ES2829251T3 - Inmunoglobulinas conjugadas por la cys80 - Google Patents

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Earl Albone
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Abstract

Un método para generar una inmunoglobulina conjugada, el método comprende: desproteger una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina derivada de conejo, la Cys80 basada en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y conjugar un compuesto reactivo con tiol a la Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoglobulinas conjugadas por la Cys80
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII y se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad. La copia ASCII, creada el 16 de junio de 2016, se denomina 104018.000953_SL.txt y tiene un tamaño de 379441 bytes.
Campo técnico
En la presente descripción se proporcionan inmunoglobulinas conjugadas por la Cys80 y métodos para crear las mismas.
Antecedentes
La utilidad de los anticuerpos monoclonales se extiende desde la investigación básica hasta las aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. La capacidad de conjugar anticuerpos con agentes funcionales amplía aún más su funcionalidad. La fabricación de anticuerpos conjugados generalmente implica la conjugación de un enlazador, fármaco, u otro agente funcional a residuos reactivos de lisina o de cisteína en las cadenas pesada (HC) y ligera (LC) de un anticuerpo monoclonal (AcM). La conjugación de lisina está mediada, típicamente, por química basada en succinimida (NHS) o basada en isotiocianato. Dado el número de lisinas expuestas en la superficie de un anticuerpo, los enfoques de conjugación basados en amina resultan en la modificación de múltiples lisinas, aunque no todos los residuos de lisina se modifican en la misma medida. Por lo tanto, el producto final es una mezcla heterogénea de AcM con una distribución de relaciones de fármaco a anticuerpo (DAR).
La mayoría de las cisteínas dentro de un anticuerpo están involucradas en enlaces disulfuro inter o intracatenarios. La conjugación a las cisteínas requiere, por lo tanto, una reducción parcial del anticuerpo. Al igual que la conjugación basada en lisina, la conjugación basada en cisteína resulta en una mezcla heterogénea de anticuerpos conjugados que difieren en la carga del fármaco y en el sitio de conjugación. Cada especie de anticuerpo conjugado puede tener propiedades distintas, lo que a su vez podría conducir a una amplia variación de las propiedades farmacocinéticas in vivo. Adicionalmente, tal heterogeneidad puede presentar desafíos en la fabricación del anticuerpo conjugado.
El documento WO 2008/136694 A1 describe "métodos para cribar y producir polipéptidos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno, en los que: los polipéptidos comprenden dominios de unión que se derivan de inmunoglobulina de conejo. Mediante el uso de supercóntigos de la cadena pesada o de la cadena ligera de anticuerpos de conejo, los métodos permiten la identificación de bucles de CDR y regiones marco novedosos que confieren una mayor estabilidad y/o afinidad a dominios variables de inmunoglobulina aislados, en particular, en relación con los derivados de anticuerpos de roedores".
El documento WO 2011/156328 A1 describe "anticuerpos modificados genéticamente con cisteína que comprenden un aminoácido de cisteína libre en la cadena pesada o en la cadena ligera".
El documento WO 2008/144757 A1 describe "métodos para humanizar regiones variables pesadas y ligeras de conejo. Las cadenas ligeras y pesadas de conejo humanizadas resultantes y los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos que contienen son muy adecuados para usar en inmunoterapia e inmunodiagnóstico, ya que retienen la afinidad de unión al antígeno del anticuerpo original y, en base a su muy alto nivel de identidad de secuencia con las secuencias de anticuerpos humanos, deben ser esencialmente no inmunogénico en humanos".
El documento WO 2005/016950 A1 describe "un método para humanizar un anticuerpo monoclonal de conejo".
El documento WO 2014/031476 A1 describe "el uso de tecnología de hibridoma de conejo, junto con un panel de fragmentos de dominio de mesotelina truncados, para identificar AcM anti-mesotelina que se unen a regiones específicas de mesotelina".
El documento WO 2006/017759 describe "anticuerpos que se unen al marcador endotelial tumoral 1 (TEM1)".
Lyon y otros, Methods in Enzymology, capítulo 6, vol. 502, 2012-01-01, páginas 123-138 describe un método que "puede reducirse para producir cantidades de microgramos de conjugado para la detección temprana, y en un entorno de fabricación puede ampliarse para producir gramos o kilogramos del conjugado para ensayos clínicos y comercialización".
El documento WO 2014/033074 A1 describe "lanzaderas de la barrera hematoencefálica que se unen a receptores en la barrera hematoencefálica (R/BBB) y los métodos para usar los mismos".
Popkov y otros, Journal of Molecular Biology, vol. 325, no. 2, 2003-01-10, páginas 325-335 "evaluaron la diversidad de bibliotecas Fab quiméricas de conejo/humana seleccionadas y no seleccionadas que se derivaron de diferentes alotipos de la cadena ligera kappa".
Resumen
En la presente descripción se describen métodos para generar una inmunoglobulina conjugada, los métodos comprenden: desproteger una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina derivada de conejo, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y conjugar un compuesto reactivo con tiol a la Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Además, se describen métodos para generar una molécula de unión a antígeno, los métodos comprenden incubar una primera inmunoglobulina conjugada con una segunda inmunoglobulina conjugada para generar la molécula de unión a antígeno, en donde: la primera inmunoglobulina conjugada comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, la primera región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys801") en donde la Cys801 está conjugada con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol; y la segunda inmunoglobulina conjugada comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys802") en donde la Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Además, en la presente descripción se describen inmunoglobulinas que comprenden una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83, al igual que las moléculas de ácido nucleico que codifican las inmunoglobulinas y las células huésped que comprenden las moléculas de ácido nucleico.
Se describen, además, inmunoglobulinas conjugadas que comprenden las inmunoglobulinas descritas, en donde la cisteína en la posición 80 está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Además, en la presente descripción se describen métodos para tratar el cáncer en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva farmacéuticamente de una inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina, en donde la inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina comprende: cualquiera de las inmunoglobulinas contra la mesotelina descritas, y un compuesto reactivo con tiol que comprende un grupo reactivo con tiol, un enlazador, y un agente funcional.
Se describen moléculas de unión a antígeno que comprenden: una primera inmunoglobulina conjugada que comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, la primera región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), en donde la Cys801 está conjugada con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol, y una segunda inmunoglobulina conjugada que comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 (" Cys802”) en donde la Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Además, en la presente descripción se describen regiones variables de la cadena ligera para usar en una inmunoglobulina conjugada, la región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición de aminoácido 80 ("Cys80") y un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición de aminoácido 83, en donde la Cys80 no está apareada.
Las modalidades de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para generar una inmunoglobulina conjugada, el método comprende:
desproteger una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina derivada de conejo, la Cys80 basada en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y
conjugar un compuesto reactivo con tiol a la Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para generar una molécula de unión a antígeno, el método comprende incubar una primera inmunoglobulina conjugada con una segunda inmunoglobulina conjugada para generar la molécula de unión a antígeno, en donde:
la primera inmunoglobulina conjugada comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, la primera región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys801") en donde la Cys801 está conjugada con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol, y en donde la inmunoglobulina se deriva de conejo y la Cys801 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia; y
la segunda inmunoglobulina conjugada comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys802") en donde la Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol, y en donde la inmunoglobulina se deriva de conejo y la Cys802 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno producida de acuerdo con un método de la presente invención para generar una molécula de unión a antígeno.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una inmunoglobulina derivada de conejo que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys80"), en donde la Cys80 no está apareada, y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83, y en donde la Cys80 y la posición 83 se basan en el sistema de numeración de Kabat o Chothia.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una inmunoglobulina conjugada que comprende: una inmunoglobulina de la presente invención, en donde la cisteína en la posición 80 está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina para usar en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde la inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina comprende:
(E) una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a la mesotelina humana y comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO: 122);
c. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
e. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130), o
(F) una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a la mesotelina humana y comprende:
a. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:176, 178, y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11LC que se establece como las SEQ ID NO:338, 340, y 342, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:182, 184, y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:350, 352, y 354, respectivamente, o zu33O11LC-CXXI que se establece como las SEQ ID NO:356, 358, y 360, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC que se establece como las SEQ ID NO:188, 190, y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC que se establece como las SEQ ID NO:362, 364, y 366, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC que se establece como las SEQ ID NO:194, 196, y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC que se establece como las Se Q ID NO:368, 370, y 372, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC que se establece como las SEQ ID NO:200, 202, y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC que se establece como las SEQ ID NO:374, 376, y 378, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC que se establece como las SEQ ID NO:206, 208, y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC que se establece como las SEQ ID NO:380, 382, y 384, respectivamente, y
un compuesto reactivo con tiol que comprende un grupo reactivo con tiol, un enlazador, y un agente funcional, en donde el agente funcional comprende un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno que comprende: una primera inmunoglobulina conjugada que comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, la primera región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), en donde la Cys801 se conjuga con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol, y en donde la inmunoglobulina se deriva de conejo y la Cys801 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, y
una segunda inmunoglobulina conjugada que comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys802") en donde la Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol, y en donde la inmunoglobulina se deriva de conejo y la Cys802 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
El resumen, así como también la siguiente descripción detallada, se entienden mejor cuando se leen junto con los dibujos adjuntos. Con el propósito de ilustrar los métodos descritos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígenos, inmunoglobulinas, y regiones variables de la cadena ligera, en los dibujos se muestran modalidades ilustrativas; sin embargo, los métodos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas, y regiones variables de la cadena ligera no se limitan a las modalidades específicas descritas. En los dibujos:
La Figura 1 representa un alineamiento de secuencias de las cadenas ligeras humanas y de conejo. (A ) Alineamiento de las secuencias de Vk de línea germinal de conejo (IGKV1S2, X02336) y humana (IGKV1-5, Z00001). El residuo en negrita indica Cys80 (de acuerdo con la numeración de Kabat o Chothia) en la secuencia del conejo. (B) Alineamiento de las secuencias de Ck de la línea germinal de conejo (IGKC1, K01360) y humana (IGKC, J00241). El residuo en negrita indica Cys171 (numeración UE) en la secuencia de conejo.
La Figura 2 representa modelos estructurales de (A ) AcM de conejo, que muestran el enlace disulfuro Cys80-Cys171, (B) AcM humano y (C) AcM quimérico de conejo-humano que muestra la Cys80 desapareada.
La Figura 3 ilustra un alineamiento de familias Vk de la línea germinal de conejo. El residuo en la posición 80 está indicado por la flecha.
La Figura 4 muestra un análisis de espectrometría de masas ilustrativo de la cadena ligera xi155D5 cuando (A ) se reduce mediante el uso de condiciones duras (DTT 20 mM, 60 °C, 5 minutos) y (B) cuando se reduce mediante el uso de condiciones suaves (DTT 100 pM, 22 °C, 30 minutos).
La Figura 5 ilustra un análisis SE-HPLc ilustrativo de la estabilidad de xi155D5. (A) Estabilidad de xi155D5 almacenado a -80 °C. (B) Estabilidad de xi155D5 almacenado a 37 °C durante 1 semana. Solo se observó un aumento muy leve en la formación de agregados o productos de degradación. Eje Y, mAU; eje x, tiempo de retención (minutos).
La Figura 6 representa un experimento de desprotección ilustrativo que muestra que la protección de la cisteína Cys80 puede eliminarse mediante condiciones suaves de reducción (tampón que contiene cisteína 5 mM durante 16 horas seguido de lavado con un tampón que contiene Tris y no contiene cisteína durante 60 horas, todas las incubaciones se realizaron a 4°C). La masa de xi155D5 antes (A) y después (B) de la desprotección fue era 145 464 y 145221 Da, respectivamente. La diferencia (243 Da) corresponde aproximadamente a dos cisteínas libres. La Figura 7 representa un experimento de conjugación ilustrativo que muestra que una Cys80 desprotegida puede conjugarse con maleimida-PEG2-biotina. (A) La cadena ligera de xi155D5 reducida (masa pronosticada de 23399 Da) tenía una masa de 23 384 Da, y (B) después de la incubación con maleimida-PEG2-biotina, el 94 % del producto mostró un aumento de masa de 526 Da (23910 Da). Los asteriscos denotan picos de la cadena no ligera. La Figura 8 representa secuencias Vk y VH de conejo de 155D5 alineadas con los dominios variables de la línea germinal humana más homólogos. La región marco (FWR) y la región determinante de complementariedad (CDR) basadas en la numeración de Kabat se identifican por encima de las secuencias. Las CDR basadas en la numeración de Chothia están subrayadas. La mitad C-terminal de CDR2 de Kabat no se considera una CDR por la numeración de Chothia y está en cursiva.
La Figura 9 ilustra una purificación de proteína A estándar ilustrativa de zu155D5-1. La zu155D5-1 se encontró protegida (A), como se demuestra por el cambio de masa después de la desprotección (B) en 233 Da, que corresponde aproximadamente a dos cisteínas de protección.
La Figura 10 ilustra modelos estructurales ilustrativos de xi155D5 quimerizado. El modelado para determinar la proximidad de Cys80 se realizó como en la Figura 2. Se resaltaron los residuos que difieren entre xi155D5 y zu155D5-1 y se midió la distancia hasta Cys80 para cada uno. (A) Los residuos Val11, Ala14, Gly17, Thr18; (B) Lys63; (C) Thr76, Gly77, Val78, Ala83; y (D) Glu103 y Leu104, están dentro de los 11 A de Cys80, excepto para la Lys63 (18 A). Estos residuos se cambiaron de nuevo a los aminoácidos de conejo en presencia de Cys80. La Figura 11 ilustra secuencias de las cadenas ligeras de los AcM humanizados ilustrativos de 155D5, 1E4, 166B3, y 33011.
La Figura 12 representa el cribado por citometría de flujo (A-D) de sueros de animales inmunizados y (E) el cribado por ELISA de sueros de animales inmunizados. (A-D) Las células se incubaron con sueros de sangrado después de la inmunización en las diluciones indicadas (A : suero de conejo 1, después del sangrado, diluido en 1:1000; B: suero de conejo 1 después del sangrado, diluido en 1:5000; C: suero de conejo 2 después del sangrado, diluido en 1:1000; y D: suero de conejo 2 después del sangrado, diluido en 1:5000). Se muestran la señal de las células que expresan transitoriamente MSLN humana (+MSLN) y la de células negativas a MSLN (-MSLN). (E) Se recubrieron placas de ELISA con 1 pg/mL de MSLN humana a 4 °C durante la noche y se bloquearon mediante el uso de BSA al 1 % en PBS con Tween al 0,01 % (PBST) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de eliminar el tampón de bloqueo, a los pocillos se añadieron muestras diluidas en serie de los sangrados previos y posteriores a la inmunización. La placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y después se lavó tres veces con PBST. Se añadió anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con HRP en tampón de bloqueo y se incubó durante 1 hora. La placa se lavó tres veces y se añadió sustrato TMB. Se detuvo la reacción y se midió la absorbancia a 450 nm.
La Figura 13 representa un pico de proteína ilustrativo de análisis de espectrometría de masas deconvolucionado antes y después de la conjugación de maleimida-PEG2-auristatina F (AuF) a Cys80.
La Figura 14 ilustra (A) la citotoxicidad de los AcM conjugados MSLN-AuF Cys80 contra células A431 negativas para MSLN y (B) la citotoxicidad de los AcM conjugados MSLN-AuF Cys80 contra células A431 MSLN positivas para MSLN.
La Figura 15 representa los volúmenes tumorales promedio entre diferentes grupos de tratamiento.
La Figura 16 representa (A) los volúmenes tumorales promedio de A431-MSLN (flanco izquierdo) entre diferentes grupos de tratamiento y (B) los volúmenes tumorales promedio entre diferentes grupos de tratamiento para A431 (flanco derecho).
La Figura 17 representa un análisis SDS-PAGE de un anticuerpo ilustrativo conjugado xi155D5-800CW. (A) mwm, marcador de peso molecular; carril 1, xi155D5, no conjugado, no reducido; carril 2, xi155D5, xi155D5-800CW, no reducido; carril 3, en blanco; carril 4, xi155D5 no conjugado, reducido; carril 5, xi155D5, xi155D5-800CW, reducido. Todos los carriles contienen 5 pg de proteína teñida con Coomassie. (B) El mismo gel que en A, fotografiado en el sistema IVIS. Los resultados indican que IRDye 800CW se conjuga solo en la cadena ligera de xi155D5. El análisis del ELISA de xi155D5-800CW indica que se retiene la unión completa a CA9 (datos no mostrados).
La Figura 18 ilustra la localización específica de tumor de un anticuerpo conjugado con DyeIR 800CW ilustrativo (xi155D5-800CW). Se injertaron células humanas colo205 (A-D) y HT-29 (E-H) en ratones desnudos, que después se inyectaron con xi155D5-800CW. La señal fluorescente (naranja-roja) se controló en varios momentos, que incluyen 0 horas (A y E), 4 horas (B y F), 24 horas (C y G) y 72 horas (D y H) (se muestra solo 0-72 horas y flanco derecho). Se muestra la ubicación aproximada del riñón (K) y el tumor (T).
La Figura 19 ilustra una purificación ilustrativa de una molécula de unión a antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1-55-2. Gráfico de cromatografía de filtración en gel que muestra el pico correspondiente a la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1-55-2 (denominada "biFab") (A). El tamaño molecular de la fracción se analizó mediante SDS-PAGE (B). Las fracciones que contenían la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífico xi155D5/xi1-55-2 (biFab) se combinaron y la masa se determinó mediante espectrometría de masas (C).
La Figura 20 ilustra la biespecificidad de una molécula de unión a antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1-55-2 (biFab) ilustrativa. El CA9 humano biotinilado se capturó en puntas de biosensor de estreptavidina octeto. Los compuestos se añadieron como indica la primera flecha ("compuesto") y después se permitió la unión. Posteriormente, se añadió TEM-1 humano soluble (segunda flecha; "TEM-1") y se midió su unión a los complejos capturados CA9/compuesto. El cambio de respuesta (flecha doble), que indica la captura de TEM-1 soluble, se observó solo con la molécula de unión a antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1-55-2 (biFab).
La Figura 21 ilustra un análisis SDS-PAGE de los AcM conjugados xi33O11-Ap (1-16) Cys80 y los AcM conjugados xi1-55-2-Ap (1-16) Cys80. Se muestran los productos antes (B) y después (A) de la conjugación de AcM-DBCO con el péptido Ap(1-16). MW, marcador de peso molecular. LC, cadena ligera.
La Figura 22 ilustra un análisis de espectrometría de masas ilustrativo de la cadena ligera original (LC) xil-55-2 y xi33O11 (A y B, respectivamente), LC conjugada xil-55-2-DBCO Cys80 y LC conjugada xi33O11 -d Bc O Cys80 (C y D, respectivamente), y LC conjugada xi1-55-2-Ap(1-16) Cys80 y LC conjugada xi33O11-Ap(1-16) Cys80 (E y F, respectivamente).
La Figura 23 muestra un esquema ilustrativo para generar moléculas de unión a antígeno. Las inmunoglobulinas derivadas de conejo pueden digerirse con papaína para generar Fab. Un primer Fab puede incubarse con maleimida-DBCO y un segundo Fab puede incubarse con maleimida-azida. El primer y segundo Fab pueden combinarse para formar una molécula de unión Fab-Fab biespecífica. SPAAC = conjugación alquino-azida promovida por tensión.
Descripción detallada de las modalidades ilustrativas
Los métodos descritos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígenos, inmunoglobulinas, y regiones variables de la cadena ligera pueden entenderse más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada tomada en relación con las figuras adjuntas, que forman parte de esta descripción. Debe entenderse que los métodos descritos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígenos, inmunoglobulinas, y regiones variables de la cadena ligera no se limitan a las modalidades específicas descritas y/o mostradas en la presente descripción, y que la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir modalidades particulares a modo de ejemplo solamente y no pretende ser una limitación de los métodos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas, y regiones variables de la cadena ligera reivindicados.
A menos que se indique específicamente lo contrario, cualquier descripción en cuanto a un posible mecanismo o modo de acción o razón para la mejora se pretende que sea ilustrativa solamente, y los métodos descritos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas, y regiones variables de la cadena ligera no deben limitarse por la corrección o incorrección de cualquier mecanismo sugerido o modo de acción o razón para la mejora.
A lo largo de este texto, las descripciones se refieren a inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígenos, inmunoglobulinas, y regiones variables de la cadena ligera y métodos para generar las mismas. Cuando la descripción describe o reivindica una característica o modalidad asociada con una inmunoglobulina conjugada, molécula de unión a antígeno, inmunoglobulina, o región variable de la cadena ligera, tal característica o modalidad es igualmente aplicable a los métodos de generación de la misma. De igual forma, cuando la descripción describe o reivindica una característica o modalidad asociada con un método para generar una inmunoglobulina conjugada, molécula de unión a antígeno, inmunoglobulina, o región variable de la cadena ligera, tal característica o modalidad es igualmente aplicable a la inmunoglobulina conjugada, antígeno- molécula de unión, inmunoglobulina, o región variable de la cadena ligera.
La referencia a un valor numérico particular incluye al menos ese valor particular, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cuando se expresa un intervalo de valores, otra modalidad incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. Además, la referencia a los valores indicados en los intervalos incluye todos y cada uno de los valores dentro de ese intervalo. Todos los intervalos son inclusivos y combinables.
Cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra modalidad.
Debe apreciarse que determinadas características de los métodos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígenos, inmunoglobulinas, y regiones variables de la cadena ligera descritos que, para mayor claridad, se describen en la presente descripción en el contexto de modalidades separadas, pueden proporcionarse, además, en combinación en una sola modalidad. A la inversa, diversas características de los métodos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas, y regiones variables de la cadena ligera descritos que, por brevedad, se describen en el contexto de una única modalidad, pueden proporcionarse, además, por separado o en cualquier subcombinación.
Como se usa en la presente descripción, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen el plural.
El término "que comprende" pretende incluir ejemplos abarcados por los términos "que consiste esencialmente en" y "que consiste en"; de manera similar, el término "que consiste esencialmente en" pretende incluir ejemplos abarcados por el término "que consiste en".
Se usan diversos términos relacionados con aspectos de la descripción a lo largo de la descripción y las reivindicaciones. A tales términos debe dársele su significado corriente en la técnica a menos que se indique lo contrario. Otros términos definidos específicamente deben interpretarse de manera coherente con las definiciones proporcionadas en la presente descripción.
El término "aproximadamente" cuando se usa en referencia a intervalos numéricos, límites, o valores específicos se usa para indicar que los valores enumerados pueden variar hasta en un 10 % del valor enumerado. Por lo tanto, el término "aproximadamente" se usa para abarcar variaciones de ± 10 % o menos, variaciones de ± 5 % o menos, variaciones de ± 1 % o menos, variaciones de ± 0,5 % o menos, o variaciones de ± 0,1 % o menos del valor especificado.
Como se usa en la presente descripción, el término "muestra biológica" se refiere a una muestra que se obtiene de un sujeto, que incluye una muestra de tejido biológico o de origen fluido que se obtiene in vivo o in vitro. Tales muestras pueden ser, pero no se limitan a, fluido corporal (por ejemplo, sangre, plasma sanguíneo, suero, leche, fluido espinal, ascitis, u orina), órganos, tejidos, fracciones, y células aisladas de mamíferos, que incluye humanos. Las muestras biológicas pueden incluir, además, secciones de la muestra que se obtiene de un sujeto, que incluye tejidos (por ejemplo, porciones en sección de un órgano o tejido). Las muestras biológicas pueden incluir, además, extractos de una muestra que se obtiene de un sujeto, por ejemplo, un antígeno de un fluido biológico (por ejemplo, sangre u orina).
El término "cisterna de protección" se refiere a una cisteína libre de la solución que forma un enlace disulfuro con la Cys80 de la región variable de la cadena ligera.
El término "quimerizado", "quimérico", "anticuerpo quimérico" y términos similares se refieren a una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, es decir, la región de unión a antígeno, de una fuente o especie y al menos una porción de una región constante de la cadena pesada y una región constante de la cadena ligera derivada de una fuente o especie diferente. Estas porciones pueden unirse químicamente mediante técnicas convencionales (por ejemplo, sintéticas) o prepararse como un polipéptido contiguo mediante el uso de técnicas de ingeniería genética (por ejemplo, el ADN que codifica las porciones de proteína del anticuerpo quimérico puede expresarse para producir una cadena polipeptídica contigua). Las inmunoglobulinas quiméricas ilustrativas incluyen aquellas que comprenden una región variable de conejo y una región constante humana. Tales inmunoglobulinas quiméricas de conejo/humano son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina de conejo y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina humana. Otras formas de "inmunoglobulinas quiméricas" abarcadas por la presente descripción son aquellas en las que la clase o subclase se han modificado o cambiado a partir de la de la inmunoglobulina original (también denominadas "inmunoglobulinas de clase conmutada"). A lo largo de la descripción, las inmunoglobulinas quiméricas se denominan "xi". En la presente descripción, "inmunoglobulina quimérica" y términos similares se refieren a la secuencia de la inmunoglobulina en lugar del proceso usado para generar el anticuerpo.
Como se usa en la presente descripción, "Cys80" se refiere a un residuo de cisteína en la posición del aminoácido 80 de la región variable de la cadena ligera con respecto a una región variable de la cadena ligera sin una secuencia líder. Por ejemplo, las regiones variables de la cadena ligera descritas en la Tabla 25 comprenden una secuencia líder de 19 aminoácidos (codificada por 57 nucleótidos). "Cys80" se produce en la posición 99 del aminoácido cuando la secuencia líder está presente y en la posición 80 del aminoácido cuando la secuencia líder está ausente. La numeración Cys80 se basa en el sistema de numeración de Kabat/Chothia.
El término "desprotección" se refiere a la eliminación de la cisteína de protección mediante el uso de los métodos proporcionados en la presente descripción en condiciones que minimizan la rotura de los disulfuros nativos intra e intercatenarios de la inmunoglobulina.
El término "inmunoglobulina derivada de" se refiere a inmunoglobulinas, o porciones de estas, que tienen al menos las regiones CDR de una inmunoglobulina de conejo. "Inmunoglobulina derivada de" incluye inmunoglobulinas quimeras conejo/humano o inmunoglobulinas de conejo humanizadas. El nivel de variabilidad tolerado al derivar una inmunoglobulina de un conejo puede determinarse, por ejemplo, por el Consejo de Nombres Adoptados de los Estados Unidos (USAN) de la Asociación Médica Estadounidense (AMA).
Como se usa en la presente descripción, "agente funcional" se refiere a un agente que tiene propiedades terapéuticas, de diagnóstico, u otras propiedades funcionales. Diversos agentes funcionales que caen dentro del alcance de la descripción se describen en otra parte de la presente descripción.
El término "humanizado", "inmunoglobulina humanizada" y términos similares se refieren a inmunoglobulinas de origen de conejo en las que la secuencia de aminoácidos en todas las regiones variables se cambia a secuencias que tienen homología con una región variable humana. Las inmunoglobulinas humanizadas ilustrativas pueden comprender un dominio variable de conejo mediante el cual los residuos en toda la región marco (FWR) y/o las CDR se reemplazan por secuencias homólogas a una inmunoglobulina humana. En algunos casos, los residuos de FWR de la inmunoglobulina de conejo no se reemplazan por los residuos humanos correspondientes. Alternativamente, "humanizado", "inmunoglobulina humanizada" y términos similares pueden referirse a inmunoglobulinas de origen humano en las que los residuos en todo el FWR y/o las CDR se reemplazaron por secuencias homólogas a una inmunoglobulina de conejo. Por ejemplo, las inmunoglobulinas humanizadas pueden ser inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de una región hipervariable de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una inmunoglobulina de conejo que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad convenientes. Además, las inmunoglobulinas humanizadas pueden comprender residuos que no se encuentran en la inmunoglobulina receptora o en la inmunoglobulina del donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento de las inmunoglobulinas. En general, la inmunoglobulina humanizada comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FWR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. La inmunoglobulina humanizada puede comprender opcionalmente, además, al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Ver, por ejemplo, Riechmann, L., y otros, Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M. S., y otros, Nature 314 (1985) 268-270. A lo largo de la descripción, las "inmunoglobulinas humanizadas" se denominan "zu". En la presente descripción, "inmunoglobulina humanizada" y términos similares se refieren a la secuencia de la inmunoglobulina en lugar del proceso usado para generar la inmunoglobulina.
El término "inmunoglobulina donante" se refiere a una inmunoglobulina no humana que aporta las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, CDR, u otros fragmentos funcionales o análogos de estas a la inmunoglobulina humanizada y, por lo tanto, proporciona a la inmunoglobulina humanizada la especificidad antigénica y la actividad neutralizante característica de la inmunoglobulina donante.
El término "inmunoglobulina receptora" se refiere a una inmunoglobulina heteróloga con respecto a la inmunoglobulina donante, que proporciona las secuencias de aminoácidos de sus regiones marco de la cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de la cadena pesada y/o ligera a la inmunoglobulina humanizada. La inmunoglobulina receptora puede derivarse de cualquier mamífero. En modalidades preferidas, la inmunoglobulina receptora no es inmunogénica en humanos. Preferentemente, la inmunoglobulina receptora es una inmunoglobulina humana.
"Humanizar" se refiere a un proceso de generación de una inmunoglobulina humanizada e incluye cualquier proceso para generar inmunoglobulinas humanizadas que tengan las características anteriores, que incluyen, pero no se limitan a, humanización in silico, modificación genética de la CDR de especies/del huésped en las inmunoglobulinas humanas, sustituir los residuos de la región marco de una inmunoglobulina quimérica para que coincida con una región marco humana correspondiente, etcétera.
"Aminoácido hidrófobo" se refiere a un aminoácido que exhibe una hidrofobicidad mayor que cero según la escala de hidrofobicidad consenso normalizada de Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Los aminoácidos hidrófobos codificados genéticamente incluyen Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) y Tyr (Y).
"Inmunoglobulina", como se usa en la presente descripción, se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina que incluyen las cadenas ligeras kappa y lambda y las cadenas pesadas alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de región variable en el extremo NH2-terminal (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el terminal COOH-. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos) están codificadas de manera similar por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante mencionados anteriormente, por ejemplo, gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). Las "inmunoglobulinas" incluyen: (a) polipéptidos de inmunoglobulina, es decir, polipéptidos de la familia de las inmunoglobulinas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a un antígeno específico (por ejemplo, MSLN, CA9, TEM1, etcétera), que incluye todos los isotipos de inmunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD, e IgY), clases (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), subclases, y diversas formas monoméricas y poliméricas de cada isotipo, a menos que se especifique lo contrario; y (b) variantes sustituidas de forma conservadora de tales polipéptidos de inmunoglobulina que se unen inmunoespecíficamente al antígeno (por ejemplo, MSLN, CA9, t EM1, etcétera). Las inmunoglobulinas se describen generalmente en, por ejemplo, Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
Una forma de inmunoglobulina descrita en la presente descripción constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir un tetrámero y consta de dos pares idénticos de las cadenas de inmunoglobulina, cada par que tiene una cadena ligera y una cadena pesada. Generalmente, en cada par, las regiones variables de la cadena ligera y cadena pesada juntas son responsables de unirse a un antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras del anticuerpo.
Además de los anticuerpos, las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de otras formas que incluyen, por ejemplo: fragmentos de unión a antígeno o porciones de una inmunoglobulina, tales como fragmentos Fv, Fab, (Fab')2 y Fv; y formatos de anticuerpos alternativos tales como inmunoglobulinas de la cadena simple (scFV y scFab), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales, y anticuerpos multiespecíficos, por nombrar algunos. Ver, por ejemplo, James D. Marks, Antibody Engineering, Chapter 2, Oxford University Press (1995) (Carl K. Borrebaeck, Ed.)
Como se usa en la presente descripción, el término "inmunoespecíficamente" se refiere a la capacidad de una inmunoglobulina de unirse específicamente a un antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina y no unirse específicamente a otros péptidos o proteínas. Una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a un antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina puede no unirse a otros polipéptidos o proteínas, o puede unirse a otros polipéptidos o proteínas con una afinidad de unión menor que al antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina como se determina mediante, por ejemplo, inmunoensayos, BIAcore, u otros ensayos conocidos en la técnica. Una inmunoglobulina se une inmunoespecíficamente a un antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina cuando se une al antígeno con una mayor afinidad de unión que a cualquier antígeno de reactividad cruzada, como se determina mediante el uso de técnicas experimentales, tales como, pero no limitadas a, radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) (ver, por ejemplo, Paul, ed., Fundamental Immunology, 2da ed., Raven Press, Nueva York, pag 332-336 (1989) para una discusión sobre la especificidad de los anticuerpos).
"Enlazador", como se usa en la presente descripción, se refiere a un espaciador, que puede ser una cadena lineal o ramificada, para conectar una inmunoglobulina (a través de un grupo reactivo con tiol en la Cys80 desapareada) a un agente funcional. Tales enlazadores pueden ser escindibles (por ejemplo, lábiles en ácido o escindibles por proteasa) o no escindibles.
El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un clon de una sola célula, que incluye cualquier clon de células eucariotas o procariotas, o un clon de fagos, y no al método mediante el cual se produce. Un anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. El término "anticuerpo monoclonal" no se limita a los anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridomas.
"Nativa" se refiere a la secuencia de inmunoglobulina de tipo silvestre de la especie de la que se deriva la inmunoglobulina. Por ejemplo, en modalidades en donde la Cys80 está presente en la región variable de la cadena ligera de la especie a partir de la que se deriva, se dice que la Cys80 está presente en la región variable de la cadena ligera nativa.
Como se usa en la presente descripción, "porcentaje de identidad" y términos similares se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos, polinucleótidos, proteínas, o polipéptidos, y se entiende en el contexto de, y junto con los términos que incluyen: (a) secuencia de referencia, (b) ventana de comparación, (c) identidad de secuencia y (d) porcentaje de identidad de secuencia.
(a) Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se usa como una base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmento de una secuencia génica o de ADNc de longitud completa, o la secuencia génica o ADNc completa. Para los polipéptidos, las longitudes ilustrativas de la secuencia polipeptídica de referencia incluyen al menos aproximadamente 16 aminoácidos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos, al menos aproximadamente 35 aminoácidos, al menos aproximadamente 50 aminoácidos, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud ilustrativa de la secuencia de ácido nucleico de referencia incluye al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 75 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, o al menos aproximadamente 300 nucleótidos, o cualquier número entero aproximado o entre ellos. (b) Una "ventana de comparación" incluye una referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos, en donde la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos puede compararse con una secuencia de referencia y en donde la parte de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones, sustituciones, o deleciones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones, sustituciones, o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. Las ventanas de comparación ilustrativas pueden tener una longitud de al menos 20 nucleótidos o aminoácidos contiguos y, opcionalmente, pueden tener 30, 40, 50, 100, o más. Los expertos en la técnica entienden que para evitar una similitud engañosamente alta con una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos, típicamente, se introduce una penalización por espacios y se resta del número de coincidencias.
(c) Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981; mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970; por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988; mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos, que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el paquete de programas informático de Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), 7 Science Dr., Madison, Wis., EE.UU.; el programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins y Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988; Corpet, y otros, Nucleic Acids Research, 16:881-90, 1988; Huang, y otros, Computer Applications in the Biosciences, 8:1-6, 1992; y Pearson, y otros, Methods in Molecular Biology, 24:7-331, 1994. La familia de programas BLAST que puede usarse para búsquedas de similitudes en bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de proteínas; BLASTP para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos. Ver, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, y otros, Eds., Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, 1995. Indudablemente, en el futuro estarán disponibles nuevas versiones de los programas anteriores o nuevos programas en su conjunto, y pueden usarse con la presente descripción.
(d) "Porcentaje de identidad" significa el valor determinado mediante la comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones, sustituciones, o deleciones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones, sustituciones, o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
"Cantidad efectiva farmacéuticamente" se refiere a una cantidad de una inmunoglobulina con la que se trata al sujeto. "Aminoácido polar" se refiere a un aminoácido hidrófilo que tiene una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico, pero que tiene al menos un enlace en el que el par de electrones compartidos en común por dos átomos se mantiene más cerca de uno de los átomos. Los aminoácidos polares codificados genéticamente incluyen Asn (N), Gln (Q), Ser (S) y Thr (T).
El término "sujeto" como se usa en la presente descripción se refiere a un organismo humano o no humano. Por lo tanto, los métodos, inmunoglobulinas, e inmunoglobulinas conjugadas descritos en la presente descripción son aplicables a enfermedades y afecciones tanto humanas como veterinarias. Los sujetos pueden ser "pacientes", es decir, seres humanos vivos u organismos no humanos que reciben atención médica por una enfermedad o afección, o seres humanos u organismos no humanos sin una enfermedad definida que se investigan en busca de signos de patología o presencia/ausencia de una afección particular.
"Sustituir" se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido por otro. "Sustituir' incluye, por ejemplo, mutaciones sin sentido en uno o más pares de bases de ADN que codifican el residuo de aminoácido o modificar genéticamente la proteína para intercambiar un aminoácido con otro.
Como se usa en la presente descripción, "tratar" y términos similares se refieren a reducir la gravedad y/o frecuencia de los síntomas de la enfermedad, eliminar los síntomas de la enfermedad y/o la causa subyacente de dichos síntomas, reducir la frecuencia o probabilidad de los síntomas de la enfermedad y/o su causa subyacente, y mejorar o remediar los daños causados, directa o indirectamente, por la enfermedad. Las enfermedades ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, cáncer.
"Grupo reactivo con tiol" se refiere a un reactivo o grupo que puede formar un enlace covalente con el grupo tiol en una cisteína.
"Cys80 no apareada" se refiere a una Cys80 presente en una inmunoglobulina que tiene un grupo funcional tiol que no está implicado en un enlace disulfuro intramolecular o intermolecular. Por ejemplo, un grupo funcional tiol de una "Cys80 desapareada" no está implicado en un enlace disulfuro con Cys171.
Como se usa en la presente descripción, "90 % idéntico a" abarca al menos 90 % idéntico, 91 % idéntico, 92 % idéntico, 93 % idéntico, 94 % idéntico, 95 % idéntico, 96 % idéntico, 97 % idéntico, 98 % idéntico, 99 % idéntico, o 100 % idéntico al elemento de referencia (por ejemplo, una secuencia biológica).
Las siguientes abreviaturas se utilizan a lo largo de la descripción: conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC); fármaco-a-anticuerpo (DAR); región del marco (FWR); región determinante de complementariedad (CDR); anhidrasa carbónica IX (CA9); mesotelina (MSLN); auristatina F (AuF); región variable pesada (VH); región variable ligera (VL); variable kappa (Vk); conejo (Rb; rabb); región constante gamma (Cy); región constante kappa (Ck); anticuerpo monoclonal (AcM); cisteína en la posición del aminoácido 80 (Cys80).
Generación de inmunoglobulinas conjugadas
En la presente descripción se describen métodos para generar una inmunoglobulina conjugada, los métodos comprenden:
desproteger una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina derivada de conejo, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y
conjugar un compuesto reactivo con tiol a la Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Las regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La región variable de la cadena ligera de las inmunoglobulinas descritas se deriva de conejo. En algunas modalidades, la Cys80 puede estar presente en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Los conejos ilustrativos a partir de los que puede derivarse una región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80 incluyen, pero no se limitan a, Oryctolagus cuniculus. En algunos aspectos, por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo Blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
Los métodos ilustrativos para desproteger una Cys80 en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina incluyen incubar la inmunoglobulina con un tampón reductor seguido de la incubación de la inmunoglobulina con un tampón oxidante. Los tampones reductores comprenden uno o más agentes reductores. Los agentes reductores adecuados incluyen, por ejemplo, cisteína (que incluye L-cisteína y D-cisteína), 2mercaptoetilamina, Tris (2-carboxietil) fosfina, ácido 2-mercaptoetanosulfónico, ácido 2-mercaptopropiónico, o combinaciones de estos. En modalidades preferidas, el tampón reductor puede comprender un reductor suave tal como cisteína. La concentración de agente reductor puede variar de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 90 mM, de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 80 mM, de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 70 mM, de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 25 mM, de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 5 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 0,2 mM. La concentración de agente reductor puede ser aproximadamente 1 mM. La concentración de agente reductor puede ser aproximadamente 2 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 5 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 10 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 15 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 20 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 25 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 30 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 40 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 50 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 60 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 70 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 80 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 90 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 100 mM.
En algunas modalidades, por ejemplo, el agente reductor puede comprender desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 10 mM de cisteína. En algunas modalidades, el agente reductor puede comprender desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 10 mM de D-cisteína. En algunas modalidades, el agente reductor puede comprender desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 10 mM de L-cisteína. En algunas modalidades, el agente reductor puede comprender desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM de 2-mercaptoetilamina. En algunas modalidades, el agente reductor puede comprender desde aproximadamente 0,2 mM hasta aproximadamente 5 mM de Tris (2-carboxietil) fosfina. En algunas modalidades, el agente reductor puede comprender desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 20 mM de ácido 2-mercaptoetanosulfónico. En algunas modalidades, el agente reductor puede comprender desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 20 mM de ácido 2-mercaptopropiónico.
El tampón reductor puede comprender, además, agentes tamponantes tales como fosfato de sodio, fosfato de potasio, MOPS, HEPES, borato de sodio, borato de potasio, o cualquier combinación de estos. Las concentraciones adecuadas de agente tamponante incluyen, pero no se limitan a, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 30 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 35 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 60 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 80 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 90 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 80 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 60 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 40 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 30 mM, o desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 20 mM.
En algunas modalidades, por ejemplo, el tampón reductor puede contener desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM de fosfato de sodio. En algunas modalidades, el tampón reductor puede contener desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM de fosfato de potasio. En algunas modalidades, el tampón reductor puede contener desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM de MOPS. En algunas modalidades, el tampón reductor puede contener desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM de HEPES. En algunas modalidades, el tampón reductor puede contener desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM de borato de sodio. En algunas modalidades, el tampón reductor puede contener desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM de borato de potasio.
El tampón reductor puede contener, además, un agente quelante que incluye, pero no se limita a, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), o una combinación de estos. Las concentraciones adecuadas de agentes quelantes incluyen desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 80 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 60 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 40 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 30 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 20 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 30 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 60 mM hasta aproximadamente 100 mM, o desde aproximadamente 80 mM hasta aproximadamente 100 mM.
Los intervalos de pH adecuados del tampón reductor incluyen desde aproximadamente 6,8 hasta aproximadamente 8,0. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 6,8. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 6,9. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,0. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,1. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,2. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,3. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,4. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,5. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,6. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,7. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,8. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 7,9. En algunas modalidades, el pH del tampón reductor puede ser de aproximadamente 8,0.
La inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 18 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 30 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 36 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 42 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 54 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 60 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 90 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 84 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 78 horas, desde aproximadamente 12 horas ha sta aproximadamente 72 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 66 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 60 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 54 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 42 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 36 horas, o desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 30 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 12 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 18 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 24 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 30 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 36 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 42 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 48 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 54 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 60 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 66 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 72 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 78 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 84 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 90 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante aproximadamente 96 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón reductor durante más de 96 horas.
Los tampones oxidantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, tampones basados en Tris, basados en glutamina, basados en arginina u otros basados en aminoácidos, o basados en aminas primarias. La concentración de tampón oxidante puede variar desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 60 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 80 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 80 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 60 mM, o desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 40 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 20 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 25 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 30 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 40 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 50 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 60 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 70 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 80 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 90 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 100 mM.
La inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 30 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 36 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 42 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 54 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 60 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 90 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 84 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 78 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 72 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 66 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 60 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 54 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 42 horas, o desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 36 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 24 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 30 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 36 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 42 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 48 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 54 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 60 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 66 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 72 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 78 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 84 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 90 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante aproximadamente 96 horas. En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede incubarse con el tampón oxidante durante más de 96 horas.
Los intervalos de pH adecuados del tampón oxidante incluyen desde aproximadamente 7,5 hasta aproximadamente 9,0. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 7,5. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 7,6. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 7,7. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 7,8. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 7,9. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,0. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,1. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,2. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,3. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,4. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,5. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,6. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,7. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,8. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 8,9. En algunas modalidades, el pH del tampón oxidante puede ser de aproximadamente 9,0.
El método puede comprender, además, inmovilizar la inmunoglobulina en una matriz antes de la incubación con el agente reductor y eluir la inmunoglobulina de la matriz después de la incubación con el tampón oxidante. Las matrices adecuadas incluyen cualquier superficie a la que pueda unirse y eluirse una inmunoglobulina que incluye, pero no se limita a, proteína A, proteína G, proteína L, anticuerpo anti-Fab, anticuerpo anti-Fc, soportes de afinidad basados en anti-AcM, y resinas de intercambio catiónico fuertes. En algunas modalidades, la matriz puede ser la proteína A. En algunas modalidades, la matriz puede ser la proteína G. En algunas modalidades, la matriz puede ser la proteína L. En algunas modalidades, la matriz puede comprender un anticuerpo anti-Fab. En algunas modalidades, la matriz puede comprender un anticuerpo anti-Fc. En algunas modalidades, la matriz puede comprender un anti-AcM. En algunas modalidades, la matriz puede comprender una resina de intercambio catiónico fuerte.
Los métodos descritos para desproteger una inmunoglobulina pueden comprender: equilibrar una matriz; inmovilizar la inmunoglobulina sobre la matriz; incubar la inmunoglobulina inmovilizada en la matriz con un tampón reductor para eliminar el grupo de protección; incubar la inmunoglobulina inmovilizada en la matriz con un tampón oxidante; eluir la inmunoglobulina de la matriz y neutralizar la inmunoglobulina.
Los expertos en la técnica reconocerán que el tampón, la concentración, el pH, y el tiempo para eluir la inmunoglobulina de la matriz dependerán, al menos en parte, de la matriz. Por ejemplo, en modalidades en donde la matriz es la proteína A, la inmunoglobulina puede eluirse de la proteína A mediante el uso de glicina (por ejemplo, 0,1 M a pH 2,9). En algunas modalidades, la elución puede realizarse en un tampón de pH bajo.
Neutralizar la inmunoglobulina puede comprender incubar la inmunoglobulina en un tampón basado en Tris, basado en fosfato de sodio, o basado en fosfato de potasio (denominado en la presente descripción "tampón de neutralización"). El tampón de neutralización puede tener una concentración de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 2 M y un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 9,5.
La conjugación puede realizarse mediante la disolución de un compuesto reactivo con tiol en una solución de disolución y la incubación del compuesto reactivo con tiol disuelto con la inmunoglobulina en un tampón de conjugación.
Para compuestos reactivos con tiol insolubles en agua, que pueden incluir, pero no se limitan a, compuestos basados en maleimida, las soluciones de disolución adecuadas incluyen disolventes orgánicos miscibles en agua tales como dimetilsulfóxido (DMSO). Para compuestos reactivos con tiol solubles en agua, las soluciones de disolución adecuadas incluyen, pero no se limitan a, agua o soluciones acuosas tamponadas, tales como solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2 (PBS 1x).
Las concentraciones adecuadas de compuestos reactivos con tiol incluyen desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 55 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 70 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 90 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 75 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 60 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 50 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 40 mM, o desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 30 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 10 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 20 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 30 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 40 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 50 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 60 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 70 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 80 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 90 mM. En algunas modalidades, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser de aproximadamente 100 mM.
Las concentraciones adecuadas de inmunoglobulina incluyen desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 20 mg/mL, desde aproximadamente 0,5 mg/mL hasta aproximadamente 20 mg/mL, desde aproximadamente 1 mg/mL hasta aproximadamente 20 mg/mL, desde aproximadamente 5 mg/mL hasta aproximadamente 20 mg/mL, desde aproximadamente 10 mg/mL hasta aproximadamente 20 mg/mL, desde aproximadamente 0,1 mg/mL hasta aproximadamente 15 mg/mL, desde aproximadamente 0,1 mg/mL hasta aproximadamente 12 mg/mL, desde aproximadamente 0,1 mg/mL hasta aproximadamente 10 mg/mL, desde aproximadamente 0,1 mg/mL hasta aproximadamente 5 mg/mL, o desde aproximadamente 0,1 mg/mL hasta aproximadamente 2 mg/mL. En algunas modalidades, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 0,1 mg/mL. En algunas modalidades, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 0,5 mg/mL. En algunas modalidades, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 1 mg/mL. En algunas modalidades, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 2 mg/mL. En algunas modalidades, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 5 mg/mL. En algunas modalidades, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 10 mg/mL. En algunas modalidades, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 15 mg/mL. En algunas modalidades, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 20 mg/mL.
Las proporciones adecuadas de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina incluyen de aproximadamente 3:1 hasta 20:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina puede ser 3:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina puede ser 4:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina puede ser 5:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina puede ser 6:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina puede ser 7:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina puede ser de 8:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser de 9:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser de 10:1. En algunas modalidades , la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser 11:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser 12:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser 13:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser 14:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser de 15:1. En algunas modalidades , la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser 16:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser 17:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser 18:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser 19:1. En algunas modalidades, la proporción de compuesto reactivo con tiol :inmunoglobu ina puede ser de 20:1.
La incubación puede realizarse en numerosos tampones de conjugación adecuados que incluyen, por ejemplo, PBS 1x, pH 7,2, fosfato de sodio, fosfato de potasio, borato de sodio, y HEPES, por nombrar algunos. La concentración de tampón de conjugación incluye desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 30 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 45 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 60 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 90 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 75 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 60 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 45 mM, o desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 30 mM. En algunas modalidades, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 10 mM. En algunas modalidades, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 20 mM. En algunas modalidades; la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 30 mM. En algunas modalidades la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 40 mM. En algunas modalidades la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 50 mM. En algunas modalidades la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 60 mM. En algunas modalidades la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 70 mM. En algunas modalidades la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 80 mM. En algunas modalidades la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 90 mM. En algunas modalidades la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 100 mM.
El tampón de conjugación puede incluir, además, cloruro de sodio. Las concentraciones adecuadas de cloruro de sodio incluyen desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 250 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 350 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 350 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 300 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 250 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 200 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 150 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 50 mM, o desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 25 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 25 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 50 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 75 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 100 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 150 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 200 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 250 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 300 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 350 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 400 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 500 mM.
El pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,5. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,6. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,7. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,8. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,9. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,0. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,1. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,2. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,3. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,4. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,5. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,6. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,7. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,8. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,9. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,0. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,1. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,2. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,3. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,4. En algunas modalidades, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,5.
Para facilitar la solubilidad del compuesto reactivo con tiol en el tampón de conjugación, una concentración final de disolvente orgánico miscible con agua en el tampón de conjugación puede ser desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 2 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 5 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 8 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 11 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 16 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 18 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 15 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 12 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 10 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 8 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 6 % o desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 2 %.
El tampón de conjugación puede comprender, además, propilenglicol para facilitar la solubilidad del compuesto reactivo con tiol en el tampón de conjugación. Las concentraciones adecuadas de propilenglicol incluyen desde aproximadamente 10 % hasta aproximadamente 50 %, desde aproximadamente 20 % hasta aproximadamente 50 %, desde aproximadamente 30 % hasta aproximadamente 50 %, desde aproximadamente 40 % hasta aproximadamente 50 %, desde aproximadamente 10 % hasta aproximadamente 40 %, desde aproximadamente 10 % hasta aproximadamente 30 %, o desde aproximadamente 10 % hasta aproximadamente 20 %. En algunas modalidades, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 10 %. En algunas modalidades, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 20 %. En algunas modalidades, la concentración de propilenglicol puede ser aproximadamente 30 %. En algunas modalidades, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 40 %. En algunas modalidades, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 50 %.
El tampón de conjugación puede comprender, además, un detergente no ióni
inmunoglobulina conjugada en el tampón de conjugación. Los detergentes no iónicos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, polisorbato-20 o polisorbato-80. Las concentraciones adecuadas de detergente no iónico incluyen desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 1 %, desde aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 1 %, desde aproximadamente 0,3 % hasta aproximadamente 1 %, desde aproximadamente 0,5 % hasta aproximadamente 1 %, desde aproximadamente 0,7 % hasta aproximadamente 1 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 0,8 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 0,6 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 0,4 % o desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 0,2 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,1 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,2 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,3 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,4 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,5 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,6 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,7 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,8 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,9 %. En algunas modalidades, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 1,0 %.
La incubación puede realizarse durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 30 horas hasta aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 36 horas hasta aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 42 horas hasta aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 42 horas, durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 36 horas, durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 30 horas, durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 24 horas, durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 18 horas, durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 12 horas, o durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 6 horas. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse durante 2 horas. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse durante 6 horas. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse durante 12 horas. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse durante 18 horas. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse durante 24 horas. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse durante 30 horas. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse durante 36 horas. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse durante 42 horas. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse durante 48 horas.
La temperatura de incubación puede ser desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 22 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 24 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 26 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 28 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 32 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 34 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 34 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 32 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 30 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 28 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 26 °C, o desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 24 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 18 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 20 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 22 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 24 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 26 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 28 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 30 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 32 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 34 °C. En algunas modalidades, la incubación puede realizarse a 37 °C.
Los compuestos reactivos con tiol no incorporados pueden separarse de la inmunoglobulina conjugada por cromatografía de desalinización mediante el uso de numerosas resinas adecuadas que incluyen, pero no se limitan a, resina G-25, resina G-50, Biogel P10, u otras resinas con límites de exclusión de intervalos entre 5000-10000 Da. La cromatografía puede realizarse en formato de columna o en formato de columna de centrifugación, en dependencia de la escala. Los tampones adecuados para la desalinización incluyen, por ejemplo, PBS 1x, fosfato de sodio, fosfato de potasio, borato de sodio, o tampones basados en HEPES que pueden sustituir a PBS 1x.
En una modalidad ilustrativa, la conjugación puede realizarse mediante la disolución de un compuesto reactivo con tiol basado en maleimida en dimetilsulfóxido al 100 % (DMSO) a una concentración final de compuesto reactivo con tiol de 10 mM. El compuesto reactivo con tiol disuelto puede incubarse después con una inmunoglobulina a una concentración de inmunoglobulina de 5 mg/mL en PBS 1x, pH 7,2 en una relación molar de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina 5:1 y se mezcla completamente. La incubación puede realizarse durante 24 horas a 22 °C. El compuesto reactivo con tiol no incorporado puede eliminarse de la inmunoglobulina conjugada por cromatografía de desalinización mediante el uso de la resina G-25 con PBS 1x como tampón de corrida.
Preferentemente, el compuesto reactivo con tiol se conjuga con la Cys80 a través del grupo reactivo con tiol. Los grupos reactivos con tiol incluyen haloacetilos, maleimidas, aziridinas, acriloilo, agentes arilantes, vinilsulfonas, piridil disulfuros, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender una maleimida. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un haloacetilo. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender una aziridina. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un acriloilo. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un agente arilante. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender una vinilsulfona. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un disulfuro de piridilo. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un TNB-tiol. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un agente reductor de disulfuro.
Los grupos reactivos con tiol pueden derivarse de numerosos reactivos adecuados que incluyen yodoacetamidas, maleimidas, haluros bencílicos y bromometilcetonas, que pueden reaccionar mediante S-alquilación de tioles para generar productos tioéter estables.
El grupo reactivo con tiol puede añadirse a un enlazador. Los enlazadores pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Los enlazadores ilustrativos incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal, y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador no escindible. Los enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunas modalidades, el enlazador puede comprender PEG. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador escindible. Los enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulinaparaaminobencilo. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en cetales. Se proporcionan ejemplos de enlazadores unidos covalentemente a un grupo reactivo con tiol, por ejemplo, en la publicación de EE.UU. núm. 20140050746.
El compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional. Los agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, fluoróforos, colorantes fluorescentes, polipéptidos, inmunoglobulinas, antibióticos, ácidos nucleicos, radionúclidos, enlazadores químicos, moléculas pequeñas, quelantes, lípidos, y fármacos. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fluoróforo. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un colorante fluorescente. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un polipéptido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una inmunoglobulina. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un antibiótico. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un ácido nucleico (tal como a Dn o ARN). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un radionúclido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un enlazador químico (por ejemplo, dibencilciclooctina (DBCO) o azida). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una molécula pequeña. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un quelante (por ejemplo, DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA, entre otros). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un lípido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fármaco. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una combinación de cualquiera de los agentes funcionales enumerados anteriormente.
El compuesto reactivo con tiol (es decir, un primer compuesto reactivo con tiol) puede unirse a un segundo compuesto reactivo con tiol, el segundo compuesto reactivo con tiol se une a una segunda inmunoglobulina que tiene una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys802"), en donde el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol unido a la Cys802. Por ejemplo, el primer compuesto reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol pueden tener un primer y un segundo enlazador químico como el primer y el segundo agentes funcionales, respectivamente. Los enlazadores químicos primero y segundo pueden unirse entre sí mediante numerosos medios adecuados que incluyen, por ejemplo, la química de click.
En modalidades preferidas, la Cys80 puede estar desapareada. Los medios adecuados para desaparear la Cys80 incluyen, por ejemplo, quimerizar una región variable de la cadena ligera que tiene Cys80 con un dominio constante que tiene un residuo de aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
Los métodos descritos pueden realizarse en una inmunoglobulina quimerizada. Por lo tanto, en algunas modalidades, la inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina quimerizada. En modalidades en donde la inmunoglobulina está quimerizada, los métodos para generar una inmunoglobulina conjugada pueden comprender: desproteger una Cys80 en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina quimerizada, en donde la inmunoglobulina quimerizada comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y conjugar un compuesto reactivo con tiol a la Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Alternativamente, los métodos descritos pueden comprender, además, la quimerización de una inmunoglobulina antes de la desprotección. Por ejemplo, los métodos para generar una inmunoglobulina conjugada pueden comprender: quimerizar una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80; desproteger la Cys80; y conjugar un compuesto reactivo con tiol a la Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Los métodos descritos pueden realizarse en una inmunoglobulina humanizada. Por lo tanto, en algunas modalidades, la inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina humanizada. En modalidades en donde la inmunoglobulina está humanizada, los métodos para generar una inmunoglobulina conjugada pueden comprender: desproteger una Cys80 en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina humanizada, en donde la inmunoglobulina humanizada comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y conjugar un compuesto reactivo con tiol a la Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Alternativamente, los métodos descritos pueden comprender, además, humanizar una inmunoglobulina antes de la desprotección. Por ejemplo, los métodos para generar una inmunoglobulina conjugada pueden comprender: humanizar una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80; desproteger la Cys80; y conjugar un compuesto reactivo con tiol a la Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Los métodos pueden comprender, además, la sustitución de un aminoácido en la posición 83 con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys. En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con alanina ("Ala83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con valina ("Val83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con treonina ("Thr83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con arginina ("Arg83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con asparagina ("Asn83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con ácido aspártico ("Asp83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con ácido glutámico ("Glu83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con glutamina ("Gln83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con glicina ("Gly83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con histidina ("His83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con leucina ("Leu83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con metionina ("Met83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con prolina ("Pro83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con serina ("Ser83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con triptófano ("T rp83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con tirosina ("Tyr83"). En algunas modalidades, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 por un aminoácido polar o hidrófobo que incluye, pero no se limita a, alanina, valina, isoleucina, o treonina.
El residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición de aminoácido 83 en combinación con los métodos de desprotección descritos puede disminuir la agregación, y aumentar la eficacia de conjugación de la Cys80, de la inmunoglobulina. La agregación de inmunoglobulina adecuada lograda por los métodos descritos incluye, por ejemplo, menos de aproximadamente 5 %, menos de aproximadamente 7 %, menos de aproximadamente 10 %, menos de aproximadamente 12 %, menos de aproximadamente 15 %, menos de aproximadamente 17 %, menos de aproximadamente 20 %, menos de aproximadamente 22 %, o menos de aproximadamente 25 %. Las eficiencias de conjugación adecuadas logradas mediante los métodos descritos incluyen, por ejemplo, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 73 %, más de aproximadamente 76 %, más de aproximadamente 79 %, más de aproximadamente 82 %, más de aproximadamente 85 %, más de aproximadamente 88 %, más de aproximadamente 91%, más de aproximadamente 94 %, más de aproximadamente 97 %, o más de aproximadamente 99 %.
Métodos para generar moléculas de unión a antígenos
Además, en la presente descripción se describen métodos para generar una molécula de unión a antígeno, el método comprende incubar una primera inmunoglobulina conjugada con una segunda inmunoglobulina conjugada para generar la molécula de unión a antígeno, en donde:
la primera inmunoglobulina conjugada comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, la primera región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys801") en donde la Cys801 está conjugada con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol; y
la segunda inmunoglobulina conjugada comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys802") en donde la Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Las moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antígeno multivalentes y/o multiespecíficas. Por ejemplo, las moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antígeno bivalentes, trivalentes y tetravalentes que son monoespecíficas o biespecíficas. En algunos aspectos, la molécula de unión a antígeno puede ser bivalente y monoespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión a antígeno puede ser bivalente y biespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión a antígeno puede ser trivalente y monoespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión a antígeno puede ser trivalente y biespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión a antígeno puede ser tetravalente y monoespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión a antígeno puede ser tetravalente y biespecífica. En algunos aspectos, la valencia puede ser mayor que la tetravalente. En algunos aspectos, la especificidad puede ser mayor que la biespecífica.
La Cys801, la Cys802, o ambas, pueden estar desapareadas. Los medios adecuados para desaparear la Cys80 incluyen, por ejemplo, quimerizar una región variable de la cadena ligera que tiene Cys80 con un dominio constante que tiene un residuo de aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
En algunos aspectos, los métodos pueden comprender, además, desproteger la Cys801. En algunos aspectos, los métodos pueden comprender, además, desproteger la Cys802. En otros aspectos, los métodos pueden comprender, además, desproteger la Cys801 y la Cys802.
La desprotección puede comprender incubar la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas, con un tampón reductor seguido de la incubación de la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas, con un tampón oxidante. En algunos aspectos de los métodos para generar moléculas de unión a antígeno, la desprotección puede comprender, además, inmovilizar la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas en una matriz antes de la incubación con el tampón reductor y eluir la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas de la matriz después de la incubación con el tampón oxidante.
Las condiciones adecuadas de desprotección y conjugación, que incluyen tampones reductores, tampones oxidantes, concentraciones, pH, tiempos y matrices, se describen en la sección titulada "generación de inmunoglobulinas conjugadas" y son igualmente aplicables en la presente descripción.
En algunos aspectos, los métodos pueden comprender, además, la conjugación de un primer compuesto reactivo con tiol a la Cys801, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol. En algunos aspectos, los métodos pueden comprender, además, conjugar un segundo compuesto reactivo con tiol a la Cys802, en donde el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol. Aún en otros aspectos, los métodos pueden comprender, además, conjugar un primer compuesto reactivo con tiol a la Cys801 y un segundo compuesto reactivo con tiol a la Cys802, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Los métodos pueden comprender, además, tanto la desprotección como la conjugación. Por ejemplo, los métodos pueden comprender, además, antes de la etapa de incubación,
desproteger la Cys801, Cys802, o ambas; y
conjugar un primer compuesto reactivo con tiol a la Cys801, un segundo compuesto reactivo con tiol a la Cys802, o ambas, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
La primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas, pueden ser quimerizadas. A la inversa, los métodos pueden comprender, además, quimerizar la primera inmunoglobulina, quimerizar la segunda inmunoglobulina o quimerizar tanto la primera inmunoglobulina como la segunda inmunoglobulina. Por ejemplo, y sin pretender ser limitativos, los métodos pueden comprender, además, antes de la etapa de incubación:
quimerizar una primera inmunoglobulina que comprende una Cys801 para generar una primera inmunoglobulina quimérica;
quimerizar la segunda inmunoglobulina que comprende una Cys802 para generar una segunda inmunoglobulina quimérica;
desproteger la Cys801, la Cys802, o ambas; y
conjugar un primer compuesto reactivo con tiol a la Cys801, un segundo compuesto reactivo con tiol a la Cys802, o ambas, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
La primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas, pueden ser humanizadas. A la inversa, los métodos pueden comprender, además, humanizar la primera inmunoglobulina, humanizar la segunda inmunoglobulina, o humanizar tanto la primera inmunoglobulina como la segunda inmunoglobulina. Por ejemplo, y sin pretender ser limitativos, los métodos pueden comprender, además, antes de la etapa de incubación:
humanizar una primera inmunoglobulina que comprende una Cys801 para generar una primera inmunoglobulina humanizada;
humanizar la segunda inmunoglobulina que comprende una Cys802 para generar una segunda inmunoglobulina humanizada;
desproteger la Cys801, la Cys802, o ambas; y
conjugar un primer compuesto reactivo con tiol a la Cys801, un segundo compuesto reactivo con tiol a la Cys802, o ambas, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Preferentemente, el primer y segundo compuestos reactivos con tiol se conjugan con Cys801 y Cys802, respectivamente, a través del primer grupo reactivo con tiol y el segundo grupo reactivo con tiol. Los grupos reactivos con tiol adecuados incluyen haloacetilo, maleimidas, aziridinas, acriloilo, agentes arilantes, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una maleimida. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un haloacetilo. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una aziridina. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un acriloilo. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un agente arilante. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una vinilsulfona. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un disulfuro de piridilo. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un TNB-tiol. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un agente reductor de disulfuro.
El primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden añadirse a un enlazador. En algunos aspectos, el primer grupo reactivo con tiol puede añadirse a un enlazador ("primer enlazador"). En algunos aspectos, el segundo grupo reactivo con tiol puede añadirse a un enlazador ("segundo enlazador"). Aún en otros aspectos, el primer grupo reactivo con tiol puede añadirse a un primer enlazador y el segundo grupo reactivo con tiol puede añadirse a un segundo enlazador. Los primeros y segundos enlazadores adecuados pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Los primeros y segundos enlazadores ilustrativos incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal, y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos, pueden ser un enlazador no escindible. Los enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunas modalidades, el primer enlazador, el segundo enlazador, o ambos pueden comprender PEG. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador escindible. Los enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulina-paraaminobencilo. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador, o ambos, pueden ser un enlazador basado en cetal. Se proporcionan ejemplos de enlazadores unidos covalentemente a un grupo reactivo con tiol, por ejemplo, en la publicación de EE.u U. núm.
20140050746.
El primer compuesto reactivo con tiol, el segundo compuesto reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender, además, un agente funcional. En algunos aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional ("primer agente funcional"). En algunos aspectos, el segundo compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional ("segundo agente funcional"). Aún en otros aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un primer agente funcional y el segundo compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un segundo agente funcional.
Los agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores químicos. Preferentemente, el enlazador químico del primer compuesto reactivo con tiol ("primer enlazador químico") y el enlazador químico del segundo compuesto reactivo con tiol ("segundo enlazador químico") pueden acoplarse. Por ejemplo, y sin pretender ser limitativo, uno del primer o segundo enlazador químico puede ser dibencilciclooctina (DBCO) y el otro del primer o segundo enlazador químico puede ser azida. En algunas modalidades, por ejemplo, el primer enlazador químico puede ser DBCO y el segundo enlazador químico puede ser azida. A la inversa, el primer enlazador químico puede ser azida y el segundo enlazador químico puede ser DBCO. El DBCO y la azida pueden acoplarse, esto resulta en la conjugación de la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina. Por ejemplo, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden conjugarse entre sí mediante química de click.
En una modalidad ilustrativa, los compuestos reactivos con tiol pueden incluir maleimida-PEG4-azida y maleimida-PEG4-dibenzociclooctina. En algunos aspectos, por ejemplo, el primer compuesto reactivo con tiol puede ser maleimida-PEG4-azida y el segundo compuesto reactivo con tiol puede ser maleimida-PEG4-dibenzociclooctina. En algunos aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede ser maleimida-PEG4-dibenzociclooctina y el segundo compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-azida.
La primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas pueden ser Fab. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina puede ser un Fab ("primer Fab"). En algunas modalidades, la segunda inmunoglobulina puede ser un Fab ("segundo Fab"). Aún en otras modalidades, la primera inmunoglobulina puede ser un primer Fab y la segunda inmunoglobulina puede ser un segundo Fab.
En algunas modalidades, los métodos comprenden generar un primer Fab, un segundo Fab, o ambos, antes de la incubación. Los procedimientos adecuados para generar Fab se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, digerir una inmunoglobulina total o parcial para producir un Fab o expresar de forma recombinante la inmunoglobulina como un Fab. Por ejemplo, los métodos para generar moléculas de unión a antígeno pueden comprender, además, antes de la incubación,
digerir una primera inmunoglobulina, una segunda inmunoglobulina, o ambas, con papaína para generar un primer Fab, un segundo Fab, o un primer y segundo Fab, en donde la primera inmunoglobulina comprende una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, la primera cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), y en donde la segunda inmunoglobulina comprende una segunda cadena pesada y una segunda cadena ligera, la segunda cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys802"); o
expresar de forma recombinante un primer Fab que comprende una primera cadena pesada y una primera cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 (Cys801), expresar de forma recombinante un segundo Fab que comprende una segunda cadena pesada y una segunda cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 (Cys802), o ambas;
y conjugar el primer Fab en la Cys801 con un primer compuesto reactivo con tiol para generar un primer Fab conjugado, conjugar el segundo Fab en la Cys802 con un segundo compuesto reactivo con tiol para generar un segundo Fab conjugado, o ambos.
Los métodos para generar moléculas de unión a antígeno pueden comprender, además, la sustitución de un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys. Los métodos para generar moléculas de unión a antígeno pueden comprender, además, la sustitución de un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys. Los métodos para generar moléculas de unión a antígeno pueden comprender, además, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys y sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys.
En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera, o sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera con alanina ("Ala83"), valina ("Val83"), isoleucina ("Ile83"), treonina ("Thr83"), arginina ("Arg83"), asparagina ("Asn83"), ácido aspártico (" Asp83"), ácido glutámico (" Glu83"), glutamina ("Gln83"), glicina ("Gly83"), histidina ("His83"), leucina ("Leu83"), metionina ("Met83"), prolina ("Pro83"), serina ("Ser83"), triptófano ("Trp83"), o tirosina ("Tyr83").
El aminoácido en la posición 83 en la primera región variable de la cadena ligera puede ser el mismo que el aminoácido en la posición 83 en la segunda región variable de la cadena ligera. A la inversa, el aminoácido en la posición 83 en la primera región variable de la cadena ligera puede ser diferente del aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la segunda región variable de la cadena ligera. El aminoácido en la posición 83 distinto de Phe, Lys, o Cys en la primera región variable de la cadena ligera y/o el aminoácido en la posición 83 distinto de Phe, Lys, o Cys en la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido polar o hidrófobo que incluye, pero no se limita a, alanina, valina, isoleucina, o treonina. En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera con valina ("Val83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera con isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera con treonina ("Thr83"). El aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la primera región variable de la cadena ligera puede ser el mismo o diferente del aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la segunda región variable de la cadena ligera.
Las regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. En algunas modalidades, la Cys801, la Cys802, o ambas, pueden estar presentes en la región variable de la cadena ligera nativa. La primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera se derivan de conejo. Los conejos ilustrativos a partir de los que puede derivarse una primera región variable de la cadena ligera, una segunda región variable de la cadena ligera o ambas incluyen, pero no se limitan a, Oryctolagus cuniculus. En algunos aspectos, por ejemplo, la región o regiones variables de la cadena ligera pueden derivarse de un conejo Blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región o regiones variables de la cadena ligera pueden derivarse de un conejo b9.
Componentes de inmunoglobulina de las inmunoglobulinas conjugadas
En la presente descripción se describen inmunoglobulinas que comprenden una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83.
Las regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La región variable de la cadena ligera se deriva del conejo. En algunas modalidades, la Cys80 puede estar presente en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Los conejos ilustrativos a partir de los que puede derivarse una región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80 incluyen, pero no se limitan a, Oryctolagus cuniculus. En algunos aspectos, por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo Blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
El aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83 incluye alanina ("Ala83"), valina ("Val83"), isoleucina ("Ile83"), treonina ("Thr83"), arginina ("Arg83"), asparagina ("Asn83"), ácido aspártico ("Asp83"), ácido glutámico ("Glu83"), glutamina ("Gln83"), glicina ("Gly83"), histidina ("His83"), leucina ("Leu83"), metionina ("Met83"), prolina ("Pro83"), serina ("Ser83"), triptófano ("Trp83"), o tirosina ("Tyr83").
En algunas modalidades, el aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83 puede ser un aminoácido polar o hidrófobo que incluye, pero no se limita a, alanina, valina, isoleucina, o treonina. En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es alanina ("Ala83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es valina ("Val83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es treonina ("Thr83").
La Cys80 puede estar desapareada. Por ejemplo, una región variable de la cadena ligera que tiene Cys80 puede quimerizarse con un dominio constante que tiene un residuo de aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
Preferentemente, la Cys80 está desprotegida.
En algunas modalidades, las inmunoglobulinas pueden ser quimerizadas. En otras modalidades, las inmunoglobulinas pueden ser humanizadas.
En alguna modalidad, la inmunoglobulina descrita se une inmunoespecíficamente al CA9 humano. En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente al CA9 humano comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78); b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110); d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-140 de zu1E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (Se Q ID NO:114); e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); o f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).
En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente al CA9 humano comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xilE4LC (SEQ ID NO:110);
d. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-140 de zu1E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); o
f. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).
En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente al CA9 humano comprende:
a. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi155D5HC que se establece como las SEQ ID NO:146, 148, y 150, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi155D5LC que se establece como las SEQ ID NO:224, 226, y 228, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu155D5HC que se establece como las SEQ ID NO:152, 154, y 156, respectivamente, y una CDR1, c DR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu155D5LC-3 que se establece como las SEQ ID NO:242, 244, y 246, respectivamente, zu155D5LC-4 que se establece como las SEQ ID NO:248, 250, y 252, respectivamente, zu155D5LC-5 que se establece como las SEQ ID NO:254, 256, y 258, respectivamente, zu155D5LC-6 que se establece como las SEQ ID NO:260, 262, y 264, respectivamente, zu155D5LC-7 que se establece como las SEQ ID NO:266, 268, y 270, respectivamente, zu155D5LC-huVK2-40 que se establece como las SEQ ID NO:278, 280, y 282, respectivamente, zu155D5LC-huVK4-1 que se establece como las SEQ ID NO:290, 292, y 294, respectivamente, zu155D5LC-huVK6-21 que se establece como las SEQ ID NO:296, 298, y 300, respectivamente, zu155D5LC-huVK6D-41 que se establece como las SEQ ID NO:302, 304, y 306, respectivamente; o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 que se establece como las SEQ ID NO:308, 310, y 312, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:164, 166, y 168, respectivamente y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi1E4LC que se establece como las SEQ ID NO:320, 322, y 324, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:170, 172, y 174, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu1E4LC-CXXA que se establece como las Se Q ID NO:332, 334, y 336, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:212, 214, y 216, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi166B3LC que se establece como las SEQ ID NO:386, 388, y 390, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:218, 220, y 222, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu166B3LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:398, 400, y 402, respectivamente.
En algunas modalidades, las inmunoglobulinas descritas se unen inmunoespecíficamente a TEM1 humano. En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20­ 139 de xi1-55-2HC (s Eq ID n O:56) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108).
En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano comprende una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108).
En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano comprende una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi1-55-2HC que se establece como las SEQ ID NO:158, 160, y 162, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi1-55-2LC que se establece como las SEQ ID NO:314, 316, y 318, respectivamente.
En algunas modalidades, las inmunoglobulinas descritas se unen inmunoespecíficamente a la mesotelina humana. En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a la mesotelina humana comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116); b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124); d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126); e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a la mesotelina humana comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-142 de xi33O1 1HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
e. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a la mesotelina humana comprende: a. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:176, 178, y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11LC que se establece como las SEQ ID NO:338, 340, y 342, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:182, 184, y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:350, 352, y 354, respectivamente o zu33O11LC-CXXI que se establece como las SEQ ID NO:356, 358, y 360, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC que se establece como las SEQ ID NO:188, 190, y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC que se establece como las SEQ ID NO:362, 364, y 366, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC que se establece como las SEQ ID NO:194, 196, y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC que se establece como las SEQ ID NO:368, 370, y 372, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC que se establece como las SEQ ID NO:200, 202, y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC que se establece como las SEQ ID NO:374, 376, y 378, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC que se establece como las SEQ ID NO:206, 208, y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC que se establece como las SEQ ID NO:380, 382, y 384, respectivamente.
Inmunoglobulinas conjugadas
En la presente descripción se describen, además, inmunoglobulinas conjugadas que comprenden cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en la presente descripción, en donde la cisteína en la posición 80 ("Cys80") se conjuga con un compuesto reactivo con tiol, el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
En algunas modalidades, las inmunoglobulinas conjugadas comprenden una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80 y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83, en donde la Cys80 está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol. En algunas modalidades, la región variable de la cadena ligera puede tener una Cys80 y un aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83.
La inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera. Las regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La región variable de la cadena ligera se deriva del conejo. En algunas modalidades, la Cys80 puede estar presente en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Los conejos ilustrativos a partir de los que puede derivarse una región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80 incluyen, pero no se limitan a, Oryctolagus cuniculus. En algunos aspectos, por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo Blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
La región variable de la cadena ligera puede tener una Cys80 y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83. El aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83 incluye alanina ("Ala83"), valina ("Val83"), isoleucina ("Ile83"), treonina ("Thr83"), arginina ("Arg83"), asparagina ("Asn83"), ácido aspártico ("Asp83"), ácido glutámico ("Glu83"), glutamina ("Gln83"), glicina ("Gly83"), histidina ("His83"), leucina ("Leu83"), metionina ("Met83"), prolina ("Pro83"), serina ("Ser83"), triptófano ("Trp83"), o tirosina ("Tyr83"). En algunas modalidades, la región variable de la cadena ligera puede tener una Cys80 y un aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83. Los aminoácidos polares o hidrófobos adecuados incluyen, pero no se limitan a, alanina, valina, isoleucina, o treonina. En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es alanina ("Ala83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es valina ("Val83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es treonina ("Thr83").
La Cys80 puede estar desapareada. Por ejemplo, la región variable de la cadena ligera que tiene la Cys80 puede ser quimerizada con un dominio constante que tiene un residuo de aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
Preferentemente, la Cys80 está desprotegida.
En algunas modalidades, la inmunoglobulina puede ser quimerizada. En otras modalidades, la inmunoglobulina puede ser humanizada.
Preferentemente, el compuesto reactivo con tiol se conjuga con la Cys80 a través del grupo reactivo con tiol. Los grupos reactivos con tiol incluyen haloacetilos, maleimidas, aziridinas, acriloilo, agentes arilantes, vinilsulfonas, piridil disulfuros, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender una maleimida. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un haloacetilo. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender una aziridina. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un acriloilo. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un agente arilante. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender una vinilsulfona. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un disulfuro de piridilo. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un TNB-tiol. En algunas modalidades, el grupo reactivo con tiol puede comprender un agente reductor de disulfuro.
El grupo reactivo con tiol puede añadirse a un enlazador. Los enlazadores pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Los enlazadores ilustrativos incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal, y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador no escindible. Los enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunas modalidades, el enlazador puede comprender PEG. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador escindible. Los enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulinaparaaminobencilo. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en cetales. Se proporcionan ejemplos de enlazadores unidos covalentemente a un grupo reactivo con tiol, por ejemplo, en la publicación de EE.UU. núm. 20140050746.
El compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional. Los agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, fluoróforos, colorantes fluorescentes, polipéptidos, inmunoglobulinas, antibióticos, ácidos nucleicos, radionúclidos, enlazadores químicos, moléculas pequeñas, quelantes, lípidos, y fármacos. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fluoróforo. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un colorante fluorescente. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un polipéptido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una inmunoglobulina. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un antibiótico. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un ácido nucleico (tal como ADN o ARN). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un radionúclido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un enlazador químico (por ejemplo, dibencilciclooctina (DBCO) o azida). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una molécula pequeña. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un quelante (por ejemplo, DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA, entre otros). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un lípido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fármaco. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una combinación de cualquiera de los agentes funcionales enumerados anteriormente.
En consecuencia, las inmunoglobulinas conjugadas descritas incluyen: conjugados Cys80 de inmunoglobulinafluoróforo, conjugados Cys80 de inmunoglobulina-colorante fluorescente, conjugados Cys80 de inmunoglobulinapolipéptido, conjugados Cys80 de inmunoglobulina-inmunoglobulina, conjugados Cys80 de inmunoglobulina-ácido nucleico, conjugados Cys80 de inmunoglobulina-radionúclido, conjugados Cys80 de inmunoglobulina-enlazador químico, conjugados Cys80 de inmunoglobulina-molécula pequeña, conjugados Cys80 de inmunoglobulina-quelante, conjugados Cys80 de inmunoglobulina-lípido, y conjugados Cys80 de inmunoglobulina-fármaco.
Cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en la presente descripción puede conjugarse con cualquiera de los agentes funcionales descritos en la presente descripción. Por ejemplo, la inmunoglobulina conjugada puede comprender una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente al CA9 humano y un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-fluoróforo. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-colorante fluorescente. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-polipéptido. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-inmunoglobulina. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-antibiótico. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-ácido nucleico. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-radionúclido. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-enlazador químico. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-molécula pequeña. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-quelante. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-lípido. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-fármaco.
Las inmunoglobulinas adecuadas que se unen inmunoespecíficamente al CA9 humano que pueden conjugarse en la Cys80 con cualquiera de los agentes funcionales anteriores incluyen:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78); b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110); d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-140 de zu1E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (Se Q ID NO:114); e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);
g. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
h. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
i. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110);
j. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-140 de zu1E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
k. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132);
l. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);
m. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi155D5HC que se establece como las SEQ ID NO:146, 148, y 150, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi155D5LC que se establece como las SEQ ID NO:224, 226, y 228, respectivamente;
n. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu155D5HC que se establece como las SEQ ID NO:152, 154, y 156, respectivamente, y una CDR1, c DR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu155D5LC-3 que se establece como las SEQ ID NO:242, 244, y 246, respectivamente, zu155D5LC-4 que se establece como las SEQ ID NO:248, 250, y 252, respectivamente, zu155D5LC-5 que se establece como las SEQ ID NO:254, 256, y 258, respectivamente, zu155D5LC-6 que se establece como las SEQ ID NO:260, 262, y 264, respectivamente, zu155D5LC-7 que se establece como las SEQ ID NO:266, 268, y 270, respectivamente, zu155D5LC-huVK2-40 que se establece como las SEQ ID NO:278, 280, y 282, respectivamente, zu155D5LC-huVK4-1 que se establece como las SEQ ID NO:290, 292, y 294, respectivamente, zu155D5LC-huVK6-21 que se establece como las SEQ ID NO:296, 298, y 300, respectivamente, zu155D5LC-huVK6D-41 que se establece como las SEQ ID NO:302, 304, y 306, respectivamente; o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 que se establece como las SEQ ID NO:308, 310, y 312, respectivamente;
o. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:164, 166, y 168, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi1E4LC que se establece como las SEQ ID NO:320, 322, y 324, respectivamente;
p. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:170, 172, y 174, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu1E4LC-CXXA que se establece como las Se Q ID NO:332, 334, y 336, respectivamente;
q. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:212, 214, y 216, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi166B3LC que se establece como las SEQ ID NO:386, 388, y 390, respectivamente; o
r. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:218, 220, y 222, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu166B3LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:398, 400, y 402, respectivamente.
La inmunoglobulina conjugada puede comprender una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano y un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-fluoróforo. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-colorante fluorescente. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-polipéptido. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-inmunoglobulina. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-antibiótico. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-ácido nucleico. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-radionúclido. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-enlazador químico. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-molécula pequeña. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-quelante. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1 -lípido. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-fármaco.
Las inmunoglobulinas adecuadas que se unen inmunoespecíficamente a TEM1 humano que pueden conjugarse en la Cys80 con cualquiera de los agentes funcionales anteriores incluyen:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-129 de xil-55-2LC (SEQ ID NO:108); b. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-129 de xil-55-2LC (SEQ ID NO:108); o
c. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi1-55-2HC que se establece como las SEQ ID NO:158, 160, y 162, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi1-55-2LC que se establece como las SEQ ID NO:314, 316, y 318, respectivamente.
La inmunoglobulina conjugada puede comprender una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a MSLN humana y un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-fluoróforo. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-colorante fluorescente. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-polipéptido. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-inmunoglobulina. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-antibiótico. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-ácido nucleico. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-radionúclido. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-enlazador químico. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-molécula pequeña. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-quelante. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-lípido. En algunas modalidades, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-fármaco.
Las inmunoglobulinas adecuadas que se unen inmunoespecíficamente a MSLN humana que pueden conjugarse en la Cys80 con cualquiera de los agentes funcionales anteriores incluyen:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116); b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124); d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126); e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130); g. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
h. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
i. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
j. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
k. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128);
l. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130);
m. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:176, 178, y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11LC que se establece como las SEQ ID NO:338, 340, y 342, respectivamente;
n. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:182, 184, y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:350, 352, y 354, respectivamente o zu33O11LC-CXXI que se establece como las SEQ ID NO:356, 358, y 360, respectivamente;
o. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC que se establece como las SEQ ID NO:188, 190, y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC que se establece como las SEQ ID NO:362, 364, y 366, respectivamente;
p. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC que se establece como las SEQ ID NO:194, 196, y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC que se establece como las SEQ ID NO:368, 370, y 372, respectivamente;
q. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC que se establece como las SEQ ID NO:200, 202, y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC que se establece como las SEQ ID NO:374, 376, y 378, respectivamente; o
r. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC que se establece como las SEQ ID NO:206, 208, y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC que se establece como las SEQ ID NO:380, 382, y 384, respectivamente.
En algunas modalidades, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a MSLN humana puede conjugarse con un agente antineoplásico de molécula pequeña, tal como una auristatina. En algunos aspectos, el agente funcional puede ser auristatina F (AuF). Por lo tanto, las inmunoglobulinas conjugadas descritas incluyen cualquiera de las inmunoglobulinas descritas anteriormente que se unen inmunoespecíficamente a MSLN humana, en donde la inmunoglobulina se conjuga con auristatina F (conjugado Cys80 de MSLN-AuF).
En las modalidades en donde la inmunoglobulina comprende dos regiones variables de la cadena ligera, la inmunoglobulina conjugada puede tener una relación inmunoglobulina:agente funcional de 2:1, con cada cadena ligera que tiene un agente funcional conjugado en la Cys80.
Moléculas de unión a antígeno
En la presente descripción se describen, además, moléculas de unión a antígeno que comprenden:
una primera inmunoglobulina conjugada que comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, la primera región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), en donde la Cys801 está conjugada con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol, y
una segunda inmunoglobulina conjugada que comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys802") en donde la Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
La primera inmunoglobulina conjugada y la segunda inmunoglobulina conjugada pueden ser cualquiera de las inmunoglobulinas conjugadas descritas en la presente descripción.
Las regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera se derivan de conejo. En algunas modalidades, la Cys801, la Cys802, o ambas, pueden estar presentes en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Los conejos ilustrativos a partir de los que puede derivarse una primera región variable de la cadena ligera, una segunda región variable de la cadena ligera o ambas incluyen, pero no se limitan a, Oryctolagus cuniculus. En algunos aspectos, por ejemplo, la región o regiones variables de la cadena ligera pueden derivarse de un conejo Blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región o regiones variables de la cadena ligera pueden derivarse de un conejo b9.
La Cys801, la Cys802, o ambas, pueden estar desapareadas. Los medios adecuados para alterar la Cys801 y/o la Cys802 incluyen, por ejemplo, quimerizar una región variable de la cadena ligera (una primera región variable de la cadena ligera, una segunda región variable de la cadena ligera, o ambas) que tiene una Cys80 con un dominio constante que tiene un residuo de aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
La primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas, pueden ser quimerizadas. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina puede ser quimerizada. En algunas modalidades, la segunda inmunoglobulina puede ser quimerizada. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden ser quimerizadas.
La primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas, pueden ser humanizadas. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina puede ser humanizada. En algunas modalidades, la segunda inmunoglobulina puede ser humanizada. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden ser humanizadas.
En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina puede ser quimerizada y la segunda inmunoglobulina puede ser humanizada. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina puede ser humanizada y la segunda inmunoglobulina puede ser quimerizada.
El aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys si el aminoácido en la posición 83 es Phe. El aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys si el aminoácido en la posición 83 es Phe. El aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido que no sea Phe, Lys, o Cys si el aminoácido en la posición 83 es Phe y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys si el aminoácido en la posición 83 es Phe. El aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y/o la segunda región variable de la cadena ligera puede ser alanina ("Ala83"), valina ("Val83"), isoleucina ("Ile83"), treonina ("Thr83"), arginina ("Arg83"), asparagina ("Asn83"), ácido aspártico ("Asp83"), ácido glutámico ("Glu83"), glutamina ("Gln83"), glicina ("Gly83"), histidina ("His83"), leucina ("Leu83"), metionina ("Met83"), prolina ("Pro83"), serina ("Ser83"), triptófano ("Trp83"), o tirosina ("Tyr83"). El aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser el mismo que el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera. A la inversa, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser diferente del aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera.
En algunas modalidades, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser un residuo polar o hidrófobo distinto de Phe si el aminoácido en la posición 83 es Phe. En algunas modalidades, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un residuo polar o hidrófobo distinto de Phe si el aminoácido en la posición 83 es Phe. En algunas modalidades, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser un residuo polar o hidrófobo distinto de Phe si el aminoácido en la posición 83 es Phe y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un residuo polar o hidrófobo distinto de Phe si el aminoácido en la posición 83 es Phe. Los aminoácidos polares o hidrófobos adecuados incluyen, pero no se limitan a, alanina, valina, isoleucina, o treonina. En algunos aspectos, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera, o el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera pueden ser alanina ("Ala83"). En algunos aspectos, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera pueden ser valina ("Val83"). En algunos aspectos, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera, o el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera pueden ser isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera pueden ser Treonina ("Thr83"). El aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la primera región variable de la cadena ligera puede ser el mismo o diferente del aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la segunda región variable de la cadena ligera.
La primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden unirse a los mismos antígenos. En algunos aspectos, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden unirse al mismo epítopo del mismo antígeno. En otros aspectos, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden unirse a diferentes epítopos del mismo antígeno. En algunas modalidades, por ejemplo, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente al CA9 humano, en donde la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas se conjugan con cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano, en donde la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas se conjugan con cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a MSLN humana, en donde la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas se conjugan con cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco.
La primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden unirse a diferentes antígenos. En algunas modalidades, por ejemplo, la primera inmunoglobulina conjugada puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente al CA9 humano, en donde la primera inmunoglobulina que se une al CA9 humano se conjuga con cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco, mientras que la segunda inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano o MSLN humana. En tales modalidades, la segunda inmunoglobulina puede conjugarse con cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina conjugada puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano, en donde la inmunoglobulina se conjuga con cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco, mientras que la segunda inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente al CA9 humano o a MSLN humana. En tales modalidades, la segunda inmunoglobulina puede conjugarse con cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina conjugada puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a MSLN humana, en donde la inmunoglobulina se conjuga con cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco, mientras que la segunda inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a CA9 humano o TEM1 humano. En tales modalidades, la segunda inmunoglobulina puede conjugarse con cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco.
Los grupos reactivos con tiol adecuados incluyen haloacetilo, maleimidas, aziridinas, acriloilo, agentes arilantes, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una maleimida. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un haloacetilo. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una aziridina. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un acriloilo. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un agente arilante. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una vinilsulfona. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un disulfuro de piridilo. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un TNB-tiol. En algunas modalidades, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un agente reductor de disulfuro.
El primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden añadirse a un enlazador. En algunos aspectos, el primer grupo reactivo con tiol puede añadirse a un enlazador ("primer enlazador"). En algunos aspectos, el segundo grupo reactivo con tiol puede añadirse a un enlazador ("segundo enlazador"). Aún en otros aspectos, el primer grupo reactivo con tiol puede añadirse a un primer enlazador y el segundo grupo reactivo con tiol puede añadirse a un segundo enlazador. Los primeros y segundos enlazadores adecuados pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Los primeros y segundos enlazadores ilustrativos incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal, y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos, pueden ser un enlazador no escindible. Los enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunas modalidades, el primer enlazador, el segundo enlazador, o ambos pueden comprender PEG. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador escindible. Los enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulina-paraaminobencilo. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador, o ambos, pueden ser un enlazador basado en cetal. Se proporcionan ejemplos de enlazadores unidos covalentemente a un grupo reactivo con tiol, por ejemplo, en la publicación de EE.UU. núm.
20140050746.
El primer compuesto reactivo con tiol, el segundo compuesto reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender, además, un agente funcional. En algunos aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional ("primer agente funcional"). En algunos aspectos, el segundo compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional ("segundo agente funcional"). Aún en otros aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un primer agente funcional y el segundo compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un segundo agente funcional.
Los agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores químicos. Preferentemente, el enlazador químico del primer compuesto reactivo con tiol ("primer enlazador químico") y el enlazador químico del segundo compuesto reactivo con tiol ("segundo enlazador químico") pueden acoplarse. Por ejemplo, y sin pretender ser limitativo, uno del primer o segundo enlazador químico puede ser dibencilciclooctina (DBCO) y el otro del primer o segundo enlazador químico puede ser azida. En algunas modalidades, por ejemplo, el primer enlazador químico puede ser DBCO y el segundo enlazador químico puede ser azida. A la inversa, el primer enlazador químico puede ser azida y el segundo enlazador químico puede ser DBCO. El DBCO y la azida pueden acoplarse, lo que resulta en la conjugación de la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina. Por ejemplo, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden conjugarse entre sí mediante química de click.
En una modalidad ilustrativa, los compuestos reactivos con tiol pueden incluir maleimida-PEG4-azida y maleimida-PEG4-dibenzociclooctina. En algunos aspectos, por ejemplo, el primer compuesto reactivo con tiol puede ser maleimida-PEG4-azida y el segundo compuesto reactivo con tiol puede ser maleimida-PEG4-dibenzociclooctina. En algunos aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede ser maleimida-PEG4-dibenzociclooctina y el segundo compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-azida. Por lo tanto, el primer compuesto reactivo con tiol puede diferir del segundo compuesto reactivo con tiol.
La primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas pueden ser Fab. En algunas modalidades, la primera inmunoglobulina puede ser un Fab ("primer Fab"). En algunas modalidades, la segunda inmunoglobulina puede ser un Fab ("segundo Fab"). Aún en otras modalidades, la primera inmunoglobulina puede ser un primer Fab y la segunda inmunoglobulina puede ser un segundo Fab.
Inmunoglobulinas conjugadas contra la mesotelina para usar en métodos de tratamiento del cáncer en un sujeto
En la presente descripción se describen, además, métodos para tratar el cáncer en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva farmacéuticamente de una inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina, en donde la inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina comprende:
cualquiera de las inmunoglobulinas conjugadas contra la mesotelina descritas en la presente descripción y un compuesto reactivo con tiol que comprende un grupo reactivo con tiol, un enlazador, y un agente funcional.
Debe entenderse que cualquiera de las características, funciones, y modalidades relacionadas con las inmunoglobulinas conjugadas descritas son igualmente aplicables a las inmunoglobulinas conjugadas para usar en los métodos descritos de tratamiento del cáncer. En consecuencia, los métodos descritos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad efectiva farmacéuticamente de una inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina, en donde la inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83, en donde la Cys80 está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol, un enlazador, y un agente funcional. En algunas modalidades, el aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83 es un aminoácido polar o hidrófobo.
Preferentemente, el cáncer es un cáncer que expresa mesotelina. En algunos aspectos, los anticuerpos conjugados para usar en los métodos descritos pueden comprender:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116); b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124); d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126); e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
Los anticuerpos (a)-(f) pueden conjugarse con numerosos compuestos reactivos con tiol adecuados que incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen un agente antineoplásico, tal como una auristatina, como el agente funcional. Por lo tanto, en algunos aspectos, los métodos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad efectiva farmacéuticamente de una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una o más de las inmunoglobulinas (a)-(f), cada una de las cuales se conjuga con un compuesto reactivo con tiol que comprende auristatina F, en donde el compuesto reactivo con tiol se conjuga con la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina en la Cys80.
En algunas modalidades, los anticuerpos conjugados para usar en los métodos descritos pueden comprender:
a. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
e. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
Los anticuerpos (a)-(f) pueden conjugarse con numerosos compuestos reactivos con tiol adecuados que incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen un agente antineoplásico, tal como una auristatina, como el agente funcional. Por lo tanto, en algunas modalidades, los métodos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad efectiva farmacéuticamente de una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una o más de las inmunoglobulinas (a)-(f), cada una de las cuales se conjuga con un compuesto reactivo con tiol que comprende auristatina F, en donde el compuesto reactivo con tiol se conjuga con la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina en la Cys80.
En algunas modalidades, los anticuerpos conjugados para usar en los métodos descritos pueden comprender:
a. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:176, 178, y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11LC que se establece como las SEQ ID NO:338, 340, y 342, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:182, 184, y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:350, 352, y 354, respectivamente o zu33O11LC-CXXI que se establece como las SEQ ID NO:356, 358, y 360, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC que se establece como las SEQ ID NO:188, 190, y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC que se establece como las SEQ ID NO:362, 364, y 366, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC que se establece como las SEQ ID NO:194, 196, y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC que se establece como las SEQ ID NO:368, 370, y 372, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC que se establece como las SEQ ID NO:200, 202, y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC que se establece como las SEQ ID NO:374, 376, y 378, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC que se establece como las SEQ ID NO:206, 208, y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC que se establece como las SEQ ID NO:380, 382, y 384, respectivamente.
Los anticuerpos (a)-(f) pueden conjugarse con numerosos compuestos reactivos con tiol adecuados que incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen un agente antineoplásico, tal como una auristatina, como el agente funcional. Por lo tanto, en algunas modalidades, los métodos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad efectiva farmacéuticamente de una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una o más de las inmunoglobulinas (a)-(f), cada una de las cuales se conjuga con un compuesto reactivo con tiol que comprende auristatina F, en donde el compuesto reactivo con tiol se conjuga con la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina en la Cys80.
Métodos para detectar el cáncer
En la presente descripción se describen, además, los métodos para detectar cáncer en un sujeto. En algunos aspectos, los métodos pueden realizarse sobre el sujeto. Por ejemplo, los métodos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad efectiva farmacéuticamente de una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83, en donde la Cys80 está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol, un enlazador, y un agente funcional. En algunos aspectos, el aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83 es polar o hidrófobo.
Alternativamente, los métodos pueden realizarse en una muestra biológica que se obtiene del sujeto. Por ejemplo, los métodos pueden comprender poner en contacto una muestra biológica con una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83, en donde la Cys80 está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol, un enlazador, y un agente funcional. El aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83 es polar o hidrófobo. En algunos aspectos, los métodos pueden realizarse ex vivo. En algunos aspectos, los métodos pueden realizarse in vivo.
El agente funcional es un fluoróforo o colorante fluorescente.
Cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en la presente descripción puede conjugarse con un fluoróforo o colorante fluorescente y usarse en los métodos descritos para detectar cáncer. En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer que expresa c A9 y la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de CA9-fluoróforo o un conjugado Cys80 de CA9-colorante fluorescente que comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78); b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110); d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-140 de zu1E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (Se Q ID NO:114); e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);
g. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
h. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3 Glu81 (SEQ ID NO:106);
i. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110);
j. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-140 de zu1E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
k. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132);
l. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);
m. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi155D5HC que se establece como las SEQ ID NO:146, 148, y 150, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi155D5LC que se establece como las SEQ ID NO:224, 226, y 228, respectivamente;
n. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu155D5HC que se establece como las SEQ ID NO:152, 154, y 156, respectivamente, y una CDR1, c DR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu155D5LC-3 que se establece como las SEQ ID NO:242, 244, y 246, respectivamente, zu155D5LC-4 que se establece como las SEQ ID NO:248, 250, y 252, respectivamente, zu155D5LC-5 que se establece como las SEQ ID NO:254, 256, y 258, respectivamente, zu155D5LC-6 que se establece como las SEQ ID NO:260, 262, y 264, respectivamente, zu155D5LC-7 que se establece como las SEQ ID NO:266, 268, y 270, respectivamente, zu155D5LC-huVK2-40 que se establece como las SEQ ID NO:278, 280, y 282, respectivamente, zu155D5LC-huVK4-1 que se establece como las SEQ ID NO:290, 292, y 294, respectivamente, zu155D5LC-huVK6-21 que se establece como las SEQ ID NO:296, 298, y 300, respectivamente, zu155D5LC-huVK6D-41 que se establece como las SEQ ID NO:302, 304, y 306, respectivamente; o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 que se establece como las SEQ ID NO:308, 310, y 312, respectivamente;
o. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:164, 166, y 168, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi1E4LC que se establece como las SEQ ID NO:320, 322, y 324, respectivamente;
p. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:170, 172, y 174, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu1E4LC-CXXA que se establece como las Se Q ID NO:332, 334, y 336, respectivamente;
q. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:212, 214, y 216, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi166B3LC que se establece como las SEQ ID NO:386, 388, y 390, respectivamente; o
r. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:218, 220, y 222, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu166B3LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:398, 400, y 402, respectivamente.
En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer que expresa TEM1 y la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de TEM1-fluoróforo o un conjugado Cys80 de TEM1-colorante fluorescente que comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108); b. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108); o
c. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi1-55-2HC que se establece como las SEQ ID NO:158, 160, y 162, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi1-55-2LC que se establece como las SEQ ID NO:314, 316, y 318, respectivamente.
En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer que expresa MSLN y la inmunoglobulina conjugada es un conjugado Cys80 de MSLN-fluoróforo o un conjugado Cys80 de MSLN-colorante fluorescente que comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116); b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124); d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126); e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130); g. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
h. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
i. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
j. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
k. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128);
l. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130);
m. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:176, 178, y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11LC que se establece como las SEQ ID NO:338, 340, y 342, respectivamente;
n. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:182, 184, y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:350, 352, y 354, respectivamente o zu33O11LC-CXXI que se establece como las SEQ ID NO:356, 358, y 360, respectivamente;
o. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC que se establece como las SEQ ID NO:188, 190, y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC que se establece como las SEQ ID NO:362, 364, y 366, respectivamente;
p. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC que se establece como las SEQ ID NO:194, 196, y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC que se establece como las SEQ ID NO:368, 370, y 372, respectivamente;
q. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC que se establece como las SEQ ID NO:200, 202, y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC que se establece como las SEQ ID NO:374, 376, y 378, respectivamente; o
r. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC que se establece como las SEQ ID NO:206, 208, y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC que se establece como las SEQ ID NO:380, 382, y 384, respectivamente.
Los ejemplos de fluoróforos para la conjugación a la inmunoglobulina incluyen, por ejemplo, IRDye-800CW.
Los métodos pueden comprender administrar la inmunoglobulina conjugada al sujeto o poner en contacto la muestra biológica con la inmunoglobulina conjugada y detectar la unión de la inmunoglobulina conjugada a un antígeno (CA9, TEM1, o MSLN) presente en el sujeto o en la muestra biológica, respectivamente. Los métodos de detección adecuados incluyen, por ejemplo, formación de imágenes fluorescentes. La detección de la unión de la inmunoglobulina conjugada al antígeno (mediante la emisión de una señal fluorescente, por ejemplo) es indicativa de cáncer.
Composiciones farmacéuticas
En la presente descripción se proporcionan, además, composiciones farmacéuticas. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden comprender cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en la presente descripción. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden comprender cualquiera de las inmunoglobulinas conjugadas descritas en la presente descripción.
La administración de una inmunoglobulina conjugada de acuerdo con los métodos de tratamiento o diagnóstico descritos en la presente descripción puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica.
Regiones variables de las cadenas ligeras para usar en inmunoglobulinas conjugadas
En la presente descripción se describen regiones variables de la cadena ligera para usar en una inmunoglobulina conjugada, la región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición de aminoácido 80 ("Cys80") y un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición de aminoácido 83, en donde la Cys80 no está apareada. En algunos aspectos, el aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83 es polar o hidrófobo.
En aspectos preferidos, la cadena ligera tiene un motivo Cys80-Xaa1-Xaa2-Xaa3, en donde Xaa3 es un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys.
Las regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La región variable de la cadena ligera se deriva del conejo. En algunos aspectos, la Cys80 puede estar presente en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Los conejos ilustrativos a partir de los que puede derivarse una región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80 incluyen, pero no se limitan a, Oryctolagus cuniculus. En algunos aspectos, por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo Blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
La Cys80 puede estar desprotegida, puede estar involucrada en un enlace disulfuro intramolecular o intermolecular o puede tener una cisteína de protección.
En algunos aspectos, la región variable de la cadena ligera puede ser quimerizada. En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede ser humanizada.
La región variable de la cadena ligera puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en:
a. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110);
d. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132);
f. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);
g. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108);
h. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
i. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
j. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
k. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
l. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
m. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
Moléculas de ácido nucleico que codifican inmunoglobulinas y células huésped que comprenden las mismas
En la presente descripción se proporcionan, además, moléculas de ácido nucleico que codifican una inmunoglobulina de la presente invención. En algunos aspectos, las moléculas de ácido nucleico codifican una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83. En algunas modalidades, el aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83 es polar o hidrófobo.
Las moléculas de ácido nucleico descritas pueden codificar una inmunoglobulina que puede unirse inmunoespecíficamente al CA9 humano. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica: a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-141 de xil55D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xil55D5LC (SEQ ID NO:78); b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-144 de zul55D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu 155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-138 de xilE4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xilE4LC (SEQ ID n O:110); d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-140 de zulE4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (Se Q ID NO:114); e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xil66B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); o f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).
En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110);
d. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-140 de zu1E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); o
f. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).
En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi155D5HC que se establece como las SEQ ID NO:146, 148, y 150, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi155D5LC que se establece como las SEQ ID NO:224, 226, y 228, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu155D5HC que se establece como las SEQ ID NO:152, 154, y 156, respectivamente, y una CDR1, c DR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu155D5LC-3 que se establece como las SEQ ID NO:242, 244, y 246, respectivamente, zu155D5LC-4 que se establece como las SEQ ID NO:248, 250, y 252, respectivamente, zu155d 5lC-5 que se establece como las SEQ ID NO:254, 256, y 258, respectivamente, zu155D5LC-6 que se establece como las SEQ ID NO:260, 262, y 264, respectivamente, zu155D5LC-7 que se establece como las SEQ ID NO:266, 268, y 270, respectivamente, zu155D5LC-huVK2-40 que se establece como las SEQ ID NO:278, 280, y 282, respectivamente, zu155D5LC-huVK4-1 que se establece como las SEQ ID NO:290, 292, y 294, respectivamente, zu155D5LC-huVK6-21 que se establece como las SEQ ID NO:296, 298, y 300, respectivamente, zu155D5LC-huVK6D-41 que se establece como las SEQ ID NO:302, 304, y 306, respectivamente; o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 que se establece como las SEQ ID NO:308, 310, y 312, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:164, 166, y 168, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi1E4LC que se establece como las SEQ ID NO:320, 322, y 324, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:170, 172, y 174, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu1E4LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:332, 334, y 336, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:212, 214, y 216, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi166B3LC que se establece como las SEQ ID NO:386, 388, y 390, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:218, 220, y 222, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu166B3LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:398, 400, y 402, respectivamente.
Las moléculas de ácido nucleico descritas pueden codificar una inmunoglobulina que puede unirse inmunoespecíficamente a TEM1 humano. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20­ 139 de xi1-55-2HC (s Eq ID n O:56) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108). En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108). En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi1-55-2HC que se establece como las SEQ ID NO:158, 160, y 162, respectivamente, y una CDR1, CDr 2, y CDR3 de xi1-55-2LC que se establece como las SEQ ID NO:314, 316, y 318, respectivamente.
Las moléculas de ácido nucleico descritas pueden codificar una inmunoglobulina que puede unirse inmunoespecíficamente a MSLN humana. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116); b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124); d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126); e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
e. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada que se establece como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que se establece como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:176, 178, y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11LC que se establece como las SEQ ID NO:338, 340, y 342, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11HC que se establece como las SEQ ID NO:182, 184, y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:350, 352, y 354, respectivamente o zu33O11LC-CXXI que se establece como las SEQ ID NO:356, 358, y 360, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC que se establece como las SEQ ID NO:188, 190, y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC que se establece como las SEQ ID NO:362, 364, y 366, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC que se establece como las SEQ ID NO:194, 196, y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC que se establece como las SEQ ID NO:368, 370, y 372, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC que se establece como las SEQ ID NO:200, 202, y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC que se establece como las SEQ ID NO:374, 376, y 378, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC que se establece como las SEQ ID NO:206, 208, y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC que se establece como las SEQ ID NO:380, 382, y 384, respectivamente.
Además, se describen células huésped que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas. Las células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, células bacterianas, células de levadura, células de insectos, por nombrar algunas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir adicionalmente algunas de las modalidades descritas en la presente descripción. Los ejemplos están destinados a ilustrar, no a limitar, las modalidades descritas.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Métodos Ilustrativos
Generación de AcM de conejo específicos para TEM1 humano (endosialina/CD248)
Inmunización de conejo: para generar los AcM de conejo específicos para TEM1 humano (hTEMI), se preparó una proteína de fusión de con el dominio Fc de ratón y el dominio extracelular de endosialina humana soluble ("dominio extracelular de endosialina humana/TEM1 fusionado con Fc de IgG2b de ratón"). El dominio extracelular de hTEM1 se clonó en el marco EcoRI/HpaI en el pEF6-EK-IgG2b, que contenía un sitio de escisión de enteroquinasa seguido por el fragmento Fc gamma de IgG2b murina. Las células CHO-K1 se transfectaron con esta construcción y se seleccionaron con blasticidina 5 pg/mL. El TEM1-Fc secretado se sometió a electroforesis en un gel PAGE al 4-12 % y se tiñó con Coomassie, seguido de la escisión de las bandas. Las láminas de gel se emulsionaron en adyuvante completo/incompleto y se inyectaron en conejos Blancos de Nueva Zelanda cada 3 a 4 semanas, cuatro inyecciones. Se recolectó el bazo de un conejo que mostraba los mejores títulos contra hTEM1 como se evaluó por ELISA para la generación de hibridomas.
Generación de hibridomas: las fusiones se realizaron de la siguiente manera: células de bazo (1,5-3 x 108) de conejos inmunizados y la pareja de fusión 240E 1-1-2 se fusionaron en una proporción de 2:1 con 50 % de PEG 4000 (Em Science, Cherry Hill, N j) a 37 °C en medio sin suero. Las células se sembraron en placas de microtitulación de 48 pocillos, a aproximadamente 2x105 células de bazo por pocillo, en medio con 15 % de FCS. Después de 72 horas, se añadió hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). El medio se cambió cada 5-6 días. Los sobrenadantes se cribaron mediante ELISA para determinar la presencia de anticuerpo específico para TEM-1 mediante el uso de placas recubiertas con TEM1-Fc y se cribaron contra la Fc de ratón. Los sobrenadantes de los hibridomas se seleccionaron para determinar la reactividad de hTEM1 mediante ELISA y se eligió el clon 1-55-2 para la clonación recombinante.
Amplificación de regiones variables de la cadena ligera y pesada de anti-hTEM1 1-55-2: se aisló ARN del hibridoma de conejo 1-55-2 mediante el uso del mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Se usaron dos pg de ARN para RT-PCR mediante el uso del sistema de RT-PCR de una sola etapa SuperScript III con Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen). Los fragmentos génicos de longitud completa de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera de conejo se amplificaron mediante el uso de los pares de cebadores N02937/N02898 y N02937/N02347, respectivamente (Tabla 1). Los parámetros de los ciclos para la amplificación por RT-PCR fueron los siguientes: 55 °C 30 minutos; 94 °C 2 minutos; 30 ciclos de (94 °C 15 segundos, 55 °C 30 segundos, 68 °C 1 minuto); 68 °C 2 minutos.
Estos productos de PCR se usaron posteriormente en una segunda ronda de PCR para amplificar fragmentos susceptibles de generar IgG quiméricas conejo/humano mediante el uso de los pares de cebadores N02416/N02761 y N02417/N02764 (Tabla 1). Los parámetros de los ciclos para la segunda ronda de PCR fueron los siguientes: 94 °C durante 2 minutos; 30 ciclos de (94 °C 30 segundos, 55 °C 30 segundos, 68 °C 1 minuto); 68 °C 2 minutos,
Tabla 1. Cebadores usados para RT-PCR y clonación de anti-hTEM1 1-55-2
Figure imgf000042_0001
Después, los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa. Los productos de PCR que tenían los tamaños moleculares correctos para los productos VL y VH se purificaron mediante el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen, Valencia, CA) y se clonaron como se describe más abajo.
Generación de AcM de conejo específicos para CA9 humano
Inmunización de conejo: para generar anticuerpos de conejo específicos para CA9 humano, se generó de forma recombinante el dominio extracelular de CA9 humano ("dominio extracelular de CA9 humano" o "CA9-ECD"). Se inmunizaron dos conejos b9 mediante el uso de CA9-ECD. Brevemente, los conejos se inyectaron subcutáneamente con los antígenos cada 21 días. Cada conejo recibió 400 pg de CA9-ECD y adyuvante completo de Freund (FCA) en la primera inyección y 200 pg de CA9-ECD y adyuvante incompleto de Freund (FIA) en las dosis de refuerzo posteriores. Se recolectaron el sangrado previo y de prueba para la evaluación del título de anticuerpos.
La sangre de antes y después de la inmunización se evaluó para determinar la unión de CA9 mediante el uso de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) como se describe en la presente descripción. Las muestras de sangre se diluyeron en serie y se añadieron a microplacas recubiertas con la proteína CA9-ECD. Cuando el título alcanzó 1:15000 después de cuatro inyecciones, los conejos recibieron finalmente una dosis de refuerzo mediante la inyección intravenosa de 400 pg de CA9-ECD sin adyuvante. Se recolectaron los bazos de conejo una semana después de la dosis de refuerzo final. Se recolectaron hasta 100 mL de la sangre extraída en presencia de anticoagulante y se aislaron los linfocitos de bazos y ganglios linfáticos de cada conejo.
Generación de hibridomas: Los esplenocitos de conejo se descongelaron rápidamente, se centrifugaron a 1200 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos y se suspendieron en cIMDM más FBS al 10 % que contenía 100 pg/mL de ADNasa. Las células se estimularon con 2,5 pg/mL de mitógeno de hierba carmesí a 37 °C durante al menos 1 hora. Después de la estimulación, las células se centrifugaron a 1200 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos y se suspendieron en medio fresco. Se determinaron los recuentos celulares y la viabilidad.
Las células CBF7, pareja de la fusión, se descongelaron y se cultivaron a 37 °C con CO25 % durante una semana antes de la fusión. Se mezcló una cantidad apropiada de esplenocitos de conejo y de las células CBF7, parejas de la fusión, en la proporción conveniente (1:1,55 ~ 1:4) en tubos de 50 mL. La mezcla de células se centrifugó a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos y se lavó dos veces con 20 mL de medio de fusión CytoPulse helado (CPFM Formula C: CytoPulse Sciences #LCM-C) a 4 °C. Las células se suspendieron en CPFM a 106 células/mL.
Para la fusión se usó el aparato de fusión de células CytoPulse CEEF-50 (CytoPulse Sciences). Se traspasó un volumen apropiado de células a la cámara de fusión y se realizó la fusión mediante la activación de la conexión de alto voltaje. Después de la fusión, las células se incubaron en la cámara a temperatura ambiente durante 5 minutos, se suspendieron suavemente en medio Post-Fusión (RPMI1640 con FBS al 10 %, que contenía glutamato, piruvato, aminoácidos no esenciales, p-mercaptoetanol, penicilina, estreptomicina, y no contenía rojo de fenol) y después se transfirieron a un frasco. La cámara se lavó con el mismo volumen de medio de post-fusión para obtener células adicionales. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 25 minutos y después durante la noche a 37 °C, CO2 5 %.
Un día después de la fusión, las células se diluyeron en medio de siembra precalentado (cIMDM más FBS al 10 % que contenía IX hipoxantina-aminopterina-timidina) hasta la densidad conveniente (35000 células mL) y se sembraron a 200 pl/pocillo en microplacas de 96 pocillos. Las placas se incubaron a 37 °C, CO25% y se alimentaron con medio fresco semanalmente durante 3-4 semanas.
Cribado de los AcM anti-CA9: se fusionaron células B de esplenocitos de conejo con células CBF7, parejas de la fusión, para generar hibridomas como se describió en la presente descripción. Cuatro semanas después de sembrar las células en la placa, se recolectaron los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas individuales y se cribaron mediante el uso de un ELISA específico de CA9. Las placas de ensayo (placa transparente de 384 pocillos Greiner Bio-One High Binding cat #655081) se recubrieron con CA9 ECD 1 pg/mL, durante la noche, a 4 °C, y se bloquearon con Tampón de Ensayo IX (PBS más BSA 1 %, que contiene Tween-20 0,05 %). Después, se añadieron 25 pl/pocillo de sobrenadante y controles a las placas bloqueadas y se incubaron durante la noche a 4 °C. Las placas de ensayo se lavaron tres veces y, a las placas se añadieron 25 pl/pocillo de anticuerpos secundarios (IgG anti-ratón generado en cabra conjugado con HRP, Jackson # 115-035-146) diluidos 1:10 000 en Tampón de Ensayo. Después de la incubación a temperatura ambiente durante una hora, las placas de ensayo se lavaron tres veces y, a las placas se añadieron 25 pl/pocillo de sustrato TMB (KPL #52-000-04). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos, se añadieron 25 pl/pocillo de solución de parada IX (1:10 H2SO4, VWR #EM-SX1244-75). La absorbancia de la muestra a 450 nm se midió mediante el uso de un lector de placas Paradigm (Beckman). Los resultados positivos del cribado primario se confirmaron mediante un segundo ELISA específico de CA9.
Clonación y mutagénesis
Amplificación de las regiones VH y Vk de los AcM CA9 y hTEM1: Las células de hibridoma que secretaban AcM de conejo de interés se lisaron para extraer ARN. Después se usó ARN para la amplificación del ADN de las regiones variable kappa (Vk) y de las regiones variables de la cadena pesada (VH) mediante el método de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Se lavaron de cien a 10000 células de hibridoma cultivadas con PBS helado y se lisaron añadiendo 100 pl de solución de lisis/unión (Ambion, 8540G5) y mediante el uso de pipetas. Las células lisadas se congelaron rápidamente en hielo seco. El ARN se aisló con el kit Ambion RNAqueous de acuerdo con el procedimiento de fabricación. Aproximadamente 5 ng de ARN se sometieron a la primera ronda de RT-PCR mediante el uso de los cebadores enumerados en la Tabla 2 en cada reacción.
Tabla 2. Cebadores usados para la primera ronda de RT-PCR
Figure imgf000043_0001
Los parámetros de los ciclos para la amplificación por RT-PCR fueron los siguientes: 55 °C 30 minutos; 95 °C 2 minutos; 30 ciclos de (94 °C 1 minuto, 54 °C 50 segundos, 68 °C 1,5 minutos); 68 °C 10 min.
Los productos de la primera ronda de RT-PCR se sometieron a una segunda ronda de amplificación por PCR en una reacción separada para la cadena pesada y la cadena ligera, mediante el uso de los cebadores enumerados en la Tabla 3.
Tabla 3. Cebadores usados para la segunda ronda de amplificación por PCR
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Los parámetros de los ciclos para la segunda ronda de amplificación por PCR fueron los siguientes: 95 °C 5 minutos; 40 ciclos de (94 °C 1 minuto, 54 °C 50 segundos, 68 °C 1,5 minutos); 68 °C 10 minutos; 4°C remojo.
Después, los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los productos de PCR que tenían los tamaños moleculares correctos para los productos VL y VH se purificaron mediante el kit de extracción de gel QIAquick® (Qiagen, Valencia, CA) y los fragmentos se subclonaron en un plásmido de expresión que contenía una región constante gamma humana (Cy) o kappa (Ck) mediante el uso de un kit de clonación InFusion HD (Clontech). Todos los clones se secuenciaron para confirmar la presencia y fidelidad de los insertos.
Síntesis de genes: los dominios VH humanizados y los dominios Vk de zu155D5LC-1, -huVK1-39, - huVK2-40, -huVK3-11, -huVK4-1, -huVK5-2, -huVK6-21, -huVK6D-41, -huVK7-3, zu1E4LC-1, y zu166B3LC-1 se optimizaron por codones para la expresión en células humanas y se sintetizaron mediante DNA 2.0. Los dominios variables se sintetizaron con una secuencia de Kozak y una secuencia líder de Ig, e incluyeron 15 pares de bases en los extremos 5' y 3' homólogos al sitio de clonación dentro del vector de subclonación. Después de la escisión del vector de DNA 2.0, los fragmentos se subclonaron en un plásmido de expresión que contenía una región Cy o Ck humana mediante el uso de un kit de clonación InFusion HD. Todos los clones se secuenciaron para confirmar la presencia y fidelidad de los insertos.
QuikChange: la mutagénesis de los dominios Vk optimizado por codones se realizó mediante el uso de QuikChange XL de Stratagene de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todos los clones se secuenciaron para confirmar la presencia de la mutación.
Cultivo de Células
Transfección y generación de la línea celular estable: Un día antes de la transfección, se sembraron células 293F a 6.0x105 células/mL en medio 293FreeStyle (Thermo Fisher Scientific) en un frasco de agitación y se incubaron a 37 °C, CO28 %, con agitación a 125 rpm. En el día de la transfección, las células se sembraron a 1x106 células/mL como anteriormente. Las células se transfectaron mediante el uso de PEI (25 kDa, lineal; Polysciences) o ExpiFectamina (Thermo Fisher Scientific). Para las transfecciones de PEI, se incubaron 166,7 ng de plásmido HC, 166,7 ng de plásmido LC, 2,2 pg de PEI, y 50 pL de OptiPro (Thermo Fisher Scientific) por mL de células transfectadas durante 15 minutos a 22 °C. La mezcla de ADN:PEI se añadió a las células mientras se agitaban y se incubó a 37 °C, CO28 %, con agitación a 125 rpm. Después de 48-72 horas, las células se alimentaron a una concentración final de 10 g/L de Yeastolato (BD Biosciences), ácido valérico 5 mM (Sigma Aldrich), y concentrado de lípidos CD 1:100 (Thermo Fisher Scientific).
Por cada mL de células a transfectar con ExpiFectamina, se incubaron 333,3 ng de plásmido HC y 333,3 ng de plásmido LC durante 10 minutos en 50 pL de Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific). De la misma manera, se incubaron 2,67 pl de ExpiFectamina en 50 pl de Opti-MEM. La solución de ExpiFectamina se añadió a la mezcla de ADN y se incubó durante 30 minutos a 22 °C. La mezcla de ADN:ExpiFectamina se añadió a las células mientras se agitaba y se incubó a 37 °C, CO28 %, con agitación a 125 rpm. Al día siguiente, a la transfección se añadieron 3 pL de potenciador 1, y 30 pL de potenciador 2, por mL de células y se continuó la incubación durante otros 7 o 10 días, en dependencia de la densidad celular.
De uno a tres días después de la transfección, se seleccionaron grupos celulares que expresaron los anticuerpos de manera estable mediante la adición de 3 mL de transfectantes a 12 mL de DMEM en un frasco T75 con blasticidina 5 pg/mL y zeocina 400 pg/mL (Thermo Fisher Scientific). Después de que las células resistentes a los fármacos crecieron hasta la confluencia, el medio se reemplazó con medio de expresión FreeStyle 293. Después de 24 o 48 horas, las células se desprendieron físicamente golpeando ligeramente el frasco (la tripsinización resultó en baja viabilidad; datos no mostrados) y después se sembraron a 6x105 células/mL en 30 mL de medio de expresión FreeStyle 293 en un frasco de agitación de 125 mL. Los cultivos se incubaron a 37 °C en CO28% con agitación a 125 rpm.
Producción de AcM: La producción de anticuerpos a partir de grupos celulares estables se realizó mediante uno de dos métodos:
1. Los grupos de líneas celulares transfectadas de manera estable se sembraron a 0,6 a 1x106 células/mL en medio 293FreeStyle. Dos días después de que el cultivo alcanzó una densidad de 1x106 células/mL, se alimentaron los cultivos como se describió en la presente descripción; o
2. Los grupos de líneas celulares transfectadas de manera estable se centrifugaron a 1000 rpm en una centrífuga Beckman Allegra 6 durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante, y las células se suspendieron en 1 L de medio expi293 (Gibco) a 0,5-0,8x106 células/mL en un frasco de agitación de 2,8-L. Las células se incubaron a 37 °C, CO28 %, con agitación a 125 rpm.
Para ambos métodos, los cultivos se incubaron a 37 °C en CO28 %, con agitación a 125 durante 7-10 días, en dependencia de cuándo la viabilidad celular descendió a aproximadamente el 50 %, momento en el que los cultivos se centrifugaron durante 1 hora a 8000 rpm en un rotor Beckman JLA8.1000. Después, se filtró el sobrenadante a través de un filtro PES de 0,2 pm y se almacenó a 4 °C o -20 °C hasta su purificación.
Purificación de AcM
Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad de proteína A: Mediante el uso de un ÁKTA Explorer (GE Healthcare), se equilibró una columna de proteína A (GE Healthcare) con 10 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,2. Después, se cargó la muestra, seguido del lavado del material no unido con 10 CV de tampón de equilibrio. La muestra se eluyó mediante el uso de 5 CV de glicina 0,1 M pH 2,9. Las fracciones que contenían el AcM se agruparon y se dializaron en tampón de fosfato de Dulbecco (DPBS) mediante el uso de un MWCO 20K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific).
Desprotección de la cisteína: mediante el uso de un ÁKTA Explorer (GE Healthcare), se equilibró una columna de proteína A (GE Healthcare) con 10 CV de fosfato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,2 (tampón de equilibrio). Después, se cargó la muestra, seguido del lavado del material no unido con 10 CV de tampón de equilibrio. La columna se lavó con 16 CV de fosfato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM, cisteína 5 mM, pH 7,2 a 0,5 mL/minuto durante 16 horas a 4 °C para eliminar el grupo de protección. Después, la columna se lavó con 60 CV de Tris 20 mM, pH 7,5 a 0,5 mL/minuto durante 60 horas a 4 °C. La muestra se eluyó mediante el uso de 5 CV de glicina 0,1 M pH 2,9 e inmediatamente se neutralizó mediante el uso de un volumen de Tris 2 M, pH 9,0 al 5 %. Las fracciones que contenían AcM se agruparon y se dializaron en DPBS mediante el uso de un MWCO 20K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific).
Análisis por mapeo de enlaces disulfuro y cisteinilación mediante LC-MS/MS
El AcM se cambió de tampón a tampón de bicarbonato de amonio 50 mM, pH 7,8 mediante el uso de una columna de desalinización por centrifugación Zeba (Thermo-Fisher). La concentración se ajustó a 1 mg/mL y se añadió RapiGest (Waters) al 0,1%. Después, el AcM se digirió con Glu-C (New England BioLabs) (25:1 p/p) a 37 °C durante 4 horas, seguido de digestión con Asp-N (New England BioLabs) (25:1 p/p) a 37 °C durante 18 horas. Después de la digestión, se añadió ácido trifluoroacético (TFA) al 5 % hasta 0,5 % y se incubó a 37 °C durante 90 minutos. La muestra se centrifugó a 13000 rpm durante 30 minutos para eliminar los sedimentos y se analizó por LC-MS/MS mediante el uso de la metodología m Se en la segunda fase de ionización. La metodología MSE usa un voltaje en rampa en lugar de un voltaje fijo en la segunda fase de ionización para generar un perfil iónico más completo. Las muestras se analizaron mediante el uso de un espectrómetro de masas Waters Acquity UPLC y Q-Tof Premier. Las muestras se inyectaron en un Waters BEH 300 C18, tamaño de poro de 1,7 mm, 2,1 x 100 mm, eluyeron de la columna con un equilibrio de 3 minutos en 97 % de fase móvil A (ácido fórmico al 0,1 % en H2O), un gradiente lineal de 55 minutos (3-45 % fase móvil B (0,1 % ácido fórmico en acetonitrilo)), un gradiente lineal de 5 minutos (45 % -90 % fase móvil B), una fase isocrática de 5 minutos (90 % fase móvil B), un gradiente lineal de 5 minutos (90 % -3 % fase móvil B), y un reequilibrio de 5 minutos en 97 % de fase móvil A, a 0,05 mL/minuto. El espectrómetro de masas Q-Tof se ejecutó en modo V de iones positivos con detección en el intervalo de 200-2000 m/z. Los parámetros de la fuente fueron los siguientes: voltaje capilar, 3,0 kV, voltaje del cono de muestreo, 40 V; temperatura de la fuente, 120 °C; temperatura de desolvatación, 250 ° C; flujo de gas de desolvatación, 600 L/hora. El patrón de referencia de masa de Lockspray fue glu-fib. El método MSE fue el siguiente: tiempo de adquisición, 3-70 minutos; intervalo de datos, 200-2000m/z; tiempo de exploración, 1,5 segundos; expresión, baja energía 6V, rampa de alta energía de 10-30V.
La agregación de anticuerpos se analizó mediante el método de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) mediante el uso de un Agilent 1100. El AcM se diluyó a 1 mg/mL en DPBS. El anticuerpo (20 pL) se inyectó en una columna de protección TSKgel SuperSW (4,6 mm x 3,5 cm, tamaño de poro de 4 pm, Tosoh Bioscience), seguido de una columna TSKgel SuperSW3000 (4,6 mm x 30 cm, tamaño de poro de 4 pm), se eluyó de la columna con PBS 0,1 M que contiene NaCl 0,15 M y N aN al 0,05 %, a pH 7,4, a una velocidad de flujo de 0,3 mL/minuto durante 20 minutos. Todos los datos se analizaron con el programa informático Agilent ChemStation. El porcentaje de agregación se calculó como [PAagregado/PAtotal]*100, donde PA = área de pico integrada.
Análisis por UPLC/ESI-MS de la conjugación de malemida-biotina:AcM
Los anticuerpos purificados se diluyeron a 1 mg/mL en DPBS (las muestras se dejaron a la concentración original si estaban por debajo de 1,0 mg/mL). Se disolvió maleimida-PEG2-biotina ((mal)-PEG2-biotina) (Thermo Fisher Scientific) en DPBS para producir una solución madre 20 mM, seguido de dilución a 1 mM en DPBS. Se añadió Mal-PEG2-Biotina a 1 mL de AcM desprotegido en una relación de conjugación de 5:1 y se incubó a 22 °C con rotación suave durante 2 horas. La reacción se desaló mediante el uso de una columna de desalinización por centrifugación Zeba. Después, los AcM se desglicosilaron mediante el uso de PNGasa F (New England BioLabs). Se añadieron tampón G7 (10 pL) y PNGasa F (2 pL) al AcM (90 pL). La reacción se incubó en un microondas Discover (CEM) durante 2 ciclos: 1) potencia de microondas 10 W, 37 °C, 10 minutos, seguido de una pausa de 5 minutos; y 2) potencia de microondas 2 W, 37 °C, 10 minutos. Una porción de la muestra se redujo mediante la adición de ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 20 mM, seguido de incubación a 60 °C durante 3 minutos.
Después, las muestras se analizaron mediante el uso de un espectrómetro de masas Waters Acquity UPLC y Q-Tof Premier. Las muestras (0,5-2 pg cada una) se inyectaron en una microcolumna de desalinización MassPrep a 65 °C, eluyeron de la columna con un equilibrio de 5 minutos en 95 % de fase móvil A, un gradiente de 10 minutos (5-90 % B), y un reequilibrio de 10 minutos en el 95 % de la fase móvil A, a 0,05 mL/minuto. La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1 % en agua. La fase móvil B era ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El espectrómetro de masas Q-Tof se ejecutó en modo V de iones positivos con detección en el intervalo de 500-4000 m/z. Los parámetros de la fuente fueron los siguientes: voltaje capilar, 2,25 kV (anticuerpo intacto)-2,50 kV (anticuerpo reducido); voltaje del cono de muestreo, 65,0 V (anticuerpo intacto) o 50,0 V (anticuerpo reducido); temperatura de la fuente, 100 °C; temperatura de desolvatación, 250 °C; flujo de gas de desolvatación, 550 L/hora. El pico de proteína se deconvolucionó mediante el uso de la función MassLynx MaxEnt 1. La eficacia de conjugación se calculó como [I biotiniado/(Ibiotiniado+I sin modificar)]*100 del espectro de masas deconvolucionado, donde I = intensidad del pico de masa.
Análisis por BIAcore de la afinidad AcM:antígeno
Se ajustaron las concentraciones de anticuerpos para generar una señal de 30-40 RU cuando se unieron al antígeno. Se inyectaron AcM humanizados purificados mediante cromatografía de afinidad de proteína A estándar o mediante el método de desprotección sobre un sensor de IgG antihumano en un BIAcore T100 (Ge Healthcare) durante 1 minuto a una velocidad de flujo de 10 pL/minuto. La superficie del sensor se lavó inyectando tampón HBS-P durante 1 minuto a una velocidad de flujo de 50 pl/minuto. Para registrar la asociación del antígeno con el AcM capturado, se inyectó una serie de concentraciones crecientes de antígeno durante 60 segundos a una velocidad de flujo de 50 pl/minuto. La disociación del antígeno se controló durante 30 minutos a la misma velocidad de flujo. La superficie del sensor se regeneró mediante la inyección de MgCl23M durante 1 minuto y después 30 segundos a una velocidad de flujo de 30 pl/minuto. Los sensogramas se analizaron con el programa informático de evaluación Biacore T100 mediante el uso de un modelo de unión de Langmuir 1:1.
Preparación de Fab bivalente/biespecífico
Los fragmentos Fab derivados del AcM se prepararon por separado mediante el uso de papaína inmovilizada, seguido del aislamiento de los fragmentos Fab puros de Fc/AcM no digerido mediante el uso de cromatografía de proteína A. Se sintetizó maleimida-PEG4-azida mediante la combinación de NHS-maleimida y azida-PEG4-amina en DMSO durante 1 hora en una relación molar 1:1. El NHS sin reaccionar se inactivó mediante la adición de tampón Tris-HCl para evitar la homodimerización. Los Fab se conjugaron con maleimida-PEG4-azida o maleimida-PEG4-dibenzociclooctina (DBCO) en una relación molar de maleimida:Fab de 5:1 y se hicieron reaccionar durante 4 horas a 22 °C. Los fragmentos Fab modificados se desalaron dos veces cada una en DPBS para eliminar todos los productos sin reaccionar y los fragmentos Fab se combinaron en una relación molar de 1:1 a una concentración final de 2 mg/mL y se dejaron formar dímeros durante la noche a 22 °C. La reacción se analizó mediante SDS-PAGE y la eficiencia de dimerización se estimó en 20 %. La preparación de dímero se purificó a partir del monómero sin reaccionar mediante cromatografía de filtración en gel S-200.
Ensayo de octetos bivalentes/biespecíficos
Se capturó CA9 humano biotinilado en puntas de biosensor de estreptavidina (Pall) durante 4 minutos. Después de la incubación en PBS durante 2 minutos, las puntas se incubaron con los Fab bivalentes/biespecíficos, AcM solo, o Fab solo durante 5 minutos. Después de la incubación en PBS durante 2 minutos, las puntas se incubaron con endosialina humana/TEM-1 durante 5 minutos. Finalmente, las puntas se incubaron en PBS durante otros 2 minutos. Se midió la asociación y disociación de proteína de las puntas.
Ejemplo 2 - conjugación de Cys80
Objetivo
Las tecnologías de conjugación específicas de sitio son convenientes para producir un producto homogéneo con una relación definida de fármaco a anticuerpo (DAR). El dominio Vk de un AcM de conejo, tal como el derivado de Oryctolagus cuniculus, puede contener una cisteína en la posición 80 (denominada "Cys80") (Figura 1A) y la región Ck puede contener una cisteína en la posición 171 ("Cys171") (Figura 1B). El modelado in silico pronosticó que Cys80 y Cys171 podrían formar un enlace disulfuro, ya que se pronostica que los dos átomos de S están separados aproximadamente por 1,6 A (Figura 2A). Los AcM humanos tienen residuos de prolina, serina, o alanina en la posición 80 (Figura 1A) y serina en la posición 171 (Figura 1B), por lo que no hay puente disulfuro entre la región variable y la constante (Figura 2B).
La estructura cristalina más cercana a las secuencias de Vk y Ck de conejo o humano se identificó mediante el uso de la base de datos BLAST pdb y se usó como un molde para el modelado de la estructura del AcM 155D5. Los modelos se generaron mediante el uso de la herramienta "Construir Modelos de Homología" de Discovery Studio (Accelrys). Se seleccionó el modelo con la energía total más baja, se tecleó con el campo de fuerza CHARMm, y la energía se minimizó aún más a través dos rondas de minimización de energía mediante el uso de la herramienta "Minimizar". Después, se refinaron los bucles de CDR mediante el uso de la herramienta "Modelado del Bucle de Anticuerpo". Se seleccionó el modelo con la energía total más baja, se tecleó con el campo de fuerza CHARMm, y la energía se minimizó aún más como se indicó anteriormente. La proximidad de Cys80 y Cys171 (Figura 2A) predice que estas cisteínas pueden formar un enlace disulfuro. Se usó la herramienta "Construir Mutantes" para representar este enlace disulfuro.
Dado que los enlaces disulfuro son críticos para mantener la integridad estructural secundaria y terciaria, que a su vez es necesaria para la actividad biológica de un anticuerpo, era importante evaluar si realmente existía el enlace pronosticado Cys80-Cys171. Por lo tanto, se condujeron experimentos ad hoc que demostraron de manera inequívoca que los AcM de conejo contenían tal enlace (Tabla 4).
Tabla 4. Demostración de la existencia del enlace disulfuro Cys80-Cys171
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Se preparó un AcM quimerizado de especie humana mediante la fusión entre: i) la región variable de la especie donde se generó el AcM; y ii) la región constante humana. Este proceso se llama quimerización. Un AcM humanizado se compone principalmente de regiones variables y constantes humanas, excepto para los residuos necesarios para la unión del antígeno, que son de la misma especie del huésped a partir del cual se generó el AcM. Este proceso se llama humanización. Para diseñar los AcM humanos quimerizados o humanizados, mediante los cuales los AcM se generaron en huéspedes pertenecientes a la especie Oryctolagus cuniculus, los dominios constantes completos, así como también la mayoría de las regiones variables (si están humanizadas), se reemplazaron genéticamente con las secuencias variable humana y constante humana. Después de la quimerización o la humanización, la Cys80 en la Vk ya no formó más un enlace disulfuro con la posición 171 en la Ck (Figura 2C) y, por lo tanto, no está apareada.
Las familias Vk de conejo NZW de la línea germinal tienen una cisteína en la posición 80 como se muestra en la Figura 3 (se eliminaron las regiones CDR y se alinearon las regiones marco (FWR) 1, 2 y 3).
Descubrimiento y caracterización de una cisteína desapareada en la posición 80
Las regiones constantes de 155D5 y 1E4 (anti-CA9), 1-55-2 (anti-hTEM1) de conejo, así como también 33011 (anti-MSLN), todas las cuales contienen Cys80 y se generaron como se describió en el Ejemplo 1, se reemplazaron con las regiones constantes humanas de una IgG1k para generar el AcM quimerizado conejo/humano, como se describe en otra parte de la presente descripción. Específicamente, la región VH de 155D5 de conejo se fusionó con la región humana Cy para generar xi155D5HC, y la región Vy de 155D5 de conejo se fusionó con la región Ck humana para generar xi155D5LC. El AcM 155D5 quimerizado conejo/humano con la Cys80 desapareada se denomina en la presente descripción xi155D5.
La región VH de 1-55-2 se fusionó con la región Cy humana para generar xi1-55-2H, y la región Vk de 1-55-2 de conejo se fusionó con la región Ck humana para generar xi1-55-2LC. El AcM 1-55-2 quimerizado conejo/humano con la Cys80 desapareada se denomina en la presente descripción xi1-55-2.
La región VH de 1E4 de conejo se fusionó con la región Cy humana para generar xi1E4HC, y la región Vk de 1E4 de conejo se fusionó con la región Ck humana para generar xi1E4LC. El AcM 1E4 quimerizado conejo/humano con la Cys80 desapareada se denomina en la presente descripción xi1E4.
La región VH de 33011 de conejo se fusionó con la región Cy humana para generar xi33O11HC, y la región Vk de 33011 de conejo se fusionó con la región Ck humana para generar xi33O11LC. El AcM 33011 quimerizado conejo/humano (xi33O11) con la Cys80 desapareada se denomina en la presente descripción xi33O11.
Debido a que la Cys171 se sustituyó con Ser171 durante la quimerización, los anticuerpos quimerizados (xi155D5, xi1-55-2, xi1E4, y xi33O11) contenían una cisteína desapareada en la posición 80 de Vk (denominada "Cys80"). Cuando se redujo mediante el uso de condiciones duras (DTT 20 mM a 60 °C durante 5 minutos), el peso molecular (masa) de la cadena ligera del AcM xi155D5 purificado con proteína A fue 23382 Da (Figura 4A). Sin embargo, cuando se sometió a condiciones reductoras suaves (DTT 100 pM, RT, 30 minutos) la masa aumentó en 120 Da (Figura 4B). Este aumento de masa sugirió que Cys80 podría formar un enlace disulfuro con una cisteína libre, denominada como cisteína "de protección". Esta estructura molecular, que resulta de una reacción denominada "cisteinilación", se denomina como Cys80 "protegida". Para confirmar esta hipótesis, se digirió el AcM xi155D5 con Asp-N y Glu-C, y se analizaron las masas de los péptidos. El análisis de espectrometría de masas de los fragmentos de péptidos correspondientes a los residuos 71 hasta Cys80 (FTLTITGVQC) (SEQ ID NO:24) indicó un peso molecular aumentado en 119 Da (Tabla 5), lo que confirma de esta manera que la Cys80 estaba protegida.
Tabla 5. Espectrometría de masas de fragmentos del péptido 71-Cys80 de xi155D5
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Debido a que la falta del enlace disulfuro Cys80-Cys171 podría haber conducido a la inestabilidad del anticuerpo, la alteración de la unión del antígeno, o ambas, se realizaron pruebas de estabilidad del anticuerpo y de unión del antígeno. La estabilidad de xi155D5 se evaluó mediante el uso de un ensayo SE-HPLC. Este ensayo evalúa si la falta de enlace disulfuro Cys80-Cys171 podría conducir a la agregación (debido a posibles enlaces Cys80-Cys80 intermoleculares) o degradación (debido a una mayor sensibilidad a las proteasas). El anticuerpo purificado a 1 mg/mL en PBS 1x se almacenó a -80 °C o 37 °C durante 1 semana. Se inyectaron diez pL de xi155D5 en una columna SuperSW3000 (TOSOH Biosciences, 4,6 mm X 30 cm, tamaño de partícula de 4 pm) equipada con una columna protectora TSKgel de 4,6 mm X 3,5 cm en línea a una velocidad de flujo de 0,3 mL/minuto con fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, NaN30,05 % como fase móvil. No se observó ningún cambio significativo en la agregación entre las dos condiciones de almacenamiento (Figura 5A y 5B). El nivel de agregación estaba en el intervalo del 3-4 % y por lo tanto dentro del intervalo normal de una IgG1 humana típica (datos no mostrados). Se observaron pocos o ningún producto de degradación en cualquier condición de almacenamiento (Figura 5). Estos resultados sugieren que xi155D5, que carece del enlace disulfuro Cys80-Cys171, es una proteína estable en las condiciones de almacenamiento evaluadas.
Para determinar si la quimerización, y por lo tanto, la pérdida del enlace disulfuro Cys80-Cys171, resulta en perturbaciones estructurales que conducen a la pérdida de la unión al antígeno, la afinidad de unión de los AcM 155D5, xi155D5, 1-55-2, y xi1-55-2 se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial. El ligando biotinilado (biotinahTEM1 para 1 -55-2, biotina-CA9 para 155D5) se capturó en un chip CAP BIAcore recubierto de biotina (GE Healthcare, Piscataway, NJ) mediante el uso de HBS-EP como tampón de corrida. Los niveles finales de captura de antígeno fueron 130 RU y 280 RU, respectivamente, para biotina-TEM1 y biotina-CA9. Se pasaron diluciones seriadas de anticuerpo (120 pl de 0-50 nM) sobre el chip recubierto de ligando. Se observó la disociación durante 25 minutos. La superficie del chip se regeneró con GuHCl 6 M, NaOH 250 mM. Se hizo doble referencia a los sensogramas y se determinaron los parámetros cinéticos mediante el uso del programa informático BIAEvaluations (ver. 4.1). Se observó poca o ninguna pérdida de afinidad de unión debido a la quimerización de dos AcM diferentes (Tabla 6), lo que sugiere que la falta del enlace disulfuro Cys80-Cys171 no conduce a la alteración de la región de unión.
Tabla 6. Constantes cinéticas de AcM quimerizados y de conejo
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Evaluación de la utilidad de Cys80 para conjugaciones de agentes funcionales
Después de haber establecido que la falta de enlace disulfuro Cys80-Cys171 no conduce a perturbaciones estructurales, se exploró la posibilidad de reemplazar la cisteína de protección con un compuesto reactivo con tiol. Un grupo reactivo con tiol puede unirse a un enlazador, que a su vez puede unirse a una molécula de utilidad diagnóstica o terapéutica, denominada en la presente descripción "agente funcional". Los agentes funcionales pueden incluir fluoróforos, colorantes fluorescentes, polipéptidos, inmunoglobulinas, antibióticos, ácidos nucleicos, radionúclidos, enlazadores químicos, moléculas pequeñas (tales como agentes quimioterapéuticos), quelantes, lípidos, y fármacos.
Para sustituir la cisteína de protección con un agente funcional, primero se eliminó la cisteína de protección. La exposición de AcM purificados a condiciones reductoras podría romper el enlace disulfuro entre Cys80 y la cisteína de protección, denominada en la presente descripción "desprotección". Sin embargo, las condiciones de reducción subóptimas, por ejemplo, las condiciones de reducción dura, podrían romper, además, los enlaces disulfuro inter e intracatenarios, lo que compromete de esta manera la estructura y la actividad del AcM. Por lo tanto, se desarrolló un método de desprotección que implica la eliminación de la cisteína de protección mediante reducción suave, seguido de la reoxidación con tampón que contiene Tris que no altera la estructura y actividad del AcM, mientras que aún permite la eliminación de la cisteína de protección. Inicialmente se evaluaron numerosos agentes reductores, que incluyen glutatión reducido, cisteína, TCEP, y DTT. El glutatión no eliminó eficazmente la cisteína de protección (datos no mostrados). Tanto el DTT como el TCEP eliminaron eficientemente la cisteína de protección, pero concentraciones más altas resultaron, además, en la rotura casi completa de los disulfuros intercatenarios y probablemente también de algunos disulfuros intracatenarios (datos no mostrados). La cisteína reductora suave eliminó eficazmente la cisteína de protección y solo se observó una rotura limitada entre cadenas. La reoxidación se examinó mediante el uso de tampón fosfato, tampón Tris, y el oxidante fuerte CuSO4. No se observó reoxidación de los disulfuros intercatenarios alterados con el tampón fosfato, mientras que CuSO4 reconstituyó los disulfuros de forma rápida y eficaz, pero no se evaluó más a fondo debido a su toxicidad inherente en comparación con Tris. Las condiciones optimizadas se adaptaron a un formato de columna para permitir la purificación secuencial y la desprotección de la materia prima. Con este método, el anticuerpo se unió a la resina de proteína A y se incubó con flujo limitado (0,5 mL/minuto) con un tampón que contenía cisteína 5 mM durante 16 horas para reducir (romper) el enlace disulfuro cisteína-Cys80, seguido de lavado con un tampón que contiene T ris sin cisteína durante 60 horas para eliminar las cisteínas liberadas mediante este tratamiento y volver a oxidar los enlaces disulfuro intercatenarios reducidos. Después, se eluyó el AcM en un tampón de glicina de pH bajo. En un experimento ilustrativo mediante el cual se aplicó el método de desprotección a xi155D5, se determinó la masa del AcM purificado no reducido y se encontró que ~ 99 % del AcM estaba desprotegido, como lo demuestra la caída en la masa equivalente a dos cisteínas libres (Figuras 6A y 6B). El ensayo de tiol libre confirmó la presencia de dos grupos tiol por AcM, lo que demuestra, además, una reoxidación eficaz (datos no mostrados).
La Cys80 desprotegida puede conjugarse con maleimida
La cisteína es un a-aminoácido con una cadena lateral apolar (tiol; -SH). La cadena lateral de tiol reducida en una cisteína desapareada podría servir como un nucleófilo que puede reaccionar con una molécula electrófila tal como maleimida, un compuesto químico con la fórmula H2C2(CO)2Nh . El doble enlace electrófilo en la maleimida reacciona fácilmente con el grupo tiol nucleófilo que se encuentra en la cisteína para formar un enlace tioéter carbono-azufre estable. La no polaridad de la cadena lateral del tiol, en dependencia de los residuos circundantes, podría conferir una propiedad hidrófoba a una cisteína que puede prevenir la exposición al solvente, necesaria para las modificaciones químicas. Además, la ubicación de la cisteína en el contexto de la estructura secundaria del péptido en el que se encuentra puede prevenir aún más el acceso de la molécula reactiva con tiol. Se realizaron pruebas experimentales para determinar si la Cys80 podría reaccionar con una molécula reactiva con tiol después de realizar la desprotección. El xi155D5 desprotegido se incubó con maleimida-PEG2-biotina como se describe en otra parte de la presente descripción. El análisis de espectrometría de masas mostró que el 94 % del AcM estaba conjugado con maleimida-PEG2-biotina como lo indica un aumento en la masa molecular de 526 Da (Figura 7), correspondiente a la masa del agente funcional. Como cada cadena ligera se encontró conjugada (único pico de masa, Figura 7), la relación maleimida-PEG2-biotina a xi155D5 fue homogéneamente igual a 2:1. Se conjugó una maleimida-PEG2-biotina a una Cys80 en cada una de las dos cadenas ligeras en el AcM quimerizado (Cys801 y Cys802).
Estos resultados demuestran que Cys80 y Cys171 forman un enlace disulfuro que une las regiones Vk y Ck de un AcM de conejo. Cuando se quimerizaron los AcM de conejo, Cys171 se sustituyó por Ser171 presente en la región Ck humana. Esta sustitución abolió el enlace disulfuro Cys80-Cys171. Cuando se evaluaron los efectos de perder este puente disulfuro sobre la estabilidad estructural y la actividad del AcM quimerizado resultante en comparación con el AcM de conejo original, se observó que el AcM quimerizado era estable y activo. Se descubrió que tanto la Cys801 como la Cys802, que permanecieron sin aparear en el AcM quimerizado, estaban cubiertas por una cisteína libre (cisteína de protección). Posteriormente, se desarrolló un método para eliminar la cisteína de protección (desprotección), mientras se mantiene la estabilidad estructural y la actividad del AcM quimera resultante. Además, se demostró que podían lograrse altos rendimientos de AcM conjugado con maleimida-PEG2-biotina con una relación de agente funcional a AcM igual a 2:1.
Humanización del AcM de conejo
Los AcM quimerizados podrían ser inmunogénicos cuando se administran a seres humanos y, por lo tanto, es conveniente humanizar los AcM de conejo mediante la sustitución de las secuencias de conejo con secuencias humanas en las regiones Vk y VH. La secuencia de aminoácidos del AcM 155D5 se analizó mediante el uso de una búsqueda BLAST contra una base de datos de dominio variable humano en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/ para identificar la secuencia humana con mayor homología con la secuencia de conejo. Se identificaron IGHV3-64*04 and IGKVI-5*03 como las mejores secuencias para la humanización, ya que su uso resultaría en el menor número de sustituciones de residuos de conejo (Figura 8).
Las secuencias de 155D5 correspondientes a los dominios de unión a antígenos identificados por Kabat y Chothia CDRH1, Chothia CDRH2, CDRh 3, CDRL1, CDRL2, y CDRL3 se insertaron en las regiones marco (FWR) de IGHV3-64*04 o IGKV1-5*03 humano para generar el AcM 155D5 humanizado, denominado zu155D5-1 (Tabla 7 y Tabla 8).
Durante la humanización de 155D5LC (zu155D5LC), se mantuvo Cys80, que no estaba apareada ya que la secuencia kappa humana tiene Ser171 en oposición a Cys171. Se produjo y se purificó zu155D5-1 mediante el uso de purificación estándar de proteína A, y se encontró que estaba protegido, como se evidencia por el cambio de masa después de la desprotección en 233 Da, correspondiente aproximadamente a dos cisteínas de protección (Figura 9). Como se observó con xi155D5, zu155D5-1 también podría desprotegerse con una eficiencia cercana al 100 % (Tabla 9). Sin embargo, la desprotección condujo a niveles masivos de agregación (70 %) versus solo el 14 % en xi155D5. Cuando se hizo reaccionar zu155D5-1 con maleimida-PEG2-biotina, se observó una conjugación del 0 % mientras que xi155D5 estaba conjugado al 93 % (Tabla 9). Estos resultados fueron sorprendentes, ya que sugieren que: 1) tener una cisteína en la posición 80, aunque es necesario, no es suficiente para permitir la conjugación específica de sitio de un agente funcional; y 2) en algunas condiciones, intentar la conjugación en Cys80 podría conducir a una alta agregación incompatible con la capacidad de fabricación del fármaco. Sin embargo, dado que los estudios descritos, que caracterizaron xi155D5, demostraron que al menos en algunas condiciones la conjugación de un agente funcional en la Cys80 podría ser muy eficaz, se investigó a continuación cómo los residuos que rodean a Cys80 pueden influir en la eficacia de la conjugación. En consecuencia, se generaron modelos estructurales de xi155D5 quimerizado (Figura 10), que indicaron que los residuos Vail11, Ala14, Gly17, Thr18, Lys63, Thr76, Gly77, Val78, Ala83, Glu103, y Leu104 estaban muy cerca (dentro de 18 A) a Cys80 y, por lo tanto, podría afectar potencialmente la eficiencia de su conjugación.
Se diseñaron dos versiones de FWR1 (FWR1a-b), una versión de FWR2, tres versiones de FWR3 (FWR3a-c), y dos versiones de FWR4 (FWR4a-b) en base a los residuos mencionados anteriormente (Tabla 7).
Tabla 7. Versiones de regiones marco derivadas de la familia Vk humana IGKV1-5
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Se generó una serie de variantes de 155D5 humanizadas que contenían combinaciones de estas regiones marcos y ya sea de Cys80-Xaa1-Xaa2-Phe83 (también conocida como C-X-X-F o CXXF) o Cys80-Xaa1-Xaa2-Ala83 (también conocida como C-X-X-A o CXXA), donde "Xaa" o "X" indica los aminoácidos en la posición 81 y 82 (Tabla 8).
Tabla 8. Variantes de 155D5 humanizadas derivadas de la familia Vk humana IGKV1-5
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Se observó que, independientemente de la versión de la FWR usada, los AcM humanizados que tenían el motivo C-X-X-F mostraron una alta agregación (después de la desprotección) y una mala conjugación (Tabla 9). Por el contrario, 4 de las 5 variantes de AcM que contienen el motivo C-X-X-A, e independientemente de la versión de la FWR usada, mostraron un alto porcentaje de eficiencia de conjugación (>80 %) y una baja agregación (después de la desprotección) de <18 % (Tabla 9). El zu155D5-4 es un caso atípico que exhibió un bajo porcentaje de eficiencia de conjugación y una alta agregación después de la desprotección. Se observa que el anticuerpo zu155D5-4 tiene una propensión a agregarse independientemente de la desprotección, lo que puede explicar los resultados observados. Estos datos sugirieron que Phe83 está involucrada en causar una alta agregación después de la desprotección y no favorece la conjugación en Cys80.
Tabla 9. Niveles de agregación y eficiencia de conjugación de xi155D5 versus diferentes variantes de zu155D5
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Es conveniente lograr una agregación del 25 % o menos como punto de partida de la optimización del proceso posterior, mediante el cual una mayor optimización de los parámetros de fermentación, las condiciones de purificación y las formulaciones de los fármacos pueden lograr un nivel de agregación más conveniente del 5 % o menos. Es deseable, además, lograr un 70 % o más de eficiencia de conjugación para minimizar el desperdicio de producto, el costo de los bienes, y maximizar la homogeneidad del producto. En lo sucesivo, la investigación se centró en cumplir y superar estas especificaciones extrapolando las reglas para aplicarlas a los métodos de humanización de los AcM de conejo.
El 155D5-1 se generó siguiendo una práctica estándar, que implica utilizar las secuencias de la línea germinal humana más homólogas a la secuencia original. Debido a esta práctica, la subfamilia Vk IGKV1-5 humana se usó para humanizar 155D5, que tiene un porcentaje de identidad del 70,5 % (datos no mostrados) y que contiene Phe83. Las subfamilias Vk alternativas, que tienen un porcentaje similar de identidad (datos no mostrados), también contenían Phe83 (Figura 8). Como este residuo pareció influir negativamente en la eficiencia de la conjugación de Cys80 y causar una alta agregación, se evaluó la presencia o ausencia de Phe83 en otras familias de Vk humanas, a pesar del hecho de que la mayor identidad encontrada en estas familias de Vk fue menor (68,4 %) y por lo tanto típicamente no se usarían para humanizar 155D5. Dado que todas las familias Vk humanas, excepto lGKV4, IGKV5 e IGKV7, tienen múltiples subfamilias, todas las subfamilias se alinearon dentro de su familia (datos no mostrados). Después de la eliminación de las secuencias redundantes, sólo quedó una secuencia para cada una de las familias IGKV-4, -5, -6, -6D, y -7, que podría usarse para la humanización. Para las familias IGKV-1, -2, y -3, se eligió la subfamilia con la homología más cercana al consenso como el marco para humanizar 155D5. Un análisis preliminar indicó que mientras algunas de estas familias Vk contenían Phe83, otras no (y Tabla 10).
Para estudiar el efecto de la presencia o ausencia de Phe83 en el contexto de estas familias Vk, las regiones CDR de 155D5 se injertaron genéticamente en los marcos humanos IGKV1-39*01, IGKV2-40*01, IGKV3-11*01, IGKV4-1*01, IGKV5-2*01, IGKV6-21*01, IGKV6D-41*01, e IGKV7-3*01. IGKV5-2*01 Asn20, que contiene un sitio de glicosilación ligado a N en los residuos 20, y su variante Thr20 no se incluyeron en este análisis porque el primero no pudo analizarse mediante espectrometría de masas debido a la heterogeneidad, y el segundo no se expresó bien. IGKV7-3*01 Asn81 no se incluyó en el análisis porque no pudo analizarse mediante espectrometría de masas. Sin embargo, en el análisis se incluyó la variante IGKV7-3*01-Glu81. Se obtuvieron los siguientes resultados a partir del análisis (Tabla 10):
1. El AcM humanizado con la secuencia huIGKV1-39 y que contenía Phe83 mostró un aumento de agregación del 0 al 26 % después de la desprotección; la eficacia de la conjugación estaba en el límite aceptable (68 %) pero no así la agregación >25%;
2. El AcM humanizado con la secuencia huIGKV2-40 contenía una Val83 de línea germinal humana; este AcM mostró agregación <25 % después de la desprotección (11%) y eficiencia de conjugación >70 % (92 %). Estos parámetros fueron aceptables, lo que sugiere que la Val83 de línea germinal humana favorece el apareamiento con Cys80 para permitir la conjugación de Cys80;
3. El AcM humanizado con la secuencia huIGKV3-11 contenía una Phe83 de línea germinal humana; mientras que la agregación estuvo por debajo del 25 %, la eficiencia de conjugación fue del 55 %, por lo que no cumplió con el criterio de >70 %;
4. El AcM humanizado con la secuencia huIGKV4-1 contenía una Val83 de línea germinal humana; este AcM mostró agregación <25 % después de la desprotección (6 %) y eficiencia de conjugación >70 % (82 %). Estos parámetros eran aceptables, lo que sugiere que Val83 humana favorece el apareamiento con Cys80 para permitir la conjugación de Cys80, como se ve con la secuencia huIGKV2-40;
5. Los AcM humanizados con las secuencias huIGKV6-21 o huIGKV6D-41 contenían ambos una Ala83 de línea germinal humana; estos AcM mostraron agregación <25 % después de la desprotección y eficiencia de conjugación >70 %. Estos parámetros eran aceptables, lo que sugiere que la Ala83 de línea germinal humana favorece el apareamiento con Cys80 para permitir la conjugación de Cys80, como se ve con la secuencia xi155D5; y 6. El AcM humanizado con la secuencia huIGKV7-3-Glu81 contiene una Thr83 de línea germinal humana; este AcM mostró agregación <25 % después de la desprotección (6 %) y una eficiencia de conjugación cercana al 100 %. Estos parámetros eran aceptables, lo que sugiere que la Thr83 de línea germinal humana favorece el apareamiento con Cys80 para permitir la conjugación de Cys80.
Tabla 10. Niveles de agregación y eficiencia de conjugación de diferentes variantes de zu155D5 generadas mediante el uso de varias subfamilias de Vk humanas
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Estos resultados apoyan el descubrimiento de que la posición 83 influye negativamente en la eficiencia de conjugación de Cys80 cuando está ocupada por fenilalanina e indican que, además de alanina, la valina y la treonina pueden sustituir a Phe83 para permitir la conjugación de Cys80.
Para confirmar que, en el contexto de otros AcM, Phe83 está involucrada en causar una alta agregación después de la desprotección y no es propicio para la conjugación en Cys80, se generaron variantes de AcM humanizados de 1E4 (anti-CA9), 166B3 (anti-CA9), y 33011 (anti-MSLN) que contenían C-X-X-F o C-X-X-A.
Las variantes de anticuerpos monoclonales que tienen el motivo C-X-X-F cumplieron las especificaciones de conjugación, pero no las especificaciones de agregación, mientras que todas las variantes de AcM humanizados que tienen C-X-X-A mostraron agregación menor del 25 % y eficiencia de conjugación mayor del 70 % (Tablas 11 y 12).
Estos estudios demuestran que C-X-X-(no)F o K es un motivo que permite cumplir con las especificaciones de conjugación.
Tabla 11. Niveles de agregación y eficiencia de conjugación de diferentes variantes de AcM humanizados comparando los motivos C-X-X-F versus C-X-X-A y C-X-X-I
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Además de Ala83, Val83, y Thr83, que pueden encontrarse en las secuencias Vk que pertenecen a las subfamilias de la línea germinal huIGKV1-7, Ile83, también puede encontrarse, aunque raramente, en la familia de la línea germinal huIGKVI. Debido a que Ala83, Val83 y Thr83 ya eran propicias para la conjugación de Cys80 (Tabla 9 y Tabla 11), quedaba por determinar si Ile83 sería un residuo favorable o desfavorable con respecto a la conjugación de Cys80. Por lo tanto, se generó la variante de AcM humanizado de 33011 que contenía el motivo Cys80-Xaa1-Xaa2-Ile83 (también denominado como C-X-X-I o CXXI), que mostraba una agregación inferior al 25 % y una eficiencia de conjugación superior al 70 % (Tabla 11), de acuerdo con los motivos previos C-X-X-(no)F evaluados. Este resultado respalda el descubrimiento de que, además de Ala83, Val83 y Thr83, Ile83 también puede sustituir a Phe83 para permitir la conjugación de Cys80 y cumplir con las especificaciones de conjugación.
Los estudios descritos indican que, mientras que los AcM de conejo quimerizados son adecuados para la conjugación específica de sitio en Cys80 solo después de aplicar el método de desprotección descrito anteriormente, los AcM de conejo humanizados que tienen el motivo C-X-X-F o el motivo C-X-X-K no son bien adecuados para tales modificaciones debido a la alta agregación después de la desprotección y/o baja eficiencia de conjugación. Se planteó la hipótesis de que los residuos circundantes a Cys80 pueden desempeñar un papel en este fenómeno. Debido a que la región Vk abarca más de 100 residuos, la comprensión de la interacción entre los residuos circundantes clave y Cys80 requirió el uso de modelos estructurales combinados con pruebas experimentales. Se descubrió que entre los residuos muy próximos a Cys80, Phe83 ejercía un efecto negativo sobre la eficacia de conjugación de Cys80. Además, se observó que todos los AcM de conejo contenían Phe83 después de la humanización mediante el uso de un enfoque de humanización clásico (Figura 11), a pesar de que las secuencias de Vk humanas también pueden contener otros aminoácidos en la posición 83, que incluye alanina, treonina, valina, e isoleucina. Cuando estas familias Vk se usaron para la humanización, se confirmó que Phe83 y Lys83 son suficientes para dotar al AcM humanizado de propiedades indeseables, tales como alta agregación y/o baja eficiencia de conjugación, mientras que los residuos de aminoácidos restantes (con la excepción de Cys, que no se evaluó debido a la conveniencia de obtener una sola Cys para la conjugación) fueron propicias para la conjugación de Cys80.
Estos resultados sugieren que el motivo C-X-X-F y el motivo C-X-X-K deben evitarse cuando se conjugan en Cys80. Mediante el uso de un motivo C-X-X-(no)F o K, por ejemplo, los motivos C-X-X-A, C-X-X-T, C-X-X-V, y C-X-X-I, mediante la sustitución de Phe83, se generaron AcM quimerizados así como también humanizados que cumplían las especificaciones de conjugación convenientes.
Afinidad de xi155D5 y de las variantes humanizadas
El xi155D5 y las variantes humanizadas se purificaron mediante cromatografía de proteína A estándar o el método de desprotección, y se analizó su afinidad mediante el uso de BIAcore (Tabla 13). Hubo una diferencia de menos de 2 veces en la KD entre 155D5 quimérico y humanizado, y poca diferencia entre las muestras purificadas por los dos métodos diferentes.
Tabla 13. Análisis por BIAcore de la unión de antígenos de los AcM 155D5 humanizados y quiméricos
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Ejemplo 3 - Generación de anticuerpos monoclonales conjugados de mesotelina-auristatina
La mesotelina (MSLN) es una proteína de la superficie celular que se expresa en cáncer, que incluye determinados tumores de ovario, pulmón, páncreas, y mesotelioma. Para mejorar la potencia de los agentes dirigidos a MSLN, se desarrollaron anticuerpos monoclonales (AcM) de conejo anti-MSLN de novo y posteriormente se diseñaron y conjugaron con auristatina F (AuF) en Cys80 para generar un panel de AcM conjugados de MSLN-AuF.
Generación y caracterización de AcM anti-MSLN de conejo
Se inmunizaron conejos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus) en Aldevron (Alemania) mediante el uso de ADN plasmídico que codifica la proteína MSLN humana ("MSLN"). El día 52, se recolectaron sueros de animales y después se analizaron para determinar la unión de MSLN por citometría de flujo mediante el uso de células de mamífero que expresan transitoriamente MSLN humana. La Figura 12-D muestra que los sueros de ambos animales contenían anticuerpos de unión a MSLN. Posteriormente, un ensayo ELISA confirmó este resultado (Figura 12E). Después, se sacrificaron los animales y se recolectaron y criopreservaron las PBMC a partir de la sangre, así como también los linfocitos de los bazos y los ganglios linfáticos.
Los linfocitos de los ganglios linfáticos previamente congelados se recuperaron y se trataron con DNasa I y mitógeno de hierba carmesí durante una hora a 37 °C/CÜ25 %. Las células se contaron y se sembraron a 5 células/40 pl/pocillo en medio IMDM completo que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 % y citocinas (IL-2 e IL-21 a 10,5 ng/mL) en placas de 384 pocillos sembradas previamente con células CHO-K1, que expresan CD154, como células alimentadoras. Las células se alimentaron de nuevo mediante la adición de 20 pl/pocillo del mismo medio que antes después de una semana. Dos semanas después de la siembra, se recolectaron los sobrenadantes del cultivo de células B para el cribado con el propósito de identificar clones con reactividad específica a MSLN humana. Las placas con células se congelaron y almacenaron a -80 °C para el futuro aislamiento de ARN y la amplificación de los genes. Los sobrenadantes de cultivo de células B se cribaron primero para detectar la producción de IgG mediante el ensayo FRET de IgG de conejo. Los clones productores de IgG (5775) se seleccionaron y se cribaron mediante el uso de ELISA para determinar la unión a MSLN humana (1er cribado). Algunos de los clones reactivos anti-MSLN se volvieron a evaluar (2do cribado) para determinar su reactividad a MSLN, pero no con un antígeno de control (CD73 humano). Se seleccionaron cinco AcM y se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14. Clones con reactividad específica a MSLN humana
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Se descongelaron las placas que contenían los AcM seleccionados y se lisaron las células B para aislar los ARN mediante el uso del kit RNAqueous Kit (Ambion). Los ARN se usaron para configurar las reacciones de RT-PCR con el propósito de amplificar las regiones variables de los anticuerpos. Los ADN resultantes se secuenciaron y se diseñaron los cebadores para que fueran compatibles con el sistema de clonación InFusion HD® como lo describe el fabricante (Clontech, Mountain View, CA). Los fragmentos de PCR de la región variable se clonaron en un plásmido de expresión que contenía una región constante kappa o gamma humana. Estos plásmidos se transfectaron mediante el uso del sistema de expresión FreeStyle 293 (Thermo Fisher Scientific) para producir AcM como se describe en otra parte de la presente descripción.
Generación y caracterización de AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF
Los AcM quimerizados se generaron como se describe en el Ejemplo 2, en donde xi33O11 es uno de los cinco AcM anti-MSLN y los otros cuatro AcM se quimerizaron siguiendo el mismo método. Por lo tanto, estos AcM anti-MSLN contienen Cys80 desapareada, específicamente, el motivo C-X-X-A. En la presente descripción ellos se denominan xi324O5, xi 178F16, xi237N18, xi33O11, y xi383I18.
Después de su producción, los cinco AcM quimerizados seleccionados se conjugaron con auristatina F (AuF) de acuerdo con los siguientes métodos para generar AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF.
Purificación de anticuerpos con "desprotección": La desprotección de AcM de conejo/humano es una etapa necesaria para la conjugación a Cys80. Mediante el uso de un ÁKTA Explorer (GE Healthcare), se equilibró una columna de proteína A (GE Healthcare) con 10 CV de fosfato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,2. Después, se cargó la muestra, seguido del lavado del material no unido con 10 CV de tampón de equilibrio. La columna se lavó con 16 CV de fosfato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM, cisteína 5 mM, pH 7,2 a 0,5 mL/minuto durante 16 horas. Después, la columna se lavó con 60 CV de Tris 20 mM, pH 7,5 a 0,5 mL/minuto durante 60 horas. La muestra se eluyó mediante el uso de 5 CV de glicina 0,1 M pH 2,9. Las fracciones que contenían el AcM se agruparon y se dializaron en DPBS mediante el uso de un MWCO 20k Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific). La recuperación de proteínas se determinó mediante un ensayo de BCA.
Conjugación de auristatina F: Los AcM-MSLN quimerizados purificados y desprotegidos, que contenían el motivo C-X-X-A (estructura que se muestra más abajo), se incubaron con maleimida-PEG2-auristatina F (mal-PEG2-AuF), se diluyeron a partir de una solución madre 10 mM en DMSO (Concortis Biosystems, San Diego, CA) en una proporción molar de 5:1 (AuF:AcM) a una concentración final de anticuerpo de 5 mg/mL en PBS 1x. La conjugación se realizó durante 2 horas a 22 °C. El mal-PEG2-AuF sin reaccionar se eliminó mediante purificación por desalinización en un FPLC AKTA equipado con una columna de desalinización 26/10 (GE Healthcare) mediante el uso de PBS 1x como tampón de corrida. Se agruparon las fracciones que contenían anticuerpos y se determinó la concentración de proteína mediante un ensayo de BCA.
Maleimida-PEG2-auristatina F:
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Análisis por UPLC/ESI-MS: Las muestras se redujeron mediante la adición de DTT a una concentración final de 20 mM, seguido de incubación a 60 °C durante 3 minutos. Después, las muestras se analizaron mediante el uso de un espectrómetro de masas Waters Acquity UPLC y Q-Tof Premier. Se inyectaron muestras (0,5-2 pg cada una) en una microcolumna de desalinización MassPrep a 65 °C, que eluyeron de la columna con un equilibrio de 5 minutos en 95 % de fase móvil A, un gradiente de 10 min (5-90 % B), y un reequilibrio de 10 minutos en el 95 % de la fase móvil A, a 0,05 mL/minuto. La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1 % en agua. La fase móvil B era ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El espectrómetro de masas Q-Tof se ejecutó en modo V de iones positivos con detección en el intervalo de 500-4000 m/z. Los parámetros de la fuente fueron los siguientes: voltaje capilar, 2,25 kV (anticuerpo intacto)-2,50 kV (anticuerpo reducido); voltaje del cono de muestreo, 65,0 V (anticuerpo intacto) o 50,0 V (anticuerpo reducido); temperatura de la fuente, 100 °C; temperatura de desolvatación, 250 °C; flujo de gas de desolvatación, 550 L/hora. El pico de proteína se deconvolucionó mediante el uso de la función MassLynx MaxEnt 1. Un análisis representativo se muestra en la Figura 13. Típicamente, >90 % de los AcM conjugados tenían una relación de anticuerpo a agente funcional de 2, lo que significa que cada AcM anti-MSLN quimerizado portaba una molécula de AuF conjugada a cada una de la Cys801 y la Cys802.
Citotoxicidad in vitro
Las A431-MSLN son células derivadas de células A431 (ATCC® CRL-1555 ™) que expresan de manera estable MSLN humana. Las células A431-MSLN se subcultivaron y se sembraron en placas de 96 pocillos a 10 000 células/pocillo/100 pL en medio RPMI que contiene FBS 10 % y se incubaron a 37 °C, CO25% durante 16 horas. Los AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF se diluyeron en serie 1:4 en placas de dilución de pocillos profundos de 2 mL. Se añadieron compuestos diluidos (100 pl) a las placas de células, con concentraciones finales que variaban entre 0,28 y 75 pg/mL. Se usó Mal-PEG2-AuF a una concentración equimolar de los AcM conjugados. Por ejemplo, 10 pg/mL de AcM conjugado Cys80 de MSLN-AuF (DAR=2) equivalen a 0,14 pg/mL de mal-PEG2-AuF. Las placas se incubaron a 37 °C, CO25% durante 48 horas adicionales. El medio se eliminó, las placas se lavaron una vez con 200 pL de DPBS, se tiñeron con 50 pL de una solución de violeta cristal al 0,2 % a 22 °C durante 15 minutos, y después se lavaron extensivamente con agua corriente. Las placas se secaron al aire y el cristal violeta se disolvió con 200 pl de una solución de SDS al 1 %. La densidad óptica colorimétrica se determinó a 570 nm. Se usó Excel para extrapolar el número de células a partir de las densidades ópticas y se usó GraphPad Prism 6 para representar el porcentaje de citotoxicidad.
Cuando se trataron células A431 negativas para MSLN con los AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF, no se observó citotoxicidad significativa, mientras que mal-PEG2-AuF fue citotóxico solo a la concentración más alta evaluada (Figura 14A). Cuando se trataron células A431-MSLN positivas para MSLN con los AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF, se observó una citotoxicidad significativa. En base a las curvas de respuesta a la dosis (Figura 14B), los AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF podrían clasificarse en 2 grupos: citotoxicidad media - xi324O5-AuF, y xi178F16-AuF; y alta citotoxicidad - xi237N18-AuF, xi33O11-AuF, y xi383I18-AuF.
Evaluación in vivo - selección inicial de AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF
La eficacia in vivo de los AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF se evaluó contra tumores que expresan MSLN, con el objetivo de seleccionar unos pocos compuestos con alta eficacia y baja toxicidad.
Las células A431-MSLN se propagaron en cultivo celular, se suspendieron en medio de crecimiento sin suero, se mezclaron 1:1 con Matrigel™ y se implantaron subcutáneamente (sc) 5 millones de células/0,2 mL/ratón en ratones NCr nu/nu atímicos. El volumen tumoral se determinó mediante mediciones con calibrador (mm) y mediante el uso de la fórmula para una esfera elipsoide: Longitud x Ancho2/2 = Volumen (mm3). Cuando el volumen tumoral varió entre 100 y 250 mm3, los ratones se asignaron al azar en grupos de tratamiento. Los pesos corporales de los animales y el tamaño del tumor se registraron dos veces por semana. El diseño general de este estudio se resume en la Tabla 15. Los AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF se administraron por vía intravenosa (iv) Q7D comenzando el día de la aleatorización (día 1), dos dosis en total.
Tabla 15. Diseño del estudio
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La Figura 15 muestra los volúmenes tumorales promedio entre los diferentes grupos de tratamiento, hasta el día 18 después de la implantación, cuando 3 de 8 animales tuvieron que sacrificarse en el grupo tratado con solución salina debido a la alta carga tumoral y/o ulceración del tumor. El día 4 después de la implantación corresponde al día en que los ratones se asignaron al azar a diferentes grupos de tratamiento, con un volumen tumoral medio que oscilaba entre 157 y 160 mm3 en todos los grupos. Ese día, se administró la primera dosis de AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF seguida de una segunda dosis el día 11.
Todos los AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF mostraron una respuesta antitumoral, como lo demuestra el hecho de que el volumen tumoral el día 18 fue del 20 % o menos en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 16). Por el contrario, mal-PEG2-AuF no mostró respuesta antitumoral.
Tabla 16. Porcentaje de volumen tumoral versus el grupo de solución salina
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La toxicidad se evaluó, además, mediante la observación de cualquier pérdida de peso corporal el día 18 (basado en el peso promedio de los animales en estudio en cada grupo) en comparación con el día 4, así como también mediante la observación de cualquier animal muerto o moribundo (Tabla 17). En el grupo tratado con xi324O5-AuF, se observó una pérdida de peso corporal del 11 % en los animales supervivientes, así como también dos animales muertos/moribundos. En los grupos tratados con xi178F16-AuF, xi237N18-AuF, y xi383I18-AuF, no se observó una pérdida de peso corporal significativa, pero se observaron uno o dos animales muertos/moribundos. Todos los demás grupos de tratamiento no mostraron pérdida de peso corporal ni animales muertos/moribundos.
Tabla 17. Evaluación de la toxicidad bruta
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En base a las respuestas antitumorales; así como también a la toxicidad mínima, se eligieron los AcM xi33O11 -AuF y xi237N18-AuF para una evaluación adicional.
Evaluación de la especificidad diana de la actividad antitumoral mediada por los AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF
El método usado para este estudio fue el mismo que el descrito anteriormente (Evaluación in vivo - Selección inicial de AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF). Además de las células A431-MSLN, que se implantaron en el flanco izquierdo de cada ratón el día 4, se implantaron células A431 negativas para MSLN en el mismo ratón, en el flanco opuesto (derecho) el día 1. Las primeras células desarrollan tumores más rápido que las últimas y, por lo tanto, se implantaron 3 días después de modo que la primera dosis del fármaco de prueba se administró cuando el tumor en ambos flancos era similar en volumen. El diseño general de este estudio se resume en la Tabla 18.
Tabla 18. Diseño del estudio
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Tumores positivos para MSLN: La Figura 16A muestra los volúmenes tumorales promedio entre los diferentes grupos de tratamiento, hasta el día 18 después de la implantación, cuando 4 de 8 animales tuvieron que sacrificarse en el grupo tratado con solución salina debido a la alta carga tumoral y/o ulceración del tumor. El día 4 después de la implantación corresponde al día en que los ratones se asignaron al azar a diferentes grupos de tratamiento, con un volumen tumoral promedio de A431-MSLN que oscilaba de 169-178 mm3 en todos los grupos. Ese día, se administró la primera dosis de AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF seguida de una segunda dosis el día 11.
El xi33O11-AuF medió las respuestas antitumorales que redujeron el volumen tumoral en el día 18 al 12 % en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 19). El xi237N18-AuF medió las respuestas antitumorales que redujeron el volumen tumoral al 24 % en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 19). Una prueba t de dos colas no apareada indicó un valor de p de 0,00039 y 0,00197, respectivamente, lo que sugiere que estas respuestas antitumorales frente al grupo tratado con solución salina fueron estadísticamente significativas. Por el contrario, el mal-PEG2-AuF o el xi1-55-2-AuF, que se dirigen a la endosialina/TEM1, no mostraron respuestas antitumorales significativas.
Tabla 19. Porcentaje de volumen tumoral A431-MSLN versus el grupo de solución salina
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Tumores negativos para MSLN: La Figura 16B muestra los volúmenes tumorales promedio entre los diferentes grupos de tratamiento, hasta el día 21 después de la implantación; este día corresponde al día 18 después de la implantación de A431-MSLN, como se describió anteriormente, y el día 7 después de la implantación corresponde al día en que los ratones se aleatorizados en diferentes grupos de tratamiento, con un volumen tumoral promedio de A431 que oscilaba de 174-184 mm3 en todos grupos. El xi33O11-AuF medió las respuestas antitumorales que redujeron el volumen tumoral el día 21 al 78 % en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 20). El AcM conjugado Cys80 xi237N18-AuF medió las respuestas anti-tumorales que redujeron el volumen tumoral el día 21 al 64 % en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 20). Una prueba t de dos colas no apareada indicó un valor de p de 0,317 y 0,091, respectivamente, lo que sugiere que estas respuestas antitumorales versus el grupo tratado con solución salina no fueron estadísticamente significativas. Estas respuestas fueron similares a las observadas con mal-PEG2-AuF o xi1-55-2-AuF.
Tabla 20. Porcentaje de volumen tumoral A431 (MSLN negativo) versus el grupo de solución salina
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La toxicidad se evaluó, además, mediante la observación de cualquier pérdida de peso corporal el día 21 después de la implantación de las células A431 en comparación con el día 7, así como también mediante la observación de cualquier animal muerto o moribundo (Tabla 21). No se observó una pérdida de peso corporal >10 % en ninguno de los grupos de tratamiento. Se observaron dos muertes en el grupo tratado con xi33O11-AuF y con xi237N18-AuF.
Tabla 21. Evaluación de toxicidad bruta
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Conclusión
Se generaron y examinaron los AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF en base a la citotoxicidad in vitro y a la actividad antitumoral in vivo. El análisis de citotoxicidad in vitro indicó que estos compuestos se dirigían y destruían células tumorales positivas para MSLN, pero no las negativas para MSLN.
Todos los AcM conjugados Cys80 MSLN-AuF evaluados tenían actividad antitumoral, algunos de los cuales parecían ser potencialmente más tóxicos que otros. La naturaleza de esta toxicidad no se caracterizó posteriormente. Se observó que ambos AcM conjugados Cys80 de MSLN-AuF evaluados in vivo podían dirigirse a tumores positivos para MSLN e inhibir su crecimiento, mientras que no se observó ningún efecto significativo contra tumores negativos para MSLN en el flanco opuesto. Si bien el perfil de toxicidad de xi237N18 fue similar en ambos estudios, el tratamiento con xi33O11-AuF no mostró toxicidad en el primer estudio, pero se asoció con dos muertes en el segundo estudio. La naturaleza de esta toxicidad no se caracterizó posteriormente; sin embargo, como los ratones tratados con xi33O11-AuF todavía tenían un gran tumor negativo para MSLN en el otro flanco y, por lo tanto, estaban más enfermos que los animales del primer estudio, estos ratones pueden haber sido más sensibles al efecto de la lisis masiva de células tumorales contra el tumor MSLN positivo.
Ejemplo 4 - Generación de conjugados anticuerpo-colorante fluorescente
El AcM xi155D5 que contiene el motivo C-X-X-A se conjugó con el colorante 800CW (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE) para generar un AcM conjugado Cys80 xi155D5-800CW que tiene dos moléculas de colorante conjugadas con Cys801 y Cys802.
La conjugación de 800CW en Cys80 se realizó mediante el uso de maleimida-(CH2)2-800CW (LiCor), por lo que (CH2)2 es un enlazador alquilo. Brevemente, maleimida-(CH2)2-800CW se disolvió en 100 % de DMSO a una concentración final de 10 mM. Maleimida-(CH2)2-800CW se añadió a xi155D5 (5 mg/mL en PBS 1x) a una relación molar 5:1 de colorante:AcM y se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente. El colorante no incorporado se eliminó mediante desalinización en las columnas PD-10 (Millipore). El xi155D5-800CW se limpió adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño en Superdex 75. El material de volumen evacuado se agrupó, se dividió en alícuotas y se congeló a -80 °C hasta su uso. La SDS-PAGE y los análisis de formación de imágenes de xi155D5-800CW reducido indicaron que el colorante se conjugó solo en la cadena ligera pero no en la cadena pesada (Figura 17).
Se inyectaron ratones hembra desnudos NCR con células tumorales humanas colo205 o HT-29 por vía subcutánea en las extremidades traseras derechas. El crecimiento tumoral se controló mediante medición con calibrador. Cuando el volumen tumoral era de 200-300 mm3, se inyectó xi155D5-800CW a través de las venas de la cola a 0,1 mg/200 pl/ratón. Para controlar la distribución de xi155D5-800CW mediante imágenes vivas fluorescentes, los animales se colocaron en una cámara de anestesia durante aproximadamente 3-4 minutos mediante el uso de isofluorano/Ü2 hasta que los animales quedaron inconscientes. Se tomaron imágenes de los animales mediante el uso del ajuste de fluorescencia de 745 de excitación y 840 de emisión en un instrumento IVIS® Lumina II-Kinetic (PerkinElmer, Waltham, MA). Las imágenes de los lados dorsal, derecho, ventral, e izquierdo se tomaron en diferentes puntos de tiempo como se indica en la Figura 18. Después de cada imagen sucesiva, se permitió que el animal recuperara la conciencia en una cámara de recuperación que recibió una descarga de oxígeno al 100 % seguido de aire normal.
Mediante el uso de los modelos colo205 o HT-29, se observó que xi155D5-800CW se dirigía eficazmente a tumores humanos, como se demuestra por la localización específica de tumor de su señal fluorescente (Figura 18).
Estos resultados demostraron que un AcM que contiene el motivo C-X-X-(no)F, K, o C puede conjugarse con un colorante y que el AcM conjugado puede usarse para identificar y controlar el estado tumoral.
Ejemplo 5 - Generación de moléculas de unión a antígeno bivalentes/biespecíficas
Cuando un AcM que contiene el motivo C-X-X-(no)F, K, o C se digiere con papaína, o se expresa de manera recombinante como un fragmento Fab, contendrá una única Cys80 desapareada ya que el Fab contiene sólo una región Vk. Mediante el uso de la química de conjugación ortogonal, los Fab que contienen Cys80 pueden usarse para generar moléculas de unión a antígenos bivalentes/biespecíficos conjugadas químicamente, tales como Fab-Fab bivalentes/biespecíficos, que pueden usarse para dirigirse a dos dianas independientes relevantes para la enfermedad, que incluye dos ligandos (citocinas, quimiocinas), dos receptores de membrana o combinaciones de ligando/receptor, por nombrar algunos.
Como ejemplo, se generaron Fab a partir de xi155D5 y xi1-55-2 mediante el uso de la digestión limitada con papaína, seguida de cromatografía de proteína A para eliminar los fragmentos Fc y AcM no digerido. Mediante el uso de espectrometría de masas se demostró que los Fab estaban completamente desprotegidos (datos no mostrados). Posteriormente, los Fab xi155D5 y xi1-55-2 se conjugaron por separado mediante el uso de maleimida-PEG4-dibencilciclooctina (DBCO) y maleimida-PEG4-azida, respectivamente. El compuesto no conjugado se eliminó mediante cromatografía de desalinización y la ocupación completa de los sitios Cys80 se confirmó mediante espectrometría de masas (datos no mostrados). Después, los fragmentos xi155D5-maleimida-PEG4-DBCO y xi1-55-2-maleimida-PEG4-azida se conjugaron entre sí mediante la química de click libre de cobre promovida por la tensión mediante incubación en PBS a 22 °C durante 16 horas. Los productos conjugados se fraccionaron mediante el uso de cromatografía de filtración en gel (Figura 19A) y las diferentes especies se identificaron mediante SDS-PAGE en base a su tamaño molecular esperado (Figura 19B). Se combinaron las fracciones que contenían la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífico xi155D5/xi1-55-2 y se confirmó la identidad de la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífico xi155D5/xi1-55-2 mediante espectrometría de masas en base a su masa esperada (95939 Da, Figura 19C).
La biespecificidad de la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífico xi155D5/xi1-55-2 se confirmó mediante análisis de inferometría de biocapa (BLI) mediante el uso de un ensayo sándwich inverso. Este análisis demostró la unión a CA9 humano inmovilizado (unido por la porción Fab xi155D5) seguido de la unión de TEM-1 soluble (unido por la porción Fab xi1-55-2) (Figura 20). Como se esperaba, el AcM xi155D5, el Fab xi155D5, y la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1-55-2 se unieron a CA9 inmovilizado. Sólo la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1-55-2 inmovilizada con CA9 fue capaz de unirse también a endosialina humana/TEM-1, como se demuestra por el cambio de respuesta adicional observado (Figura 20, flecha doble). El análisis de resonancia de plasmón de superficie demostró que la afinidad de xi155D5/xi1-55-2 por CA9 o TEM-1 era la misma o ligeramente reducida, respectivamente (Tabla 22).
Estos resultados demuestran que: 1) un AcM que contiene C-X-X-(no)F puede conjugarse con polipéptidos, tales como un fragmento de anticuerpo o un Fab; y 2) cuando dos AcM o Fab, de diferente especificidad, que contienen el C-X-X-(no)F se conjugan ortogonalmente, puede generarse un compuesto bivalente/biespecífico.
Tabla 22. Afinidad de la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1-55-2 a CA9 y TEM-1
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(continuación)
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Ejemplo 6 - Generación de conjugados anticuerpo-péptido
Los AcM xi33O11 y xi1-55-2 que contenían el motivo C-X-X-A se conjugaron con el péptido Ap(1-16) modificado con azida (SEQ ID NO:40) (Tabla 23).
Tabla 23. Secuencia de péptidos Ap(1-16)
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La conjugación del péptido Ap(1-16) en Cys80 se realizó mediante el uso de un procedimiento de conjugación de dos etapas, mediante el cual la Cys80 se conjugó primero con maleimida-dibencilciclooctina (mal-DBCO). Después, el péptido Ap(1-16) modificado con azida se conjugó con los AcM modificados con DBCO mediante el uso de química de click libre de cobre promovida por tensión. Brevemente, se incubó el AcM (20 mg) con mal-DBCO (Click Chemistry Tools, cat A108) a una relación molar mal-DBCO:AcM de 5:1 durante 16 horas a 22 °C en DPBS 1x. El mal-DBCO no incorporado se eliminó del AcM conjugado por cromatografía de desalinización mediante el uso de una columna HiPrep 26/10 con DPBS 1x como tampón de corrida. Se confirmó una eficacia de conjugación del 100 % (sin evidencia de la cadena ligera no conjugada) para ambos AcM mediante LC-MS (Figura 21 y Tabla 24). Cada AcM (50 pL/cada uno, 95 pg y 70 pg de xi1-55-2 y xi33O11, respectivamente) se incubó con el péptido Ap(1-16) a una relación molar de péptido:AcM de 20:1 en DPBS 1x durante 16 horas a 22 °C. Las conjugaciones se analizaron mediante SDS-PAGE. Las muestras se procesaron en condiciones reductoras, con DTT 20 mM como reductor y calentamiento a 75 °C durante 10 minutos antes de la separación.
El análisis de SDS-PAGE indicó un retraso de la migración de la cadena ligera conjugada con péptido acompañada de una cadena ligera no conjugada no detectable, lo que indica una conjugación eficaz (Figura 21). No se observó ningún cambio en la movilidad de la cadena pesada. A continuación, se desalaron las conjugaciones mediante el uso de columnas de desalinización para centrífuga Zeba 40k MWCO de 0,5 mL (Thermo-Fisher) para eliminar el péptido no conjugado y se analizaron mediante LC-MS. El análisis de espectrometría de masas (Figura 22A-F) indicó que el péptido se conjugó con las cadenas ligeras de xi1-55-2 y xi33O11 con eficiencias del 85 %-100 % (Tabla 24).
Estos resultados demostraron que un AcM que contiene el motivo C-X-X-(no)F, K, o C puede conjugarse eficazmente con péptidos.
Tabla 24. Resumen de conjugación
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Tabla 25. Anticuerpos monoclonales y LC y HC correspondientes
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Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un método para generar una inmunoglobulina conjugada, el método comprende:
    desproteger una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina derivada de conejo, la Cys80 basada en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y
    conjugar un compuesto reactivo con tiol a la Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
  2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la desprotección comprende incubar la inmunoglobulina con un tampón reductor seguido de la incubación de la inmunoglobulina con un tampón oxidante.
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el método comprende, además, inmovilizar la inmunoglobulina en una matriz antes de la incubación con el tampón reductor y eluir la inmunoglobulina de la matriz después de la incubación con el tampón oxidante.
  4. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde
    (a) el compuesto reactivo con tiol está unido a un agente funcional, en donde el agente funcional comprende un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido, o fármaco y/o
    (b) el compuesto reactivo con tiol se une a un segundo compuesto reactivo con tiol, el segundo compuesto reactivo con tiol está unido a una segunda inmunoglobulina que tiene una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys802"), la Cys802 basado en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, en donde el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol unido a la Cys802, y/o
    (c) la Cys80 no está apareada, y/o
    (d) el método comprende, además, sustituir un aminoácido en la posición 83 con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys, en la posición 83 en base al sistema de numeración de Kabat o Chothia.
  5. 5. Un método para generar una molécula de unión a antígeno, el método comprende incubar una primera inmunoglobulina conjugada con una segunda inmunoglobulina conjugada para generar la molécula de unión a antígeno, en donde:
    la primera inmunoglobulina conjugada comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, la primera región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys801") en donde la Cys801 está conjugada con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol, y en donde la inmunoglobulina se deriva de conejo y la Cys801 se basa en el sistema de numeración Kabat o Chothia; y
    la segunda inmunoglobulina conjugada comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys802") en donde la Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol, y en donde la inmunoglobulina se deriva de conejo y la Cys802 se basa en el sistema de numeración Kabat o Chothia.
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde
    (a) la Cys801, la Cys802, o ambas no están apareadas, y/o
    (b) el método comprende, además, antes de la etapa de incubación,
    desproteger la Cys801, Cys802, o ambas; y
    conjugar un primer compuesto reactivo con tiol a la Cys801, un segundo compuesto reactivo con tiol a la Cys802, o ambas, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
  7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde
    (a) el primer compuesto reactivo con tiol comprende, además, un primer agente funcional, el segundo compuesto reactivo con tiol comprende, además, un segundo agente funcional, o ambos, y/o
    (b) la primera inmunoglobulina es un primer Fab, la segunda inmunoglobulina es un segundo Fab, o ambos, y/o
    (c) el método comprende, además, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys, o ambos.
  8. 8. La molécula de unión a antígeno que se produce de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-7.
  9. 9. Una inmunoglobulina derivada de conejo que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys80"), en donde la Cys80 no está apareada, y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83, y en donde la Cys80 y la posición 83 se basan en el sistema de numeración de Kabat o Chothia.
  10. 10. La inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 9, en donde la Cys80 está desprotegida.
  11. 11. La inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 9 o 10, en donde:
    (A) la inmunoglobulina se une inmunoespecíficamente al CA9 humano y comprende:
    a. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-141 de xil55D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-130 de xil55D5LC (SEQ ID NO:78);
    b. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-144 de zul55D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-130 de zul55D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zul55D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zul55D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zul55D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zul55D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu8l (SEQ ID NO:106);
    c. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110);
    d. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-140 de zu1E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
    e. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); o
    f. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136), o
    (B) la inmunoglobulina se une inmunoespecíficamente al CA9 humano y comprende:
    a. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi155D5HC que se establece como las SEQ ID NO:146, 148, y 150, respectivamente, y una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena ligera de xil55D5LC que se establece como las SEQ ID NO:224, 226 y 228, respectivamente;
    b. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zul55D5HC que se establece como las SEQ ID NO:152, 154 y 156, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu155D5LC-3 que se establece como las SEQ ID NO:242, 244 y 246, respectivamente, zu155D5LC-4 que se establece como las SEQ ID NO:248, 250 y 252, respectivamente, zu155D5LC-5 que se establece como las SEQ ID NO:254, 256 y 258, respectivamente, zu155D5LC-6 que se establece como las SEQ ID NO:260, 262 y 264, respectivamente, zu155D5LC-7 que se establece como las SEQ ID NO:266, 268 y 270, respectivamente, zu155D5LC-huVK2-40 que se establece como las SEQ ID NO:278, 280 y 282, respectivamente, zu155D5LC-huVK4-1 que se establece como las SEQ ID NO:290, 292 y 294, respectivamente, zu155D5LC-huVK6-21 que se establece como las SEQ ID NO:296, 298 y 300, respectivamente, zu155D5LC-huVK6D-41 que se establece como las SEQ ID NO:302, 304 y 306, respectivamente; o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 que se establece como las SEQ ID NO:308, 310 y 312, respectivamente;
    c. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:164, 166 y 168, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi1E4LC que se establece como las Se Q ID NO:320, 322 y 324, respectivamente;
    d. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de zu1E4HC que se establece como las SEQ ID NO:170, 172 y 174, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu1E4LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:332, 334 y 336, respectivamente;
    e. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:212, 214 y 216, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xil66B3LC que se establece como las SEQ ID NO:386, 388 y 390, respectivamente; o
    f. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu166B3HC que se establece como las SEQ ID NO:218, 220 y 222, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu166B3LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:398, 400 y 402, respectivamente, o
    (C) la inmunoglobulina se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108), o (D) la inmunoglobulina se une específicamente a TEM1 humano y comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi1-55-2HC que se establece como las SEQ ID NO:158, 160 y 162, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi1-55-2LC que se establece como las SEQ ID NO:314, 316 y 318, respectivamente, o
    (E) la inmunoglobulina se une inmunoespecíficamente a la mesotelina humana y comprende:
    a. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-142 de xi33011HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-131 de xi33011LC (SEQ ID NO:116);
    b. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-145 de zu33011HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33011LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
    c. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
    d. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
    e. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
    f. una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130), o
    (F) la inmunoglobulina se une inmunoespecíficamente a la mesotelina humana y comprende:
    a. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi33011HC que se establece como las SEQ ID NO:176, 178 y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi33011LC que se establece como las SEQ ID NO:338, 340 y 342, respectivamente;
    b. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu33011HC que se establece como las SEQ ID NO:182, 184 y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11LC-CXXA que se establece como las SEQ ID NO:350, 352 y 354, respectivamente, o zu33011LC-CXXI que se establece como las SEQ ID NO:356, 358 y 360, respectivamente;
    c. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC que se establece como las SEQ ID NO:188, 190 y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC que se establece como las SEQ ID NO:362, 364 y 366, respectivamente;
    d. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC que se establece como las SEQ ID NO:194, 196 y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC que se establece como las SEQ ID NO:368, 370 y 372, respectivamente;
    e. una CDR1, CDR2, y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC que se establece como las SEQ ID NO:200, 202 y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC que se establece como las SEQ ID NO:374, 376 y 378, respectivamente; o
    f. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC que se establece como las SEQ ID NO:206, 208 y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC que se establece como las SEQ ID NO:380, 382 y 384, respectivamente.
  12. 12. Una inmunoglobulina conjugada que comprende:
    la inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde la cisteína en la posición 80 está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
  13. 13. La inmunoglobulina conjugada de conformidad con la reivindicación 12, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende, además, un agente funcional, en donde el agente funcional comprende un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco.
  14. 14. Una inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina para usar en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde la inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina comprende:
    la inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 11(E) u 11(F), y un compuesto reactivo con tiol que comprende un grupo reactivo con tiol, un enlazador, y un agente funcional, en donde el agente funcional comprende un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco.
  15. 15. La inmunoglobulina conjugada contra la mesotelina para usar de conformidad con la reivindicación 14, en donde el agente funcional es auristatina F.
  16. 16. Una molécula de unión a antígeno que comprende:
    una primera inmunoglobulina conjugada que comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, la primera región variable de la cadena ligera tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), en donde la Cys801 está conjugada con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol, y en donde la inmunoglobulina se deriva de conejo y la Cys801 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, y una segunda inmunoglobulina conjugada que comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, la segunda región variable de la cadena ligera tiene una cisteína en la posición 80 ("Cys802") en donde la Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol, y en donde la inmunoglobulina se deriva de conejo y la Cys802 se basa en el sistema de numeración Kabat o Chothia.
  17. 17. La molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 16, en donde
    (a) la Cys801, la Cys802, o ambas no están apareadas, y/o
    (b) el aminoácido en la posición 83 de la primera inmunoglobulina, el aminoácido en la posición 83 de la segunda inmunoglobulina, o ambos, es un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys, en donde la posición 83 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, y/o
    (c) el primer compuesto reactivo con tiol comprende, además, un primer agente funcional, el segundo compuesto reactivo con tiol comprende, además, un segundo agente funcional, o ambos, en donde el primer y segundo agente funcional comprenden un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, nucleico ácido, radionúclido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco, y/o
    (d) la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambas es un Fab.
  18. 18. Una molécula de ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-11.
  19. 19. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18.
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