ES2894837T3 - Composición con inmunogenicidad reducida - Google Patents
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Abstract
Una composición de suero antilinfocítico (ALS) dirigida contra linfocitos humanos, para el uso en la prevención del rechazo tardío de injertos en un paciente humano, en donde dicho ALS se produce en, y se obtiene a partir de, un mamífero no humano desprovisto de un gen que codifique una citidina-5'-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y desprovisto además de un gen que codifique una α-(1,3)-galactosiltransferasa funcional, comprendiendo dicho ALS anticuerpos policlonales dirigidos contra dichos linfocitos humanos, careciendo los anticuerpos policlonales de determinantes antigénicos de ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y α-1,3- galactosa.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición con inmunogenicidad reducida
Campo de la Invención
La presente invención se refiere al campo de la inmunología y más particularmente a sueros antilinfocíticos (ALS) y sueros antitimocíticos (ATG) y a su uso en medicina humana.
Descripción de la Técnica Relacionada
Se sabe en la técnica que el rechazo de aloinjertos implica principalmente a células T humanas activadas que, en contacto con antígenos celulares del donante, se transformaban en linfocitos efectores perjudiciales que destruyen las células del injerto.
Para asegurar un trasplante de órganos satisfactorio y una supervivencia de los injertos a largo plazo, se ha propuesto contrarrestar el efecto nocivo de las células T de los pacientes injertados con respecto al injerto mediante la administración de suero antilinfocítico (ALS) y globulina antitimocítica (ATG) (Mohty M y cols., Best Pract. Res. Clin. Haematol., junio 2010; 23 (2): 275-82).
Además, según una estrategia terapéutica diferente, se ha obtenido una reducción del efecto nocivo de las células T en pacientes injertados al usar anticuerpos monoclonales dirigidos a antígenos soportados por la membrana específicos. Vale la pena mencionar el uso de basiliximab, que es un anticuerpo monoclonal dirigido contra la subunidad alfa (CD25) del receptor de interleucina-2 (IL-2R) sobre linfocitos activados. También se puede citar el uso de alemtuzumab (comercializado como Campath, MabCampath o Campath-1H y actualmente bajo un desarrollo adicional como Lemtrada) que es un anticuerpo monoclonal dirigido contra la glicoproteína de la superficie celular (CD 52) presente sobre la superficie de linfocitos maduros.
En comparación notablemente con anticuerpos monoclonales tales como basiliximab o alemtuzumab, los ALS y ATG inhiben una pluralidad de receptores diferentes, provocando de ese modo un agotamiento marcado de los linfocitos T (S Louis y cols., Transplantation, 2007, vol. 83 : 712-721).
Así, se sabe en la técnica que los ALS y ATG pueden reducir la incidencia del rechazo agudo, pueden además tratar episodios de rechazo agudo, así como mejorar la supervivencia del injerto (Gaber AO y cols., Drugs. 16 abril 2010; 70 (6): 691-732; Lawen JG y cols., Transplantation 2003, 75: 37-43; Lee BM y cols., Transplant. Proc. 2006, 38: 2025 2028; Gaber AO y cols., Drugs. 16 abril 2010; 70 (6): 691-732; Mohty M y cols., Best Pract. Res. Clin. Haematol., junio 2010; 23 (2): 275-82).
Por ejemplo, hasta la fecha, los ALS y ATG son el tratamiento más popular de inducción para el riñón.
Los ALS y ATG son infusiones de anticuerpos policlonales derivados de animales no humanos contra células humanas, en particular células T humanas. Más particularmente, los ALS y ATG son anticuerpos policlonales séricos obtenidos mediante la inmunización de animales no humanos, tales como conejos y caballos, usando células xenogénicas (especialmente linfocitos), en particular linfocitos humanos, timocitos humanos o una línea celular inmortalizada humana en el caso de la preparación de ALS y ATG destinados a ser usados por seres humanos.
Los ALS y ATG tienen un efecto inmunosupresor que se ha demostrado en seres humanos, y así se usan para prevenir y/o tratar el rechazo de injertos, incluyendo en la prevención y/o el tratamiento del rechazo agudo en el trasplante de órganos.
Los ALS y ATG también se usan en la prevención y/o el tratamiento de anemia aplástica y también de la enfermedad del injerto contra el anfitrión (GVHD) (Norbert Frickhofen y cols., N Engl J Med 1991,324: 1297-1304; Kaya B y cols., J. Clin. Pathol. 58 (9): 994-5; Stein RS y cols., Am J Med Sci. diciembre 1994; 308(6): 338-43; Bacigalupo A y cols., Blood 98 (10): 2942-7; Bacigalupo A y cols., Biology of Blood and Marrow Transplantation 12 (5): 560-5).
Sin embargo, se sabe que los ALS y ATG convencionales están asociados con efectos adversos no deseados (TU y cols., Chin. Med. J., 2012, 125 (9): 1664-1666; WANG y cols., Chin. Med. J., 2012, 125(6): 1135-1140).
En particular, se sabe que los ALS y ATG convencionales están asociados con el síndrome de liberación de citocinas a corto plazo y un incremento del riesgo del trastorno linfoproliferativo postrasplante a largo plazo.
Por otra parte, a pesar de que actualmente se administran con otros fármacos inmunosupresores, los ALS y ATG siguen siendo fuertemente inmunogénicos y son responsables de la generación de enfermedades relacionadas con el complejo inmunitario (IC) incluyendo manifestaciones graves del IC tales como erupciones cutáneas, fiebre, etc.
A este respecto, los inventores muestran por primera vez que la presencia de la enfermedad del suero es una variable independiente conectada con la pérdida tardía del injerto. Por otra parte, los inventores observan por primera vez una asociación estadísticamente significativa entre la enfermedad del suero y un incremento en anticuerpos IgG anti-Neu5Gc años después del trasplante (véase en la presente posteriormente el ejemplo 4). SANDHU y cols. (Hindawi Publishing Corporation, Case Reports in medicine, Vol. 2012, Artículo IS 234515) menciona que un paciente desarrollaba enfermedad del suero después de recibir Thymoglobulin y rituximab, usados ampliamente en la inducción de inmunosupresión en el trasplante de órganos sólidos y el tratamiento de rechazo celular agudo del aloinjerto, que llevaba a considerar al rituximab como una de las causas potenciales en esta enfermedad del suero del paciente. Según esto, se menciona que se puede producir enfermedad del suero después del tratamiento con anticuerpos monoclonal o policlonales tales como rituximab o Thymoglobulin, respectivamente.
Así, sigue existiendo una necesidad de proporcionar composiciones dotadas de efectos adversos reducidos, incluyendo composiciones que estén mejoradas o sean alternativas en cuanto a composiciones de ALS o ATG convencionales, y que sean significativamente menos inmunogénicas, en comparación con los ALS o ATG convencionales, y que idealmente no impliquen la manifestación de enfermedades relacionadas con el IC.
Contexto de la invención
Como se sabe en la técnica, se pueden obtener fácilmente anticuerpos contra células humanas al inmunizar a un mamífero no humano, lo que incluye cerdos, caballos o conejos, mediante la administración de una composición inmunogénica que comprende células humanas diana.
Esto se ilustra específicamente mediante la preparación de composiciones denominadas "ALS" y "ATG" que se obtienen al inmunizar a mamíferos no humanos con células humanas, a saber, linfocitos humanos y timocitos humanos, respectivamente.
A continuación, se pueden obtener anticuerpos policlonales contra cualquier tipo de células humanas al inmunizar a un mamífero no humano con dichas células humanas.
Esto incluye anticuerpos policlonales de interés terapéutico, anticuerpos que se dirigen contra células, cuya presencia en un organismo humano es indeseable.
Esto incluye anticuerpos policlonales dirigidos contra células que ejercen efectos perjudiciales en el organismo humano, tales como linfocitos que son nocivos hacia un injerto de tejido o un injerto de órgano o tales como células que tienen propiedades proliferativas desreguladas como células malignas (células tumorales o células cancerosas).
Por lo tanto, dichas células humanas se pueden seleccionar en un grupo que comprende linfocitos humanos, timocitos humanos y células cancerosas humanas, más particularmente en un grupo que comprende linfocitos humanos y timocitos humanos.
Sumario de la invención
La presente invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas, se refiere a una composición de suero antilinfocítico (ALS) dirigida contra linfocitos humanos, para el uso en la prevención del rechazo tardío de injertos en un paciente humano, en donde dicho ALS se produce en, y se obtiene a partir de, un mamífero no humano que carece de un gen que codifique una citidina-5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y que carece además de un gen que codifique una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional, comprendiendo dicho ALS anticuerpos policlonales dirigidos contra dichos linfocitos humanos, careciendo los anticuerpos policlonales de determinantes antigénicos de ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y a-1,3-galactosa.
La presente invención se refiere además a una composición de suero globulínico antitimocítico (ATG) dirigida contra timocitos humanos, para el uso en la prevención del rechazo tardío de injertos en un paciente humano, en donde dicho ATG se produce en, y se obtiene a partir de, un mamífero no humano que carece de un gen que codifique una citidina-5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y que carece además de un gen que codifique una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional, comprendiendo dicho ATG anticuerpos policlonales dirigidos contra dichos timocitos humanos, careciendo los anticuerpos policlonales de determinantes antigénicos de ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y a-1,3-galactosa.
También se divulgan en la presente materiales y métodos para obtener dicho ALS y ATG.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: ilustra una gráfica de datos recogidos, procedentes de pacientes (cohorte multicéntrica del banco de datos de DIVAT, Nantes Transplantation Institute, Nantes) que han recibido al menos un injerto de riñón y un tratamiento de inducción con ALS o ATG y que a este respecto han desarrollado enfermedades relacionadas con el complejo inmunitario (IC), referentes a la proporción que exhibe una enfermedad del suero y los efectos adversos relacionados con respecto a la supervivencia del injerto a largo plazo (Abscisas: duración (en meses); Ordenadas: % de supervivencia del injerto).
Figura 2: ilustra una gráfica de datos recogidos, procedentes de pacientes (cohorte monocéntrica del banco de datos de DIVAT, Nantes Transplantation Institute, Nantes) que han recibido un injerto de riñón y un tratamiento con ALS o ATG y que a este respecto han desarrollado enfermedades relacionadas con el complejo inmunitario (IC), referentes a la proporción que exhibe una enfermedad del suero y los efectos adversos relacionados con respecto a la supervivencia del injerto a largo plazo (Abscisas: duración (en meses); Ordenadas: % de supervivencia del injerto).
Figura 3: ilustra una gráfica de datos recogidos, procedentes de pacientes (cohorte multicéntrica del banco de datos de DIVAT, Nantes Transplantation Institute, Nantes) que han recibido un primer injerto de riñón o riñón/páncreas y un tratamiento con ALS o ATG y que a este respecto han desarrollado enfermedades relacionadas con el complejo inmunitario (IC), referentes a la proporción que exhibe una enfermedad del suero y los efectos adversos relacionados con respecto a la supervivencia del injerto a largo plazo (Abscisas: duración (en años); Ordenadas: % de supervivencia del injerto).
Figura 4 : ilustra una gráfica que exhibe cantidades de anticuerpos anti-PBL humanos en el suero de cerdos inmunizados mediante detección por citometría de flujo.
Figura 5 : ilustra una gráfica que exhibe un ensayo de ELISA para la detección de IgGs anti-Neu5Gc en suero de cerdos.
Las Figuras 1 y 2 se refieren a una cohorte de DIVAT multicéntrica y monocéntrica, respectivamente, pero la figura 3, que se ha usado para el estudio estadístico, se refiere a una cohorte monocéntrica más homogénea (DIVAT, Nantes), según se muestra después en la presente en las tablas A a C.
Divulgación detallada
1. Definiciones
El término "anticuerpo" se usa en la presente en el sentido más amplio. "Anticuerpo" se refiere a cualquier polipéptido que comprenda al menos (i) una región Fc y (ii) un dominio polipeptídico de unión derivado de una región variable de una inmunoglobulina. Los anticuerpos incluyen así, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, anticuerpos, conjugados de anticuerpo de longitud completa y fragmentos de cada uno, respectivamente. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se pueden usar intercambiablemente en la presente.
El término "anticuerpo" abarca un polipéptido como el mencionado anteriormente que comprende además al menos un resto de azúcar distinto del determinante antigénico seleccionado en un grupo que comprende (i) ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y/o (ii) a-1,3-galactosa.
Por "anticuerpos policlonales" según se usa en la presente se entiende una mezcla de anticuerpos que reconocen diferentes epítopos de un antígeno dado. Anticuerpos policlonales abarcan los que están contenidos en, o alternativamente que se derivan de, líquidos corporales, especialmente suero o plasma procedentes de un organismo mamífero.
En el caso de inmunoglobulinas humanas, las cadenas ligeras se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente
Por "IgG" según se usa en la presente se entiende un polipéptido perteneciente a la clase de anticuerpos que son sustancialmente codificados por un gen de inmunoglobulina gamma reconocido. En seres humanos, IgG comprende las subclases o isotipos IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ratones, la IgG comprende IgG 1, IgG2a, IgG2b, IgG3. Las IgGs de longitud completa consisten en dos pares idénticos de dos cadenas inmunoglobulínicas, teniendo cada par una cadena ligera y una pesada, comprendiendo cada cadena ligera los dominios inmunoglobulínicos VL y CL, y comprendiendo cada cadena pesada los dominios inmunoglobulínicos VH, Cy1 (también llamado CH1), Cy2 (también llamado CH2) y Cy3 (también llamado CH3).
Según se usa en la presente, "toxicidad mediada celularmente dependiente de anticuerpo" (o ADCC) se refiere a un mecanismo de inmunidad mediada celularmente por el que una célula efectora del sistema inmunitario somete a lisis activamente a una célula diana que se ha unido a anticuerpos específicos. La ADCC está mediada principalmente por células NK, pero también por otras células inmunitarias tales como neutrófilos y eosinófilos. Típicamente, la ADCC resulta de la activación de células NK. La activación de células NK implica la unión de sus receptores de Fc a la región Fc de IgG unida a antígenos presentes sobre la superficie de células diana. Estas interacciones inducen la liberación por células NK de citocinas y gránulos citotóxicos. Para determinar la capacidad de un anticuerpo para inducir ADCC, se puede realizar un ensayo, según se describe en de Romeuf y cols. Br J Haematol. 2008 Mar;140(6):635-43.
Por "determinante antigénico" (o epítopo), según se aplica en la presente a anticuerpos policlonales de mamífero no humano, según se usa en la presente, se entiende un componente estructural de una molécula antigénica, que incluye una proteína antigénica y un carbohidrato antigénico, responsable de su interacción específica con moléculas de anticuerpo provocadas por el mismo antígeno o uno relacionado. Por extensión, el término "determinante antigénico", según se aplica en la presente a anticuerpos policlonales de mamífero no humano, también se usa colectivamente en la presente para una molécula antigénica que comprende una pluralidad de epítopos propensos a ser reconocidos por moléculas de anticuerpo provocadas por el mismo antígeno o uno relacionado. Ilustrativamente, la molécula antigénica ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) se puede denominar en la presente un "determinante antigénico", aunque dicha molécula antigénica puede contener más de un epítopo reconocido por anticuerpos provocados con Neu5Gc o con moléculas que contienen Neu5Gc.
Los "timocitos" son células progenitoras hematopoyéticas presentes en el timo. La timopoyesis es el proceso en el timo por el que los timocitos se diferencian en linfocitos T maduros.
Las "células T" o los "linfocitos T" pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos, y representan un papel principal en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como células B y células asesinas naturales (células NK), por la presencia de un receptor de células T (TCR) sobre la superficie celular. Se denominan células T debido a que maduran en el timo.
Las "células B" o los "linfocitos B" también pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos, convirtiéndolos en una parte vital del sistema inmunitario - específicamente la rama de inmunidad humoral del sistema inmunitario adaptativo. Las células B se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como células T y células asesinas naturales (células NK), por la presencia de una proteína sobre la superficie externa de la célula B conocida como receptor de células B (BCR). Esta proteína receptora especializada permite que una célula B se una a un antígeno específico. Las principales funciones de las células B son formar anticuerpos contra antígenos, para realizar el papel de células presentadoras de antígenos (APCs), y para desarrollarse en células B de memoria después de la activación mediante interacción con antígenos.
En la sangre, el "suero" es el componente derivado de plasma en el que se han retirado células (glóbulos blancos, así como glóbulos rojos) y factores de coagulación. El suero incluye todas las proteínas no usadas en la solidificación de la sangre (coagulación) y todos los electrolitos, anticuerpos, antígenos, hormonas y cualesquiera sustancias finalmente también exógenas (p. ej. fármacos y microorganismos).
Los "sueros antilinfocíticos" (o ALS) y la "globulina antitimocítica" (o ATG) son, según se menciona anteriormente, infusiones de anticuerpos policlonales derivados de animales no humanos contra linfocitos humanos y timocitos humanos, respectivamente
Por "suero convencional" y, en particular, por "suero antilinfocítico (ALS) convencional" y "suero globulínico antitimocítico (ATG) convencional" (o "suero conocido, ATG conocido o ALS conocido"), según se usan en la presente, se entiende suero para el que los anticuerpos policlonales que están comprendidos en el mismo no carecen de un determinante antigénico seleccionado en un grupo que comprende (i) ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y/o (ii) a-1,3-galactosa. A este respecto, se pueden citar notablemente los productos comercializados bajo el nombre Thymoglobulin por la compañía Genzyme, o el nombre Atgam por la compañía Pfizer.
Los términos "células malignas", "células cancerosas" y "células tumorales" se pueden usar intercambiablemente en la presente. Según se usa en la presente, "células tumorales" se refiere a células que hiperproliferan autónomamente in vivo. Ejemplos de células tumorales incluyen células incluidas en (1) sarcomas tales como osteosarcoma y sarcoma de tejidos blandos, (2) carcinomas tales como carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma de la glándula tiroidea, carcinoma de próstata, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, carcinoma de páncreas, carcinoma de estómago, carcinoma de hígado, carcinoma de útero, carcinoma de cuello uterino y carcinoma de ovario, (3) linfomas tales como linfoma hodgkiniano y linfoma no hodgkiniano, (4) neuroblastomas, (5) melanomas, (6) mielomas, (7) tumores de Wilms, (8) leucemias tales como leucemia mielocítica aguda (AML), leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia linfocítica aguda (ALL) y leucemia linfocítica crónica (CLL), (9) gliomas y (10) retinoblastomas.
Según se usa en la presente, el término "cáncer" significa el crecimiento anormal descontrolado de células e incluye dentro de su alcance todas las enfermedades bien conocidas que están provocadas por el crecimiento descontrolado y anormal de células. Ejemplos no limitativos de cánceres comunes incluyen cáncer de vejiga urinaria, cáncer de mama, cáncer ovárico y cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer endometrial, cáncer de la cabeza y el cuello, cáncer de pulmón, melanoma, mieloma múltiple, leucemia (p. ej. leucemias mieloides, linfocíticas, mielocíticas y linfoblásticas), linfoma no hodgkiniano, cáncer de próstata, cáncer rectal, melanomas malignos y en particular cáncer pancreático.
Según se usa en la presente, el término "enfermedad autoinmunitaria" significa una enfermedad resultante de una respuesta inmunitaria contra tejido o componente tisular propio, incluyendo tanto respuestas de anticuerpos como respuestas mediadas por células propias.
El término enfermedad autoinmunitaria, según se usa en la presente, abarca enfermedades autoinmunitarias específicas de órganos, en las que una respuesta inmunitaria se dirige contra un solo tejido, tales como diabetes mellitus tipo I (T1 D), enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, miastenia grave, vitíligo, enfermedad de Graves, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison y gastritis autoinmunitaria y hepatitis autoinmunitaria. El término enfermedad autoinmunitaria también abarca enfermedades autoinmunitarias no específicas de órganos, en las que una respuesta autoinmunitaria se dirige contra un componente presente en varios o muchos órganos en todo el cuerpo. Estas enfermedades autoinmunitarias incluyen, por ejemplo, una enfermedad reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica progresiva y variantes, polimiositis y dermatomiositis. Enfermedades autoinmunitarias adicionales incluyen anemia perniciosa, incluyendo alguna de gastritis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, trombocitopenia autoinmunitaria, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple y psoriasis. Un experto en la técnica entiende que los métodos que se divulgan en la presente se pueden aplicar a estas y otras enfermedades autoinmunitarias, según se desee. Ejemplos no limitativos de enfermedad autoinmunitaria grave también incluyen una trombocitopenia tal como la púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), retinocoroiditis en perdigonada, síndrome de Guillain-Barré (GBS), neuropatía motriz multifocal o enfermedad de Kawasaki o síndrome linfomucocutáneo, tiroiditis autoinmunitaria o espondilitis anquilosante.
2. Composiciones
Se ha encontrado que, en una población de pacientes injertados que hayan recibido un tratamiento con ALS o ATG, el tiempo de supervivencia del injerto depende principalmente de la presencia de enfermedades relacionadas con el IC tales como la enfermedad del suero en estos pacientes que sufren generación del complejo inmunitario (IC). Más precisamente, se ha encontrado que los pacientes tratados con ALS o tratados con ATG que experimenten una enfermedad relacionada con el IC, y especialmente enfermedad del suero, tienen un tiempo de supervivencia del injerto reducido muy significativamente y un pobre resultado a largo plazo, siendo el último comparable al observado en el rechazo de injertos provocado por cinco frente a una incompatibilidad de1HLA.
Con vistas a vencer las desventajas de los ALS o ATG convencionales, se describen en la presente composiciones que comprenden anticuerpos policlonales que tienen propiedades inmunogénicas reducidas en individuos humanos, y que tienen así una capacidad reducida para inducir complejo inmunogénico (IC) en un ser humano y, por consiguiente, una capacidad reducida para inducir enfermedades relacionadas con el IC tales como enfermedad del suero.
Se describe en la presente una composición que comprende anticuerpos policlonales dirigidos contra células humanas, en donde dichos anticuerpos policlonales carecen de un primer determinante antigénico seleccionado en un grupo que comprende (i) ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y (ii) a-1,3-galactosa.
La composición descrita puede carecer además de un segundo determinante antigénico que es distinto del primer determinante antigénico y en donde dicho segundo determinante antigénico se selecciona en un grupo que comprende (i) ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y (ii) a-1,3-galactosa.
Se cree que los anticuerpos policlonales contenidos en una composición de anticuerpos policlonales descrita en la presente poseen propiedades inmunogénicas reducidas en un ser humano en comparación con las composiciones de anticuerpos policlonales que se usan actualmente en la técnica bajo la forma de ALS y ATG.
Se sabe en la técnica que el Neu5Gc es inmunogénico en seres humanos (Noguchi A. y cols., J. Biochem. Tokyo (1995), 117(1): 59-62). Además, se sabe que los pacientes que desarrollan complejo inmunitario (IC) grave después de la infusión de inmunoglobulinas animales montan anticuerpos que se desarrollan principalmente contra el epítopo de Neu5Gc (Merrick JM y cols., Int. Allergy Appl. Immunol., 1978, Vol. 57 : 477-480 ; Aggarwal S. y cols., Nat Biotechnol. 2008;26:1227-1233; Arnold JN y cols., Annu Rev Immunol. 2007;25:21-50; Durocher Y y cols., Curr Opin Biotechnol. 2009;20:700-707; Higgins E y cols., Glycoconj. J. 2009).
También se sabe en la técnica que la enzima a l ,3-galactosiltransferasa (al ,3GT o GGTA1) sintetiza epítopos de a l ,3-galactosa (a1,3Ga1) (Gala1,3Galp1,4GlcNAc-R), que son los principales xenoantígenos que provocan rechazo hiperagudo en el xenotrasplante de cerdo a ser humano.
Por consiguiente, una composición que contenga anticuerpos policlonales carentes de determinantes antigénicos de (i) ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y/o (ii) a-1,3-galactosa, debido a que estos anticuerpos policlonales son menos inmunogénicos que los anticuerpos policlonales que están contenidos en ALS y ATG convencionales, posee inmunogenicidad reducida. Entonces, se cree que una composición que contiene anticuerpos policlonales tal como la divulgada en la presente posee propiedades reducidas para elevar los diversos efectos adversos que se inducen después de la administración de productos de ALS o ATG convencionales, que incluyen la inducción de enfermedades del IC graves, incluyendo enfermedad del suero, síndrome de liberación de citocinas y del trastorno linfoproliferativo postrasplante.
Así, se cree que una composición que contenga anticuerpos policlonales como la divulgada en la presente reduce el riesgo de presencia de los efectos adversos inducidos por ALS convencionales o de los inducidos por ATG convencionales, contribuyendo cada uno de estos efectos adversos a una disminución de la supervivencia del injerto a largo plazo en seres humanos, según se muestra en la presente.
Según el conocimiento de los inventores, no se conoce en la técnica ningún ALS o ATG carente de un determinante antigénico seleccionado en un grupo que comprende (i) Neu5Gc y/o (ii) a-1,3-galactosa, más particularmente para el uso divulgado en la presente memoria descriptiva.
A este respecto, una composición como la divulgada en la presente es particularmente ventajosa ya que precisamente permite vencer los susodichos efectos indeseables provocados por los ALS y ATG convencionales ya que conserva sus propiedades inmunomoduladoras contra células T y/o células B humanas mientras que es menos tóxica a nivel sistémico del organismo humano.
En otras palabras, una composición como la divulgada en la presente es significativamente menos inmunogénica y así se espera que se reduzca significativamente la presencia de enfermedades relacionadas con el complejo inmunitario (IC), y especialmente la enfermedad del suero, observada con ALS o ATG convencionales.
Una ventaja asociada con una composición como la divulgada en la presente es que permite mejorar significativamente la supervivencia del injerto a largo plazo.
Además, se sabe en la técnica que la N-glicosilación de anticuerpos representa un papel crucial en la modulación de sus propiedades efectoras, especialmente de sus propiedades pro- o antinflamatorias.
Así, se ha identificado que la sialilación es la adición de ácido N-acetilneuramínico, también llamado Neu5Ac, NANA, ácido N-acetilsiálico o ácido siálico, sobre residuos de galactosa de N-glicanos del fragmento cristalizable (Fc) de anticuerpos.
La sialilación imparte a los anticuerpos propiedades antinflamatorias particularmente interesantes (Dimitrov y cols.; Nephrol. Dial. Transplant., 2007.22: 1301 y el documento WO 2007/117505).
Por lo tanto, cuando los anticuerpos policlonales que se divulgan en la presente carecen de al menos el determinante antigénico ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc), dichos anticuerpos policlonales son más ventajosos ya que presentan, al permitir un mayor acceso fisiológico al receptor de Fc gamma, un incremento de afinidad para FcyR y, así, un incremento de ADCC con respecto a linfocitos T humanos.
Además, debido a la ausencia, en anticuerpos policlonales como los divulgados en la presente, del determinante antigénico seleccionado en un grupo que comprende (i) ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y/o (ii) a-1,3-galactosa, dichos anticuerpos policlonales, cuando se administran a un organismo humano, no provocan una respuesta inmunitaria que incluya la producción de anticuerpos anti-Neu5Gc o anti-GAL, anticuerpos que contribuyen a la presencia de complejos inmunitarios (IC) y de enfermedades relacionadas con IC tales como enfermedad del suero.
Un método destinado a identificar o caracterizar anticuerpos policlonales como los divulgados en la presente se encuentra dentro del conocimiento general de un experto en la técnica.
Un método que puede ser usado por un experto en la técnica para identificar o caracterizar anticuerpos policlonales como los divulgados en la presente incluye un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) en el que se usan anticuerpos anti-Neu5Gc y/o anticuerpos anti-Gal como moléculas de detección.
Como anticuerpos anti-Neu5Gc para determinar la falta de determinante antigénico Neu5Gc, se puede citar el Gc-Free Basic Kit comercializado por la compañía Sialix, Inc.
Como anticuerpos anti-Gal para demostrar la ausencia de determinante antigénico a-1,3-galactosa, se puede considerar el protocolo divulgado en Jianq-Qiang Wang y cols. (J. Am. Chem. Soc., 1999, 121: 8181) o los comercializados bajo el nombre WH0051083M1 Sigma por la compañía Sigma-Aldrich.
Según un método de ELISA en el que anticuerpos anti-Neu5Gc y/o anti-Gal específicos se inmovilizarían en pocillos de una placa de microvaloración, solamente los anticuerpos que comprenden el determinante antigénico seleccionado en un grupo que comprende (i) ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y/o (ii) a-1,3-galactosa forman un complejo con dichos anticuerpos anti-Neu5Gc y/o anti-Gal y, así, permanecen unidos a los pocillos. Cuando se usa un método de ELISA, anticuerpos policlonales como los divulgados en la presente son los que carecen de uno o más de los determinantes antigénicos seleccionados en un grupo que comprende (i) ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y/o (ii) a-1,3-galactosa, y por consiguiente son los que no forman complejos con (i) anticuerpos anti-Neu5Gc anticuerpos, (ii) anticuerpos anti-Gal o (iii) tanto anticuerpos anti-Neu5Gc como anticuerpos anti-Gal.
También se describe en la presente un método para producir una composición que comprende anticuerpos policlonales como los descritos en la presente que comprende las etapas de:
a) proporcionar un mamífero no humano genéticamente alterado que carece de un primer gen seleccionado en un grupo que comprende (i) un gen que codifica una citidina 5'-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y (ii) un gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional;
b) inmunizar a dicho mamífero no humano genéticamente alterado contra células humanas; y
c) recoger los anticuerpos contenidos en un líquido corporal de dicho mamífero no humano genéticamente alterado de la etapa b), con lo que se obtiene una composición que comprende anticuerpos policlonales.
La composición se puede preparar al mezclar los anticuerpos policlonales recogidos en la etapa c) del método descrito anteriormente con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como un portador, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables.
Los anticuerpos policlonales se pueden purificar antes de usarse en la composición.
La composición de anticuerpos policlonales puede estar en forma líquida.
La composición de anticuerpos policlonales puede estar en forma sólida, que incluye una forma liofilizada.
La composición que se divulga en la presente se puede formular según métodos estándar tales como los descritos en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Lippincott Williams & Wilkins; Vigesimoprimera Edición, 2005). Excipientes farmacéuticamente aceptables que se pueden usar se describen, en particular, en the Handbook of Pharmaceuticals Excipients, American Pharmaceutical Association (Pharmaceutical Press; 6a edición revisada, 2009). A fin de tratar a un paciente que lo necesite, tal como se menciona anteriormente, se puede administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la composición.
Por "dosis terapéuticamente eficaz" se entiende en la presente una dosis que produzca los efectos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y será determinada por un experto en la técnica usando técnicas conocidas. Las dosificaciones pueden variar de 0,001 a 100 mg de anticuerpos policlonales como los divulgados en la presente por kg de peso corporal (mg/kg) o más, por ejemplo 0,1, 1,0, 10 o 50 mg/kg de peso corporal, prefiriéndose de 1 a 10 mg/kg. La dosificación y frecuencia de administración se pueden adaptar dependiendo de la respuesta del anfitrión, así como la frecuencia de inyección debido a una mejor tolerancia.
Como se sabe en la técnica, pueden ser necesarios ajustes para la degradación de proteínas, el aporte sistémico frente a localizado, así como la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la interacción con fármacos y la gravedad de la afección, y se determinan fácilmente con una experimentación habitual por los expertos en la técnica.
La administración de la composición se puede realizar de una variedad de modos, incluyendo, pero no limitados a, oralmente, subcutáneamente, intravenosamente, parenteralmente, intranasalmente, intraorticalmente, intraocularmente, rectalmente, vaginalmente, transdérmicamente, tópicamente (p. ej., geles), intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonarmente o intratecalmente.
La composición se puede administrar con otros agentes terapéuticos concomitantemente, es decir, los agentes terapéuticos descritos en la presente se pueden coadministrar con otras terapias o agentes terapéuticos, incluyendo, por ejemplo, moléculas pequeñas, otros agentes biológicos, radioterapia, cirugía, etc.
En el aspecto más preferido, la composición según la invención está en una forma adecuada para la administración mediante una vía intravenosa.
Según una realización particular, la composición según la invención puede comprender además al menos un fármaco inmunosupresor, tal como glucocorticoides, agentes citostáticos (azatioprina, metotrexato), anticuerpos, fármacos que actúan sobre inmunofilinas (ciclosporina, tacrolimus, rapamicina).
3. Métodos para producir composiciones
Según se menciona anteriormente, un método para producir la composición descrita en la presente comprende las etapas de:
a) proporcionar un mamífero no humano genéticamente alterado que carece de un primer gen seleccionado en un grupo que comprende (i) un gen que codifica una citidina 5'-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y (ii) un gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional;
b) inmunizar a dicho mamífero no humano genéticamente alterado contra células humanas; y
c) recoger los anticuerpos contenidos en un líquido corporal de dicho mamífero no humano genéticamente alterado de la etapa b).
Según un aspecto particular, el mamífero no humano genéticamente alterado puede carecer además de un segundo gen distinto del primer gen, seleccionándose dicho segundo gen del grupo que comprende (i) un gen que codifica una citidina 5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y (ii) un gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional.
Preferiblemente, el método puede comprender además una etapa d) de purificación de dichos anticuerpos policlonales a partir de dicho líquido corporal.
3.1. Etapa a) de provisión de un mamífero no humano genéticamente alterado
Para preparar la composición, se realiza una primera etapa a) que consiste en proporcionar un mamífero transgénico no humano genéticamente alterado que carece de un gen seleccionado en un grupo que comprende (i) un gen que codifica una citidina 5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y/o (ii) un gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional.
Preferiblemente, dicho mamífero no humano genéticamente alterado es un mamífero transgénico no humano con inactivación de CMAH y/o GGTA1 (o mamífero no humano KO para CMAH y/o GGTA1), que incluye un mamífero transgénico no humano con doble inactivación para CMAH y GGTA1.
Según se usa en la presente, un "mamífero transgénico no humano con inactivación" consiste en un mamífero transgénico no humano en el que la función de uno o más alelos se ha alterado, por ejemplo, mediante recombinación homóloga u otra inserción o eliminación.
Este gen puede estar perturbado. Por "gen perturbado" se entiende que una porción del código genético se ha alterado, afectando de ese modo a la transcripción y/o la traducción de ese segmento del código genético, p. ej., haciendo a ese segmento del código ilegible a través de técnicas de inactivación o mediante la inserción de un gen adicional para una proteína deseada o la inserción de una secuencia reguladora que module la transcripción de una secuencia existente.
Todas las células el mamífero transgénico no humano pueden incluir el gen perturbado.
El mamífero transgénico no humano con inactivación puede ser un mamífero transgénico no humano en el que uno o más alelos del gen considerado se han vuelto no funcionales.
Ambos alelos del gen considerado se pueden volver no funcionales, lo que incluye casos comúnmente denominados "inactivaciones (“knockouts”) génicas", introducciones (“knock-ins”) génicas" y cualquier otra modificación de uno o más alelos naturales del gen natural considerado que vuelva al gen no funcional. Este mamífero transgénico no humano es útil como la fuente para producir la composición.
Un método para obtener un mamífero no humano genéticamente alterado que carezca de un gen seleccionado en un grupo que comprende (i) un gen que codifica una citidina-5'-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa funcional
y/o (ii) un gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional se encuentra dentro del conocimiento general de un experto en la técnica.
Un mamífero no humano genéticamente alterado que carece del gen que codifica una citidina-5'-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa funcional se denomina mamífero no humano CMAH KO.
Un mamífero no humano genéticamente alterado que carece del gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional se denomina mamífero no humano GAL KO.
Un método para obtener un mamífero transgénico no humano con inactivación de CMAH se describe notablemente en el documento WO 2006/133356 que divulga más particularmente un método para producir productos animales que carecen de ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) para uso humano que comprende las etapas de: preparar un mamífero no humano genéticamente alterado desprovisto de un gen de citidina-5'-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional; y extraer al menos un producto animal del animal no humano genéticamente alterado.
Un método para obtener un mamífero transgénico no humano con inactivación de GAL se encuentra dentro del conocimiento general del experto en la técnica (Cooper DK y cols., Genetically engineered pigs, Lancet 1993, 342: 682; Lai L y cols., Science 2002, 295: 1089; Sachs DH y cols., Current Opinion in Organ Transplantation, 2009, 14:148-153).
Un método para obtener un mamífero transgénico no humano con inactivación de GAL se describe notablemente en el documento US 7.547.816.
La obtención de la composición que comprende anticuerpos policlonales dirigidos contra linfocitos humanos y timocitos humanos, en donde dichos anticuerpos policlonales carecen de un determinante antigénico seleccionado en un grupo que comprende (i) ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y (ii) a-1,3-galactosa, puede implicar la utilización de un mamífero no humano genéticamente alterado desprovisto de un gen seleccionado en un grupo que comprende (i) un gen que codifica una citidina 5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y (ii) un gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional.
En otras palabras, dicho mamífero no humano genéticamente alterado específico es un mamífero transgénico no humano con inactivación doble de CMAH y GAL.
Un protocolo para obtener este mamífero transgénico no humano con inactivación doble de CMAH y GAL específico se describe en Lutz AL y cols. (Xenotransplantation, 2013; 20 (1): 27-35) o en Conchon S. y cols. (Xenotransplantation; edición especial International Xenotransplantation Association IXA 2013, 2013, Vol. 20, Edición 5).
Como mamífero transgénico no humano genéticamente alterado que se puede usar en la presente invención se pueden citar notablemente Ovidae, Bovidae, Suidae, Leporidae y Equidae.
Preferiblemente, el mamífero transgénico no humano genéticamente alterado puede consistir en un cerdo.
En efecto, los cerdos se prefieren para obtener la composición, y más particularmente un ALS o un ATG, ya que son particularmente interesantes desde un punto de vista industrial.
En efecto, los cerdos ofrecen varias ventajas, notablemente en comparación con los conejos, ya que el volumen de sueros inmunitarios, y así de anticuerpos policlonales de interés, que se puede recoger es proporcional a la relación en peso del animal (30 veces mejor).
Es más, los cerdos no necesitan ser sacrificados en el momento de la recogida del suero y, así los procedimientos legales que permiten la recogida de suero se facilitan significativamente.
En efecto, se puede recoger 10% del volumen de sangre del animal al mes.
Por todas estas razones, obtener la composición de un cerdo transgénico genéticamente alterado es particularmente económico.
3.2. Etapa b) de inmunización del mamífero no humano genéticamente alterado contra células humanas
Una vez que se obtiene un mamífero transgénico no humano genéticamente alterado desprovisto de un gen seleccionado en un grupo que comprende (i) un gen que codifica una citidina 5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y/o (ii) un gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional, se inyecta a continuación una solución que comprende notablemente células humanas.
Preferiblemente, las células humanas de la etapa b) se pueden seleccionar del grupo que consiste en linfocitos humanos, timocitos humanos y células cancerosas humanas, y más particularmente linfocitos humanos y timocitos humanos.
Por ejemplo, un método para obtener una solución que comprende notablemente células T humanas se encuentra dentro del conocimiento general de un experto en la técnica (documentos EP 1778 836; EP 0335 804).
Según un aspecto particular, dichas células humanas son clones de células T humanas tales como los divulgados en el documento EP 0335 804.
Esto es ventajoso ya que permite vencer posibles efectos secundarios no deseados asociados con la presencia, junto con células humanas, especialmente linfocitos T, de diversos contaminantes celulares, incluyendo neutrófilos, monocitos, glóbulos rojos y plaquetas, que pueden implicar, por el mamífero no humano inmunizado, la formación de anticuerpos contaminantes correspondientes.
Un protocolo para obtener un buen nivel de inmunización del mamífero transgénico no humano con respecto a células T se describe notablemente en el documento EP 0335 804.
Este protocolo puede consistir notablemente en inmunizar animales, tales como conejos, caballos o cerdos, preferiblemente cerdos, con administración repetida, según métodos conocidos, de células T humanas.
Por ejemplo, se realizan varias administraciones, intravenosamente o subcutáneamente, con o sin adyuvante, de 106 a 109 células cada vez, estando espaciadas las administraciones al menos una semana. Aproximadamente una semana después de la última inmunización, se recoge suero de animales inmunizados y se aísla según métodos conocidos.
El mamífero transgénico no humano genéticamente alterado producirá anticuerpos contra estas células T humanas, careciendo dichos anticuerpos específicos del determinante antigénico Neu5Gc y/o a-1,3-Gal según la naturaleza del mamífero transgénico no humano genéticamente alterado considerado.
3.3. Etapa c) de recogida de los anticuerpos contenidos en el líquido corporal del mamífero no humano genéticamente alterado de la etapa b).
A continuación, se extrae una porción del líquido sanguíneo de dicho mamífero transgénico no humano genéticamente alterado, de la que se recogen anticuerpos, anticuerpos que son de interés.
Según un aspecto particular, dicho líquido sanguíneo se puede seleccionar en un grupo que comprende plasma sanguíneo y suero sanguíneo.
Un protocolo para obtener un líquido sanguíneo, y más particularmente un plasma sanguíneo o un suero sanguíneo, se encuentra dentro del conocimiento general de un experto en la técnica.
3.4. Etapa d) opcional de purificación de los anticuerpos del líquido corporal de la etapa c)
Según se menciona anteriormente, un método como el divulgado en la presente puede comprender además una etapa d) de purificación de los anticuerpos de dicho líquido corporal.
Dicha etapa d) de purificación es ventajosa ya que permite notablemente vencer posibles efectos secundarios no deseados asociados con la presencia, dentro del líquido corporal, de diversos contaminantes celulares que pueden implicar, por el mamífero no humano inmunizado, la formación de anticuerpos contaminantes correspondientes .
Dicha etapa d) de purificación también es ventajosa ya que permite obtener una composición que tiene un grado de pureza deseado.
Dicha etapa d) de purificación se encuentra dentro del conocimiento general de un experto en la técnica. Toda la posible adaptación de cualquier protocolo de purificación convencional también se encuentra dentro del conocimiento general de un experto en la técnica. A este respecto, según una primera variante, una composición como la divulgada en la presente puede ser el suero antilinfocítico (ALS), el suero globulínico antitimocítico (ATG) o el suero de anti células cancerosas como tal, en particular una composición como la divulgada en la presente es el suero antilinfocítico (ALS) o el suero globulínico antitimocítico (ATG) como tal.
Como un método apropiado para obtener dicho ALS o ATG, se puede citar notablemente el método de precipitación fraccionada con etanol, con sulfato amónico, con rivanol o con polietilenglicol, el método mediante el paso a través de columnas de intercambio iónico. A continuación, los anticuerpos obtenidos se pueden someter a tratamientos
convencional para su administración intravenosa, por ejemplo, mediante tratamientos de escisión enzimática, plasmina, papaína o pepsina.
A este respecto, se puede citar más particularmente el protocolo llevado a cabo en el ejemplo 3 del documento EP 0 335 804, que lleva a cabo una cromatografía de intercambio iónico sobre DEAE-celulosa.
La composición puede consistir en una composición en la que los anticuerpos obtenidos en la etapa c) del método descrito anteriormente se separan de otros sustituyentes celulares distintos de anticuerpos, incluyendo notablemente neutrófilos, monocitos, glóbulos rojos y plaquetas.
La composición puede consistir en una composición que contiene los anticuerpos policlonales purificados que están inicialmente presentes en el suero, estando dichos anticuerpos policlonales purificados sustancialmente libres de componentes proteínicos del suero o incluso anticuerpos policlonales que están sustancialmente libres de cualquier sustancia que estuviera inicialmente contenida en el suero usado como el producto de partida.
Como un método apropiado para purificar estos anticuerpos policlonales de interés, se pueden citar los métodos para purificar anticuerpos con un soporte de afinidad sobre el que se acopla al antígeno, sobre proteína G o sobre proteína A, por ejemplo, los comercializados por las compañías ProteoGenix, Cell Biolabs, Inc. o CliniSciences o también divulgados en los documentos EP 1601 697, JP 7155 194 o US 6,870,034.
También se puede citar un soporte de afinidad para la fijación selectiva de los anticuerpos de interés procedentes de un líquido sanguíneo, que comprende un material de soporte sólido que tiene un adaptámero inmovilizado que se une específicamente a dichos anticuerpos de interés procedentes de un líquido corporal. Este método se divulga notablemente en el documento WO 2010/094901.
4. Usos médicos
Según se menciona anteriormente, se describe en la presente el uso de un mamífero no humano genéticamente alterado desprovisto de un primer gen seleccionado del grupo que comprende (i) un gen que codifica una citidina 5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y (ii) un gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional, para producir una composición que comprende anticuerpos policlonales dirigidos contra células humanas.
Según un aspecto particular, este mamífero no humano genéticamente alterado puede estar desprovisto además de un segundo gen distinto del primer gen, seleccionándose dicho segundo gen del grupo que comprende (i) un gen que codifica una citidina 5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y (ii) un gen que codifica una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional.
En particular, la ausencia de anticuerpos anti-Neu5Gc en una muestra se puede determinar según el método de dosificación descrito en Padler-Karavani V y cols. (PLoS One. 2013; 8 (3): e58443).
Preferiblemente, las células humanas se pueden seleccionar en un grupo que comprende linfocitos humanos, timocitos humanos y células cancerosas humanas, y más particularmente se puede seleccionar en un grupo que comprende linfocitos humanos y timocitos humanos.
La composición divulgada en la presente puede ser un suero dirigido contra células humanas, seleccionándose preferiblemente dicha composición en un grupo que comprende un suero antilinfocítico (ALS), un suero globulínico antitimocítico (ATG) y suero anti-células cancerosas, siendo la composición en particular un suero antilinfocítico (ALS) o un suero globulínico antitimocítico (ATG).
También se describe una composición que comprende anticuerpos policlonales como los descritos a lo largo de la presente memoria descriptiva, para su uso como un medicamento.
Se divulga en la presente una composición que comprende anticuerpos policlonales como los descritos a lo largo de la presente memoria descriptiva, para su uso para prevenir y/o tratar un trastorno seleccionado en un grupo que comprende un rechazo de injerto, anemia aplástica, una enfermedad del injerto contra el anfitrión, una enfermedad autoinmunitaria grave y una enfermedad relacionada con células malignas (o una enfermedad relacionada con células cancerosas).
Se divulga en la presente una composición que comprende anticuerpos policlonales como los descritos a lo largo de la presente memoria descriptiva, para su uso para la prevención y/o el tratamiento de un rechazo de injerto, y especialmente un rechazo de injerto renal.
Se divulga en la presente una composición que comprende anticuerpos policlonales como los descritos a lo largo de la presente memoria descriptiva, para su uso para la prevención de enfermedades relacionadas con el complejo
inmunitario (IC) posteriores a un trasplante, en particular enfermedad del suero, erupciones cutáneas o fiebre en comparación con un suero convencional dirigidos contra linfocitos humanos o timocitos humanos.
Además, se describe en la presente un método para inducir un estado de inmunosupresión en un individuo que lo necesite, comprendiendo dicho método una etapa de administración a dicho individuo de una composición como la divulgada en la presente.
5. Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a una composición de suero antilinfocítico (ALS) dirigida contra linfocitos humanos, para el uso en la prevención del rechazo tardío de injertos en un paciente humano, en donde dicho ALS se produce en, y se obtiene a partir de, un mamífero no humano desprovisto de un gen que codifique una citidina-5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y desprovisto además de un gen que codifique una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional,
comprendiendo dicho ALS anticuerpos policlonales dirigidos contra dichos linfocitos humanos,
careciendo los anticuerpos policlonales de determinantes antigénicos de ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y a-1,3-galactosa.
La presente invención se refiere además a una composición de suero globulínico antitimocítico (ATG) dirigida contra timocitos humanos, para el uso en la prevención del rechazo tardío de injertos en un paciente humano, en donde dicho ATG se produce en, y se obtiene a partir de, un mamífero no humano desprovisto de un gen que codifique una citidina-5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y desprovisto además de un gen que codifique una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional
comprendiendo dicho ATG anticuerpos policlonales dirigidos contra dichos timocitos humanos,
careciendo los anticuerpos policlonales de determinantes antigénicos de ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y a-1,3-galactosa.
Según una realización particular, dicho mamífero no humano es un conejo, un caballo o un cerdo, y es más particularmente un conejo o un cerdo, en particular un cerdo.
Dicho individuo puede estar afectado de anemia aplástica o puede ser el receptor de un injerto de órgano alogénico o xenogénico.
La composición se puede administrar a un individuo que lo necesite en combinación con al menos un fármaco inmunosupresor.
Como este fármaco inmunosupresor, se pueden citar notablemente un glucocorticoide, citostáticos (metotrexato, azatioprina y mercaptopurina), fármacos que actúan sobre inmunofilinas (ciclosporina, tacrolimus y sirolimus), fingolimod, ácido micofenólico, proteínas que se unen a TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa) (infliximab (Remicade), etanercept (Enbrel) o adalimumab (Humira)).
Como ilustrativos de esta realización particular, se pueden citar Marsh J y cols. (Blood. 1 de abril de 1999; 93 (7): 2191-5) o Delmonico FL y cols. (Ann Surg. noviembre 1987; 206 (5): 649-54).
EJEMPLOS
En todos los ejemplos posteriores de la presente, los cerdos utilizados tienen una dieta no modificada.
Ejemplo 1: protocolo para preparar un ALS y un ATG a partir de un cerdo doble GAL/CMAH KO
Preliminarmente, el cerdo doble GAL/CMAH KO utilizado es el divulgado en Lutz AL y cols. (Xenotransplantation, 2013; 20 (1): 27-35) o el divulgado en Conchon S. y cols. (Xenotransplantation; edición especial International Xenotransplantation Association IXA 2013, 2013, Vol. 20, Edición 5).
La línea celular inmortalizada de linfocitos T humanos usada en el ensayo es la línea Jurkat que está disponible en the American Type Culture Collection bajo el número de referencia CRL2899 (que también se pueden denominar "células T" en el ejemplo de la presente).
1) Protocolo de inmunización del cerdo doble GAL/CMAH KO con respecto a linfocitos T humanos
Inmunización del cerdo doble GAL/CMAH KO descrito en Lutz AL y cois. (Xenotransplantation, 2013; 20 (1): 27-35) o en Conchon S. y cois. (Xenotransplantation; edición especial International Xenotransplantation Association IXA 2013, 2013, Vol. 20, Edición 5) mediante la administración de 3.108 células T.
Realización de tres inyecciones intravenosas los días 0, 14 y 21.
Opcionalmente, administración intravenosa de 10 dosis de BCG, o cualquier tipo de adyuvante, a 107-108 gérmenes/10 dosis el día 5.
Recogida del suero el día 28, mediante sangría. Recogida de aproximadamente 100 ml de suero de cerdo.
2) Protocolo para obtener un ALS procedente del cerdo doble GAL/CMAH KO
Se somete el susodicho suero de cerdo a una cromatografía sobre celulosa DEAE Whatman y a continuación realización de una etapa de elución con un tampón de fosfato disódico 1,5 g/l, pH 8.
Purificación de la solución de gammaglobulina obtenida mediante doble precipitación con sulfato sódico en 180 g/l, a continuación 170 g/l, pH 7. Redisolución el precipitado en una solución de glicina 0,3 M, pH 7, a fin de obtener un volumen igual al volumen de partida.
Alternativamente, la susodicha etapa de purificación se puede llevar a cabo usando proteína A seguido por una columna de intercambio iónico.
Adsorción con hema de la solución dos veces sobre pellas de glóbulos rojos humanos (volumen de la pella para cada adsorción sustancialmente igual al volumen de suero crudo) para reducir la tasa de hemaglutininas. Precipitación de nuevo de la solución con sulfato sódico para retirar hemoglobina. Disolución del precipitado en tampón de glicina 0,3 M, diafiltrado contra una solución final de 10 g/l de glicina, NaCl 2 g/l de glicina, 10 g/l de manitol. Adición de proteínas hasta 5 g/l, y a continuación se liofilizó.
Comentarios:
El ALS obtenido procedente del cerdo doble GAL/CMAH KO es particularmente interesante ya que es significativamente menos inmunogénico en comparación con un ALS convencional.
Este ALS permite así reducir enfermedades relacionadas con el complejo inmunitario (IC) que pueden desarrollar los pacientes injertados consecutivamente a un aloinjerto o un xenoinjerto. Lo que, es más, este ALS también permite reducir la enfermedad del suero que puede aparecer adicionalmente.
Todas estas ventajas mejoran necesariamente la supervivencia del injerto a largo plazo.
Ejemplo 2: reacción inmunitaria de cerdos doble GAL/CMAH KO contra células T humanas (o PBL humanos)
La inmunización de cerdos con inactivación doble según el ejemplo 1 (en donde no se considera BCG ni ningún otro tipo de adyuvante) y sus homólogos silvestres se realizó mediante tres inyecciones sucesivas de 30.106 células Jurkat en solución salina tamponada con fosfato: una primera inyección subcutánea el día 0 seguida por dos inyecciones intravenosas el día 14 y 28. Las células Jurkat se cultivaron en medio libre de Neu5Gc y compuestos. La sangre se muestreó el día 35, y se usó suero para experimentos adicionales o purificación de IgGs.
La detección de anticuerpos específicos de PBLs humanos en dicho suero se adaptó a partir del protocolo descrito en Poirier N y cols., Journal of Surgical Research, 2007. Brevemente, 2,5.105 células mononucleares de sangre periférica humana se incubaron con diferentes diluciones de suero de cerdo inmunizado (de 1 : 5 a 1 : 5000), o sin suero como control negativo, durante 30 minutos a 4°C. Después de lavar en tampón de FACS (PBS, BSA al 1%, azida al 0,1%), las células se incubaron con anticuerpo caprino anti-IgG de cerdo marcado con FITC (AbD Serotec, referencia: AAI41F) con una dilución de 1 : 30, durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron tres veces antes de resuspender en tampón de FACS y un análisis inmediato en un BD FACSCanto™ II.
Los resultados se indican como intensidad de fluorescencia mediana en un mismo experimento, para suero muestreado el día 35 del protocolo de inmunización.
Resultados:
Los resultados se presentan en la figura 4. La intensidad más fuerte se observa con el suero de cerdos doble GAL/CMAH KO. Así, dichos cerdos doble KO montan una respuesta vigorosa contra PBLs (= linfocitos de sangre periférica) humanos después de una inmunización con células Jurkat.
Ejemplo 3: medida de anticuerpos anti-Neu5Gc (o IgGs anti-Neu5Gc) en cerdos doble GAL/CMAH KO
Anticuerpos anti-Neu5Gc en suero de cerdo inmunizado del ejemplo 2 (muestreado el día 35 del protocolo de inmunización) se cuantificaron usando un ensayo de ELISA adaptado de Scobie y cols., J Immunol., 2013, modificado para mejorar la especificidad. Brevemente, las placas se revistieron con suero de ratón silvestre (que contiene Neu5Gc) durante la noche a 4°C, a continuación, se bloquearon usando ovoalbúmina al 1% en PBS Tween al 0,05% durante 2 horas a temperatura ambiente. Durante este tiempo, las muestras se preincubaron durante 2 horas sobre hielo con suero de ratones CMAH-KO (sin expresión de Neu5Gc), y con o sin 5 mM de Neu5Gc sintético (para la absorción competitiva de anticuerpos anti-Neu5Gc). A continuación, las muestras se añadieron a la placa de ELISA durante 2 horas a temperatura ambiente. Se usó un anticuerpo secundario caprino anti-IgG (Fc) de cerdo marcado con peroxidasa de rábano picante (AbD Serotec, referencia: AAI41P) para la detección de anticuerpos anti-Neu5Gc, y las placas se revelaron usando sustrato TMB (Sigma-Aldrich). La densidad óptica se leyó en un lector de placas MRX (Dynatech Laboratories). Los resultados se presentan como la diferencia entre la densidad óptica de los pocillos inhibidos o no inhibidos por Neu5Gc sintético.
Resultados:
Los resultados se presentan en la figura 5. Así, los ratones doble GAL/CMAH KO solo desarrollan una cantidad mínima de anticuerpos anti-NeuGc, lo que muestra que no se necesitará absorción de suero inmunitario.
Ejemplo 4: conexión entre el diagnóstico de una enfermedad del suero y la supervivencia del injerto renal
Este estudio determina la proporción, entre datos recogidos de pacientes (cohorte monocéntrica de la base de satos de DIVAT, Nantes Transplantation Institute, Nantes) que han recibido un primer injerto de riñón/páncreas y un tratamiento con ALS o ATG y que a este respecto han desarrollado enfermedades relacionadas con el complejo inmunitario (IC), que exhiben una enfermedad del suero y los efectos adversos relacionados con respecto a la supervivencia del injerto a largo plazo.
Dicho estudio se ilustra mediante la figura 3 y mediante las tres tablas A a C siguientes.
La tabla A exhibe características de los pacientes que forman la cohorte considerada. Las tablas B y C exhiben los análisis de supervivencia mediante los modelos de Cox univariable y de Cox multivariable, respectivamente
Tabla A
Tabla B
Tabla C
Comentarios:
En cuanto a estos datos clínicos (véase la figura 3), se muestra que la presencia de enfermedad del suero es una variable independiente conectada a la pérdida tardía del injerto.
Por otra parte, se muestra que el riesgo relativo ("HR" para "Relación de Peligro") en cuanto a dicha enfermedad del suero se clasifica como número 2 después de un rechazo agudo y es más fuerte que todas las variables probadas.
Finalmente, se observa una asociación estadística entre la enfermedad del suero y un incremento en anticuerpos de anti-Neu5Gc IgG enteros años después del trasplante.
Claims (5)
1. Una composición de suero antilinfocítico (ALS) dirigida contra linfocitos humanos, para el uso en la prevención del rechazo tardío de injertos en un paciente humano, en donde dicho ALS se produce en, y se obtiene a partir de, un mamífero no humano desprovisto de un gen que codifique una citidina-5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y desprovisto además de un gen que codifique una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional, comprendiendo dicho ALS anticuerpos policlonales dirigidos contra dichos linfocitos humanos,
careciendo los anticuerpos policlonales de determinantes antigénicos de ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y a-1,3-galactosa.
2. Una composición de suero globulínico antitimocítico (ATG) dirigida contra timocitos humanos, para el uso en la prevención del rechazo tardío de injertos en un paciente humano, en donde dicho ATG se produce en, y se obtiene a partir de, un mamífero no humano desprovisto de un gen que codifique una citidina-5’-monofosfato ácido N-acetilneuramínico hidrolasa (CMAH) funcional y desprovisto además de un gen que codifique una a-(1,3)-galactosiltransferasa funcional,
comprendiendo dicho ATG anticuerpos policlonales dirigidos contra dichos timocitos humanos,
careciendo los anticuerpos policlonales de determinantes antigénicos de ácido N-glicolneuramínico (Neu5Gc) y a-1,3-galactosa.
3. La composición para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho mamífero no humano es un conejo, un caballo o un cerdo.
4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho mamífero no humano es un conejo o un cerdo.
5. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho mamífero no humano es un cerdo.
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