KR20180021807A - cys80 접합된 면역글로불린 - Google Patents

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에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
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Abstract

접합된 면역글로불린을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공되고, 상기 방법은 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에서 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys80")을 탈캡핑하는 단계(여기서, 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함함); 및 티올 반응성 화합물을 Cys80에 접합시키는 단계(여기서, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함함)를 포함한다. 항원-결합 분자 및 이를 생성하는 방법, 면역글로불린, 및 면역글로불린을 암호화하는 핵산 분자 및 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포, 접합된 면역글로불린, 및 접합된 면역글로불린에서 사용하기 위한 경쇄 가변 영역이 또한 제공된다.

Description

cys80 접합된 면역글로불린
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2015년 6월 19일에 출원된 미국 가출원 제62/182,020호(이의 개시내용은 그 전문치 참고로 본 명세서에 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다.
서열 목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자로 제출되고 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2016년 6월 16일에 생성된 ASCII 카피는 명칭이 104018.000953_SL.txt이고, 크기가 379,441 바이트이다.
기술 분야
Cys80 접합된 면역글로불린 및 이를 생성하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
단일클론 항체의 유용성은 기본적 조사로부터 치료학적 및 진단학적 분야로 연장된다. 작용제에 항체를 접합시키는 능력은 훨씬 더 이의 기능성을 연장시킨다. 접합된 항체의 제조는 보통 단일클론 항체(mAb)의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)에서의 반응성 라이신 또는 시스테인 잔기에 대한 링커, 약물 또는 다른 작용제의 접합을 수반한다. 라이신 접합은 통상적으로 숙신이미드(NHS)계 또는 아이소티오사이아네이트계 화학물질에 의해 매개된다. 항체의 표면 상의 노출된 라이신의 수를 고려하면, 아민 기반 접합 접근법은 변형된 다수의 라이신을 생성시키지만, 모든 라이신 잔기가 동일한 정도로 변형되지는 않는다. 따라서, 최종 생성물은 약물-대-항체(drug-to-antibody: DAR) 비율의 분포에 의해 mAb의 이종 혼합물이다.
항체 내의 대부분의 시스테인은 사슬간 또는 사슬내 다이설파이드 결합에 관여한다. 시스테인에 대한 접합은 따라서 항체의 적어도 부분 환원을 요한다. 라이신 기반 접합과 같이, 시스테인 기반 접합은 약물 로드(drug load) 및 접합 부위가 다른 접합된 항체의 이종 혼합물을 생성시킨다. 접합된 항체의 각각의 종은 구별되는 특성을 가질 수 있고, 이것은 결국 생체내 약동학적 특성의 넓은 변동을 발생시킬 수 있다. 게다가, 이러한 이종성은 접합된 항체의 제조에 도전을 제시할 수 있다.
접합된 면역글로불린을 생성하는 방법이 본 명세서에 개시되고, 상기 방법은 토끼로부터 유래된 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에서 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys80")을 탈캡핑하는 단계(여기서, 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함함); 및 티올 반응성 화합물을 Cys80에 접합시키는 단계(여기서, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함함)를 포함한다.
항원-결합 분자를 생성시키는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 제1 접합된 면역글로불린을 제2 접합된 면역글로불린과 항온처리하여 항원-결합 분자를 생성시키는 단계를 포함하고, 여기서 제1 접합된 면역글로불린은 제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제1 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys801")을 가지고, Cys801은 제1 티올 반응성 기를 포함하는 제1 티올 반응성 화합물에 접합되고; 제2 접합된 면역글로불린은 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys802")을 가지고, Cys802는 제2 티올 반응성 기를 포함하는 제2 티올 반응성 화합물에 접합된다.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린(경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys80") 및 83번 위치에 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가짐)이 본 명세서에 또한 제공되고, 면역글로불린을 암호화하는 핵산 분자 및 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포도 그렇다.
개시된 면역글로불린을 포함하는 접합된 면역글로불린이 추가로 제공되고, 여기서 80번 위치에서의 시스테인은 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함한다.
약제학적 유효량의 접합된 메소텔린 면역글로불린을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되고, 접합된 메소텔린 면역글로불린은 하기를 포함한다: 임의의 개시된 메소텔린 면역글로불린, 및 티올 반응성 기, 링커 및 작용제를 포함하는 티올 반응성 화합물.
제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 접합된 면역글로불린(여기서, 제1 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys801")을 가지고, Cys801은 제1 티올 반응성 기를 포함하는 제1 티올 반응성 화합물에 접합됨), 및 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 접합된 면역글로불린(여기서, 제2 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys802")을 가지고, Cys802는 제2 티올 반응성 기를 포함하는 제2 티올 반응성 화합물에 접합됨)을 포함하는 항원-결합 분자가 제공된다.
접합된 면역글로불린에서 사용하기 위한 경쇄 가변 영역(여기서, 경쇄 가변 영역은 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 아미노산 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기를 가지고, Cys80은 짝을 이루지 못함(unpaired))이 본 명세서에 또한 개시된다.
요약, 및 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 추가로 이해된다. 개시된 방법, 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 및 경쇄 가변 영역을 예시할 목적을 위해, 도면에 예시적인 실시형태가 도시되어 있지만, 상기 방법, 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 및 경쇄 가변 영역은 개시된 구체적인 실시형태로 제한되지 않는다. 도면에서,
도 1은 토끼 및 인간 경쇄 서열의 정렬을 나타낸다. (A) 토끼(IGKV1S2, X02336) 및 인간(IGKV1-5, Z00001)으로부터의 생식선 Vκ 서열의 정렬. 화살표는 토끼 서열에서의 (카밧(Kabat) 또는 쵸티아(Chothia) 넘버링에 따른) Cys80을 나타낸다. (B) 토끼(IGKC1, K01360) 및 인간(IGKC, J00241)으로부터의 생식선 Cκ 서열의 정렬. 화살표는 토끼 서열에서의 Cys171(EU 넘버링)을 나타낸다.
도 2는 (A) Cys80-Cys171 다이설파이드 결합을 보여주는 토끼 mAb, (B) 인간 mAb 및 (C) 짝을 이루지 못한 Cys80을 보여주는 토끼-인간 키메라 mAb의 구조 모델을 나타낸다.
도 3은 토끼 생식선 Vκ 패밀리의 정렬을 예시한다. 80번 위치에서의 잔기는 화살표에 의해 표시된다.
도 4는 (A) 가혹한 조건(20mM DTT, 60℃, 5분)을 이용하여 환원될 때 및 (B) 온화한 조건(100μM DTT, 22℃, 30분)을 이용하여 환원될 때 xi155D5 경쇄의 예시적인 질량 분광 분석을 예시한다.
도 5는 xi155D5의 안정성의 예시적인 SE-HPLC 분석을 예시한다. (A) -80℃에서 저장된 xi155D5의 안정성. (B) 1주 동안 37℃에서 저장된 xi155D5의 안정성. 분해 생성물 또는 응집체의 형성의 오직 매우 약간의 증가가 관찰된다. Y 축, mAU; x 축, 보유 시간(분).
도 6은 Cys80을 캡핑하는 시스테인이 온화한 환원 조건(16시간 동안 5mM 시스테인을 함유하는 완충제, 이어서 60시간 동안 시스테인 유리 Tris 함유 완충제에 의한 세척; 모든 항온처리는 4℃에서 수행됨)에 의해 제거될 수 있다는 것을 보여주는 예시적인 탈캡핑 실험을 나타낸다. 탈캡핑 전(A) 및 후(B)의 xi155D5의 질량은 각각 145,464 및 145,221Da이었다. 차이(243Da)는 대략 2개의 유리 시스테인에 상응한다.
도 7은 비캡핑된 Cys80이 말레이미드-PEG2-바이오틴에 접합될 수 있다는 것을 보여주는 예시적인 접합 실험을 나타낸다. (A) 환원된 xi155D5의 경쇄는 23,384Da(23,399Da의 예측된 질량)의 질량을 가지고, (B) 말레이미드-PEG2-바이오틴과의 항온처리 후, 생성물의 94%는 526Da 만큼의 질량 증가(23,910Da)를 보여준다. 별표는 비경쇄 피크를 나타낸다.
도 8은 가장 상동성인 인간 생식선 가변 도메인과 정렬된 토끼 155D5 Vκ 및 VH 서열을 나타낸다. 카밧 넘버링에 기초한 프레임워크 영역(framework region: FWR) 및 상보성 결정 영역(complementary determining region: CDR)은 서열 위에 표시된다. 쵸티아 넘버링에 기초한 CDR은 밑줄 쳐진다. 카밧 CDR2의 C 말단 절반은 쵸티아 넘버링에 의해 CDR로 생각되지 않고, 이탤릭체이다.
도 9는 zu155D5-1의 예시적인 표준 단백질 A 정제를 예시한다. zu155D5-1은, 2개의 캡핑 시스테인에 대략 상응하는, 탈캡핑 후 233Da 만큼의 질량의 변화에 의해 입증된 바대로(B), 캡핑된 것으로 발견되었다(A).
도 10은 키메라화된 xi155D5의 예시적인 구조 모델을 예시한다. Cys80 근접성을 결정하기 위한 모델링은 도 2에서처럼 수행되었다. xi155D5와 zu155D5-1 사이에 다른 잔기는 강조되고, Cys80에 대한 거리가 각각에 대해 측정된다. (A) 잔기 Val11, Ala14, Gly17, Thr18; (B) Lys63; (C) Thr76, Gly77, Val78, Ala83; 및 (D) Glu103 및 Leu104는, Lys63(18Å)을 제외하고, Cys80의 11Å 내이다. 이 잔기는 Cys80의 존재 하에 토끼 아미노산으로 다시 변경된다.
도 11은 155D5, 1E4, 166B3 및 33O11 경쇄 서열의 예시적인 인간화된 mAb를 예시한다.
도 12는 (A-D) 면역화된 동물로부터의 혈청의 유세포계수 스크리닝 및 (E) 면역화된 동물로부터의 혈청의 ELISA 스크리닝을 나타낸다. (A-D) 세포를 표시된 희석률로 면역화 후 출혈한 혈청과 항온처리하였다(A: 채혈 후, 1:1000으로 희석된 토끼 1 혈청; B: 채혈 후, 1:5000으로 희석된 토끼 1 혈청; C: 채혈 후, 1:1000으로 희석된 토끼 2 혈청; 및 D: 채혈 후, 1:5000으로 희석된 토끼 2 혈청). 인간 MSLN을 일시적으로 발현하는 세포(+MSLN) 및 MSLN 음성 세포(-MSLN)로부터의 신호가 도시되어 있다. (E) ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 1㎍/㎖의 인간 MSLN에 의해 코팅하고, 실온에서 2시간 동안 0.01% Tween(PBST)과 PBS 중의 1% BSA를 사용하여 차단하였다. 차단 완충제를 제거한 후, 면역화 전 및 후의 혈액의 연속 희석된 샘플을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리하고, 이후 PBST에 의해 3회 세척하였다. HRP 접합된 염소 항-토끼 항체를 차단 완충제 중에 첨가하고, 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 3회 세척하고, TMB 기질을 첨가하였다. 반응을 중단하고, 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
도 13은 Cys80에 대한 말레이미도-PEG2-아우리스타틴 F(AuF)의 접합 전 및 후의 디콘볼루션된 질량 분광 분석의 예시적인 단백질 피크를 나타낸다.
도 14는 (A) MSLN 음성 A431 세포에 대한 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb 세포독성 및 (B) MSLN 양성 A431-MSLN 세포에 대한 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb 세포독성을 예시한다.
도 15는 상이한 치료군 사이에 평균 종양 용적을 나타낸다.
도 16은 (A) 상이한 치료군 사이에 평균 A431-MSLN(왼쪽 옆구리) 종양 용적 및 (B) A431에 대한 상이한 치료군 사이에 평균 종양 용적(오른쪽 옆구리)을 나타낸다.
도 17은 예시적인 xi155D5-800CW 접합된 항체의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. (A) mwm, 분자량 마커; 레인 1, xi155D5, 비접합, 비환원; 레인 2, xi155D5, xi155D5-800CW, 비환원; 레인 3, 블랭크; 레인 4, 비접합된 xi155D5, 환원; 레인 5, xi155D5, xi155D5-800CW, 환원. 모든 레인은 쿠마쉬 염색된 5㎍의 단백질을 함유한다. (B) IVIS 시스템에서 영상화된, A에서와 동일한 겔. 결과는 IRDye 800CW가 xi155D5의 경쇄에 오직 접합한다는 것을 나타낸다. xi155D5-800CW의 ELISA 분석은 CA9에 대한 완전 결합이 보유된다는 것을 나타낸다(데이터 비도시).
도 18은 예시적인 DyeIR 800CW 접합된 항체(xi155D5-800CW)의 종양 특이적 국재화를 예시한다. 인간 colo205(A-D) 및 HT-29(E-H) 세포를 누드 마우스에 그래프팅하였고, 이것에 이후 xi155D5-800CW를 주사하였다. 형광 신호(오렌지색-적색)를 0시간(A 및 E), 4시간(B 및 F), 24시간(C 및 G) 및 72시간(D 및 H)을 포함하는 다양한 시간에 모니터링하였다(오직 0-72시간 및 오른쪽 옆구리가 도시됨). 신장(K) 및 종양(T)의 근사적 위치가 도시되어 있다.
도 19는 xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자의 예시적인 정제를 예시한다. 겔 여과 크로마토그래피 그래프는 xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자("이중Fab"라 칭함)에 상응하는 피크를 보여준다(A). 분획의 분자 크기를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(B). xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자(이중Fab)을 함유하는 분획을 혼주시키고, 질량 분광법에 의해 질량을 결정하였다(C).
도 20은 예시적인 xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자(이중Fab)의 이중특이성을 예시한다. 바이오티닐화된 인간 CA9는 스트렙타비딘 옥테트(Octet) 바이오센서 팁에서 포획되었다. 화합물을 제1 화살표("화합물")에 의해 표시된 바대로 첨가하고, 이후 결합하게 하였다. 후속하여, 가용성 인간 TEM-1(제2 화살표; "TEM-1")을 첨가하고, 포획된 CA9/화합물 복합체에 대한 이의 결합을 측정하였다. 가용성 TEM-1의 포획을 나타내는, 반응 이동(이중 화살표)은 오직 xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자(이중Fab)에 의해 관찰되었다.
도 21은 xi33O11-Aβ(1-16) Cys80 접합된 mAb 및 xi1-55-2-Aβ(1-16) Cys80 접합된 mAb의 SDS-PAGE 분석을 예시한다. 펩타이드 Aβ(1-16)와의 mAb-DBCO의 접합 전(B) 및 후(A)의 생성물이 도시되어 있다. MW, 분자량 마커. LC, 경쇄.
도 22는 xi1-55-2 및 xi33O11 모 경쇄(LC)(각각 a 및 b), xi1-55-2-DBCO Cys80 접합된 LC 및 xi33O11-DBCO Cys80 접합된 LC(각각 c 및 d) 및 xi1-55-2-Aβ(1-16) Cys80 접합된 LC 및 xi33O11-Aβ(1-16) Cys80 접합된 LC(각각 e 및 f)의 예시적인 질량 분광 분석을 예시한다.
도 23은 항원 결합 분자를 생성하기 위한 예시적인 도식을 예시한다. 토끼로부터 유래된 면역글로불린은 Fab를 생성하도록 파파인에 의해 분해될 수 있다. 제1 Fab는 말레이미도-DBCO와 항온처리될 수 있고, 제2 Fab는 말레이미도-아지드와 항온처리될 수 있다. 제1 Fab 및 제2 Fab는 이중특이적-Fab-Fab 결합 분자를 형성하도록 조합될 수 있다. SPAAC = 균주 프로모팅된 알킨-아지드 접합.
개시된 방법, 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 및 경쇄 가변 영역은 본 개시내용의 일부를 형성하는 첨부한 도면과 연결되어 취해진 하기 상세한 설명을 참조하여 더 용이하게 이해될 수 있다. 개시된 방법, 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 및 경쇄 가변 영역이 본 명세서에 기재되고/되거나 도시된 구체적인 실시형태로 제한되지 않고, 본 명세서에 사용된 전문용어가 오직 예로서 특정한 실시형태를 기재할 목적을 위한 것이고, 청구된 방법, 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 및 경쇄 가변 영역을 제한하는 것으로 의도되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다.
달리 구체적으로 기재되지 않은 한, 가능한 기전 또는 작용 방식 또는 개선에 대한 이유에 관한 임의의 설명은 오직 예시적인 것으로 의도되고, 개시된 방법, 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 및 경쇄 가변 영역은 임의의 이러한 제안된 기전 또는 작용 방식 또는 개선에 대한 이유의 정확 또는 부정확에 의해 제한되지 않는다.
본 문헌에 걸쳐, 설명은 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린, 및 경쇄 가변 영역 및 이를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용이 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 또는 경쇄 가변 영역과 연관된 특징 또는 실시형태를 기술하거나 청구할 때, 이러한 특징 또는 실시형태는 이를 생성하는 방법에 동등하게 적용 가능하다. 마찬가지로, 본 개시내용이 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 또는 경쇄 가변 영역을 생성하는 방법과 연관된 특징 또는 실시형태를 기술하거나 청구할 때, 이러한 특징 또는 실시형태는 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 또는 경쇄 가변 영역에 동등하게 적용 가능하다.
특정한 숫자 값의 언급은, 문맥이 명확히 달리 기술하지 않은 한, 적어도 그 특정한 값을 포함한다. 값의 범위가 표시될 때, 또 다른 실시형태는 하나의 특정한 값으로부터 및/또는 다른 특정한 값으로 포함한다. 추가로, 범위에 기재된 값의 언급은 그 범위 내의 각각의 및 모든 값을 포함한다. 모든 범위는 포함적이고 조합 가능하다.
값이 근사치로 표시될 때, 선행사 "약"의 사용에 의해, 특정한 값이 또 다른 실시형태를 형성한다고 이해될 것이다.
별개의 실시형태의 맥락에서 명확성을 위해 본 명세서에 기재된 개시된 방법, 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 및 경쇄 가변 영역의 소정의 특징이 단일 실시형태와 조합되어 또한 제공될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 반대로, 단일 실시형태의 맥락에서 간단함을 위해 개시된 방법, 접합된 면역글로불린, 항원-결합 분자, 면역글로불린 및 경쇄 가변 영역의 다양한 특징은 별개로 또는 임의의 하위조합으로 또한 제공될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 단수 형태 "일", "하나" 및 "이"는 복수를 포함한다.
용어 "포함하는"은 용어 "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"에 의해 포함되는 예를 포함하도록 의도되고; 유사하게, 용어 "본질적으로 이루어진"은 용어 "이루어진"에 의해 포함되는 예를 포함하도록 의도된다.
설명의 양태에 관한 다양한 용어가 명세서 및 청구항에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 당해 분야에서 이의 보통의 의미가 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 구성되어야 한다.
용어 "약"은, 숫자 범위, 컷오프 또는 구체적인 값을 언급하면서 사용될 때, 인용된 값이 기재된 값으로부터 10%만큼까지 변할 수 있다는 것을 나타내도록 사용된다. 따라서, 용어 "약"은 기재된 값으로부터 ±10% 이하, ±5% 이하의 변동, ±1% 이하의 변동, ±0.5% 이하의 변동 또는 ±0.1% 이하의 변동을 포함하도록 사용된다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 얻은 샘플, 예컨대 생체내 또는 시험관내 얻은 생물학적 조직 또는 유체 기원의 샘플을 의미한다. 이러한 샘플은 포유류, 예컨대 인간으로부터 단리된 체액(예를 들어, 혈액, 혈액 혈장, 혈청, 젖, 척수액, 복수 또는 뇨), 장기, 조직, 분획 및 세포일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 생물학적 샘플은 또한 대상체로부터 얻은 샘플의 절편, 예컨대 조직(예를 들어, 장기 또는 조직의 절편 부분)을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 대상체로부터 얻은 샘플로부터의 추출물, 예를 들어 생물학적 유체(예를 들어, 혈액 또는 뇨)로부터의 항원을 또한 포함할 수 있다.
용어 "캡핑 시스테인"은 경쇄 가변 영역의 Cys80과 다이설파이드 결합을 형성하는 용액으로부터의 유리 시스테인을 의미한다.
용어 "키메라화된", "키메라", "키메라 항체" 및 유사한 용어는 하나의 소스 또는 종으로부터의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린, 즉 항원-결합 영역 및 상이한 소스 또는 종으로부터 유래한 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역의 적어도 일부를 의미한다. 이 부분은 종래의 기법(예를 들어, 합성)에 의해 화학적으로 함께 연결되거나, 유전자 조작 기법을 이용하여 인접 폴리펩타이드로서 제조될 수 있다(예를 들어, 키메라 항체의 단백질 부분을 암호화하는 DNA는 인접 폴리펩타이드 사슬을 생성하도록 발현될 수 있다). 예시적인 키메라 면역글로불린은 토끼 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 것을 포함한다. 이러한 토끼/인간 키메라 면역글로불린은 토끼 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 분절 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 개시내용에 의해 포함된 "키메라 면역글로불린"의 다른 형태는 종류 또는 하위종류가 원래 면역글로불린의 것으로부터 변형되거나 변경된 것("종류 전환된 면역글로불린"이라고도 함)이다. 본 개시내용에 걸쳐, 키메라 면역글로불린은 "xi"라 지칭된다. 본 명세서에서, "키메라 면역글로불린" 및 유사한 용어는 항체를 생성하기 위해 사용된 과정보다는 면역글로불린의 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "Cys80"은 리더 서열이 부재한 경쇄 가변 영역에 비해 경쇄 가변 영역의 80번 아미노산 위치에서의 시스테인 잔기를 의미한다. 예를 들어, 표 25에 개시된 경쇄 가변 영역은 (57개의 뉴클레오타이드에 의해 암호화된) 19개의 아미노산의 리더 서열을 포함한다. "Cys80"은 리더 서열이 존재할 때 99번 아미노산 위치에서 발생하고, 리더 서열이 부재할 때 80번 아미노산 위치에서 발생한다. Cys80 넘버링은 카밧/쵸티아 넘버링 시스템에 기초한다.
용어 "탈캡핑"은 면역글로불린의 네이티브 사슬내 및 사슬간 다이설파이드의 파괴를 최소화하는 조건 하에 본 명세서에 제공된 방법을 이용한 캡핑 시스테인의 제거를 의미한다.
용어 "유래한 면역글로불린"은 토끼 면역글로불린의 적어도 CDR 영역을 가지는 면역글로불린, 또는 이의 일부를 의미한다. "유래한 면역글로불린"은 토끼/인간 키메라 또는 인간화 토끼 면역글로불린을 포함한다. 토끼로부터 면역글로불린을 유도할 때 관용적인 가변성의 수준은 미국 의학 협회(American Medical Association: AMA)의 예를 들어 미국 채택 명칭 위원회(United States Adopted Names Counsel: USAN)에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, "작용제"는 치료학적, 진단학적, 또는 다른 기능적 특성(들)을 가지는 물질을 의미한다. 본 개시내용의 범위 내에 해당하는 다양한 작용제는 본 명세서에서 그 외 기재되어 있다.
용어 "인간화된", "인간화된 면역글로불린" 및 유사한 용어는 가변 영역에 걸쳐 아미노산의 서열이 인간 가변 영역에 대한 동종성을 가지는 서열로 변경된 토끼 기원의 면역글로불린을 의미한다. 예시적인 인간화된 면역글로불린은 토끼 가변 도메인을 포함할 수 있고, 이로써 프레임워크 영역(FWR) 및/또는 CDR에 걸친 잔기는 인간 면역글로불린에 상동성인 서열에 의해 대체된다. 몇몇 경우에, 토끼 면역글로불린의 FWR 잔기는 상응하는 인간 잔기에 의해 대체되지 않는다. 대안적으로, "인간화된", "인간화된 면역글로불린" 및 유사한 용어는 FWR 및/또는 CDR에 걸친 잔기가 토끼 면역글로불린에 상동성인 서열에 의해 대체된 인간 기원의 면역글로불린을 의미할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 면역글로불린은 인간 면역글로불린의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 역량을 가지는 토끼 면역글로불린의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린일 수 있다. 더욱이, 인간화된 면역글로불린은 수혜자 면역글로불린 또는 공여자 면역글로불린에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이 변형은 면역글로불린 성능은 추가로 개선하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 면역글로불린은 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 것에 상응하는 적어도 하나, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인의 전부를 실질적으로 포함할 것이고, FWR의 전부 또는 실질적인 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 면역글로불린은 임의로 면역글로불린 불변 영역(Fc), 통상적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M. S., et al., Nature 314 (1985) 268-270]을 참조한다. 본 개시내용에 걸쳐, "인간화된 면역글로불린"은 "zu"라 지칭한다. 본 명세서에서, "인간화된 면역글로불린" 및 유사한 용어는 면역글로불린을 생성하기 위해 사용된 과정보다는 면역글로불린의 서열을 의미한다.
용어 "공여자 면역글로불린"은, 인간화된 면역글로불린에 대한 이의 가변 영역, CDR, 또는 다른 기능적 단편 또는 이의 유사체의 아미노산 서열에 기여하고, 이로써 공여자 면역글로불린의 항원 특이성 및 중화 활성 특징을 가지는 인간화된 면역글로불린을 제공하는, 비인간 면역글로불린을 의미한다.
용어 "수혜자 면역글로불린"은 이의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 이의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 인간화된 면역글로불린에 제공하는 공여자 면역글로불린에 비상동성인 면역글로불린을 의미한다. 수혜자 면역글로불린은 임의의 포유류로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 수혜자 면역글로불린은 인간에서 비면역원성이다. 바람직하게는, 수혜자 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다.
"인간화"는 인간화된 면역글로불린을 생성하는 과정을 의미하고, 상기 특징을 가지는 인간화된 면역글로불린을 생성하기 위한 임의의 과정, 예컨대 인 실리코(in silico) 인간화, 인간 면역글로불린으로의 종/숙주 CDR의 조작, 상응하는 인간 프레임워크 영역을 일치시키기 위한 키메라 면역글로불린의 프레임워크 영역 잔기의 치환 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함한다.
"소수성 아미노산"은 문헌[Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142]의 정규화 공통 소수화도 척도에 따라 0 초과의 소수화도를 나타내는 아미노산을 의미한다. 유전적으로 암호화된 소수성 아미노산은 Pro(P), Ile(I), Phe(F), Val(V), Leu(L), Trp(W), Met(M), Ala(A), Gly(G) 및 Tyr(Y)을 포함한다.
"면역글로불린"은, 본 명세서에 사용된 바대로, 카파 및 람다 경쇄 및 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 중쇄를 포함하는 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 의미한다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25Kd 또는 214개의 아미노산)는 NH2 말단에서의 가변 영역 유전자(약 110개의 아미노산) 및 COOH 말단에서의 카파 또는 람다 불변 영역 유전자에 의해 암호화된다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50Kd 또는 446개의 아미노산)는 가변 영역 유전자(약 116개의 아미노산) 및 다른 상기 언급된 불변 영역 유전자, 예를 들어, 감마(약 330개의 아미노산을 암호화) 중 하나에 의해 유사하게 암호화된다. "면역글로불린"은 (a) 특이적 항원(예를 들어, MSLN, CA9, TEM1 등)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는, 면역글로불린 폴리펩타이드, 즉 면역글로불린 패밀리의 폴리펩타이드, 예를 들어, 달리 기재되지 않은 한, 모든 면역글로불린 아이소타입(IgG, IgA, IgE, IgM, IgD 및 IgY), 종류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), 하위종류, 및 각각의 아이소타입의 다양한 단량체 및 중합체 형태; 및 (b) 항원(예를 들어, MSLN, CA9, TEM1 등)에 면역특이적으로 결합하는 이러한 면역글로불린 폴리펩타이드의 보존적으로 치환된 변이체를 포함한다. 면역글로불린은 일반적으로 예를 들어 문헌[Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)]에 기재되어 있다.
본 명세서에 개시된 면역글로불린의 하나의 형태는 항체의 기본 구조 단위를 구성한다. 예를 들어, 항체는 사합체를 포함하고 면역글로불린 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 이루어질 수 있고, 각각의 쌍은 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄를 가진다. 일반적으로, 각각의 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 함께 항원에 대한 결합을 담당하고, 불변 영역은 항체 이펙터 기능을 담당한다.
항체 이외에, 면역글로불린은 예를 들어 항원-결합 단편 또는 면역글로불린의 일부, 예컨대 몇몇 열거하자면 Fv, Fab, (Fab')2 및 Fv 단편; 및 대안적인 항체 포맷, 예컨대 단쇄 면역글로불린(scFV 및 scFab), 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 선형 항체, 및 다중특이적 항체 등의 다양한 다른 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 문헌[James D. Marks, Antibody Engineering, Chapter 2, Oxford University Press (1995) (Carl K. Borrebaeck, Ed.)]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "면역특이적으로"는 면역글로불린이 생성되는 항원에 특이적으로 결합하고 다른 펩타이드 또는 단백질에 특이적으로 결합하지 않는 면역글로불린의 능력을 의미한다. 면역글로불린이 생성된 항원에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 다른 폴리펩타이드 또는 단백질에 면역특이적으로 결합하지 않을 수 있거나, 예를 들어 면역검정, BIAcore, 또는 당해 분야에 공지된 다른 검정에 의해 결정된 바대로 면역글로불린이 생성된 항원보다 더 낮은 결합 친화도로 다른 폴리펩타이드 또는 단백질에 결합할 수 있다. 면역글로불린은, 실험 기법, 예컨대 방사면역측정법(radioimmunoassay: RIA) 및 효소 연결 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)(이들로 제한되지는 않음)을 이용하여 결정된 바대로, 임의의 교차 반응성 항원에 대한 것보다 더 높은 결합 친화도로 항원에 결합할 때, 면역글로불린이 생성된 항원에 면역특이적으로 결합한다(예를 들어, 항체 특이성에 관한 토의에 대해 문헌[Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, pages 332-336 (1989)] 참조).
"링커"는, 본 명세서에 사용된 바대로, (짝을 이루지 못한 Cys80 상의 티올 반응성 기를 통해) 면역글로불린을 작용제에 연결하기 위한 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 스페이서(spacer)를 의미한다. 이러한 링커는 절단 가능(예를 들어, 산 불안정 또는 프로테아제 절단 가능) 또는 절단 불가일 수 있다.
용어 "단일클론 항체"는, 이것이 생성되는 방법이 아니라, 단일 세포 클론, 예컨대 임의의 진핵생물 또는 원핵생물 세포 클론, 또는 파지 클론으로부터 유래한 항체를 의미한다. 단일클론 항체는 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이한다. 용어 "단일클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다.
"네이티브"는 면역글로불린이 유래한 종으로부터의 야생형 면역글로불린 서열을 의미한다. 예를 들어, 실시형태에서, Cys80은 이것이 유래한 종으로부터의 경쇄 가변 영역에 존재하고, Cys80은 네이티브 경쇄 가변 영역에 존재한다고 말해진다.
본 명세서에 사용된 바대로, "동일성 백분율" 및 유사한 용어는 2개 이상의 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 관계를 기재하도록 사용되고, (a) 기준 서열, (b) 비교 창, (c) 서열 동일성 및 (d) 서열 동일성의 백분율을 포함하는 용어의 맥락에서 이것과 함께 이해된다.
(a) "기준 서열"은 서열 비교에 대한 기본으로서 사용되는 정의된 서열이다. 기준 서열은 기재된 서열의 하위집단 또는 이의 전부, 예를 들어 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 분절, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. 폴리펩타이드의 경우, 기준 폴리펩타이드 서열의 예시적인 길이는 적어도 약 16개의 아미노산, 적어도 약 20개의 아미노산, 적어도 약 25개의 아미노산, 적어도 약 35개의 아미노산, 적어도 약 50개의 아미노산, 또는 적어도 약 100개의 아미노산을 포함한다. 핵산의 경우, 기준 핵산 서열의 예시적인 길이는 적어도 약 50개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 60개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 75개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 300개의 뉴클레오타이드, 또는 이들 근처 또는 이들 사이의 임의의 정수를 포함한다.
(b) "비교 창"은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 인접한 및 기재된 분절에 대한 기준을 포함하고, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 기준 서열과 비교될 수 있고, 비교 창에서의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부는, 2개의 서열의 최적 정렬에 대해 (부가, 치환 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열과 비교하여, 부가, 치환 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 예시적인 비교 창은 적어도 20개의 길이의 인접 뉴클레오타이드 또는 아미노산일 수 있고, 임의로 30개, 40개, 50개, 100개 이상일 수 있다. 당해 분야의 당업자는 폴리뉴클레오타이드에서의 갭 또는 폴리펩타이드 서열 갭 패널티의 포함으로 인해 기준 서열과의 오해할 정도로 높은 유사성을 피하는 것이 통상적으로 도입되고 일치의 수로부터 공제된다는 것을 이해한다.
(c) 비교에 대한 서열의 정렬의 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 비교에 대한 서열의 최적 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981]의 국소 동종성 알고리즘에 의해; 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970]의 동종성 정렬 알고리즘에 의해; 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988]의 유사성 방법에 대한 조사에 의해; 이 알고리즘의 컴퓨터화 실행, 예를 들어 Intelligenetics(캘리포니아주 마운틴 뷰)에 의한 PC/유전자 프로그램에서의 CLUSTAL, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG)(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 7)에서의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA(이들로 제한되지는 않음)에 의해 수행될 수 있고; CLUSTAL 프로그램은 문헌[Higgins and Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988; Corpet, et al., Nucleic Acids Research, 16:881-90, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:1-6, 1992; 및 Pearson, et al., Methods in Molecular Biology, 24:7-331, 1994]에 의해 기재되어 있다. 데이터베이스 유사성 조사에 사용될 수 있는 프로그램의 BLAST 패밀리는 뉴클레오타이드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 쿼리 서열에 대한 BLASTN; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 단백질 쿼리 서열에 대한 BLASTP; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 쿼리 서열에 대한 BLASTX; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 단백질 쿼리 서열에 대한 BLASTP; 뉴클레오타이드 데이터베이스 서열에 대한 단백질 쿼리 서열에 대한 TBLASTN; 및 뉴클레오타이드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 쿼리 서열에 대한 TBLASTX를 포함한다. 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995]을 참조한다. 상기 프로그램의 새로운 버전 또는 새로운 프로그램은 함께 미래에 의심 없이 이용 가능해질 것이고, 본 개시내용과 사용될 수 있다.
(d) "동일성 백분율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하고, 여기서 비교 창에서의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부는, 2개의 서열의 최적 정렬에 대해 (부가, 치환 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열과 비교하여, 부가, 치환 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 서열 둘 다에서 발생하는 위치의 수를 결정함으로써 계산되어, 일치된 위치의 수를 생성시켜서, 비교 창에서 위치의 전체 수로 일치된 위치의 수를 나누고 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성의 백분율을 생성시킨다.
"약제학적 유효량"은 대상체를 치료하는 면역글로불린의 양을 의미한다.
"극성 아미노산"은 생리학적 pH에서 비하전되지만, 2개의 원자에 의해 공통으로 공유된 전자의 쌍이 원자 중 하나에 의해 매우 가깝게 유지되는 적어도 하나의 결합을 가지는 측쇄를 가지는 친수성 아미노산을 의미한다. 유전적으로 암호화된 극성 아미노산은 Asn(N), Gln(Q), Ser(S) 및 Thr(T)을 포함한다.
용어 "대상체"는 본 명세서에 사용된 바대로, 인간 또는 비인간 유기체를 의미한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법, 면역글로불린, 및 접합된 면역글로불린은 인간 및 수의학적 질환 및 병태 둘 다에 적용 가능하다. 대상체는 "환자", 즉 질환 또는 병태에 대한 의학 관리를 받는 살아 있는 인간 또는 비인간 유기체, 또는 병리학의 징후 또는 특정한 병태의 존재/부재에 대해 조사되는 한정된 질병이 없는 인간 또는 비인간 유기체일 수 있다.
"치환하는"은 또 다른 아미노산 잔기에 대한 하나의 아미노산 잔기의 대체를 의미한다. "치환하는"은 예를 들어 아미노산 잔기를 암호화하는 하나 이상의 DNA 염기 쌍에서의 미스센스 돌연변이 또는 또 다른 아미노산에 의해 하나의 아미노산을 교환하기 위해 단백질을 조작하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "치료하는" 및 유사한 용어는 질환 증상의 중증도 및/또는 빈도의 감소, 질환 증상 및/또는 상기 증상의 기초하는 원인의 제거, 질환 증상의 빈도 또는 가능성 및/또는 이의 기초하는 원인의 감소, 및 질환에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 생긴 손상의 개선 또는 교정을 의미한다. 예시적인 질환은 암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"티올 반응성 기"는 시스테인 내의 티올 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 시약 또는 기를 의미한다.
"짝을 이루지 못한 Cys80"은 분자내 또는 분자간 다이설파이드 결합에 관여되지 않은 티올 작용기를 가지는 면역글로불린에 존재하는 Cys80을 의미한다. 예를 들어, "짝을 이루지 못한 Cys80"의 티올 작용기는 Cys171과의 다이설파이드 결합에 관여되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바대로, "90% 동일"은 기준 항목(예를 들어, 생물학적 서열)과 적어도 90% 동일, 91% 동일, 92% 동일, 93% 동일, 94% 동일, 95% 동일, 96% 동일, 97% 동일, 98% 동일, 99% 동일 또는 100% 동일을 포함한다.
하기 약어는 본 개시내용에 걸쳐 사용된다: 항체 약물 접합체(ADC); 약물-대-항체(DAR); 프레임워크 영역(FWR); 상보성 결정 영역(CDR); 탄산무수화효소 IX(CA9); 메소텔린(MSLN); 아우리스타틴 F(AuF); 가변 중쇄 영역(VH); 가변 경쇄 영역(VL); 가변 카파(Vκ); 토끼(Rb; rabb); 감마 불변 영역(Cγ); 카파 불변 영역(Cκ); 단일클론 항체(mAb); 80번 아미노산 위치에서의 시스테인(Cys80).
접합된 면역글로불린의 생성
접합된 면역글로불린을 생성하는 방법이 본 명세서에 개시되고, 상기 방법은 하기를 포함한다:
토끼로부터 유래된 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에서 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys80")을 탈캡핑하는 단계(여기서, 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함함); 및
반응성 화합물을 Cys80에 접합시키는 단계(여기서, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함함).
적합한 경쇄 가변 영역은 예를 들어 카파 경쇄 가변 영역을 포함한다. 개시된 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 토끼로부터 유래된다. 몇몇 실시형태에서, Cys80은 토끼 면역글로불린의 네이티브 경쇄 가변 영역에 존재할 수 있다. Cys80을 가지는 경쇄 가변 영역이 유래될 수 있는 예시적인 토끼는 오릭톨라구스 쿠니쿠루스(Oryctolagus cuniculus)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 양태에서, 예를 들어 경쇄 가변 영역은 뉴질랜드 화이트(New Zealand White: NZW) 토끼로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 경쇄 가변 영역은 b9 토끼로부터 유래될 수 있다.
면역글로불린의 경쇄 가변 영역에서 Cys80을 탈캡핑하기 위한 예시적인 방법은 면역글로불린을 환원 완충제와 항온처리한 후, 면역글로불린을 산화 완충제와 항온처리하는 단계를 포함하나다. 환원 완충제는 하나 이상의 환원제를 포함한다. 적합한 환원제는 예를 들어 시스테인(L-시스테인 및 D-시스테인 포함), 2-머캅토에틸아민, 트리스(2-카복시에틸) 포스핀, 2-머캅토에탄설폰산, 2-머캅토프로피온산, 또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 환원 완충제는 온화한 환원제, 예컨대 시스테인을 포함할 수 있다. 환원제의 농도는 약 0.2mM 내지 약 100mM, 약 1mM 내지 약 100mM, 약 2mM 내지 약 100mM, 약 5mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 50mM 내지 약 100mM, 약 0.2mM 내지 약 90mM, 약 0.2mM 내지 약 80mM, 약 0.2mM 내지 약 70mM, 약 0.2mM 내지 약 50mM, 약 0.2mM 내지 약 30mM, 약 0.2mM 내지 약 25mM, 약 0.2mM 내지 약 10 mM, 또는 약 0.2mM 내지 약 5mM의 범위일 수 있다. 환원제의 농도는 약 0.2mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 1mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 2mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 5mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 10mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 15mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 20mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 25mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 30mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 40mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 50mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 60mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 70mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 80mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 90mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 100mM일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 예를 들어 환원제는 약 2mM 내지 약 10mM 시스테인을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원제는 약 2mM 내지 약 10mM D-시스테인을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원제는 약 2mM 내지 약 10mM L-시스테인을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원제는 약 10mM 내지 약 100mM 2-머캅토에틸아민을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원제는 약 0.2mM 내지 약 5mM 트리스(2-카복시에틸) 포스핀을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원제는 약 2mM 내지 약 20mM 2-머캅토에탄설폰산을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원제는 약 2mM 내지 약 20mM 2-머캅토프로피온산을 포함할 수 있다.
환원 완충제는 완충제, 예컨대 인산나트륨, 인산칼륨, MOPS, HEPES, 붕산나트륨, 붕산칼륨, 또는 임의의 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 완충제 농도는 약 10mM 내지 약 100mM, 약 15mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 100mM, 약 35mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 60mM 내지 약 100mM, 약 80mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 90mM, 약 10mM 내지 약 80mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 30 mM, 또는 약 10mM 내지 약 20mM을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 실시형태에서, 예를 들어 환원 완충제는 약 10mM 내지 약 100mM 인산나트륨을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제는 약 10mM 내지 약 100mM 인산칼륨을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제는 약 10mM 내지 약 100mM MOPS를 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제는 약 10mM 내지 약 100mM HEPES를 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제는 약 10mM 내지 약 100mM 붕산나트륨을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제는 약 10mM 내지 약 100mM 붕산칼륨을 함유할 수 있다.
환원 완충제는 킬레이트화제, 예컨대 EDTA(에틸렌다이아민테트라아세트산), DTPA(다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산)(이들로 제한되지는 않음), 또는 이들의 조합을 또한 함유할 수 있다. 킬레이트화제의 적합한 농도는 약 10mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 80mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 50mM 내지 약 100mM, 약 60mM 내지 약 100 mM, 또는 약 80mM 내지 약 100mM을 포함한다.
환원 완충제의 적합한 pH 범위는 약 6.8 내지 약 8.0을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 6.8일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 6.9일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.0일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.2일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.3일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.4일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.5일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.6일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.7일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.8일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 7.9일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환원 완충제의 pH는 약 8.0일 수 있다.
면역글로불린은 약 12시간 내지 약 96시간, 약 18시간 내지 약 96시간, 약 24시간 내지 약 96시간, 약 30시간 내지 약 96시간, 약 36시간 내지 약 96시간, 약 42시간 내지 약 96시간, 약 48시간 내지 약 96시간, 약 54시간 내지 약 96시간, 약 60시간 내지 약 96시간, 약 12시간 내지 약 90시간, 약 12시간 내지 약 84시간, 약 12시간 내지 약 78시간, 약 12시간 내지 약 72시간, 약 12시간 내지 약 66시간, 약 12시간 내지 약 60시간, 약 12시간 내지 약 54시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 42시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 또는 약 12시간 내지 약 30시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 12시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 18시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 24시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 30시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 36시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 42시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 48시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 54시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 60시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 66시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 72시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 78시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 84시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 90시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 96시간 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 96시간 초과 동안 환원 완충제와 항온처리될 수 있다.
적합한 산화 완충제는 Tris계, 글루타민계, 아르기닌계 또는 다른 아미노산계 또는 1차 아민계 완충제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 산화 완충제의 농도는 약 20mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 60mM 내지 약 100mM, 약 80mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 80mM, 약 20mM 내지 약 60 mM, 또는 약 20mM 내지 약 40mM의 범위일 수 있다. 산화 완충제의 농도는 약 20mM일 수 있다. 산화 완충제의 농도는 약 25mM일 수 있다. 산화 완충제의 농도는 약 30mM일 수 있다. 산화 완충제의 농도는 약 40mM일 수 있다. 산화 완충제의 농도는 약 50mM일 수 있다. 산화 완충제의 농도는 약 60mM일 수 있다. 산화 완충제의 농도는 약 70mM일 수 있다. 산화 완충제의 농도는 약 80mM일 수 있다. 산화 완충제의 농도는 약 90mM일 수 있다. 환원제의 농도는 약 100mM일 수 있다.
면역글로불린은 약 24시간 내지 약 96시간, 약 30시간 내지 약 96시간, 약 36시간 내지 약 96시간, 약 42시간 내지 약 96시간, 약 48시간 내지 약 96시간, 약 54시간 내지 약 96시간, 약 60시간 내지 약 96시간, 약 24시간 내지 약 90시간, 약 24시간 내지 약 84시간, 약 24시간 내지 약 78시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 66시간, 약 24시간 내지 약 60시간, 약 24시간 내지 약 54시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 42시간, 또는 약 24시간 내지 약 36시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 24시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 30시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 36시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 42시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 48시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 54시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 60시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 66시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 72시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 78시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 84시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 90시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 약 96시간 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 96시간 초과 동안 산화 완충제와 항온처리될 수 있다.
산화 완충제의 적합한 pH 범위는 약 7.5 내지 약 9.0을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 7.5일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 7.6일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 7.7일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 7.8일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 7.9일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.0일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.2일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.3일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.4일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.5일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.6일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.7일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.8일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 8.9일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 산화 완충제의 pH는 약 9.0일 수 있다.
상기 방법은 환원제와 항온처리하기 전에 매트릭스 상의 면역글로불린을 고정시키는 단계 및 산화 완충제와 항온처리한 후에 매트릭스로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 매트릭스는 면역글로불린이 결합하거나 용리될 수 있는 임의의 표면, 예컨대 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 항-Fab 항체, 항-Fc 항체, 항-Mab 기반 친화도 지지체 및 강한 양이온 교환 수지(이들로 제한되지는 않음)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 매트릭스는 단백질 A일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 매트릭스는 단백질 G일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 매트릭스는 단백질 L일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 매트릭스는 항-Fab 항체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 매트릭스는 항-Fc 항체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 매트릭스는 항-MAb를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 매트릭스는 강한 양이온 교환 수지를 포함할 수 있다.
면역글로불린을 탈캡핑하기 위한 개시된 방법은 매트릭스를 평형화하는 단계; 매트릭스 상에 면역글로불린을 고정시키는 단계; 매트릭스 상의 고정된 면역글로불린을 환원 완충제와 항온처리하여 캡핑 기를 제거하는 단계; 매트릭스 상의 고정된 면역글로불린을 산화 완충제와 항온처리하는 단계; 매트릭스로부터 면역글로불린을 용리시키고 면역글로불린을 중화시키는 단계를 포함할 수 있다.
당해 분야의 당업자는, 매트릭스로부터 면역글로불린을 용리시키기 위한 완충제, 농도, pH 및 시간이, 적어도 부분적으로, 매트릭스에 따라 달라진다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 매트릭스가 단백질 A인 실시형태에서, 면역글로불린은 글라이신(예를 들어, pH 2.9에서 0.1M)을 사용하여 단백질 A로부터 용리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 용리는 낮은 pH 완충제 중에 수행될 수 있다.
면역글로불린을 중화시키는 단계는 Tris계, 인산나트륨계 또는 인산칼륨계 완충제(본 명세서에서 "중화 완충제"라 칭함) 중에 면역글로불린을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 중화 완충제는 약 0.5M 내지 약 2M의 농도, 및 약 8.0 내지 약 9.5의 pH를 가질 수 있다.
티올 반응성 화합물을 용해 용액 중에 용해시키고, 접합 완충제 중에 용해된 티올 반응성 화합물을 면역글로불린과 항온처리하는 단계에 의해 접합을 수행할 수 있다.
말레이미드계 화합물(이들로 제한되지는 않음)을 포함할 수 있는 수성 불용성 티올 반응성 화합물의 경우, 적합한 용해 용액은 유기, 수혼화성 용매, 예컨대 다이메틸설폭사이드(DMSO)를 포함한다. 수성 가용성 티올 반응성 화합물의 경우, 적합한 용해 용액은 물 또는 완충 수용액, 예컨대 인산염 완충 식염수(pH 7.2)(1x PBS)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
적합한 티올 반응성 화합물의 농도는 약 5mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 25mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 55mM 내지 약 100mM, 약 70mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 90mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 40 mM, 또는 약 10mM 내지 약 30mM을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 10mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 20mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 30mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 40mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 50mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 60mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 70mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 80mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 90mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물의 농도는 약 100mM일 수 있다.
면역글로불린의 적합한 농도는 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖, 약 0.5㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖, 약 1㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖, 약 5㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖, 약 10㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖, 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 15㎎/㎖, 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 12㎎/㎖, 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 10㎎/㎖, 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 5㎎/㎖, 또는 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 2㎎/㎖를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린의 농도는 약 0.1㎎/㎖일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린의 농도는 약 0.5㎎/㎖일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린의 농도는 약 1㎎/㎖일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린의 농도는 약 2㎎/㎖일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린의 농도는 약 5㎎/㎖일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린의 농도는 약 10㎎/㎖일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린의 농도는 약 15㎎/㎖일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린의 농도는 약 20㎎/㎖일 수 있다.
티올 반응성 화합물:면역글로불린의 적합한 비율은 약 3:1 내지 20:1을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 3:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 4:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 5:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 6:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 7:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 8:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 9:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 10:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 11:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 12:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 13:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 14:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 15:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 16:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 17:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 18:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 19:1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 비율은 20:1일 수 있다.
항온처리는 다수의 적합한 접합 완충제, 열거하자면, 예를 들어 1xPBS(pH 7.2), 인산나트륨, 인산칼륨, 붕산나트륨 및 HEPES 등 중에 수행될 수 있다. 접합 완충제의 농도는 약 5mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 100mM, 약 45mM 내지 약 100mM, 약 60mM 내지 약 100mM, 약 75mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 90mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10mM 내지 약 45 mM, 또는 약 10mM 내지 약 30mM을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 10mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 20mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 30mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 40mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 50mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 60mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 70mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 80mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 90mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 농도는 약 100mM일 수 있다.
접합 완충제는 염화나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 염화나트륨의 농도는 약 0mM 내지 약 500mM, 약 25mM 내지 약 500mM, 약 50mM 내지 약 500mM, 약 75mM 내지 약 500mM, 약 100mM 내지 약 500mM, 약 150mM 내지 약 500mM, 약 200mM 내지 약 500mM, 약 250mM 내지 약 500mM, 약 300mM 내지 약 500mM, 약 350mM 내지 약 500mM, 약 400mM 내지 약 500mM, 약 0mM 내지 약 400mM, 약 0mM 내지 약 350mM, 약 0mM 내지 약 300mM, 약 0mM 내지 약 250mM, 약 0mM 내지 약 200mM, 약 0mM 내지 약 150mM, 약 0mM 내지 약 100mM, 약 0mM 내지 약 50 mM, 또는 약 0mM 내지 약 25mM을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 25mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 50mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 75mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 100mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 150mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 200mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 250mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 300mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 350mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 400mM일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 500mM일 수 있다.
접합 완충제의 pH는 약 6.5 내지 약 8.5일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 6.5일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 6.6일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 6.7일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 6.8일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 6.9일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.0일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.2일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.3일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.4일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.5일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.6일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.7일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.8일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 7.9일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 8.0일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 8.1일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 8.2일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 8.3일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 8.4일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합 완충제의 pH는 약 8.5일 수 있다.
접합 완충제 중의 티올 반응성 화합물의 용해도를 촉진하도록, 접합 완충제 중의 유기, 수혼화성 용매의 최종 농도는 약 0% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 8% 내지 약 20%, 약 11% 내지 약 20%, 약 16% 내지 약 20%, 약 0% 내지 약 18%, 약 0% 내지 약 15%, 약 0% 내지 약 12%, 약 0% 내지 약 10%, 약 0% 내지 약 8%, 약 0% 내지 약 6%, 또는 약 0% 내지 약 2%일 수 있다.
접합 완충제는 접합 완충제 중의 티올 반응성 화합물의 용해도를 촉진하도록 프로필렌 글라이콜을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 프로필렌 글라이콜의 농도는 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20%를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로필렌 글라이콜의 농도는 약 10%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프로필렌 글라이콜의 농도는 약 20%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프로필렌 글라이콜의 농도는 약 30%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프로필렌 글라이콜의 농도는 약 40%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프로필렌 글라이콜의 농도는 약 50%일 수 있다.
접합 완충제는 접합 완충제 중의 접합된 면역글로불린의 용해도를 촉진하도록 비이온성 세제를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 비이온성 세제는 폴리소르베이트-20 또는 폴리소르베이트-80을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 비이온성 세제의 농도는 약 0% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.3% 내지 약 1%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 0.7% 내지 약 1%, 약 0% 내지 약 0.8%, 약 0% 내지 약 0.6%, 약 0% 내지 약 0.4%, 또는 약 0% 내지 약 0.2%를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.1%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.2%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.3%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.4%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.5%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.6%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.7%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.8%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 0.9%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비이온성 세제의 농도는 약 1.0%일 수 있다.
항온처리는 약 2시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 30시간 내지 약 48시간, 약 36시간 내지 약 48시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 2시간 내지 약 42시간, 약 2시간 내지 약 36시간, 약 2시간 내지 약 30시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 18시간, 약 2시간 내지 약 12시간, 또는 약 2시간 내지 약 6시간 동안 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 2시간 동안 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 6시간 동안 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 12시간 동안 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 18시간 동안 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 24시간 동안 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 30시간 동안 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 36시간 동안 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 42시간 동안 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 48시간 동안 수행될 수 있다.
항온처리의 온도는 약 18℃ 내지 약 37℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 22℃ 내지 약 37℃, 약 24℃ 내지 약 37℃, 약 26℃ 내지 약 37℃, 약 28℃ 내지 약 37℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 약 32℃ 내지 약 37℃, 약 34℃ 내지 약 37℃, 약 18℃ 내지 약 34℃, 약 18℃ 내지 약 32℃, 약 18℃ 내지 약 30℃, 약 18℃ 내지 약 28℃, 약 18℃ 내지 약 26℃, 또는 약 18℃ 내지 약 24℃일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 18℃에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 20℃에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 22℃에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 24℃에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 26℃에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 28℃에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 30℃에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 32℃에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 34℃에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항온처리는 37℃에서 수행될 수 있다.
비혼입된 티올 반응성 화합물은 다수의 적합한 수지, 예컨대 G-25 수지, G-50 수지, Biogel P10, 또는 5,000 내지 10,000Da 범위의 배제 범위를 가지는 다른 수지(이들로 제한되지는 않음)를 사용하여 크로마토그래피를 탈염시킴으로써 접합된 면역글로불린으로부터 분리될 수 있다. 크로마토그래피는 규모에 따라 칼럼 포맷 또는 스핀-칼럼 포맷에서 수행될 수 있다. 탈염에 적합한 완충제는 예를 들어 1xPBS, 인산나트륨, 인산칼륨, 붕산나트륨을 포함하거나, HEPES 기반 완충제는 1x PBS를 대체할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 접합은 10mM의 최종 티올 반응성 화합물의 농도에서 100% 다이메틸설폭사이드(DMSO) 중에 말레이미도계 티올 반응성 화합물을 용해시킴으로써 수행될 수 있다. 이후, 용해된 티올 반응성 화합물은 5:1 티올 반응성 화합물:면역글로불린의 몰 비율로 1xPBS(pH 7.2) 중의 5㎎/㎖의 면역글로불린 농도로 면역글로불린과 항온처리되고 완전히 혼합될 수 있다. 항온처리는 22℃에서 24시간 동안 수행될 수 있다. 비혼입된 티올 반응성 화합물은 실행 완충제로서 1x PBS와 G-25 수지를 사용하여 크로마토그래피를 탈염시킴으로써 접합된 면역글로불린으로부터 제거될 수 있다.
바람직하게는, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 통해 Cys80에 접합된다. 티올 반응성 기는 할로아세틸, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴화제, 비닐설폰, 피리딜 다이설파이드, TNB-티올 및 다이설파이드 환원제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 말레이미드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 할로아세틸을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 아지리딘을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 아크릴로일을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 아릴화제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 비닐설폰을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 피리딜 다이설파이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 TNB-티올을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 다이설파이드 환원제를 포함할 수 있다.
티올 반응성 기는 다수의 적합한 시약, 예컨대 요오도아세트아마이드, 말레이미드, 벤질 할라이드 및 브로모메틸케톤으로부터 유도될 수 있고, 이것은 안정한 티오에터 생성물을 생성하도록 티올의 S-알킬화에 의해 반응할 수 있다.
티올 반응성 기는 링커에 부착될 수 있다. 링커는 절단 불가 링커 또는 절단 가능 링커일 수 있다. 예시적인 링커는 예를 들어 다이설파이드 함유 링커, 아세탈계 링커 및 케탈계 링커를 포함한다. 몇몇 양태에서, 링커는 절단 불가 링커일 수 있다. 적합한 절단 불가 링커는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 알킬을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 링커는 PEG를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 링커는 절단 가능 링커일 수 있다. 적합한 절단 가능 링커는 예를 들어 발린-시트룰린-파라 아미노벤질을 포함한다. 몇몇 양태에서, 링커는 다이설파이드 함유 링커일 수 있다. 몇몇 양태에서, 링커는 아세탈계 링커일 수 있다. 몇몇 양태에서, 링커는 케탈계 링커일 수 있다. 티올 반응성 기에 공유로 부착된 링커의 예는 예를 들어 미국 공보 제20140050746호에 제공된다.
티올 반응성 화합물은 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 작용제는 예를 들어 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 및 약물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 작용제는 형광단을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 형광성 염료를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 면역글로불린을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 항생제를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 핵산(예컨대, DNA 또는 RNA)을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 화학 링커(예를 들어, 다이벤질사이클로옥틴(DBCO) 또는 아지드)를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 소분자를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 킬레이터(예를 들어, 무엇보다도 DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA)를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 지질을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 약물을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 임의의 상기 기재된 작용제의 조합을 포함할 수 있다.
티올 반응성 화합물(즉, 제1 티올 반응성 화합물)은 제2 티올 반응성 화합물에 결합할 수 있고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 가지는 제2 면역글로불린에 결합하고, 제2 경쇄 가변 영역은 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys802")을 가지고, 제2 티올 반응성 화합물은 Cys802에 결합된 제2 티올 반응성 기를 포함한다. 예를 들어, 제1 티올 반응성 화합물 및 제2 티올 반응성 화합물은 각각 제1 작용제 및 제2 작용제로서 제1 화학 링커 및 제2 화학 링커를 가질 수 있다. 제1 화학 링커 및 제2 화학 링커는 다수의 적합한 수단, 예컨대 클릭 화학 등에 의해 서로 결합될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, Cys80은 짝을 이루지 못할 수 있다. Cys80을 짝을 이루지 못하게 하는 적합한 수단은 예를 들어 171번 위치에서 시스테인 이외의 아미노산 잔기를 가지는 불변 도메인에 의해 Cys80을 가지는 경쇄 가변 영역을 키메라화하는 것을 포함한다.
개시된 방법은 키메라화된 면역글로불린에서 수행될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 키메라화된 면역글로불린일 수 있다. 면역글로불린이 키메라화되는 실시형태에서, 접합된 면역글로불린을 생성하는 방법은 키메라화된 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에서 Cys80을 탈캡핑하는 단계(여기서, 키메라화된 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함함); 및 티올 반응성 화합물을 Cys80에 접합시키는 단계(여기서, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함함)를 포함할 수 있다.
대안적으로, 개시된 방법은 탈캡핑 전에 면역글로불린을 키메라화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 접합된 면역글로불린을 생성하는 방법은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린을 키메라화하는 단계(여기서, 경쇄 가변 영역은 Cys80을 가짐); Cys80을 탈캡핑하는 단계; 및 티올 반응성 화합물을 Cys80에 접합시키는 단계(여기서, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함함)를 포함할 수 있다.
개시된 방법은 인간화된 면역글로불린에서 수행될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 인간화된 면역글로불린일 수 있다. 면역글로불린이 인간화되는 실시형태에서, 접합된 면역글로불린을 생성하는 방법은 인간화된 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에서 Cys80을 탈캡핑하는 단계(여기서, 인간화된 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함함); 및 티올 반응성 화합물을 Cys80에 접합시키는 단계(여기서, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함함)를 포함할 수 있다.
대안적으로, 개시된 방법은 탈캡핑 전에 면역글로불린을 인간화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 접합된 면역글로불린을 생성하는 방법은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린을 인간화하는 단계(여기서, 경쇄 가변 영역은 Cys80을 가짐); Cys80을 탈캡핑하는 단계; 및 티올 반응성 화합물을 Cys80에 접합시키는 단계(여기서, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함함)를 포함할 수 있다.
상기 방법은 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 알라닌("Ala83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 발린("Val83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 아이소류신("Ile83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 트레오닌("Thr83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 아르기닌("Arg83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 아스파라긴("Asn83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 아스파르트산("Asp83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 글루탐산("Glu83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 글루타민("Gln83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 글라이신("Gly83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 히스티딘("His83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 류신("Leu83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 메티오닌("Met83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 프롤린("Pro83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 세린("Ser83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 트립토판("Trp83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 타이로신("Tyr83")에 의해 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 페닐알라닌을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 극성 또는 소수성 아미노산, 예컨대 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌(이들로 제한되지는 않음)에 의해 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것을 포함할 수 있다.
개시된 탈캡핑 방법과 조합되어 83번 아미노산 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기는 면역글로불린의 응집을 감소시키고, Cys80 접합 효율을 증가시킬 수 있다. 개시된 방법에 의해 달성된 적합한 면역글로불린 응집은 예를 들어 약 5% 미만, 약 7% 미만, 약 10% 미만, 약 12% 미만, 약 15% 미만, 약 17% 미만, 약 20% 미만, 약 22% 미만, 또는 약 25% 미만을 포함한다. 개시된 방법에 의해 달성된 적합한 접합 효율은 예를 들어 약 70% 초과, 약 73% 초과, 약 76% 초과, 약 79% 초과, 약 82% 초과, 약 85% 초과, 약 88% 초과, 약 91% 초과, 약 94% 초과, 약 97% 초과, 또는 약 99% 초과를 포함한다.
항원-결합 분자를 생성시키는 방법
항원-결합 분자를 생성시키는 방법이 본 명세서에 또한 제공되고, 상기 방법은 제1 접합된 면역글로불린을 제2 접합된 면역글로불린과 항온처리하여 항원-결합 분자를 생성시키는 단계를 포함하고, 여기서
제1 접합된 면역글로불린은 제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제1 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys801")을 가지고, Cys801은 제1 티올 반응성 기를 포함하는 제1 티올 반응성 화합물에 접합되고;
제2 접합된 면역글로불린은 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys802")을 가지고, Cys802는 제2 티올 반응성 기를 포함하는 제2 티올 반응성 화합물에 접합된다.
항원-결합 분자는 다가 및/또는 다중특이적 항원-결합 분자를 포함한다. 예를 들어, 항원-결합 분자는, 단일특이적 또는 이중특이적인, 2가, 3가 및 4가 항원-결합 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 항원-결합 분자는 2가 및 단일특이적일 수 있다. 몇몇 양태에서, 항원-결합 분자는 2가 및 이중특이적일 수 있다. 몇몇 양태에서, 항원-결합 분자는 3가 및 단일특이적일 수 있다. 몇몇 양태에서, 항원-결합 분자는 3가 및 이중특이적일 수 있다. 몇몇 양태에서, 항원-결합 분자는 4가 및 단일특이적일 수 있다. 몇몇 양태에서, 항원-결합 분자는 4가 및 이중특이적일 수 있다. 몇몇 양태에서, 원자가는 4가 초과일 수 있다. 몇몇 양태에서, 특이성은 이중특이적보다 높을 수 있다.
Cys801, Cys802, 또는 둘 다는 짝을 이루지 못할 수 있다. Cys80을 짝을 이루지 못하게 하기 위한 적합한 수단은 예를 들어 171번 위치에서의 시스테인 이외의 아미노산 잔기를 가지는 불변 도메인에 의해 Cys80을 가지는 경쇄 가변 영역을 키메라화하는 것을 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 Cys801을 탈캡핑하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 Cys802를 탈캡핑하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 방법은 Cys801 및 Cys802를 탈캡핑하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
탈캡핑은 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 환원 완충제와 항온처리하고, 이후 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 산화 완충제와 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 항원-결합 분자를 생성시키는 방법의 몇몇 양태에서, 탈캡핑은 환원 완충제와 항온처리하기 전에 매트릭스 상에 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 고정시키는 단계 및 산화 완충제와 항온처리한 후에 매트릭스로부터 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 용리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
적합한 탈캡핑 및 접합 조건, 예컨대 환원 완충제, 산화 완충제, 농도, pH, 시간 및 매트릭스는 "접합된 면역글로불린의 생성"의 표제의 부문에 개시되어 있고, 본 명세서에서 동등하게 적용 가능하다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 제1 티올 반응성 화합물을 Cys801에 접합시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 티올 반응성 기를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 제2 티올 반응성 화합물을 Cys802에 접합시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 기를 포함한다. 훨씬 다른 양태에서, 상기 방법은 제1 티올 반응성 화합물을 Cys801에 그리고 제2 티올 반응성 화합물을 Cys802에 접합시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 티올 반응성 기를 포함하고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 기를 포함한다.
상기 방법은 탈캡핑 및 접합 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은, 항온처리 단계 전에, 하기를 추가로 포함할 수 있다:
Cys801, Cys802, 또는 둘 다를 탈캡핑하는 단계; 및
제1 티올 반응성 화합물을 Cys801에 접합하거나, 제2 티올 반응성 화합물을 Cys802에 접합하거나, 또는 둘 다인 단계(여기서, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 티올 반응성 기를 포함하고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 기를 포함함).
제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 키메라화될 수 있다. 반대로, 상기 방법은 제1 면역글로불린을 키메라화하는 것, 제2 면역글로불린을 키메라화하는 것, 또는 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린 둘 다를 키메라화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제한으로 의도되지 않으면서, 상기 방법은, 항온처리 단계 전에, 하기를 추가로 포함할 수 있다:
Cys801을 포함하는 제1 면역글로불린을 키메라화하여 제1 키메라 면역글로불린을 생성하는 단계;
Cys802를 포함하는 제2 면역글로불린을 키메라화하여 제2 키메라 면역글로불린을 생성하는 단계;
Cys801, Cys802, 또는 둘 다를 탈캡핑하는 단계; 및
제1 티올 반응성 화합물을 Cys801에 접합하거나, 제2 티올 반응성 화합물을 Cys802에 접합하거나, 또는 둘 다인 단계(여기서, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 티올 반응성 기를 포함하고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 기를 포함함).
제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 인간화될 수 있다. 반대로, 상기 방법은 제1 면역글로불린을 인간화하는 것, 제2 면역글로불린을 인간화하는 것, 또는 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린 둘 다를 인간화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제한으로 의도되지 않으면서, 상기 방법은, 항온처리 단계 전에, 하기를 추가로 포함할 수 있다:
Cys801을 포함하는 제1 면역글로불린을 인간화하여 제1 인간화된 면역글로불린을 생성하는 단계;
Cys802를 포함하는 제2 면역글로불린을 인간화하여 제2 인간화된 면역글로불린을 생성하는 단계;
Cys801, Cys802, 또는 둘 다를 탈캡핑하는 단계; 및
제1 티올 반응성 화합물을 Cys801에 접합하거나, 제2 티올 반응성 화합물을 Cys802에 접합하거나, 또는 둘 다인 단계(여기서, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 티올 반응성 기를 포함하고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 기를 포함함).
바람직하게는, 제1 및 제2 티올 반응성 화합물은 제1 티올 반응성 기 및 제2 티올 반응성 기를 통해 각각 Cys801 및 Cys802에 접합된다. 적합한, 티올 반응성 기는 할로아세틸, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴화제, 비닐설폰, 피리딜 다이설파이드, TNB-티올 및 다이설파이드 환원제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 말레이미드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 할로아세틸을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 아지리딘을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 아크릴로일을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 아릴화제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 비닐설폰을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 피리딜 다이설파이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 TNB-티올을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 다이설파이드 환원제를 포함할 수 있다.
제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 링커에 부착될 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 티올 반응성 기는 링커("제1 링커")에 부착될 수 있다. 몇몇 양태에서, 제2 티올 반응성 기는 링커("제2 링커")에 부착될 수 있다. 훨씬 다른 양태에서, 제1 티올 반응성 기는 제1 링커에 부착될 수 있고, 제2 티올 반응성 기는 제2 링커에 부착될 수 있다. 적합한 제1 링커 및 제2 링커는 절단 불가 링커 또는 절단 가능 링커일 수 있다. 예시적인 제1 링커 및 제2 링커는 예를 들어 다이설파이드 함유 링커, 아세탈계 링커 및 케탈계 링커를 포함한다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 절단 불가 링커일 수 있다. 적합한 절단 불가 링커는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 알킬을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 PEG를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 절단 가능 링커일 수 있다. 적합한 절단 가능 링커는 예를 들어 발린-시트룰린-파라 아미노벤질을 포함한다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 다이설파이드 함유 링커일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 아세탈계 링커일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 케탈계 링커일 수 있다. 티올 반응성 기에 공유로 부착된 링커의 예는 예를 들어 미국 공보 제20140050746호에 제공된다.
제1 티올 반응성 화합물, 제2 티올 반응성 화합물, 또는 둘 다는 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 티올 반응성 화합물은 작용제("제1 작용제")를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 제2 티올 반응성 화합물은 작용제("제2 작용제")를 추가로 포함할 수 있다. 훨씬 다른 양태에서, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 작용제를 를 추가로 포함할 수 있고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 작용제를 추가로 포함할 수 있다.
적합한 작용제는 예를 들어 화학 링커를 포함한다. 바람직하게는, 제1 티올 반응성 화합물의 화학 링커("제1 화학 링커") 및 제2 티올 반응성 화합물의 화학 링커("제2 화학 링커")는 커플링될 수 있다. 예를 들어, 제한으로 의도되지 않으면서, 제1 화학 링커 또는 제2 화학 링커의 하나는 다이벤질사이클로옥틴(DBCO)일 수 있고, 제1 화학 링커 또는 제2 화학 링커의 다른 하나는 아지드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 제1 화학 링커는 DBCO일 수 있고, 제2 화학 링커는 아지드일 수 있다. 반대로, 제1 화학 링커는 아지드일 수 있고, 제2 화학 링커는 DBCO일 수 있다. DBCO 및 아지드는 커플링될 수 있고, 이것은 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린의 접합을 발생시킨다. 예를 들어, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 클릭 화학에 의해 서로에 접합될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-아지드 및 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들어 제1 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-아지드일 수 있고, 제2 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴일 수 있고, 제2 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-아지드일 수 있다.
제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 Fab일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린은 Fab("제1 Fab")일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제2 면역글로불린은 Fab("제2 Fab")일 수 있다. 훨씬 다른 실시형태에서, 제1 면역글로불린은 제1 Fab일 수 있고, 제2 면역글로불린은 제2 Fab일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 항온처리 전에, 제1 Fab, 제2 Fab, 또는 둘 다를 생성하는 단계를 포함한다. Fab를 생성하기에 적합한 기법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 완전 또는 부분 면역글로불린을 분해하여 Fab를 생성하는 것 또는 Fab로서 면역글로불린을 재조합으로 발현하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항원-결합 분자를 생성시키는 방법은, 항온처리 전에, 하기를 추가로 포함할 수 있다:
제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 파파인에 의해 분해하여 제1 Fab, 제2 Fab, 또는 제1 Fab 및 제2 Fab를 생성하는 단계(여기서, 제1 면역글로불린은 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 포함하고, 제1 경쇄는 80번 위치에 시스테인("Cys801")을 가지고, 제2 면역글로불린은 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, 제2 경쇄는 80번 위치에 시스테인("Cys802")을 가짐); 또는
80번 위치에 시스테인(Cys801)을 가지는 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 포함하는 제1 Fab를 재조합으로 발현시키거나, 80번 위치에 시스테인(Cys802)을 가지는 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하는 제2 Fab를 재조합으로 발현시키거나, 또는 둘 다인 단계; 및
Cys801에서의 제1 Fab를 제1 티올 반응성 화합물에 접합하여 제1 접합된 Fab를 생성하거나, Cys802에서의 제2 Fab를 제2 티올 반응성 화합물에 접합하여 제2 접합된 Fab를 생성하거나, 또는 둘 다인 단계.
항원-결합 분자를 생성시키는 방법은 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 항원-결합 분자를 생성시키는 방법은 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 항원-결합 분자를 생성시키는 방법은 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것 및 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 알라닌("Ala83"), 발린("Val83"), 아이소류신("Ile83"), 트레오닌("Thr83"), 아르기닌("Arg83"), 아스파라긴("Asn83"), 아스파르트산("Asp83"), 글루탐산("Glu83"), 글루타민("Gln83"), 글라이신("Gly83"), 히스티딘("His83"), 류신("Leu83"), 메티오닌("Met83"), 프롤린("Pro83"), 세린("Ser83"), 트립토판("Trp83") 또는 타이로신("Tyr83")에 의해 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 또는 제1 경쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것을 포함할 수 있다.
제1 경쇄 가변 영역에서의 83번 위치에서의 아미노산은 제2 경쇄 가변 영역에서의 83번 위치에서의 아미노산과 동일할 수 있다. 반대로, 제1 경쇄 가변 영역에서의 83번 위치에서의 아미노산 영역은 제2 경쇄 가변 영역에서의 83번 위치에서의 극성 또는 소수성 아미노산과 상이할 수 있다. 제1 경쇄 가변 영역에서의 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 및/또는 제2 경쇄 가변 영역에서의 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 극성 또는 소수성 아미노산, 예컨대 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌(이들로 제한되지는 않음)일 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 발린("Val83")에 의해 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 또는 제1 경쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 아이소류신("Ile83")에 의해 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 또는 제1 경쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 트레오닌("Thr83")에 의해 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 또는 제1 경쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것을 포함할 수 있다. 제1 경쇄 가변 영역 영역에서의 83번 위치에서의 극성 또는 소수성 아미노산은 제2 경쇄 가변 영역에서의 83번 위치에서의 극성 또는 소수성 아미노산과 동일하거나 상이할 수 있다.
적합한 경쇄 가변 영역은 예를 들어 카파 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Cys801, Cys802, 또는 둘 다는 네이티브 경쇄 가변 영역에 존재할 수 있다. 제1 경쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역은 토끼로부터 유래된다. 제1 경쇄 가변 영역, 제2 경쇄 가변 영역, 또는 둘 다가 유래될 수 있는 예시적인 토끼는 오릭톨라구스 쿠니쿠루스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 양태에서, 예를 들어 경쇄 가변 영역(들)은 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 경쇄 가변 영역(들)은 b9 토끼로부터 유래될 수 있다.
접합된 면역글로불린의 면역글로불린 화합물
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린이 본 명세서에 개시되고, 경쇄 가변 영역은 80번 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가진다.
적합한 경쇄 가변 영역은 예를 들어 카파 경쇄 가변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 토끼로부터 유래된다. 몇몇 실시형태에서, Cys80은 토끼 면역글로불린의 네이티브 경쇄 가변 영역에 존재할 수 있다. Cys80을 가지는 경쇄 가변 영역이 유래될 수 있는 예시적인 토끼는 오릭톨라구스 쿠니쿠루스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 양태에서, 예를 들어 경쇄 가변 영역은 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 경쇄 가변 영역은 b9 토끼로부터 유래될 수 있다.
83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 알라닌("Ala83"), 발린("Val83"), 아이소류신("Ile83"), 트레오닌("Thr83"), 아르기닌("Arg83"), 아스파라긴("Asn83"), 아스파르트산("Asp83"), 글루탐산("Glu83"), 글루타민("Gln83"), 글라이신("Gly83"), 히스티딘("His83"), 류신("Leu83"), 메티오닌("Met83"), 프롤린("Pro83"), 세린("Ser83"), 트립토판("Trp83") 또는 타이로신("Tyr83")을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 극성 또는 소수성 아미노산, 예컨대 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌(이들로 제한되지는 않음)일 수 있다. 몇몇 양태에서, 83번 위치에서의 Phe 이외의 극성 또는 소수성 아미노산은 알라닌("Ala83")이다. 몇몇 양태에서, 83번 위치에서의 Phe 이외의 극성 또는 소수성 아미노산은 발린("Val83")이다. 몇몇 양태에서, 83번 위치에서의 Phe 이외의 극성 또는 소수성 아미노산은 아이소류신("Ile83")이다. 몇몇 양태에서, 83번 위치에서의 Phe 이외의 극성 또는 소수성 아미노산은 트레오닌("Thr83")이다.
Cys80은 짝을 이루지 못할 수 있다. 예를 들어, Cys80을 가지는 경쇄 가변 영역은 171번 위치에서 시스테인 이외의 아미노산 잔기를 가지는 불변 도메인에 의해 키메라화될 수 있다.
바람직하게는, Cys80은 탈캡핑된다.
몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 키메라화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역글로불린은 인간화될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 개시된 면역글로불린은 인간 CA9에 면역특이적으로 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 CA9에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 하기를 포함한다:
a. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
f. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역.
몇몇 실시형태에서, 인간 CA9에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 하기를 포함한다:
a. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
b. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
c. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
d. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
e. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역; 또는
f. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역.
몇몇 실시형태에서, 인간 CA9에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 하기를 포함한다:
a. 각각 서열 번호 146, 148 및 150에 기재된 xi155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 224, 226 및 228에 기재된 xi155D5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
b. 각각 서열 번호 152, 154 및 156에 기재된 zu155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 242, 244 및 246에 기재된 zu155D5LC-3, 각각 서열 번호 248, 250 및 252에 기재된 zu155D5LC-4, 각각 서열 번호 254, 256 및 258에 기재된 zu155D5LC-5, 각각 서열 번호 260, 262 및 264에 기재된 zu155D5LC-6, 각각 서열 번호 266, 268 및 270에 기재된 zu155D5LC-7, 각각 서열 번호 278, 280 및 282에 기재된 zu155D5LC-huVK2-40, 각각 서열 번호 290, 292 및 294에 기재된 zu155D5LC-huVK4-1, 각각 서열 번호 296, 298 및 300에 기재된 zu155D5LC-huVK6-21, 각각 서열 번호 302, 304 및 306에 기재된 zu155D5LC-huVK6D-41; 또는 각각 서열 번호 308, 310 및 312에 기재된 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
c. 각각 서열 번호 164, 166 및 168에 기재된 xi1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 각각 서열 번호 320, 322 및 324에 기재된 xi1E4LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
d. 각각 서열 번호 170, 172 및 174에 기재된 zu1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 332, 334 및 336에 기재된 zu1E4LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
e. 각각 서열 번호 212, 214 및 216에 기재된 xi166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 각각 서열 번호 386, 388 및 390에 기재된 xi166B3LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
f. 각각 서열 번호 218, 220 및 222에 기재된 zu166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 398, 400 및 402에 기재된 zu166B3LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
몇몇 실시형태에서, 개시된 면역글로불린은 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 각각 서열 번호 158, 160 및 162에 기재된 xi1-55-2HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 314, 316 및 318에 기재된 xi1-55-2LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 개시된 면역글로불린은 인간 메소텔린에 면역특이적으로 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 인간 메소텔린에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 하기를 포함한다:
a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역.
몇몇 실시형태에서, 인간 메소텔린에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 하기를 포함한다:
a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역; 또는
f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역.
몇몇 실시형태에서, 인간 메소텔린에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 하기를 포함한다:
a. 각각 서열 번호 176, 178 및 180에 기재된 xi33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 338, 340 및 342에 기재된 xi33O11LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
b. 각각 서열 번호 182, 184 및 186에 기재된 zu33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 350, 352 및 354에 기재된 zu33O11LC-CXXA 또는 각각 서열 번호 356, 358 및 360에 기재된 zu33O11LC-CXXI의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
c. 각각 서열 번호 188, 190 및 192에 기재된 xi324O5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 362, 364 및 366에 기재된 xi324O5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
d. 각각 서열 번호 194, 196 및 198에 기재된 xi178F16HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 368, 370 및 372에 기재된 xi178F16LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
e. 각각 서열 번호 200, 202 및 204에 기재된 xi237N18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 374, 376 및 378에 기재된 xi237N18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
f. 각각 서열 번호 206, 208 및 210에 기재된 xi383I18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 380, 382 및 384에 기재된 xi383I18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
접합된 면역글로불린
본 명세서에 개시된 임의의 면역글로불린을 포함하는 접합된 면역글로불린이 본 명세서에 또한 개시되고, 80번 위치에서의 시스테인("Cys80")은 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 Cys80 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가지고, Cys80은 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 Cys80 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 극성 또는 소수성 아미노산을 가질 수 있다.
면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 적합한 경쇄 가변 영역은 예를 들어 카파 경쇄 가변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 토끼로부터 유래된다. 몇몇 실시형태에서, Cys80은 토끼 면역글로불린의 네이티브 경쇄 가변 영역에 존재할 수 있다. Cys80을 가지는 경쇄 가변 영역이 유래될 수 있는 예시적인 토끼는 오릭톨라구스 쿠니쿠루스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 양태에서, 예를 들어 경쇄 가변 영역은 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 경쇄 가변 영역은 b9 토끼로부터 유래될 수 있다.
경쇄 가변 영역은 Cys80 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가질 수 있다. 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 알라닌("Ala83"), 발린("Val83"), 아이소류신("Ile83"), 트레오닌("Thr83"), 아르기닌("Arg83"), 아스파라긴("Asn83"), 아스파르트산("Asp83"), 글루탐산("Glu83"), 글루타민("Gln83"), 글라이신("Gly83"), 히스티딘("His83"), 류신("Leu83"), 메티오닌("Met83"), 프롤린("Pro83"), 세린("Ser83"), 트립토판("Trp83") 또는 타이로신("Tyr83")을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 Cys80 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 극성 또는 소수성 아미노산을 가질 수 있다. 적합한 극성 또는 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 양태에서, 83번 위치에서의 Phe 이외의 극성 또는 소수성 아미노산은 알라닌("Ala83")이다. 몇몇 양태에서, 83번 위치에서의 Phe 이외의 극성 또는 소수성 아미노산은 발린("Val83")이다. 몇몇 양태에서, 83번 위치에서의 Phe 이외의 극성 또는 소수성 아미노산은 아이소류신("Ile83")이다. 몇몇 양태에서, 83번 위치에서의 Phe 이외의 극성 또는 소수성 아미노산은 트레오닌("Thr83")이다.
Cys80은 짝을 이루지 못할 수 있다. 예를 들어, Cys80을 가지는 경쇄 가변 영역은 171번 위치에서 시스테인 이외의 아미노산 잔기를 가지는 불변 도메인에 의해 키메라화될 수 있다.
바람직하게는, Cys80은 탈캡핑된다.
몇몇 실시형태에서, 면역글로불린은 키메라화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역글로불린은 인간화될 수 있다.
바람직하게는, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 통해 Cys80에 접합된다. 티올 반응성 기는 할로아세틸, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴화제, 비닐설폰, 피리딜 다이설파이드, TNB-티올 및 다이설파이드 환원제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 말레이미드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 할로아세틸을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 아지리딘을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 아크릴로일을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 아릴화제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 비닐설폰을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 피리딜 다이설파이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 TNB-티올을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티올 반응성 기는 다이설파이드 환원제를 포함할 수 있다.
티올 반응성 기는 링커에 부착될 수 있다. 링커는 절단 불가 링커 또는 절단 가능 링커일 수 있다. 예시적인 링커는 예를 들어 다이설파이드 함유 링커, 아세탈계 링커 및 케탈계 링커를 포함한다. 몇몇 양태에서, 링커는 절단 불가 링커일 수 있다. 적합한 절단 불가 링커는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 알킬을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 링커는 PEG를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 링커는 절단 가능 링커일 수 있다. 적합한 절단 가능 링커는 예를 들어 발린-시트룰린-파라 아미노벤질을 포함한다. 몇몇 양태에서, 링커는 다이설파이드 함유 링커일 수 있다. 몇몇 양태에서, 링커는 아세탈계 링커일 수 있다. 몇몇 양태에서, 링커는 케탈계 링커일 수 있다. 티올 반응성 기에 공유로 부착된 링커의 예는 예를 들어 미국 공보 제20140050746호에 제공된다.
티올 반응성 화합물은 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 작용제는 예를 들어 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 및 약물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 작용제는 형광단을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 형광성 염료를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 면역글로불린을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 항생제를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 핵산(예컨대, DNA 또는 RNA)을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 화학 링커(예를 들어, 다이벤질사이클로옥틴 (DBCO) 또는 아지드)를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 소분자를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 킬레이터(예를 들어, 무엇보다도 DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA)를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 지질을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 약물을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 임의의 상기 기재된 작용제의 조합을 포함할 수 있다.
따라서, 개시된 접합된 면역글로불린은 면역글로불린-형광단 Cys80 접합체, 면역글로불린-형광성 염료 Cys80 접합체, 면역글로불린-폴리펩타이드 Cys80 접합체, 면역글로불린-면역글로불린 Cys80 접합체, 면역글로불린-항생제 Cys80 접합체, 면역글로불린-핵산 Cys80 접합체, 면역글로불린-방사성 핵종 Cys80 접합체, 면역글로불린-화학 링커 Cys80 접합체, 면역글로불린-소분자 Cys80 접합체, 면역글로불린-킬레이터 Cys80 접합체, 면역글로불린-지질 Cys80 접합체 및 면역글로불린-약물 Cys80 접합체를 포함한다.
본 명세서에 개시된 임의의 면역글로불린은 본 명세서에 개시된 임의의 작용제에 접합될 수 있다. 예를 들어, 접합된 면역글로불린은 인간 CA9에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린 및 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-형광단 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-형광성 염료 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-폴리펩타이드 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-면역글로불린 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-항생제 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-핵산 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-방사성 핵종 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-화학 링커 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-소분자 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-킬레이터 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-지질 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 CA9-약물 Cys80 접합체이다.
Cys80에서 임의의 상기 작용제에 접합될 수 있는, 인간 CA9에 면역특이적으로 결합하는, 적합한 면역글로불린은 하기를 포함한다:
a. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
f. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
g. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
h. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
i. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
j. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
k. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC의 20 내지 130번 아미노산(서열 번호 132)에 기재된 경쇄 가변 영역;
l. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
m. 각각 서열 번호 146, 148 및 150에 기재된 xi155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 224, 226 및 228에 기재된 xi155D5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
n. 각각 서열 번호 152, 154 및 156에 기재된 zu155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 242, 244 및 246에 기재된 zu155D5LC-3, 각각 서열 번호 248, 250 및 252에 기재된 zu155D5LC-4, 각각 서열 번호 254, 256 및 258에 기재된 zu155D5LC-5, 각각 서열 번호 260, 262 및 264에 기재된 zu155D5LC-6, 각각 서열 번호 266, 268 및 270에 기재된 zu155D5LC-7, 각각 서열 번호 278, 280 및 282에 기재된 zu155D5LC-huVK2-40, 각각 서열 번호 290, 292 및 294에 기재된 zu155D5LC-huVK4-1, 각각 서열 번호 296, 298 및 300에 기재된 zu155D5LC-huVK6-21, 각각 서열 번호 302, 304 및 306에 기재된 zu155D5LC-huVK6D-41; 또는 각각 서열 번호 308, 310 및 312에 기재된 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
o. 각각 서열 번호 164, 166 및 168에 기재된 xi1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 320, 322 및 324에 기재된 xi1E4LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
p. 각각 서열 번호 170, 172 및 174에 기재된 zu1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 332, 334 및 336에 기재된 zu1E4LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
q. 각각 서열 번호 212, 214 및 216에 기재된 xi166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 386, 388 및 390에 기재된 xi166B3LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
r. 각각 서열 번호 218, 220 및 222에 기재된 zu166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 398, 400 및 402에 기재된 zu166B3LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
접합된 면역글로불린은 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린 및 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-형광단 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-형광성 염료 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-폴리펩타이드 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-면역글로불린 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-항생제 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-핵산 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-방사성 핵종 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-화학 링커 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-소분자 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-킬레이터 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-지질 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 TEM1-약물 Cys80 접합체이다.
Cys80에서 임의의 상기 작용제에 접합될 수 있는, 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합하는, 적합한 면역글로불린은 하기를 포함한다:
a. xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역; 또는
c. 각각 서열 번호 158, 160 및 162에 기재된 xi1-55-2HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 314, 316 및 318에 기재된 xi1-55-2LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
접합된 면역글로불린은 인간 MSLN에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린 및 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-형광단 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-형광성 염료 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-폴리펩타이드 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-면역글로불린 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-항생제 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-핵산 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-방사성 핵종 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-화학 링커 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-소분자 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-킬레이터 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-지질 Cys80 접합체이다. 몇몇 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 MSLN-약물 Cys80 접합체이다.
Cys80에서 임의의 상기 작용제에 접합될 수 있는, 인간 MSLN에 면역특이적으로 결합하는, 적합한 면역글로불린은 하기를 포함한다:
a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
g. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
h. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
i. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
j. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
k. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
l. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
m. 각각 서열 번호 176, 178 및 180에 기재된 xi33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 338, 340 및 342에 기재된 xi33O11LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
n. 각각 서열 번호 182, 184 및 186에 기재된 zu33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 350, 352 및 354에 기재된 zu33O11LC-CXXA 또는 각각 서열 번호 356, 358 및 360에 기재된 zu33O11LC-CXXI의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
o. 각각 서열 번호 188, 190 및 192에 기재된 xi324O5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 362, 364 및 366에 기재된 xi324O5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
p. 각각 서열 번호 194, 196 및 198에 기재된 xi178F16HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 368, 370 및 372에 기재된 xi178F16LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
q. 각각 서열 번호 200, 202 및 204에 기재된 xi237N18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 374, 376 및 378에 기재된 xi237N18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
r. 각각 서열 번호 206, 208 및 210에 기재된 xi383I18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 380, 382 및 384에 기재된 xi383I18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
몇몇 실시형태에서, 인간 MSLN에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린은 소분자 항신생물제, 예컨대 아우리스타틴에 접합될 수 있다. 몇몇 양태에서, 작용제는 아우리스타틴 F(AuF)일 수 있다. 따라서, 개시된 접합된 면역글로불린은 인간 MSLN에 면역특이적으로 결합하는 임의의 상기 개시된 면역글로불린을 포함하고, 면역글로불린은 아우리스타틴 F에 접합된다(MSLN-AuF Cys80 접합체).
면역글로불린이 2개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 실시형태에서, 접합된 면역글로불린은 2:1의 면역글로불린:작용제 비율을 가질 수 있고, 각각의 경쇄는 Cys80에서 접합된 작용제를 가진다.
항원-결합 분자
하기를 포함하는 항원-결합 분자가 본 명세서에서 추가로 제공된다:
제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 접합된 면역글로불린(여기서, 제1 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys801")을 가지고, Cys801은 제1 티올 반응성 기를 포함하는 제1 티올 반응성 화합물에 접합됨), 및
제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 접합된 면역글로불린(여기서, 제2 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys802")을 가지고, Cys802는 제2 티올 반응성 기를 포함하는 제2 티올 반응성 화합물에 접합됨).
제1 접합된 면역글로불린 및 제2 접합된 면역글로불린은 본 명세서에 개시된 접합된 면역글로불린 중 임의의 하나일 수 있다.
적합한 경쇄 가변 영역은 예를 들어 카파 경쇄 가변 영역을 포함한다. 제1 경쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역은 토끼로부터 유래된다. 몇몇 실시형태에서, Cys801, Cys802, 또는 둘 다는 토끼 면역글로불린의 네이티브 경쇄 가변 영역에 존재할 수 있다. 제1 경쇄 가변 영역, 제2 경쇄 가변 영역, 또는 둘 다가 유래될 수 있는 예시적인 토끼는 오릭톨라구스 쿠니쿠루스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 양태에서, 예를 들어 경쇄 가변 영역(들)은 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 경쇄 가변 영역(들)은 b9 토끼로부터 유래될 수 있다.
Cys801, Cys802, 또는 둘 다는 짝을 이루지 못할 수 있다. Cys801 및/또는 Cys802를 짝을 이루지 못하게 하기 위한 적합한 수단은 예를 들어 171번 위치에서 시스테인 이외의 아미노산 잔기를 가지는 불변 도메인에 의해 Cys80을 가지는 경쇄 가변 영역(제1 경쇄 가변 영역, 제2 경쇄 가변 영역, 또는 둘 다)을 키메라화하는 것을 포함한다.
제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 키메라화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린은 키메라화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제2 면역글로불린은 키메라화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 키메라화될 수 있다.
제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 인간화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린은 인간화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제2 면역글로불린은 인간화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 인간화될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린은 키메라화될 수 있고, 제2 면역글로불린은 인간화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린은 인간화될 수 있고, 제2 면역글로불린은 키메라화될 수 있다.
제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은, 83번 위치에서의 아미노산이 Phe인 경우, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산일 수 있다. 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은, 83번 위치에서의 아미노산이 Phe인 경우, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산일 수 있다. 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은, 83번 위치에서의 아미노산이 Phe인 경우, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산일 수 있고, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은, 83번 위치에서의 아미노산이 Phe인 경우, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산일 수 있다. 제1 경쇄 가변 영역 및/또는 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은 알라닌("Ala83"), 발린("Val83"), 아이소류신("Ile83"), 트레오닌("Thr83"), 아르기닌("Arg83"), 아스파라긴("Asn83"), 아스파르트산("Asp83"), 글루탐산("Glu83"), 글루타민("Gln83"), 글라이신("Gly83"), 히스티딘("His83"), 류신("Leu83"), 메티오닌("Met83"), 프롤린("Pro83"), 세린("Ser83"), 트립토판("Trp83") 또는 타이로신("Tyr83")일 수 있다. 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산과 동일할 수 있다. 반대로, 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산과 상이할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은, 83번 위치에서의 아미노산이 Phe인 경우, Phe 이외의 극성 또는 소수성 잔기일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은, 83번 위치에서의 아미노산이 Phe인 경우, Phe 이외의 극성 또는 소수성 잔기일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은, 83번 위치에서의 아미노산이 Phe인 경우, Phe 이외의 극성 또는 소수성 잔기일 수 있고, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은, 83번 위치에서의 아미노산이 Phe인 경우, Phe 이외의 극성 또는 소수성 잔기일 수 있다. 적합한 극성 또는 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 아이소류신 또는 트레오닌을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 양태에서, 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산, 또는 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산 및 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은 알라닌("Ala83")일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산, 또는 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산 및 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은 발린("Val83")일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산, 또는 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산 및 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은 아이소류신("Ile83")일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산, 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산, 또는 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산 및 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산은 트레오닌("Thr83")일 수 있다. 제1 경쇄 가변 영역에서의 83번 위치에서의 극성 또는 소수성 아미노산은 제2 경쇄 가변 영역에서의 83번 위치에서의 극성 또는 소수성 아미노산와 동일하거나 상이할 수 있다.
제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 동일한 항원에 결합할 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 양태에서, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 인간 CA9에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있고, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물 중 임의의 하나에 접합된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있고, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물 중 임의의 하나에 접합된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 인간 MSLN에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있고, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물 중 임의의 하나에 접합된다.
제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 상이한 항원에 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 제1 접합된 면역글로불린은 인간 CA9에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있고, 인간 CA9에 결합하는 제1 면역글로불린은 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물 중 임의의 하나에 접합되지만, 제2 면역글로불린은 인간 TEM1 또는 인간 MSLN에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 제2 면역글로불린은 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물 중 임의의 하나에 접합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 접합된 면역글로불린은 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있고, 면역글로불린은 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물 중 임의의 하나에 접합되지만, 제2 면역글로불린은 인간 CA9 또는 인간 MSLN에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 제2 면역글로불린은 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물 중 임의의 하나에 접합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 접합된 면역글로불린은 인간 MSLN에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있고, 면역글로불린은 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물 중 임의의 하나에 접합되지만, 제2 면역글로불린은 인간 CA9 또는 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 제2 면역글로불린은 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물 중 임의의 하나에 접합될 수 있다.
적합한 티올 반응성 기는 할로아세틸, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴화제, 비닐설폰, 피리딜 다이설파이드, TNB-티올 및 다이설파이드 환원제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 말레이미드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 할로아세틸을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 아지리딘을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 아크릴로일을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 아릴화제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 비닐설폰을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 피리딜 다이설파이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 TNB-티올을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 다이설파이드 환원제를 포함할 수 있다.
제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 링커에 부착될 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 티올 반응성 기는 링커("제1 링커")에 부착될 수 있다. 몇몇 양태에서, 제2 티올 반응성 기는 링커("제2 링커")에 부착될 수 있다. 훨씬 다른 양태에서, 제1 티올 반응성 기는 제1 링커에 부착될 수 있고, 제2 티올 반응성 기는 제2 링커에 부착될 수 있다. 적합한 제1 링커 및 제2 링커는 절단 불가 링커 또는 절단 가능 링커일 수 있다. 예시적인 제1 링커 및 제2 링커는 예를 들어 다이설파이드 함유 링커, 아세탈계 링커 및 케탈계 링커를 포함한다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 절단 불가 링커일 수 있다. 적합한 절단 불가 링커는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 알킬을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 PEG를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 절단 가능 링커일 수 있다. 적합한 절단 가능 링커는 예를 들어 발린-시트룰린-파라 아미노벤질을 포함한다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 다이설파이드 함유 링커일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 아세탈계 링커일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 케탈계 링커일 수 있다. 티올 반응성 기에 공유로 부착된 링커의 예는 예를 들어 미국 공보 제20140050746호에 제공된다.
제1 티올 반응성 화합물, 제2 티올 반응성 화합물, 또는 둘 다는 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 티올 반응성 화합물은 작용제("제1 작용제")를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 제2 티올 반응성 화합물은 작용제("제2 작용제")를 추가로 포함할 수 있다. 훨씬 다른 양태에서, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 작용제를 추가로 포함할 수 있고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 작용제를 추가로 포함할 수 있다.
적합한 작용제는 예를 들어 화학 링커를 포함한다. 바람직하게는, 제1 티올 반응성 화합물의 화학 링커("제1 화학 링커") 및 제2 티올 반응성 화합물의 화학 링커("제2 화학 링커")는 커플링될 수 있다. 예를 들어, 제한으로 의도되지 않으면서, 제1 화학 링커 또는 제2 화학 링커 중 하나는 다이벤질사이클로옥틴(DBCO)일 수 있고, 제1 화학 링커 또는 제2 화학 링커 중 다른 하나는 아지드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 제1 화학 링커는 DBCO일 수 있고, 제2 화학 링커는 아지드일 수 있다. 반대로, 제1 화학 링커는 아지드일 수 있고, 제2 화학 링커는 DBCO일 수 있다. DBCO 및 아지드는 커플링될 수 있고, 이것은 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린의 접합을 발생시킨다. 예를 들어, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 클릭 화학에 의해 서로에 접합될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-아지드 및 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들어 제1 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-아지드일 수 있고, 제2 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제1 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴일 수 있고, 제2 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-아지드일 수 있다. 따라서, 제1 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 화합물과 다를 수 있다.
제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 Fab일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 면역글로불린은 Fab("제1 Fab")일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제2 면역글로불린은 Fab("제2 Fab")일 수 있다. 훨씬 다른 실시형태에서, 제1 면역글로불린은 제1 Fab일 수 있고, 제2 면역글로불린은 제2 Fab일 수 있다.
대상체에서 암을 치료하는 방법
약제학적 유효량의 접합된 메소텔린 면역글로불린을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되고, 접합된 메소텔린 면역글로불린은 하기를 포함한다:
본 명세서에 개시된 임의의 접합된 메소텔린 면역글로불린, 및
티올 반응성 기, 링커 및 작용제를 포함하는 티올 반응성 화합물.
개시된 접합된 면역글로불린에 관련한 임의의 특징, 특성 및 실시형태가 암을 치료하는 개시된 방법에서 사용된 접합된 면역글로불린에 동등하게 적용 가능한 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 개시된 방법은 약제학적 유효량의 접합된 메소텔린 면역글로불린을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 접합된 메소텔린 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 80번 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가지고, Cys80은 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기, 링커 및 작용제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 극성 또는 소수성 아미노산이다.
바람직하게는, 암은 메소텔린 발현 암이다. 몇몇 실시형태에서, 개시된 방법에서 사용하기 위한 접합된 항체는 하기를 포함할 수 있다:
a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역.
항체 (a)-(f)는 다수의 적합한 티올 반응성 화합물, 예컨대 작용제로서 항신생물제, 예컨대 아우리스타틴을 가지는 것(이들로 제한되지는 않음)에 접합될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 약제학적 유효량의 접합된 면역글로불린을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 접합된 면역글로불린은 면역글로불린 (a)-(f) 중 하나 이상을 포함하고, 각각은 아우리스타틴 F를 포함하는 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 Cys80에서 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에 접합된다.
몇몇 실시형태에서, 개시된 방법에서 사용하기 위한 접합된 항체는 하기를 포함할 수 있다:
a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역; 또는
f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역.
항체 (a)-(f)는 다수의 적합한 티올 반응성 화합물, 예컨대 작용제로서 항신생물제, 예컨대 아우리스타틴을 가지는 것(이들로 제한되지는 않음)에 접합될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 약제학적 유효량의 접합된 면역글로불린을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 접합된 면역글로불린은 면역글로불린 (a)-(f) 중 하나 이상을 포함하고, 각각은 아우리스타틴 F를 포함하는 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 Cys80에서 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에 접합된다.
몇몇 실시형태에서, 개시된 방법에서 사용하기 위한 접합된 항체는 하기를 포함할 수 있다:
a. 각각 서열 번호 176, 178 및 180에 기재된 xi33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 338, 340 및 342에 기재된 xi33O11LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
b. 각각 서열 번호 182, 184 및 186에 기재된 zu33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 350, 352 및 354에 기재된 zu33O11LC-CXXA 또는 각각 서열 번호 356, 358 및 360에 기재된 zu33O11LC-CXXI의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
c. 각각 서열 번호 188, 190 및 192에 기재된 xi324O5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 362, 364 및 366에 기재된 xi324O5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
d. 각각 서열 번호 194, 196 및 198에 기재된 xi178F16HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 368, 370 및 372에 기재된 xi178F16LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
e. 각각 서열 번호 200, 202 및 204에 기재된 xi237N18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 374, 376 및 378에 기재된 xi237N18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
f. 각각 서열 번호 206, 208 및 210에 기재된 xi383I18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 380, 382 및 384에 기재된 xi383I18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
항체 (a)-(f)는 다수의 적합한 티올 반응성 화합물, 예컨대 작용제로서 항신생물제, 예컨대 아우리스타틴을 가지는 것(이들로 제한되지는 않음)에 접합될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 약제학적 유효량의 접합된 면역글로불린을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 접합된 면역글로불린은 면역글로불린 (a)-(f) 중 하나 이상을 포함하고, 각각은 아우리스타틴 F를 포함하는 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 Cys80에서 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에 접합된다.
암을 검출하는 방법
대상체에서 암을 검출하는 방법이 본 명세서에 또한 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 약제학적 유효량의 접합된 면역글로불린을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 접합된 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 80번 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가지고, Cys80은 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기, 링커 및 작용제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 극성 또는 소수성이다.
대안적으로, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 생물학적 샘플을 접합된 면역글로불린과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 접합된 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys80") 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가지고, Cys80은 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기, 링커 및 작용제를 포함한다. 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 극성 또는 소수성이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 생체외 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 생체내 수행될 수 있다.
작용제는 형광단 또는 형광성 염료이다.
본 명세서에 개시된 임의의 면역글로불린은 형광단 또는 형광성 염료에 접합되고, 암을 검출하는 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 암은 CA9를 발현하는 암이고, 접합된 면역글로불린은 하기를 포함하는 CA9-형광단 Cys80 접합체 또는 CA9-형광성 염료 Cys80 접합체이다:
a. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
f. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
g. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
h. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
i. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
j. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
k. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
l. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
m. 각각 서열 번호 146, 148 및 150에 기재된 xi155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 224, 226 및 228에 기재된 xi155D5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
n. 각각 서열 번호 152, 154 및 156에 기재된 zu155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 242, 244 및 246에 기재된 zu155D5LC-3, 각각 서열 번호 248, 250 및 252에 기재된 zu155D5LC-4, 각각 서열 번호 254, 256 및 258에 기재된 zu155D5LC-5, 각각 서열 번호 260, 262 및 264에 기재된 zu155D5LC-6, 각각 서열 번호 266, 268 및 270에 기재된 zu155D5LC-7, 각각 서열 번호 278, 280 및 282에 기재된 zu155D5LC-huVK2-40, 각각 서열 번호 290, 292 및 294에 기재된 zu155D5LC-huVK4-1, 각각 서열 번호 296, 298 및 300에 기재된 zu155D5LC-huVK6-21, 각각 서열 번호 302, 304 및 306에 기재된 zu155D5LC-huVK6D-41; 또는 각각 서열 번호 308, 310 및 312에 기재된 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
o. 각각 서열 번호 164, 166 및 168에 기재된 xi1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 320, 322 및 324에 기재된 xi1E4LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
p. 각각 서열 번호 170, 172 및 174에 기재된 zu1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 332, 334 및 336에 기재된 zu1E4LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
q. 각각 서열 번호 212, 214 및 216에 기재된 xi166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 386, 388 및 390에 기재된 xi166B3LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
r. 각각 서열 번호 218, 220 및 222에 기재된 zu166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 398, 400 및 402에 기재된 zu166B3LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
몇몇 실시형태에서, 암은 TEM1을 발현하는 암이고, 접합된 면역글로불린은 하기를 포함하는 TEM1-형광단 Cys80 접합체 또는 TEM1-형광성 염료 Cys80 접합체이다:
a. xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역; 또는
c. 각각 서열 번호 158, 160 및 162에 기재된 xi1-55-2HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 314, 316 및 318에 기재된 xi1-55-2LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
몇몇 실시형태에서, 암은 MSLN을 발현하는 암이고, 접합된 면역글로불린은 하기를 포함하는 MSLN-형광단 Cys80 접합체 또는 MSLN-형광성 염료 Cys80 접합체이다:
a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
g. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
h. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
i. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
j. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
k. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
l. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
m. 각각 서열 번호 176, 178 및 180에 기재된 xi33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 338, 340 및 342에 기재된 xi33O11LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
n. 각각 서열 번호 182, 184 및 186에 기재된 zu33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 350, 352 및 354에 기재된 zu33O11LC-CXXA 또는 각각 서열 번호 356, 358 및 360에 기재된 zu33O11LC-CXXI의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
o. 각각 서열 번호 188, 190 및 192에 기재된 xi324O5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 362, 364 및 366에 기재된 xi324O5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
p. 각각 서열 번호 194, 196 및 198에 기재된 xi178F16HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 368, 370 및 372에 기재된 xi178F16LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
q. 각각 서열 번호 200, 202 및 204에 기재된 xi237N18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 374, 376 및 378에 기재된 xi237N18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
r. 각각 서열 번호 206, 208 및 210에 기재된 xi383I18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 380, 382 및 384에 기재된 xi383I18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
면역글로불린에 대한 접합에 예시적인 형광단은 예를 들어 IRDye-800CW를 포함한다.
상기 방법은 대상체에게 접합된 면역글로불린을 투여하는 단계 또는 생물학적 샘플을 접합된 면역글로불린과 접촉시키는 단계 및 각각 대상체 또는 생물학적 샘플에 존재하는 항원(CA9, TEM1 또는 MSLN)에 대한 접합된 면역글로불린의 결합을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 검출 방법은 예를 들어 형광성 영상화를 포함한다. (예를 들어, 형광 신호의 방출을 통한) 항원에 대한 접합된 면역글로불린의 결합의 검출은 암을 표시한다.
약제학적 조성물
약제학적 조성물이 본 명세서에 또한 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 임의의 면역글로불린을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 임의의 접합된 면역글로불린을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 치료 또는 진단의 방법에 따른 접합된 면역글로불린의 투여는 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의할 수 있다.
접합된 면역글로불린에서 사용하기 위한 경쇄 가변 영역
접합된 면역글로불린에서 사용하기 위한 경쇄 가변 영역이 본 명세서에 제공되고, 경쇄 가변 영역은 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 아미노산 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기를 가지고, Cys80은 짝을 이루지 못한다. 몇몇 실시형태에서, 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 극성 또는 소수성이다.
바람직한 실시형태에서, 경쇄는 Cys80-Xaa1-Xaa2-Xaa3 모티프를 가지고, 여기서 Xaa3은 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산이다.
적합한 경쇄 가변 영역은 예를 들어 카파 경쇄 가변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 토끼로부터 유래된다. 몇몇 실시형태에서, Cys80은 토끼 면역글로불린의 네이티브 경쇄 가변 영역에 존재할 수 있다. Cys80을 가지는 경쇄 가변 영역이 유래될 수 있는 예시적인 토끼는 오릭톨라구스 쿠니쿠루스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 양태에서, 예를 들어 경쇄 가변 영역은 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 경쇄 가변 영역은 b9 토끼로부터 유래될 수 있다.
Cys80은 비캡핑될 수 있거나, 분자내 또는 분자간 다이설파이드 결합에 관여될 수 있거나, 캡핑 시스테인을 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 키메라화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 인간화될 수 있다.
경쇄 가변 영역은 하기를 포함하거나 이들로 이루어지거나 이들로 본질적으로 이루어질 수 있다:
a. xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
f. zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
g. xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
h. xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
i. zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
j. xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
k. xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
l. xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
m. xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역.
면역글로불린을 암호화하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 숙주 세포
임의의 상기 개시된 면역글로불린을 암호화하는 핵산 분자가 본 명세서에 또한 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린을 암호화하고, 경쇄 가변 영역은 80번 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 극성 또는 소수성이다.
개시된 핵산 분자는 인간 CA9에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린을 암호화할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 하기를 암호화한다:
a. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
f. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역.
몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 하기를 암호화한다:
a. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
b. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
c. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
d. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
e. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역; 또는
f. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역.
몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 하기를 암호화한다:
a. 각각 서열 번호 146, 148 및 150에 기재된 xi155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 224, 226 및 228에 기재된 xi155D5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
b. 각각 서열 번호 152, 154 및 156에 기재된 zu155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 242, 244 및 246에 기재된 zu155D5LC-3, 각각 서열 번호 248, 250 및 252에 기재된 zu155D5LC-4, 각각 서열 번호 254, 256 및 258에 기재된 zu155D5LC-5, 각각 서열 번호 260, 262 및 264에 기재된 zu155D5LC-6, 각각 서열 번호 266, 268 및 270에 기재된 zu155D5LC-7, 각각 서열 번호 278, 280 및 282에 기재된 zu155D5LC-huVK2-40, 각각 서열 번호 290, 292 및 294에 기재된 zu155D5LC-huVK4-1, 각각 서열 번호 296, 298 및 300에 기재된 zu155D5LC-huVK6-21, 각각 서열 번호 302, 304 및 306에 기재된 zu155D5LC-huVK6D-41; 또는 각각 서열 번호 308, 310 및 312에 기재된 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
c. 각각 서열 번호 164, 166 및 168에 기재된 xi1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 320, 322 및 324에 기재된 xi1E4LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
d. 각각 서열 번호 170, 172 및 174에 기재된 zu1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 332, 334 및 336에 기재된 zu1E4LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
e. 각각 서열 번호 212, 214 및 216에 기재된 xi166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 386, 388 및 390에 기재된 xi166B3LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
f. 각각 서열 번호 218, 220 및 222에 기재된 zu166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 398, 400 및 402에 기재된 zu166B3LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
개시된 핵산 분자는 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린을 암호화할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 각각 서열 번호 158, 160 및 162에 기재된 xi1-55-2HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 314, 316 및 318에 기재된 xi1-55-2LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 암호화한다.
개시된 핵산 분자는 인간 MSLN에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린을 암호화할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 하기를 암호화한다:
a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역.
몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 하기를 암호화한다:
a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역;
e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역; 또는
f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산에 기재된 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산에 기재된 경쇄 가변 영역.
몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 하기를 암호화한다:
a. 각각 서열 번호 176, 178 및 180에 기재된 xi33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 338, 340 및 342에 기재된 xi33O11LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
b. 각각 서열 번호 182, 184 및 186에 기재된 zu33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 350, 352 및 354에 기재된 zu33O11LC-CXXA 또는 각각 서열 번호 356, 358 및 360에 기재된 zu33O11LC-CXXI의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
c. 각각 서열 번호 188, 190 및 192에 기재된 xi324O5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 362, 364 및 366에 기재된 xi324O5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
d. 각각 서열 번호 194, 196 및 198에 기재된 xi178F16HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 368, 370 및 372에 기재된 xi178F16LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
e. 각각 서열 번호 200, 202 및 204에 기재된 xi237N18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 374, 376 및 378에 기재된 xi237N18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
f. 각각 서열 번호 206, 208 및 210에 기재된 xi383I18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 380, 382 및 384에 기재된 xi383I18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
임의의 개시된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 또한 개시된다. 적합한 숙주 세포는 몇몇 열거하자면 포유류 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
하기 실시예는 본 명세서에 개시된 실시형태 중 몇몇을 추가로 기재하도록 제공된다. 실시예는 개시된 실시형태를 제한하는 것이 아니라 예시하도록 의도된다.
실시예
실시예 1 - 예시적인 방법
인간 TEM1(엔도시알린/CD248)에 특이적인 토끼 mAb의 생성
토끼 면역화: 인간 TEM1(hTEM1)에 특이적인 토끼 mAb를 생성하기 위해, 가용성 인간 엔도시알린 세포외 도메인-마우스 Fc 융합 단백질("마우스 IgG2b Fc에 융합된 인간 엔도시알린/TE M1 세포외 도메인")을 제조하였다. hTEM1의 세포외 도메인은, 엔테로키나제 절단 부위, 이어서 쥣과 IgG2b Fc 감마 단편을 함유하는 pEF6-EK-IgG2b로, 인프레임 EcoRI/HpaI 클로닝되었다. CHO-K1 세포를 이 작제물에 의해 형질감염시키고, 5㎍/㎖의 블라스티시딘에 의해 선택하였다. 선택된 TEM1-Fc를 4-12% PAGE 겔에서 전기천공하고, 쿠마시 염색한 후, 밴드를 절제하였다. 겔 슬라이스를 완전/불완전 아쥬반트 중에 유화시키고, 3주 내지 4주마다 4의 주사로 뉴질랜드 화이트 토끼에 주사하였다. 하이브리도마의 생성을 위해, ELISA에 의해 평가된 바와 같이, hTEM1에 대한 최고의 역가를 보여주는 토끼로부터의 비장을 수확하였다.
하이브리도마의 생성: 하기와 같이 융합을 수행하였다: 면역화된 토끼의 비장 세포(1.5-3x108) 및 융합 파트너 240E 1-1-2를 혈청 비함유 배지에서 37℃에서 50% PEG 4000(EM Science(뉴저지주 체리 힐))과 2:1의 비율로 융합하였다. 세포를 15% FCS를 가지는 배지에서 웰마다 대략 2x105개의 비장 세포로 48웰 미량적정 플레이트에서 플레이팅하였다. 72시간 후, 하이포잔틴-아미노프테린-타이미딘(HAT)을 첨가하였다. 배지를 5-6일마다 바꿨다. 상청액을 TEM1-Fc 코팅된 플레이트를 사용하여 TEM-1에 특이적인 항체의 존재에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하고, 마우스 Fc에 대해 대조 스크리닝하였다. ELISA에 의해 hTEM1 반응성에 대해 하이브리도마로부터의 상청액을 스크리닝하고, 재조합 클로닝에 대해 클론 1-55-2를 선택하였다.
항- hTEM1 1-55-2 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 증폭: RNeasy 미니 키트(Qiagen(캘리포니아주 발렌시아))를 사용하여 토끼 하이브리도마 1-55-2로부터 RNA를 단리하였다. Platinum Taq High Fidelity(Invitrogen)를 가지는 SuperScript III 원-스텝 RT-PCR 시스템을 사용하여 RT-PCR에 2㎍의 RNA를 사용하였다. 각각 프라이머 쌍 N02937/N02898 및 N02937/N02347을 사용하여 토끼 가변 중쇄 및 전장 경쇄 유전자 단편을 증폭시켰다(표 1). RT-PCR 증폭에 대한 사이클링 매개변수는 하기와 같다: 55℃ 30분; 94℃ 2분; (94℃ 15초, 55℃ 30초, 68℃ 1분)의 30회 사이클; 68℃ 2분.
후속하여, 이 PCR 생성물을 2회차 PCR에서 사용하여, 프라이머 쌍 N02416/N02761 및 N02417/N02764를 사용하여 키메라 토끼/인간 IgG를 생성하는 데 수정 가능한 단편을 증폭시켰다(표 1). 2회차 PCR에 대한 사이클링 매개변수는 하기와 같다: 2분에 대해 94℃; (94℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 1분)의 30회 사이클; 68℃ 2분,
Figure pct00001
이후, PCR 생성물을 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분리하였다. VL에 대한 정확한 분자 크기를 가지는 PCR 생성물 및 VH 생성물을 QIAquick(등록상표) Gel Extraction Kit(Qiagen(캘리포니아주 발렌시아))에 의해 정제하고, 하기한 바대로 클로닝하였다.
인간 CA9에 특이적인 토끼 mAb의 생성
토끼 면역화: 인간 CA9에 특이적인 토끼 항체를 생성하기 위해, 인간 CA9 세포외 도메인("인간 CA9 세포외 도메인" 또는 "CA9-ECD")을 재조합으로 생성하였다. CA9-ECD를 사용하여 2개의 b9 토끼를 면역화하였다. 간단히 말하면, 토끼에 21일마다 항원을 피하로 주사하였다. 각각의 토끼는 제1 주사에서 400㎍의 CA9-ECD 및 프로인트 완전 아쥬반트(FCA) 및 후속하는 부스트에서 200㎍의 CA9-ECD 및 프로인트 불완전 아쥬반트(FIA)를 받았다. 항체 역가 시험을 위해 예비 및 시험 혈액을 수집하였다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)을 이용하여 CA9 결합에 대해 면역화 전 및 후 혈액을 시험하였다. 혈액을 연속 희석하고, CA9-ECD 단백질 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하였다. 4의 주사 후 역가가 1:15,000에 도달할 때, 토끼를 마지막으로 아쥬반트가 없는 400㎍의 CA9-ECD의 정맥 주사에 의해 부스팅하였다. 최종 부스팅 후 1주에 토끼 비장을 수집하였다. 항응고제의 존재 하에 100㎖ 이하의 방혈 혈액을 수집하고, 각각의 토끼로부터 비장 및 림프절로부터의 림프구를 단리하였다.
하이브리도마의 생성: 토끼 비장세포를 빠르게 해동하고, 1200rpm에서 실온에서 5분 동안 스피닝하고, 100㎍/㎖의 DNase를 함유하는 10% FBS와 cIMDM 중에 재현탁시켰다. 세포를 적어도 1시간 동안 37℃에서 2.5㎍/㎖의 미국자리공 미토겐에 의해 자극하였다. 자극 후, 세포를 1200rpm에서 실온에서 5분 동안 스피닝하고, 새로운 배지 중에 재현탁시켰다. 세포수 및 생존능력을 결정하였다.
융합 파트너 세포 CBF7을 해동하고, 융합 전 1주 동안 5% CO2에 의해 37℃에서 배양하였다. 50㎖ 관에서 적절한 양의 토끼 비장세포 및 융합 파트너 세포 CBF7을 원하는 비율(1:1.55 내지 1:4)로 혼합하였다. 세포의 혼합물을 1000rpm에서 실온에서 5분 동안 스피닝하고, 4℃에서 아주 찬 20㎖의 CytoPulse 융합 배지(CPFM 제제 C: CytoPulse Sciences LCM-C호)에 의해 2회 세척하였다. 세포를 106개의 세포/㎖로 CPFM 중에 재현탁시켰다.
융합에 CytoPulse 세포 융합 장치 CEEF-50(CytoPulse Sciences)을 사용하였다. 적절한 용적의 세포를 융합 챔버로 이동시키고, 고압 연결을 활성화함으로써 융합을 수행하였다. 융합 후, 세포를 실온에서 5분 동안 항온처리하고, 융합 후 배지(10% FBS를 가지는 RPMI1640, 글루타메이트, 피류베이트, 비필수 아미노산, β-머캅토에탄올, 페니실린, 스트렙토마이신 함유 및 페놀 레드 무) 중에 온화하게 재현탁시키고, 이후 플라스크로 옮겼다. 챔버를 동일한 용적의 융합 후 배지에 의해 세척하여 추가적인 세포를 얻었다. 세포를 실온에서 25분 동안, 이후 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온처리하였다.
융합 후 1일에, 세포를 원하는 밀도(35,000개의 세포/㎖)로 예비 가온된 시딩 배지(1X 하이포잔틴-아미노프테린-타이미딘을 함유하는 cIMDM와 10% FBS) 중에 희석시키고, 96웰 마이크로플레이트에서 200㎕/웰로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 항온처리하고, 3-4주 동안 새로운 배지를 공급하였다.
항-CA9 mAb의 스크리닝: 토끼 비장세포로부터의 B 세포를 융합 파트너 세포 CBF7에 융합하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 하이브리도마를 생성하였다. 세포를 플레이팅한 후 4주에, 개별 하이브리도마 배양물로부터의 상청액을 수집하고, CA9 특이적 ELISA를 사용하여 스크리닝하였다. 검정 플레이트(Greiner Bio-One High Binding 384웰 투명 플레이트, 카탈로그 655081호)를 1㎍/㎖의 CA9 ECD에 의해 4℃에서 밤새 코팅하고, 1x 검정 완충제(PBS와 1% BSA, 0.05% Tween-20 함유)에 의해 차단하였다. 이후, 25㎕/웰의 상청액 및 대조군을 차단된 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 검정 플레이트를 3회 세척하고, 검정 완충제 중에 1:10,000 희석된 25㎕/웰의 2차 항체(HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG, Jackson 115-035-146호)를 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리 후, 검정 플레이트를 3회 세척하고, 25㎕/웰의 TMB 기질(KPL 52-000-04호)을 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 항온처리 후, 25㎕/웰의 1x 중지 용액(1:10 H2SO4, VWR EM-SX1244-75호)을 첨가하였다. 패러다임(Beckman) 플레이트 판독기를 사용하여 450㎚에서의 샘플 흡광도를 측정하였다. 1차 스크린으로부터의 야성 히트(hit)를 제2 CA9 특이적 ELISA에 의해 확인하였다.
클로닝 및 돌연변이유발
CA9 및 hTEM1 mAb의 VH 및 Vκ 영역의 증폭: 관심 있는 토끼 mAb를 분비하는 하이브리도마 세포를 용리시켜서 RNA를 추출하였다. 이후, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 이용함으로써 가변 카파(Vκ) 및 중쇄 가변(VH) 영역의 DNA 증폭에 RNA를 사용하였다. 100개 내지 10,000개의 배양된 하이브리도마 세포를 아주 찬 PBS에 의해 세척하고, 100㎕의 용해/결합 용액(Ambion, 8540G5)을 첨가함으로써 용해시키고 피펫팅하였다. 드라이아이스에서 용해된 세포를 빨리 동결시켰다. 제조사의 절차에 따라 Ambion RNAqueous Kit에 의해 RNA를 단리하였다. 각각의 반응에서 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 약 5ng의 RNA를 1회차의 RT-PCR로 처리하였다.
Figure pct00002
RT-PCR 증폭에 대한 사이클링 매개변수는 하기와 같다: 55℃ 30분; 95℃ 2분; (94℃ 1분, 54℃ 50초, 68℃ 1.5분)의 30회 사이클; 68℃ 10분.
1회차의 RT-PCR로부터의 생성물을 표 3에 기재된 프라이머를 사용하여 중쇄 및 경쇄에 대한 별개의 반응에서 2회차의 PCR 증폭으로 처리하였다.
Figure pct00003
2회차의 PCR 증폭에 대한 사이클링 매개변수는 하기와 같다: 95℃ 5분; (94℃ 1분, 54℃ 50초, 68℃ 1.5분)의 40회 사이클; 68℃ 10분; 4℃ 침지.
이후, PCR 생성물을 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분리하였다. VL 및 VH 생성물에 대한 정확한 분자 크기를 가지는 PCR 생성물을 QIAquick(등록상표) 겔 추출 키트(Qiagen(캘리포니아주 발렌시아))에 의해 정제하고, InFusion HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하여 단편을 인간 감마(Cγ) 또는 카파(Cκ) 불변 영역을 함유하는 발현 플라스미드로 서브클로닝하였다. 모든 클론을 서열분석하여서 삽입체의 존재 및 충실도를 확인하였다.
유전자 합성: 인간화 VH 도메인 및 zu155D5LC-1, -huVK1-39, -huVK2-40, -huVK3-11, -huVK4-1, -huVK5-2, -huVK6-21, -huVK6D-41, -huVK7-3, zu1E4LC-1, 및 zu166B3LC-1 Vκ 도메인을 인간 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화하고, DNA 2.0에 의해 합성하였다. 가변 도메인은 코작(Kozak) 서열 및 Ig 리더 서열에 의해 합성되었고, 서브클로닝 벡터 내에 클로닝 부위와 상동성인 5' 및 3' 말단에서 15개의 염기쌍을 포함하였다. DNA 2.0 벡터로부터의 절제 후, InFusion HD 클로닝 키트를 사용하여 단편을 인간 Cγ 또는 Cκ 영역을 함유하는 발현 플라스미드로 서브클로닝하였다. 모든 클론을 서열분석하여서 삽입체의 존재 및 충실도를 확인하였다.
QuikChange: 제조사 프로토콜에 따라 Stratagene의 QuikChange XL을 사용하여 코돈 최적화된 Vκ 도메인의 돌연변이유발을 수행하였다. 모든 클론을 서열분석하여서 돌연변이의 존재를 확인하였다.
세포 배양
형질감염 및 안정한 세포주 생성: 형질감염 전일에, 293F 세포를 진탕 플라스크 내에서 293 FreeStyle 배지(Thermo Fisher Scientific) 중에 6.0x105개의 세포/㎖로 시딩하고, 125rpm에서 진탕시키면서 37℃, 8% CO2에서 항온처리하였다. 형질감염의 일자에, 세포를 상기한 바대로 1x106개의 세포/㎖로 시딩하였다. PEI(25kDa, 선형; Polysciences) 또는 ExpiFectamine(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. PEI 형질감염을 위해, 형질감염된 세포의 1㎖당 166.7ng의 HC 플라스미드, 166.7ng의 LC 플라스미드, 2.2㎍의 PEI 및 50㎕의 OptiPro(Thermo Fisher Scientific)를 22℃에서 15분 동안 항온처리하였다. DNA:PEI 혼합물을 스왈링하면서 세포에 첨가하고, 125rpm에서 진탕시키면서 37℃, 8% CO2에서 항온처리하였다. 48 내지 72시간 후, 세포를 10g/ℓ의 이스톨레이트(BD Biosciences), 5mM 발레르산(Sigma Aldrich) 및 1:100 CD 지질 농축액(Thermo Fisher Scientific)의 최종 농도로 공급하였다.
ExpiFectamine에 의해 형질감염된 세포의 각각의 1㎖에 대해, 333.3ng의 HC 플라스미드 및 333.3ng의 LC 플라스미드를 50㎕의 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific) 중에 10분 동안 항온처리하였다. 마찬가지로, 2.67㎕의 ExpiFectamine을 50㎕의 Opti-MEM 중에 항온처리하였다. ExpiFectamine 용액을 DNA 혼합물에 첨가하고, 22℃에서 30분 동안 항온처리하였다. DNA:ExpiFectamine 혼합물을 스왈링하면서 세포에 첨가하고, 125rpm에서 진탕시키면서 37℃, 8% CO2에서 항온처리하였다. 다음날, 세포의 1㎖당 3㎕의 인핸서 1 및 30㎕의 인핸서 2를 형질감염에 첨가하고, 세포 밀도에 따라 또 다른 7일 또는 10일 동안 계속해서 항온처리하였다.
형질감염 후 1일 내지 3일에 5㎍/㎖의 블라스티시딘 및 400㎍/㎖의 제오신(Thermo Fisher Scientific)을 가지는 T75 플라스크에서 3㎖의 형질감염체를 12㎖의 DMEM에 첨가함으로써 항체를 발현하는 안정한 풀을 선택하였다. 약물 내성 세포가 포화상태(confluency)로 성장한 후, 배지를 FreeStyle 293 발현 배지에 의해 대체하였다. 24 또는 48시간 후, 플라스크를 두드려서 세포를 물리적으로 제거하고(트립신처리는 낮은 생존능력을 발생시킴; 데이터 비도시), 이후 125㎖의 진탕 플라스크 내에서 30㎖의 FreeStyle 293 발현 배지 중에 6x105개의 세포/㎖로 시딩하였다. 배양물을 125rpm에서 진탕시키면서 8% CO2에서 37℃에서 항온처리하였다.
mAb 제조: 안정한 풀로부터의 항체 제조를 2개 중 하나의 방법에 의해 수행하였다:
1. 293 FreeStyle 배지 중에서 안정한 형질감염된 세포주 풀을 0.6 내지 1x106개의 세포/㎖로 시딩하였다. 배양물이 1x106개의 세포/㎖의 밀도에 도달한 후 2일에, 배양물을 본 명세서에 기재된 바대로 공급하였다; 또는
2. Beckman Allegra 6 원심분리기에서 안정한 형질감염된 세포주 풀을 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 2.8ℓ의 진탕 플라스크에서 세포를 1ℓ의 expi293 배지(Gibco) 중에 0.5-0.8x106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포를 125rpm에서 진탕시키면서 37℃, 8% CO2에서 항온처리하였다.
상기 방법 둘 다에 대해, Beckman JLA8.1000 회전자에서 배양물을 8000rpm에서 1시간 동안 원심분리하는 시간에, 세포 생존능력이 약 50%로 떨어질 때에 따라, 배양물을 125rpm에서 7-10일 동안 진탕시키면서 8% CO2에서 37℃에서 항온처리하였다. 이후, 상청액을 0.2㎛ PES 필터를 통해 여과시키고, 정제까지 4℃ 또는 -20℃에서 저장하였다.
mAb 정제
단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 항체 정제: AKTA Explorer(GE Healthcare)를 사용하여, 단백질 A 칼럼(GE Healthcare)을 10 칼럼 용적(CV)의 20mM 인산나트륨, 10mM EDTA(pH 7.2)에 의해 평형화시켰다. 이후, 샘플을 로딩한 후, 10CV의 평형 완충제에 의해 비결합 재료를 세척하였다. 5CV의 0.1M 글라이신(pH 2.9)을 사용하여 샘플을 용리시켰다. mAb를 함유하는 분획을 혼주시키고, MWCO 20K 슬라이드-A-용리장치(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 둘베코 인산염 완충제(DPBS) 중에 투석하였다.
시스테인 탈캡핑: AKTA Explorer(GE Healthcare)를 사용하여, 단백질 A 칼럼(GE Healthcare)을 10CV의 20mM 인산나트륨, 10mM EDTA(pH 7.2)(평형 완충제)에 의해 평형화시켰다. 이후, 샘플을 로딩한 후, 10CV의 평형 완충제에 의해 비결합 재료를 세척하였다. 칼럼을 0.5㎖/분으로 4℃에서 16시간 동안 16CV의 20mM 인산나트륨, 10mM EDTA, 5mM 시스테인(pH 7.2)에 의해 세척하여 캡핑 기를 제거하였다. 이후, 칼럼을 0.5㎖/분으로 4℃에서 60시간 동안 60CV의 20mM Tris(pH 7.5)에 의해 세척하였다. 샘플을 5CV의 0.1M 글라이신(pH 2.9)을 사용하여 용리시키고, 5% 용적의 2M Tris(pH 9.0)를 사용하여 즉시 중화시켰다. mAb를 함유하는 분획을 혼주시키고, MWCO 20K 슬라이드-A-용리장치(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 DPBS 중에 투석하였다.
LC-MS/MS 시스테이닐화 및 다이설파이드 결합 맵핑 분석
Zeba 스핀 탈염 칼럼(Thermo-Fisher)을 사용하여 mAb를 50mM 중탄산암모늄 완충제(pH 7.8)로 완충제 교환하였다. 농도를 1㎎/㎖로 조정하고, RapiGest(Waters)를 0.1%에 첨가하였다. 이후, mAb를 37℃에서 4시간 동안 Glu-C(New England BioLabs)(25:1 w/w)에 의해 분해한 후, 37℃에서 18시간 동안 Asp-N(New England BioLabs)(25:1 w/w)에 의해 분해하였다. 분해 후, 5% 트라이플루오로아세트산(TFA)을 0.5%에 첨가하고, 37℃에서 90분 동안 항온처리하였다. 샘플을 13,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 펠렛을 제거하고, 제2 이온화 상에서 MSE 방법론을 이용하여 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. MSE 방법론은 제2 이온화 상에서 고정된 전압보다는 상승한 전압을 이용하여서 더 완전한 이온 프로파일을 생성하였다. Waters Acquity UPLC 및 Q-Tof Premier 질량 분광계를 사용하여 샘플을 분석하였다. 샘플은 Waters BEH 300(C18, 1.7㎛ 기공 크기, 2.1x100㎜)으로 주입되고, 0.05㎖/분으로 이동상 A의 97%(H2O 중 0.1% 폼산) 중의 3분 평형, 55분 선형 구배(3-45%의 이동상 B(아세토나이트릴 중 0.1% 폼산)), 5분 선형 구배(45%-90%의 이동상 B), 5분 등용매 상(90%의 이동상 B), 5분 선형 구배(90%-3%의 이동상 B) 및 이동상 A의 97% 중의 5분 재평형으로 칼럼으로부터 용리되었다. Q-Tof 질량 분광계는 200-2000m/z의 범위의 검출로 양성 이온, V-모드 중에 실행되었다. 소스 매개변수는 하기와 같다: 모세관 전압, 3.0kV, 샘플링 콘 전압, 40V; 소스 온도, 120℃; 탈용매화 온도, 250℃; 탈용매화 유속, 600ℓ/시간. 락스프레이 질량 기준 표준은 glu-fib였다. MSE 방법은 하기와 같다: 획득 시간, 3-70분; 데이터 범위, 200-2000m/z; 스캔 시간, 1.5초; 발현, 저에너지 6V, 10-30V로부터의 상승 고에너지.
Agilent 1100을 사용하여 크기 배제, 고성능 액체 크로마토그래피 방법(SEC-HPLC)에 의해 항체 응집을 분석하였다. mAb를 DPBS 중에 1㎎/㎖로 희석시켰다. 항체(20㎕)는 TSKgel 슈퍼SW 가드 칼럼(4.6㎜ x 3.5㎝, 4㎛ 기공 크기, Tosoh Bioscience), 이어서 TSKgel 슈퍼SW3000 칼럼(4.6㎜ x 30㎝, 4㎛ 기공 크기)으로 주입되고, 20분 동안 0.3㎖/분의 유속으로 0.15M NaCl 및 0.05% NaN3(pH 7.4)을 함유하는 0.1M PBS를 가지는 칼럼으로부터 용리되었다. Agilent ChemStation 소프트웨어를 사용하여 모든 데이터를 분석하였다. [PA응집체/PA전체] * 100(여기서, PA = 적분된 피크 면적)으로서 응집 백분율을 계산하였다.
말레이미드 - 바이오틴:mAb 접합의 UPLC / ESI -MS 분석
정제된 항체를 DPBS 중에 1㎎/㎖로 희석하였다(샘플을 1.0㎎/㎖ 미만인 경우 원래 농도로 남음). 말레이미드-PEG2-바이오틴((mal)-PEG2-바이오틴)(Thermo Fisher Scientific)을 DPBS 중에 용해시켜 20mM 스톡 용액을 생성시킨 후, DPBS 중에 1mM로 희석시켰다. Mal-PEG2-바이오틴을 1㎖의 탈캡핑된 mAb에 5:1 접합 비율로 첨가하고, 2시간 동안 온화한 회전에 의해 22℃에서 항온처리하였다. Zeba 스핀 탈염 칼럼을 사용하여 반응물을 탈염시켰다. 이후, PNGase F(New England BioLabs)를 사용하여 mAb를 탈글라이코실화하였다. G7 완충제(10㎕) 및 PNGase F(2㎕)를 mAb(90㎕)에 첨가하였다. 반응물을 2회 사이클 동안 Discover 마이크로파(CEM)에서 항온처리하였다: 1) 마이크로파 전력 10W, 37℃, 10분, 이어서 5분 정지; 및 2) 마이크로파 전력 2W, 37℃, 10분. 다이티오트레이톨(DTT)을 20mM의 최종 농도로 첨가함으로써 샘플의 일부를 환원시키고, 60℃에서 3분 동안 항온처리하였다.
이후, Waters Acquity UPLC 및 Q-Tof Premier 질량 분광계를 사용하여 샘플을 분석하였다. 샘플(각각 0.5-2㎍)은 65℃에서 MassPrep 마이크로 탈염 칼럼으로 주입되고, 0.05㎖/분으로 이동상 A의 95% 중의 5분 평형, 10분 구배(5-90% B) 및 이동상 A의 95% 중의 10분 재평형으로 칼럼으로부터 용리되었다. 이동상 A는 물 중의 0.1% 폼산이었다. 이동상 B는 아세토나이트릴 중의 0.1% 폼산이었다. Q-Tof 질량 분광계는 500-4000m/z의 범위의 검출로 양성 이온, V-모드 중에 실행되었다. 소스 매개변수는 하기와 같다: 모세관 전압, 2.25kV(온전한 항체)-2.50kV(환원된 항체); 샘플링 콘 전압, 65.0V(온전한 항체) 또는 50.0V(환원된 항체); 소스 온도, 100℃; 탈용매화 온도, 250℃; 탈용매화 유속, 550ℓ/시간. MassLynx MaxEnt 1 함수를 사용하여 단백질 피크를 디콘볼루션하였다. [I바이오틴닐 화/(I바이오틴닐화 + I비변형)] * 디콘볼루션된 질량 스펙트럼(여기서, I = 질량 피크 강도)의 100으로서 접합 효율을 계산하였다.
mAb:항원 친화도의 BIAcore 분석
항원에 결합될 때 30-40 RU 신호를 생성하도록 항체 농도를 조정하였다. 표준 단백질 A 친화도 크로마토그래피 또는 탈캡핑 방법에 의해 정제된 인간화된 mAb를 10㎕/분의 유속으로 1분 동안 BIAcore T100(GE Healthcare)에서 항-인간 IgG 센서 위로 주입하였다. 50㎕/분의 유속으로 1분 동안 HBS-P 완충제를 주입함으로써 센서 표면을 세척하였다. 포획된 mAb에 대한 항원 회합을 기록하기 위해, 일련의 증가하는 농도의 항원을 50㎕/분의 유속으로 60초 동안 주입하였다. 항원의 해리를 동일한 유속에서 30분 동안 모니터링하였다. 30㎕/분의 유속으로 1분 동안 및 이후 30초 동안 3M MgCl2를 주입함으로써 센서 표면을 재생성하였다. 1:1 Langmuir 결합 모델을 이용하여 Biacore T100 평가 소프트웨어에 의해 센소그램을 분석하였다.
2가/ 이중특이적 Fab 제조
고정된 파파인을 사용하여 mAb 유래 Fab 단편을 별도로 제조한 후, 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 Fc/비분해된 mAb로부터 순수한 Fab 단편을 단리하였다. DMSO 중에 1시간 동안 1:1 몰 비율로 NHS-말레이미드 및 아지도-PEG4-아민을 조합함으로써 말레이미도-PEG4-아지드를 합성하였다. 비반응된 NHS를 Tris-HCl 완충제의 첨가에 의해 켄칭하여 동종이합체화를 막았다. Fab를 말레이미드:Fab의 5:1 몰 비율로 말레이미도-PEG4-아지드 또는 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴(DBCO)에 접합하고, 22℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 변형된 Fab 단편을 각각 DPBS 중에 2회 탈염시켜서 모든 비반응된 생성물을 제거하고, Fab 단편을 2㎎/㎖의 최종 농도로 1:1의 몰 비율로 조합하고, 22℃에서 밤새 이합체를 형성하도록 하였다. SDS-PAGE에 의해 반응을 분석하고, 이합체화 효율은 20%로 예상되었다. S-200 겔 여과 크로마토그래피에 의해 비반응된 단량체로부터 이합체 제제를 정제하였다.
2가/ 이중특이적 옥테트 검정
바이오티닐화된 인간 CA9를 스트렙타비딘 Biosensor 선단(Pall)에서 4분 동안 포획하였다. PBS 중에 2분 동안 항온처리 후, 선단을 2가/이중특이적 Fab, mAb 단독 또는 Fab 단독과 5분 동안 항온처리하였다. PBS 중에 2분 동안 항온처리 후, 선단을 인간 엔도시알린/TEM-1과 5분 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 선단을 PBS 중에 또 다른 2분 동안 항온처리하였다. 선단에 대한 결합 및 해리 단백질을 내내 측정하였다.
실시예 2 - Cys80 접합
목적
한정된 약물-대-항체 비율(DAR)을 가지는 균일한 생성물을 생성하도록 부위 특이적 접합 기술이 바람직하다. 오릭톨라구스 쿠니쿠루스로부터 유래한 것과 같은 토끼 mAb의 Vκ 도메인은 80번 위치에서의 시스테인("Cys80"이라 칭함)(도 1A)을 함유할 수 있고, Cκ 영역은 171번 위치에서의 시스테인("Cys171")(도 1B)을 함유할 수 있다. 인실리코 모델링은, 2개의 S 원자가 대략 1.6Å 떨어진 것으로 예측되면서(도 2A), Cys80 및 Cys171이 다이설파이드 결합을 형성한다고 예측하였다. 인간 mAb는 80번 위치에 프롤린, 세린 또는 알라닌 잔기를 가지고(도 1A), 171번 위치에서 세린을 가진다(도 1B), 따라서 가변 영역 및 불변 영역 사이에 다이설파이드 브릿지가 없다(도 2B).
토끼 또는 인간 Vκ 및 Cκ 서열에 가장 가까운 결정 구조는 BLAST pdb 데이터베이스를 이용하여 확인되고, 155D5 mAb 구조를 모델링하기 위한 주형으로 사용되었다. 모델은 Discovery Studio의 "빌드 호몰로지 모델(Build Homology Model)" 툴(Accelrys)을 이용하여 생성되었다. 가장 낮은 전체 에너지를 가지는 모델이 선택되고, CHARMm 포스필드에 의해 타이핑되고, 에너지는 "최소화" 툴을 이용하여 2회차의 에너지 최소화를 통해 추가로 최소화되었다. 이후, "모델 항체 루프" 툴을 이용하여 CDR 루프를 개선하였다. 가장 낮은 전체 에너지를 가지는 모델이 선택되고, CHARMm 포스필드에 의해 타이핑되고, 에너지는 상기 기재된 바대로 추가로 최소화되었다. Cys80 및 Cys171의 근접성(도 2A)은 이 시스테인 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다는 것을 예측한다. "Build Mutants" 툴은 이 다이설파이드 결합을 나타내도록 사용되었다.
항체의 생물학적 활성에 결국 필요한 2차 및 3차 구조 통합성을 유지하는 데 다이설파이드 결합이 중요하므로, 예측된 Cys80-Cys171 결합이 실제로 존재하는지를 입증하는 것이 중요하다. 따라서, 토끼 mAb가 이러한 결합을 함유한다는 것을 명백히 입증하도록 특별(ad hoc) 실험을 수행하였다(표 4).
Figure pct00004
(NZW 토끼로부터의) 토끼 155D5 MAb의 Glu-C/Asp-N 분해물에서 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 다이설파이드 연결된 cys80-cys171에 상응하는 질량만이 발견되어서, cys80이 토끼 IgG에서 cys171과 다이설파이드 결합을 형성한다는 것을 나타낸다. (b9 토끼로부터의) 1-55-2 mAb를 사용하여 유사한 분석을 수행하였다.
i) mAb가 생성된 종으로부터의 가변 영역; 및 ii) 인간 불변 영역 사이에 융합을 통해 종-인간 키메라화된 mAb는 만들어졌다. 이 과정은 키메라화라 불린다. 인간화된 mAb는, mAb가 생성된 숙주의 동일한 종으로부터 생긴, 항원 결합에 필요한 잔기를 제외하고, 인간 가변 영역 및 불변 영역으로 주로 만들어졌다. 이 과정은 인간화라 불린다. 종 오릭톨라구스 쿠니쿠루스에 속하는 숙주에서 mAb가 생성되도록 인간 키메라화 또는 인간화된 mAb를 조작하기 위해, 전체 불변 도메인, 및 (인간화된 경우) 대부분의 가변 영역은 인간 가변 및 인간 불변 서열에 의해 유전적으로 대체되었다. 키메라화 또는 인간화 후, Vκ에서의 Cys80은 Cκ에서의 171번 위치와 다이설파이드 결합을 더 이상 형성하지 않고(도 2C), 따라서 짝을 이루지 못한다.
생식선 NZW 토끼 Vκ 패밀리는 도 3에 도시된 바대로 80번 위치에 시스테인을 가진다(CDR 영역은 결실되고, 프레임워크(FWR) 1, 2 및 3은 정렬된다).
짝을 이루지 못한 80번 위치에서의 시스테인의 발견 및 규명
155D5 및 1E4(항-CA9), 1-55-2(항-hTEM1) 및 33O11(항-MSLN)(이들 모두 Cys80을 함유하고, 실시예 1에 기재된 바대로 생성됨)의 토끼 불변 영역은 IgG1κ의 인간 불변 영역에 의해 대체되어서, 본 명세서에서 그 외 기재된 바대로 토끼/인간 키메라화된 mAb를 생성하였다. 구체적으로, 155D5의 토끼 VH 영역을 인간 Cγ 영역과 융합하여서 xi155D5HC를 생성하고, 155D5의 토끼 Vκ 영역을 인간 Cκ 영역과 융합하여서 xi155D5LC를 생성하였다. 짝을 이루지 못한 Cys80을 가지는 토끼/인간 키메라화 155D5 mAb는 본 명세서에서 xi155D5라 칭해진다.
1-55-2의 VH 영역은 인간 Cγ 영역과 융합되어 xi1-55-2H를 생성하고, 1-55-2의 토끼 Vκ 영역은 인간 Cκ 영역과 융합되어 xi1-55-2LC를 생성한다. 짝을 이루지 못한 Cys80을 가지는 토끼/인간 키메라화 1-55-2 mAb는 본 명세서에서 xi1-55-2라 칭해진다.
1E4의 토끼 VH 영역은 인간 Cγ 영역과 융합되어 xi1E4HC를 생성하고, 1E4의 토끼 Vκ 영역은 인간 Cκ 영역과 융합되어 xi1E4LC를 생성한다. 짝을 이루지 못한 Cys80을 가지는 토끼/인간 키메라화 1E4 mAb는 본 명세서에서 xi1E4라 칭해진다.
33O11의 토끼 VH 영역은 인간 Cγ 영역과 융합되어 xi33O11HC를 생성하고, 33O11의 토끼 Vκ 영역은 인간 Cκ 영역과 융합되어 xi33O11LC를 생성한다. 짝을 이루지 못한 Cys80을 가지는 토끼/인간 키메라화 33O11 mAb(xi33O11)는 본 명세서에서 xi33O11이라 칭해진다.
Cys171이 키메라화 동안 Ser171에 의해 치환되므로, 키메라화 항체(xi155D5, xi1-55-2, xi1E4 및 xi33O11)는 Vκ에서 80번 위치에서의 짝을 이루지 못한 시스테인("Cys80")을 함유하였다. 가혹한 조건(60℃에서 5분 동안 20mM DTT)을 이용하여 환원될 때, 단백질 A-정제된 mAb xi155D5 경쇄의 분자량(질량)은 23,382Da였다(도 4a). 그러나, 온화한 환원 조건(100μM DTT, 실온, 30분)으로 처리될 때, 질량은 120Da만큼 증가하였다(도 4b). 이 질량 증가는 Cys80이 "캡핑" 시스테인이라 칭하는 유리 시스테인과 다이설파이드 결합을 형성한다는 것을 제안한다. "시스테이닐화"라 불리는 반응으로부터 생긴, 이 분자 구조는 "캡핑된" Cys80이라 칭해진다. 이 가설을 확인하기 위해, xi155D5 mAb를 Asp-N 및 Glu-C에 의해 분해하고, 펩타이드의 질량을 분석하였다. Cys80에 걸쳐 71번 잔기에 상응하는 펩타이드 단편(FTLTITGVQC)(서열 번호 24)의 질량 분광 분석은 119Da만큼 증가한 분자량을 나타내어서(표 5), Cys80이 캡핑되었다는 것을 확인시켜준다.
Figure pct00005
Cys80-Cys171 다이설파이드 결합의 결여가 항체 불안정성, 항원 결합의 파괴, 또는 둘 다를 발생시킬 수 있으므로, 항체 안정성 및 항원 결합 시험을 수행하였다. SE-HPLC 검정을 이용하여 xi155D5의 안정성을 시험하였다. 이 검정은 Cys80-Cys171 다이설파이드 결합의 결여가 (가능한 분자간 Cys80-Cys80 결합으로 인한) 응집 또는 (프로테아제에 대한 증가한 감수성으로 인한) 분해를 발생시키는지를 시험한다. 1x PBS 중의 1㎎/㎖의 정제된 항체를 -80℃ 또는 37℃에서 1주 동안 저장하였다. 이동상으로서 0.1M 인산나트륨, 0.15M NaCl, 0.05% NaN3에 의해 0.3㎖/분의 유속으로 인라인 TSKgel 4.6㎜ x 3.5㎝ 가드 칼럼이 구비된 슈퍼SW3000 칼럼(TOSOH Biosciences, 4.6㎜ x 30㎝, 4㎛ 입자 크기)에 10㎕의 xi155D5를 주입하였다. 2개의 저장 조건 사이에 응집의 상당한 변화가 관찰되지 않았다(도 5A 및 도 5B). 응집의 수준은 3-4% 범위였고, 그러므로 통상적인 인간 IgG1의 정상 범위 내였다(데이터 비도시). 임의의 저장 조건에서 분해 생성물이 관찰되지 않거나 거의 관찰되지 않았다(도 5). 이 결과는 Cys80-Cys171 다이설파이드 결합이 결여된 xi155D5가 시험된 저장 조건 하에 안정한 단백질이라는 것을 제안한다.
키메라화, 및 이에 따라 Cys80-Cys171 다이설파이드 결합의 소실이 항원 결합의 소실을 발생시키는 구조 변화를 발생시키는지를 결정하기 위해, 표면 플라즈몬 공명에 의한 mAb 155D5, xi155D5, 1-55-2 및 xi1-55-2의 결합 친화도를 평가하였다. 실행 완충제로서 HBS-EP를 사용하여 코팅된 바이오틴 CAP BIAcore 칩(GE Healthcare(뉴저지주 피츠카타웨이))에서 바이오티닐화 리간드(1-55-2에 대해 바이오틴-hTEM1, 155D5에 대해 바이오틴-CA9)를 포획하였다. 최종 항원 포획 수준은 바이오틴-TEM1 및 바이오틴-CA9에 대해 각각 130RU 및 280RU였다. 항체의 연속 희석(120㎕의 0-50nM)을 리간드 코팅된 칩 위로 통과시켰다. 25분 동안 해리가 관찰되었다. 6M GuHCl, 250mM NaOH에 의해 칩 표면을 재생성하였다. 센소그램은 이중 참조되었고, 동역학 매개변수는 BIAEvaluations 소프트웨어(4.1 버전)를 이용하여 결정되었다. 결합 친화도의 소실이 2개의 상이한 mAb의 키메라화로 인해 발견되지 않거나 거의 발견되지 않아서(표 6), Cys80-Cys171 다이설파이드 결합의 결여가 결합 영역의 파괴를 발생시키지 않는다는 것을 제안한다.
Figure pct00006
작용제의 접합에 대한 Cys80의 유용성의 평가
Cys80-Cys171 다이설파이드 결합의 결여가 구조 변화를 발생시키지 않는다는 것을 확립한 후, 티올 반응성 화합물에 의해 캡핑 시스테인을 대체할 가능성을 조사하였다. 티올 반응성 기는 링커에 부착될 수 있고, 이것은 결국, 본 명세서에서 "작용제"라 칭하는, 진단학적 또는 치료학적 유용성의 분자에 부착될 수 있다. 작용제는 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자(예컨대, 화학치료제), 킬레이터, 지질 및 약물을 포함할 수 있다.
작용제에 의해 캡핑 시스테인을 치환하기 위해, 캡핑 시스테인을 처음에 제거하였다. 정제된 mAb를 환원 조건에 노출시키는 것은, 본 명세서에서 "탈캡핑"이라 칭하는, Cys80과 캡핑 시스테인 사이의 다이설파이드 결합을 파괴할 수 있다. 그러나, 준최적 환원 조건, 예를 들어 가혹한 환원 조건은 사슬간 및 사슬내 다이설파이드 결합을 또한 파괴할 수 있고, 이로써 mAb 구조 및 활성을 손상시킨다. 따라서, 캡핑 시스테인의 제거를 여전히 허용하면서, 온화한 환원을 이용한 캡핑 시스테인의 제거, 이어서 mAb 구조 및 활성을 변경하지 않는 Tris 함유 완충제에 의한 재산화를 수반하는 탈캡핑 방법이 개발되었다. 환원된 글루타티온, 시스테인, TCEP 및 DTT를 포함하는 다수의 환원제를 초기에 평가하였다. 글루타티온은 캡핑 시스테인을 효과적으로 제거하지 않았다(데이터 비도시). DTT 및 TCEP 둘 다는 캡핑 시스테인을 효과적으로 제거하였지만, 더 높은 농도는 또한 사슬내 다이설파이드의 거의 완전한 파괴 및 역시 아마도 약간의 사슬간 다이설파이드를 발생시켰다(데이터 비도시). 온화한 환원제 시스테인은 캡핑 시스테인을 효과적으로 제거하고, 오직 제한된 사슬간 파괴가 관찰되었다. 포스페이트 완충제, Tris 완충제 및 강한 산화제 CuSO4를 사용하여 재산화를 조사하였다. 파괴된 사슬간 다이설파이드의 재산화가 포스페이트 완충제에 의해 관찰되지 않은 반면, CuSO4는 다이설파이드를 효과적으로 빠르게 다이설파이드를 리포밍하지만, Tris와 비교하여 이의 고유 독성으로 인해 추가로 평가되지 않았다. 최적화된 조건은 공급원료로부터 순차적 정제 및 탈캡핑을 허용하도록 칼럼 포맷에 채택되었다. 이 방법에 의해, 항체는 단백질 A 수지에 결합하고, Cys80-시스테인 다이설파이드 결합을 환원(파괴)시키도록 16시간 동안 5mM 시스테인을 함유하는 완충제와 제한된 유속(0.5㎖/분)으로 항온처리되고, 이어서 이 처리에 의해 방출된 시스테인을 제거하고 임의의 환원된 사슬간 다이설파이드 결합을 재산화시키도록 60시간 동안 시스테인 비함유 Tris 함유 완충제에 의해 세척되었다. 이후, mAb를 낮은 pH의 글라이신 완충제 중에 용리시켰다. 탈캡핑 방법이 xi155D5에 적용되는 예시적인 실험에서, 비환원된 정제된 mAb의 질량을 결정하고, 약 99%의 mAb는 2개의 유리 시스테인에 균등한 질량의 감소로 입증된 바대로, 탈캡핑되는 것으로 발견되었다(도 6A 및 도 6B). 유리 티올 검정은 mAb마다 2개의 티올기의 존재를 확인시켜주어서, 또한 효과적인 재산화를 입증하였다(데이터 비도시).
탈캡핑된 Cys80은 말레이미드에 접합될 수 있다
시스테인은 비극성 측쇄(티올; -SH)를 가지는 α-아미노산이다. 짝을 이루지 못한 시스테인에서의 환원된 티올 측쇄는 친전자체 분자, 예컨대 말레이미드, 화학식 H2C2(CO)2NH를 가지는 화학 화합물과 반응할 수 있는 친핵체로서 작용할 수 있다. 말레이미드에서의 친전자체 이중 결합은 시스테인에서 발견되는 친핵체 티올기와 용이하게 반응하여서 안정한 탄소-황 티오에터 결합을 형성한다. 티올 측쇄의 비극성은, 둘러싼 잔기에 따라, 화학 변형에 필요한 용매 노출을 막을 수 있는 시스테인에 소수성 특성을 부여한다. 게다가, 이것이 위치한 펩타이드의 2차 구조의 맥락에서 시스테인의 위치는 티올 반응성 분자의 접근을 추가로 막을 수 있다. 탈캡핑 후 Cys80이 티올 반응성 분자와 반응하는지를 결정하기 위한 실험적 시험을 수행하였다. 탈캡핑된 xi155D5를 본 명세서에서 그 외 기재된 바대로 말레이미드-PEG2-바이오틴과 항온처리하였다. 질량 분광 분석은, 작용제 질량에 상응하는 526Da만큼의 분자 질량의 증가에 의해 표시된 바대로(도 7), mAb의 94%가 말레이미드-PEG2-바이오틴에 의해 접합된다는 것을 보여주었다. 각각의 경쇄가 접합된 것으로 발견되면서(단일 질량 피크, 도 7), 말레이미드-PEG2-바이오틴 대 xi155D5 비율은 균일하게 2:1였다. 하나의 말레이미드-PEG2-바이오틴을 키메라화된 mAb(Cys801 및 Cys802)에서 2개의 경쇄의 각각에서 Cys80에 접합하였다.
이 결과는 Cys80 및 Cys171이 토끼 mAb의 Vκ 및 Cκ 영역을 연결하는 다이설파이드 결합을 형성한다는 것을 입증한다. 토끼 mAb가 키메라화될 때, Cys171은 인간 Cκ 영역에 존재하는 Ser171에 의해 치환되었다. 이 치환은 Cys80-Cys171 다이설파이드 결합을 무효화하였다. 모 토끼 mAb와 비교된 생성된 키메라화된 mAb의 구조 안정성 및 활성에 대한 이 다이설파이드 브릿지의 소실의 효과가 평가될 때, 키메라화된 mAb가 안정하고 활성인 것으로 관찰되었다. 키메라화된 mAb에서 짝을 이루지 못한 채 있는, Cys801 및 Cys802 둘 다가 유리 시스테인(캡핑 시스테인)에 의해 캡핑되는 것으로 발견되었다. 후속하여, 생성된 키메라 mAb의 구조 안정성 및 활성을 유지시키면서 캡핑 시스테인을 제거하는 방법(탈캡핑)이 개발되었다. 게다가, 말레이미드-PEG2-바이오틴에 접합된 mAb의 높은 수율이 2:1인 작용제 대 mAb 비율에 의해 달성되는 것으로 입증되었다.
토끼 mAb의 인간화
키메라화된 mAb는 인간에게 투여될 때 면역원성일 수 있고, 이에 따라 Vκ 및 VH 영역에서 인간 서열에 의해 토끼 서열을 치환함으로써 토끼 mAb를 인간화하는 것이 바람직하다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/에서 인간 가변 도메인 데이터베이스에 대해 BLAST 조사를 이용하여 mAb 155D5의 아미노산 서열을 분석하여서 토끼 서열에 대한 가장 높은 동종성을 가지는 인간 서열을 확인하였다. IGHV3-64*04 및 IGKV1-5*03의 사용이 토끼 잔기 치환의 가장 적은 수를 발생시키므로, 이들은 인간화에 대한 최과의 서열로서 확인되었다(도 8).
카밧 및 쵸티아 CDRH1, 쵸티아 CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3에 의해 확인된 항원 결합 도메인에 상응하는 155D5 서열을 인간 IGHV3-64*04 또는 IGKV1-5*03의 프레임워크(FWR) 영역에 삽입하여서 zu155D5-1이라 칭하는 인간화 155D5 mAb를 생성하였다(표 7 및 표 8).
155D5LC의 인간화(zu155D5LC) 동안, Cys80을 유지시키고, 인간 카파 서열이 Cys171과 반대로 Ser171을 가지므로 이것은 짝을 이루지 못하였다. zu155D5-1은 표준 단백질 A 정제를 사용하여 생성되고 정제되고, 2개의 캡핑 시스테인에 대략 상응하는, 탈캡핑 후 233Da만큼의 질량 변화에 의해 입증된 바대로, 캡핑된 것으로 발견되었다(도 9). xi155D5에 의해 관찰된 바대로, zu155D5-1은 100%에 가까운 효율로 또한 탈캡핑될 수 있었다(표 9). 그러나, 탈캡핑은 xi155D5에서의 불과 14%에 비해 많은 수준의 응집(70%)을 발생시켰다. zu155D5-1이 말레이미드-PEG2-바이오틴과 반응할 때, 0%의 접합이 관찰되는 반면, xi155D5은 93% 접합되었다(표 9). 이것이 1) 필요하지는 않지만, 작용제의 부위 특이적 접합을 허용하기에 충분하지 않은 80번 위치에서 시스테인을 가지는 것; 및 2) 일부 조건에서, Cys80에 대한 접합의 시도가 약물 제조가능성과 양립가능 하지 않은 높은 응집을 발생시킬 수 있다는 것을 제안하면서, 이 결과는 놀랍다. 그러나, xi155D5를 규명하는 개시된 연구가 적어도 일부 조건에서 Cys80에 대한 작용제의 접합이 매우 효과적일 수 있다는 것을 입증하므로, Cys80을 둘러싼 잔기가 접합 효율에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지가 다음에 조사되었다. 결과적으로, 키메라화된 xi155D5의 구조 모델이 생성되었고(도 10), 이것은 잔기 Val11, Ala14, Gly17, Thr18, Lys63, Thr76, Gly77, Val78, Ala83, Glu103 및 Leu104가 Cys80에 매우 근접(18Å 내)하고, 따라서 이의 접합의 효율에 잠재적으로 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
FWR1의 2개의 버전(FWR1a-b), FWR2의 1개의 버전, FWR3의 3개의 버전(FWR3a-c) 및 FWR4의 2개의 버전(FWR4a-b)을 상기 언급된 잔기에 기초하여 설계하였다(표 7).
Figure pct00007
이 프레임워크 및 Cys80-Xaa1-Xaa2-Phe83(C-X-X-F 또는 CXXF라고도 칭함) 또는 Cys80-Xaa1-Xaa2-Ala83(C-X-X-A 또는 CXXA라고도 칭함)(여기서, "Xaa" 또는 "X"는 81번 및 82번 위치에서의 아미노산을 나타냄) 중 어느 하나의 조합을 함유하는 일련의 인간화 155D5 변이체를 생성하였다(표 8).
Figure pct00008
사용된 FWR 버전과 무관하게, C-X-X-F 모티프를 가지는 인간화된 mAb가 (탈캡핑 후) 높은 응집 및 불량한 접합을 나타낸다(표 9)는 것이 관찰되었다. 반대로, C-X-X-A 모티프를 함유하는 5개 중 4개의 mAb 변이체는, 사용된 FWR 버전과 무관하게, 높은 백분율의 접합 효율(80% 초과) 및 (탈캡핑 후) 18% 미만의 낮은 응집을 나타냈다(표 9). zu155D5-4는 탈캡핑 후 낮은 백분율의 접합 효율 및 높은 응집을 나타내는 이상점이다. zu155D5-4 항체가 탈캡핑과 독립적으로 응집하는 경향을 가진다는 것이 주목되고, 이것은 관찰된 결과를 설명할 수 있다. 이 데이터는 Phe83이 탈캡핑 후 높은 응집을 발생시키는 데 관여하고, Cys80에서의 접합에 적합하지 않다는 것을 제안한다.
Figure pct00009
하류 공정 최적화의 출발점으로서 25% 이하의 응집을 달성하는 것이 바람직하고, 이로써 발효 매개변수, 정제 조건 및 약물 제제의 추가의 최적화는 5% 이하의 더 바람직한 응집 수준을 달성할 수 있다. 생성물 폐기물, 제품 비용을 최소화하고 생성물 균질성을 최대화하기 위해 70% 이상의 접합 효율을 달성하는 것이 또한 바람직하다. 이후로, 토끼 mAb의 인간화 방법에 적용할 규칙을 외삽함으로써 이 사양을 만족시키거나 초과하는 것에 조사는 초점을 둔다.
155D5-1은 하기 표준 실행에 의해 생성되고, 이것은 모 서열에 가장 동종성인 인간 생식선 서열을 사용하는 것을 수반한다. 이 실행 때문에, 인간 Vκ 하위패밀리 IGKV1-5는 70.5%의 동일성 백분율(데이터 비도시)을 가지고 Phe83을 함유하는 155D5를 인간화하기 위해 사용되었다. 대안적인 Vκ 하위패밀리는 유사한 동일성의 백분율(데이터 비도시)을 가지고, 또한 Phe83을 함유한다(도 8). 이 잔기가 Cys80 접합 효율에 부정적으로 영향을 미치고 높은 응집을 발생시키는 것으로 보이므로, 이 Vκ 패밀리에서 발견된 가장 높은 동일성이 더 낮다(68.4%)는 사실에도 불구하고, 다른 인간 Vκ 패밀리에서의 Phe83의 존재 또는 부재가 평가되었고, 따라서 이것은 155D5를 인간화하기 위해 통상적으로 사용되지 않을 것이다. IGKV4, IGKV5 및 IGKV7을 제외한 모든 인간 Vκ 패밀리가 다수의 하위패밀리를 가지므로, 모든 하위패밀리는 이의 패밀리 내에 정렬된다(데이터 비도시). 중복성 서열의 제거 후, 각각의 IGKV-4, -5, -6, -6D 및 -7 패밀리에 오직 하나의 서열이 남고, 이것은 인간화에 사용될 수 있다. 패밀리 IGKV-1, -2 및 -3의 경우, 공통에 가장 가까운 동종성을 가지는 하위패밀리가 155D5를 인간화하기 위한 프레임워크로서 선택되었다. 예비 분석은 이 Vκ 패밀리 중 일부가 Phe83을 함유하는 반면, 다른 것을 그렇지 않다는 것을 나타낸다(및 표 10).
이 Vκ 패밀리의 맥락에서 Phe83의 존재 또는 부재의 효과를 연구하기 위해, 155D5의 CDR 영역을 인간 프레임워크 IGKV1-39*01, IGKV2-40*01, IGKV3-11*01, IGKV4-1*01, IGKV5-2*01, IGKV6-21*01, IGKV6D-41*01 및 IGKV7-3*01에 유전적으로 그래프팅하였다. 20번 잔기에서 N 연결된 글라이코실화 부위를 함유하는 IGKV5-2*01 Asn20, 및 이의 Thr20 변이체는 이 분석에 포함되지 않았는데, 왜냐하면 전자는 이질성으로 인해 질량 분광법에 의해 분석될 수 없고, 후자는 잘 발현되지 않기 때문이다. IGKV7-3*01 Asn81이 질량 분광법에 의해 분석될 수 없으므로 분석에 포함되지 않았다. 그러나, 변이체 IGKV7-3*01-Glu81은 분석에 포함되었다. 하기 결과는 분석으로부터 얻어졌다(표 10):
1. huIGKV1-39 서열을 가지고 Phe83을 함유하는 인간화된 mAb는 탈캡핑 후 0% 내지 26%의 응집 증가를 보여주고; 접합 효율은 경계선상 허용 가능하지만(68%), 25% 초과의 응집이 없었다;
2. huIGKV2-40 서열을 가지는 인간화된 mAb는 인간 생식선 Val83을 함유하고; 이 mAb는 탈캡핑 후 25% 미만의 응집(11%) 및 70% 초과의 접합 효율(92%)을 보여준다. 이 매개변수는 허용 가능하여서, 인간 생식선 Val83이 Cys80 접합을 허용하도록 Cys80과의 쌍 지음에 적합하다는 것을 제안한다;
3. huIGKV3-11 서열을 가지는 인간화된 mAb는 인간 생식선 Phe83을 함유하는 반면; 응집은 25% 미만이고, 접합 효율은 55%이어서, 70% 초과의 기준을 만족시키지 않는다;
4. huIGKV4-1 서열을 가지는 인간화된 mAb는 인간 생식선 Val83을 함유하고; 이 mAb는 탈캡핑 후 25% 미만의 응집(6%) 및 70% 초과의 접합 효율(82%)을 보여준다. 이 매개변수는 허용 가능하여서, 인간 Val83이, huIGKV2-40 서열에 의해 볼 수 있는 것처럼, Cys80 접합을 허용하도록 Cys80과의 쌍 지음에 적합하다는 것을 제안한다;
5. huIGKV6-21 또는 huIGKV6D-41 서열 둘 다를 가지는 인간화된 mAb는 인간 생식선 Ala83을 함유하고; 이 mAb는 탈캡핑 후 25% 미만의 응집 및 70% 초과의 접합 효율을 보여준다. 이 매개변수는 허용 가능하여서, 인간 생식선 Ala83이, xi155D5 서열에 의해 볼 수 있는 것처럼, Cys80 접합을 허용하도록 Cys80과의 쌍 지음에 적합하다는 것을 제안한다; 그리고
6. huIGKV7-3-Glu81 서열을 가지는 인간화된 mAb는 인간 생식선 Thr83을 함유하고; 이 mAb는 탈캡핑 후 25% 미만의 응집(6%) 및 100%에 가까운 접합 효율을 보여준다. 이 매개변수는 허용 가능하여서, 인간 생식선 Thr83이 Cys80 접합을 허용하도록 Cys80과의 쌍 지음에 적합하다는 것을 제안한다.
Figure pct00010
이 결과는 83번 위치가 페닐알라닌에 의해 점유될 때 Cys80 접합 효율에 부정적으로 영향을 미친다는 발견을 지지하고, 알라닌 이외에, 발린 및 트레오닌이 Cys80 접합을 허용하도록 Phe83을 치환할 수 있다는 것을 나타낸다.
다른 mAb의 맥락에서, Phe83이 탈캡핑 후 높은 응집을 발생시키는 데 관여하고, Cys80에서의 접합에 적합하지 않다는 것을 확인하기 위해, C-X-X-F 또는 C-X-X-A 중 어느 하나를 함유하는 1E4(항-CA9), 166B3(항-CA9) 및 33O11(항-MSLN)의 인간화된 mAb 변이체를 생성하였다.
C-X-X-F 모티프를 가지는 단일클론 항체 변이체는 응집 사양이 아니라 접합 사양을 만족시키는 반면, C-X-X-A를 가지는 모든 인간화된 mAb 변이체는 25% 미만의 응집 및 70% 초과의 접합 효율을 보여준다(표 11 및 표 12). 이 연구는 C-X-X-(non) F 또는 K가 접합 사양을 만족시키도록 허용하는 모티프라는 것을 입증한다.
Figure pct00011
Figure pct00012
huIGKV1-7 생식선 하위패밀리에 속하는 Vκ 서열에서 발견될 수 있는 Ala83, Val83 및 Thr83 이외에, Ile83은, 드물기는 하지만, huIGKV1 생식선 패밀리에서 또한 발견될 수 있다. Ala83, Val83 및 Thr83이 Cys80 접합에 적합한 것으로 이미 발견되었지만(표 9 및 표 11), Ile83이 Cys80 접합과 관련하여 양호한 또는 불량한 잔기일 것인지를 결정되는 것이 남아 있다. 그러므로, 시험된 이전의 C-X-X-(non)F 모티프와 일치하게, 25% 미만의 응집 및 70% 초과의 접합 효율(표 11)을 나타낸, Cys80-Xaa1-Xaa2-Ile83(C-X-X-I 또는 CXXI라고도 칭함) 모티프를 함유하는, 33O11의 인간화된 mAb 변이체가 생성되었다. 이 결과는, Ala83, Val83 및 Thr83 이외에, Ile83이 접합 사양을 만족시키면서 Cys80 접합을 허용하도록 Phe83을 또한 치환할 수 있다는 발견을 지지한다.
개시된 연구는, 키메라화된 토끼 mAb가 상기 기재된 바대로 오직 개시된 탈캡핑 방법을 적용한 후 Cys80에 대한 부위 특이적 접합에 적합한 반면, C-X-X-F 모티프 또는 C-X-X-K 모티프를 가지는 인간화 토끼 mAb가 탈캡핑 후 높은 응집 및/또는 낮은 접합 효율로 인해 이러한 변형에 매우 적합하지 않다는 것을 나타낸다. Cys80을 둘러싸는 잔기가 이 현상에서 역할을 할 수 있다고 가정된다. Vκ 영역이 100개 초과의 잔기를 포함하므로, Cys80과 중요한 둘러싼 잔기 사이의 상호작용의 이해는 실험적 시험과 쌍 지은 구조 모델링의 사용을 요했다. Cys80과 매우 근접한 잔기 중에, Phe83이 Cys80 접합 효율에 부정적 효과를 발휘한다는 것이 발견되었다. 인간 Vκ 서열이 알라닌, 트레오닌, 발린 및 아이소류신을 포함하는 83번 위치에서의 다른 아미노산을 또한 함유할 수 있다는 사실에도 불구하고, 모든 토끼 mAb가 전통적인 인간화 접근법을 이용하여 인간화 후 Phe83을 함유한다는 것이 또한 관찰되었다(도 11). 이 Vκ 패밀리가 인간화에 사용될 때, Phe83 및 Lys83이 바람직하지 않은 특성, 예컨대 높은 응집 및/또는 낮은 접합 효율을 인간화된 mAb에 부여하기에 충분하지만, (접합을 위해 단일 Cys를 얻을 소망으로 인해 시험되지 않은 Cys를 제외하고) 남은 아미노산 잔기는 Cys80 접합에 적합하다는 것이 확인되었다.
이 결과는 Cys80에서 접합할 때 C-X-X-F 모티프 및 C-X-X-K 모티프가 회피되어야 한다는 것을 제안한다. Phe83의 치환을 통한 C-X-X-(not)F 또는 K 모티프, 예를 들어 모티프 C-X-X-A, C-X-X-T, C-X-X-V 및 C-X-X-I를 사용하여, 원하는 접합 사양을 만족시키는 키메라화된, 및 인간화된 mAb가 생성되었다.
xi155D5 및 인간화된 변이체의 친화도
xi155D5 및 인간화된 변이체를 표준 단백질 A 크로마토그래피 또는 탈캡핑 방법에 의해 정제하고, BIAcore를 사용하여 이의 친화도를 분석하였다(표 13). 키메라와 인간화된 155D5 사이에 KD의 2배 미만의 차이가 있고, 2개의 상이한 방법에 의해 정제된 샘플 사이에 차이가 거의 없었다.
Figure pct00013
실시예 3 - 메소텔린 - 아우리스타틴 접합된 단일클론 항체의 생성
메소텔린(MSLN)은 소정의 난소, 폐, 췌장 및 중피종 종양을 포함하는 암에서 발현된 세포-표면 단백질이다. MSLN을 표적화하기 위한 물질의 효력을 개선하기 위해, 신생 항-MSLN 토끼 단일클론 항체(mAb)를 개발하고, 후속하여 Cys80에서의 아우리스타틴 F(AuF)에 의해 조작하고 접합하여서 일련의 MSLN-AuF 접합된 mAb를 생성하였다.
토끼 항- MSLN mAb의 생성 및 규명
인간 MSLN 단백질("MSLN")을 암호화하는 플라스미드 DNA를 사용하여 Aldevron(독일)에서 뉴질랜드 토끼(오릭톨라구스 쿠니쿠루스)를 면역화하였다. 52일에, 동물 혈청을 수집하고 이후 인간 MSLN을 일시적으로 발현하는 포유류 세포를 사용하여 유세포계수법에 의해 MSLN 결합에 대해 시험하였다. 도 12-D는 동물 둘 다로부터의 혈청이 MSLN-결합 항체를 함유한다는 것을 보여준다. ELISA 검정은 이후 이 결과를 확인시켜주었다(도 12E). 이후, 동물을 희생시키고, 혈액으로부터의 PBMC, 및 비장 및 림프절로부터의 림프구를 수집하고 저온보존하였다.
이전에 냉동된 림프절로부터의 림프구를 회수하고 37℃/5% CO2에서 1시간 동안 DNase I 및 미국자리공 미토겐에 의해 처리하였다. 세포를 계수하고, 공급 세포로서 CD154를 발현하는 CHO-K1 세포에 의해 예비 시딩된 384웰 플레이트에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 사이토카인(10.5ng/㎖에서의 IL-2 및 IL-21)을 함유하는 완전 IMDM 배지 중에 5개의 세포/40㎕/웰로 시딩하였다. 1주 후 상기한 바대로 20㎕/웰의 동일한 배지를 첨가함으로써 세포를 다시 공급하였다. 시딩 후 2주에, B 세포 배양 상청액을 스크리닝에 대해 수집하여서, 인간 MSLN에 비반응성을 가지는 클론을 확인하였다. 세포를 가지는 플레이트를 냉동시키고, 미래의 RNA 단리 및 유전자 증폭을 위해 -80℃에서 저장하였다. B 세포 배양 상청액을 토끼 IgG FRET 검정에 의한 IgG 생성에 대해 처음에 스크리닝하였다. IgG 생성 클론(5,775)을 선택하고, ELISA를 사용하여 스크리닝하여서 인간 MSLN에 대한 결합을 결정하였다(제1 스크리닝). 항-MSLN 반응성 클론 중 일부를 대조군 항원(인간 CD73)이 아니라 MSLN에 대한 반응성에 대해 제시험하였다(제2 스크리닝). 5개의 mAb가 선택되고, 표 14에 기재되어 있다.
Figure pct00014
선택된 mAb를 함유하는 플레이트를 해동하고, B 세포를 용해시켜 RNAqueous Kit(Ambion)를 사용하여 RNA를 단리하였다. RNA를 사용하여 RT-PCR 반응을 설정하여서 항체 가변 영역을 증폭시켰다. 생성된 DNA를 서열분석하고, 제조사(Clontech(캘리포니아주 마운틴 뷰))가 기재한 바대로 InFusion HD(등록상표) 클로닝 시스템과의 접합성에 대해 프라이머를 설계하였다. 가변 영역 PCR 단편을 인간 감마 또는 카파 불변 영역을 함유하는 발현 플라스미드로 클로닝하였다. FreeStyle 293 발현 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 이 플라스미드를 형질감염시켜 본 명세서에서 어딘가 기재된 바와 같은 mAb를 생성하였다.
MSLN - AuF Cys80 접합된 mAb의 생성 및 규명
실시예 2에 개시된 바대로 키메라화된 mAb를 생성하였고, 여기서 xi33O11은 5개의 항-MSLN mAb 중 하나이고, 다른 4개의 mAb는 동일한 방법에 따라 키메라화되었다. 그러므로, 이 항-MSLN mAb는 짝을 이루지 못한 Cys80, 구체적으로 모티프 C-X-X-A를 함유한다. 이것은 본 명세서에서 xi324O5, xi178F16, xi237N18, xi33O11 및 xi383I18이라 칭한다.
이의 제조 후, 선택된 5개의 키메라화된 mAb를 하기 방법에 따라 아우리스타틴 F(AuF)에 접합하여 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb를 생성하였다.
"탈캡핑"에 의한 항체 정제: 토끼/인간 mAb를 탈캡핑하는 것은 Cys80에 대한 접합을 요하는 단계이다. AKTA Explorer(GE Healthcare)를 사용하여, 단백질 A 칼럼(GE Healthcare)을 10CV의 20mM 인산나트륨, 10mM EDTA(pH 7.2)에 의해 평형화하였다. 이후, 샘플을 로딩한 후, 10CV의 평형 완충제에 의해 비결합 재료를 세척하였다. 칼럼을 16시간 동안 0.5㎖/분에서 16CV의 20mM 인산나트륨, 10mM EDTA, 5mM 시스테인(pH 7.2)에 의해 세척하였다. 이후, 칼럼을 60시간 동안 0.5㎖/분에서 60CV의 20mM Tris(pH 7.5)에 의해 세척하였다. 5CV의 0.1M 글라이신(pH 2.9)을 사용하여 샘플을 용리시켰다. mAb를 함유하는 분획을 혼주시키고, MWCO 20K 슬라이드-A-용리장치(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 DPBS 중에 투석하였다. BCA 검정에 의해 단백질 회수를 결정하였다.
아우리스타틴 F 접합: C-X-X-A 모티프를 함유하는 정제되고 탈캡핑된 키메라화된 MSLN-mAb를 말레이미도-PEG2-아우리스타틴 F(mal-PEG2-AuF)와 항온처리하고(구조 비도시), 1x PBS 중에 5㎎/㎖의 최종 항체 농도로 5:1 몰 비(AuF:MAb)로 DMSO(Concortis Biosystems(캘리포니아주 샌 디에고)) 중에 10mM 스톡으로부터 희석시켰다. 22℃에서 2시간 동안 접합을 수행하였다. 실행 완충제로서 1x PBS를 사용하여 26/10 탈염 칼럼(GE Healthcare)이 장착된 AKTA FPLC에서 탈염 정제에 의해 비반응된 mal-PEG2-AuF를 제거하였다. 항체 함유 분획을 혼주시키고, BCA 검정에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
말레이미도-PEG2-아우리스타틴 F:
Figure pct00015
UPLC/ESI-MS 분석: 샘플을 20mM의 최종 농도로 DTT를 첨가함으로써 환원시킨 후, 3분 동안 60℃에서 항온처리하였다. 이후, Waters Acquity UPLC 및 Q-Tof Premier 질량 분광계를 사용하여 샘플을 분석하였다. 샘플(각각 0.5-2㎍)은 65℃에서 MassPrep 마이크로 탈염 칼럼으로 주입되고, 0.05㎖/분에서 이동상 A의 95% 중의 5분 평형, 10분 구배(5-90% B) 및 이동상 A의 95% 중의 10분 재평형으로 칼럼으로부터 용리되었다. 이동상 A는 물 중의 0.1% 폼산이었다. 이동상 B는 아세토나이트릴 중의 0.1% 폼산이었다. Q-Tof 질량 분광계는 500-4000m/z의 범위의 검출로 양성 이온, V-모드 중에 실행되었다. 소스 매개변수는 하기와 같다: 모세관 전압, 2.25kV(온전한 항체)-2.50kV(환원된 항체); 샘플링 콘 전압, 65.0V(온전한 항체) 또는 50.0V(환원된 항체); 소스 온도, 100℃; 탈용매화 온도, 250℃; 탈용매화 유속, 550ℓ/시간. MassLynx MaxEnt 1 함수를 사용하여 단백질 피크를 디콘볼루션하였다. 대표적인 분석은 도 13에 도시되어 있다. 통상적으로, 90% 이상의 접합된 mAb는 2의 항체-대-작용제 비율을 가져서, 각각의 키메라화된 항-MSLN mAb가 Cys801 및 Cys802의 각각에 접합된 AuF 분자를 보유한다는 것을 의미한다.
시험관내 세포독성
A431-MSLN은 인간 MSLN을 안정하게 발현하는 A431 세포(ATCC(등록상표) CRL-1555(상표명))로부터 유래한 세포이다. A431-MSLN 세포를 계대배양하고, 96웰 플레이트에서 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지 중에 10,000개의 세포/웰/100㎕로 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 16시간 동안 항온처리하였다. 2㎖의 딥웰 희석 플레이트에서 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb를 1:4 연속 희석하였다. 희석된 화합물(100㎕)을 0.28-75㎍/㎖의 범위의 최종 농도로 세포 플레이트에 첨가하였다. Mal-PEG2-AuF를 접합된 mAb의 등몰 농도로 사용하였다. 예를 들어, 10㎍/㎖의 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb(DAR=2)는 0.14㎍/㎖의 mal-PEG2-AuF에 상응한다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 추가적인 48시간 동안 항온처리하였다. 배지를 버리고, 플레이트를 200㎕의 DPBS에 의해 1회 세척하고, 22℃에서 15분 동안 50㎕의 0.2% 결정 바이올렛 용액에 의해 염색하고, 이후 수돗물로 광범위하게 세척하였다. 플레이트를 공기 건조시키고, 결정 바이올렛을 200㎕의 1% SDS 용액에 의해 용해시켰다. 570㎚에서 비색 광학 밀도를 결정하였다. 엑셀을 사용하여 광학 밀도로부터 세포 수를 추론하고, GraphPad Prism 6을 사용하여 세포독성 백분율을 작도하였다.
MSLN 음성 A431 세포를 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb에 의해 처리할 때, 상당한 세포독성이 관찰되지 않은 반면, mal-PEG2-AuF는 오직 시험된 가장 높은 농도에서 세포독성이었다(도 14A). MSLN 양성 A431-MSLN 세포를 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb에 의해 처리할 때, 상당한 세포독성이 관찰되었다. 용량-반응 곡선(도 14B)에 기초하여, MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb는 2개 군으로 분류될 수 있었다: 중간 세포독성 - xi324O5-AuF 및 xi178F16-AuF; 및 높은 세포독성 - xi237N18-AuF, xi33O11-AuF 및 xi383I18-AuF.
생체내 평가 - MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb의 초기 선택
높은 효율 및 낮은 독성을 가지는 아주 적은 화합물을 선택할 목적으로 MSLN을 발현하는 종양에 대한 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb의 생체내 효율을 시험하였다.
A431-MSLN 세포를 세포 배양물 중에 증식시키고, 혈청 비함유 성장 배지 중에 현탁시키고, Matrigel(상표명)과 1:1 혼합하고, 500만 개의 세포/0.2㎖/마우스를 무흉선 NCr nu/nu 마우스로 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양 용적을 캘리퍼 측정에 의해 타원체 구에 대한 식을 이용하여 결정하였다(㎜): 길이 x 폭2/2 = 용적(㎣). 종양 용적이 100-250㎣의 범위일 때, 마우스를 치료군으로 무작위화하였다. 동물 체중 및 종양 크기를 주마다 2회 기록하였다. 이 연구의 전체 설계는 표 15에 요약되어 있다. MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb를, 전체 2 용량으로, 무작위화 일(1일)에 시작하여 정맥내(i.v.) Q7D 투여하였다.
Figure pct00016
도 15는, 8마리 중 3마리의 동물이 높은 종양 부담 및/또는 종양 궤양으로 인해 식염수 치료군에서 마취되어야 할 때, 이식 후 18일까지 상이한 치료군 중에 평균 종양 용적을 보여준다. 이식 후 4일은, 모든 군에 걸쳐 157-160㎣의 범위의 평균 종양 용적으로, 마우스가 상이한 치료군으로 무작위화된 날짜에 상응한다. 이 날에, MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb의 제1 용량을 투여하고, 이후 11일에 제2 용량을 투여하였다.
모든 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb는, 18일에 종양 용적이 식염수 치료군과 비교되어 20% 이하라는 사실에 의해 입증된 바대로 항-종양 반응을 보여주었다(표 16). 반대로, mal-PEG2-AuF는 항-종양 반응을 보여주지 않았다.
Figure pct00017
4일과 비교하여 (각각의 군에서의 연구 중 동물의 평균 중량을 기준으로) 18일에 임의의 체중 감소를 관찰하고, 임의의 죽은 또는 빈사 상태의 동물을 관찰함으로써 독성을 또한 평가하였다(표 17). xi324O5-AuF 치료군에서, 살아 있는 동물, 및 2마리의 죽은/빈사 상태의 동물에서 11%의 체중 감소가 관찰되었다. xi178F16-AuF, xi237N18-AuF 및 xi383I18-AuF 치료군에서, 상당한 체중 감소가 관찰되지 않았지만, 1마리 또는 2마리의 죽은/빈사 상태의 동물이 관찰되었다. 모든 다른 치료군은 체중 감소도 죽은/빈사 상태의 동물도 나타내지 않았다.
Figure pct00018
항-종양 반응 및 최소 독성에 기초하여, 추가의 평가에 대해 mAb xi33O11-AuF 및 xi237N18-AuFFFM 선택하였다.
MSLN - AuF Cys80 접합된 mAb에 의해 매개된 항-종양 활성의 표적 특이성의 평가
이 연구에 사용된 방법은 상기 기재된 것과 동일하였다(생체내 평가 - MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb의 초기 선택). 4일에 각각의 마우스의 왼쪽 옆구리에 이식된 A431-MSLN 세포 이외에, MSLN 음성 A431 세포를 동일한 마우스에서 1일에 반대쪽(오른쪽) 옆구리에서 이식하였다. 전자의 세포는 후자보다 더 빨리 종양을 성장시키고, 그러므로 이후 3일에 이식되어서, 옆구리 둘 다에서의 종양이 용적이 유사할 때 시험 약물의 제1 용량이 주어졌다. 이 연구의 전체 설계는 표 18에 요약되어 있다.
Figure pct00019
MSLN 양성 종양: 도 16A는, 8마리 중 4마리의 동물이 높은 종양 부담 및/또는 종양 궤양으로 인해 식염수 치료군에서 마취되어야 할 때, 이식 후 18일까지 상이한 치료군 중에 평균 종양 용적을 보여준다. 이식 후 4일은, 모든 군에 걸쳐 169-178㎣의 범위의 평균 A431-MSLN 종양 용적으로, 마우스가 상이한 치료군으로 무작위화된 날짜에 상응한다. 이 날에, MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb의 제1 용량을 투여하고, 이후 11일에 제2 용량을 투여하였다.
xi33O11-AuF는 식염수 치료군과 비교하여 12%로 18일에 종양 용적을 감소시킨 항-종양 반응을 매개하였다(표 19). xi237N18-AuF는 식염수 치료군과 비교하여 24%로 종양 용적을 감소시킨 항-종양 반응을 매개하였다(표 19). 비대응 양측 t 검정은 각각 0.00039 및 0.00197의 p 값을 나타내어서, 식염수 치료군에 대한 이 항-종양 반응이 통계학적으로 유의미하지 않다는 것을 제안한다. 반대로, 엔도시알린/TEM1을 표적화하는, mal-PEG2-AuF 또는 xi1-55-2-AuF는 유의미한 항-종양 반응을 나타내지 않았다.
Figure pct00020
MSLN 음성 종양: 도 16B는 이식 후 21일까지 상이한 치료군 중에 평균 종양 용적을 보여주고, 이 날짜는 상기 기재된 바대로 A431-MSLN 이식 후 18일에 상응하고, 이식 후 7일은, 모든 군에 걸쳐 174-184㎣의 범위의 평균 A431 종양 용적으로, 마우스가 상이한 치료군으로 무작위화된 날짜에 상응한다. xi33O11-AuF는 식염수 치료군과 비교하여 78%로 21일에 종양 용적을 감소시킨 항-종양 반응을 매개하였다(표 20). xi237N18-AuF Cys80 접합된 mAb는 식염수 치료군과 비교하여 64%로 21일에 종양 용적을 감소시킨 항-종양 반응을 매개하였다(표 20). 비대응 양측 t 검정은 각각 0.317 및 0.091의 p 값을 나타내어서, 식염수 치료군에 대한 이 항-종양 반응이 통계학적으로 유의미하지 않다는 것을 제안한다. 이 반응은 mal-PEG2-AuF 또는 xi1-55-2-AuF에 의해 관찰된 것과 유사하였다.
Figure pct00021
독성은 7일과 비교하여 A431 세포의 이식 후 21일에 임의의 체중 감소를 관찰하고, 임의의 죽은 또는 빈사 상태의 동물을 관찰함으로써 또한 평가되었다(표 21). 임의의 치료군에서 10% 초과의 체중 감소가 관찰되었다. xi33O11-AuF 및 xi237N18-AuF 치료군 둘 다에서 2건의 사망이 관찰되었다.
Figure pct00022
결론
MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb가 생성되고 시험관내 세포독성 및 생체내 항-종양 활성에 기초하여 스크리닝되었다. 시험관내 세포독성 분석은 이 화합물이 MSLN 음성 종양 세포가 아니라 MSLN 양성을 표적화하고 사멸한다는 것을 나타낸다.
시험된 모든 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb는 항-종양 활성을 가지고, 이들 중 몇몇은 다른 것보다 잠재적으로 더 독성인 것으로 보였다. 이 독성의 성질이 추가로 규명되지 않았다. 생체내 시험된 MSLN-AuF Cys80 접합된 mAb 둘 다가 MSLN 양성 종양을 표적화하고 이의 성장을 저해하는 것으로 관찰된 반면, 반대 옆구리에서 MSLN 음성 종양에 대한 상당한 효과가 관찰되지 않았다. xi237N18의 독성 프로파일이 연구 둘 다에서 유사하지만, xi33O11-AuF 처리는 제1 연구에서 독성을 나타내지 않지만, 제2 연구에서 2건의 사멸과 연관되었다. 이 독성의 성질이 추가로 규명되지 않았지만, xi33O11-AuF 처리된 마우스가 다른 옆구리에서 여전히 큰 MSLN 음성 종양을 보유하고, 따라서 제1 연구에서 동물보다 더 아프고, 이 마우스는 MSLN 양성 종양에 대한 많은 종양 세포 용해의 효과에 더 감수성일 수 있다.
실시예 4 - 항체-형광성 염료 접합체의 생성
C-X-X-A 모티프를 함유하는 xi155D5 mAb를 800CW 염료(LI-COR Biotechnology(네브라스카주 링컨))에 접합하여 Cys801 및 Cys802에 접합된 2개의 염료 분자를 가지는 xi155D5-800CW Cys80 접합된 mAb를 생성하였다.
말레이미드-(CH2)2-800CW(LiCor)를 사용하여 Cys80에 대한 800CW의 접합을 수행하고, 이로써 (CH2)2는 알킬 링커이다. 간단히 말하면, 말레이미드-(CH2)2-800CW를 10mM의 최종 농도로 100% DMSO 중에 용해시켰다. 말레이미드-(CH2)2-800CW를 염료:MAb의 5:1 몰 비로 xi155D5(1x PBS 중 5㎎/㎖)에 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 항온처리하였다. PD-10 칼럼(Millipore)에서 탈염시킴으로써 비혼입된 염료를 제거하였다. Superdex 75에서 크기 배제 크로마토그래피를 통해 xi155D5-800CW를 추가로 손질하였다. 보이드 용적 재료를 혼주시키고 분취하고 사용까지 -80℃에서 냉동시켰다. 환원된 xi155D5-800CW의 SDS-PAGE 및 영상화 분석은 염료가 중쇄가 아니라 경쇄 상에 오직 접합된다는 것을 나타낸다(도 17).
NCR-누드 암컷 마우스에 오른쪽 뒷다리에 피하로 colo205 또는 HT-29 인간 종양 세포를 주사하였다. 캘리퍼 측정에 의해 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 용적이 200-300㎣일 때, 0.1㎎/200㎕/마우스로 xi155D5-800CW를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 형광 리빙 영상화를 통해 xi155D5-800CW 분포를 모니터링하기 위해, 동물이 의식이 없을 때까지 아이소플루오란/O2를 사용하여 동물을 대략 3-4분 동안 마취 챔버에 위치시켰다. IVIS(등록상표) Lumina II-Kinetic 기기(PerkinElmer(메사추세츠주 왈탐))에서 745 여기 및 840 방출의 형광 설정을 이용하여 동물을 영상화하였다. 도 18에 표시된 바대로 상이한 시점에 배측, 오른측, 등측 및 왼측의 영상을 취했다. 각각의 연속 영상 후, 동물이 100% 산소 플러쉬, 이어서 일반 공기를 받은 회수 챔버에서 의식을 다시 얻도록 하였다.
colo205 또는 HT-29 모델을 이용하여, xi155D5-800CW가, 이의 형광 신호의 종양 특이적 국재화에 의해 입증된 바대로, 인간 종양을 효과적으로 표적화한다는 것이 관찰되었다(도 18).
이 결과는 C-X-X-(not)F, K 또는 C 모티프를 함유하는 mAb가 염료에 접합될 수 있다는 것 및 종양 상태를 확인하고 모니터링하기 위해 접합된 mAb가 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 5 - 2가/이중특이적 항원-결합 분자의 생성
C-X-X-(not)F, K, 또는 C 모티프를 함유하는 mAb가 파파인에 의해 분해되거나, Fab 단편으로서 재조합으로 발현될 때, Fab가 오직 하나의 Vκ 영역을 함유하므로, 이것은 단일의 짝을 이루지 못한 Cys80을 함유할 것이다. 직각 접합 화학을 이용하여, 몇몇 열거하자면 2개의 리간드(사이토카인, 케모카인), 2개의 막 수용체, 또는 리간드/수용체 조합을 포함하는 2개의 독립적인 질환 관련 표적을 표적화하기 위해 사용될 수 있는, 화학적으로 접합된 2가/이중특이적 항원-결합 분자, 예컨대 2가/이중특이적 Fab-Fab를 생성하도록 Cys80 함유 Fab를 사용할 수 있다.
예로서, Fc 단편 및 비분해된 mAb를 제거하도록 제한된 파파인 분해, 이어서 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 xi155D5 및 xi1-55-2로부터 Fab를 생성하였다. 질량 분광법을 이용하여 Fab는 완전히 탈캡핑되는 것으로 나타났다(데이터 비도시). 후속하여, xi155D5 및 xi1-55-2 Fab를 각각 말레이미도-PEG4-다이벤질사이클로옥틴(DBCO) 및 말레이미도-PEG4-아지드를 사용하여 별개로 접합하였다. 비접합된 화합물을 탈염 크로마토그래피에 의해 제거하고, Cys80 부위의 완전한 점유는 질량 분광법에 의해 확인되었다(데이터 비도시). 이후, xi155D5-말레이미도-PEG4-DBCO 및 xi1-55-2-말레이미도-PEG4-아지드 단편을 균주 프로모팅된 구리 비함유 클릭 화학을 이용하여 22℃에서 16시간 동안 PBS 중의 항온처리에 의해 서로에 접합하였다. 접합된 생성물을 겔 여과 크로마토그래피를 이용함으로써 분별하고(도 19A), 상이한 종을 이의 예상된 분자 크기에 기초하여 SDS-PAGE에 의해 확인하였다(도 19B). xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자를 함유하는 분획을 혼주시키고, xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자 동일성을 이의 예상된 질량(95,939Da, 도 19C)에 기초하여 질량 분광법에 의해 확인하였다.
xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자의 이중특이성은 역 샌드위치 검정을 이용하여 바이오층 간섭 측정법(biolayer inferometry: BLI) 분석을 통해 확인되었다. 이 분석은 (xi155D5 Fab 모이어티에 의해 결합된) 고정된 인간 CA9에 대한 결합, 이어서 (xi1-55-2 Fab 모이어티에 의해 결합된) 가용성 TEM-1의 결합을 입증한다(도 20). 예상된 바대로, xi155D5 mAb, xi155D5 Fab 및 xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자는 고정된 CA9에 결합하였다. 오직 CA9 고정된 xi155D5/xi1-55-2 2가/이중특이적 항원-결합 분자는, 관찰된 추가적인 반응 이동에 의해 입증된 바대로, 인간 엔도시알린/TEM-1에 또한 결합할 수 있었다(도 20, 이중 화살표). 표면 플라즈몬 분석은 CA9 또는 TEM-1에 대한 xi155D5/xi1-55-2의 친화도가 각각 동일하거나 약간 감소한다는 것을 입증한다(표 22).
이 결과는 1) C-X-X-(not)F를 함유하는 mAb가 폴리펩타이드, 예컨대 항체 단편 또는 Fab에 접합될 수 있다는 것; 및 2) C-X-X-(not)F를 함유하는, 상이한 특이성의, 2개의 mAb 또는 Fab가 직각으로 접합될 때, 2가/이중특이적 화합물이 생성될 수 있다는 것을 입증한다.
Figure pct00023
실시예 6 - 항체-펩타이드 접합체의 생성
C-X-X-A 모티프를 함유하는 xi33O11 및 xi1-55-2 mAb를 아지드-변형된 펩타이드 Aβ(1-16)(서열 번호 40)에 접합하였다(표 23).
Figure pct00024
2단계 접합 절차를 이용하여 Cys80으로의 펩타이드 Aβ(1-16)의 접합을 수행하고, 이로써 Cys80은 처음에 말레이미도-다이벤질사이클로옥틴(mal-DBCO)에 의해 접합되었다. 이후, 균주 프로모팅된 구리 비함유 클릭 화학을 이용하여 아지도-변형된 펩타이드 Aβ(1-16)는 DBCO-변형된 mAb에 접합되었다. 간단히 말하면, mAb(20㎎)를 1x DPBS 중에 22℃에서 16시간 동안 5:1의 mal-DBCO:MAb 몰 비로 mal-DBCO(Click Chemistry Tools, 카탈로그 A108)와 항온처리하였다. 실행 완충제로서 1x DPBS를 가지는 HiPrep 26/10 칼럼을 사용하여 탈염 크로마토그래피에 의해 비혼입된 mal-DBCO를 접합된 mAb로부터 제거하였다. 100%의 접합 효율(비접합된 경쇄의 증거가 없음)은 LC-MS에 의해 mAb 둘 다에 대해 확인되었다(도 21 및 표 24). 각각의 mAb(50㎕/각각, 각각 95㎍ 및 70㎍의 xi1-55-2 및 xi33O11)를 22℃에서 16시간 동안 1x DPBS 중에 20:1의 펩타이드:MAb 몰 비로 펩타이드 Aβ(1-16)와 항온처리하였다. SDS-PAGE에 의해 접합을 분석하였다. 샘플을 환원제로서 20mM DTT에 의해 환원 조건 하에 실행하고, 분리 전에 10분 동안 75℃로 가열하였다.
SDS-PAGE의 분석은 검출 불가능한 비접합된 경쇄에 의해 동반된 펩타이드-접합된 경쇄 이동의 지연은 나타내어서, 효과적인 접합을 나타낸다(도 21). 중쇄 이동도의 변화가 관찰되지 않았다. 이후, 접합을 0.5㎖의 Zeba 40k MWCO 스핀 탈염 칼럼(Thermo-Fisher)을 사용하여 탈염시켜 비접합된 펩타이드를 제거하고, LC-MS에 의해 분석하였다. 질량 분광 분석(도 22a-f)은 펩타이드가 85%-100%의 효율로 xi1-55-2 및 xi33O11의 경쇄에 접합한다는 것을 나타낸다(표 24).
이 결과는 C-X-X-(not)F, K 또는 C 모티프를 함유하는 mAb가 효과적으로 펩타이드에 접합될 수 있다는 것을 입증한다.
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당해 분야의 당업자는 다수의 변경 및 변형이 본 발명의 바람직한 실시형태에 이루어질 수 있고, 이러한 변경 및 변형이 본 발명의 정신으로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 첨부된 청구항이 본 발명의 진정한 정신 및 범위에 해당하는 모든 이러한 균등한 변동을 포괄하는 것으로 의도된다.
실시형태
실시형태의 하기 목록은 이전의 설명을 대체하거나 이에 대신하기보다는 보완하도록 의도된다.
실시형태 1. 접합된 면역글로불린을 생성하는 방법으로서,
토끼로부터 유래된 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에서 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys80")을 탈캡핑하는 단계(여기서, 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함함); 및
티올 반응성 화합물을 Cys80에 접합시키는 단계(여기서, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함함)를 포함하는, 방법.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 가변 영역인, 방법.
실시형태 3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 경쇄 가변 영역은 오릭톨라구스 쿠니쿠루스로부터 유래된, 방법.
실시형태 4. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 경쇄 가변 영역은 패밀리 IGKV-1의 인간 카파 경쇄 가변 영역인, 방법.
실시형태 5. 이전의 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 탈캡핑은 면역글로불린을 환원 완충제와 항온처리한 후, 면역글로불린을 산화 완충제와 항온처리하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 6. 실시형태 5에 있어서, 환원 완충제와의 항온처리 전에 매트릭스 상에 면역글로불린을 고정시키는 단계 및 산화 완충제와의 항온처리 후에 매트릭스로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 7. 실시형태 6에 있어서, 매트릭스는 단백질 A를 포함하는, 방법.
실시형태 8. 이전의 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 티올 반응성 기는 말레이미드 또는 할로아세틸인, 방법.
실시형태 9. 이전의 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 티올 반응성 기는 링커에 부착된, 방법.
실시형태 10. 실시형태 9에 있어서, 링커는 절단 불가 링커 또는 절단 가능 링커인, 방법.
실시형태 11. 실시형태 10에 있어서, 링커는 다이설파이드 함유 링커, 아세탈계 링커 또는 케탈계 링커인, 방법.
실시형태 12. 이전의 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 티올 반응성 화합물은 작용제에 부착된, 방법.
실시형태 13. 실시형태 12에 있어서, 작용제는 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물을 포함하는, 방법.
실시형태 14. 이전의 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 화합물에 결합되고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 가지는 제2 면역글로불린에 결합되고, 제2 경쇄 가변 영역은 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys802")을 가지고, 제2 티올 반응성 화합물은 Cys802에 결합된 제2 티올 반응성 기를 포함하는, 방법.
실시형태 15. 실시형태 14에 있어서, 티올 반응성 화합물은 클릭 화학에 의해 제2 티올 반응성 화합물에 결합된, 방법.
실시형태 16. 이전의 실시형태 중 어느 하나에 있어서, Cys80은 짝을 이루지 못한, 방법.
실시형태 17. 이전의 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린은 키메라화된 면역글로불린인, 방법.
실시형태 18. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 탈캡핑 전에 면역글로불린을 키메라화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 19. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린은 인간화된 면역글로불린인, 방법.
실시형태 20. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린을 인간화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 21. 이전의 실시형태 중 어느 하나에 있어서, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 22. 실시형태 21에 있어서, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기는 극성 또는 소수성 잔기인, 방법.
실시형태 23. 항원-결합 분자를 생성시키는 방법으로서, 제1 접합된 면역글로불린을 제2 접합된 면역글로불린과 항온처리하여 항원-결합 분자를 생성시키는 단계를 포함하고,
제1 접합된 면역글로불린은 제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제1 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys801")을 가지고, Cys801은 제1 티올 반응성 기를 포함하는 제1 티올 반응성 화합물에 접합되고;
제2 접합된 면역글로불린은 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys802")을 가지고, Cys802는 제2 티올 반응성 기를 포함하는 제2 티올 반응성 화합물에 접합된, 방법.
실시형태 24. 실시형태 23에 있어서, Cys801 , Cys802, 또는 둘 다는 짝을 이루지 못한, 방법.
실시형태 25. 실시형태 23 또는 24에 있어서, 항온처리 단계 전에,
Cys801, Cys802, 또는 둘 다를 탈캡핑하는 단계; 및
제1 티올 반응성 화합물을 Cys801에 접합하거나, 제2 티올 반응성 화합물을 Cys802에 접합하거나, 또는 둘 다인 단계이되, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 티올 반응성 기를 포함하고, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 기를 포함하는, 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 26. 실시형태 23-25 중 어느 하나에 있어서, 탈캡핑은 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 환원 완충제와 항온처리한 후, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 산화 완충제와 항온처리하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 27. 실시형태 26에 있어서, 환원 완충제와의 항온처리 전에 매트릭스 상에 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 고정시키는 단계 및 산화 완충제와의 항온처리 후에 매트릭스로부터 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 용리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 28. 실시형태 27에 있어서, 매트릭스는 단백질 A를 포함하는, 방법.
실시형태 29. 실시형태 23 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 키메라화된, 방법.
실시형태 30. 실시형태 23 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 탈캡핑 전에 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 키메라화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 31. 실시형태 23 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 인간화된, 방법.
실시형태 32. 실시형태 23 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다를 인간화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 33. 실시형태 23 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 말레이미드 또는 할로아세틸인, 방법.
실시형태 34. 실시형태 23 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 링커에 부착되거나, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 링커에 부착되거나, 또는 둘 다인, 방법.
실시형태 35. 실시형태 34에 있어서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 절단 불가 링커 또는 절단 가능 링커인, 방법.
실시형태 36. 실시형태 35에 있어서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 다이설파이드 함유 링커, 아세탈계 링커 또는 케탈계 링커인, 방법.
실시형태 37. 실시형태 23 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 작용제를 추가로 포함하거나, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 작용제를 추가로 포함하거나, 또는 둘 다인, 방법.
실시형태 38. 실시형태 37에 있어서, 제1 작용제, 제2 작용제, 또는 둘 다는 화학 링커인, 방법.
실시형태 39. 실시형태 38에 있어서, 제1 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-아지드 또는 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴인, 방법.
실시형태 40. 실시형태 38 또는 39에 있어서, 제2 티올 반응성 화합물은 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴 또는 말레이미도-PEG4-아지드인, 방법.
실시형태 41. 실시형태 23 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 클릭 화학에 의해 서로 접합된, 방법.
실시형태 42. 실시형태 23 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린은 제1 Fab이거나, 제2 면역글로불린은 제2 Fab이거나, 또는 둘 다인, 방법.
실시형태 43. 실시형태 23 내지 42 중 어느 하나에 있어서, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 또는 둘 다를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 44. 실시형태 43에 있어서, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기는 극성 또는 소수성 잔기인, 방법.
실시형태 45. 실시형태 23 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 제1 경쇄 가변 영역, 제2 경쇄 가변 영역, 또는 둘 다는 오릭톨라구스 쿠니쿠루스로부터 유래된, 방법.
실시형태 46. 실시형태 23 내지 45 중 어느 하나의 방법에 따라 제조된 항원-결합 분자.
실시형태 47. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린으로서, 경쇄 가변 영역은 80번 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가지는, 면역글로불린.
실시형태 48. 실시형태 47에 있어서, 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 가변 영역인, 면역글로불린.
실시형태 49. 실시형태 47 또는 48에 있어서, 경쇄 가변 영역은 오릭톨라구스 쿠니쿠루스로부터 유래된, 면역글로불린.
실시형태 50. 실시형태 47 내지 49 중 어느 하나에 있어서, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산은 극성 또는 소수성 아미노산인, 면역글로불린.
실시형태 51. 실시형태 47 내지 50 중 어느 하나에 있어서, Cys80은 짝을 이루지 못한, 면역글로불린.
실시형태 52. 실시형태 47 내지 51 중 어느 하나에 있어서, Cys80은 탈캡핑된, 면역글로불린.
실시형태 53. 실시형태 47 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린은 키메라화된, 면역글로불린.
실시형태 54. 실시형태 47 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린은 인간화된, 면역글로불린.
실시형태 55. 실시형태 47 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린은 인간 CA9에 면역특이적으로 결합하는, 면역글로불린.
실시형태 56. 실시형태 55에 있어서,
a. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
f. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역글로불린.
실시형태 57. 실시형태 56에 있어서,
a. 각각 서열 번호 146, 148 및 150에 기재된 xi155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 224, 226 및 228에 기재된 xi155D5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
b. 각각 서열 번호 152, 154 및 156에 기재된 zu155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 242, 244 및 246에 기재된 zu155D5LC-3, 각각 서열 번호 248, 250 및 252에 기재된 zu155D5LC-4, 각각 서열 번호 254, 256 및 258에 기재된 zu155D5LC-5, 각각 서열 번호 260, 262 및 264에 기재된 zu155D5LC-6, 각각 서열 번호 266, 268 및 270에 기재된 zu155D5LC-7, 각각 서열 번호 278, 280 및 282에 기재된 zu155D5LC-huVK2-40, 각각 서열 번호 290, 292 및 294에 기재된 zu155D5LC-huVK4-1, 각각 서열 번호 296, 298 및 300에 기재된 zu155D5LC-huVK6-21, 각각 서열 번호 302, 304 및 306에 기재된 zu155D5LC-huVK6D-41; 또는 각각 서열 번호 308, 310 및 312에 기재된 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
c. 각각 서열 번호 164, 166 및 168에 기재된 xi1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 320, 322 및 324에 기재된 xi1E4LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
d. 각각 서열 번호 170, 172 및 174에 기재된 zu1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 332, 334 및 336에 기재된 zu1E4LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
e. 각각 서열 번호 212, 214 및 216에 기재된 xi166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 386, 388 및 390에 기재된 xi166B3LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
f. 각각 서열 번호 218, 220 및 222에 기재된 zu166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 398, 400 및 402에 기재된 zu166B3LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 면역글로불린.
실시형태 58. 실시형태 46 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린은 인간 TEM1에 면역특이적으로 결합하는, 면역글로불린.
실시형태 59. 실시형태 58에 있어서,
xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역글로불린.
실시형태 60. 실시형태 59에 있어서,
각각 서열 번호 158, 160 및 162에 기재된 xi1-55-2HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 314, 316 및 318에 기재된 xi1-55-2LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 면역글로불린.
실시형태 61. 실시형태 46 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린은 인간 메소텔린에 면역특이적으로 결합하는, 면역글로불린.
실시형태 62. 실시형태 61에 있어서,
a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역글로불린.
실시형태 63. 실시형태 62에 있어서,
a. 각각 서열 번호 176, 178 및 180에 기재된 xi33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 338, 340 및 342에 기재된 xi33O11LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
b. 각각 서열 번호 182, 184 및 186에 기재된 zu33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 350, 352 및 354에 기재된 zu33O11LC-CXXA, 또는 각각 서열 번호 356, 358 및 360에 기재된 zu33O11LC-CXXI의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
c. 각각 서열 번호 188, 190 및 192에 기재된 xi324O5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 362, 364 및 366에 기재된 xi324O5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
d. 각각 서열 번호 194, 196 및 198에 기재된 xi178F16HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 368, 370 및 372에 기재된 xi178F16LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
e. 각각 서열 번호 200, 202 및 204에 기재된 xi237N18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 374, 376 및 378에 기재된 xi237N18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
f. 각각 서열 번호 206, 208 및 210에 기재된 xi383I18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 380, 382 및 384에 기재된 xi383I18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 면역글로불린.
실시형태 64. 접합된 면역글로불린으로서,
실시형태 46-63 중 어느 하나의 면역글로불린을 포함하고, 80번 위치에서의 시스테인은 티올 반응성 화합물에 접합되고, 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함하는, 접합된 면역글로불린.
실시형태 65. 실시형태 64에 있어서, 티올 반응성 기는 말레이미드 또는 할로아세틸인, 접합된 면역글로불린.
실시형태 66. 실시형태 64 또는 65에 있어서, 티올 반응성 기는 링커에 부착된, 접합된 면역글로불린.
실시형태 67. 실시형태 66에 있어서, 링커는 절단 불가 링커 또는 절단 가능 링커인, 접합된 면역글로불린.
실시형태 68. 실시형태 67에 있어서, 링커는 다이설파이드 함유 링커, 아세탈계 링커 또는 케탈계 링커인, 접합된 면역글로불린.
실시형태 69. 실시형태 64 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 티올 반응성 화합물은 작용제를 추가로 포함하는, 접합된 면역글로불린.
실시형태 70. 실시형태 69에 있어서, 작용제는 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물을 포함하는, 접합된 면역글로불린.
실시형태 71. 실시형태 70에 있어서, 작용제는 아우리스타틴 F인, 접합된 면역글로불린.
실시형태 72. 실시형태 69 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 접합된 면역글로불린은 2:1의 면역글로불린:작용제 비율을 가지는, 접합된 면역글로불린.
실시형태 73. 약제학적 유효량의 접합된 메소텔린 면역글로불린을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 접합된 메소텔린 면역글로불린은
실시형태 61 내지 63 중 어느 하나의 면역글로불린, 및
티올 반응성 기, 링커 및 작용제를 포함하는 티올 반응성 화합물을 포함하는, 방법.
실시형태 74. 실시형태 73에 있어서, 작용제는 아우리스타틴 F인, 방법.
실시형태 75. 실시형태 73 또는 74에 있어서, 암은 메소텔린을 발현하는 암인, 방법.
실시형태 76. 항원-결합 분자로서,
제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 접합된 면역글로불린(여기서, 제1 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys801")을 가지고, Cys801은 제1 티올 반응성 기를 포함하는 제1 티올 반응성 화합물에 접합됨), 및
제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 접합된 면역글로불린(여기서, 제2 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys802")을 가지고, Cys802는 제2 티올 반응성 기를 포함하는 제2 티올 반응성 화합물에 접합됨)을 포함하는, 항원-결합 분자.
실시형태 77. 실시형태 76에 있어서, 제1 경쇄 가변 영역, 제2 경쇄 가변 영역, 또는 둘 다는 오릭톨라구스 쿠니쿠루스로부터 유래된, 항원-결합 분자.
실시형태 78. 실시형태 76 또는 77에 있어서, Cys801, Cys802, 또는 둘 다는 짝을 이루지 못한, 항원-결합 분자.
실시형태 79. 실시형태 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 키메라화된, 항원-결합 분자.
실시형태 80. 실시형태 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 인간화된, 항원-결합 분자.
실시형태 81. 실시형태 76 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린의 83번 위치에서의 아미노산, 제2 면역글로불린의 83번 위치에서의 아미노산, 또는 둘 다는 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기인, 항원-결합 분자.
실시형태 82. 실시형태 81에 있어서, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기는 극성 또는 소수성 잔기인, 항원-결합 분자.
실시형태 83. 실시형태 76 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린 및 제2 면역글로불린은 상이한 항원에 결합하는, 항원-결합 분자.
실시형태 84. 실시형태 76 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 제1 티올 반응성 기, 제2 티올 반응성 기, 또는 둘 다는 말레이미드 또는 할로아세틸인, 항원-결합 분자.
실시형태 85. 실시형태 76 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 링커를 추가로 포함하거나, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 링커를 추가로 포함하거나, 또는 둘 다인, 항원-결합 분자.
실시형태 86. 실시형태 85에 있어서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 절단 가능 링커 또는 절단 불가 링커인, 항원-결합 분자.
실시형태 87. 실시형태 86에 있어서, 제1 링커, 제2 링커, 또는 둘 다는 다이설파이드 함유 링커, 아세탈계 링커 또는 케탈계 링커인, 항원-결합 분자.
실시형태 88. 실시형태 76-87 중 어느 하나에 있어서, 제1 티올 반응성 화합물은 제1 작용제를 추가로 포함하거나, 제2 티올 반응성 화합물은 제2 작용제를 추가로 포함하거나, 또는 둘 다인, 항원-결합 분자.
실시형태 89. 실시형태 88에 있어서, 제1 작용제, 제2 작용제, 또는 둘 다는 화학 링커인, 항원-결합 분자.
실시형태 90. 실시형태 76 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 제1 티올 반응성 화합물, 제2 티올 반응성 화합물, 또는 둘 다는 말레이미도-PEG4-아지드 또는 말레이미도-PEG4-다이벤조사이클로옥틴인, 항원-결합 분자.
실시형태 91. 실시형태 76 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 제1 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 화합물과 상이한, 항원-결합 분자.
실시형태 92. 실시형태 76 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 Fab인, 항원-결합 분자.
실시형태 93. 접합된 면역글로불린에서 사용하기 위한 경쇄 가변 영역으로서, 경쇄 가변 영역은 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 아미노산 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기를 가지고, Cys80은 짝을 이루지 못한, 경쇄 가변 영역.
실시형태 94. 실시형태 93에 있어서, 경쇄 가변 영역은 Cys80-Xaa1-Xaa2-Xaa3 모티프를 가지고, Xaa3은 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 임의의 아미노산인, 경쇄 가변 영역.
실시형태 95. 실시형태 93 또는 94에 있어서, 경쇄 가변 영역은 오릭톨라구스 쿠니쿠루스로부터 유래된, 경쇄 가변 영역.
실시형태 96. 실시형태 93 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 경쇄 가변 영역은 키메라화된, 경쇄 가변 영역.
실시형태 97. 실시형태 93 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 경쇄 가변 영역은 인간화된, 경쇄 가변 영역.
실시형태 98. 실시형태 47 내지 63 중 어느 하나의 면역글로불린을 암호화하는 핵산 분자.
실시형태 99. 실시형태 98의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
SEQUENCE LISTING <110> MORPHOTEK, INC. <120> CYS80 CONJUGATED IMMUNOGLOBULINS <130> WO2016/205618 <140> PCT/US2016/038041 <141> 2016-06-17 <150> US 62/182,020 <151> 2015-06-19 <160> 491 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 gatcaagctt gccgccacca tgggctggtc ctgcatcatc ctgtttctgg tggcggccgc 60 caccggcgtg cactcc 76 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 gtgcctttgg ctggcctgar gagayggtga ccagggtgcc 40 <210> 3 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 gatcaagctt gccgccacca tgggctggtc ctgcatcatc ctgtttctgg tggcggccgc 60 caccggcgtg cactcc 76 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial 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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Val Tyr Gly Tyr Ser Phe 85 90 95 Asp Asp Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 485 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 485 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Val Tyr Gly Tyr Ser Phe 85 90 95 Asp Asp Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 486 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 486 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Tyr Thr Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Thr Ile Gly Gly Ser 20 25 30 Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Trp Tyr Ala Thr Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Ala Ala 85 90 95 Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 487 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 487 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Thr Ile Gly Gly Ser 20 25 30 Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Ala Thr Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Cys Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ala Ala Ala 85 90 95 Ser Tyr Arg Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 488 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 488 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Trp Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ile Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gly Val Tyr Ser Ile Ser Thr 85 90 95 Asp Asp Gly Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 489 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 489 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Cys 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Val Tyr Ser Ile Ser Thr 85 90 95 Asp Asp Gly Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 490 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 490 Glu Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Asn Tyr Gly Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Asn Tyr Gly Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 491 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 491 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Asn Tyr Gly Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Asn Tyr Gly Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (38)

  1. 접합된 면역글로불린을 생성하는 방법으로서,
    토끼로부터 유래된 면역글로불린의 경쇄 가변 영역에서 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys80")을 탈캡핑하는 단계로서, 상기 면역글로불린은 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 탈캡핑하는 단계; 및
    티올 반응성 화합물을 상기 Cys80에 접합시키는 단계로서, 상기 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함하는, 상기 접합시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 탈캡핑하는 단계는 상기 면역글로불린을 환원 완충제와 항온처리한 후, 상기 면역글로불린을 산화 완충제와 항온처리하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 환원 완충제와의 상기 항온처리 전에 매트릭스 상에 상기 면역글로불린을 고정시키는 단계, 및 상기 산화 완충제와의 상기 항온처리 후에 상기 매트릭스로부터 상기 면역글로불린을 용리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티올 반응성 화합물은 작용제(functional agent)에 부착된, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 작용제는 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 화합물에 결합되고, 상기 제2 티올 반응성 화합물은 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 가지는 제2 면역글로불린에 결합되고, 상기 제2 경쇄 가변 영역은 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys802")을 가지고, 상기 제2 티올 반응성 화합물은 상기 Cys802에 결합된 제2 티올 반응성 기를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cys80은 짝을 이루지 못한(unpaired), 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 항원-결합 분자를 생성시키는 방법으로서,
    제1 접합된 면역글로불린을 제2 접합된 면역글로불린과 항온처리하여 상기 항원-결합 분자를 생성시키는 단계를 포함하되,
    상기 제1 접합된 면역글로불린은 제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 제1 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys801")을 가지고, 상기 Cys801은 제1 티올 반응성 기를 포함하는 제1 티올 반응성 화합물에 접합되고;
    상기 제2 접합된 면역글로불린은 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 제2 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys802")을 가지고, 상기 Cys802는 제2 티올 반응성 기를 포함하는 제2 티올 반응성 화합물에 접합된, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 Cys801, 상기 Cys802, 또는 둘 다는 짝을 이루지 못한, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 항온처리하는 단계 전에,
    상기 Cys801, 상기 Cys802, 또는 둘 다를 탈캡핑하는 단계; 및
    제1 티올 반응성 화합물을 상기 Cys801에 접합하거나, 제2 티올 반응성 화합물을 상기 Cys802에 접합하거나, 또는 둘 다인 접합 단계로서, 상기 제1 티올 반응성 화합물은 제1 티올 반응성 기를 포함하고, 상기 제2 티올 반응성 화합물은 제2 티올 반응성 기를 포함하는, 상기 접합 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 티올 반응성 화합물은 제1 작용제를 추가로 포함하거나, 상기 제2 티올 반응성 화합물은 제2 작용제를 추가로 포함하거나, 또는 둘 다인, 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 면역글로불린은 제1 Fab이거나, 제2 면역글로불린은 제2 Fab이거나, 또는 둘 다인, 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 상기 제1 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기에 의해 상기 제2 경쇄 가변 영역의 83번 위치에서의 아미노산을 치환하는 것, 또는 둘 다를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 항원-결합 분자.
  16. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린으로서, 상기 경쇄 가변 영역은 80번 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산을 가지는, 면역글로불린.
  17. 제16항에 있어서, 상기 Cys80은 짝을 이루지 못한, 면역글로불린.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 Cys80은 탈캡핑된, 면역글로불린.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. xi155D5HC(서열 번호 52)의 20 내지 141번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi155D5LC(서열 번호 78)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
    b. zu155D5HC(서열 번호 54)의 20 내지 144번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu155D5LC-3(서열 번호 84), zu155D5LC-4(서열 번호 86), zu155D5LC-5(서열 번호 88), zu155D5LC-6(서열 번호 90), zu155D5LC-7(서열 번호 92), zu155D5LC-huVK2-40(서열 번호 96), zu155D5LC-huVK4-1(서열 번호 100), zu155D5LC-huVK6-21(서열 번호 102), zu155D5LC-huVK6D-41(서열 번호 104); 또는 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81(서열 번호 106)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
    c. xi1E4HC(서열 번호 58)의 20 내지 138번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1E4LC(서열 번호 110)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
    d. zu1E4HC(서열 번호 60)의 20 내지 140번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu1E4LC-CXXA(서열 번호 114)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
    e. xi166B3HC(서열 번호 74)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi166B3LC(서열 번호 132)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
    f. zu166B3HC(서열 번호 76)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu166B3LC-CXXA(서열 번호 136)의 20 내지 130번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역글로불린.
  20. 제19항에 있어서,
    a. 각각 서열 번호 146, 148 및 150에 기재된 xi155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 224, 226 및 228에 기재된 xi155D5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    b. 각각 서열 번호 152, 154 및 156에 기재된 zu155D5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 242, 244 및 246에 기재된 zu155D5LC-3, 각각 서열 번호 248, 250 및 252에 기재된 zu155D5LC-4, 각각 서열 번호 254, 256 및 258에 기재된 zu155D5LC-5, 각각 서열 번호 260, 262 및 264에 기재된 zu155D5LC-6, 각각 서열 번호 266, 268 및 270에 기재된 zu155D5LC-7, 각각 서열 번호 278, 280 및 282에 기재된 zu155D5LC-huVK2-40, 각각 서열 번호 290, 292 및 294에 기재된 zu155D5LC-huVK4-1, 각각 서열 번호 296, 298 및 300에 기재된 zu155D5LC-huVK6-21, 각각 서열 번호 302, 304 및 306에 기재된 zu155D5LC-huVK6D-41; 또는 각각 서열 번호 308, 310 및 312에 기재된 zu155D5LC-huVK7-3-Glu81의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    c. 각각 서열 번호 164, 166 및 168에 기재된 xi1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 320, 322 및 324에 기재된 xi1E4LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    d. 각각 서열 번호 170, 172 및 174에 기재된 zu1E4HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 332, 334 및 336에 기재된 zu1E4LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    e. 각각 서열 번호 212, 214 및 216에 기재된 xi166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 386, 388 및 390에 기재된 xi166B3LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
    f. 각각 서열 번호 218, 220 및 222에 기재된 zu166B3HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 398, 400 및 402에 기재된 zu166B3LC-CXXA의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 면역글로불린.
  21. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    xi1-55-2HC(서열 번호 56)의 20 내지 139번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi1-55-2LC(서열 번호 108)의 20 내지 129번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역글로불린.
  22. 제21항에 있어서,
    각각 서열 번호 158, 160 및 162에 기재된 xi1-55-2HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 314, 316 및 318에 기재된 xi1-55-2LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 면역글로불린.
  23. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. xi33O11HC(서열 번호 62)의 20 내지 142번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi33O11LC(서열 번호 116)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
    b. zu33O11HC(서열 번호 64)의 20 내지 145번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 zu33O11LC-CXXA(서열 번호 120) 또는 zu33O11LC-CXXI(서열 번호 122)의 20 내지 131번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
    c. xi324O5HC(서열 번호 66)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi324O5LC(서열 번호 124)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
    d. xi178F16HC(서열 번호 68)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi178F16LC(서열 번호 126)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역;
    e. xi237N18HC(서열 번호 70)의 20 내지 132번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi237N18LC(서열 번호 128)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
    f. xi383I18HC(서열 번호 72)의 20 내지 137번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 xi383I18LC(서열 번호 130)의 20 내지 127번 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역글로불린.
  24. 제23항에 있어서,
    a. 각각 서열 번호 176, 178 및 180에 기재된 xi33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 338, 340 및 342에 기재된 xi33O11LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    b. 각각 서열 번호 182, 184 및 186에 기재된 zu33O11HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 350, 352 및 354에 기재된 zu33O11LC-CXXA, 또는 각각 서열 번호 356, 358 및 360에 기재된 zu33O11LC-CXXI의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    c. 각각 서열 번호 188, 190 및 192에 기재된 xi324O5HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 362, 364 및 366에 기재된 xi324O5LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    d. 각각 서열 번호 194, 196 및 198에 기재된 xi178F16HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 368, 370 및 372에 기재된 xi178F16LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    e. 각각 서열 번호 200, 202 및 204에 기재된 xi237N18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 374, 376 및 378에 기재된 xi237N18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
    f. 각각 서열 번호 206, 208 및 210에 기재된 xi383I18HC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호 380, 382 및 384에 기재된 xi383I18LC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 면역글로불린.
  25. 접합된 면역글로불린으로서,
    제16항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역글로불린을 포함하고, 80번 위치에서의 시스테인은 티올 반응성 화합물에 접합되고, 상기 티올 반응성 화합물은 티올 반응성 기를 포함하는, 접합된 면역글로불린.
  26. 제25항에 있어서, 상기 티올 반응성 화합물은 작용제를 추가로 포함하는, 접합된 면역글로불린.
  27. 제26항에 있어서, 상기 작용제는 형광단, 형광성 염료, 폴리펩타이드, 면역글로불린, 항생제, 핵산, 방사성 핵종, 화학 링커, 소분자, 킬레이터, 지질 또는 약물을 포함하는, 접합된 면역글로불린.
  28. 약제학적 유효량의 접합된 메소텔린 면역글로불린을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 접합된 메소텔린 면역글로불린은,
    제23항 또는 제24항의 면역글로불린, 및
    티올 반응성 기, 링커 및 작용제를 포함하는 티올 반응성 화합물을 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 작용제는 아우리스타틴 F인, 방법.
  30. 항원-결합 분자로서,
    제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 접합된 면역글로불린이되, 상기 제1 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys801")을 가지고, 상기 Cys801은 제1 티올 반응성 기를 포함하는 제1 티올 반응성 화합물에 접합된, 상기 제1 접합된 면역글로불린, 및
    제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 접합된 면역글로불린이되, 상기 제2 경쇄 가변 영역은 80번 위치에 시스테인("Cys802")을 가지고, 상기 Cys802는 제2 티올 반응성 기를 포함하는 제2 티올 반응성 화합물에 접합된, 상기 제2 접합된 면역글로불린을 포함하는, 항원-결합 분자.
  31. 제30항에 있어서, Cys801, Cys802, 또는 둘 다는 짝을 이루지 못한, 항원-결합 분자.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 제1 면역글로불린의 83번 위치에서의 아미노산, 상기 제2 면역글로불린의 83번 위치에서의 아미노산, 또는 둘 다는 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기인, 항원-결합 분자.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 티올 반응성 화합물은 제1 작용제를 추가로 포함하거나, 상기 제2 티올 반응성 화합물은 제2 작용제를 추가로 포함하거나, 또는 둘 다인, 항원-결합 분자.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 면역글로불린, 제2 면역글로불린, 또는 둘 다는 Fab인, 항원-결합 분자.
  35. 접합된 면역글로불린에서 사용하기 위한 경쇄 가변 영역으로서, 상기 경쇄 가변 영역은 80번 아미노산 위치에서의 시스테인("Cys80") 및 83번 아미노산 위치에서의 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기를 가지고, 상기 Cys80은 짝을 이루지 못한, 경쇄 가변 영역.
  36. 제35항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 Cys80-Xaa1-Xaa2-Xaa3 모티프를 가지고, Xaa3은 Phe, Lys 또는 Cys 이외의 임의의 아미노산인, 경쇄 가변 영역.
  37. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역글로불린을 암호화하는 핵산 분자.
  38. 제37항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
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