH7.4)稀释10倍，使终浓度为4mg/mL。载体蛋白的溶液如下制备。将小鼠血清白蛋白(MSA，Sigma-Aldrich)冻干粉末溶解在PBS中，将终浓度设为10mg/mL。在1.5mL容量的Eppendorf Safe-Lock管(Eppendorf)内，将4mg/mL的GAL13溶液(500μL)和10mg/mL的MSA溶液(200μL)混合。然后，将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，Thermo Scientific)溶解在超纯水中，制作10mg/mL水溶液。在GAL13与MSA的混合溶液(700μL)中迅速添加10mg/mL EDC水溶液(100μL)，颠倒混和后，室温温育过夜。

反应结束后，立即用Zeba Spin Desalting Columns(Zeba旋转脱盐柱)(7KMWCO，Thermo Scientific)对反应溶液进行凝胶过滤。进一步使用Slide-A-Lyzer MINI透析设备(3.5KMWCO，Thermo Scientific)，在低温下(4℃)透析。透析外液设为PBS。透析开始3小时后，对外液进行替换，进一步进行一夜的透析。透析结束后，回收透析设备内的溶液，用Amicon Ultra-0.5(30KMWCO，默克)浓缩。用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒(ThermoScientific)求出使GAL13交联的MSA(GAL13-MSA)的蛋白质浓度，用PBS调整为任意蛋白质浓度。GAL13-MSA作为小鼠单克隆抗体制作中的免疫抗原使用。

在酶联免疫吸附测定(ELISA)中，使GAL13与牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)交联，在试验中作为GAL13-BSA使用。此外，作为阴性对照区，使N^α,N^ε-二苄氧羰基-L-赖氨酸(Z-Lys(Z)-OH，渡边化学工业)与BSA交联，制备Z-Lys-BSA。这些试样根据需要在超净工作台内进行过滤器过滤灭菌(孔径0.22μm)。

[实施例3]单克隆抗体的制作

(1)对小鼠的免疫

作为免疫抗原，将甘油-AGEs来源的新的结构体修饰-小鼠血清白蛋白(GAL13-MSA，1mg/mL)与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich)混合而制备乳浊液(抗原的浓度：0.5mg/mL)，在5只BALB/c小鼠的背部皮下进行初次免疫(抗原的量：200μg/只)。使用将GAL13-MSA(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)混合而制备的乳浊液(抗原的浓度：0.5mg/mL)，每隔一周进行追加免疫(抗原的量：50μg/只)。从初次免疫开始6次免疫后，从尾静脉进行采血，进行抗体效价的确认。对于抗体效价高的样品，用追加免疫用的乳浊液(抗原的量：50μg)在小鼠的腹腔内进行最终给药，其3天后将脾脏摘下用于细胞融合。

(2)抗体效价的测定

通过ELISA评价抗血清的效价。在96孔微量滴定板(NUNC)上，以1μg/mL的浓度滴加在作为免疫抗原的GAL13-MSA中将载体蛋白改为BSA的甘油-AGEs来源的新的结构体修饰-牛血清白蛋白(GAL13-BSA)，50μL/孔，4℃固相化一夜。用含有0.05％(v/v)吐温20的PBS(PBS-T)洗涤3次后，用含有0.5％(w/v)明胶的碳酸缓冲液(pH9.5)封闭1小时。抗血清从1000倍开始依次3倍梯度稀释，直至制备729000倍的稀释系列后，加入抗原固相化平板中，50μL/孔，静置1小时。洗涤后，加入用PBS-T稀释2500倍的二抗(辣根过氧化物酶(HRP)标记抗小鼠IgG(ZYMED)，50μL/孔，静置1小时。洗涤后，在各孔中添加用含有0.02％(w/v)的过氧化氢的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)调整至0.5mg/mL的邻苯二胺溶液(100μL)，25℃静置10分钟后，在各孔中添加1M硫酸溶液(100μL)，使显色反应停止。然后，用酶标仪测定490nm的吸光度。其结果，将抗血清的9000倍以上的稀释溶液中显示与抗原显著的反应性的小鼠用于细胞融合。

(3)脾脏细胞的制备和细胞融合

对从小鼠摘下的脾脏进行研磨，每只制备约1×10⁸个脾脏细胞。对骨髓瘤细胞P3U1进行培养，制备细胞融合当天活细胞率为95％以上的P3U1。将前述脾脏细胞与P3U1按5:1(细胞数之比)混合，利用50％(w/v)浓度的分子量1,450的聚乙二醇进行细胞融合。融合后，将细胞用培养基洗涤，悬浮在HAT培养基中，在96孔培养板的各孔中接种细胞，1×10⁵个/孔，进行杂交瘤的选择培养。细胞融合第10天回收杂交瘤培养上清，进行培养上清中抗体效价的测定。

(4)产抗体阳性孔的筛选

细胞融合后，回收第10天的培养上清，产抗体阳性孔的筛选通过上述抗体效价测定方法来进行。选择GAL13-BSA、含有甘油醛来源AGEs的BSA(甘油-AGEs-BSA)为阳性、Z-赖氨酸修饰牛血清白蛋白(Z-Lys-BSA)为阴性的克隆。

(5)克隆

通过极限稀释法将对GAL13-BSA特异性高的克隆进行克隆。即，用含有10％的FCS的RPMI培养基制备细胞5个/mL，添加在2块96孔培养板的各孔中，每孔200μL。10天后，确认培养上清中的GAL13-BSA、甘油-AGEs-BSA为阳性并且Z-Lys-BSA为阴性，得到来源于各个孔的克隆。得到产生作为具有充分特异性的本发明的抗体的新的单克隆抗体SJ-5的细胞。

(6)抗体的纯化

将产生新的单克隆抗体SJ-5的细胞用含有10％的FCS的RPMI培养基培养后，用PBS洗涤，用无血清培养基(SMF培养基，Thermo Scientific)培养4天～6天，得到培养上清。将培养上清用蛋白G柱(GE医疗公司制)纯化IgG组分，得到作为具有充分特异性的本发明的抗体的、新的单克隆抗体SJ-5。

[实施例4]单克隆抗体和多克隆抗体的过氧化物酶(POD)标记方法

得到的新的单克隆抗体SJ-5(PBS溶液，200μg)或抗甘油醛来源AGEs多克隆抗体(利用Molecular Medicine 6(2):114-125,2000记载的竹内等人的方法，PBS溶液，200μg)使用过氧化物酶标记试剂盒-SH(同仁化学研究所)进行POD标记。标记方法按照操作说明书的步骤。得到的POD标记抗体溶液与甘油(Sigma-Aldrich)按1:1混合，-20℃保存。

[实施例5]利用ELISA直接法确认新的单克隆抗体的反应性

按1μg/mL的浓度加入甘油-AGEs来源的新的结构体修饰-BSA(GAL13-BSA)，100μL/孔，4℃固相化一夜。用含有0.05％(v/v)吐温20的PBS(PBS-T)洗涤3次后，用含有0.5％(w/v)明胶的PBS-T封闭1小时。关于制备实施例4中制备的POD标记的新的单克隆抗体SJ-5以及作为对照的抗甘油醛来源AGEs多克隆抗体，从4μg/mL开始4倍梯度逐次稀释，直至制备0.06254μg/mL的稀释系列后，加入至抗原固相化平板，100μL/孔，静置1小时。洗涤后，在各孔中添加用含有0.02％(w/v)的过氧化氢的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)调整至0.5mg/mL的邻苯二胺溶液(100μL)，25℃静置10分钟后，在各孔中添加1M硫酸溶液(50μL)，使显色反应停止。然后用酶标仪测定490nm的吸光度。

结果，如图1所示，表明POD标记的SJ-5抗体良好地与GAL13-BSA反应。

[实施例6]利用ELISA竞争法确认新的单克隆抗体的反应性

以1μg/mL的浓度加入GAL13-BSA，100μL/孔，4℃固相化一夜。用含有0.05％(v/v)吐温20的PBS(PBS-T)洗涤3次后，用含有0.5％(w/v)明胶的碳酸缓冲液(pH9.5)封闭1小时。制备POD标记的SJ-5抗体(0.4μg/mL)以及作为对照的抗甘油醛来源AGEs多克隆抗体(6μg/mL)后，在抗原固相化平板中加入GAL13-BSA与对照BSA的10倍稀释系列溶液(各50μL)和POD标记的SJ-5抗体、或者作为对照的抗甘油醛来源AGEs多克隆抗体(50μL)，用平板混合器搅拌后，室温静置1小时。洗涤后，在各孔中添加100μL用含有0.02％(w/v)的过氧化氢的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)调整至0.5mg/mL的邻苯二胺溶液，25℃静置10分钟后，在各孔中添加50μL 1M硫酸溶液，使显色反应停止。然后用酶标仪测定490nm的吸光度。图2显示的是抗甘油醛来源AGEs多克隆抗体的结果，图3显示的是POD标记的SJ-5抗体的结果。

POD标记的SJ-5抗体以及抗甘油醛来源AGEs多克隆抗体在竞争法中均表现出与GAL13-BSA的良好反应，表明POD标记的SJ-5抗体的抗体使用浓度可以获得与比抗甘油醛来源AGEs多克隆抗体低15倍的浓度同样的结果。

[实施例7]利用ELISA竞争法确认新的单克隆抗体的特异性

在96孔微量滴定板(NUNC)的各孔中各添加100μL作为固相化抗原的用PBS(pH7.4)调整至1μg/mL的GAL13-BSA或甘油-AGEs-BSA，25℃放置1小时。4℃固相化一夜。用含有0.05％(v/v)吐温20的PBS(PBS-T)洗涤3次后，用含有0.5％(w/v)明胶的碳酸缓冲液(pH9.5)封闭1小时。在与实施例6同样的条件下制备POD标记的SJ-5抗体(0.4μg/mL)，为了进行特异性确认，在抗原固相化平板中，将含有葡萄糖来源AGEs的BSA(Glu-AGEs-BSA)、含有乙醇醛来源AGEs的BSA(乙二醇-AGEs-BSA)、含有甲基乙二醛来源AGEs的BSA(MGO-AGEs-BSA)、含有乙二醛来源AGEs的BSA(GO-AGEs-BSA)、含有N^ε-羧甲基赖氨酸的BSA(CML-BSA)、含有N^ε-羧乙基赖氨酸的BSA(CEL-BSA)和牛血清白蛋白(BSA)同样地各添加50μL，进一步添加POD标记的SJ-5抗体(50μL)，用平板混合器搅拌后，室温静置1小时。洗涤后，在各孔中添加用含有0.02％(w/v)的过氧化氢的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)调整至0.5mg/mL的邻苯二胺溶液(100μL)，25℃静置10分钟后，在各孔中添加50μL 1M硫酸溶液，使显色反应停止。然后用酶标仪测定490nm的吸光度。

图4中显示的是使用GAL13-BSA作为固相化抗原时的POD标记的SJ-5抗体的特异性的结果，图5中显示的是，将对照BSA设为1时的吸光度，作为使用甘油-AGEs-BSA作为固相化抗原时的POD标记新单克隆抗体SJ-5的特异性的结果。

使GAL13-BSA和甘油-AGEs-BSA固相化的情况下也同样，作为新的单克隆抗体SJ-5的特异性，甘油-AGEs-BSA和乙二醇-AGEs-BSA为阳性、Glu-AGEs-BSA、Fru-AGEs-BSA、MGO-AGEs-BSA、GO-AGEs-BSA、CML-BSA和CEL-BSA为阴性。

[实施例8]单克隆抗体的解离常数测定

对于单克隆抗体SJ-5，通过以下的方法测定解离常数(K_d值)。将含有甘油醛来源AGEs的BSA(甘油-AGEs-BSA)用10mM乙酸钠溶液(pH4.0)稀释，制备终浓度100μg/mL的配体溶液。关于配体的固定化和K_d值的计算，使用Biacore T200(GE医疗)。使用胺偶联试剂盒(GE医疗)，将配体溶液固定在感应芯片CM5(GE医疗)上。然后，制成将单克隆抗体稀释至0～400nM的浓度的抗体稀释液，算出K_d值。

结果，单克隆抗体的K_d值为57.4nM。此外，将化学结合了用HPLC分离收集的峰的BSA(GAL13-BSA)用10mM乙酸钠溶液(pH5.0)稀释，制备终浓度25μg/mL的配体溶液。与上述同样地计算单克隆抗体的K_d值，结果为87.5nM。

[实施例9]GAL13的质谱分析

质谱分析中使用的溶剂是富士胶片和光纯药的HPLC等级的试剂。将通过实施例2制备的GAL13干燥粉末用含有50％乙腈的0.1％TFA溶液溶解，终浓度设为0.25mg/mL。基质是从岛津GLC购买α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)并用含有50％乙腈的0.1％TFA溶液制备的10mg/mL溶液。将试样溶液和基质溶液在0.6mL容量的Eppendorf Safe-Lock管(Eppendorf)内等量混合后，在测定用平板的孔中滴加1μL，使其风干。作为用于质量校正的肽，制备des-Arg¹-Bradykinin、血管紧张肽(Angiotensin)I、Glu¹-血纤维蛋白肽(Fibrinopeptide)(ABSCIEX)与基质的混合溶液，同样地滴加在平板中。风干后的平板插入作为矩阵辅助激光解析离子化飞行时间型质谱分析装置(MALDI-TOF-MS)的AXIMA Performance(岛津制作所)中，利用反射器模式进行阳离子测定。将质谱分析的结果示于图8。

结果，在m/z＝650-750和953观察到试样来源的峰。尤其是，m/z＝691.2926被认为是作为C₃₄H₄₄N₄O₁₀的Na加成物的[M+Na]⁺离子(单同位素质量的理论值691.2957，与实测值的误差4.5ppm)。这与Z-Lys-OH2分子用DL-GLA2分子交联而成的结构体的单同位素质量大体一致。此外，m/z＝953.3945被认为是作为C₄₈H₆₂N₆O₁₃的Na加成物的[M+Na]⁺离子(单同位素质量的理论值953.4276，与实测值的误差34.7ppm)。这与Z-Lys-OH3分子用DL-GLA2分子交联而得的结构体的单同位素质量大体一致。根据以上的结果表明，GAL13中至少包含以下2种化合物。

[化25]

以及

[实施例10]用HPLC分离收集的峰的自由基测定

将通过实施例2制备的GAL13干燥粉末用0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)溶解，终浓度设为50mg/mL。用带有刻度的玻璃毛细管微量移液器(DrummondScientific Company)取50μL该溶液，用EM Meister红细胞比容毛细管密封蜡板(亚速旺)将毛细管的下端密封。然后，将毛细管移至电子自旋共振(ESR)装置用标准试样管(外径4mm，株式会社SHIGEMI)，插入ESR的共振器中。ESR装置使用ELEXSYS-II E580(Bruker)、通过连续波(Continuous Wave)法在室温下进行测定。测定条件如下：

场中心(Field center)3350G，

场宽(Field width)150G，

平均扫描(Averaged scan)20，

采样时间(Sampling time)0.03s，

场调制振幅(Field modulation amplitude)0.4mT，

场调制频率(Field modulation Frequency)100kHz，

微波功率(Microwave power)3mW，

接收器增益(Receiver gain)60。

将结果示于图9。根据g值(2.0043)和图谱的线形可见，用HPLC分离收集的峰是含有产生自由基的碳中心的甘油醛来源AGEs。

[实施例11]GAL13的氧化活性评价

(1)3,3’-二氨基联苯胺(DAB)的制备

DAB从同仁化学研究所购买。称取DAB，以终浓度为5mg/mL的方式溶解在Tris缓冲液(50mM，pH7.4)中。

(2)试样溶液的制备

将按照实施例2制备的GAL13干燥粉末溶解在磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4)中，制备2mg/mL溶液。同时制备2mg/mL的Z-Lys-OH溶液作为阴性对照区。

(3)氧化活性的评价方法

在96孔板(VIOLAMO)中添加5mg/mL的DAB溶液或者Tris缓冲液(50mM，pH7.4)，每孔10μL。然后添加试样溶液，每孔90μL，用平板混合器搅拌。将平板在避光条件下37℃温育3小时后，用Cytation5酶标仪(BioTek)测定460nm的吸光度。通过从DAB添加区的460nm的吸光度减去Tris缓冲液添加区的460nm的吸光度，求出对DAB的氧化活性。将结果示于图10的图表。显示了3次测定值的平均值和标准偏差。统计分析通过JMP14.0(SAS)进行Student’s t检验，可见GAL13对DAB的氧化活性显著比Z-Lys-OH高(P＜0.01)。

[实施例12]甘油醛来源吡啶鎓化合物(GLAP)的制备

GLAP可以通过公知的方法来制备(Usui等，Biosci.Biotechnol.Biochem.,2003,67(4),930-932)。具体地，通过以下的方法制备GLAP。

(1)GLAP反应溶液的制备

N^α-乙酰基-L-赖氨酸(Ac-Lys-OH，东京化成工业)、DL-甘油醛(DL-GLA，NacalaiTesque)通过购买获得。

称取DL-GLA(360.3mg)，移入50mL的离心管。在管中加入磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4，20mL)，用涡旋混合器搅拌直至DL-GLA溶解。然后，加入Ac-Lys-OH(376.5mg)，搅拌至溶解(溶液中的DL-GLA的浓度：200mM，Ac-Lys-OH的浓度：100mM)。用Parafilm(商标)等膜将管的盖子密封，以使管内的液体不会蒸发，37℃温育1周。得到的反应溶液4℃保存。

(2)GLAP的分离纯化

GLAP反应溶液用孔径0.2μm的针头过滤器(Millex-LG，默克)过滤，将滤液作为液相色谱质谱分析仪(LC-MS)的试样。LC/MS的LC部由1260Infinity II系统(安捷伦科技)构成，MS部由四极质谱分析仪(InfinityLab LC/MSD，G6125B，安捷伦科技)构成。其中，LC部由以下的模块构成：四分泵(Quarterly pump)(G7111B)、等度泵(Isocratic pump)(G7110B)、多点采样器(Multi sampler)(G7167A)、多列恒温器(Multi-column thermostat)(G7116A)、二极管阵列检测器(G7115A)、级分收集器(G1364F)、MS流量调节器(G7170B)、OpenLAB CDS ChemStation软件。移动相购买的是富士胶片和光纯药的HPLC等级的试剂。移动相A设为10mL 1M乙酸铵溶液与990mL蒸馏水混合而成的10mM乙酸铵水溶液，移动相B设为乙腈。分析时间0-7分钟时，以移动相A:B＝99:1流下；7.1-12分钟时，以移动相A:B＝10:90流下。色谱柱使用ZORBAXSB-C18(150×9.4mm，安捷伦科技)，将流速设为4mL/分钟。将80μL过滤后的试样溶液注入LC-MS装置，用二极管阵列检测器(215nm和254nm)和MS(阳离子检测)检测GLAP的峰。分析时间5分钟时，观察到了具有UV吸收性的峰，该峰含有m/z＝297.1的阳离子。因此，将m/z＝297设为扳机进行MS分离收集，回收保持时间5分钟的峰。分离收集后的溶液用旋转蒸发仪(东京理化器械)浓缩干燥固化。得到的沉淀4℃保存。

(3)GLAP的结构确认

得到的沉淀(8mg)溶解在重水(0.6mL，富士胶片和光纯药)中，移入外径5mm的核磁共振(NMR)用样品管(SHIGEMI)。然后，用NMR装置(AVANCE III HD，500MHz，CryoProbe搭载型，Bruker)确定GLAP的结构。利用¹H-NMR和¹³C-NMR的图谱数据确定全部氢和碳的归属。此外，通过对¹H-¹HCOSY、¹H-¹³CHSQC、¹H-¹³CHMBC、¹H-¹⁵NHSQC、¹H-¹⁵NHMBC图谱进行分析来确认归属的恰当性。将GLAP的结构示于以下。

[化26]

[实施例13]利用竞争ELISA评价新的单克隆抗体与GLAP的反应性

(1)试剂制备

将下述试剂溶解在RO水中制成1L，作为包被溶液使用。

碳酸钠(富士胶片和光纯药) 1.59g

碳酸氢钠(富士胶片和光纯药) 2.93g

将BSA(5g，Sigma-Aldrich)溶解在PBS(500mL)中，作为封闭溶液使用。

将50mM Tris(6.1g，富士胶片和光纯药)溶解在RO水(约900mL)中，用6N盐酸(富士胶片和光纯药)调节至pH7.4。在得到的溶液中加入甘油(1mL，Sigma-Aldrich)、吐温20(1mL，Nacalai Tesque)，用RO水定容至1L。将得到的溶液作为稀释溶液使用。

将下述试剂溶解在RO水中制成1L，进一步加入9L RO水后，加入吐温20(5mL)。将得到的溶液作为洗涤溶液使用。

氯化钠(富士胶片和光纯药) 80g

磷酸二氢钾(富士胶片和光纯药) 2g

磷酸氢二钠12水合物(富士胶片和光纯药) 29g

(3)抗原的固相化

在96孔微量滴定板(COSTAR)中加入在包被溶液中制备成1μg/mL的含有甘油醛来源AGEs的BSA(原液：10mg/mL PBS溶液)溶液，每孔100μL，4℃温育一夜。

(4)封闭

将进行了固相化处理的各孔用洗涤溶液(300μL)洗涤3次，加入封闭溶液(200μL)，室温放置1小时。

(5)竞争实验

将GAL13(通过实施例2制备)、GLAP(通过实施例12制备)、Z-Lys-OH(东京化成工业)分别溶解在磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4)中，制备20mg/mL溶液。通过进一步用稀释溶液进行稀释，制作0.0063～2mg/mL的2倍稀释系列(6点)的试样溶液。将POD标记的新的单克隆抗体(SJ-5)溶液用含有BSA(1mg/mL，富士胶片和光纯药)的稀释溶液稀释16,000倍，制成POD标记的SJ-5抗体稀释溶液。

将用封闭溶液处理过的各孔用洗涤溶液(300μL)洗涤3次，加入2倍稀释系列的试样溶液(各50μL)和POD标记的SJ-5抗体稀释溶液(50μL)，用平板混合器搅拌2分钟后，25℃温育1小时。

(6)显色

用洗涤溶液(300μL)洗涤3次后，加入100μL的底物溶液(ELISA POD底物TMB试剂盒(Popular)，Nacalai Tesque)，室温、避光条件下温育10分钟。然后，加入2N硫酸(50μL)停止显色。

(7)吸光度测定和数据分析

用酶标仪(Cytation5，BioTek)测定主波长450nm和副波长650nm的吸光度，从主波长的吸光度减去副波长的吸光度。将其结果示于图11。GAL13中观察到吸光度发生浓度依赖性地降低，而GLAP和Z-Lys-OH未观察到吸光度的降低。因此可见，新的单克隆抗体SJ-5是不识别作为公知的甘油醛来源AGEs的GLAP的抗体。

[实施例14]使用SJ-5对由甘油-AGEs-BSA导致的血管内皮细胞管腔形成抑制的中和试验

(1)基质胶基质的制备

将基质胶基质(康宁)放入冰箱，用一夜熔化。熔化的基质胶基质添加在12孔板(康宁)中，300μL/孔，通过在37℃、CO₂培养箱(Espec)中静置1小时进行硬化。

(2)与甘油-AGEs-BSA或对照BSA的抗体反应液的制备

将10μL实施例1中制备的甘油-AGEs-BSA(10mg/mL)或10μL对照BSA(10mg/mL)与磷酸缓冲生理盐水(PBS，和光)、90μL SJ-5(10mg/mL)或对照抗体(10mg/mL)加入1.5mL管(WATSON)中，室温静置10分钟。然后，使用离心分离机(Thermo Fisher Scientific)，14000rpm离心分离15分钟，回收上清。

(3)管腔形成试验

HUVEC(人脐带静脉血管内皮细胞，日本国立研究开发法人医药基盘健康营养研究所JCRB细胞库)使用10cm培养盘(康宁)用10mL HUVEC用培养基(KAC)来培养。

培养的HUVEC用10mL PBS洗涤后，添加1mL胰蛋白酶-EDTA(和光)，室温静置3分钟。静置后，确认HUVEC从培养盘脱离，通过添加10mL HUVEC用培养基，对胰蛋白酶-EDTA进行中和。中和后，全量移入50mL管(康宁)，使用离心分离机(久保田)，1500rpm进行3分钟离心分离。

离心分离后，舍弃上清，在沉淀的细胞中加入1mLHUVEC用培养基，再次使其悬浮。取10μL悬浮液，与10μL台盼蓝(NanoEnTek)混和，在血球计数板(NanoEnTek)中添加10μL。然后，用自动细胞计数器EVE(NanoEnTek)对活细胞数进行计数。将细胞悬浮液以成为2.5x10⁵细胞/mL的方式用HUVEC用培养基稀释，接种于(1)中制备的基质胶，400μL/孔。接种后，添加将(2)中制备的各反应液用PBS调整至100μg/mL的溶液，100μL/孔，用CO₂培养箱培养8小时。

将培养8小时后使用BZ-X710(基恩士)的20倍物镜进行明视场观察时HUVEC的形态示于图13。如该图所示，HUVEC在添加有对照BSA的组中确认到SJ-5抗体和对照抗体反应液基质胶基质中的管腔形成。但甘油-AGEs-BSA阻碍管腔形成。此外，该管腔形成的阻碍被与SJ-5抗体的反应液中和，对照抗体中未确认到该中和。根据该结果可见，SJ-5可中和甘油-AGEs-BSA对HUVEC产生的影响。

[实施例15]使用SJ-5抗体的由甘油-AGEs-BSA导致的内皮-间质转化的阻碍试验

(1)基质胶基质的制备与实施例14同样地进行操作。

(2)与甘油-AGEs-BSA或对照BSA的抗体反应液的制备

将10μL实施例1中制备的甘油-AGEs-BSA(10mg/mL)与90μL PBS、SJ-5(10mg/mL)或对照抗体(10mg/mL)加入1.5mL管(WATSON)。此外，加入90μL对照BSA(10mg/mL)的PBS溶液。将这些溶液室温静置10分钟。然后，使用离心分离机(Thermo Fisher Scientific)，14000rpm离心分离15分钟，回收上清。

(3)管腔形成的阻碍试验

HUVEC使用10cm培养盘用10mL HUVEC用培养基进行培养。

培养的HUVEC用10mL PBS洗涤后，添加1mL胰蛋白酶-EDTA，室温静置3分钟。静置后，确认HUVEC从培养盘脱离，通过添加10mL HUVEC用培养基，对胰蛋白酶-EDTA进行中和。中和后，全量移入50mL管，使用离心分离机，1500rpm进行3分钟离心分离。

离心分离后，舍弃上清，在沉淀的细胞中加入1mL HUVEC用培养基，再次使其悬浮。取10μL悬浮液，与10μL台盼蓝混和，在血球计数板中添加10μL。然后，用自动细胞计数器EVE对活细胞数进行计数。将细胞悬浮液以成为2.5x10⁵细胞/mL的方式用HUVEC用培养基稀释，接种于(1)中制备的基质胶，400μL/孔。接种后，添加(2)中制备的各反应液，100μL/孔，用CO₂培养箱培养8小时。

(4)细胞的回收

将各个孔用1mL的PBS洗涤三次，添加细胞回收溶液(康宁)，500μL/孔。

用Bluechip(WATSON)刮取细胞和基质胶基质，在1.5mL管中回收，用500μL的细胞回收溶液再次对孔进行冲洗，移入1.5mL管。将1.5mL管颠倒混和5次后，冰上静置1小时，确认基质胶基质完全分解。基质胶基质分解后，在4℃、800rpm进行离心分离，舍弃上清。将沉淀的细胞轻柔地悬浮在1mL冰冷的PBS中，在4℃、800rpm进行离心分离，舍弃上清，将再次沉淀的细胞轻柔地悬浮在1mL冰冷的PBS中，4℃、800rpm进行离心分离。

(5)mRNA回收

mRNA回收使用用于RT-PCR的CellAmp^TM DirectRNA Prep试剂盒(Takara)来进行。实际操作如下述所示。

离心分离，在沉淀的细胞中添加125μL试剂盒所附CellAmp清洗缓冲液，使其混和。300xg进行5分钟离心分离，除去上清，在各管中添加49μL试剂盒所附CellAmp处理缓冲液和1μL用于Direct RNA Prep的DNase I。室温静置5分钟后，移入PCR管(日本Genetics)，使用热循环仪(日本Genetics)，75℃静置5分钟，从而得到mRNA。

(6)逆转录反应

逆转录反应使用PrimeScript^TMRT Master Mix(Takara)来进行。实际操作如下述所示。将1μL通过(5)得到的mRNA、2μL 5×PrimeScript RT Master Mix和7μL Master Mix所附的无RNase dH₂O在PCR管中混和，使用热循环仪，37℃15分钟、85℃5秒进行反应。

(7)实时PCR

实时PCR使用Luna Universal qPCR Master Mix(BioLabs)来进行。将通过(6)得到的逆转录反应产物用90μL超纯水(Thermo Fisher Scientific)稀释。稀释后，按照下表的组成制备反应液，添加于384孔板(日本Genetics)。

[表2]

Luna Universal qPCR Master Mix(Luna)	5.5μL
		正向引物(10μM)	0.5μL
反向引物(10μM)	0.5μL
		逆转录反应物	4.5μL

引物使用委托株式会社Fasmac合成下述序列而获得的引物。

人α-SMAα-SMA

正向：CGGCTTTGCTGGGGACGAT

反向：CAGGGGCAACACGAAGCTCAT

人CD31

正向：ATTGCAGTGGTTATCATCGGAGTG

反向：CTCGTTGTTGGAGTTCAGAAGTGG

人β-肌动蛋白

正向：CTGGAACGGTGAAGGTGACA

反向：AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA

添加后，使用QuantStudio^TM 12KFlex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行实时PCR，对基因表达量进行定量。

已知CD31是内皮细胞的标志物，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是间质细胞的标志物(非专利文献14，图2等)。通过以β-肌动蛋白的表达量为内标计算α-SMA和CD31的表达量从而进行评价的图表示于图14和图15。由图14可见，通过添加甘油-AGEs-BSA，α-SMA的表达量增加。此外，该作用可能被SJ-5抑制，而对照抗体中并未确认到抑制。此外，由图15可见，关于CD31，通过添加甘油-AGEs-BSA，CD31的表达量降低。此外，该作用可能被SJ-5抑制，而对照抗体中并未确认到抑制。α-SMA的表达量增加和CD31的表达量降低是在血管内皮细胞发生向间质系细胞的转化的内皮-间质转化中确认到的作用。根据这些结果，确认甘油-AGEs-BSA具有引起内皮-间质转化的作用，SJ-5可抑制该作用。

[实施例16]甘油-AGEs-Z-Lys的分离纯化(高纯度化)

将实施例2中作为沉淀物获得的甘油-AGEs-Z-Lys溶解在0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)中，制备50mg/mL的试样溶液。然后，用孔径0.2μm的针头过滤器(Millex-LG，默克)过滤，将滤液作为液相色谱质谱分析仪(LC/MS)的试样。LC/MS的LC部和MS部与实施例12同样地构成。移动相购买的是富士胶片和光纯药的HPLC等级的试剂。移动相A设为10mL 1M乙酸铵溶液与990mL蒸馏水混合而成的10mM乙酸铵水溶液，移动相B设为乙腈。分析时间0-2分钟时，以移动相A:B＝100:0-85:15的浓度梯度流下。分析时间2-15分钟时，以移动相A:B＝85:15-70:30的浓度梯度流下；15-17分钟时，以移动相A:B＝70:30-10:90流下。色谱柱使用ZORBAXSB-C18(150×9.4mm，安捷伦科技)，将流速设为4mL/分钟。将50μL过滤后的试样溶液注入LC/MS装置，用二极管阵列检测器(260nm)和MS(阳离子检测)检测甘油-AGEs-Z-Lys的峰。分析时间12.3分钟时，观察到基因UV吸收性的峰，该峰含有m/z＝691.3的[M+Na]⁺。因此，通过以m/z＝691为扳机进行MS分离收集，回收保持时间12.3分钟的峰。以后，将该峰称为GAL691。将LC/MS的分析结果示于图16(二极管阵列检测(260nm))、图17(UV图谱)和图18(MS图谱)。

将分离收集溶液所含的乙腈用旋转蒸发仪(东京理化器械)除去。对于5mL残渣溶液，加入1mL 10％TFA水溶液，颠倒混和。然后，室温离心分离10分钟(12,000×g)，将上清除去。在得到的沉淀物中加入超纯水(5mL)，再次进行离心分离，将上清除去。将该操作合计实施3次，从而对沉淀进行洗涤。洗涤后的沉淀风干后，测定干重(1mg)，冷藏保存。

[实施例17]甘油醛来源吡啶鎓化合物(Lys-羟基-短杆菌酪肽)的制备

Lys-羟基-短杆菌酪肽可以通过公知的方法来制备(非专利文献12)。具体地，通过以下方法制备Lys-羟基-短杆菌酪肽。

(1)Lys-羟基-短杆菌酪肽反应溶液的制备

甲醇(富士胶片和光纯药)、二亚乙基三胺-N,N,N’，N”，N”-五乙酸(DTPA，同仁化学研究所)、N^α-乙酰基-L-赖氨酸(Ac-Lys-OH，东京化成工业)、DL-甘油醛(DL-GLA，NacalaiTesque)通过购买获得。

在50mL的离心管中将磷酸缓冲液(0.267M，pH10.5，30mL)、甲醇(10mL)混合(含有25％甲醇的0.2M磷酸缓冲液)。对于36mL上述溶液，加入DTPA(15.7mg)和DL-GLA(356.7mg)，利用涡旋混合器使其溶解。然后，加入Ac-Lys-OH(799.6mg)，搅拌至溶解(溶液中的DTPA的浓度：1mM，DL-GLA的浓度：110mM，Ac-Lys-OH的浓度：118mM)。进一步，用Parafilm(商标)等膜将管的盖子密封，以使管内的液体不会蒸发，37℃温育9天。其中，在反应第3天和第6天的反应液中补加260mg、196mg DL-GLA并使其溶解。得到的反应溶液4℃保存。

(2)Lys-羟基-短杆菌酪肽的分离纯化

Lys-羟基-短杆菌酪肽反应溶液用孔径0.2μm的针头过滤器(Millex-LG，默克)过滤，将滤液作为液相色谱质谱分析仪(LC/MS)的试样。LC/MS的LC部和MS部与实施例12同样地构成。移动相购买的是富士胶片和光纯药的HPLC等级的试剂。移动相A设为10mL 1M乙酸铵溶液与990mL蒸馏水混合而成的10mM乙酸铵水溶液，移动相B设为乙腈。在分析时间0-8分钟时，以移动相A:B＝97:3-95:5的浓度梯度流下。在分析时间8-10分钟时，以移动相A:B＝95:5-10:90的浓度梯度流下；在10-13分钟时，以移动相A:B＝10:90流下。色谱柱使用ZORBAXSB-C18(150×9.4mm，安捷伦科技)，将流速设为4mL/分钟。将50μL过滤后的试样溶液注入LC/MS装置，用二极管阵列检测器(269nm)和MS(检测阳离子)检测Lys-羟基-短杆菌酪肽的峰。分析时间5.7分钟时，观察到了具有UV吸收性的峰，该峰包含m/z＝467.3的阳离子。因此，通过以m/z＝467为扳机进行MS分离收集，回收保持时间5.7分钟的峰。分离收集后的溶液用旋转蒸发仪(东京理化器械)浓缩干燥固化。得到的沉淀在-20℃保存。

(3)Lys-羟基-短杆菌酪肽的结构确认

得到的沉淀(10mg)溶解在重水(0.6mL，富士胶片和光纯药)中，移入外径5mm的核磁共振(NMR)用样品管(SHIGEMI)。然后，用NMR装置(AVANCE III HD，500MHz，CryoProbe搭载型，Bruker)对Lys-羟基-短杆菌酪肽的结构进行确认。利用¹H-NMR和¹³C-NMR的图谱数据确定全部氢和碳的归属。此外，通过分析¹H-¹HCOSY、¹H-¹³CHSQC、¹H-¹³CHMBC图谱，确认归属的恰当性。将Lys-羟基-短杆菌酪肽的结构示于以下。

[化27]

[实施例18]利用竞争ELISA评价新的单克隆抗体与GAL691、Lys-羟基-短杆菌酪肽的反应性

(1)试剂制备

将下述试剂溶解在RO水中制成1L，作为包被溶液使用。

碳酸钠(富士胶片和光纯药) 1.59g

碳酸氢钠(富士胶片和光纯药) 2.93g

将BSA(5g，Sigma-Aldrich)溶解在PBS(500mL)中，作为封闭溶液使用。

将50mM Tris(6.1g，富士胶片和光纯药)溶解在RO水(约900mL)中，用6N盐酸(富士胶片和光纯药)调节至pH7.4。在得到的溶液中加入甘油(1mL，Sigma-Aldrich)、吐温20(1mL，Nacalai Tesque)，用RO水定容至1L。将得到的溶液作为稀释溶液使用。

将下述试剂溶解在RO水中制成1L，进一步加入9L RO水后，加入吐温20(5mL)。将得到的溶液作为洗涤溶液使用。

氯化钠(富士胶片和光纯药) 80g

磷酸二氢钾(富士胶片和光纯药) 2g

磷酸氢二钠12水合物(富士胶片和光纯药) 29g

(2)抗原的固相化

将在包被溶液中制备成1μg/mL的含有甘油醛来源AGEs的BSA(原液：10mg/mLPBS溶液)的溶液加入至96孔微量滴定板(COSTAR)，每孔100μL，4℃温育一夜。

(3)封闭

进行了固相化处理的各孔用洗涤溶液(300μL)洗涤3次，加入封闭溶液(200μL)，室温放置1小时。

(4)竞争实验

将GAL691(通过实施例16制备)、Lys-羟基-短杆菌酪肽(通过实施例17制备)分别溶解在磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4)中，制备10mg/mL溶液。然后，通过用稀释溶液进行稀释，制作0.625～10mg/mL的2倍稀释系列(5点)的试样溶液。不含试样的空白溶液也同样地制备稀释溶液。将POD标记的新的单克隆抗体(SJ-5)溶液用含有BSA(1mg/mL，富士胶片和光纯药)的稀释溶液稀释12,000倍，作为POD标记的SJ-5抗体稀释溶液。

将用封闭溶液处理过的各孔用洗涤溶液(300μL)洗涤3次，加入2倍稀释系列的试样溶液(各50μL)和POD标记的SJ-5抗体稀释溶液(50μL)，用平板混合器搅拌2分钟后，25℃温育1小时。

(5)显色

用洗涤溶液(300μL)洗涤3次后，加入100μL的底物溶液(ELISA POD底物TMB试剂盒(Popular)，Nacalai Tesque)，室温、避光条件下温育10分钟。然后，加入2N硫酸(50μL)停止显色。

(6)吸光度测定和数据分析

用酶标仪(Cytation5，BioTek)测定主波长450nm和副波长650nm的吸光度，从主波长的吸光度减去副波长的吸光度。将GAL691与Lys-羟基-短杆菌酪肽的吸光度变化作为相对于空白溶液的吸光度的相对值来表述。将其结果示于图19。GAL691中，吸光度发生浓度依赖性地降低，而Lys-羟基-短杆菌酪肽中未观察到吸光度的降低。因此可见，新的单克隆抗体SJ-5是与新的结构体甘油醛来源AGEs结合、但不识别作为公知的甘油醛来源AGEs的Lys-羟基-短杆菌酪肽的抗体。

[实施例19]GAL691和公知的甘油-AGEs的自由基测定

对于实施例16中制备的GAL691(10mg/mL的PBS溶液)，利用ESR进行自由基的分析。除了以下的参数以外，ESR的测定条件与实施例10是同样的：

采样时间(Sampling time):0.06s；

场调制振幅(Field modulation Amplitude):0.2mT；以及

微波功率(Microwave power):15mW。

磁场用α,γ-双二亚苯基-β-苯基烯丙基(BDPA)的g值(2.00264)来校正。

根据图20A的ESR图谱，GAL691检测到显示g＝2.00328的有机自由基的信号。该信号由于10％(w/v)的亚硫酸钠(Na₂SO₃，富士胶片和光纯药工业)的添加而大幅衰减(图20B)。此外，GLAP(实施例12)、Lys-羟基-短杆菌酪肽(实施例17)(各为10mg/mL的PBS溶液)也同样地供于ESR测定，结果，无法检测到来源于自由基的信号(图20C、图20D)。根据以上的结果，确认GAL691具有在公知的甘油-AGEs中未确认到的自由基性。

[实施例20]光照射对GAL691的氧化活性的影响

AGEs被指出在眼睛的玻璃体、布鲁赫膜、晶状体等组织中累积，与包括糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性的各种疾病相关联(Yokoi等，Br.J.Ophthalmol.,2005,89,673-675；Glenn等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,2009,50(1),441-451；Nagaraj等，AminoAcids,201242,1205-1220；Katagiri等，Int.Ophthalmol.,2017,38(2),1-9；Kanda等，Sci.Rep.,2017,7,16168)。此外，眼睛是通过将光转变为电信号而将信息传递至脑的重要器官。因此，关注AGEs与光的关系，研究了光对GAL691的氧化活性的影响。

对于实施例16中制备的GAL691和Z-Lys(各2mg/mL的PBS溶液)，与实施例11同样地研究了对于DAB的氧化活性。此时，在白色LED的照射下(3000lux)反应一夜。

如图21所示，与GAL691单独处理(避光条件下)相比，DAB的氧化产生的产物在用GAL691和光照射下处理时增加2.6倍。因此可见，GAL691的氧化活性在光照射下变得更强。

[实施例21]GAL691的光敏作用导致的单线态氧的生成

对于实施例16中制备的GAL691，研究了光敏作用导致的单线态氧的生成能力。作为GAL691的对照区使用的N-α,N-ε-二(苄氧羰基)-L-赖氨酸(Z-Lys(Z)-OH)从渡边化学工业购买。

利用0.6mL容量微量管(WATSON)将25μL的GAL691或Z-Lys(Z)-OH(10mM，PBS溶液)、12.5μL的4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶(4-OH-TEMP，东京化成工业，400mM，PBS溶液)、12.5μL的PBS混合，制备反应溶液。4-OH-TEMP捕捉单线态氧，变为一氧化氮自由基，因此经常用于使用ESR的单线态氧的检测(Nakamura等，J.Clin.Biochem.Nutr.,2011,49(2),87-95)。使用便携型LED光源(美馆成像)，对反应溶液照射1小时UV365nm、蓝色470nm、绿色530nm或红色630nm的光。然后，使用各反应溶液的一部分(50μL)进行ESR的测定。除了一部分参数以外，ESR的测定在与实施例10同样的条件下实施。改变的测定参数如下：

场中心(Field center):3354.47G；场宽(Field width):70G；采样时间(Samplingtime):0.06s；场调制振幅(Field modulation amplitude):0.1mT；微波功率(Microwavepower):15mW。

为了对生成的一氧化氮自由基的浓度进行定量，进行以下的分析。首先，将观察到的一氧化氮自由基的图谱用Xepr软件(Bruker)内的SpinFit模块模拟，鉴定自由基种类(g＝2.0058，I＝1，A_N＝17.05G)。然后，用SpinCount模块求出模拟的一氧化氮自由基的自旋浓度(μM)。

如图22所示，可见GAL691通过尤其是蓝色光照射显著生成一氧化氮自由基。因此，表明GAL691是通过光敏作用生成单线态氧的甘油醛来源AGEs。

[实施例22]GAL691与已知的甘油醛来源AGEs的借助于光敏作用的单线态氧生成量的比较

对于GAL691(实施例16)、GLAP(实施例12)、Lys-羟基-短杆菌酪肽(实施例17)，将蓝色光照射下单线态氧的生成量进行比较。试样的制备方法、光源、ESR分析条件、ESR图谱分析条件以实施例21为准。测定试样的制备中，制备作为单线态氧的捕捉剂的虾青素(富士胶片和光纯药)为10mM的二甲基亚砜(DMSO，富士胶片和光纯药)溶液，代替PBS而加入12.5μL(终浓度2.5mM)。对于未经虾青素处理的试样，不加入PBS，而是加入12.5μL DMSO。

将其结果示于图23。关于蓝色光照射导致的单线态氧的生成量，与GLAP、Lys-羟基-短杆菌酪肽相比，GAL691多了9倍。此外，由于GAL691和光照射而产生的单线态氧被虾青素捕捉。从这些结果出发，表明与公知的甘油醛来源AGEs相比，GAL691是表现强的光敏作用的新的甘油醛来源AGE。

[实施例23]GAL691的超氧阴离子生成能力的研究

对于GAL691(实施例16)、GLAP(实施例12)、Lys-羟基-短杆菌酪肽(实施例17)，将蓝色光照射下超氧阴离子的生成量进行比较。超氧阴离子的生成通过使用1-羟基-4-膦酰基氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶(PPH)测定ESR来确认。即，捕捉了超氧阴离子的PPH变为稳定的氮氧化物，因此通过ESR测定其自由基浓度，作为超氧阴离子量进行评价(Dikalov等，Biochemical and Biophysical Research Communications,1998,248,211-215)。对于PPH-HCl(Enzo Life Sciences)，制备10mM的PBS溶液(pH7.4)。在0.6mL容量的微量管中加入各25μL的GAL691、Z-Lys(Z)、GLAP、Lys-羟基-短杆菌酪肽(10mM的PBS溶液)。然后，加入12.5μL的PPH溶液、12.5μL的含有DTPA(0.4mM)的PBS，制备合计50μL的反应溶液。然后，进行1小时蓝色光照射，测定ESR。其中，光源、ESR分析条件、ESR图谱分析条件与实施例21是同样的，仅Microwave power改为5mW。

将结果示于图24。未照射光的情况下(避光条件下)，GAL691与其他甘油醛来源AGEs相比生成4倍量以上的超氧阴离子。进一步，其生成量由于蓝色光照射而增加约3倍。因此，表明GAL691是不依赖光地生成超氧阴离子的甘油醛来源AGE，其生成量由于光而增加。

[实施例24]免疫抗原的制备

将实施例2中作为沉淀物获得的甘油-AGEs-Z-Lys溶解在0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)中，制备50mg/mL的试样溶液。然后，用孔径0.2μm的针头过滤器(Millex-LG，默克)过滤，将滤液作为LC/MS的试样。LC/MS的分析条件与实施例16是同样的。对含有作为新的结构体的GAL691的保持时间10-16分钟的组分进行分离收集。分离收集溶液所含的乙腈用旋转蒸发仪(东京理化器械)除去。对于残渣溶液(5mL)，加入10％TFA水溶液(1mL)，颠倒混和。然后，室温离心分离10分钟(12,000×g)，将上清除去。在得到的沉淀物中加入至超纯水(5mL)，再次进行离心分离，将上清除去。将该操作合计实施3次，从而对沉淀进行洗涤。洗涤后的沉淀风干后，测定干重，冷藏保存。每1mL 50mg/mL的试样溶液得到20mg沉淀。

将干燥后的沉淀溶解在0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)中，将终浓度设为40mg/mL(A-峰值溶液)。进一步将该溶液用磷酸缓冲生理盐水(PBS，pH7.4)稀释10倍，将终浓度设为4mg/mL。载体蛋白的溶液如下制备。将牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)冻干粉末溶解在PBS中，将终浓度设为10mg/mL。在1.5mL容量的Eppendorf Safe-Lock管(Eppendorf)内将4mg/mL的A-峰值溶液(500μL)和10mg/mL的BSA溶液(200μL)混合。然后，将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，Thermo Scientific)溶解在超纯水中，制作10mg/mL水溶液。在A-峰值与BSA的混合溶液(700μL)中迅速添加10mg/mL EDC水溶液(100μL)，颠倒混和后，室温温育过夜。

反应结束后，立即用Zeba Spin Desalting Columns(Zeba旋转脱盐柱)(7KMWCO，Thermo Scientific)对反应溶液进行凝胶过滤。进一步使用Slide-A-Lyzer MINI透析设备(3.5KMWCO，Thermo Scientific)，在低温下(4℃)透析。透析外液设为PBS。透析开始3小时后，对外液进行替换，进一步进行一夜的透析。

透析结束后，回收透析设备内的溶液，用Amicon Ultra-0.5(30KMWCO，默克)浓缩。用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo Scientific)求出交联了A-峰值的BSA(A-峰值-BSA)的蛋白质浓度，用PBS调整为任意蛋白质浓度。A-峰值-BSA作为小鼠单克隆抗体制作中的免疫抗原使用。

[实施例25]单克隆抗体的制作(PB-1)

(1)对小鼠的免疫

作为免疫抗原，将A-峰值-BSA(4mg/mL)与等体积的弗氏完全佐剂(AdjuvantComplete Freund)(BD)混合，制备乳浊液(抗原的浓度：2mg/mL)，在10只BALB/c小鼠的背部皮下进行初次免疫(抗原的量：200μg/只)。使用将A-峰值-BSA(1mg/mL)与等体积的弗氏完全佐剂(BD)混合而制备的乳浊液(抗原的浓度：0.5mg/mL)，每隔一周进行追加免疫(抗原的量：50μg/只)。从初次免疫开始6次免疫后，从尾静脉进行采血，进行抗体效价的确认。对于抗体效价高的样品，用追加免疫用的抗原(抗原的量：50μg/只)在小鼠的腹腔内进行最终给药，其3天后将脾脏摘下用于细胞融合。

(2)抗体效价的测定

通过ELISA评价抗血清的效价。在96孔微量滴定板(NUNC)中以5μg/mL的浓度加入作为免疫抗原的A-峰值-BSA，50μL/孔，4℃固相化一夜。用含有0.05％(v/v)吐温20的PBS(PBS-T)洗涤3次后，用含有0.5％(w/v)明胶的PBS-T封闭1小时。抗血清从500倍开始每次5倍进行梯度稀释，制备直至1562500倍的稀释系列，然后加入抗原固相化平板中，50μL/孔，静置1小时。洗涤后，加入用0.1％明胶PBS-T稀释10000倍的二抗(辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG(KPL))，50μL/孔，静置1小时。洗涤后，在各孔中添加用含有0.02％(w/v)的过氧化氢的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)调整至0.5mg/mL的邻苯二胺溶液(100μL)，25℃静置20分钟后，在各孔中添加2N硫酸溶液(50μL)使显色反应停止。然后用酶标仪测定490nm的吸光度。其结果，将在抗血清的12500倍以上的稀释溶液中显示与抗原的显著反应性的小鼠用于细胞融合。

(3)脾脏细胞的制备和细胞融合

对从小鼠摘下的脾脏进行研磨，每1只制备约1×10⁸个脾脏细胞。对作为骨髓瘤细胞的P3U1进行培养，制备细胞融合当天活细胞率为95％以上的P3U1。将前述脾脏细胞与P3U1按5:1(细胞数之比)混合，利用50％(w/v)浓度的分子量4000的聚乙二醇进行细胞融合。融合后，用培养基洗涤细胞，使其悬浮在HAT培养基中，在96孔培养板的各孔中以成为1×10⁵个/孔的方式接种细胞，进行杂交瘤的选择培养。细胞融合第10天回收杂交瘤培养上清，进行培养上清中抗体效价的测定。

(4)产抗体阳性孔的筛选

回收细胞融合后第10天的培养上清，通过上述抗体效价测定方法进行产抗体阳性孔的筛选。选择A-峰值-BSA、含有甘油醛来源AGEs的KLH(甘油-AGEs-KLH)为阳性、BSA为阴性的克隆。其中，甘油-AGEs-KLH的制备方法示于实施例27。

(5)克隆

通过极限稀释法，对于对A-峰值-BSA特异性高的克隆进行克隆。即，将细胞用含有10％的FBS的RPMI培养基制备为10个/mL，添加在2块96孔培养板的各孔中，每孔200μL。10天后，对培养上清中A-峰值-BSA、甘油-AGEs-KLH为阳性、以及BSA为阴性进行确认，得到来源于各个孔的克隆。得到产生作为具有充分特异性的本发明的抗体的新的单克隆抗体PB-1的细胞。

(6)抗体的纯化

将产生新的单克隆抗体PB-1的细胞用含有10％的FBS的RPMI培养基培养后，用PBS洗涤，用无血清培养基(SFM培养基、GIBCO)培养5天～7天，得到培养上清。对于培养上清，用蛋白G柱(GE医疗)纯化IgG组分，得到作为具有充分特异性的本发明的抗体的、新的单克隆抗体PB-1。

[实施例26]单克隆抗体PB-1的解离常数测定

对于单克隆抗体PB-1，通过以下的方法测定解离常数(K_d值)。将A-峰值-BSA用10mM乙酸钠溶液(pH5.0)稀释，制备终浓度50μg/mL的配体溶液。关于配体的固定化和K_d值的计算，使用Biacore T200(GE医疗)。使用胺偶联试剂盒(GE医疗)，将配体溶液固定在感应芯片CM5(GE医疗)上(最终固定量72RU)。然后，用电泳缓冲液HBS-P+(GE医疗)制作0.1953～50nM的PB-1抗体稀释溶液，得到传感图线。

作为拟合模型，采用1:1绑定(1:1binding)，对传感图线进行分析，结果，PB-1单克隆抗体的Kd值为4.15nM。

将通过常规方法确定的可变区的氨基酸序列示于图25。下划线部分表示CDR序列。

[实施例27]含有甘油醛来源AGEs的钥孔血蓝蛋白(甘油-AGEs-KLH)的制备

甘油-AGEs-KLH的制备方法以实施例1中记载的甘油-AGEs-BSA的制备方法为准。但不是使500mg的BSA、而是使167mg的血蓝蛋白、透孔螺(Macroschisma sinense，スカシガイ)制(KLH，富士胶片和光纯药)与DL-甘油醛反应(溶液中的KLH的浓度：8.3mg/mL)。

[实施例28]乙醇醛来源吡啶鎓化合物(GA-吡啶)的制备

GA-吡啶可以通过公知的方法来制备(Murakami等，Bioscience Biotechnologyand Biochemistry,2018,82(2),312-319)。具体地，通过以下的方法制备GA-吡啶。

(1)GA-吡啶反应溶液的制备

N^α-乙酰基-L-赖氨酸(Ac-Lys-OH，东京化成工业)、乙醇醛二聚物(GA，Sigma-Aldrich)通过购买获得。在50mL的离心管中加入0.96g的GA(0.2M)，完全溶解在40mL的磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4)中。然后，加入0.75g的Ac-Lys-OH(0.1M)，搅拌至溶解。用Parafilm(商标)等膜将管的盖子密封，以使管内的液体不会蒸发，50℃温育3天。得到的反应溶液4℃保存。

(2)GA-吡啶的分离纯化

GA-吡啶反应溶液用孔径0.2μm的针头过滤器(Millex-LG，默克)过滤，将滤液作为液相色谱质谱分析仪(LC/MS)的试样。LC/MS的LC部和MS部与实施例12同样地构成。移动相购买的是富士胶片和光纯药的HPLC等级的试剂。移动相A设为将1mL甲酸与1000mL蒸馏水混合而得的0.1％甲酸水溶液，移动相B设为将500mL乙腈、500mL蒸馏水、1mL甲酸混合而得的50％乙腈/0.1％甲酸溶液。分析时间0-10分钟时，以移动相A:B＝100:0-90:10的浓度梯度流下。分析时间10-12分钟时，以移动相A:B＝90:10-0:100的浓度梯度留下；12-15分钟时，以移动相A:B＝0:100流下。在35℃使用ZORBAXSB-C18(150×9.4mm，安捷伦科技)色谱柱，将流速设为4mL/分钟。将80μL过滤后的试样溶液注入LC/MS装置，用二极管阵列检测器(290nm)和MS(阳离子检测)检测GA-吡啶的峰。分析时间6分钟时，观察到了具有UV吸收性的峰，该峰含有m/z＝297.1的阳离子。因此，通过以m/z＝297为扳机进行MS分离收集，回收保持时间6分钟的峰。分离收集后的溶液用旋转蒸发仪(东京理化器械)浓缩干燥固化。得到的沉淀在-20℃保存。

(3)GA-吡啶结构的确认

得到的沉淀(4.7mg)溶解在重水(0.6mL，富士胶片和光纯药)中，移入外径5mm的核磁共振(NMR)用样品管(SHIGEMI)。然后，用NMR装置(AVANCE III HD，500MHz，CryoProbe搭载型，Bruker)确认GA-吡啶的结构。将得到的¹H-NMR图谱数据与非专利文献(Nagai等，Journal of Biological chemistry,2002,277(50),48905-48912)进行比较，确定全部氢的归属。此外，通过对¹H-¹³CHSQC图谱进行分析确认归属的恰当性。将GA-吡啶的结构示于下文。

[化28]

[实施例29]乙二醛来源赖氨酸二聚物(GOLD)的制备

GOLD(Wells-Knecht等，J.Org.Chem.1995,60,6264-6247)通过以下的方法制备。

(1)反应溶液的制备

N^α-乙酰基-L-赖氨酸(Ac-Lys-OH，东京化成工业)、40％乙二醛溶液(Sigma-Aldrich)通过购买获得。使188mg的Ac-Lys-OH溶解在磷酸缓冲液(0.5M，pH7.4，1mL)中，制备1M溶液。在微量管内，将1M Ac-Lys-OH溶液(500μL)、40％乙二醛溶液(73μL)、0.5M磷酸缓冲液(427μL)混合，用涡旋混合器搅拌。然后，将管密闭，95℃加热5分钟。得到的反应溶液4℃保存。

(2)GOLD的分离纯化

GOLD反应溶液用孔径0.2μm的针头过滤器(Millex-LG，默克)过滤，将滤液作为液相色谱质谱分析仪(LC/MS)的试样。LC/MS的LC部和MS部与实施例12同样地构成。移动相购买的是富士胶片和光纯药的HPLC等级的试剂。移动相A设为将1mL甲酸与1000mL蒸馏水混合而得的0.1％甲酸水溶液，移动相B设为将500mL乙腈、500mL蒸馏水、1mL甲酸混合而得的50％乙腈/0.1％甲酸溶液。分析时间0-10分钟时，以移动相A:B＝95:5-70:30的浓度梯度流下。分析时间10-12分钟时，以移动相A:B＝70:30-0:100的浓度梯度流下；12-15分钟时，以移动相A:B＝0:100流下。35℃下，使用ZORBAXSB-C18(150×9.4mm，安捷伦科技)色谱柱，将流速设为4mL/分钟。将20μL过滤后的试样溶液注入LC/MS装置，用二极管阵列检测器(215nm)和MS(阳离子检测)检测GOLD的峰。分析时间4.2分钟时，观察到了具有UV吸收性的峰，该峰含有m/z＝411.2的阳离子。因此，通过以m/z＝411为扳机进行MS分离收集，回收保持时间4.2分钟的峰。分离收集后的溶液用旋转蒸发仪(东京理化器械)浓缩干燥固化。得到的沉淀在-20℃保存。

(3)GOLD的结构确认

得到的沉淀(6.7mg)溶解在重水(0.6mL，富士胶片和光纯药)中，移入外径5mm的核磁共振(NMR)用样品管(SHIGEMI)。然后，用NMR装置(AVANCE III HD，500MHz，CryoProbe搭载型，Bruker)确认GOLD的结构。对于¹H-NMR和¹³C-NMR的图谱数据，参照上述文献，确定全部氢和碳的归属。此外，通过对¹H-¹HCOSY、¹H-¹³CHSQC、¹H-¹³CHMBC图谱进行分析确认归属的恰当性。将GOLD的结构示于下文。

[化29]

[实施例30]利用ELISA竞争法确认新的单克隆抗体PB-1的特异性

(1)抗原的固相化

在96孔微量滴定板(Coster)的各孔中，加入100μL用包被溶液(实施例13)制备为1μg/mL的浓度的A-峰值-BSA或者甘油-AGEs-BSA，4℃固相化一夜。

(2)封闭

用含有0.05％(v/v)吐温20的PBS(PBS-T)洗涤3次后，用含有0.5％(w/v)明胶的PBS-T封闭1小时。

(3)竞争反应

将用含有0.1％(w/v)明胶的PBS-T稀释至10μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)、含有葡萄糖来源AGEs的BSA(Glu-AGEs-BSA)、含有果糖来源AGEs的BSA(Fru-AGEs-BSA)、含有乙醇醛来源AGEs的BSA(乙二醇-AGEs-BSA)、含有甘油醛来源AGEs的BSA(甘油-AGEs-BSA)、含有Nε-羧乙基赖氨酸的BSA(CEL-AGEs-BSA)、含有Nε-羧甲基赖氨酸的BSA(CML-AGEs-BSA)、含有乙二醛来源AGEs的BSA(GO-AGEs-BSA)、含有甲基乙二醛来源AGEs的BSA(MGO-AGEs-BSA)、A-峰值-BSA添加在抗原固相化平板中，各50μL，进一步加入50μL用含有0.1％(w/v)明胶的PBS-T稀释至0.05μg/mL的PB-1抗体，用平板混合器搅拌后，室温静置1小时。

(4)与检测用抗体的反应

洗涤后，加入用含有0.1％(w/v)明胶的PBS-T稀释至0.05μg/mL的过氧化物酶标记抗小鼠IgG(H+L)多克隆抗体、F(ab’)₂片段(KPL)，每孔100μL，室温静置1小时。

(5)显色和吸光度测定

洗涤后，在各孔中加入100μL ELISA POD底物TMB试剂盒(Nacalai Tesque)，室温下在暗处静置。10分钟后各加入50μL 2N硫酸，停止显色。用酶标仪(Cytation5，BioTek)测定主波长450nm和副波长650nm的吸光度，从主波长的吸光度减去副波长的吸光度。

图26A中显示的是，使用A-峰值-BSA作为固相化抗原时PB-1抗体的特异性的结果；图26B中显示的是，使用甘油-AGEs-BSA作为固相化抗原时PB-1抗体的特异性的结果。图表的纵轴用将对照BSA作为1时的吸光度变化来表示。将A-峰值-BSA和甘油-AGEs-BSA固相化的情况下也同样，作为新的单克隆抗体PB-1的特异性，乙二醇-AGEs-BSA、甘油-AGEs-BSA、A-峰值-BSA为阳性，Glu-AGEs-BSA、Fru-AGEs-BSA、CEL-AGEs-BSA、CML-AGEs-BSA、GO-AGEs-BSA、MGO-AGEs-BSA为阴性。

[实施例31]利用竞争ELISA评价新的单克隆抗体PB-1的反应性

(1)抗原的固相化

使用实施例13中记载的试剂进行竞争ELISA。将在包被溶液中制备为1μg/mL的A-峰值-BSA的溶液加入96孔微量滴定板(Costar)，每孔100μL，4℃温育一夜。

(2)封闭

将进行了固相化处理的各孔用洗涤溶液(300μL)洗涤3次，加入封闭溶液(200μL)，室温放置1小时。

(3)竞争实验

将GAL691(通过实施例16制备)、GLAP(通过实施例12制备)、Lys-羟基-短杆菌酪肽(通过实施例17制备)、GA-吡啶(通过实施例28制备)、GOLD(通过实施例29制备)、Z-Lys分别溶解在磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4)中，制备100mM溶液。然后，用含有BSA(1mg/mL，富士胶片和光纯药)的稀释溶液稀释10倍，制作10mM溶液。进一步，用10％(v/v)磷酸缓冲液和含有1mg/mL BSA的稀释液制作0.04、0.16、0.63、2.5mM的4倍稀释系列试样溶液。作为不含试样的空白溶液，制备将磷酸缓冲液同样地用含有1mg/mL BSA的稀释溶液稀释10倍的溶液。对于PB-1抗体，用含有1mg/mL BSA的稀释液制备0.1μg/mL溶液。

将用封闭溶液处理过的各孔用洗涤溶液(300μL)洗涤3次，加入4倍稀释系列的试样溶液(各50μL)和PB-1抗体稀释溶液(50μL)，用平板混合器搅拌2分钟后，室温温育1小时。

(4)与检测用抗体的反应

将竞争反应后的各孔用洗涤溶液(300μL)洗涤3次，加入用含有1mg/mL BSA的稀释溶液稀释至0.05μg/mL的过氧化物酶标记抗小鼠IgG(H+L)多克隆抗体、F(ab’)₂片段(KPL)，每孔100μL，室温静置1小时。

(5)显色

用洗涤溶液(300μL)洗涤3次后，加入100μL的底物溶液(ELISA POD底物TMB试剂盒(Popular)，Nacalai Tesque)，室温、避光条件下温育10分钟。然后，加入2N硫酸(50μL)停止显色。

(6)吸光度测定和数据分析

用酶标仪(Cytation5，BioTek)测定主波长450nm和副波长650nm的吸光度，从主波长的吸光度减去副波长的吸光度。将GAL691、GLAP、Lys-羟基-短杆菌酪肽、GA-吡啶、GOLD、Z-Lys的吸光度变化以相对于空白溶液吸光度的相对值的形式来表示。将其结果示于图27。GAL691中吸光度发生浓度依赖性地降低，而其他化合物中未观察到吸光度的降低。因此，可见新的单克隆抗体PB-1是与新的结构体甘油醛来源AGEs结合、而不识别作为公知的甘油醛来源AGEs的GLAP、Lys-羟基-短杆菌酪肽、作为公知的乙醇醛来源AGEs的GA-吡啶、作为乙二醛来源AGEs的GOLD的抗体。

多克隆

[实施例32]使用PB-1抗体抑制A-峰值-BSA导致的DAB氧化的试验

(1)反应溶液的制备

制备二氨基联苯胺(DAB，同仁化学)为5mg/mL的PBS溶液。A-峰值-BSA(2mg/mL，PBS溶液)的制备与实施例24是同样的。在0.6mL容量的微量管(WATSON)中加入10μLDAB溶液，进一步加入100μLPBS、PB-1抗体(1.8mg/mL)、或小鼠IgG同型对照(Ctrl-mIgG，Thermo FisherScientific)。用涡旋混合器搅拌后，加入10μL A-峰值-BSA溶液。将这些溶液用涡旋混合器搅拌后，照射白色LED(3000lux)一夜。对于光照射后的溶液，用涡旋混合器搅拌后，降低转速，将100μL回收在VIOLAMO96孔板(亚速旺)中。

(2)吸光度测定和数据分析

用酶标仪(Cytation5，BioTek)测定波长460nm的吸光度，检测氧化的DAB。将其结果示于图28。图表的纵轴作为相对于抗体未处理区(PBS添加区)中检测到的氧化型DAB的相对值来表示。与PBS处理区、Ctrl-mIgG处理区相比，PB-1抗体处理区中氧化型DAB大幅减少。根据该结果可见，PB-1抗体通过与新的结构体甘油醛来源AGEs结合，能够抑制新的结构体导致的DAB的氧化作用。

[实施例33]SJ-5抗体与抗GA-吡啶单克隆抗体的交叉竞争

作为乙醇醛来源AGEs的GA-吡啶已由Nagai等人报告(Nagai等，Journal ofBiological chemistry,2002,277(50),48905-48912)，针对GA-吡啶的单克隆抗体(克隆名2A2)也已构建。因此，对于新构建的SJ-5抗体、PB-1抗体和抗GA-吡啶抗体2A2的交差性，用竞争ELISA进行了研究。对于竞争ELISA中使用的一部分试剂，与实施例13同样地制备。

(1)抗原的固相化

将在包被溶液中制备为1μg/mL的A-峰值-BSA溶液加入96孔微量滴定板(Costar)，每孔100μL，4℃温育一夜。

(2)封闭

将进行了固相化处理的各孔用洗涤溶液(300μL)洗涤3次，加入溶解有0.5％明胶的含有0.05％吐温20的PBS(PBS-T)(200μL)，室温静置1小时。

(3)竞争实验

将PB-1抗体、小鼠IgG同型对照(Ctrl-mIgG，Thermo Fisher Scientific)、抗GA-吡啶抗体2A2(Cosmo Bio)用含有0.1％明胶的PBS-T稀释，制作4倍稀释系列(0.049～50μg/mL)。此外，对于HRP标记SJ-5抗体(实施例4)，用含有0.1％明胶的PBS-T稀释10000倍。

将用封闭溶液处理过的各孔用洗涤溶液(300μL)洗涤3次，加入4倍稀释系列的试样溶液(各50μL)和HRP标记SJ-5抗体稀释溶液(50μL)，用平板混合器搅拌2分钟后，室温温育1小时。

(4)显色

用洗涤溶液(300μL)洗涤3次后，加入100μL的底物溶液(ELISA POD底物TMB试剂盒(Popular)，Nacalai Tesque)，室温、避光条件下温育10分钟。然后，加入2N硫酸(50μL)停止显色。

(5)吸光度测定和数据分析

用酶标仪(Cytation5，BioTek)测定主波长450nm和副波长650nm的吸光度，从主波长的吸光度减去副波长的吸光度。将其结果示于图29。A-峰值-BSA与SJ-5抗体的反应中，由于PB-1的添加，PB-1的吸光度发生浓度依赖性地减少。另一方面，Ctrl-mIgG、抗GA-吡啶抗体2A2中未观察到吸光度的减少，没有交叉竞争。因此，表明SJ-5抗体与PB-1抗体为识别同一表位的抗体，而抗GA-吡啶抗体是不识别SJ-5抗体的表位的抗体。

[实施例34]视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)的紧密连接崩溃抑制试验

视网膜色素上皮细胞通过细胞间紧密连接而形成血-视网膜屏障，从而限制物质从脉络膜血管的移动，维持视网膜的功能。血-视网膜屏障的崩溃被认为是糖尿病性视网膜病变等疾病的原因，视网膜色素上皮细胞的紧密连接在视网膜的功能保持中是极为重要的(Willermain等，Int.J.Mol.Sci.,2018,19(4),pii:E1056.)。xCELLigence RTCA DP系统是孔底面设有电极的设备。该设备通过使微弱的电流流经孔底面，能够不对细胞的功能产生影响地测定孔底面的阻抗。已知阻抗由于细胞间紧密连接的形成而增大，由于紧密连接的崩溃而降低(Wittchen等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,2011,52(10),7455-63)。本实施例中，使用xCELLigence RTCA DP系统，确认视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)对于由A-峰值-BSA导致的紧密连接的影响，评价SJ-5抗体和PB-1抗体中的该抑制效果。

(1)细胞培养

在D-MEM(富士胶片和光纯药)中添加10％FBS(富士胶片和光纯药)，添加1％青霉素-链霉素(Nacalai Tesque)，制备DMEM培养基，ARPE-19细胞(ATCC)用DMEM培养基且使用10cm培养盘(康宁)进行培养。

(2)测定平板

将xCELLigence RTCA DP系统(ACEA Biosciences)设置在CO₂培养箱内，为了使其稳定化，在设置后放置一夜以上的状态下使用。细胞制备之前，在E检测板(E-plate)(ACEABiosciences)中添加DMEM培养基，50μL/孔，测定背景值。

(3)细胞制备

将上述(1)中培养的ARPE-19细胞的培养基除去，通过重复两次10mL的PBS(-)(富士胶片和光纯药)的添加/除去进行洗涤。添加1mL胰蛋白酶-EDTA(富士胶片和光纯药)，在CO₂培养箱(TAITEC)中37℃温育3分钟，从而使细胞分散。然后，添加10mL的DMEM培养基，对胰蛋白酶的活性进行中和。中和后的细胞分散液移入50mL的管(FALCON)中，使用离心分离机(久保田)，1500rpm离心分离5分钟。然后，舍弃上清，再次将沉淀悬浮在1mL的DMEM培养基中。取10μL再次悬浮的细胞分散液，与10μL台盼蓝(NanoEnTek)混和，在血球计数板(NanoEnTek)中添加10μL。然后，用自动细胞计数器EVE(NanoEnTek)对活细胞数进行计数。将细胞悬浮液以成为4.0x10⁵细胞/mL的方式用DMEM培养基稀释，接种在E-检测板(ACEABiosciences)中，80μL/孔。

(4)抗体和A-峰值-BSA的添加

使用xCELLigence RTCA DP系统每15分钟测定平板的阻抗，确认细胞对平板的粘附。细胞接种后，20～24小时后添加9μL的PB-1抗体(10mg/mL)、PB-1抗体(3mg/mL)、PB-1抗体(1mg/mL)、PB-1抗体(0.3mg/mL)、SJ-5抗体(10mg/mL)或PBS与1μL的A-峰值-BSA(10mg/mL)。对照则是20～24小时后添加10μL PBS。添加后也隔15分钟测定阻抗。

测定添加A-峰值-BSA 10～12小时后的阻抗，将以A-峰值-BSA添加组为0进行标准化的结果示于图30。如该图所示，确认到由于A-峰值-BSA的添加，阻抗显著降低。该阻抗的降低通过PB-1抗体的添加被显著抑制。此外，SJ-5抗体添加组中，在终浓度1mg/mL时确认到降低被抑制，但在PB-1抗体的添加中，在更低的浓度区域中也确认到比SJ-5抗体更强的抑制。根据以上的结果，提示：A-峰值-BSA诱导视网膜色素上皮细胞的紧密连接的崩溃，可以通过PB-1抗体和SJ-5抗体的添加来抑制这一现象。

[实施例35]使用PB-1抗体的由甘油-AGEs-BSA导致的血管内皮细胞管腔形成抑制的中和试验

(1)基质胶基质的制备

基质胶基质的制备与实施例14同样地进行操作。

(2)与甘油-AGEs-BSA的抗体反应液的制备

将10μL实施例1中制备的甘油-AGEs-BSA(10mg/mL)与10μL的磷酸缓冲生理盐水(PBS，富士胶片和光纯药)、90μL PB-1抗体(10mg/mL)或对照抗体(10mg/mL)加入1.5mL管(WATSON)中，室温静置10分钟。然后，使用离心分离机(Thermo Fisher Scientific)，14000rpm离心分离15分钟，回收上清。

(3)管腔形成阻碍试验与实施例14同样地进行操作。将培养8小时后HUVEC的形态示于图31。如该图所示，HUVEC在添加有对照BSA的组中的基质胶基质中确认到管腔形成。但甘油-AGEs-BSA阻碍管腔形成。此外，该管腔形成的阻碍被与PB-1的反应液中和。根据该结果可见，PB-1抗体可中和甘油-AGEs-BSA对HUVEC产生的影响。

[实施例36]糖尿病小鼠和对照小鼠的利用PB-1抗体的视网膜组织染色

(1)小鼠的饲养

购买妊娠13天的C57BL6/J小鼠(日本Clea)，得到幼鼠。对于糖尿病小鼠，用生理盐水(大冢制药)将链脲佐菌素(富士胶片和光纯药)以成为5mg/mL的方式溶解，对出生2天后的雄性幼鼠进行300μL皮下给药。对于对照小鼠，用生理盐水对出生2天后的雄性幼鼠进行300μL皮下给药。与母鼠同居4周后断乳，糖尿病小鼠用HFD32(日本Clea)饲养8周。对照小鼠用CE-2(日本Clea)饲养8周。

(2)解剖

将1.875mL的Domitor(日本全药工业)、2mL的咪达唑仑(SANDOZ)、2.5mL的Vetorphale(Meiji Seika Pharma)与18.625mL的生理盐水混和，制备三合一麻醉剂。用体重计(TANITA)测量小鼠的体重，按0.1mL/g用三合一麻醉剂进行腹腔内给药。麻醉效果通过后肢回缩反射的消失来确认，用镊子(夏目制作所)和剪刀(夏目制作所)开腹、开胸，将下腔静脉切断。通过从左心室用10mL生理盐水给药进行灌注，灌注后将眼球摘下。摘下的眼球浸入充满OCT化合物(日本樱花精细技术)的Cryomold(日本樱花精细技术)内，用液氮冷冻，从而制作新鲜冷冻块。制作后，保存于设为-80℃的深度冷冻器(Deep freezer)(ThermoFisher Scientific)。

(3)切片、染色

用设定为-30℃的冰箱(福岛工业)对丙酮(富士胶片和光纯药)进行16小时以上保温，制备冷丙酮。在PBS中添加0.1％的Triton X-100(Nacalai Tesque)，制备PBS-T。将新鲜冷冻块用Cryostat CM1950(徕卡)以10μm厚度切薄片。切薄片后的组织粘贴于MAS包覆载玻片(MAS Coat slide glass)(松波硝子工业)，干燥。干燥后，用冷丙酮温育10分钟，从而使组织固定。固定后，用PBS-T洗涤2次，每次10分钟。洗涤后，通过将Fc block(BioLegend)用溶解有5％的BSA(Sigma-Aldrich)的TBS-T稀释50倍来制备封闭液，室温温育30分钟，从而进行封闭。封闭后，制备将PB-1抗体(1mg/mL)或对照抗体(1mg/mL)用溶解有1％的BSA的TBS-T稀释500倍而得的一抗反应液，在设为4℃的冰箱(福岛工业)中温育一夜。一抗反应后，用PBS-T洗涤2次，每次10分钟。制备将Alexa594标记的山羊抗小鼠IgG H&L(Abcam)用溶解有1％的BSA的TBS-T稀释100倍而得的二抗反应液，避光条件下室温反应1小时。二抗反应后，用PBS-T洗涤2次，每次10分钟。在染色组织中添加作为包埋剂的VECTASHIELD(VectorLaboratories)，用盖玻片(松波硝子工业)封好。然后，用激光共聚焦显微镜(奥林巴斯)观察视网膜Alexa594的荧光。

(4)结果

将结果示于图32。可见，与对照小鼠相比，PB-1抗体牢固地与糖尿病小鼠的视网膜神经节细胞层、内颗粒层、外颗粒层、视网膜色素上皮细胞层结合。此外，用对照抗体确认糖尿病小鼠的染色性，结果，未获得同样的染色结果，因而可见，该染色性是PB-1抗体的可变区带来的特异性结合引起的。由这些结果可见，具有PB-1抗体的表位结构的AGE在生物体内是存在的，存在于糖尿病小鼠视网膜中的视网膜神经节细胞层、内颗粒层、外颗粒层、视网膜色素上皮细胞层。此外，可见PB-1抗体是用于从免疫染色学上确认新的结构体的存在的有用的工具。

[实施例37]使用PB-1抗体柱的人血清蛋白的纯化和利用免疫印迹试验(Westernblotting)的检测

(1)PB-1抗体柱的制作

将PB-1抗体的溶剂利用PD10柱(GE医疗)替换为偶联缓冲液(0.2M碳酸钠、0.5MNaCl，pH8.3)，制备1mL 10mg/mL PB-1抗体溶液。作为偶联载体，使用NHS-激活的琼脂糖4快流速(NHS-activated Sepharose 4Fast Flow)(GE医疗)。在1mL NHS-激活的琼脂糖4快流速中流过冰浴冷却的1mM HCl，然后立即与先前制备的10mg/mL PB-1抗体溶液混合，使用颠倒混合器(TAITEC)颠倒混和(4℃，一整夜)，从而使PB-1抗体固定于偶联载体。然后，按封闭用缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH8.0)、洗涤用缓冲液(0.1M乙酸钠、0.5M NaCl，pH5.0)的顺序各流过3mL，将该操作重复三次。最后流过10mL PBS对溶剂进行替换，然后4℃保存。

(2)使用PB-1抗体柱的人血清蛋白的纯化

作为纯化试样，使用人血清(Pool，池)(Cosmo Bio株式会社)。最初将10mL的人血清(Pool)用结合缓冲液(0.02M Tris-HCl、0.03mM NaCl，pH7.4)稀释7倍，使用30mL SP琼脂糖快流速(SP Sepharose Fast Flow)(GE医疗)，按照产品手册纯化。将得到的洗脱组分用结合缓冲液透析后，使用3mL蛋白G琼脂糖4快流速(Protein G Sepharose 4Fast Flow)(GE医疗)，按照产品手册纯化，将IgG去除。以得到的快流通组分为样品，使用1mL PB-1抗体柱纯化。通过纯化得到的各组分按照常规方法通过电泳(SDS-PAGE)进行分析。

将SDS-PAGE的结果示于图33。使样品(图中的样品)通过PB-1抗体柱后(图中的溢流道)，2次重复流下25mL结合缓冲液(图中的洗液1、洗液2)。然后，用10mL洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH3.0)将结合于PB-1抗体柱的蛋白质洗脱(图中的洗脱)。洗脱液中立即加入0.4mL的中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.0)进行中和，SDS-PAGE的结果表明，大部分杂蛋白被除去，纯化试样的纯度提高。

(3)使用PB-1抗体的免疫印迹试验

将用PB-1抗体柱纯化的蛋白质按照常规方法进行电泳(SDS-PAGE)，电转至PVDF膜，进行免疫印迹试验。抗体反应中，使用PB-1抗体作为一抗、使用过氧化物酶缀合的亲和纯化山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)作为二抗来进行。此外，为了区别二抗的结合导致的非特异性信号，也进行了仅使用二抗的抗体反应。接下来，使用ECL免疫印迹试验检测试剂(GE医疗)显色，检测蛋白质的条带。

仅使二抗反应的PVDF膜中，完全检测不到条带。另一方面，仅在使PB-1抗体反应的PVDF膜中检测到了条带(图34)。根据该结果可见，使用PB-1抗体的免疫印迹法可以检测人血清中存在的新的结构体修饰蛋白。

Claims (20)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其与式(XI)或(XII)的化合物、其阳离子自由基或其二价阳离子结合，

[化1]

式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

Q¹表示氢原子或-CH₂-X¹-Y¹基，

Q²表示氢原子或-CH₂-X²-Y²基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化2]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与式(I)或(II)的化合物、其阳离子自由基或其二价阳离子结合，

[化3]

式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化4]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基。

3.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs所含的表位结合，且为：

(1)重链可变区的互补决定区即VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3或轻链可变区的互补决定区即VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列包含如下的(1-1V)、(1-1L)、(1-2V)或(1-2L)的单克隆抗体或其抗原结合片段；

(1-1V)

(a)VH CDR1：序列编号：1所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(b)VH CDR2：序列编号：2所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，和

(c)VH CDR3：序列编号：3所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(1-1L)

(d)VL CDR1：序列编号：5所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(e)VL CDR2：序列编号：6所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，和

(f)VL CDR3：序列编号：7所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(1-2V)

(g)VH CDR1：序列编号：15所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(h)VH CDR2：序列编号：16所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，和

(i)VH CDR3：序列编号：17所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，或

(1-2L)

(j)VL CDR1：序列编号：19所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(k)VL CDR2：序列编号：20所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(l)VL CDR3：序列编号：21所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

或者

(2)关于与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合，与所述(1)的抗体或其抗原结合片段交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs所含的表位结合，且为：

(1)重链可变区的互补决定区即VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3和轻链可变区的互补决定区即VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列包含如下的(1-1)或(1-2)的单克隆抗体或其抗原结合片段；

(1-1)

(a)VH CDR1：序列编号：1所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(b)VH CDR2：序列编号：2所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(c)VH CDR3：序列编号：3所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(d)VL CDR1：序列编号：5所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(e)VL CDR2：序列编号：6所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，和

(f)VL CDR3：序列编号：7所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，或

(1-2)

(g)VH CDR1：序列编号：15所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(h)VH CDR2：序列编号：16所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(i)VH CDR3：序列编号：17所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(j)VL CDR1：序列编号：19所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(k)VL CDR2：序列编号：20所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

(l)VL CDR3：序列编号：21所示氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

或者

(2)关于与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合，与所述(1)的抗体或其抗原结合片段交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs所含的表位结合，且为：

(1)重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为

序列编号：4的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列、和/或序列编号：8的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，或

序列编号：18的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列、和/或序列编号：22的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列，

或者

(2)关于与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位的结合，为与所述(1)所述的抗体或其抗原结合片段交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，与甘油醛来源AGEs所含的表位结合。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体或sc(Fv)₂。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，为小鼠抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、或其抗原结合片段。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以1×10^-5M以下的解离常数即K_d值与甘油醛来源AGEs或乙醇醛来源AGEs的表位结合。

10.一种医药组合物，含有权利要求1～9中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

11.根据权利要求10所述的医药组合物，用于选自肥胖、糖尿病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性神经病变、糖尿病性心肌病、糖尿病血管并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性肾脏病变、糖尿病足病変、糖尿病酮症酸中毒、牙周病、年龄相关性黄斑变性、肺纤维化、特发性肺纤维化、细支气管周围纤维化、间质性肺疾病、肺癌、癌症纤维性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、急性下肢动脉栓塞、周围动脉疾病、小气道疾病、肺气肿、肾盂肾炎、肾小球硬化症、肾小球肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、糖尿病性肾病变、肾源性系统性纤维化、慢性肾病、特发性腹膜后纤维化、肾病、硬皮病、肾间质纤维化、女性不孕、多囊卵巢综合征、卵巢功能障碍、早期卵巢功能障碍、卵巢癌、乳腺癌、子宫体癌、前列腺癌、男性不育、肝病、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎、肝癌、动脉粥样硬化血栓性脑梗塞、动脉粥样硬化性动脉硬化、颈内动脉狭窄、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、心血管疾病、心绞痛、充血性心力衰竭、急性心力衰竭、慢性心力衰竭、缺血性心脏病、扩张型心肌病、心脏结节病、高血压、肺动脉高血压、肺心病、心肌炎、血管狭窄心脏纤维化、心肌梗死后心脏纤维化、心肌梗死后左心室肥大、类风湿性关节炎、生活方式相关疾病、血脂异常、阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、脑梗塞、脑肿瘤、脑血管障碍、葡萄膜炎、内分泌疾病、骨质疏松症、舌癌、口腔癌、咽癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、胰腺癌、视网膜色素变性、糖尿病性黄斑水肿、莱伯氏先天性黑蒙、斯特格病、厄舍综合征、无脉络膜症、杆体锥体营养不良、锥体营养不良、进行性视网膜膜萎缩、黄斑营养不良、脉络膜硬化、全脉络膜萎缩、囊样黄斑水肿、葡萄膜炎、视网膜脱离、黄斑裂孔、黄斑部毛细血管扩张症、绿内障、视神经病变、缺血性视网膜疾病、早产儿视网膜病、视网膜血管堵塞病和视网膜小动脉瘤的疾病的诊断、治疗或预防。

12.根据权利要求10所述的医药组合物，用于选自糖尿病、糖耐量异常、视网膜病、肾病、伴随糖尿病的并发症、周围神经病变、下肢坏疽、动脉硬化、血栓、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、癌症、不孕不育、多囊卵巢综合征、卵巢功能障碍、中枢神经障碍和包括阿尔茨海默氏病的神经变性疾病的疾病的诊断、治疗或预防。

13.根据权利要求12所述的医药组合物，疾病为选自黑色素瘤、肺癌和肝癌的癌症。

14.根据权利要求10所述的医药组合物，用于眼病的诊断、治疗或预防。

15.根据权利要求14所述的医药组合物，眼病选自糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、视网膜色素变性、糖尿病性黄斑水肿、莱伯氏先天性黑蒙、斯特格病、厄舍综合征、无脉络膜症、杆体锥体营养不良、锥体营养不良、进行性视网膜膜萎缩、年龄相关性黄斑变性、黄斑营养不良、脉络膜硬化、全脉络膜萎缩、囊样黄斑水肿、葡萄膜炎、视网膜脱离、黄斑裂孔、黄斑部毛细血管扩张症、绿内障、视神经病变、缺血性视网膜疾病、早产儿视网膜病、视网膜血管堵塞病和视网膜小动脉瘤。

16.一种核酸，编码权利要求1～9中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

17.一种表达载体，包含权利要求16所述的核酸。

18.一种宿主细胞，包含权利要求17的表达载体。

19.式(I)或(II)的化合物、其阳离子自由基、或其二价阳离子、或其盐：

[化5]

式中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基，

X¹和X²表示-O-或-NH-，

Y¹和Y²表示氢原子、保护基或下述基：

[化6]

R⁵和R⁶各自独立地选自氢原子、保护基和氨基酸残基数1～1000的肽基。

20.一种抗体的制造方法，包括：

1)使α位氨基被保护的赖氨酸与甘油醛反应而得到反应混合物，

2)对反应混合物进行分离，得到含有式(Ia)、(Ib)、(IIa)或(IIb)所表示的化合物的组分，

[化7]

式中，R¹、R³和R⁶为保护基，

3)使用该组分对动物进行免疫而得到以该组分为抗原的抗体。

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