ES2932602T3 - Anticuerpos contra la proteína alfa reguladora de señales y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

En este documento se proporcionan, entre otros, anticuerpos aislados que se unen a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-α v1 humano (p. ej., el dominio D1), un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-α v2 humano, o ambos. En algunas realizaciones, los anticuerpos también se unen a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-α de mono, un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-α de ratón, un dominio extracelular de un polipéptido SiRP-β humano y/o un dominio extracelular de un polipéptido humano. Polipéptido SIRP-γ. En algunas realizaciones, los anticuerpos bloquean o no se unen entre un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-α humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano, mientras que en algunas realizaciones, los anticuerpos reducen la afinidad de un polipéptido SIRP-α humano por uniéndose a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. Además se proporcionan en este documento métodos, polinucleótidos, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra la proteína alfa reguladora de señales y métodos de uso
Campo
La presente divulgación se refiere a anticuerpos aislados que se unen a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v i humano, un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v2 humano, o ambos, así como polinucleótidos, vectores, células hospedadoras y métodos relacionados con estos.
Antecedentes
La proteína alfa reguladora de señales (SIRP-a) es parte de una familia de receptores de superficie celular que cumplen funciones esenciales en la regulación del sistema inmunitario (véase, por ejemplo, Barclay, A.N. y Brown, M.H. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:457-64). SIRP-a se expresa en la superficie de varias células, las que incluyen leucocitos, tales como células dendríticas, eosinófilos, neutrófilos y macrófagos. SIRP-a incluye un dominio extracelular que interactúa con estímulos externos, tales como ligandos, y un dominio intracelular que media una diversidad de señales intracelulares.
Una de las principales funciones de SIRP-a es su regulación de la respuesta inmunitaria a través de interacciones con CD47. CD47 se expresa en la superficie de una diversidad de tipos de células. Cuando el dominio IgSF de CD47 se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de SIRP-a expresado en una célula inmunitaria (por ejemplo, un macrófago), esto transduce una señal mediada por SIRP-a en la célula inmunitaria que previene la fagocitosis de la célula que expresa CD47. Por lo tanto, CD47 sirve para transmitir lo que se ha denominado una señal "no me comas" ("don’t eat me") al sistema inmunitario que previene la fagocitosis de células sanas (véanse, por ejemplo, el documento WO2015/138600 y Weiskopf, K. et al. (2013) Science 341:88-91). Sin embargo, también se ha demostrado que CD47 se expresa en gran medida mediante una diversidad de cánceres y se cree que su interacción con SIRP-a en este contexto permite a los tumores imitar la señal saludable de "no me comas" a efectos de evadir la vigilancia inmunitaria y la fagocitosis de macrófagos (véanse, por ejemplo, Majeti, R. et al. (2009) Cell 138:286-99; Zhao, X.W. et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108:18342-7). Por lo tanto, los anticuerpos que bloquean esta interacción son muy convenientes.
Se sabe que SIRP-a es una proteína muy polimórfica en seres humanos, monos y ratones. Por ejemplo, se han identificado 20 diferencias de aminoácidos entre proteínas SIRP-a en las cepas de ratón NOD y C57BL/6, y estos polimorfismos llevan a consecuencias funcionales relacionadas con la unión a CD47 y el injerto de células madre hematopoyéticas humanas en estas cepas de ratón. En los seres humanos, se han identificado al menos 10 alelos distintos del gen SIRPA (Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol. 8:1313-23, Zhao, X. et al. (2011), PNAS. 108:18342-47; van der Heijden, J. (2014). Genetic variation in human Fc gamma receptors: Functional consequences of polymorphisms and copy number variation (tesis de doctorado)).
Debido a la importancia de la interacción SIRP-a-CD47 en la función inmunitaria normal y tumorigénesis, así como la naturaleza polimórfica de SIRP-a y la existencia de otros receptores de la familia SIRP, la identificación de anticuerpos que tienen especificidades de unión diferentes con reactividad cruzada intraespecies y/o interespecies es de gran interés para el desarrollo de candidatos clínicos que sean eficientes en las poblaciones humanas y la caracterización de estos candidatos en diversos modelos animales. Por lo tanto, son necesarios herramientas de investigación y candidatos clínicos posibles que modulen la función de SIRP-a, por ejemplo, su interacción de unión con CD47. También son necesarios métodos para aislar anticuerpos con una diversidad de especificidades de unión a SIRP-a y efectos en la unión de CD47-SIRP-a con el fin de entender y seleccionar como diana de manera eficaz esta interacción fundamental.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano, en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v1 humano, al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v2 humano, al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a de mono y al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a murino; y en donde el anticuerpo comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende:
(i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2AX3S, en donde X1 es S o T; X2 es N, Y, H o D; y X3 es M, L o V (SEQ ID NO: 297);
(ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISX1X2X3X4X5X6YYX7 X8SX9KG, en donde Xi es A o S; X2 es G, S o está ausente; X3 es S, D o G; X4 es G o S; X5 es D, S o G; X6 es T o A; X7 es P, G, V, I, A o S; X8 es A, D o G y X9 es V o M (SEQ ID NO: 298); y
(iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende:
(i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGX1X2 X3SX4YYX5, en donde X1 es D, G, S, I o está ausente; X2 es S, W, G, Y, D o está ausente; X3 es S, Y, T o D; X4 es H, T, S o Y; y X5 es G o A (SEQ ID NO: 299);
(ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDX1X2RPX3, en donde X1 es D o N; X2 es E, K o Q; y X3 es S o P (SEQ ID NO: 300); y
(iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2YDX3X4X5YX6NX7, en donde X1 es G o A; X2 es G o A; X3 es G, Y, Q, S o A; X4 es S, R o T; X5 es T o S; X6 es A, I, V, L o T; y X7 es T, A, D o P (SEQ ID NO: 301).
En el presente documento se proporciona un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo comprende: un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende: una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2AX3S, en donde X1 es S o T; X2 es N, Y, H o D; y X3 es M, L o V (SEQ ID NO: 297); una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISX1X2X3X4X5X6YYX7X8SX9KG, en donde X1 es A o S; X2 es G, S o está ausente; X3 es S, D o G; X4 es G o S; X5 es D, S o G; X6 es T o A; X7 es P, G, V, I, A o S; X8 es A, D o G; y X9 es V o M (SEQ ID NO: 298); y una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); y/o un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende: una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGX1X2 X3SX4YYX5, en donde X1 es D, G, S, I o está ausente; X2 es S, W, G, Y, D o está ausente; X3 es S, Y, T o D; X4 es H, T, S o Y; y X5 es G o A (SEQ ID NO: 299); una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDX1X2RPX3, en donde X1 es D o N; X2 es E, K o Q; y X3 es S o P (SEQ ID NO: 300); y una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2YDX3X4X5YX6NX7, en donde X1 es G o A; X2 es G o A; X3 es G, Y, Q, S o A; X4 es S, R o T; X5 es T o S; X6 es A, I, V, L o T; y X7 es T, A, D o P (SEQ ID NO: 301). En otros aspectos, en el presente documento se proporciona un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo comprende: un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende: un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende: una secuencia de HVR-H1 que comprende la cadena de aminoácidos de SX1AX2S, en donde X1 es N o Y; y en donde X2 es M, L o V (SEQ ID NO: 302); una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISX1GX2X3DTYYX4X5SVKG, en donde X1 es A o S; X2 es G o está ausente; X3 es S o G; X4 es P, G o V; y X5 es A o D (SEQ ID NO: 303); y una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); y/o un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende: una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGX1YSSYYYA, en donde X1 es S o A (SEQ ID NO: 304); una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336); y una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). En algunas realizaciones, el dominio VH comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SNAMS (SEQ ID nO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SEQ ID NO: 318), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GiSa GGSDTYYPAsVkG (SEQ ID NO: 195) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135, 263, 264 o 330. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SEQ ID NO: 318), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISSg SdTYYGDSVKG (s EQ ID NO: 197) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137, 265, 266 o 331. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SYAMS (SEQ ID NO: 200), SYAVS (SEQ ID NO: 272) o SYALS (SEQ ID NO: 319), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISSGGDTYYVDSVKG (s EQ ID NO: 201) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139, 267, 268 o 332. En algunas realizaciones, el dominio VL comprende la secuencia FW1 —HVR-L1 —FW2—HVR-L2—FW3—HVR-L3—FW4 (extremo N a extremo C), en donde FW1 comprende la secuencia de aminoácidos SYELTQPPSVSVSPGQTARITC (SEQ ID NO: 314), FW2 comprende la secuencia de aminoácidos WYQQKPGQAPVTLIY (SEQ ID NO: 315), FW3 comprende la secuencia de aminoácidos NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC (SEQ ID NO: 316) y FW4 comprende la secuencia de aminoácidos FGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 317). En algunas realizaciones, el dominio VL comprende (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGSYSSYYYA (SEQ iD NO: 170), (ii) una secuencia de hVr-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). En algunas realizaciones, el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252. En algunas realizaciones, el dominio VL comprende (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGAYSSYYYA (SEQ ID No : 261), (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). En algunas realizaciones, el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 264, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 330, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 265, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 331, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 267, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 268, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 332, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 264, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 330, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 265, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 331, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 267, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 268, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 332, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; o el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262.
En otros aspectos, en el presente documento se proporciona un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo se une a un polipéptido SIRP-a v1 humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 y K96, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al polipéptido SIRP-a v1 humano en I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 y K96, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une además al polipéptido SIRP-a v1 humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 y R95, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une además al polipéptido SIRP-a v1 humano en L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 y R95, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo scFv-Fc. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263, y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; en donde el anticuerpo comprende además una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 325, 326 o 426; y en donde el anticuerpo comprende además una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 320-324.
En el presente documento se proporcionan además los anticuerpos para su uso en métodos para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo, comprendiendo los métodos administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además administrar al individuo una cantidad eficaz de un segundo anticuerpo. En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo se une a un antígeno expresado por una célula cancerosa. En algunas realizaciones, el antígeno expresado por la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, Mucina 1, Mucina 16, PTK7, STEAP1, receptor de endotelina B, mesotelina, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nectina 4, NaPi2b, LIV-1A, guanilil ciclasa C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrina aVp3, integrina a5pi, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascina, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, una mucina, CAIX, EPHA3, receptor de folato a, GD2, GD3, y un complejo de MHC/péptido que comprende un péptido de NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, una proteína de la familia Ma Ge , MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirosinasa, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, receptor de laminina inmadura, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, p-catenina, TGF-pRII, VPH E6 o VPH E7. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además administrar al individuo una cantidad eficaz de un agente inmunoterapéutico. En algunas realizaciones, el agente inmunoterapéutico comprende un segundo anticuerpo. En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo se une a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, OX40, CTLA-4, CD137/4-1BB, TNFR2, B7-H3, FZD7, CD27, CCR4, CSF1R, CSF, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, CCR2, IDO, A2R, CD39, CD73, TIGIT, CD80, CD47, arginasa, TDO y PVRIG.
En el presente documento se proporcionan además anticuerpos para su uso en métodos para tratar o retrasar la progresión de una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria en un individuo, comprendiendo los métodos la administración al individuo de una cantidad eficaz del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores. La enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria puede seleccionarse del grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, una espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria mediada por anticuerpos, enfermedad de injerto contra huésped, sepsis, diabetes, psoriasis, artritis psoriásica, ateroesclerosis, síndrome de Sjogren esclerosis sistémica progresiva, esclerodermia, síndrome coronario agudo, reperfusión isquémica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, endometriosis, glomerulonefritis, nefropatía IgA, enfermedad renal poliquística, miastenia grave, fibrosis pulmonar idiopática, asma, dermatitis atópica, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), vasculitis y miositis inflamatoria autoinmunitaria. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
En el presente documento se proporcionan además composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la presente divulgación y un transportador farmacéuticamente aceptable.
Sumario de la divulgación adicional
En el presente documento también se describen anticuerpos aislados que se unen a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano. El anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v i humano, y el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v1 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMD FSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 5). El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v2 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDF SISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 6). El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v i humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMD FSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 5) y puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v2 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDF SISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 6). El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D i) de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polipéptidos de la variante de SIRP-a humanos diferentes. Cada uno de los tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polipéptidos de la variante de SIRP-a humanos diferentes puede comprender un dominio extracelular que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 6 y 76-83. El anticuerpo se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a de mono. El polipéptido SIRP-a de mono puede ser un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de al menos dos polipéptidos de la variante de SIRP-a de mono diferentes. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o ambos. El anticuerpo se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a murino. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de dos o más polipéptidos de la variante de SIRP-a murinos diferentes. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de uno o más polipéptidos SIRP-a murinos, y en donde el uno o más polipéptidos SIRP-a murinos comprende, cada uno, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-10. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-p humano. El anticuerpo se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-y humano. El anticuerpo puede no unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-p humano. El anticuerpo puede no unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-y humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-p de humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, el dominio extracelular de un polipéptido SIRP-p de humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o ambos. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-y humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15. El anticuerpo puede modular la señalización de SIRP-a en una célula que expresa un polipéptido SIRP-a humano. La célula puede ser un leucocito seleccionado del grupo que consiste en un macrófago, una célula dendrítica, un neutrófilo, un eosinófilo y una célula supresora procedente de mieloide (MDSC, forma siglada de myeloid-derived suppressor cell). El anticuerpo puede inhibir la señalización de SIRP-a en un macrófago que expresa un polipéptido SIRP-a humano. El anticuerpo puede potenciar la fagocitosis mediante un macrófago que expresa un polipéptido SIRP-a humano. El anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula. El anticuerpo puede no unirse a un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un dominio de IgSF de CD47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a CD47 humana con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio D1 de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana. El anticuerpo puede no bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede no bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula. El anticuerpo puede unirse a un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un dominio IgSF de CD47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio de SIRP-a D1 de alta afinidad de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a CD47 humano con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio SIRP-a D1 de origen natural que se une a CD47 humano. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano puede reducir la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula puede reducir la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión de un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano puede aumentar la koff del polipéptido SIRP-a humano para la unión de un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula puede aumentar la koff del polipéptido SIRP-a humano para la unión de un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v1 humano, y al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v2 humano; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a de mono; y en donde el anticuerpo no bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v1 humano y al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v2 humano; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a de mono, y en donde el anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v1 humano, y al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v2 humano; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a de mono; y en donde la unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano reduce la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión al dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v i humano, y al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano ; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y en donde el anticuerpo no bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, y al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y en donde el anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, y al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y en donde la unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano reduce la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, y al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y en donde el anticuerpo no bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido c D47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, y al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y en donde el anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, y al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano; en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y en donde la unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano reduce la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión de un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, el dominio D i) de dos o más polipéptidos variantes SIRP-a humanos diferentes, un polipéptido SIRP-a murino, y un polipéptido SIRP-a de mono; en donde el anticuerpo no se une a al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano; y en donde el anticuerpo bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de CDR; una secuencia de dominio variable de cadena pesada; y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera de anticuerpo Si30. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, el dominio D i) de dos o más polipéptidos variantes SIRP-a humanos diferentes, un polipéptido SIRP-a murino, un polipéptido SIRP-a de mono; y al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano; y en donde el anticuerpo bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de CDR; una secuencia de dominio variable de cadena pesada; y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S8, Si3, S i4 y S i2 i. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D i) de dos o más polipéptidos variantes de SIRP-a humanos diferentes, un polipéptido SIRP-a murino, y un polipéptido SIRP-a de mono; en donde el anticuerpo no se une o se une con afinidad reducida a al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano; y en donde el anticuerpo no bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de CDR; una secuencia de dominio variable de cadena pesada; y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera de anticuerpo Si37. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D i) de dos o más polipéptidos variantes de SIRP-a humanos diferentes y un polipéptido SIRP-a de mono; en donde el anticuerpo no se une a un polipéptido SIRP-a murino y un polipéptido SIRP-a de mono; en donde el anticuerpo no se une a al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-y humano; y en donde el anticuerpo bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de c DR; una secuencia de dominio variable de cadena pesada; y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S128. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de dos o más polipéptidos de variante de SIRP-a humanos diferentes, un polipéptido SIRP-a de mono y al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-y humano; en donde el anticuerpo no se une a un polipéptido SIRP-a murino; y en donde el anticuerpo bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de CDR; una secuencia de dominio variable de cadena pesada; y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S9, S11, S119, S120, S122 y S135. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de dos o más polipéptidos de variante de SIRP-a humanos diferentes y los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de dos o más polipéptidos de variante de SIRP-a de mono diferentes, y en donde la unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano reduce la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de CDR; una secuencia de dominio variable de cadena pesada; y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S115, S116, S117 y S118. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 120 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142.
El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 115 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 115 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 116 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 116 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 117 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 117 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 118 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 118 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 119 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 119 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 120 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 120 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 121 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 121 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 122 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 122 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 123 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 123 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 126 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 126 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 128 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 128 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 130 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 130 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 135 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 135 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 137 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 137 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 138 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 138 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 1 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 1 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 2 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 2 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 8 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 8 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 9 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 9 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 11 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 11 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 12 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 12 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 13 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 13 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio Vh que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 14 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 14 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VH del anticuerpo 21, 25, 27 o 66 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2) y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al dominio VL del anticuerpo 21, 25, 27 o 66 (por ejemplo, tal como se enumeró en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 116 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 93. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 117 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 94. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 118 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 95. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 119 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 96. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 335 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 97. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 121 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 98. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 122 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 99. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 123 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 100. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %,
99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 124 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %,
99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 101. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende
una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 125 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 102. El anticuerpo puede comprender un dominio
VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,
93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 126 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,
94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 103. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %,
89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 127
y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,
90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 104. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %,
86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la
SEQ ID NO: 128 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %,
88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID
NO: 105. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos
que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o
100 % idéntica a la SEQ ID NO: 129 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que
es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %
idéntica a la SEQ ID NO: 106. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 130 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 107. El anticuerpo puede comprender un dominio
VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,
93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 108 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,
94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 85. El anticuerpo puede comprender
un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %,
91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 109 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %,
91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 86. El anticuerpo
puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %,
88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID
NO: 110 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %,
89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 87.
El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %,
86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la
SEQ ID NO: 111 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %,
88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID
NO: 88. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que
es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %
idéntica a la SEQ ID NO: 112 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %,
86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la
SEQ ID NO: 89. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %,
99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 113 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %,
99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 90. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende
una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 114 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 91. El anticuerpo puede comprender un dominio
VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,
93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 115 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,
94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 92. El anticuerpo puede comprender
un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %,
91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 135, 137, 139 o
141 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,
90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 136, 138, 140 o 142.
El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227 o 230, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 228 o 231, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 229; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 233, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 234. El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 219 o 235, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 236 o 238, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 237; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 239, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 240, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 241. El anticuerpo puede comprender (a) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GFSFSX1X2AMX3, en donde X1 es N o I; X2 es F o Y; y X3 es T o S (SEQ ID NO: 185); (b) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de TIGX4X5DTYYADSVKG, en donde X4 es S o A y X5 es G o D (SEQ ID NO: 186); (c) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSTVX6WSGDFFDY, en donde X6 es S o G (SEQ ID NO: 187); (d) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASQNVX7X8DX9A, en donde X7 es K o R; Xs es N o S; y X9 es L o I (SEQ ID NO: 188); (e) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de AAX10X11RX12T, en donde X10 es R o S; X11 es I o S; y X12 es E o D (SEQ ID NO: 189); y (f) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR del anticuerpo 119 (por ejemplo, tal como se enumera en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR de las secuencias de dominio variable de la SEQ ID NO: 335 y 97 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de la secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 335 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de la secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 97). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR del anticuerpo 135 (por ejemplo, tal como se enumera en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR de las secuencias de dominio variable de la SEQ ID NO: 127 y 104 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de la secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 127 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de la secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 104). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR de las secuencias de dominio variable de la SEQ ID NO: 97, 104, 120, 335 y 127 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de la secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 335 y 127 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de la secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 97 y 104). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 143-148 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 143-145 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 146-148). El anticuerpo puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 148-153 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 149-151 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 152, 153 y 148). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR del anticuerpo 136 (por ejemplo, tal como se enumera en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 155-160 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 155-157 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 158-160). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR del anticuerpo 21 (por ejemplo, tal como se enumera en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 161-166 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 161-163 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 164-166). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR del anticuerpo 25 (por ejemplo, tal como se enumera en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 161, 163, 168 y 170-172 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 161, 168 y 163 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 170-172). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR del anticuerpo 27 (por ejemplo, tal como se enumera en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 163, 173, 174 y 176-178 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 163, 173 y 174 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 176-178). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR del anticuerpo 66 (por ejemplo, tal como se enumera en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 162, 163, 179 y 182-184 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 162, 163 y 179 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 182-184). El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID nO: 143, 202, 204 o 205, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144, 203 o 206, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145 o 207; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146 o 208, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 147 o 209, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 o 210. El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEq ID NO: 149, 211, 213 o 214, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 150, 212 o 215, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 151 o 216; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152 o 217, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153 o 218, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 155, 219, 221 o 222, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156, 220 o 223, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157 o 224; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158 o 225, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 159 o 226, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160. El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nO: 161, 191 o 194, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 162, 192 o 195, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163 o 193; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166. El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nO: 161, 191 o 194, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168, 196 o 197, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163 o 193; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 171, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 172. El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nO: 173, 198 o 200, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 174, 199 o 201, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163 o 193; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 176, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 177, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178. El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 179, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 162, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 184. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 171, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 172. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 176, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 177, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141 y/o un dominio Vl que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 184. El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR del anticuerpo 3 (por ejemplo, tal como se enumera en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una, dos o tres secuencias de HVR de la SEQ ID NO: 242 y/o (b) un dominio VL que comprende una, dos o tres secuencias HVR de la SEQ ID NO: 243. El anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR de anticuerpo 45 (por ejemplo, tal como se enumera en la Tabla 2). El anticuerpo puede comprender (a) un dominio VH que comprende una, dos o tres secuencias de HVR de la SEQ ID NO: 244 y/o (b) un dominio VL que comprende una, dos o tres secuencias HVR de la SEQ ID NO: 245. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. El anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141 y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. Kabat puede definir una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR. Chothia puede definir una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR. IMGT puede definir una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR. El anticuerpo puede comprender secuencias de HVR tal como se definen según dos o más de Kabat, Chothia e IMGT (por ejemplo, el anticuerpo comprende una o más secuencias de HVR tal como se definen mediante una delineación y una o más secuencias de HVR tal como se definen mediante una delineación diferente).
En el presente documento también se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de NFAMT (SEQ ID NO: 175), NFAVT (SEQ ID NO: 204) o NFALT (SEQ ID NO: 305), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de TIGSGDTy Ya DSVKG (SEQ ID NO: 144) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSTVSWSGDFFDY (SEQ iD No : 145) y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASQNVKNDLA (SEQ ID NO: 146), (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de AARIRET (SEQ ID NO: 147) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148). El dominio VH puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 120, 335, 246, 258 o 327; y/o el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97 o 312. El dominio VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246, y el dominio VL comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 97; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 258, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 335, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 327, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 312; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 258, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 312; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 335, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 312; o el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 327, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 312.
En el presente documento también se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de IYAMS (SEQ ID NO: 269), IYAVS (SEQ ID NO: 213) o IYALS (SEQ ID NO: 306), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de TIGADDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 150) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSTv Gw SGDFFDY (SEQ iD NO: 151) y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASQNVRSDlA (SEQ ID NO: 152), (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de AASSRDT (SEQ ID NO: 153) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148). El dominio VH puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 341, 247, 259 o 328; y/o el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 104 o 248. El dominio VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127, y el dominio VL comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 104; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 247, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 259, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 328, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 247, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 259, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248; o el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 328, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248.
En el presente documento también se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo comprende: a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende: (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2DX3N, en donde X1 es S o T; X2 es Y o S; y X3 es M, L o V (SEQ ID NO: 307); (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LISGSGEIX1YYADSVKG, en donde X1 es I o T (SEQ ID NO: 308); y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EX1X2X3YRFFDX4, en donde X1 es N o D; X2 es N o D; X3 es R o M; y X4 es D o Y (SEQ ID NO: 309); y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende: (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RAX1QSVYX2YLA, en donde X1 es S o D; y X2 es T o S (SEQ ID NO: 310); (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1AX2X3RAX4, en donde X1 es G, A o D; X2 es S o R; X3 es S, N o T; y X4 es T o A (SEQ ID NO: 311); y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQYYDRPPLT (SEQ ID NO: 160). El anticuerpo puede comprender (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SYDMN (SEQ ID NO: 270), SYDVN (SEQ ID NO: 221) o SYDLN (SEQ ID NO: 313), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LISGSGEIIYYADSVKG (SEQ ID NO: 156) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ENNrYr FFDD (SEQ iD NO: 157) y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de Ra Sq Sv YTYLA (SEQ iD NO: 158), (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GASSRAT (SEQ ID NO: 159) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQYYDRPPLT (SEQ ID NO: 160). El dominio VH puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249, 133, 260 o 329 y/o el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134, 250 o 251. El dominio VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260, y el dominio VL comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 134; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 329, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 329, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 329, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250; o el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251.
En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo se une a un polipéptido SIRP-a v1 humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en I7, P9, D10, K11, S12, A42, A108 y E111, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse al polipéptido SIRP-a v1 humano en K11, A42, A108 y E111, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse al polipéptido SIRP-a v1 humano en I7, P9, D10, K11, S12, A108 y E111, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse además al polipéptido SIRP-a v i humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en L14, T26, T28, T88, Y90, S106, S113 y A116, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse además al polipéptido SIRP-a vi humano en L14, T88, Y90, S106, S113 y A116 de SIRP-a v i humano, de acuerdo con la SeQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse además al polipéptido SIRP-a v i humano en L14, T26 y T28, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296.
En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio Di), en donde el anticuerpo se une a un polipéptido SIRP-a v i humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en E47, L48, P58, R59, T82 y A84, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse al polipéptido SIRP-a v i humano en E47, L48, P58, R59, T82 y A84, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse además al polipéptido SIRP-a v i humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Ai7, P44, G45, I49, E54, G55, H56, F57 y P83, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse además al polipéptido SIRP-a v i humano en Ai7, P44, G45, I49, E54, G55, H56, F57 y P83 de SIRP-a v i humano, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296.
En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio Di), en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v i humano con una constante de disociación (Kd) de menos de i00 nM, y en donde el anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v2 humano con una constante de disociación (Kd) de menos de i00 nM. El anticuerpo puede unirse al dominio Di de un polipéptido SIRP-a v i humano y el dominio Di de un polipéptido SIRP-a v2 humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-p humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-y humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a murino.
En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio Di), en donde el anticuerpo se une al dominio Di de un polipéptido SIRP-a humano y en donde el anticuerpo no bloquea la unión entre un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio Di de un SIRP-a humano con una constante de disociación (Kd) de menos de i00 nM. El anticuerpo puede unirse al dominio Di de un polipéptido SIRP-a v i humano con una constante de disociación (Kd) de menos de i00 nM y/o se une al dominio Di de un polipéptido SIRP-a v2 humano con una constante de disociación (Kd) de menos de i00 nM. El anticuerpo puede unirse al dominio Di de un polipéptido SIRP-a v i humano y el dominio Di de un polipéptido SIRP-a v2 humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-p humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a murino.
En el presente documento se proporciona un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio Di), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos ii9 , i20, i2 i, i22, 2 i, 25, 27, 66 y i35. En otros aspectos, en el presente documento se proporciona un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio Di), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i20 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97; (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i2 i y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98; (c) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i30 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i07; (d) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i22 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99; (e) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i35 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i36; (f) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i37 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i38; (g) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i39 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i40; (h) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de
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aminoácidos de la SEQ ID NO: 141 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142; o (i) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104.
En el presente documento se proporciona un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 136 y 137. En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; o (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105.
En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 3, 213, 173 y 209. En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 243; (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 275 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 276; (c) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 278 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 279; o (d) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 280 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 81.
En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 115, 116, 117, 118 y 132. En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 116 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 93; (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94; (c) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 95; (d) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 119 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 96; o (e) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 282 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 283.
En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 218, 123, 149, 161, 162 y 194. En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 284 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 285; (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 123 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 100; (c) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 286 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 287; (d) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 288 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 289; (e) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 290; y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 291 o (f) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 292 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 293.
En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo 45. En el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1), en donde el anticuerpo compite por la unión al dominio extracelular del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 244 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 245.
El anticuerpo puede potenciar la fagocitosis mediante un macrófago que expresa un polipéptido SIRP-a humano. El anticuerpo puede potenciar la activación de una célula dendrítica que expresa un polipéptido SIRP-a humano. El anticuerpo puede inhibir el crecimiento in vivo de un tumor que expresa c D47. El anticuerpo puede no prevenir las interacciones entre una célula que expresa CD47 y un linfocito T.
El anticuerpo puede comprender una región Fc. En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc humana seleccionada del grupo que consiste en una región Fc de IgG1, una región Fc de IgG2 y una región Fc de IgG4. En algunas realizaciones, la región Fc comprende una región Fc de IgG1 humana que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en L234A, L235A, L235E, G237A y N297A, de acuerdo con la numeración de EU. En algunas realizaciones, la región Fc comprende una región Fc de IgG2 humana que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en A330S, P331S y N297A, de acuerdo con la numeración de EU. En algunas realizaciones, la región Fc comprende una región Fc de IgG4 humana que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en S228P, E233P, F234V, L235A, L235E, delG236 y N297A, de acuerdo con la numeración de EU. El anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv y scFv. En algunas realizaciones, el anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico o marcador.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. El anticuerpo puede comprender un primer dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y un segundo dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno expresado por una célula cancerosa. El antígeno expresado por la célula cancerosa puede seleccionarse del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, mucina 1, mucina 16, PD-L1, PTK7, STEAP1, receptor de endotelina B, mesotelina, EGfRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nectina 4, NaPi2b, LIV-1A, guanilil ciclasa C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrina aVp3, integrina a5p1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, una mucina, CAIX, EPHA3, receptor de folato a, GD2, GD3 y un complejo de MHC y péptido que comprende un péptido de NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, una proteína de la familia MAg E, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirosinasa, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, receptor de laminina inmadura, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, p-catenina, TGF-pRII, HPV E6 o HPV E7. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de pollo, humanizado, quimérico o humano. El anticuerpo puede generarse a partir de un pollo u obtenerse de un pollo.
En el presente documento también se proporcionan polinucleótidos que comprenden el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores. En el presente documento también se proporcionan vectores que comprenden el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores. En el presente documento también se proporcionan células hospedadoras que comprenden el polinucleótido o vector de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores. En el presente documento también se proporcionan métodos para producir un anticuerpo que comprende el cultivo de la célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, de forma que se produzca el anticuerpo. En algunas realizaciones, el método incluye además recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora.
En el presente documento también se proporcionan anticuerpos para su uso en métodos para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo, comprendiendo los métodos la administración al individuo de una cantidad eficaz del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la administración al individuo de una cantidad eficaz de un segundo anticuerpo. En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo se une a un antígeno expresado por una célula cancerosa. En algunas realizaciones, el antígeno expresado por la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, mucina 1, mucina 16, PTK7, STEAP1, receptor de endotelina B, mesotelina, EGFRvIII, En Pp3, SLC44A4, GNMB, nectina 4, NaPi2b, LIV-1A, guanilil ciclasa C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrina aVp3, integrina a5p1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, una mucina, CAIX, EPHA3, receptor de folato a, GD2, GD3 y un complejo de MHC y péptido que comprende un péptido de NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, una proteína de la familia MAGE, Ma Ge-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirosinasa, TRp2, CEA, PSA, TAG-72, receptor de laminina inmadura, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, pcatenina, TGF-pRII, HPV E6 o HPV E7. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la administración al individuo de una cantidad eficaz de un agente inmunoterapéutico. En algunas realizaciones, el agente inmunoterapéutico comprende un segundo anticuerpo. En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo se une a un antígeno seleccionados del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, OX40, CTLA-4, CD137/4-1BB, TNFR2, B7-H3, FZD7, CD27, CCR4, CSF1R, CSF, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, CCR2, IDO, A2R, CD39, CD73, TIGIT, CD80, CD47, arginasa, TDO y PVRIG. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo se une al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v1 humano, el dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v2 humano o los dominios extracelulares tanto de un polipéptido SIRP-a v i humano como un polipéptido SIRP-a v2 humano con una constante de disociación (Kd) de menos de 100 nM, en donde el primer anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano y en donde el segundo anticuerpo se une a PD-1. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo se une al dominio D1 de un polipéptido SIRP-a humano, en donde el primer anticuerpo no bloquea la unión entre un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano, y en donde el segundo anticuerpo se une a PD-1. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo se une al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v1 humano con una constante de disociación (Kd) de menos de 100 nM, en donde el primer anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano y en donde el segundo anticuerpo se une a PD-L1. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo se une al dominio D1 de un polipéptido SIRP-a humano, en donde el primer anticuerpo no bloquea la unión entre un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano, y en donde el segundo anticuerpo se une a PD-L1. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
En el presente documento también se proporcionan anticuerpos para su uso en métodos para tratar o retrasar la progresión de una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria en un individuo, comprendiendo los métodos la administración al individuo de una cantidad eficaz del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores. La enfermedad autoinmunitaria o enfermedad inflamatoria puede seleccionarse del grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, una espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria mediada por anticuerpos, enfermedad del injerto contra el hospedador, sepsis, diabetes, psoriasis, artritis psoriásica, ateroesclerosis, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica progresiva, escleroderma, síndrome coronario agudo, reperfusión isquémica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, endometriosis, glomerulonefritis, nefropatía por IgA, enfermedad de riñón poliquístico, miastenia grave, fibrosis pulmonar idiopática, asma, dermatitis atópica, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), vasculitis y miositis autoinmunitaria inflamatoria. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
También se describen en el presente documento métodos para identificar un dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y no bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano, comprendiendo los métodos (a) proporcionar un dominio de unión a antígeno que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano; (b) ensamblar un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un polipéptido que comprende un dominio IgSF de CD47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a una CD47 humana con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio D1 de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana; (c) poner el dominio de unión a antígeno en contacto con el complejo ensamblado; y (d) detectar la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo, en donde la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo indica que el dominio de unión a antígeno no bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. También se describen en el presente documento métodos para identificar un anticuerpo o dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y no bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano, comprendiendo los métodos poner un anticuerpo o un dominio de unión a antígeno que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano en contacto con un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un polipéptido que comprende un dominio IgSF de Cd47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a una CD47 humana con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio D1 de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana y detectar la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo, en donde la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo indica que el dominio de unión a antígeno no bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. También se describen en el presente documento métodos para identificar un dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano, comprendiendo los métodos (a) proporcionar un dominio de unión a antígeno que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano; (b) ensamblar un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un polipéptido que comprende un dominio IgSF de c D47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a una CD47 humana con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio D1 de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana; (c) poner el dominio de unión a antígeno en contacto con el complejo ensamblado; y (d) detectar la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo, en donde una carencia de unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo indica que el dominio de unión a antígeno bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. También se describen en el presente documento métodos para identificar un anticuerpo o un dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano, comprendiendo los métodos poner un anticuerpo o un dominio de unión a antígeno que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano en contacto con un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un polipéptido que comprende un dominio IgSF de Cd47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a una CD47 humana con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio D1 de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana y (d) detectar la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo, en donde una carencia de unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo indica que el dominio de unión a antígeno bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. La variante de SIRP-a D1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17-52. El dominio IgSF de CD47 puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. El polipéptido que comprende el dominio IgSF de CD47 puede comprender un dominio extracelular de c D47 humana. El polipéptido que comprende el dominio IgSF de CD47 puede comprender además una región Fc del anticuerpo.
También se describen en el presente documento métodos para producir un anticuerpo anti-SIRP-a que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano, comprendiendo los métodos: (a) inmunizar un pollo con un péptido que comprende al menos una parte de un dominio extracelular de SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1); (b) obtener un anticuerpo de una célula que produce anticuerpos del pollo inmunizado y (c) detectar la unión entre el anticuerpo obtenido de la célula y los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de un polipéptido SIRP-a humano, en donde la unión entre el anticuerpo y el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano indica que el anticuerpo es un anticuerpo anti-SIRP-a que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido de la variante de SIRP-a humano. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de pollo, humanizado, quimérico o humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v1 humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v1 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMD FSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 5). El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v2 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDF SISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 6). El anticuerpo puede unirse une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v1 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMD FSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 5) y se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v2 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDF SISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 6). El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polipéptidos de la variante de SIRP-a humanos diferentes. Cada uno de los tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polipéptidos de la variante de SIRP-a humanos diferentes puede comprender un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 6 y 76-83. Los métodos pueden comprender además la detección de unión entre el anticuerpo obtenido de la célula y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de uno o más polipéptidos SIRP-a seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido SIRP-a de mono, un polipéptido SIRP-a murino, un polipéptido SIRP-p humano y un polipéptido SIRP-y humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono. El polipéptido SIRP-a de mono puede ser un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D i) de al menos dos polipéptidos de la variante de SIRP-a de mono diferentes. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o ambos. El anticuerpo se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D i) de dos o más polipéptidos de la variante de SIRP-a murinos diferentes. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de uno o más polipéptidos SIRP-a murinos, y en donde el uno o más polipéptidos SIRP-a murinos comprende, cada uno, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-i0. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano. El anticuerpo puede no unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano. El anticuerpo puede no unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: i3, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i4 o ambos. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i5. Los métodos pueden comprender además la detección de la unión o una carencia de unión entre el anticuerpo obtenido de la célula y un complejo que comprende una variante de SIRP-a Di unida a un dominio de IgSF de CD47, en donde la variante de SIRP-a Di es un dominio Di de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a Di se une a CD47 humana con una afinidad que es al menos i0 veces mayor que la afinidad de un dominio Di de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana. El anticuerpo puede unirse a un complejo que comprende una variante de SIRP-a Di unida a un dominio de IgSF de c D47, en donde la variante de SIRP-a Di es un dominio Di de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a Di se une a CD47 humana con una afinidad que es al menos i0 veces mayor que la afinidad de un dominio Di de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana. El anticuerpo puede no bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede no bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula. El anticuerpo puede no unirse a un complejo que comprende una variante de SIRP-a Di unida a un dominio de IgSF de CD47, en donde la variante de SIRP-a Di es un dominio Di de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a Di se une a CD47 humana con una afinidad que es al menos i0 veces mayor que la afinidad de un dominio Di de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana. El anticuerpo puede bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano puede reducir la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión al dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula puede reducir la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano puede aumentar la koff del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula puede aumentar la koff del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula. El anticuerpo puede modular la señalización de SIRP-a en una célula que expresa un polipéptido SIRP-a humano. La célula puede ser un leucocito seleccionado del grupo que consiste en un macrófago, una célula dendrítica, un neutrófilo, un eosinófilo y una célula supresora procedente de mieloide (MDSC). El anticuerpo puede inhibir la señalización de SIRP-a en un macrófago que expresa un polipéptido SIRP-a
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humano. El anticuerpo puede potenciar la fagocitosis mediante un macrófago que expresa un polipéptido SIRP-a humano.
Se ha de comprender que una, algunas o todas las propiedades de las diversas realizaciones descritas en el presente documento pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención se volverán evidentes para un experto en la materia. Estas y otras realizaciones de la invención se describen de adicionalmente en la descripción detallada que sigue a continuación.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1A muestra un alineamiento entre los dominios D1 de 10 polipéptidos de la variante de SIRP-a humanos diferentes. Las secuencias mostradas corresponden a las s Eq ID NO: 5, 6 y 76-83 (de arriba hacia abajo). Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 1B muestra un alineamiento entre dominios D1 de SIRP-a v i humana, v2 humana, de mono cynomolgus y de ratón 129. Las secuencias mostradas corresponden a las SEQ ID NO: 5, 6, 11 y 7 (de arriba hacia abajo). Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 1C muestra alineamientos entre varios dominios D1 de SIRP-a humana y de ratón, con indicación de bucles R1, R2 y R3. Se muestra un alineamiento entre dominios D1 de SIRP-a v1 humana, v2 humana, de ratón 129, ratón NOD, ratón C57BL/6 y ratón BALB/c. Las secuencias mostradas corresponden a las SEQ ID NO: 5-10 (de arriba hacia abajo). Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 2 muestra un alineamiento entre dominios D1 de SIRP-a v1 humana, v2 humana, de mono cynomolgus, ratón 129 y pollo. Las secuencias mostradas corresponden a las SEQ ID NO: 5, 6, 11, 7 y 84 (de arriba hacia abajo). Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
Las FIG. 3A y 3B muestran la especificidad de unión del clon del anticuerpo S130 para una diversidad de péptidos SIRP. La FIG. 3A muestra las curvas de unión de ELISA para el anticuerpo contra dominios D1 de SIRPa v1 humana, v2 humana, murino y de mono cynomolgus, así como SIRPy humana (SEQ ID NO: 15) y un complejo preformado de variantes de SIRP-a de afinidad elevada unido al dominio IgSF de CD47 (SEQ ID NO: 16). El complejo preformado se generó mediante la mezcla de dos polipéptidos SIRP-a v1 y v2 humanos de afinidad elevada (SEQ ID NO: 17 y 19) en una relación 1:1 y la combinación de la mezcla con CD47 para generar el complejo SIRP-a:CD47. El complejo preformado SIRP-a:CD47 para las FIG. 4A-9B se prepara también de manera similar. La FIG. 3B resume la especificidad de unión del clon contra cada una de estas dianas ("+" indica la unión; "-" indica la carencia de unión).
Las FIG. 4A y 4B muestran la especificidad de unión del clon del anticuerpo S121 para una diversidad de péptidos SIRP. La FIG. 4A muestra las curvas de unión de ELISA para el anticuerpo contra dominios D1 de SIRPa v1 humana, v2 humana, murino y de mono cynomolgus, así como SIRPy humana (SEQ ID NO: 15) y un complejo preformado de variantes de SIRP-a de afinidad elevada (SEQ ID NO: 17 y 19) unido al dominio IgSF de CD47 (SEQ ID NO: 16). La FIG. 4B resume la especificidad de unión del clon contra cada una de estas dianas ("+" indica la unión; "-" indica la carencia de unión).
Las FIG. 5A y 5B muestran la especificidad de unión del clon del anticuerpo S137 para una diversidad de péptidos SIRP. La FIG. 5A muestra las curvas de unión de ELISA para el anticuerpo contra dominios D1 de SIRPa v1 humana, v2 humana, murino y de mono cynomolgus, así como SIRPy humana (SEQ ID NO: 15) y un complejo preformado de variantes de SIRP-a de afinidad elevada (SEQ ID NO: 17 y 19) unido al dominio IgSF de CD47 (SEQ ID NO: 16). La FIG. 5B resume la especificidad de unión del clon contra cada una de estas dianas ("+" indica la unión; "-" indica la carencia de unión).
Las FIG. 6A y 6B muestran la especificidad de unión del clon del anticuerpo S128 para una diversidad de péptidos SIRP. La FIG. 6A muestra las curvas de unión de ELISA para el anticuerpo contra dominios D1 de SIRPa v1 humana, v2 humana, murino y de mono cynomolgus, así como SIRPy humana (SEQ ID NO: 15) y un complejo preformado de variantes de SIRP-a de afinidad elevada (SEQ ID NO: 17 y 19) unido al dominio IgSF de CD47 (SEQ ID NO: 16). La FIG. 6B resume la especificidad de unión del clon contra cada una de estas dianas ("+" indica la unión; "-" indica la carencia de unión).
Las FIG. 7A y 7B muestran la especificidad de unión del clon del anticuerpo S135 para una diversidad de péptidos SIRP. La FIG. 7A muestra las curvas de unión de ELISA para el anticuerpo contra dominios D1 de SIRPa v1 humana, v2 humana, murino y de mono cynomolgus, así como SIRPy humana (SEQ ID NO: 15) y un complejo preformado de variantes de SIRP-a de afinidad elevada (SEQ ID NO: 17 y 19) unido al dominio IgSF de CD47 (SEQ ID NO: 16). La FIG. 7B resume la especificidad de unión del clon contra cada una de estas dianas ("+" indica la unión; "-" indica la carencia de unión).
Las FIG. 8A y 8B muestran la especificidad de unión del clon del anticuerpo S126 para una diversidad de péptidos SIRP. La FIG. 8A muestra las curvas de unión de ELISA para el anticuerpo contra dominios D1 de SlRPa v i humana, v2 humana, murino y de mono cynomolgus, así como SIRPy humana (SEQ ID NO: 15) y un complejo preformado de variantes de SIRP-a de afinidad elevada (SEQ ID NO: 17 y 19) unido al dominio IgSF de CD47 (SEQ ID NO: 16). La FIG. 8B resume la especificidad de unión del clon contra cada una de estas dianas ("+" indica la unión; "-" indica la carencia de unión).
Las FIG. 9A y 9B muestran la especificidad de unión del clon del anticuerpo S138 para una diversidad de péptidos SIRP. La FIG. 9A muestra las curvas de unión de ELISA para el anticuerpo contra dominios D1 de SIRPa v1 humana, v2 humana, murino y de mono cynomolgus, así como SIRPy humana (SEQ ID NO: 15) y un complejo preformado de variantes de SIRP-a de afinidad elevada (SEQ ID NO: 17 y 19) unido al dominio IgSF de CD47 (SEQ ID NO: 16). La FIG. 9B resume la especificidad de unión del clon contra cada una de estas dianas ("+" indica la unión; "-" indica la carencia de unión).
La FIG. 10A muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones de scFv-Fc obtenidos a partir de un pollo de tipo silvestre. Se muestran las SEQ ID NO: 53-60 (en orden descendente en el alineamiento). Las CDR y las secuencias enlazadoras se indican mediante líneas. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 10B muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones de scFv-Fc obtenidos a partir de un pollo que produce anticuerpos humanos. Se muestran las SEQ ID NO: 61-74 (en orden descendente en el alineamiento). Las CDR y las secuencias enlazadoras se indican mediante líneas. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 11A muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones de familia 2. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH son las SEQ ID NO: 294, 139, 358, 362, 354, 380, 384, 350, 137, 374, 356, 352, 135, 348, 376, 346, 342, 344, 141, 360, 370, 382, 364, 366, 368, 372 y 378 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL son las SEQ ID NO 295, 363, 140, 359, 355, 351, 136, 349, 377, 138, 375, 357, 353, 381, 385, 345, 365, 367, 369, 347, 142, 343, 371, 379, 383, 361 y 373 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de HVR se indican mediante líneas. Las HVR son según Kabat. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 11B muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones de familia 3. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH son las SEQ ID NO: 133, 128, 396, 386, 398, 402, 392, 388, 390, 394 y 400 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL son las SEQ ID NO 134, 105, 387, 389, 395, 397, 399, 403, 391, 393 y 401 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de HVR se indican mediante líneas. Las HVR son según Kabat. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 11C muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones de familia 4. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH son las SEQ ID NO 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL son las SEQ ID NO 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de HVR se indican mediante líneas. Las HVR son según Kabat. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos. La FIG. 11D muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones de familia 5, grupo 4. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH son las SEQ ID NO: 278 y 412 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL son las SEQ ID NO 279 y 413 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de HVR se indican mediante líneas. Las HVR son según Kabat. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 11E muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones adicionales de familia 5, grupo 4. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH son las SEQ ID NO: 275 y 414 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL son las SEQ ID NO: 276 y 415 (en orden descendente en el alineamiento). Las HVR y las secuencias enlazadoras se indican mediante líneas. Las HVR son según Kabat. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 11F muestra las secuencias de dominios VH y VL (SEQ ID NO 280 y 281, respectivamente del clon de familia 5, grupo 4 S209. Las secuencias de HVR están subrayadas.
La FIG. 11G muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones de familia 5, grupo 5. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH son las SEQ ID NO: 123 y 292 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL son las SEQ ID NO 100 y 293 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de HVR se indican mediante líneas. Las HVR son según Kabat. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 11H muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones adicionales de familia 5, grupo 5. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH son las SEQ ID NO: 288, 290, 408 y 410 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL son las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de HVR se indican mediante líneas. Las HVR son según Kabat. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 11I muestra las secuencias de dominios VH y VL del clon 149 (SEQ ID NO 286 y 287, respectivamente) y del clon 218 (SEQ ID NO: 284 y 285, respectivamente). Las secuencias de HVR están subrayadas.
La FIG. 11J muestra un alineamiento de los dominios VH y VL de los clones de familia 1. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH son las SEQ ID NO: 120, 121, 130 y 122 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL son las SEQ ID NO: 97, 98, 107 y 99 (en orden descendente en el alineamiento). Las secuencias de HVR se indican mediante líneas. Las HVR son según Kabat. Las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
Las FIG. 12A-12C muestran perfiles de unión de resonancia de plasmones superficiales (SPR) de clones de anticuerpo representativos que se unen a un complejo preformado de una variante de SIRP-a de afinidad elevada (SEQ ID NO: 18) mezclada con concentraciones crecientes del dominio IgSF de CD47 (SEQ ID NO: 16). La FIG. 12A muestra la curva de unión de un clon de anticuerpo (S123) que no bloquea la unión de CD47 a SIRP-a (por ejemplo, un anticuerpo no bloqueador). La FIG. 12B muestra la curva de unión de un clon de anticuerpo (S119) que bloquea la unión de CD47 a SIRP-a (por ejemplo, un anticuerpo bloqueador). La FIG. 12C muestra la curva de unión de un clon de anticuerpo (S118) que se une a SIRP-a y reduce su afinidad de unión a CD47 (por ejemplo, un anticuerpo "de partida").
Las FIG. 13A-13G muestran los resultados de ensayos de fagocitosis de células tumorales in vitro mediante el uso de macrófagos tratados con anticuerpo anti-SIRP-a (en series de concentraciones indicadas), cetuximab o trastuzumab, anticuerpo anti-SIRP-a más cetuximab o trastuzumab, o anticuerpo de control (IgG1, k), tal como se indicó. Los macrófagos con células tumorales fagocitadas se identificaron como células positivas para CD33, CD206 y CFSE mediante citometría de flujo. Las células tumorales sometidas a ensayo fueron d Ld-1 (FIG. 13A-13D y 13G) o las células OE19 (FiG. 13E y 13F). Los anticuerpos anti-SIRP-a evaluados fueron AB3a (FIG. 13A y 13B), AB45a (FIG. 13C y 13D), AB119a (FIG. 13E), AB135a (FIG. 13F) y AB136c (FIG. 13G).
La FIG. 14 muestra los resultados de los ensayos de activación de células dendríticas in vivo en células dendríticas aisladas de los bazos de ratones Balb/c tratados con anticuerpo anti-SIRP-a AB136b, anticuerpo antagonista anti-SIRP-a antirratón de rata de control (clon p84), control de IgG de rata o control de IgG de ratón, tal como se indicó. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa con el anticuerpo indicado a 10 mg/kg y se recogieron los bazos cinco horas después de la inyección. Se midió el marcador de activación CD86 en células dendríticas mediante citometría de flujo.
La FIG. 15 muestra los resultados de un modelo de carcinoma de colon de ratón singénico in vivo para evaluar la actividad de agente simple. Las células MC38 se implantaron de forma subcutánea en ratones C57BL/6 y se asignaron a grupos de forma aleatoria (8 ratones/grupo). Los ratones se trataron con vehículo (PBS), el anticuerpo anti-SIRP-a bloqueador de CD47 AB25b, el anticuerpo anti-SIRP-a bloqueador de CD47 AB25c, el anticuerpo anti-SIRP-a bloqueador de CD47 AB27b, el anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador de CD47 AB3b o el anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador de CD47 136b. El tratamiento se inició cuando los tumores tenían un promedio 60 mm3, el día 7 luego del implante. Se administraron dosis a los ratones por vía intraperitoneal (IP) a 10 mg/kg dos veces por semana durante tres semanas con anticuerpos anti-SIRPa. Los animales se sacrificaron cuando los tumores llegaron a un volumen de ~2000 mm3.
La FIG. 16 muestra los resultados de un modelo de carcinoma de colon de ratón singénico in vivo para evaluar la actividad de agente simple. Las células CT26 se implantaron de forma subcutánea en ratones BALB/c (se usaron 8-9 ratones por grupo) que se trataron con AB136b o vehículo (PBS), tal como se indicó. El tratamiento se inició cuando los tumores tenían en promedio 80 mm3, el día 7 luego del implante. Se administraron dosis a los ratones por vía intraperitoneal (IP) a 3 mg/kg o 10 mg/kg dos veces por semana durante tres semanas con anticuerpos anti-SIRPa. Los animales se sacrificaron cuando los tumores llegaron a un volumen de ~2000 mm3.
La FIG. 17A muestra una comparación de la unión de CD47 y Fab 119 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a con SIRP-a, tal como se determinó mediante cristalografía de rayos X.
La FIG. 17B muestra el sitio de interacción entre Fab 119 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a y SIRP-a, tal como se determinó mediante análisis de área de superficie no expuesta. Los restos de SIRP-a incluidos en el epítopo de unión a Fab 119 del anticuerpo están sombreados según los cambios del área de superficie no expuesta. Se indican los restos de anticuerpo claves en el parátopo de SIRP-a: (H) = resto de cadena pesada; (L) = resto de cadena ligera.
La FIG. 18A muestra una comparación de la unión de CD47 y Fab 136 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a con SIRP-a, tal como se determinó mediante cristalografía de rayos X.
La FIG. 18B muestra el sitio de interacción entre Fab 136 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a y SIRP-a, tal como se determinó mediante análisis de área de superficie no expuesta. Los restos de SIRP-a incluidos en el epítopo de unión a Fab 136 del anticuerpo están sombreados según los cambios del área de superficie no expuesta. Se indican los restos de anticuerpo claves en el parátopo de SIRP-a: (H) = resto de cadena pesada; (L) = resto de cadena ligera.
La FIG. 19A muestra una comparación de la unión de CD47 y Fab 3 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a con SIRP-a, tal como se determinó mediante cristalografía de rayos X.
La FIG. 19B muestra el sitio de interacción entre Fab 3 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a y SIRP-a, tal como se determinó mediante análisis de área de superficie no expuesta. Los restos de SIRP-a incluidos en el epítopo de unión a Fab 3 del anticuerpo están sombreados según los cambios del área de superficie no expuesta. Se indican los restos de anticuerpo claves en el parátopo de SIRP-a: (H) = resto de cadena pesada; (L) = resto de cadena ligera.
La FIG. 19C muestra una comparación de la unión de CD47 y Fab 115 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a con SIRP-a, tal como se determinó mediante cristalografía de rayos X.
La FIG. 19D muestra el sitio de interacción entre Fab 115 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a y SIRP-a, tal como se determinó mediante análisis de área de superficie no expuesta. Los restos de SIRP-a incluidos en el epítopo de unión a Fab 115 del anticuerpo están sombreados según los cambios del área de superficie no expuesta. Se indican los restos de anticuerpo claves en el parátopo de SIRP-a: (H) = resto de cadena pesada; (L) = resto de cadena ligera.
La FIG. 20A ilustra una comparación de la unión de CD47, Fab 119 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a, Fab 136 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a, Fab 3 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a, Fab 115 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a a SIRP-a, tal como se determinó mediante cristalografía de rayos X.
La FIG. 20B muestra los epítopos para la unión de CD47, Fab 119 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a, Fab 136 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a, Fab 3 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a y Fab 115 del clon de anticuerpo anti-SIRP-a a SIRP-a, tal como se determinó mediante cristalografía de rayos X. Los valores indican la diferencia entre área accesible de superficie de cada átomo del resto en Fab/CD47 cuando se analiza solo contra cuando se analiza en un complejo con SIRP-a, expresados como área de superficie no expuesta (A2). La numeración de los restos es según la SEQ ID NO: 296.
La FIG. 21A muestra un diagrama de flujo para el agrupamiento de epítopos de anticuerpos anti-SIRP-a. La FIG. 21B muestra resultados de un ejemplo de ensayo para el agrupamiento de epítopos de anticuerpos anti-SIRP-a A, B, C, D, E y F.
Las FIG. 22A y 22B muestran los resultados del agrupamiento de epítopos de los anticuerpos anti-SIRP-a indicados. La cantidad de clones para el ligando (anti-SIRPa) unido al chip se indica como filas, y la cantidad de clones para los analitos (anti-SIRPa) inyectados en el chip se indica como columnas. Los recuadros blancos indican anticuerpos que forman sándwiches (y se considera que se unen a epítopos diferentes). Los recuadros grises indican anticuerpos que no forman sándwiches (y se considera que se unen a los mismos epítopos). "X" indica casos en los que los datos de una orientación difieren con los de la otra.
La FIG. 23 proporciona un modelo para la unión del anticuerpo anti-SIRP-a y CD47 al dominio D1 de SIRP-a con base en el agrupamiento de epítopos. Se proporcionan clones de anticuerpo representativos para cada grupo (y se marcaron con números).
La FIG. 24A muestra alineaciones entre la cadena pesada 119 parental (119_VH_Wt), la cadena pesada variante 119 con 4 mutaciones (3 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón y una mutación en CDR-H1 que remueve un posible punto clave de oxidación; VH_MutALL), la cadena pesada variante 119 con 3 mutaciones (3 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal solo en el armazón; VH_MutAll_V34M) y la cadena pesada variante 119 con 3 mutaciones y una mutación M34L (3 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón; VH_MutAll_V34L). Las secuencias mostradas son: SEQ ID NO: 335 para 119_VH_Wt, SEQ ID NO: 246 para VH_MutALL, SEQ ID NO: 258 para VH_MutAll_V34M y SEQ ID NO: 327 para VH_MutAll_V34L. Se indican las secuencias de CDR con líneas; las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 24B muestra alineaciones entre la cadena ligera parental 119 (119_VL_Wt) y la cadena ligera variante 119 con 4 mutaciones (4 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón; VL_mutAll). Las secuencias mostradas son: SEQ ID NO: 97 para 119_VL_Wt y SEQ ID NO: 312 para VL_mutAll. Se indican las secuencias de CDR con líneas; las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 25A muestra alineaciones entre la cadena ligera parental 135 (VL_Wt) y la cadena ligera variante 135 con 2 mutaciones (2 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón; VL_mutALL). Las secuencias mostradas son: SEQ ID NO: 104 para 135 VL_wt y SEQ ID NO: 248 para 135 VL_MutALL Se indican las secuencias de HVR con líneas; las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos. La FIG. 25B muestra alineaciones entre la cadena pesada 135 parental (VH_wt), la cadena pesada variante 135 con 6 mutaciones (5 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón y una mutación en CDR-H1 que remueve un posible punto clave de oxidación; VH_MutAll), la cadena pesada variante 135 con 5 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón (VH_MutAll_V34M) y la cadena pesada variante 135 con 5 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón y la mutación M34L (VH_MutAll_V34L). Las secuencias mostradas son: SEQ ID NO: 341 para VH_wt, SEQ ID NO: 247 para VH_MutAll y SEQ ID NO: 259 para VH_MutAll_V34M y SEQ ID NO: 328 para VH_MutAll_V34L. Se indican las secuencias de HVR con líneas; las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 26A muestra alineaciones entre la cadena ligera 136 parental (VL_wt), la cadena ligera variante 136 con 4 mutaciones (4 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón; VL_mutaLL), la cadena ligera variante 136 con una retromutación I2T única que vuelve a la secuencia de tipo silvestre en una referencia de otro modo "all mut" (VL_Mutall_I2T). Las secuencias mostradas son: SEQ ID NO: 134 para VL_wt, SEQ ID NO: 250 para VL_mutaLL y SEQ ID No : 251 para VL_Mutall_I2T. Se indican las secuencias de HVR con líneas; las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 26B muestra alineaciones entre la cadena pesada 136 parental (VH_wt), la cadena pesada variante 136 con 6 mutaciones (5 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón y una mutación en CDR-H1 que remueve un posible punto clave de oxidación; VH_mutall), la cadena pesada variante 136 con 5 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón (VH_Mutall_V34M) y la cadena pesada variante 136 con 5 retromutaciones respecto a la secuencia de línea germinal en el armazón y la mutación M34L (VH_Mutall_V34L). Las secuencias mostradas son: SEQ ID NO: 133 para VH_wt, SEQ ID NO: 249 para VH_mutall, SEQ ID NO: 260 para VH_Mutall_V34M y SEQ ID NO: 329 para VH_Mutall_V34L. Se indican las secuencias de HVR con líneas; las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 27A muestra afinidades de unión de variantes del anticuerpo 136 para seis proteínas SIRP-a: SIRP-a v1 humana (SEQ ID NO: 5), SIRP-a v2 humana (SEQ ID NO: 6), SIRP-a de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 11), SIRP-a de ratón NOD (SEQ ID NO: 8), SIRP-a de ratón BL/6 (SEQ ID NO: 9) y SIRP-a de ratón BALB/c (SEQ ID NO: 10). Las variantes de anticuerpo presentaron cadenas ligeras con mutación (mut) o parentales (wt, forma siglada de wild-type, de tipo silvestre) y cadenas pesadas con mutación o parentales, tal como se indicó en el orden cadena ligera/cadena pesada. En la gráfica, el eje y indica la relación de Kd mut/KD wt. Una relación de 1 significa que el anticuerpo tenía una Kd equivalente al anticuerpo wt/wt (indicado por la línea punteada), una relación >1 indica afinidad menor que wt/wt y una relación <1 indica afinidad mayor que wt/wt.
La FIG. 27B muestra afinidades de unión de variantes del anticuerpo 136 para siete proteínas SIRP-a: SIRP-a de ratón BL/6 (SEQ ID NO: 9), SIRP-a de ratón NOD (SEQ ID NO: 8), SIRP-a de ratón BALB/c (SEQ ID NO: 10), SIRP-a v1 humana (SEQ ID NO: 5), SIRP-a v2 humana (SEQ ID NO: 6), SIRP-a de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 11) y SIRP-y v1 humana (SEQ ID NO: 15). Además de evaluar 136 wt y 136 con mutaciones totales, las variantes se construyeron con eliminación de cada mutación individual en una referencia de cadena ligera con mutaciones totales. En la gráfica, el eje y indica la relación de Kd mut/KD wt. Una relación de 1 significa que el anticuerpo tenía una Kd equivalente al anticuerpo wt/wt (indicado por la línea punteada), una relación >1 indica afinidad menor que wt/wt y una relación <1 indica afinidad mayor que wt/wt.
La FIG. 28 compara el rendimiento de expresión y la afinidad de unión de los anticuerpos que tienen las cadenas pesadas humanas y las cadenas ligeras humanizadas indicadas en células 293-FS FreeStyle™ (Thermo Fisher).
La FIG. 29 muestra un alineamiento entre los dominios VL de Hum1, Hum8 y Hum9. Hum8 se generó con base en Hum1, pero con 5 sustituciones de aminoácidos cerca de HVR-L1 y HVR-L2 o en ellas que aumentan la calidad humana. Hum9 se generó con base en Hum1, pero con 4 sustituciones de aminoácidos cerca de HVR-L1 y HVR-L2 o en ellas que aumentan la calidad humana. Se muestran las SEQ ID NO: 252 (Hum1), 416 (Hum 8) y 262 (Hum9). Se indican las secuencias de HVR con líneas; las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 30 muestra alineaciones entre la variante del anticuerpo 21 con retromutaciones de la línea germinal (HC_MutAll), la variante de anticuerpo 21 con retromutaciones de línea germinal y mutación en CDR-H1 que remueve un punto clave de oxidación posible M34V (HC_MutAll_M34V), la variante de anticuerpo 21 con retromutaciones de línea germinal y mutación M34L (HC_MutAll_M34L), la variante de anticuerpo 25 con retromutaciones de línea germinal (HC_MutAll), la variante de anticuerpo 25 con retromutaciones de línea germinal y mutación en CDR-H1 que remueve un punto clave de oxidación posible M34V (HC_MutAll_M34V), la variante de anticuerpo 25 con retromutaciones de línea germinal y mutación M34L (HC_MutAll_M34L), la variante de anticuerpo 27 con retromutaciones de línea germinal (HC_MutAll), la variante de anticuerpo 27 con retromutaciones de línea germinal y mutación en CDR-H1 que remueve un punto clave de oxidación posible M34V (HC_MutAll_M34V) y la variante de anticuerpo 27 con retromutaciones de línea germinal y mutación M34L (HC_MutAll_M34L). Las secuencias mostradas son las SEQ ID NO: 263, 264, 330, 267, 268, 332, 265, 266 y 331 (de arriba hacia abajo). Se indican las secuencias de HVR con líneas; las diferencias de aminoácidos se indican con asteriscos.
La FIG. 31 muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células OE19 HER2(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Se evaluaron los anticuerpos anti-SIRP-a "de partida" en las concentraciones indicadas en combinación con trastuzumab del anticuerpo anti-HER2. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
La FIG. 32 muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Se evaluaron los anticuerpos anti-SIRP-a no bloqueadores en las concentraciones indicadas en combinación con cetuximab del anticuerpo anti-EGFR. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
Las FIG. 33A-33C muestran los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Se evaluaron los anticuerpos anti-SIRP-a en las concentraciones indicadas en combinación con cetuximab del anticuerpo anti-EGFR. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
La FIG. 34 muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Los anticuerpos anti-SIRP-a no bloqueadores 27 y 136 se evaluaron como un anticuerpo de longitud completa (con región Fc) o un fragmento F(ab)2 en las concentraciones indicadas en combinación con el cetuximab del anticuerpo anti-EGFR. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
La FIG. 35 muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Se evaluaron las variantes 119 del anticuerpo anti-SIRP-a bloqueadores en las concentraciones indicadas en combinación con cetuximab del anticuerpo anti-EGFR. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
La FIG. 36 muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Se evaluaron las variantes 135 del anticuerpo anti-SIRP-a bloqueadores en las concentraciones indicadas en combinación con cetuximab del anticuerpo anti-EGFR. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
La FIG. 37 muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Se evaluaron los anticuerpos anti-SIRP-a no bloqueadores en las concentraciones indicadas en combinación con cetuximab del anticuerpo anti-EGFR. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
Las FIG. 38A-38B muestran los resultados de los ensayos de activación de células dendríticas in vivo con los anticuerpos anti-SIRP-a indicados. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa con el anticuerpo indicado a 10 mg/kg y se recogieron los bazos cinco horas después de la inyección. Se midieron los marcadores de activación CD86, MHCII y CCR7 en células dendríticas CD4+ mediante citometría de flujo.
La FIG. 39A muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Se evaluaron las variantes 218a y 218 de los anticuerpos anti-SIRP-a en las concentraciones indicadas en combinación con cetuximab del anticuerpo anti-EGFR. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
La FIG. 39B muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Los ejemplos de anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores 119a, 120a y 122a se evaluaron en las concentraciones indicadas. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
La FIG. 39C muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Los ejemplos de anticuerpos anti-SIRP-a no bloqueadores 136a y 137a se evaluaron en las concentraciones indicadas. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
La FIG. 39D muestra los resultados de ensayos de fagocitosis in vitro mediante el uso de células DLD-1 EGFR(+) como diana y macrófagos M2 como célula que fagocita. Los ejemplos de anticuerpos anti-SIRP-a de partida 115a, 116a, 117a, 118a y 132a se evaluaron en las concentraciones indicadas. La fagocitosis se midió mediante un porcentaje de células CFSE+.
La FIG. 40 muestra los resultados de un modelo de carcinoma de colon de ratón singénico in vivo para evaluar la actividad de la combinación del tratamiento anti-SIRP-a con inhibición de la vía PD-L1/PD-1. Las células CT26 se implantaron de forma subcutánea en ratones C57BL/6 y se asignaron a grupos de forma aleatoria (8 ratones/grupo). Se trató a los ratones con vehículo (PBS), anticuerpo anti-PD-L1, anticuerpo anti-SIRP-a bloqueador de CD47 AB25b o AB25b y PD-L1. El tratamiento se inició cuando los tumores tenían en promedio 60 mm3, el día 7 luego del implante. Se administraron dosis a los ratones por vía intraperitoneal (IP) a 10 mg/kg dos veces por semana durante tres semanas y se los sacrificó cuando los tumores llegaron a un volumen de ~2000 mm3.
La FIG. 41 muestra los resultados de un modelo de carcinoma de colon de ratón singénico in vivo para evaluar la actividad de la combinación del tratamiento anti-SIRP-a con inhibición de la vía PD-L1/PD-1. Las células MC38 se implantaron de forma subcutánea en ratones C57BL/6 y se asignaron a grupos de forma aleatoria (8 ratones/grupo). Se trató a los ratones con vehículo (PBS), anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-SIRP-a bloqueador de c D47 AB25b, AB25b y anti-PD-1, anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador de CD47 AB136b, o AB136b y anti-PD-1. El tratamiento se inició cuando los tumores tenían en promedio 60 mm3, el día 7 luego del implante. Se dosificó a los ratones por vía intraperitoneal (IP) a 10 mg/kg dos veces por semana durante tres semanas y se los sacrificó cuando los tumores llegaron a un volumen de ~2000 mm3. Descripción detallada
La presente divulgación describe anticuerpos que se unen a dominios extracelulares (por ejemplo, el dominio D1) de uno o más polipéptidos SIRP-a humanos y tienen una diversidad de perfiles de unión a SIRP-a de interés potencial. Estos perfiles de unión a SIRP-a únicos incluyen una o más de las siguientes capacidades de unión, las que se combinan de manera multifactorial para producir una multitud de especificidades únicas. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de SIRP-a v1 humano, SIRP-a v2 humano o ambos; el anticuerpo se puede unir a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de uno o más polipéptidos SIRP-a de mono o puede carecer de dicha unión; el anticuerpo se puede unir a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de uno o más polipéptidos SIRP-a murinos o puede carecer de dicha unión; el anticuerpo se puede unir al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRPp humano, o puede carecer de dicha unión; y/o el anticuerpo se puede unir al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRPy humano, o puede carecer de dicha unión. Además, la presente divulgación describe anticuerpos que bloquean la unión de CD47 a SIRP-a, anticuerpos que no bloquean la unión de CD47 a SIRP-a y anticuerpos que no bloquean la unión de CD47 a SIRP-a, pero reducen la afinidad de SIRP-a por CD47, lo que lleva a una disociación más rápida del complejo CD47/SIRP-a. Además, la presente divulgación describe anticuerpos anti-SIRP-a con una o más actividades biológicas in vitro y/o in vivo de interés, tal como la capacidad de mejorar la fagocitosis por macrófagos, mejorar la activación de células dendríticas, inhibir el crecimiento in vivo de un tumor que expresa CD47 y/o la capacidad de lograr una o más de estas actividades sin prevenir las interacciones entre una célula que expresa CD47 y un linfocito T.
Los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para identificar anticuerpos con combinaciones únicas de las especificidades de unión anteriores. Sin desear limitarse a la teoría, se cree que la capacidad de identificar anticuerpos anti-SIRP-a únicos con perfiles de unión diferentes, tal como se describe anteriormente, hace posible la identificación de anticuerpos (por ejemplo, aquellos descritos en el presente documento) con propiedades clínicas convenientes y beneficios para la investigación preclínica. En el presente documento se describen anticuerpos aislados que se unen al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v1 humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos. En el presente documento se proporcionan además polinucleótidos y vectores que codifican los anticuerpos de la presente divulgación, así como también métodos de producción de anticuerpos relacionados a esta.
En el presente documento se describen anticuerpos para su uso en métodos para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo, que comprenden la administración al individuo de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente divulgación.
En el presente documento se describen anticuerpos para su uso en métodos para tratar o retrasar la progresión de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un individuo, que comprenden la administración al individuo de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente divulgación.
En el presente documento se proporcionan métodos para identificar un dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y no bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. En algunas realizaciones, los métodos incluyen (a) proporcionar un dominio de unión a antígeno que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano; (b) ensamblar un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un polipéptido que comprende un dominio IgSF de c D47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a una CD47 humana con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio D1 de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana; (c) poner el dominio de unión a antígeno en contacto con el complejo ensamblado; y (d) detectar la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo, en donde la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo indica que el dominio de unión a antígeno no bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. En el presente documento se describen métodos para identificar un dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y no bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. En algunas realizaciones, los métodos incluyen poner un anticuerpo o dominio de unión a antígeno que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano con un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un polipéptido que comprende un dominio IgSF de CD47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a una CD47 humana con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio D1 de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana y detectar la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo, en donde la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo indica que el dominio de unión a antígeno no bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano.
En el presente documento se describen métodos para identificar un dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. En algunas realizaciones, el método incluye (a) proporcionar un dominio de unión a antígeno que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano; (b) ensamblar un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un polipéptido que comprende un dominio IgSF de CD47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a una CD47 humana con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio D1 de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana; (c) poner el dominio de unión a antígeno en contacto con el complejo ensamblado; y (d) detectar la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo, en donde una carencia de unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo indica que el dominio de unión a antígeno bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. En el presente documento se describen métodos para identificar un dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. En algunas realizaciones, el método incluye poner un anticuerpo o dominio de unión a antígeno que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano con un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 unida a un polipéptido que comprende un dominio IgSF de CD47, en donde la variante de SIRP-a D1 es un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada de origen no natural, y en donde la variante de SIRP-a D1 se une a una CD47 humana con una afinidad que es al menos 10 veces mayor que la afinidad de un dominio D1 de SIRP-a de origen natural que se une a CD47 humana y detectar la unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo, en donde la carencia de unión del dominio de unión a antígeno respecto al complejo indica que el dominio de unión a antígeno bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano.
En el presente documento se describen métodos para producir un anticuerpo anti-SIRP-a que se une a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de dos o más polipéptidos de la variante de SIRP-a humanos diferentes. En algunas realizaciones, el método incluye (a) inmunizar un pollo con un péptido que comprende al menos una parte de un dominio extracelular de SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1); (b) obtener un anticuerpo de una célula que produce anticuerpos del pollo inmunizado y (c) detectar la unión entre el anticuerpo obtenido de la célula y los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de dos o más polipéptidos de la variante de SIRP-a humanos diferentes, en donde la unión entre el anticuerpo y los dominios extracelulares (por ejemplo, el dominio D1) de los dos o más polipéptidos de la variante de SIRP-a humanos diferentes indica que el anticuerpo es un anticuerpo anti-SIRP-a que se une a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de uno o más polipéptidos de la variante de SIRP-a humano.
Definiciones
Antes de describir las realizaciones divulgadas con mayor detalle, se deberá entender que la presente divulgación no se limita a composiciones o sistemas biológicos particulares, los que pueden, evidentemente, variar. Se debe comprender también que la terminología utilizada en el presente documento tiene el fin de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende ser taxativa.
Tal como se utilizan en el presente documento memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen las referencias a plurales a menos que el contenido claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "una molécula" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de tales moléculas y similares.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente" hace referencia al intervalo de error habitual para el valor respectivo que reconoce fácilmente el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se orientan a ese valor o parámetro en sí.
Se entiende que los aspectos y las realizaciones de la presente divulgación incluyen "que comprende", "que consiste en" y "que consiste básicamente en" aspectos y realizaciones.
Tal como se usa en el presente documento, "polipéptido SIRP-a" puede hacer referencia a cualquier polipéptido SIRP-a endógeno o de origen natural codificado por un genoma de cualquier vertebrado, los que incluyen mamíferos, tales como seres humanos, monos, roedores (por ejemplo, ratón o rata) y aves, tales como pollos. La expresión también incluye variantes de origen natural, por ejemplo, variantes empalmadas de manera alternativa, variantes alélicas o polimorfismos (por ejemplo, aquellos descritos en el presente documento). La expresión también puede hacer referencia a polipéptidos SIRP-a sin procesar de longitud completa, así como polipéptidos SIRP-a que resultan del procesamiento celular, por ejemplo, la remoción de una secuencia señal, etc. En el presente documento se describen ejemplos de secuencias de polipéptidos SIRP-a. En algunas realizaciones, un polipéptido SIRP-a humano es uno codificado por un gen SIRPA humano, por ejemplo, tal como se describió mediante la id. de gen del NCBI n.° 140885. Tal como se describió en el presente documento, los polipéptidos SIRP-a son muy polimórficos dentro de las especies y entre ellas. Por ejemplo, se han identificado al menos diez variantes humanas con polimorfismos de aminoácidos en el dominio extracelular.
Los polipéptidos SIRP-a incluyen un dominio extracelular que se une a ligandos/compañeros, por ejemplo, CD47. Los polipéptidos SIRP-a comprenden 3 dominios extracelulares tipo inmunoglobulina (Ig) con homología alta D1, D2 y D3. El dominio D1 de SIRP-a ("dominio D1") hace referencia al dominio extracelular distante de la membrana de SIRP-a y media la unión de SIRP-a a CD47 (véanse, por ejemplo, Hatherley, D. et al. (2008) Mol. Cell 31:266-77; Hatherley, D. et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:14567-75; Hatherley, D. et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:26613-9 y Lee, W. Y. et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:37953-63). El dominio extracelular suele hacer referencia a la totalidad de la parte extracelular de SIRP-a, por ejemplo, tal como se expresó en una superficie celular, y puede incluir dominios de SIRP-a distintos, tales como el dominio D1. El dominio D1 contiene restos que se ha demostrado que son fundamentales para mediar en la unión de CD47 (véase, por ejemplo, Lee, W.Y. et al. (2007) J. Immunol. 179:7741-50). En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a se une a uno o más restos del dominio D1. Los ejemplos de secuencias de dominio D1 de SIRP-a humano se describen en el presente documento divulgación e incluyen, pero sin limitación, las SEQ ID NO: 5, 6 y 76-83. Asimismo, se conocen las secuencias del dominio D2 y D3 de SIRP-a humano e incluyen, pero sin limitación, APVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDV HSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIR (SEQ ID NO: 131) para el dominio D2 y VPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVS AHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVS (SEQ ID NO: 132) para el dominio D3.
Tal como se usa en el presente documento, "CD47" (también conocida como proteína asociada a la integrina (IAP), MER6 y OA3) hace referencia a un polipéptido que, entre otras funciones, actúa como un compañero de unión para los polipéptidos SIRP-a. En algunas realizaciones, CD47 hace referencia a un polipéptido CD47 humano, por ejemplo, un polipéptido codificado por un gen CD47 humano, tal como el descrito por la SEQ ID NO: 961 de referencia del NCBi. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de CD47 humana son conocidos (véase, por ejemplo, el n.° de acceso de la secuencia de referencia del NCBI n.° NP_001768). En particular, el dominio IgSF de CD47 hace referencia al dominio extracelular del extremo N de CD47 que se sabe que es fundamental para la unión de SIRP-a (véase, por ejemplo, Barclay, A.N. y Brown, M.H. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:457-64 y Hatherley, D. et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:26613-9). En algunas realizaciones, el dominio IgSF de CD47 comprende la secuencia de aminoácidos de QLLFNKTKSVEFTFSNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLL KGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS (SEQ ID NO: 16). La expresión "CD47" también puede incluir polipéptidos de CD47 modificados que son capaces de unión a SIRP-a, por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio IgSF de CD47 conjugado con otro polipéptido u otro resto, por ejemplo, una región Fc de Ig.
Tal como se usa en el presente documento, un "epítopo de SIRP-a" puede hacer referencia a los aminoácidos de un polipéptido SIRP-a que forma el sitio de unión para un anticuerpo anti-SIRP-a de la presente divulgación y/o un compañero de unión a SIRP-a, lo que incluye, pero sin limitación, CD47. La unión de un anticuerpo u otro polipéptido a un epítopo se puede caracterizar y/o mapear mediante el uso de diversos ensayos conocidos en la técnica, los que incluyen, pero sin limitación, un ensayo de bloqueo cruzado (véase Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988)), mapeo de epítopos (véase Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)), cocristalografía de rayos X, agrupamiento de epítopos, mutagénesis dirigida al sitio, barrido de oligopéptidos, mapeo de mutagénesis de alto rendimiento, intercambio de hidrógeno y deuterio, proteólisis limitada, entre otros.
Tal como se utiliza en el presente documento, "modular la señalización de SIRP-a" puede hacer referencia a antagonizar, agonizar o interferir de otra manera con uno o más aspectos de la señalización de SIRP-a en una célula que expresa un polipéptido SIRP-a. La señalización de SIRP-a puede hacer referencia a uno o más eventos de señalización intracelular mediados por la activación de un polipéptido SIRP-a, los que incluyen, pero sin limitación, la fosforilación de tirosina de la región intracelular de SIRP-a, unión de fosfatasa (por ejemplo, SHP1), unión de proteína adaptadora (por ejemplo, SCAP2, FYB y/o GRB2), producción de citocinas (por ejemplo, IL-10, IL-1p, IFN o TNF) y producción de óxido nítrico; y/o uno o más fenotipos intercelulares, los que incluyen, pero sin limitación, fagocitosis por macrófagos y otros fenotipos de activación o supresión de macrófagos, eosinófilos, neutrófilos, células dendríticas y células supresoras procedentes de mieloides (las MDSC).
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo" puede hacer referencia a anticuerpos intactos; fragmentos de anticuerpos (los que incluyen, pero sin limitación, Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv, diacuerpos, scFv, scFv-Fc, anticuerpos de dominio simple, anticuerpos de cadena pesada simple y anticuerpos de cadena ligera simple), siempre que exhiban la actividad biológica deseada (por ejemplo, unión de epítopo); anticuerpos monoclonales; anticuerpos policlonales; anticuerpos monoespecíficos; anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y proteínas tipo anticuerpo.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "biespecífico" cuando se usa para hacer referencia a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que poseen dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, cada especificidad de unión puede reconocer un antígeno diferente o cada especificidad de unión puede reconocer el mismo antígeno con afinidad diferente y/o epítopo exacto. En algunas realizaciones, cada especificidad de unión diferente comprende uno o más dominios de unión a antígeno del anticuerpo diferentes (por ejemplo, dominios variables), de manera que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo biespecífico comprenda al menos un primer dominio de unión a antígeno con una primera especificidad de unión y un segundo dominio de unión a antígeno con una segunda especificidad de unión. En el presente documento se describe una diversidad de ejemplos de formatos de anticuerpo biespecífico conocidos en la técnica.
Un anticuerpo "aislado" puede hacer referencia a un anticuerpo que se separó y/o se recuperó de un componente de su entorno natural, por ejemplo, una célula hospedadora o un organismo. En algunas realizaciones, se purifica un anticuerpo hasta una pureza deseada en peso (por ejemplo, al menos 95 %); y/u homogeneidad mediante SDS-PAGE, por ejemplo, con tinción con plata, Coomassie, etc. En algunas realizaciones, se obtiene un anticuerpo aislado mediante la o las etapas de purificación siguientes.
Tal como se conoce en la técnica, los anticuerpos "naturales" hacen referencia a complejos normalmente heterotetraméricos que incluyen dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cantidades variables de enlaces disulfuro conectan las dos cadenas pesadas y uno conecta cada cadena ligera a una cadena pesada, además de puentes de disulfuro intracatenarios. Las cadenas pesadas incluyen un dominio variable (VH) seguido (del extremo N al extremo C) de tres o cuatro dominios constantes. Las cadenas ligeras incluyen un dominio variable (VL) seguido de un dominio constante (CL). Normalmente, las cadenas ligeras de mamífero entran en una de dos categorías con base en la secuencia de aminoácidos: kappa y lambda.
Un "dominio constante" puede hacer referencia a la parte más conservada del anticuerpo o fragmento, por ejemplo, fuera de los dominios variables. El término puede incluir el dominio CL, así como los dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2, CH3 y opcionalmente CH4.
Los dominios constantes de la cadena pesada se pueden asignar a uno de 5 tipos principales: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Existen varios subtipos para muchos de estos tipos principales. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son conocidas y se describen en forma general, por ejemplo, en Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4a ed. (W.B. Saunders, Co., 2000).
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "dominio variable de anticuerpo" hace referencia a las partes de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo que incluyen las regiones de determinación de la complementariedad (CDR, por ejemplo, CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 y CDR H3) y regiones armazón (FR).
El término "variable" hace referencia al hecho de que subsecuencias de los dominios variables difieren sustancialmente en secuencia entre anticuerpos y son esenciales para la especificidad de unión de un anticuerpo en particular para su antígeno. La variabilidad se concentra en tres regiones hipervariables (HVR) tanto en los dominios VH como VL. Las partes más conservadas de los dominios variables se denominan regiones armazón (FR) en las que se intercalan las HVR. Cada dominio variable de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprende cuatro regiones FR conectadas por tres HVR que forman bucles (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1991).
La expresión "región hipervariable (HVR)" puede hacer referencia a las subregiones de los dominios VH y VL caracterizados por variabilidad de secuencia mejorada y/o formación de bucles definidos. Estas incluyen tres HVR en el dominio VH (H1, H2 y H3) y tres Hv R en el dominio VL (L1, L2 y L3). Se cree que H3 es esencial para impartir la especificidad de unión fina, con L3 y H3 que muestran el nivel más alto de diversidad. Véase Johnson y Wu en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003).
Se conoce una cantidad de delineaciones de HVR. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de la secuencia y son las más utilizadas comúnmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos nacionales de salud, Bethesda, Md. 1991). Por el contrario, Chothia hace referencia a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un punto intermedio entre las HVR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan en el software de realización de modelos de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. A continuación, se describen los restos de cada una de estas HVR. Los restos "armazón" o "FR" son los restos de dominio variable distintos a los restos de HVR.
BucleKabat AbM Chothia Contacto
L1L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración Kabat)
H1H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración Chothia)
H2H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
Asimismo, se conocen las HVR "extendidas": 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en la VH (numeración de Kabat). La "numeración de acuerdo con Kabat" puede hacer referencia al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento o una inserción de una FR o una HVR del dominio variable. La numeración de restos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo determinado mediante el alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada conforme a Kabat. Normalmente, la numeración de Kabat se usa cuando se hace referencia a un resto en los dominios variables (aproximadamente los restos 1-107 de la cadena ligera y los restos 1-113 de la cadena pesada), mientras que el sistema o índice de numeración de EU (por ejemplo, el índice EU como en Kabat, numeración de acuerdo con IgG1 de EU) se suele usar cuando se hace referencia a un resto en la región constante de cadena pesada.
Los anticuerpos de "longitud completa" o "intactos" suelen incluir cadenas pesadas con una región Fc, por ejemplo, a diferencia de un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos "Fab" de unión a antígeno con un único sitio de unión a antígeno se pueden liberar del fragmento Fc residual mediante digestión de papaína. Los fragmentos F(ab')2 incluyen dos sitios de unión a antígeno producidos mediante tratamiento de pepsina de un anticuerpo. Sin embargo, los fragmentos de anticuerpo incluirán una o más regiones variables de anticuerpos.
Un fragmento "Fv" contiene un sitio de unión a antígeno completo. Un Fv de cadena simple (scFv) puede incluir un dominio VH y VL enlazado por un enlazador peptídico de manera que los dominios VH y VL se asocien, por ejemplo, como en un anticuerpo o fragmento Fab, de manera que las HVR formen un sitio de unión a antígeno. Véase Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tomo 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), págs. 269-315. En algunas realizaciones, el scFv se fusiona a un dominio Fc del anticuerpo (por ejemplo, scFv-Fc). Si bien normalmente seis HVR comprenden un sitio de unión a antígeno, un dominio variable único con tres HVR sigue siendo capaz de unirse a un antígeno, aunque a una afinidad inferior. Véase Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996). Los anticuerpos de dominio simple (por ejemplo, anticuerpos camélidos) suelen incluir un dominio variable monomérico único para la unión al antígeno. También se conocen los anticuerpos de cadena pesada simple (VHH) y de cadena ligera simple. Un fragmento Fab' suele incluir algunos restos más en el extremo C que un fragmento Fab. Un Fab'-SH incluye restos de cisteína con un tiol libre. En la técnica se conocen varios acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
Un "diacuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno. Estos incluyen un dominio VH y VL conectado mediante un enlazador, el cual suele ser muy corto para facilitar el acoplamiento de dominios en la misma cadena. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Se conocen los tricuerpos y tetracuerpos, u otras cantidades de dominios VH/VL. Véase Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo "monoclonal" hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, sustancialmente idénticos pero que permiten niveles pequeños de mutaciones y/o modificaciones de fondo. "Monoclonal" indica el carácter sustancialmente homogéneo de los anticuerpos, y no requiere producción del anticuerpo mediante ningún método particular. En algunas realizaciones, se selecciona un anticuerpo monoclonal mediante sus secuencias HVR, VH y/o VL y/o propiedades de unión, por ejemplo, seleccionadas de un grupo de clones (por ejemplo, recombinante, hibridoma u obtenido de fagos). Un anticuerpo monoclonal se puede modificar para incluir una o más mutaciones, por ejemplo, para afectar la afinidad de unión u otras propiedades del anticuerpo, crear un anticuerpo humanizado o quimérico, mejorar la producción de anticuerpos y/u homogeneidad, modificar un anticuerpo multiespecífico, anticuerpos resultantes que todavía se consideran de naturaleza monoclonal. Se puede diferenciar una población de anticuerpos monoclonales de anticuerpos policlonales al tiempo que los anticuerpos monoclonales individuales de la población reconocen el mismo sitio antigénico. Se conoce una diversidad de técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales; véase, por ejemplo, el método hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4816567), tecnología de expresión en fagos (véanse, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a los humanos en animales que tienen una parte o la totalidad de los locus de inmunoglobulina humana o genes que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); patentes de Estados Unidos n.° 5545 807; 5545 806; 5 569825; 5625 126; 5633425 y 5661 016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
Los anticuerpos "quiméricos" pueden hacer referencia a un anticuerpo con una parte de la cadena pesada y/o ligera de un isotipo, clase u organismo particular, y otra parte de otro isotipo, clase u organismo. En algunas realizaciones, la región variable será de una fuente u organismo, y la región constante será de otra.
Los "anticuerpos humanizados" pueden hacer referencia a anticuerpos con secuencia predominantemente humana y una cantidad mínima de secuencia no humana (por ejemplo, de ratón o pollo). En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado tiene una o más secuencias de HVR (con una especificidad de unión de interés) de un anticuerpo obtenido de un organismo no humano (por ejemplo, ratón o pollo) injertado en un armazón (FR) de anticuerpo receptor humano. En algunas realizaciones, los restos no humanos se injertan adicionalmente en el armazón humano (no presente en anticuerpos de fuente o receptor), por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá básicamente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, donde todos o básicamente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o básicamente todas las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Un anticuerpo "humano" puede hacer referencia a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha producido usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Los anticuerpos humanos se pueden producir mediante varios métodos conocidos en la técnica, lo que incluye genotecas de expresión en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); preparación de anticuerpos monoclonales humanos, tal como se describe en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); y mediante la administración del antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir dichos anticuerpos como respuesta al desafío antigénico, pero cuyos locus endógenos han sido inhabilitados, por ejemplo, xenorratones inmunizados (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6075 181 y 6 150 584 respecto a la tecnología XENOMOUSE™) o pollos con secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO2012162422, WO2011019844 y WO2013059159).
Tal como se usa en el presente documento, el término "enlazador" hace referencia a un enlace entre dos elementos, por ejemplo, dominios de proteínas. En algunas realizaciones, un enlazador puede ser un enlace covalente o un espaciador. El término "espaciador" hace referencia a una fracción (por ejemplo, un polímero de polietilenglicol (PEG)) o una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una secuencia de 1-200 aminoácidos) que aparece entre dos polipéptidos o dominios de polipéptidos para proporcionar espacio o flexibilidad (o tanto espacio como flexibilidad) entre los dos polipéptidos o dominios de polipéptidos. En algunas realizaciones, un espaciador de aminoácidos es parte de la secuencia primaria de un polipéptido (por ejemplo, que se une a los polipéptidos o dominios de polipéptidos espaciados a través de la estructura principal de polipéptidos).
La expresión "agente citotóxico", tal como se usa en el presente documento, puede hacer referencia a cualquier agente que inhibe la proliferación celular o induce la muerte celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, agentes quimioterapéuticos; isótopos radioactivos; agentes inhibidores del crecimiento y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas, las que incluyen fragmentos y/o variantes de estas. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, inhibidores metabólicos, agentes antimicrotubulares, compuestos que contienen platino, agentes alquilantes, inhibidores de proteasoma, inhibidores de topoisomerasa II, antimetabolitos, inhibidores de topoisomerasa I, inhibidores de la vía de transducción de señales, inhibidores de angiogénesis de tirosina cinasa distintos al receptor, hormonas y análogos hormonales, agentes proapoptóticos, inhibidores de LDH-A, inhibidores del ciclo celular, inhibidores de HDAC y agentes antibióticos.
Tal como se usa en el presente documento, un "marcador" puede incluir cualquier fracción que actúa como agente de detección, por ejemplo, de unión entre un anticuerpo marcado de la presente divulgación y una macromolécula o célula. Los ejemplos de marcadores incluyen, pero sin limitación, fracciones fluorescentes (por ejemplo, compuestos o proteínas), radioactivos o enzimáticos, así como marcadores de purificación de afinidad.
Tal como se usa en el presente documento, se puede decir que un anticuerpo "se une a" un antígeno con una afinidad suficiente para hacer que el anticuerpo sea útil para la manipulación in vitro y/o in vivo del antígeno. En algunas realizaciones, un anticuerpo que "se une a" un antígeno tiene una constante de disociación (Kd ) para el antígeno que es menor o igual a 1 pM a 25 °C.
Tal como se usan en el presente documento, las expresiones "afinidad" o "afinidad de unión" hacen referencia a la intensidad de la interacción de unión entre dos moléculas. Por lo general, la afinidad de unión hace referencia a la intensidad de la suma total de interacciones no covalentes entre una molécula y su compañero de unión, tal como una variante de SIRP-a D1 de afinidad alta y CD47. A menos que se indique lo contrario, la afinidad de unión hace referencia a la afinidad de unión intrínseca, que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión. La afinidad de unión entre dos moléculas se describe comúnmente mediante la constante de disociación (Kd ) o la constante de asociación (Ka ). Por lo general, dos moléculas que tienen una afinidad de unión baja entre sí se unen con lentitud, tienden a disociarse con facilidad y presentan una Kd grande. Por lo general, dos moléculas que tienen una afinidad de unión alta entre sí se unen con rapidez, tienden a permanecer unidas por más tiempo y presentan una Kd pequeña. En algunas realizaciones, la Kd de dos moléculas en interacción se determina mediante métodos y técnicas que se conocen, por ejemplo, resonancia de plasmones superficiales (SPR). La Kd se puede calcular como la relación de ko ff/ko n .
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "Kd de menos de" hace referencia a un valor de Kd numéricamente más pequeño y una afinidad de unión en aumento con respecto al valor de Kd mencionado. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "Kd de más de" hace referencia a un valor de Kd numéricamente más grande y una afinidad de unión en descenso con respecto al valor de Kd mencionado.
Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" puede hacer referencia a la administración terapéutica de una molécula, compuesto, formulación, composición, etc., con el fin de modificar uno o más síntomas patológicos en un individuo o una célula que se trata. Los efectos convenientes de tratamiento pueden incluir, pero sin limitación, desacelerar la progresión de la enfermedad, mejorar o paliar un síntoma patológico o un estado de la enfermedad, mejorar el pronóstico y/o lograr la remisión de la enfermedad. Por ejemplo, el cáncer de un individuo es "tratado" con éxito si se mitigan o se suprimen uno o más síntomas asociados al cáncer tales como, pero sin limitación, la reducción de la proliferación de células cancerosas, la eliminación de células cancerosas o carga tumoral, la reducción de síntomas que resultan del cáncer, el aumento de la calidad de vida del individuo, la reducción de la dosis de otros medicamentos y/o la extensión de la supervivencia del individuo. A modo de otro ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria se puede "tratar" de manera exitosa si se mitigan o suprimen uno o más síntomas asociados a la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, tales como, pero sin limitación, reducir las células inmunitarias autorreactivas y/o las células inmunitarias inflamatorias o citocinas, reducir la activación inmunitaria y/o la inflamación, enlentecer o mitigar el daño a los órganos a consecuencia de la enfermedad, reducir los síntomas que resultan de la enfermedad, aumentar la calidad de vida del individuo, disminuir la dosis de otros medicamentos y/o prolongar la supervivencia del individuo.
Tal como se usa en el presente documento, "retrasar la progresión" de una enfermedad puede hacer referencia a enlentecer, retardar, diferir, posponer el desarrollo, estabilizar o de otro modo impedir el curso patológico de la enfermedad. En algunas realizaciones, la expresión puede hacer referencia a una demora suficiente para abarcar eficazmente la prevención, por ejemplo, en la prevención de que el individuo contraiga la enfermedad. En algunas realizaciones, por ejemplo, un cáncer avanzado, retrasar la progresión puede incluir el retraso de metástasis. Un experto en la materia entenderá que la duración exacta del retraso dependerá, por ejemplo, de la enfermedad o afección específica del individuo y similares.
Los términos "cáncer" y "canceroso" pueden describir el crecimiento o la proliferación de células desregulados o no regulados mediante una célula o células en un mamífero. Se puede incluir cualquier tipo de cáncer conocido en la técnica, tal como, pero sin limitación, carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, linfoma y blastoma. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen, pero sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer de célula escamosa, tumores cerebrales, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer colorrectal (por ejemplo, cáncer de colon o recto), cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer gástrico o de estómago, cáncer pancreático, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de tracto urinario, cáncer de mama, cáncer peritoneal, cáncer de útero, cáncer de glándula salival, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de linfocitos B (lo que incluye linfomas no hodgkiniano (NHL)); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia mieloide aguda (AML); carcinoma de células de Merkel; leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica (CML) y metástasis asociadas.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" puede hacer referencia a una cantidad de un anticuerpo de la presente divulgación o una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la presente divulgación que es suficiente y eficaz para lograr un efecto terapéutico deseado en el tratamiento o el retraso de la progresión de un paciente que padece la enfermedad, tal como un cáncer, por ejemplo, tumor sólido o cáncer hematológico. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz evitará los efectos secundarios adversos y/o dichos efectos secundarios serán superados por los efectos beneficiosos. Una cantidad eficaz puede depender del individuo que se trate, por ejemplo, edad, peso, sexo, estado de la enfermedad, así como la capacidad del agente para producir una respuesta deseada. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Tal como en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica se puede lograr o no en conjunto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica, tal como otro agente terapéutico. Por lo tanto, una "cantidad eficaz" puede considerarse además en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales y un único agente puede considerarse suministrado en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes adicionales, puede lograrse o se logra un resultado conveniente.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" puede hacer referencia a una formulación farmacéutica o medicinal que incluye un ingrediente activo, así como excipientes o diluyentes (o tanto excipientes como diluyentes) y permite que el ingrediente activo sea administrado por métodos adecuados de administración. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que se describen en el presente documento incluyen componentes farmacéuticamente aceptables compatibles con uno o más anticuerpos de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se encuentra en forma de comprimido o cápsula para la administración oral o en forma acuosa para la administración intravenosa o subcutánea, por ejemplo, mediante inyección.
Tal como se usan en el presente documento, los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan de manera intercambiable para hacer referencia a un vertebrado, por ejemplo, un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, murinos, simios, seres humanos, animales de granja, animales utilizados en deportes y mascotas.
Tal como se usa en el presente documento, "en conjunto con" o "en combinación con" puede hacer referencia a la administración de un agente terapéutico además de (por ejemplo, antes, durante y/o después) otro agente terapéutico.
Anticuerpos
Determinados aspectos de la presente divulgación hacen referencia a anticuerpos que se unen al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular de un polipéptido SlRP-a v2 humano o ambos. Tal como se demostró en el presente documento, se han caracterizado los anticuerpos que se unen específicamente a v i o v2, así como anticuerpos que se unen a ambas proteínas. En los seres humanos, se han identificado al menos 10 alelos distintos de SIRPA (véase la FIG. 1A; véase también Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol. 8:1313-23). Los anticuerpos que se unen a uno o más polipéptidos SIRP-a humanos y poseen una o más de las demás especificidades de unión descritas en el presente documento son un descubrimiento beneficioso de la presente divulgación. Además, la presente divulgación demuestra métodos para producir e identificar anticuerpo que representan una diversidad sorprendente de perfiles de especificidad de unión de SIRP-a novedosos.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMD FSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 5). Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDF SISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 6). Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMD FSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 5) y a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDF SISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 6).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D i) de i, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o io polipéptidos de variante de SIRP-a humanos diferentes. Tal como se utiliza en el presente documento, un "polipéptido de variante de SIRP-a humano" puede hacer referencia a un polipéptido de variante de SIRP-a humano de origen natural o un polimorfismo que se expresa en un ser humano, por ejemplo, a diferencia de una variante con una o más mutaciones modificadas. Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de uno o más polipéptidos de variante de SIRP-a humanos que comprende una secuencia que se muestra en la Tabla i. Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano y/o un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano, y se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de uno o más polipéptidos SIRP-a humanos seleccionados de v3, v4, v5, v6, v7, v8, v9 y vio.
Tabla i. Secuencias de polipéptido de variante de SIRP-a humano que corresponde al dominio Di.
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Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a de mono (por ejemplo, el dominio D1 de un polipéptido SIRP-a de mono). Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus (por ejemplo, el que se encuentra en el organismo Macaca fascicularis). El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de al menos dos polipéptidos de la variante de SIRP-a de mono diferentes. El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de al menos dos polipéptidos de la variante de SIRP-a de mono cynomolgus diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPEKSVSVAAGESATLNCTATSLIPVGPIQWFRGVGPGRELIYHQKEGHFPRVTPVSDPTKRNNMD FSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDVELKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 11), un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus que comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQVIQPEKSVSVAAGDSATLNCTVSSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNLKEGHFPRVTAVSDPTKRNNMD FSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDVELKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 12) o ambos.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a murino o de ratón (por ejemplo, el que se encuentra en el organismo Mus musculus; por ejemplo, el dominio D1 de un polipéptido SIRP-a murino o de ratón). El anticuerpo puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de dos o más polipéptidos de la variante de SIRP-a murinos diferentes. Se conoce una diversidad de polipéptidos de variante de SIRP-a murinos de cepas de ratón diferentes. En algunas realizaciones, el polipéptido de la variante de SIRP-a murino comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de KELKVTQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIKWYRGVGQSRLLIYSFTGEHFPRVTNVSDATKRNNMDF SIRISNVTPEDAGTYYCVKFQKGPSEPDTEIQSGGGTEVYVLAKPS (SEQ ID NO: 7; de la cepa de ratón 129), TEVKVIQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIRWYRGVGQSRQLIYSFTTEHFPRVTNVSDATKRSNLDFS IRISNVTPEDAGTYYCVKFQRGSPDTEIQSGGGTEVYVLAK (SEQ ID NO: 8; de la cepa de ratón NOD), KELKVTQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIRWYRGVGPSRLLIYSFAGEYVPRIRNVSDTTKRNNMDF SIRISNVTPADAGIYYCVKFQKGSSEPDTEIQSGGGTEVYVLAK (SEQ ID NO: 9; de la cepa de ratón C57BL/6) y TEVKVTQPEKSVSVAAGDSTILNCTVTSLLPVGPIRWYRGVGQSRLLIYSFTGEHFPRIRNVSDTTKRNNMDFS IRISNVTPEDAGTYYCVKFQRGSSEPDTEIQSGGGTEVYVLAK (SEQ ID NO: 10; de la cepa de ratón BALB/c).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de una proteína de la familia SIRP humana. Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-p humano. En algunas realizaciones, un polipéptido SIRP-p humano hace referencia a un polipéptido codificado por un gen SIRPB1 humano, por ejemplo, tal como se describió mediante la SEQ ID NO: 10326 de referencia del NCBI. En algunas realizaciones, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-p humano comprende la secuencia de aminoácidos de EDELQVIQPEKSVSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEGHFPRVTTVSELTKRNNLD FSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13) o EEELQVIQPDKSISVAAGESATLHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDF SIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDHVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 14).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-y humano. En algunas realizaciones, un polipéptido SIRP-y humano hace referencia a un polipéptido codificado por un gen SIRPG humano, por ejemplo, tal como se describió mediante la SEQ ID NO: 55423 de referencia del NCBI. En algunas realizaciones, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-y humano comprende la secuencia de aminoácidos de EEELQMIQPEKLLLVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMD FSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 15).
Además de los anticuerpos que se unen a uno o más de los polipéptidos descritos anteriormente, la presente divulgación contempla anticuerpos que no se unen a uno o más de los polipéptidos descritos anteriormente. Dicho de otra manera, el perfil de unión de un anticuerpo de la presente divulgación se puede caracterizar por exponer de manera positiva y negativa cualquiera de las especificidades y/o propiedades de unión descritas en el presente documento.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede modular la señalización de SIRP-a en una célula que expresa un polipéptido SIRP-a humano. Un anticuerpo de la presente divulgación puede antagonizar la señalización de SIRP-a en una célula que expresa un polipéptido SIRP-a humano. Un anticuerpo de la presente divulgación puede interferir con la señalización de SIRP-a en una célula que expresa un polipéptido SIRP-a humano. Un anticuerpo de la presente divulgación puede agonizar la señalización de SIRP-a en una célula que expresa un polipéptido SIRP-a humano. La señalización de SIRP-a puede incluir uno o más eventos de señalización intracelular mediados por la activación de un polipéptido SIRP-a, los que incluyen, pero sin limitación, fosforilación de tirosina de la región intracelular de SIRP-a, unión de fosfatasa (por ejemplo, SHP1), unión de proteína adaptadora (por ejemplo, SCAP2, FYB y/o GRB2) y producción de óxido nítrico. Varios ensayos para medir la señalización de SIRP-a en una célula incluyen, pero sin limitación, fosforilación de SIRP-a, inmunoprecipitación conjunta de SHP1 y SHP2, señalización de PI3-cinasa, producción de citocinas (citocinas inflamatorias IL-12, IL-23, TNFa, IFN y citocinas supresoras IL-10, IL-4, IL-13, niveles de marcadores de superficie celular para marcadores de macrófagos M1 y M2) o activación y funcionamiento de células dendríticas; Kharitonenkov, A. et al. (1997) Nature 386: 181-6; Ochi, F. et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 239:483-7; Kim, E.J. et al. (2013) Inflammation Research 62:377-86; Yi, T. et al. (2015) Immunity 43:764-75.
La célula que expresa un polipéptido SIRP-a humano puede ser un leucocito. La célula puede ser un macrófago, una célula dendrítica, un neutrófilo, un eosinófilo o una célula supresora procedente de mieloide (MDSC). Un anticuerpo de la presente divulgación puede reducir o antagonizar la señalización de SIRP-a en una célula que expresa un polipéptido SIRP-a humano en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 %, por ejemplo, mediante el uso de uno o más de los ensayos de señalización de SIRP-a descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica. Un anticuerpo de la presente divulgación puede aumentar o agonizar la señalización de SIRP-a en una célula que expresa un polipéptido SIRP-a humano en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 %, por ejemplo, mediante el uso de uno o más de los ensayos de señalización de SIRP-a descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede modular un fenotipo intercelular mediado por SIRP-a. Un anticuerpo de la presente divulgación puede potenciar la fagocitosis mediante un macrófago que expresa un polipéptido SIRP-a humano. Por ejemplo, la actividad fagocítica de un macrófago tratado o puesto en contacto con un anticuerpo de la presente divulgación se puede comparar con la actividad fagocítica de un macrófago no tratado ni puesto en contacto con el anticuerpo, o la actividad fagocítica de un macrófago que expresa un polipéptido SIRP-a humano y es tratado o puesto en contacto con un anticuerpo de la presente divulgación se puede comparar con la actividad fagocítica de un macrófago que no expresa un polipéptido SIRP-a humano y es tratado o puesto en contacto con el anticuerpo. Los ejemplos de ensayos de fagocitosis se pueden encontrar, por ejemplo, en Wieskopf, K. et al. (2013) Science 341: 88 y Willingham, S.B. et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. 109:6662-7. Un anticuerpo de la presente divulgación puede aumentar la fagocitosis mediante un macrófago que expresa un polipéptido SIRP-a humano en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 %, por ejemplo, mediante el uso de uno o más de los ensayos de fagocitosis descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede potenciar la activación de la célula (o células) dendrítica que expresan un polipéptido SIRP-a humano (por ejemplo, un nivel mayor de activación de células dendríticas individuales o una mayor proporción de la célula (o células) dendrítica que se activa en una población de muestra). Por ejemplo, la activación de la célula (o células) dendrítica tratada o puesta en contacto con un anticuerpo de la presente divulgación se puede comparar con la activación de la célula (o células) dendrítica no tratada ni puesta en contacto con el anticuerpo, o la activación de la célula (o células) dendrítica que expresa un polipéptido SIRP-a humano y se trata o pone en contacto con un anticuerpo de la presente divulgación se puede comparar con la activación de la célula (o células) dendrítica que no expresa un polipéptido SIRP-a humano y son tratadas o puestas en contacto con el anticuerpo. En el presente documento se describen ensayos de activación de células dendríticas de ejemplo. Un anticuerpo de la presente divulgación puede aumentar la activación de célula dendrítica (por ejemplo, que expresa un polipéptido SIRP-a humano) en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 %, por ejemplo, mediante el uso de uno o más de los ensayos de activación de células dendríticas descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede inhibir el crecimiento in vivo de un tumor que expresa CD47. Por ejemplo, el crecimiento in vivo de un tumor que expresa CD47 y es tratado con un anticuerpo de la presente divulgación se puede comparar con el crecimiento in vivo de un tumor que expresa CD47 y no es tratado con un anticuerpo de la presente divulgación. En el presente documento se describen ensayos de crecimiento tumoral in vivo de ejemplo. Un anticuerpo de la presente divulgación puede inhibir el crecimiento in vivo de un tumor que expresa CD47 en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 %, por ejemplo, mediante el uso de uno o más de los ensayos de crecimiento tumoral in vivo descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano (por ejemplo, un anticuerpo "bloqueador"). Por ejemplo, el anticuerpo y el polipéptido CD47 pueden "competir" por el mismo epítopo SIRP-a y/o la unión del anticuerpo a SIRP-a puede ser mutuamente excluyente con la unión de CD47 a SIRP-a. Se conocen la interfaz de unión entre SIRP-a y CD47, así como los restos de ambas proteínas que participan en la unión; véase Hatherley, D. et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:14567-75 y Nakaishi, A. et al. (2008) J. Mol. Biol. 375:650-60. En el presente documento se describen ejemplos de ensayos para determinar si un anticuerpo bloquea la unión de CD47 a SIRP-a. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido c D47 humano en un ensayo in vitro, por ejemplo, con polipéptidos SIRP-a y/o CD47 purificados. Por ejemplo, en el presente documento se describen ensayos ELISA y s Pr in vitro, aunque esto no pretende ser limitante, ya que también se pueden usar otros ensayos de unión in vitro. En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo a un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 (por ejemplo, la unión del dominio D1 de SIRP-a que tiene afinidad elevada de origen no natural con CD47 que tiene mayor afinidad que uno o más equivalentes de origen natural, tal como se describió en el presente documento) unida a un dominio IgSF de CD47 se usa para analizar anticuerpos bloqueadores, no bloqueadores y/o de partida. En algunas realizaciones, anticuerpos "bloqueadores" y/o "no bloqueadores" analizados a través de la resonancia de plasmones superficiales (SPR; por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 1). Por ejemplo, se puede formar un complejo entre un dominio IgSF de CD47 y una variante de SIRP-a D1 (por ejemplo, la unión de un dominio D1 de SIRP-a que tiene afinidad elevada de origen no natural con CD47 que tiene mayor afinidad que uno o más equivalentes de origen natural, tal como se describió en el presente documento), entonces se puede medir la unión de un anticuerpo de prueba con el complejo. En el caso de un anticuerpo que bloquea la unión de SIRP-a a CD47, en concentraciones crecientes de CD47, uno esperaría que menos moléculas de SIRP-a se encuentren disponibles para la unión al anticuerpo ya que el anticuerpo compite por el mismo sitio de unión que CD47 y la mayor parte/todos los SIRP-a se encuentran en un complejo con CD47. Por lo tanto, uno esperaría que la resonancia (UR) se redujera con concentración creciente de CD47 en la mezcla. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-SIRP-a "bloqueador" de la presente divulgación se une al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a (por ejemplo, el dominio D1) en uno o más restos de la interfaz de unión entre CD47 y SIRP-a, es decir, el anticuerpo bloqueador y CD47 comparten parcial o completamente epítopos solapantes. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-SIRP-a "bloqueador" de la presente divulgación se une al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a (por ejemplo, el dominio D1) en una o más posiciones de aminoácidos que también se unen mediante CD47 en el complejo CD47:SIRP-a. Las interfaces de unión entre SIRP-a y los ejemplos de anticuerpos anti-SIRP-a o CD47 se describen en el Ejemplo 4. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula, por ejemplo, un ensayo de unión in vivo entre polipéptidos expresados en la superficie de las células. En algunas realizaciones, el ensayo in vivo puede evaluar la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula mediante la evaluación de uno o más aspectos de la señalización de SIRP-a, por ejemplo, uno o más eventos de señalización intracelular mediados por la activación de un polipéptido SIRP-a, lo que incluye, pero sin limitación, fosforilación de tirosina de la región intracelular de SIRP-a, unión de fosfatasa (por ejemplo, SHP1), unión de proteína adaptadora (por ejemplo, SCAP2, FYB y/o GRB2), producción de citocina (por ejemplo, IL-10, IL-1p, IFN o TNF) y producción de óxido nítrico; y/o uno o más fenotipos intercelulares, los que incluyen, pero sin limitación, fagocitosis por macrófagos y otros fenotipos de activación o supresión de macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos y células supresoras procedentes de mieloides (las MDSC).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede no bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano, por ejemplo, un anticuerpo "no bloqueador". Por ejemplo, el anticuerpo y el polipéptido CD47 pueden unir epítopos distintos y/o no superpuestos de SIRP-a. Un anticuerpo de la presente divulgación puede no bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano, en un ensayo in vitro, por ejemplo, con polipéptidos SIRP-a y/o CD47 purificados. Por ejemplo, en el presente documento se describen ensayos ELISA y SPR in vitro, aunque esto no pretende ser limitante, ya que también se pueden usar otros ensayos de unión in vitro. La unión del anticuerpo a un complejo que comprende una variante de SIRP-a D1 (por ejemplo, la unión del dominio D1 de SIRP-a que tiene afinidad elevada de origen no natural con CD47 que tiene mayor afinidad que uno o más equivalentes de origen natural, tal como se describió en el presente documento) unida a un dominio IgSF de CD47 puede utilizarse para analizar anticuerpos bloqueadores, no bloqueadores y/o de partida. Los anticuerpos "bloqueadores" y/o "no bloqueadores" analizados a través de la resonancia de plasmones superficiales (SPR; por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 1). Por ejemplo, se puede formar un complejo entre un dominio IgSF de CD47 y una variante de SIRP-a D1 (por ejemplo, la unión de un dominio D1 de SIRP-a que tiene afinidad elevada de origen no natural con CD47 que tiene mayor afinidad que uno o más equivalentes de origen natural, tal como se describió en el presente documento), entonces se puede medir la unión de un anticuerpo de prueba con el complejo. En el caso de un anticuerpo que no bloquea la unión de SIRP-a a CD47, se esperaría que el anticuerpo se una al complejo SIRP-a/CD47 y forme un sándwich. Por lo tanto, a concentraciones crecientes de CD47, la resonancia aumentaría en consecuencia debido a la mayor formación de sándwich. Un anticuerpo anti-SIRP-a "no bloqueador" de la presente divulgación puede unirse al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a (por ejemplo, el dominio D1) en uno o más restos que son distintos de la interfaz de unión entre CD47 y SIRP-a, es decir, el anticuerpo no bloqueador y CD47 comparten completamente epítopos no solapantes. Las interfaces de unión entre SIRP-a y los ejemplos de anticuerpos anti-SIRP-a o CD47 se describen en el Ejemplo 4. Un anticuerpo de la presente divulgación puede no bloquear la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula, por ejemplo, un ensayo de unión in vivo entre polipéptidos expresados en la superficie de las células. El ensayo in vivo puede evaluar la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula mediante la evaluación de uno o más aspectos de la señalización de SIRP-a, por ejemplo, uno o más eventos de señalización intracelular mediados por la activación de un polipéptido SIRP-a, lo que incluye, pero sin limitación, fosforilación de tirosina de la región intracelular de SIRP-a, unión de fosfatasa (por ejemplo, SHP1), unión de proteína adaptadora (por ejemplo, SCAP2, FYB y/o GRB2), producción de citocina (por ejemplo, IL-10, IL-1p, IFN o TNF) y producción de óxido nítrico; y/o uno o más fenotipos intercelulares, los que incluyen, pero sin limitación, fagocitosis por macrófagos y otros fenotipos de activación o supresión de macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos y células supresoras procedentes de mieloides (MDSC). Es un hallazgo sorprendente de la presente divulgación que los anticuerpos que no bloquean la interacción de SIRP-a con CD47 sean capaces de aumentar la fagocitosis y bloquear el crecimiento tumoral in vivo. Sin desear limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos anti-SIRP-a no bloqueadores pueden modular una o más funciones de SIRP-a independiente de la unión a CD47.
La unión de un anticuerpo de la presente divulgación a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano puede reducir la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión al dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano (por ejemplo, un anticuerpo "de partida"). La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano puede aumentar la koff del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano de afinidad elevada (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento) puede aumentar la koff del polipéptido SIRP-a humano de afinidad elevada (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento) para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano a más de aproximadamente 1x10'31/s. Por ejemplo, el anticuerpo y el polipéptido CD47 pueden tener epítopos de SIRP-a adyacentes o parcialmente superpuestos, de manera que el anticuerpo es capaz de unir SIRP-a cuando se une a CD47, pero el anticuerpo: SIRP-a promueve la disociación del complejo SIRP-a: CD47. Un anticuerpo de la presente divulgación puede reducir la afinidad de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano para la unión de un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano en un ensayo in vitro, por ejemplo, mediante el uso de SIRP-a y/o polipéptidos CD47 purificados. La unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano puede aumentar la koff del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano en un ensayo in vitro, por ejemplo, con polipéptidos SIRP-a y/o CD47 purificados. Por ejemplo, en el presente documento se describen ensayos e LisA y SPR in vitro, aunque esto no pretende ser limitante, ya que también se pueden usar otros ensayos de unión in vitro. La unión del anticuerpo a un complejo que comprende una variante de SIRP-a Di (por ejemplo, la unión del dominio Di de SIRP-a que tiene afinidad elevada de origen no natural con CD47 que tiene mayor afinidad que uno o más equivalentes de origen natural, tal como se describió en el presente documento) unida a un dominio IgSF de c D47 puede utilizarse para analizar anticuerpos bloqueadores, no bloqueadores y/o de partida. Un anticuerpo de la presente divulgación puede reducir la afinidad de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula, por ejemplo, un ensayo de unión in vivo entre polipéptidos expresados en la superficie de las células. Un anticuerpo anti-SIRP-a "de partida" de la presente divulgación puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SlRP-a en uno o más restos de la interfaz de unión entre CD47 y SIRP-a, es decir, el anticuerpo de partida y CD47 comparten parcialmente epítopos solapantes. Un anticuerpo anti-SIRP-a "de partida" de la presente divulgación puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a en 1 o más restos que también se unen mediante c D47 en el complejo CD47:SIRP-a. Por ejemplo, un anticuerpo anti-SIRP-a "de partida" se puede unir al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a en 2 o más restos que también se unen con CD47 en el complejo CD47:SIRP-a y se encuentran en la periferia del epítopo de unión a CD47 de SIRP-a. Las interfaces de unión entre SIRP-a y los ejemplos de anticuerpos anti-SIRP-a o CD47 se describen en el Ejemplo 4. La unión de un anticuerpo de la presente divulgación a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula puede aumentar la koff del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula, por ejemplo, en un ensayo de unión in vivo entre polipéptidos expresados en la superficie de las células. El ensayo in vivo puede evaluar la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano expresado en la superficie de una primera célula y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano expresado en la superficie de una segunda célula mediante la evaluación de uno o más aspectos de la señalización de SIRP-a, por ejemplo, uno o más eventos de señalización intracelular mediados por la activación de un polipéptido SIRP-a, lo que incluye, pero sin limitación, fosforilación de tirosina de la región intracelular de SIRP-a, unión de fosfatasa (por ejemplo, SHP1), unión de proteína adaptadora (por ejemplo, SCAP2, FYB y/o GRB2), producción de citocina (por ejemplo, IL-10, IL-ip, IFN o TNF) y producción de óxido nítrico; y/o uno o más fenotipos intercelulares, los que incluyen, pero sin limitación, fagocitosis por macrófagos y otros fenotipos de activación o supresión de macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos y células supresoras procedentes de mieloides (las MDSC).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede modular una o más funciones de célula inmunitaria mediante la unión de uno o más (o los tres) de SIRP-a, SIRPp y SIRPy.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se une el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos; se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono; y el anticuerpo no bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido c D47 humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos; el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono; y el anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos; el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono; y la unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano reduce la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión de un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos; se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y el anticuerpo no bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido c D47 humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos; el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y el anticuerpo bloquea la unión entre un dominio
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extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido c D47 humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos; el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y la unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano reduce la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión de un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos; se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de un mono (por ejemplo, cynomolgus); se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y el anticuerpo no bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos; se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono (por ejemplo, cynomolgus); se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y el anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano, el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v2 humano o ambos; se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono (por ejemplo, cynomolgus); se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino; y la unión del anticuerpo a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano reduce la afinidad del polipéptido SIRP-a humano para la unión a un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D i) de dos o más polipéptidos variantes SIRP-a humanos diferentes, un polipéptido SIRP-a murino, y un polipéptido SIRP-a de mono; el anticuerpo no se une a al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano; y el anticuerpo bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano (véanse, por ejemplo, las FIG. 3A y 3B).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, el dominio D i) de dos o más polipéptidos variantes SIRP-a humanos diferentes, un polipéptido SIRP-a murino, un polipéptido SIRP-a de mono; y al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano; y el anticuerpo bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano (véanse, por ejemplo, las FIG. 4A y 4B).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D i) de dos o más polipéptidos variantes SIRP-a humanos diferentes, un polipéptido SIRP-a murino, y un polipéptido SIRP-a de mono; el anticuerpo no se une a al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano; y el anticuerpo no bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano (véanse, por ejemplo, las FIG. 5A y 5B).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D i) de dos o más polipéptidos variantes de SIRP-a humanos diferentes y un polipéptido SIRP-a de mono; el anticuerpo no se une a un polipéptido SIRP-a murino y un polipéptido SIRP-a de mono; el anticuerpo no se une a al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano; y el anticuerpo bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano (véanse, por ejemplo, las FIG. 6A y 6B).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de dos o más polipéptidos de variante de SIRP-a humanos diferentes, un polipéptido SIRP-a de mono y al menos uno de un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-p humano y un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) de un polipéptido SIRP-y humano; el anticuerpo no se une a un polipéptido SIRP-a murino; y el anticuerpo bloquea la unión entre el dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano (véanse, por ejemplo, las FIG. 7A y 7B).
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende tres CDR de un dominio VH que comprende una secuencia establecida en la Tabla 2 y/o tres CDR de un dominio VL que comprende una secuencia establecida en la Table 2 (se proporcionan las secuencias de VH y VL con las CDR subrayadas en las FIG. 10A-10B y 11A-11J). Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende tres CDR de un dominio VH que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 294, 139, 358, 362, 354, 380, 384, 350, 137, 374, 356, 352, 135, 348, 376, 346, 342, 344, 141, 360, 370, 382, 364, 366, 368, 372, 378, 133, 128, 396, 386, 398,402, 392, 388, 390, 394, 400, 116, 117, 118, 119, 282, 404, 406, 278, 412, 275, 414, 280, 123, 292, 288, 290, 408, 410, 286, 284, 120, 121, 130 y 122 y/o tres CDR de un dominio VL que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 295, 363, 140, 359, 355, 351, 136, 349, 377, 138, 375, 357, 353, 381, 385, 345, 365, 367, 369, 347, 142, 343, 371, 379, 383, 361, 373, 134, 105, 387, 389, 395, 397, 399, 403, 391, 393, 401, 93, 94, 95, 96, 283, 405, 407, 279, 413, 276, 415, 281, 100, 293, 289, 291, 409, 411, 287, 285, 97, 98, 107 y 99. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio VH que comprende una secuencia establecida en la Tabla 2 y/o un dominio VL que comprende una secuencia establecida en la Table 2 (véanse las FIG. 10A-10B y 11A-11J). Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 294, 139, 358, 362, 354, 380, 384, 350, 137, 374, 356, 352, 135, 348, 376, 346, 342, 344, 141, 360, 370, 382, 364, 366, 368, 372, 378, 133, 128, 396, 386, 398,402, 392, 388, 390, 394, 400, 116, 117, 118, 119, 282, 404, 406, 278, 412, 275, 414, 280, 123, 292, 288, 290, 408, 410, 286, 284, 120, 121, 130 y 122 y/o un dominio VL que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 295, 363, 140, 359, 355, 351, 136, 349, 377, 138, 375, 357, 353, 381, 385, 345, 365, 367, 369, 347, 142, 343, 371, 379, 383, 361, 373, 134, 105, 387, 389, 395, 397, 399, 403, 391, 393, 401, 93, 94, 95, 96, 283, 405, 407, 279, 413, 276, 415, 281, 100, 293, 289, 291, 409, 411, 287, 285, 97, 98, 107 y 99. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende seis secuencias de CDR de un anticuerpo descrito en la Tabla 2 (véanse las FIG. 10A-10B y 11A-11J). En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio VL que comprende la secuencia del dominio VL de los dominios VL Hum1-Hum9, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio VH y/o un dominio VL de un anticuerpo descrito en la Tabla 2. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio VH que comprende un resto D o E seguido de (por ejemplo, en dirección del extremo N al extremo C) una secuencia del dominio VH seleccionada de las SeQ ID NO: 116-130.
Tabla 2. Secuencias de aminoácidos de clones de anticuerpo descritas en el presente documento.
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continuación
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Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un polipéptido SIRP-a humano en uno o más restos. Se entiende que los restos de un polipéptido SIRP-a que se unen mediante un anticuerpo de la presente divulgación se pueden describir respecto a un polipéptido SIRP-a de referencia, pero la presente descripción no se limita a un único polipéptido SIRP-a (es decir, el polipéptido SIRP-a de referencia). En cambio, los restos de aminoácido específicos de un polipéptido SIRP-a de referencia se describen para identificar las posiciones de aminoácidos correspondientes que se pueden identificar en varios polipéptidos SIRP-a. Por ejemplo, los restos específicos que corresponden a una o más posiciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 296 se pueden identificar para varios polipéptidos SIRP-a humanos, tales como v i y/o v2. Dado que las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 296 y SEQ ID NO: 5 difieren solo en la posición N80 (excepto por una pequeña cantidad de restos del extremo C de la SEQ ID NO: 296 útil para la producción y purificación de proteínas), un experto en la materia entenderá que las referencias en el presente documento a posiciones de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 296 corresponderán a las mismas posiciones en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Las técnicas para determinas los restos de un polipéptido SIRP-a unido por un anticuerpo son conocidas en la técnica; los ejemplos y descripciones no taxativas se proporcionan en el Ejemplo 4.
SEQ ID NO: 296
EEELQVIQPD KSVLVAAGET ATLRCTATSL IPVGPIQWFR GAGPGRELIY NQKEGHFPRV TTVSDLTKRN NMDFSIRIGA ITPADAGTYY CVKFRKGSPD DVEFKSGAGT ELSVRAKPST RHHHHHH
Un anticuerpo de la presente divulgación se une a un polipéptido SIRP-a v i humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas de I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 y K96, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al polipéptido SIRP-a v i humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas de L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 y R95, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un polipéptido SIRP-a v i humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas de I7, P9, D10, K11, S12, A42, A108 y E111, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse al polipéptido SIRP-a v i humano en K11, A42, A108 y E111, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse al polipéptido SIRP-a v i humano en i7, P9, D10, K11, S12, A108 y E111, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse además al polipéptido SIRP-a v i humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas de L14, T26, T28, T88, Y90, S106, S113 y A116, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse además al polipéptido SIRP-a v i humano en L14, T88, Y90, S106, S113 y A116 de SIRP-a v i humano, de acuerdo con la SeQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse además al polipéptido SIRP-a v i humano en L14, T26 y T28, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse a un polipéptido SIRP-a v i humano en una o más de las posiciones de aminoácidos seleccionadas de E47, L48, P58, R59, T82 y A84, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296. El anticuerpo puede unirse al polipéptido SIRP-a v i humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas de A17, P44, G45, W9, E54, G55, H56, F57 y P83, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano con una constante de disociación (Kd ) de menos de 100 nM, menos de 50 nM o menos de 30 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano, y el anticuerpo se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano con una constante de disociación (Kd ) de menos de i00 nM, menos de 50 nM o menos de 30 nM. El anticuerpo puede unirse al dominio Di de un polipéptido SIRP-a v i humano y el dominio Di de un polipéptido SIRP-a v2 humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-y humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede unirse al dominio Di de un polipéptido SIRP-a humano y no bloquea la unión entre un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano. El anticuerpo puede unirse al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a v i humano con una constante de disociación (Kd ) de menos de i00 nM, menos de 50 nM o menos de 30 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un dominio Di de un polipéptido SIRP-a v i humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al dominio Di de un polipéptido SIRP-a v i humano y el dominio Di de un polipéptido SIRP-a v2 humano. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a de mono cynomolgus. El anticuerpo puede unirse a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-p humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a murino.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano con referencia al anticuerpo anti-SIRP-a de referencia. En la técnica se conocen las técnicas para determinar si un anticuerpo compite por la unión del dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo anti-SIRP-a de referencia; los ejemplos y descripciones no taxativas se proporcionan en el Ejemplo 5.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más anticuerpos anti-SIRP-a de referencia seleccionados de i i9 , i20, i2 i, i22, 2 i, 25, 27, 66, y i35. Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más de los siguientes anticuerpos anti-SIRP-a de referencia: (a) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i20 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97, (b) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i2 i y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98, (c) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i30 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i07, (d) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i22 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99, (e) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i35 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i36, (f) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i37 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i38, (g) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i39 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i40, (h) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i4 i y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i42 e (i) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i27 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i04.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más anticuerpos anti-SIRP-a de referencia seleccionados de i36 y i37. Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más de los siguientes anticuerpos anti-SIRP-a de referencia: (a) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i33 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: i34 y (b) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más anticuerpos anti-SIRP-a de referencia seleccionados de 3, 213, 173 y 209. Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más de los siguientes anticuerpos anti-SIRP-a de referencia: (a) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 243; (b) un anticuerpo que comprende dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 275 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 276; (c) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 278 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 279; o (d) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 280 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 281.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más anticuerpos anti-SIRP-a de referencia seleccionados de 115, 116, 117, 118 y 132. Un anticuerpo de la presente divulgación competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más de los siguientes anticuerpos anti-SIRP-a de referencia: (a) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 116 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 93; (b) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94; (c) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 95; (d) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 119 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 96; o (e) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 282 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 283.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más anticuerpos anti-SIRP-a de referencia seleccionados de 218, 123, 149, 161, 162 y 194. Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano con uno o más de los siguientes anticuerpos anti-SIRP-a de referencia: (a) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 284 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 285; (b) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 123 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 100; (c) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 286 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 287; (d) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 288 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 289; (e) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 290; y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 291 o (f) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 292 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 293.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano con referencia al anticuerpo anti-SIRP-a 45 de referencia. Un anticuerpo de la presente divulgación puede competir por la unión al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D1) del polipéptido SIRP-a humano con un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 244 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 245.
La presente divulgación proporciona múltiples familias de anticuerpos anti-SIRP-a y cada familia comprende múltiples anticuerpos. Tal como se demostró en el presente documento, los anticuerpos en una familia dada pueden compartir determinadas propiedades estructurales (por ejemplo, secuencias de HVR o CDR similares o idénticas) así como una o más propiedades funcionales, las que incluyen, pero sin limitación, afinidad de unión a polipéptidos SIRP-a humanos, de mono y/o ratón, afinidad de unión a polipéptidos SIRP-p, afinidad de unión a polipéptidos SIRP-y, modo de unión a SIRP-a (por ejemplo, bloqueo de CD47, no bloqueo de CD47 o unión "de partida"), inducción de fagocitosis (por ejemplo, en un ensayo in vitro), activación de células dendríticas, eficacia antitumoral, restos de epítopo de unión a SIRP-a o "grupo" (por ejemplo, tal como se determinó mediante un ensayo de agrupamiento) y similares (véanse, por ejemplo, las Tablas P-T). Debido a estas propiedades compartidas, se contempla que las secuencias de anticuerpos de HVR y/o VH o VL que pertenecen a la misma familia se pueden intercambiar o entremezclar, de manera que un anticuerpo anti-SIRP-a pueda comprender HVR y/o Vh o VL obtenidas de más de un anticuerpo anti-SlRP-a específico descrito en el presente documento. Tal como se discutió con mayor detalle en el presente documento, en la técnica se conocen varias metodologías para determinar secuencias de HVR o CDR de un dominio variable de anticuerpo y se pueden usar indistintamente en el presente documento, lo que incluye, pero sin limitación, las definiciones de Kabat, Chothia e IMGT, así como combinaciones de estas.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 y 328; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SeQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 y 328; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 y 328; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 y 312; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 y 312;/ una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 y 312. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 y 328; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 y 328; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 y 328. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 y 312; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 y 312; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 y 312. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 y 328; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 y 328; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335 y 328; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 y 312; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 y 312; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 107, 99, 104 y 312.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, y 384; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 y 384; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, y 384; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 y 385; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 y 385; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 y 385. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 y 384; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 y 384; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SeQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 y 384. Un anticuerpo de la presente divulgación comprende una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 y 385; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 y 385; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 y 385. Un anticuerpo de la presente divulgación comprende una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 y 384; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 y 384; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382 y 384; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 y 385; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 y 385; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 y 385.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 y 402; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 y 402; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 y 402; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 y 403; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 y 403; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 y 403. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 y 402; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 y 402; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 y 402. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 y 403; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 y 403; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 y 403. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 y 402; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 y 402; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400 y 402; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 y 403; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 y 403; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las s Eq ID NO: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 y 403.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 y 406; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 283, 405 y 407.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 242; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 242; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 242; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 243; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 243; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 243. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 242; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 242; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 242. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la s Eq ID NO: 243; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 243; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 243. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 242; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 242; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 242; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 243; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 243; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 243.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 278 y 412; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 278 y 412; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 278 y 412; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 279 y 413; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 279 y 413; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 279 y 413. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 278 y 412; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 278 y 412; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 278 y 412. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 279 y 413; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 279 y 413; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 279 y 413. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 278 y 412; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 278 y 412; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 278 y 412; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 279 y 413; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 279 y 413; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 279 y 413.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275 y 414; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275 y 414; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275 y 414; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 276 y 415; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 276 y 415; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 276 y 415. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275 y 414; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275 y 414; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275 y 414. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 276 y 415; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 276 y 415; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 276 y 415. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275 y 414; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275 y 414; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275 y 414; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 276 y 415; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 276 y 415; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 276 y 415.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 280; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 280; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 280; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 281; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 281; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 281. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 280; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 280; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 280. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la s Eq ID NO: 281; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 281; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 281. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 280; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 280; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 280; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 281; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 281; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 281.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123 y 292; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123 y 292; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123 y 292; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100 y 293; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100 y 293; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100 y 293. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123 y 292; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123 y 292; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123 y 292. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100 y 293; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100 y 293; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100 y 293. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123 y 292; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123 y 292; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 123 y 292; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100 y 293; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100 y 293; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100 y 293.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 288, 290, 408 y 410; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 288, 290, 408 y 410; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SeQ ID NO: 288, 290, 408 y 410; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 288, 290, 408 y 410; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 288, 290, 408 y 410; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 288, 290, 408 y 410. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 288, 290, 408 y 410; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 288, 290, 408 y 410; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 288, 290, 408 y 410; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411; y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 289, 291, 409 y 411.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 286; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 286; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 286; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 287; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 287; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 287. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 286; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 286; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 286. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la s Eq ID NO: 287; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 287; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 287. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 286; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 286; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 286; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 287; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 287; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 287.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 284; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 284; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 284; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 285; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 285; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 285. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 284; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 284; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 284. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la s Eq ID NO: 285; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 285; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 285. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 284; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 284; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 284; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 285; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 285; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 285.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 244; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 244; una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 244; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 245; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 245; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 245. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 244; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 244; y una HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 244. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 245; HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 245 y una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 245. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una HVR-H1 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 244; una HVR-H2 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 244; HVR-H3 de una secuencia de dominio VH establecida en la SEQ ID NO: 244; una HVR-L1 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 245; una HVR-L2 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 245; y/o una HVR-L3 de una secuencia de dominio VL establecida en la SEQ ID NO: 245.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 243. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 243. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 244 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 245. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 244 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 245. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 275 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 276. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 275 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 276. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 278 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 279. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 278 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 279. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 280 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 281. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 280 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 281. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 282 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 283. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 282 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 283. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 284 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 285. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 284 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 285. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 286 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 287. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 286 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 287. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 288 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 289. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 288 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 289. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 290 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 291. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 290 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 291. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 292 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 293. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 292 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 293.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 278 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 279. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 278 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 279. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 280 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 281. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 280 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 281. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 275 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 276. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 275 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 276. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 414 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 415. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 414 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 415. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 123 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 100. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 123 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 100. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 292 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 293. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 292 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 293. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 288 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 289. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 288 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 289. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 290 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 291. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 290 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 291. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 286 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 287. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 286 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 287. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 284 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 285, 333 o 334. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 284 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 285, 333 o 334.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de NFAMT (SEQ ID NO: 175), NFAVT (SEQ ID NO: 204) o NFALT (SEQ ID NO: 305), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de TIGSGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 144) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos DSTVSw Sg DFFDY (SEQ iD nO: 145); y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQNv Kn DLA (SEQ ID No : 146), (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos AARIRET (SEQ ID NO: 147) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYy Dw PPFT (SEQ ID nO: 148). El dominio VH puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 120, 246, 258 o 327; y/o el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 97 o 312. El dominio VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 258 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 120 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 327 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 312; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 258 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 312; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 120 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 312; o el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 327 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 312.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de IYAMS (SEQ ID NO: 269), IYAVS (SEQ ID NO: 213) o IYALS (SEQ ID NO: 306), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de TIGADDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 150) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos DSTVGw Sg DFFDY (SEQ iD nO: 151); y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQNVRSDIA (SEQ ID NO: 152), (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos AASSRDT (SEQ ID NO: 153) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148). El dominio VH puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 341, 127, 247, 259 o 328; y/o el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 104 o 248. El dominio VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 341 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 247 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 259 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 328 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 341 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 247 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 259 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248; o el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 328 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende: (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2 DX3 N, en donde X i es S o T; X2 es Y o S; y X3 es M, L o V (SEQ ID NO: 307); (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LISGSGEIX1YYADSVKG, en donde X1 es I o T (SEQ ID NO: 308); y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EX1X2X3YRFFDX4 , en donde X1 es N o D; X2 es N o D; X3 es R o M; y X4 es D o Y (SEQ ID NO: 309); y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende: (i) una secuencia HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RAX1QSVYX2YLA, en donde X1 es S o D; y X2 es T o S (SEQ ID NO: 310); (ii) una secuencia HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1AX2X3 RAX4 , en donde X1 es G, A o D; X2 es S o R; X3 es S, N o T; y X4 es T o A (SEQ ID NO: 311); y (iii) una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQYYDRPPLT (SEQ ID NO: 160). Un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SYDMN (SeQ ID NO: 270), SYDVN (SEQ ID NO: 221) o SYDLN(SEQ ID NO: 313), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LIs Gs GEIIYYADSVkG (s Eq ID NO: 156) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENNRYRFFDD (SEQ ID NO: 157); y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos Ra Sq Sv YTYlA (SEQ ID NO: 158), (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 159) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYYDRPPLT (SEQ ID NO: 160). El dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133, 260, 329 o 249; y/o el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 134, 250, 251, 417, 418 o 419. El dominio VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 329 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 417; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 417; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 329 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 417; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 417; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 418; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 418; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 329 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 418; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 418; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 419; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 419; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 329 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 419; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 419; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 329 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 329 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250; o el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende: (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2AX3 S, en donde X1 es S o T; X2 es N, Y, H o D; y X3 es M, L o V (SEQ ID NO: 297); (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISX1X2X3X4X5X6YYX7X8 SX9 KG, en donde X i es A o S; X2 es G, S o está ausente; X3 es S, D o G; X4 es G o S; X5 es D, S o G; X6 es T o A; X7 es P, G, V, I, A o S; X8 es A, D o G; y X9 es V o M (SEQ ID NO: 298); y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende: (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGX1X2 X3 SX4YYX5 , en donde X1 es D, G, S, I o está ausente; X2 es S, W, G, Y, D o está ausente; X3 es S, Y, T o D; X4 es H, T, S o Y; y X5 es G o A (SEQ ID NO: 299); (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDX1X2 RPX3 , en donde X1 es D o N; X2 es E, K o Q; y X3 es S o P (SEQ ID NO: 300); y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2YDX3X4X5YX6 NX7 , en donde X1 es G o A; X2 es G o A; X3 es G, Y, Q, S o A; X4 es S, R o T; X5 es T o S; X6 es A, I, V, L o T; y X7 es T, A, D o P (SEQ ID NO: 301). En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende: (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SX1AX2 S, en donde X1 es N o Y; y en donde X2 es M, L o V (SEQ ID NO: 302); (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISX1GX2X3 DTYYX4X5 SVKG, en donde X1 es A o S; X2 es G o está ausente; X3 es S o G; X4 es P, G o V; y X5 es A o D (SEQ ID NO: 303); y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); y/o (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende: (i) una secuencia HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SGGX1YSSYYYA, en donde X1 es S o A (SEQ ID NO: 304); (ii) una secuencia HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SDDKRPS (SEQ ID NO: 336); y (iii) una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos GGYDQSsYt NP (SEQ ID NO: 172). En algunas realizaciones, el dominio VH comprende (i) una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SeQ ID NO: 318), (ii) una secuencia HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos GIsAg GSDTYYPASVKG (SEQ ID NO: 195) y (iii) una secuencia HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135, 263, 264 o 330. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende (i) una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SEQ ID NO: 318), (ii) una secuencia HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos GISSGSDTYYGDSVKG (SEQ ID nO: 197) y (iii) una secuencia HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 137, 265, 266 o 331. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende (i) una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200), SYAVS (SEQ ID NO: 272) o SYALS (SEQ ID NO: 319), (ii) una secuencia HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos GISSGGDTYYVDSVKG (SEQ ID NO: 201) y (iii) una secuencia HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139, 267, 268 o 332. En algunas realizaciones, el dominio VL comprende una o más secuencias armazón de IGLV3 humanas. En algunas realizaciones, el dominio VL comprende cuatro secuencias armazón de IGLV3 humanas. En algunas realizaciones, el dominio VL comprende la secuencia FW1—HVR-L1—FW2—HVR-L2—FW3—HVR-L3—FW4 (de extremo N a extremo C), en donde FW1 comprende la secuencia de aminoácidos SYELTQPPSVsVs PGQTARITC (SEQ ID NO: 314), FW2 comprende la secuencia de aminoácidos WYQQKPGQAPVTLIY (SEQ ID NO: 315), FW3 comprende la secuencia de aminoácidos NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC (SEQ ID NO: 316) y FW4 comprende la secuencia de aminoácidos FGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 317). En algunas realizaciones, el dominio VL comprende (i) una secuencia HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO: 170), (ii) una secuencia HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SDDKRPS (SEQ ID NO: 336) y (iii) una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). En algunas realizaciones, el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252. En algunas realizaciones, el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254. En algunas realizaciones, el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416. En algunas realizaciones, el dominio VL comprende (i) una secuencia HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO: 261), (ii) una secuencia HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SDDKRPS (SEQ ID NO: 336) y (iii) una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). En algunas realizaciones, el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 264 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 330 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 265 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 331 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 267 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 268 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 332 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 264 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 330 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 265 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 331 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 267 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 268 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 332 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; o el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 264 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 330 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 265 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 331 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 267 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 268 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 332 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 264 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 330 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 265 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 331 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 267 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 268 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 332 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos
de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y el
dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; el dominio VH comprende la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos
de la SEQ ID NO: 254; el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y el
dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 416; o el dominio VH comprende la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos
de la SEQ ID NO: 262.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia
de aminoácidos de la SEQ ID NO: 120 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEQ ID NO: 97. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 127 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 104. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133 y/o un
dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134. Un anticuerpo de la
presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEQ ID NO: 135 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEQ ID NO: 138. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender el un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141 y/o un
dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142.
El anticuerpo puede comprender (a) una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GFSFSX1X2AMX3 , en donde X1 es N o I; X2 es F o Y; y X3 es T o S (SEQ ID NO: 185); (b) una secuencia
HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de TIGX4X5 DTYYADSVKG, en donde X4 es S o A y X5
es G o D (SEQ ID NO: 186); (c) una secuencia HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSTVX6WSGDFFDY, en donde X6 es S o G (SEQ ID NO: 187 ); (d) una secuencia HVR-L1 que comprende la
secuencia de aminoácidos de RASQNVX7X8 DX9A, en donde X7 es K o R; Xs es N o S; y X9 es L o I (SEQ ID
NO: 188); (e) una secuencia HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de AAX10X11 RX12T, en
donde X10 es R o S; X11 es I o S; y X12 es E o D (SEQ ID NO: 189); y (f) una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias
de HVR con una secuencia de aminoácidos seleccionadas de las SEQ ID NO: 143-148 (por ejemplo, una dos
o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 143-145 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 146-148). Un anticuerpo de la
presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR con una
secuencia de aminoácidos seleccionadas de las SEQ ID NO: 148-153 (por ejemplo, una dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 149-151 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 152, 153 y 148). Un anticuerpo de la
presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR con una
secuencia de aminoácidos seleccionadas de las SEQ ID NO: 155-160 (por ejemplo, una dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 155-157 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 158-160). Un anticuerpo de la
presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR con una
secuencia de aminoácidos seleccionadas de las SEQ ID NO: 161-166 (por ejemplo, una dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 161-163 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 164-166). Un anticuerpo de la
presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR con una
secuencia de aminoácidos seleccionadas de las SEQ ID NO: 161-166 (por ejemplo, una dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 161-163 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio variable indicado en la Tabla 2). Un anticuerpo de la
presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR con una
secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 161, 163, 168 y 170-172 (por ejemplo, una, dos
o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 161, 168 y 163 y/o una, dos
o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 170-172). Un anticuerpo de la
presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR con una
secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 161, 163, 168 y 170-172 (por ejemplo, una, dos
o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 161, 168 y 163 y/o una, dos
o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio variable mostrado en la Tabla 2). Un anticuerpo de
la presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR con una
secuencia de aminoácidos seleccionadas de las SEQ ID NO: 163, 173, 174 y 176-178 (por ejemplo, una dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 163, 173 y 174 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 176-178). Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 162, 163, 179 y 182-184 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 162, 163 y 179 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NO: 182-184). Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 162, 163, 179 y 182-184 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NO: 162, 163 y 179 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de un dominio variable mostrado en la Tabla 2). Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR de las secuencias de dominio variable de las SEQ ID NO: 120 y 97 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de la secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de la secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 97). Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR de las secuencias de dominio variable de las SEQ ID NO: 127 y 104 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de cadena pesada de la secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 127 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de la secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 104). Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de HVR de las secuencias de dominio variable de las SEQ ID NO: 97, 104, 120 y 127 (por ejemplo, una, dos o tres secuencias de HVR de la secuencia de dominio variable de cadena pesada de las SEQ ID NO: 120 y 127 y/o una, dos o tres secuencias de HVR de cadena ligera de la secuencia de dominio variable de cadena ligera de las SEQ ID NO: 97 y 104).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 147 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 150 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 151; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 143 o 149, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 144 o 150, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 145 o 151; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 146 o 152, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 147 o 153, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 155, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 159 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 161, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 162 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 161, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 171 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 172. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 173, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 174 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 176, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 177 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 179, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 162 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 183 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 184.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135; y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137; y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 171 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 172. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139; y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 176, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 177 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 178. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141; y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 183 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 184.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 161, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 162 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 161, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 173, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 174 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID nO: 179, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 162 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135; y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137; y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139; y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141; y/o un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, 170, 176 o 182, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165, 171, 177 o 183, y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166, 172, 178 o 184.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una, dos o tres secuencias de HVR de la SEQ ID NO: 242 y/o (b) un dominio VL que comprende una, dos o tres secuencias de HVR de la SEQ ID NO: 243. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una, dos o tres secuencias de HVR de la SEQ ID NO: 244 y/o (b) un dominio VL que comprende una, dos o tres secuencias de HVR de la SEQ ID NO: 245.
Tal como se describió anteriormente, se conocen en la técnica varias técnicas para delinear regiones hipervariables (HVR) o regiones determinantes de complementariedad (CDR) y se pueden aplicar a las secuencias de dominio variable descritas en el presente documento. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender HVR tal como las definen Chothia, Kabat, IMGT o una combinación de estas (por ejemplo, una o más HVR definidas por una delineación y una o más HVR definidas por una delineación diferente). Las secuencias de HVR de anticuerpos de la presente divulgación delineados con tres delineaciones conocidos (Chothia, Kabat e IMGT) se proporcionan en la Tabla 5. Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, la numeración de los restos de HVR se define conforme a la numeración de Kabat.
Tabla 5. Delinaciones de HVR
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
continuación
Figure imgf000077_0002
continuación
Figure imgf000078_0001
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 HVR enumeradas en la Tabla 5 (por ejemplo, un dominio VL que comprende 1, 2 o 3 HVR de cadena ligera enumeradas en la Tabla 5 y/o un dominio VH que comprende 1, 2 o 3 HVR de cadena pesada enumeradas en la Tabla 5).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 191, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 192 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 193. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 191, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 196 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 193. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 199 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 193. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166 y/o un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 191 o 198, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 192, 196 o 199, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 193. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 233 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 234; y/o un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 230, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 231 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 239, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 240 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 241; y/o un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 219, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 238 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 237.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 194; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 195 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 193. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 194; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 197 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 193. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 200; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 201 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 193. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 166 y/o un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 194, 198 o 200, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 195, 197 o 201, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 193. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 233 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 234; y/o un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 228 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 230. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 239, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 240 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 241; y/o un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 235, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 236 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 237.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 161, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 162 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 161, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 173, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 174 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 202; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 203 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 147 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 211; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 212 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 151; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 219; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 220 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 159 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 204, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 147 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 213, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 150 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 151; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 221, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157; y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 159 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160.
El anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 205; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 206 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 207 y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 208; una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 209 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 210. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 214; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 215 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 216 y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 217; una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 218 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (a) un dominio VH que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 222; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 223 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 224 y/o (b) un dominio VL que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 225; una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 160.
El anticuerpo puede potenciar la fagocitosis mediante un macrófago que expresa un polipéptido SIRP-a humano, potencia la activación de una célula dendrítica que expresa un polipéptido SIRP-a humano, inhibe el crecimiento in vivo de un tumor o células tumorales que expresan CD47, y/o no evita las interacciones entre un linfocito T y una célula que expresa CD47. Ejemplos de ensayos para medir la fagocitosis, activación de células dendríticas, inhibición de crecimiento tumoral e interacciones entre células que expresan CD47 y linfocitos T (por ejemplo, ensayos de adhesión) se describen en el presente documento y se conocen en la técnica.
Producción de anticuerpo y otras propiedades del anticuerpo
Un anticuerpo de la presente divulgación se puede producir mediante cualesquiera medios conocidos en la técnica. A continuación, se describen ejemplos de técnicas para producción de anticuerpos. Sin embargo, estos ejemplos de técnicas tienen fines únicamente ilustrativos y no son limitantes. Además, también se describen ejemplos de propiedades de anticuerpos para usar con los anticuerpos descritos en el presente documento.
Un anticuerpo que se "une" a un antígeno puede tener una constante de disociación (Kd ) por el antígeno que es menor o igual que 1 pM a 25 °C. Un anticuerpo de la presente divulgación puede tener una constante de disociación (Kd ) para polipéptidos SIRP-a v1 y/o v2 humanos que es menor o igual que 1 pM a 25 °C, menor o igual que 500 nM a 25 °C, menor o igual que 400 nM a 25 °C, menor o igual que 300 nM a 25 °C, menor o igual que 250 nM a 25 °C, menor o igual que 200 nM a 25 °C, menor o igual que 200 nM a 25 °C, menor o igual que 100 nM a 25 °C o menor o igual que 50 nM a 25 °C. Un anticuerpo que une un polipéptido SIRP-a humano y uno o más polipéptidos SIRP-a no humanos puede unirse al polipéptido SIRP-a humano con mayor afinidad (por ejemplo, 10 veces o 100 veces mayor) que el polipéptido SIRP-a no humano, aunque se considera igualmente que "une" ambos polipéptidos. Un anticuerpo que une un polipéptido SIRP-a no humano y uno o más polipéptidos SIRP-a humanos puede unirse el polipéptido SIRP-a no humano con mayor afinidad (por ejemplo, 10 veces o 100 veces mayor) que el polipéptido SIRP-a humano, aunque se considera igualmente que "une" ambos polipéptidos. Se conocen en la técnica ensayos para determinar la afinidad de unión e incluyen, pero sin limitación, resonancia de plasmones superficiales (SPR), por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, ensayo de unión a antígenos radiomarcados (RIA), por ejemplo, con una versión Fab de un anticuerpo y su antígeno, y similares. Se describen en el presente documento otros ejemplos de ensayos de unión.
Para preparar un antígeno, es posible purificar el antígeno u obtenerlo de otra forma a partir de una fuente natural o se puede expresar mediante técnicas recombinantes. El antígeno se puede usar como una proteína soluble. El antígeno se puede conjugar con otro polipéptido u otro resto, por ejemplo, para aumentar su inmunogenicidad. Por ejemplo, un antígeno descrito en el presente documento se puede acoplar con una región Fc. Se puede usar una célula que expresa el antígeno en su superficie celular como el antígeno.
Es posible generar anticuerpos policlonales en un animal mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno y un adyuvante. Por ejemplo, se describen en el presente documento descripciones de inmunización de pollos. El antígeno puede conjugarse con una proteína inmunogénica, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de la soja con un agente bifuncional o de derivación. En el presente documento, se proporcionan ejemplos de métodos para inmunización de pollos. Se conocen en la técnica métodos de interés adecuados para una variedad de otros organismos, tales como mamíferos.
Tal como se describió anteriormente, los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante una variedad de métodos. En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal de la presente divulgación se produce con el método de hibridoma que se describió en primer lugar en Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), y se describe adicionalmente en Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); y Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Se describe la tecnología de hibridoma humano (tecnología de Trioma) en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005). Es posible explorar un medio de cultivo en el que crecen células de hibridoma para determinar la presencia de un anticuerpo de interés, por ejemplo, mediante ensayo de unión in vitro, inmunoprecipitación, ELISA, RIA, etc., y es posible determinar la afinidad de unión, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard. Un hibridoma que produce un anticuerpo con propiedades de unión deseadas se puede subclonar y cultivar mediante técnicas de cultivo conocidas, hacer que crezca in vivo como ascitis tumorales en un animal y similares.
Un anticuerpo monoclonal puede producirse con un método de biblioteca, tal como una biblioteca de expresión en fagos. Véase, por ejemplo, Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001). Pueden clonarse repertorios de genes de VH y VL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan de forma aleatoria en bibliotecas de fagos que, luego, se exploran para determinar la presencia de fagos de unión a antígeno, por ejemplo, tal como se describió en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Usualmente, los fagos expresan fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv de cadena simple (scFv) o como fragmentos Fab. De manera alternativa, es posible clonar el repertorio sin inmunización (por ejemplo, humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos a un amplio rango de autoantígenos y xenoantígenos sin inmunización alguna, tal como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, es posible producir bibliotecas sin inmunización en forma sintética mediante la clonación de segmentos de gen V sin reordenamiento de células madre y el uso de cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 muy variables y para lograr el reordenamiento in vitro, tal como lo describieron Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo de pollo. Los anticuerpos de pollo se pueden producir con varias técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6143559, 8592644 y 9380769.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación es un anticuerpo quimérico. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4816567 y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984). Un anticuerpo quimérico puede comprender una región variable no humana (por ejemplo, una región variable obtenida de un pollo, ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. Un anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo con "cambio de clase" en el que se cambió la clase o subclase respecto al anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de estos.
Un anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo humanizado. Se puede humanizar un anticuerpo no humano para reducir la inmunogenicidad en humanos, al tiempo que se mantienen la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR (o partes de estas), por ejemplo, CDR, se derivan de un anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo de pollo) y las FR (o partes de estas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Opcionalmente, un anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una parte de una región constante humana. Algunos restos de FR en un anticuerpo humanizado pueden sustituirse con restos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del cual derivan los restos de HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de un anticuerpo. Los anticuerpos humanizados y los métodos para elaborarlos se resumen, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci.
13:1619-1633 (2008). También se han descrito métodos para humanizar un anticuerpo de pollo, por ejemplo, en el documento WO2005014653.
Las regiones armazón humanas útiles para la humanización incluyen, pero sin limitación: regiones armazón seleccionadas con el método de "mejor ajuste", regiones armazón obtenidas de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada, regiones armazón con mutación somática humana o regiones armazón de línea germinal humana, y regiones armazón obtenidas del análisis de bibliotecas de FR. Véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993); Cárter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993); Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir mediante varias técnicas conocidas en la técnica. El anticuerpo humano puede producirlo un animal no humano, tal como pollos genéticamente modificados (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 8592644 y 9380769) y/o ratones descritos en el presente documento. Los anticuerpos humanos se describen generalmente en Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación es generado por un pollo o se obtiene de este, por ejemplo, mediante los métodos descritos en el presente documento.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un fragmento de anticuerpo que incluye, pero sin limitación, un fragmento Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv o scFv, o un anticuerpo de dominio simple, cadena pesada simple o cadena ligera simple. Los fragmentos de anticuerpo se pueden generar, por ejemplo, mediante digestión enzimática o mediante técnicas recombinantes. Puede utilizarse digestión proteolítica de un anticuerpo intacto para generar un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, tal como se describe en Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985). Una célula hospedadora recombinante puede producir un fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, E. coli expresa fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv y se secretan de esta. De manera alternativa, es posible aislar los fragmentos de anticuerpo de una biblioteca de expresión en fagos.
Alternativamente, es posible recuperar directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplarlos químicamente para formar fragmentos F(ab')2. Véase Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992). También es posible aislar fragmentos F(ab')2 directamente de un cultivo de células hospedadoras recombinantes. Se describen fragmentos Fab y F(ab')2 con mayor semivida in vivo que comprenden restos de epítopo de unión a receptor de tipo silvestre en la patente de Estados Unidos n.° 5869046.
Un anticuerpo puede ser un fragmento de Fv de cadena simple (scFv). Véanse el documento WO 93/16185 y las patentes de Estados Unidos n.° 5 571 894 y 5 587 458. Las proteínas de fusión de scFv se pueden construir para producir una fusión de una proteína efectora en cualquiera de los extremos amino o carboxilo de un scFv. El fragmento de anticuerpo también puede ser un anticuerpo lineal, por ejemplo, tal como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5641 870. Estos anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo multiespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos presentan especificidades de unión por más de un antígeno (por ejemplo, con dos, tres o más especificidades de unión). El anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico puede comprender dos especificidades de unión diferentes por el mismo antígeno (por ejemplo, con epítopo específico del mismo antígeno y/o afinidad de unión diferente). Un anticuerpo biespecífico puede comprender especificidades de unión por dos antígenos diferentes. El anticuerpo biespecífico puede ser un anticuerpo intacto o de longitud completa. El anticuerpo biespecífico puede ser un fragmento de anticuerpo de la presente divulgación.
Se contemplan en el presente documento anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos con una variedad de combinaciones o especificidades de unión. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico tiene una primera especificidad de unión por uno o más polipéptidos SIRP-a tal como se describe en el presente documento. El anticuerpo biespecífico puede tener una segunda especificidad de unión por un antígeno expresado por una célula cancerosa, por ejemplo, en la superficie celular. Ejemplos de dichos antígenos incluyen, pero sin limitación, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, mucina 1, mucina 16, PTK7, PD-L1, STEAP1, receptor de endotelina B, mesotelina, EGFRvlII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nectina 4, NaPi2b, LIV-1A, guanilil ciclasa C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrina aVp3, integrina a5p1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, Ley , EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, una mucina, CAIX, EPHA3, receptor de folato a, GD2, GD3 y un complejo de MHC/péptido que comprende un péptido de NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, una proteína de la familia MAGE, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirosinasa, TRp2, CEA, PSA, TAG-72, receptor de laminina inmaduro, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, pcatenina, TGF-pRII, HPV E6 o HPV E7. Sin limitarse a la teoría, se cree que la combinación de una especificidad de unión tal con una especificidad de unión contra una SIRP-a es particularmente ventajosa, por ejemplo, para dirigir la selección de diana de los leucocitos que expresan FcR a una célula tumoral con la segunda especificidad de unión, al tiempo que se inhibe la capacidad de respuesta de SIRP-a expresada por el leucocito por cualquier CD47 expresada por la célula tumoral con la primera especificidad de unión.
Se conocen en la técnica varios métodos para generar y purificar un anticuerpo biespecífico. Se han descrito múltiples enfoques. El proceso de "botones en ojales" o "protuberancia en cavidad" es un enfoque (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5731 168). Se promueve la heterodimerización de monómeros del dominio Fc mediante la introducción de sustituciones diferentes, pero compatibles, en los dos monómeros del dominio Fc, tales como los pares de restos de "botón en ojal" y los pares de restos de carga. La interacción entre botón y ojal favorece la formación de heterodímeros, mientras que la interacción botónbotón y ojal-ojal obstaculiza la formación de homodímeros debido al choque estérico y la eliminación de interacciones favorables. Un ojal hace referencia a un vacío que se crea cuando un aminoácido original en una proteína se reemplaza con un aminoácido diferente con un volumen menor de cadena lateral. Un botón hace referencia a una protuberancia que se crea cuando un aminoácido original en una proteína se reemplaza con un aminoácido diferente con un volumen mayor de cadena lateral. Por ejemplo, un aminoácido que se reemplaza se encuentra en el dominio constante del anticuerpo CH3 de un monómero del dominio Fc y está involucrado en la dimerización de dos monómeros del dominio Fc. Se puede crear un ojal en un dominio constante de anticuerpo CH3 que se adapta a un botón en otro dominio constante de anticuerpo CH3, de forma tal que los aminoácidos del botón y el ojal actúen para promover o favorecer la heterodimerización de los dos monómeros del dominio Fc. Se puede crear un ojal en un dominio constante de anticuerpo CH3 que se adapte mejor a un aminoácido original en otro dominio constante de anticuerpo CH3. Se puede crear un botón en un dominio constante de anticuerpo CH3 para formar interacciones adicionales con aminoácidos originales en otro dominio constante de anticuerpo CH3.
Se puede construir un ojal mediante el reemplazo de aminoácidos con cadenas laterales más grandes, tales como tirosina o triptófano, por aminoácidos con cadenas laterales más pequeñas, tales como alanina, valina o treonina, por ejemplo, una mutación Y407V en el dominio constante de anticuerpo CH3. De manera similar, se puede construir un botón mediante el reemplazo de aminoácidos con cadenas laterales más pequeñas por aminoácidos con cadenas laterales más grandes, por ejemplo, una mutación T366W en el dominio constante de anticuerpo CH3. Un monómero del dominio Fc puede incluir la mutación de botón T366W y el otro monómero del dominio Fc incluye las mutaciones de ojal T366S, L358A y Y407V. Un polipéptido de la divulgación que incluye una variante de SIRP-a D1 con afinidad alta puede fusionarse con un monómero del dominio Fc que incluye la mutación de botón T366W para limitar la formación de homodímeros botón-botón no deseados. En la Tabla 3 se incluyen, pero sin limitación, ejemplos de pares de aminoácidos de botón en ojal.
Tabla 3. Pares de aminoácidos de botón en ojal.
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Otros enfoques usan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo y antígeno) fusionadas a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina, por ejemplo, con un dominio constante de cadena de inmunoglobulina, lo que comprende al menos parte de la bisagra y las regiones CH2 y CH3. El anticuerpo biespecífico puede tener una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un grupo y un par de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (lo que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro grupo. Véase el documento WO 94/04690. Otro enfoque usa reticulación (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.676.980) para producir un anticuerpo heteroconjugado. Es posible preparar anticuerpos biespecíficos con enlaces químicos (véase, por ejemplo, Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)) para la escisión proteolítica de un anticuerpo intacto en fragmentos F(ab')2 que se reducen en presencia de un agente de formación de complejos de ditiol y se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB), uno de los cuales se reconvierte en Fab'-tiol mediante reducción y se mezcla con el otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los fragmentos Fab'-SH pueden acoplarse químicamente. Se pueden producir fragmentos de anticuerpo biespecífico en cultivo celular con cremalleras de leucina, tal como en Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Se puede encontrar información sobre otros formatos de anticuerpo biespecífico, por ejemplo, en Spiess, C. et al. (2015) Mol. Immunol. 67:95-106.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un diacuerpo. Véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). En un diacuerpo, los dominios Vh y Vl de un fragmento se aparean con dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento y así forman dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo de dominio simple. Un anticuerpo de dominio simple hace referencia a una cadena polipeptídica simple que comprende la totalidad o una parte del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. Un anticuerpo de dominio simple puede ser un anticuerpo de dominio simple humano (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6 248 516 B1). En una modalidad, un anticuerpo de dominio simple incluye la totalidad o una parte del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo. También se conocen anticuerpos camélidos.
Los anticuerpos se pueden producir mediante métodos recombinantes. Se aísla el ácido nucleico que codifica el anticuerpo y se inserta en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o expresión adicional para la producción recombinante de un anticuerpo antiantigénico. Es posible aislar fácilmente ADN que codifica el anticuerpo y secuenciarlo mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Se encuentran disponibles múltiples vectores. En general, los componentes vectoriales incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción.
Un anticuerpo de la presente divulgación se puede producir de forma recombinante como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, una secuencia señal u otro polipéptido con un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada puede ser una que la célula hospedadora reconoce y procesa (por ejemplo, con escisión por un péptido señal). En el caso de células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan una secuencia señal de anticuerpo de origen natural, se sustituye la secuencia señal con una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes de enterotoxina II estables al calor. En el caso de secreción de levadura, la secuencia señal nativa se puede sustituir, por ejemplo, con el líder de invertasa de levadura, un líder de factor (lo que incluye líderes de factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces) o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans, etc. En la expresión de células de mamífero, se encuentran disponibles tanto secuencias señal de mamífero como líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.
Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que hace posible la replicación del vector en una o más células hospedadoras, por ejemplo, para permitir la replicación del vector de forma independiente del ADN cromosómico del hospedador. Esta secuencia puede incluir orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Se conocen dichas secuencias para una variedad de bacterias, levadura y virus. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (es posible usar el origen de SV40 porque contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección o marcador de selección. Los genes de selección usuales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos. Ejemplos de selección dominante emplean los fármacos neomicina, ácido micofenicólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores de selección adecuados para células de mamíferos son los que hacen posible la identificación de células competentes para la absorción de ácido nucleico que codifica anticuerpo, tal como DHFR, glutamina sintetasa (GS), timidina cinasa, metalotioneína I y II, preferentemente, genes de metalotioneína de primate, desaminasa de adenosina, decarboxilasa de ornitina, etc. Por ejemplo, se identifica una línea de células de ovario de hámster chino (CHO) con deficiencia de actividad de DHFR endógena transformada con el gen de DHFR mediante el cultivo de los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR.
De manera alternativa, es posible seleccionar células hospedadoras (particularmente, hospedadores de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de interés, gen de DHFR de tipo silvestre y otro marcador de selección, tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), mediante crecimiento celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador de selección, tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418.
En general, los vectores de expresión y clonación contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y que se enlaza de forma operativa al ácido nucleico que codifica un anticuerpo. Los promotores adecuados para su uso con hospedadores procariotas incluyen el promotor phoA, sistemas promotores de lactosa y p-lactamasa, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Los promotores de levadura se conocen en la técnica y pueden incluir promotores/potenciadores inducibles regulados por condiciones de crecimiento. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 a 30 bases antes del sitio en el que se inicia la transcripción. Ejemplos incluyen, pero sin limitación, los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosa fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Es posible controlar la transcripción de anticuerpos de vectores en células hospedadoras de mamíferos, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de los genomas de virus. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma conveniente como un fragmento de restricción HindIII E. De manera alternativa, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous se puede usar como el promotor.
La transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo de la presente invención por eucariotas mayores puede aumentar a menudo al insertar una secuencia potenciadora en el vector. En la actualidad, se conocen varias secuencias potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Usualmente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariota.
Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para terminar la transcripción y para estabilizar el ARNm.
Las células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente son las células procariotas, de levaduras o eucariotas superiores anteriormente descritas. Los procariotas adecuados para este fin incluyen eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, etc. Además de los procariotas, microorganismos eucariotas tales como levaduras u hongos filamentosos son hospedadores de expresión o clonación adecuados para vectores que codifican anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común, es la más comúnmente utilizada entre microorganismos hospedadores eucariotas inferiores. Es posible seleccionar determinadas cepas de levaduras y hongos en las que se humanizaron las vías de glucosilación, lo que resulta en la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase, por ejemplo, Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
También es posible utilizar cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, soja, petunia, tomate, lentejas de agua (Leninaceae), alfalfa (M. truncatula) y tabaco como hospedadores.
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado diversas cepas y variantes baculovirales y células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes de hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori.
Es posible usar células de vertebrados como hospedadores y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles son la línea cV l de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionaria humana (células 293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñones de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70), células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587), células de cáncer de cuello uterino humanas (HELA, ATCC CCL 2), células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34), células de hígado de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75), células de hígado humano (Hep G2, HB 8065), tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y una línea de hepatoma humana (Hep G2). Otras líneas de células hospedadoras de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), las que incluyen células c Ho DHFR-(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) y líneas celulares de mieloma tales como NS0 y Sp2/0. Véase una reseña de determinadas líneas de células hospedadoras de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, por ejemplo, en Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Tomo 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), págs. 255-268.
Es posible cultivar las células hospedadoras de la presente divulgación en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado con Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para el cultivo de células hospedadoras. Además, se puede usar cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth Enz, 58:44 (1979), Barnes et al., Anal Biochem, 102:255 (1980), las patentes de Estados Unidos n.° 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 o 5 122 469, las solicitudes de patente internacional n.° WO 90/03430 o WO 87/00195, o la reemisión de patente estadounidense n.° 30985 como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario también se puede incluir a concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con la célula hospedadora seleccionada para expresión y serán evidentes para alguien con experiencia en la técnica.
Al emplear técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir en forma intracelular en el espacio periplasmático o secretar directamente al medio. Si el anticuerpo se produce de forma intracelular, como una primera etapa, se retiran los restos particulados, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugado o ultrafiltración. Carte et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992), describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplasmático de E. coli.
La composición de anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar, por ejemplo, con cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrofóbica, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, y esta última es una de las etapas de purificación usualmente preferidas.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 325, 326 o 426. Se proporcionan ejemplos no limitantes de secuencias de región constante de cadena ligera en la Tabla 6. Un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una región constante de cadena ligera lambda IGLC3 o una región constante IGLC7.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación incluye una región Fc. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc humana, por ejemplo, IgG1, IgG2 o IgG4 y subtipos de estas. Se proporcionan ejemplos no limitantes de regiones Fc en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 320-324 en la Tabla 6. En algunas realizaciones, una región Fc en una o más de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 320-324 comprende una o más de las mutaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, más adelante.
Tabla 6. Ejemplos de secuencias de región constante.
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En algunas realizaciones, la región Fc incluye una o más mutaciones que influyen en una o más propiedades del anticuerpo, tales como estabilidad, patrón de glucosilación u otras modificaciones, función de células efectoras, farmacocinética y más. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación tiene glucosilación reducida o mínima. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación tiene función efectora reducida o se la elimina. Ejemplos de mutaciones de Fc incluyen, pero sin limitación, (i) mutaciones de una región Fc de IgG1 humana L234A, L235A, G237A y N297A; (ii) mutaciones de una región Fc de IgG2 humana A330S, P331S y N297A; y (iii) mutaciones de una región Fc de IgG4 humana S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 y n297A (numeración EU). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG2 humana comprende las mutaciones A330S y P331S. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 humana comprende una mutación S288P. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 humana comprende las mutaciones S288P y L235E.
Los anticuerpos dirigidos a antígenos de la superficie celular pueden desencadenar funciones inmunoestimuladoras y efectoras asociadas a la unión al receptor de Fc (FcR) en las células inmunitarias. Existen múltiples receptores de Fc que son específicos para clases particulares de anticuerpos, los que incluyen IgG (receptores gamma), IgE (receptores eta), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión de la región Fc a receptores de Fc en las superficies celulares puede desencadenar múltiples respuestas biológicas que incluyen la fagocitosis de partículas recubiertas con anticuerpo (fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos o ADCP), la depuración de complejos inmunitarios, la lisis de células recubiertas con anticuerpo por parte de linfocitos citolíticos (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos o ADCC) y la liberación de mediadores inflamatorios, la transferencia de placenta y el control de la producción de inmunoglobulina. De manera adicional, la unión del componente C1 del complemento a anticuerpos puede activar el sistema del complemento. La activación del complemento puede ser importante para la lisis de patógenos celulares. Sin embargo, la activación del complemento también puede estimular la respuesta inflamatoria y también puede estar involucrada en la hipersensibilidad autoinmunitaria u otros trastornos inmunológicos. Las regiones Fc variantes con una capacidad reducida o eliminada de unión a determinados receptores de Fc son útiles para desarrollar anticuerpos terapéuticos y construcciones de polipéptidos de fusión a Fc que actúen mediante la selección como diana, la activación o la neutralización de funciones de los ligandos, al tiempo que no dañan o destruyen células o tejidos locales.
Un monómero del dominio Fc puede hacer referencia a una cadena de polipéptido que incluye un segundo y un tercer dominios constantes de anticuerpo (por ejemplo, CH2 y CH3). Un monómero del dominio Fc también puede incluir un dominio bisagra. El monómero del dominio Fc puede ser de cualquier isotipo de anticuerpo de inmunoglobulina, que incluye IgG, IgE, IgM, IgA e IgD. De manera adicional, un monómero del dominio Fc puede ser de cualquier subtipo de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3 e IgG4). Los monómeros del dominio Fc pueden incluir hasta diez cambios con respecto a una secuencia de monómero del dominio Fc de tipo silvestre (por ejemplo, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 sustituciones, adiciones o inserciones, eliminaciones de aminoácidos o combinaciones de estas) que alteran la interacción entre un dominio Fc y un receptor de Fc.
Un monómero del dominio Fc de una inmunoglobulina o un fragmento de un monómero del dominio Fc puede ser capaz de formar un dominio Fc con otro monómero del dominio Fc. Un monómero del dominio Fc de una inmunoglobulina o un fragmento de un monómero del dominio Fc puede no ser capaz de formar un dominio Fc con otro monómero del dominio Fc. Un monómero del dominio Fc o un fragmento de un dominio Fc puede fusionarse con un polipéptido de la divulgación para aumentar la semivida en suero del polipéptido. Un monómero del dominio Fc o un fragmento de un monómero del dominio Fc puede fusionarse a un polipéptido de la divulgación se dimeriza con un segundo monómero del dominio Fc para formar un dominio Fc que se une a un receptor de Fc o, de manera alternativa, un monómero del dominio Fc se une a un receptor de Fc. Un dominio Fc o un fragmento del dominio Fc puede fusionarse a un polipéptido para aumentar la semivida en suero del polipéptido no induce ninguna respuesta relacionada con el sistema inmunitario. Un dominio Fc incluye dos monómeros del dominio Fc que se dimerizan mediante la interacción entre los dominios constantes de anticuerpo CH3.
Un dominio Fc de tipo silvestre forma la estructura mínima que se une a un receptor de Fc, por ejemplo, FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa, FcYRIIIb y FcyRIV. El dominio Fc en un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una o más sustituciones, adiciones o inserciones, eliminaciones de aminoácidos o cualesquiera combinaciones de estas que llevan a una disminución de la función efectora, tal como una disminución de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), una disminución de la citólisis dependiente del complemento (CDC), una disminución de la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) o cualesquiera combinaciones de estas. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente divulgación puede presentar unión reducida (por ejemplo, unión mínima o ausencia de unión) a un receptor de Fc humano y unión reducida (por ejemplo, unión mínima o ausencia de unión) a la proteína de complemento C1q; unión reducida (por ejemplo, unión mínima o ausencia de unión) a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIB, FcyRIIIB humanas o cualesquiera combinaciones de estas, y C1q; función efectora dependiente de anticuerpo alterada o reducida, tal como ADCC, CDC, ADCP o cualesquiera combinaciones de estas, entre otras cosas. Ejemplos de mutaciones incluyen, pero sin limitación, una o más sustituciones de aminoácidos en E233, L234, L235, G236, G237, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 o P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede tener unión reducida o eliminada a receptores de Fcy CD16a, CD32a, CD32b, CD32c y CD64. Un anticuerpo con una región Fc no natural descrito en el presente documento puede exhibir una reducción de al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de unión a C1q en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc de tipo silvestre. Un anticuerpo con una región Fc no natural tal como se describe en el presente documento puede presentar una reducción de al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de CDC en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, las variantes de Fc en el presente documento experimentan una glucosilación mínima o tienen una glucosilación reducida con respecto a una secuencia de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la desglucosilación se logra con una mutación de N297A o mediante la mutación de N297 a cualquier aminoácido que no sea N.
Las variantes de las regiones constantes de IgG del anticuerpo (por ejemplo, variantes de Fc) poseen una capacidad reducida para unirse específicamente a receptores de Fcy o tienen una capacidad reducida para inducir la fagocitosis. Las variantes de las regiones constantes de IgG del anticuerpo (por ejemplo, variantes de Fc) pueden poseer una capacidad reducida para unirse específicamente a receptores de Fcy y tienen una capacidad reducida para inducir la fagocitosis. Por ejemplo, un dominio Fc puede someterse a una mutación para que carezca de funciones efectoras, lo cual es típico de un dominio Fc "muerto". Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dominio Fc incluye sustituciones de aminoácidos específicas que se sabe que minimizan la interacción entre el dominio Fc y un receptor de Fcy. En algunas realizaciones, un monómero del dominio Fc proviene de un anticuerpo IgG1 e incluye una o más de las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A, G237A y N297A (conforme a la designación de acuerdo con el sistema de numeración EU según Kabat et al., 1991). Una o más mutaciones adicionales en esa variante de Fc de IgG1. Los ejemplos no limitantes de esas mutaciones adicionales para variantes de Fc de IgG1 humana incluyen E318A y K322A. En algunos casos, una variante de Fc de IgG1 humana tiene hasta 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 mutaciones en total o menos en comparación con la secuencia de IgG1 humana de tipo silvestre. Pueden incluirse una o más eliminaciones adicionales en esa variante de Fc de IgG1. Por ejemplo, puede eliminarse la lisina de extremo C de la región constante de cadena pesada de IgG1 de Fc, por ejemplo, para aumentar la homogeneidad del polipéptido cuando se produce en células bacterianas o de mamíferos. En algunos casos, una variante de Fc de IgG1 humana tiene hasta 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 eliminaciones en total o menos en comparación con la secuencia de IgG1 humana de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, un monómero del dominio Fc proviene de un anticuerpo IgG2 e incluye las sustituciones de aminoácidos A330S, P331S, o tanto A330S como P331S. Las posiciones de aminoácidos mencionadas anteriormente se definen de acuerdo con Kabat et al. (1991). Es posible determinar la numeración de Kabat de los restos de aminoácidos para un anticuerpo determinado mediante el alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia con numeración de Kabat "estándar". En algunas realizaciones, la variante de Fc comprende una secuencia de Fc de IgG2 humana que comprende una o más de las sustituciones de aminoácidos A330S, P331S y N297A (conforme a la designación de acuerdo con el sistema de numeración EU según Kabat et al. (1991). Pueden incluirse una o más mutaciones adicionales en esas variantes de Fc de IgG2. Ejemplos no limitantes de esas mutaciones adicionales para la variante de Fc de IgG2 humana incluyen V234A, G237A, P238S, V309L y H268A (conforme a la designación de acuerdo con el sistema de numeración EU según Kabat et al. 1991). En algunos casos, una variante de Fc de IgG2 humana tiene hasta 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o menos mutaciones en total en comparación con la secuencia de IgG2 humana de tipo silvestre. Pueden incluirse una o más eliminaciones adicionales en dicha variante de Fc de IgG2.
Cuando la variante de Fc es una variante de Fc de IgG4, en algunas realizaciones, dicha variante de Fc comprende una mutación S228P, E233P, F234V, L235A, L235E o delG236 (conforme a la designación de acuerdo con Kabat et al. 1991). En algunos casos, una variante de Fc de IgG4 humana tiene hasta 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mutación en total en comparación con la secuencia de IgG4 humana de tipo silvestre.
La variante de Fc puede presentar unión reducida a un receptor de Fc del sujeto en comparación con la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. La variante de Fc puede presentar unión eliminada a un receptor de Fc del sujeto en comparación con la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. La variante de Fc puede presentar una reducción de la fagocitosis en comparación con la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. La variante de Fc puede presentar una eliminación de fagocitosis en comparación con la región Fc de IgG humana de tipo silvestre.
La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, a la que también se hace referencia en el presente documento como ADCC, hace referencia a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig secretada se une a receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK) y neutrófilos), lo cual permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana con antígenos y, posteriormente, destruyan la célula diana. La fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos, a la que también se hace referencia en el presente documento como ADCP, hace referencia a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig secretada se une a receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células fagocíticas (por ejemplo, macrófagos), lo cual permite que estas células efectoras fagocíticas se unan específicamente a una célula diana con antígenos y, posteriormente, envuelvan y digieran la célula diana. Los anticuerpos de IgG con afinidad elevada específicos para ligandos dirigidos a la superficie de células diana pueden estimular las células citotóxicas o fagocíticas y se pueden usar para dicha destrucción. Las construcciones de polipéptidos que comprenden una variante de Fc tal como se describe en el presente documento presentan una ADCC o ADCP reducida en comparación con una construcción de polipéptidos que comprende una región Fc de tipo silvestre. Las construcciones de polipéptidos que comprenden una variante de Fc tal como se describe en el presente documento pueden presentar una reducción de al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la ADCC o ADCP en comparación con una construcción de polipéptido que comprende una región Fc de tipo silvestre. Los anticuerpos que comprenden una variante de Fc tal como se describe en el presente documento pueden presentar ausencia de ADCC o ADCP en comparación con una construcción de polipéptido que comprende una región Fc de tipo silvestre.
La citotoxicidad dirigida por el complemento, a la que también se hace referencia en el presente documento como CDC, hace referencia a una forma de citotoxicidad en la cual la cascada del complemento se activa mediante la unión del componente del complemento C1q al Fc del anticuerpo. Las construcciones de polipéptidos que comprenden una variante de Fc tal como se describe en el presente documento pueden presentar una reducción de al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la unión a C1q en comparación con una construcción de polipéptido que comprende una región Fc de tipo silvestre. En algunos casos, las construcciones de polipéptidos que comprenden una variante de Fc tal como se describe en el presente documento presentan una CDC reducida en comparación con una construcción de polipéptidos que comprende una región Fc de tipo silvestre. Las construcciones de polipéptidos que comprenden una variante de Fc tal como se describe en el presente documento pueden presentar una reducción de al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la CDC en comparación con una construcción de polipéptido que comprende una región Fc de tipo silvestre. En algunos casos, los anticuerpos que comprenden una variante de Fc tal como se describe en el presente documento presentan una CDC insignificante en comparación con una construcción de polipéptidos que comprende una región Fc de tipo silvestre.
Las variantes de Fc en el presente documento incluyen aquellas que presentan una unión reducida a un receptor de Fcy en comparación con la región Fc de IgG humana de tipo silvestre. Por ejemplo, una variante de Fc puede presentar una unión a un receptor de Fcy que es menor que la unión presentada por una región Fc de IgG humana de tipo silvestre a un receptor de Fcy. En algunos casos, una variante de Fc tiene una unión reducida a un receptor de Fcy en un factor de 10 %, 20 % 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % (función efectora completamente eliminada). La unión reducida puede ser de uno o más receptores Fcy cualesquiera, por ejemplo, CD16a, CD32a, CD32b, CD32c o CD64. En algunos casos, las variantes de Fc que se describen en el presente documento presentan una reducción de la fagocitosis en comparación con su región Fc de IgG humana de tipo silvestre. Esas variantes de Fc presentan una reducción de la fagocitosis en comparación con su región Fc de IgG humana de tipo silvestre, en donde la reducción de la actividad de fagocitosis tiene lugar, por ejemplo, en un factor del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En algunos casos, una variante de Fc presenta ausencia de fagocitosis en comparación con su región Fc de IgG humana de tipo silvestre.
Las variantes de Fc divulgadas en el presente documento pueden acoplarse a uno o más compañeros de fusión. En algunos casos, el compañero de fusión es una fracción terapéutica, tal como un agente citotóxico de la presente divulgación. En algunos casos, el compañero de fusión se selecciona para permitir el direccionamiento de una proteína expresada, la purificación, la exploración, la presentación y similares. El compañero de fusión también puede afectar el grado de unión a receptores de Fc o el grado de reducción de la fagocitosis.
Los compañeros de fusión pueden enlazarse a la secuencia variante de Fc a través de una secuencia enlazadora. La secuencia enlazadora comprende generalmente una pequeña cantidad de aminoácidos, tal como menos de diez aminoácidos, si bien también se utilizan enlazadores más largos. En algunos casos, el enlazador tiene una longitud de menos de 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos o menos. En algunos casos, el enlazador tiene una longitud de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 o 35 aminoácidos o más. Opcionalmente, se emplea un enlazador escindible.
Un compañero de fusión es una secuencia señal o de direccionamiento que dirige una proteína variante de Fc y todo compañero de fusión asociado a una ubicación celular deseada o a los medios extracelulares. Determinadas secuencias de señalización se dirigen a una proteína para que se secrete en los medios de cultivo, o en el espacio periplasmático, ubicado entre las membranas interna y externa de la célula. En algunas realizaciones, un compañero de fusión es una secuencia que codifica un péptido o una proteína que permite la purificación o filtración. Esos compañeros de fusión incluyen, pero sin limitación, etiquetas de polihistidina (etiquetas de His) (por ejemplo, His6 e His10) u otros marcadores para usar con sistemas de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) (por ejemplo, columnas de afinidad Ni+2), fusiones de GST, fusiones de MBP, marcador Strep, la secuencia diana de biotinilación de BSP de la enzima bacteriana BirA y marcadores de epítopos a las que se dirigen los anticuerpos (por ejemplo, marcadores cmyc, marcadores flag y similares).
Dichos marcadores pueden ser útiles para la purificación, la determinación o ambas. Por ejemplo, una variante de Fc puede purificarse mediante el uso de una etiqueta His al inmovilizarla en una columna de afinidad Ni+2 y luego, después de la purificación, la misma etiqueta His se usa para inmovilizar el anticuerpo en una placa recubierta con Ni+2 para realizar un ensayo ELISA u otro ensayo de unión.
Se encuentran disponibles diversos compañeros de fusión que permiten una variedad de métodos de selección. Por ejemplo, al fusionar los miembros de una biblioteca de variantes de Fc a la proteína del gen III, se puede emplear la expresión en fagos. Los compañeros de fusión pueden permitir que se marquen las variantes de Fc. De manera alternativa, un compañero de fusión puede unirse a una secuencia específica en el vector de expresión, lo cual permite que el compañero de fusión y la variante de Fc asociada se enlacen de manera covalente o no covalente con el ácido nucleico que los codifica.
Cuando un compañero de fusión es una fracción terapéutica, la fracción terapéutica puede ser, por ejemplo, un agente citotóxico, un péptido, una proteína, un anticuerpo, un ARNip o una molécula pequeña.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede estar unido a diversos transportadores o marcadores y se usa para detectar la presencia de células con expresión de antígenos específicos. Los ejemplos de transportadores incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del transportador puede ser soluble o insoluble. Se conocen diversas marcadores diferentes y métodos de marcado. Los ejemplos de marcadores incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuesto quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Se encuentran disponibles diversas técnicas para la unión de marcadores a anticuerpos divulgados en el presente documento. Los anticuerpos pueden acoplarse a haptenos de peso molecular bajo. Luego, estos haptenos se detectan de manera específica por medio de una segunda reacción. Por ejemplo, el hapteno biotina puede utilizarse con avidina o los haptenos dinitrofenol, piridoxal o fluoresceína se detectan con anticuerpos antihaptenos específicos (por ejemplo, anticuerpos antidinitrofenol, anticuerpos antipiridoxal y anticuerpos antifluoresceína, respectivamente). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden utilizarse in vitro para ensayos de unión, tales como ensayos inmunitarios. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse en fase líquida o se unen a un transportador de fase sólida. Los anticuerpos utilizados para inmunoensayos pueden marcarse de manera detectable de diversas maneras.
Métodos para identificar y/o generar anticuerpos
Determinados aspectos de la presente divulgación hacen referencia a métodos para identificar un dominio de unión a antígeno que se une a un dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a. De manera ventajosa, es posible usar los métodos descritos en el presente documento para identificar dominios de unión a antígeno que bloquean la unión entre CD47 humana y un polipéptido SIRP-a humano, no bloquean la unión entre c D47 humana y un polipéptido SIRP-a humano, o reducen la afinidad de un polipéptido SIRP-a humano por CD47 humana.
Los métodos pueden incluir proporcionar un dominio de unión a antígeno que se une al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano. Ejemplos de dominios de unión a antígeno y anticuerpos que se unen al dominio extracelular (por ejemplo, el dominio D i) de un polipéptido SIRP-a humano y/u otros polipéptidos SIRP se describen en el presente documento, al igual que ejemplos de métodos para identificar dichos anticuerpos/dominios de unión a antígeno. Se describen de forma más detallada ejemplos de métodos en los ejemplos que se encuentran más adelante.
Los métodos pueden incluir la formación de un complejo que comprende una variante de SIRP-a Di unida a un polipéptido que comprende un dominio IgSF de CD47. La "formación" del complejo puede incluir proporcionar una solución que contiene tanto una variante de SIRP-a Di como un polipéptido que comprende un dominio IgSF de CD47. La variante de SIRP-a Di puede ser una variante de origen no natural, por ejemplo, que se une a CD47 humana con una afinidad que es al menos i0 veces al menos i00 veces o al menos i00 veces mayor que la afinidad de unión de un dominio Di de SIRP-a de origen natural con CD47 humana. De manera ventajosa, esto facilita el análisis para determinar la presencia de un anticuerpo, dado que una interacción SIRP-a:CD47 natural puede ser demasiado débil para su uso en ensayos de unión y determinación. Ejemplos de variantes se describen de forma más detallada más adelante.
Los métodos pueden incluir el contacto del dominio de unión a antígeno con el complejo formado. Se puede detectar la unión, o un ausencia o deficiencia de esta, del dominio de unión a antígeno al complejo. Se describen en el presente documento varias técnicas de detección. Se puede utilizar SPR o ELISA. La unión detectable del dominio de unión a antígeno al complejo indica que el dominio de unión a antígeno no bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. Una ausencia de unión detectable del dominio de unión a antígeno al complejo indica que el dominio de unión a antígeno bloquea la unión entre CD47 humana y el polipéptido SIRP-a humano. Además, se usa SPR para distinguir anticuerpos bloqueadores, no bloqueadores y de partida. Por ejemplo, un anticuerpo no de bloqueo puede aumentar las UR cuando se inyecta en la parte superior del complejo SIRPa:CD47 previamente formado, un anticuerpo de partida puede aumentar la Koff de un complejo SIRPa:CD47 previamente formado y el anticuerpo bloqueador puede no cambiar las UR o la Koff de un complejo SIRPa:CD47 previamente formado.
El dominio IgSF de CD47 puede ser un dominio IgSF humano. El polipéptido que comprende el dominio IgSF de CD47 puede comprender un dominio extracelular de CD47 humana. El dominio IgSF de CD47 puede comprender la secuencia de aminoácidos QLLFNKTKSVEFTFSNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLL KGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS (SEQ ID NO: i6). El polipéptido que comprende el dominio IgSF de CD47 puede conjugarse con otro polipéptido u otro resto, por ejemplo, una región Fc de Ig.
Variantes de dominios D1 de SIRP-a de afinidad alta
Se contempla la posibilidad de uso de múltiples variantes Di de SIRP-a de afinidad elevada en el presente documento. Por ejemplo, la variante de SIRP-a Di puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: i7-52 (véase la Tabla 4). A continuación, se encuentran descripciones adicionales de las variantes Di de SIRP-a.
Tabla 4. Ejemplos de secuencias de aminoácidos de variante de SIRP-a Di.
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9 i
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continuación
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Un polipéptido de la variante de SIRP-a D1 o fragmento de este puede unirse a CD47 con una Kd menor de 1 x 10-8 M, menor de 5 x 10-9 M, menor de 1 x 10-9 M, menor de 5 x 10-10 M, menor de 1 x 10-10 M o menor de 1 x 10'11 M. Un polipéptido de la variante de SIRP-a D1 o fragmento de este puede unirse a CD47 con una Kd de entre aproximadamente 500 nM y 100 nM, entre aproximadamente 100 nM y 50 nM, entre aproximadamente 50 nM y 10 nM, entre aproximadamente 10 nM y 5 nM, entre aproximadamente 5 nM y 1 nM, entre aproximadamente 1 nM y 500 pM, entre aproximadamente 500 pM y 100 pM, entre aproximadamente 100 pM y 50 pM o entre aproximadamente 50 pM y 10 pM.
Los fragmentos pueden incluir polipéptidos de menos de 10 aminoácidos de longitud, aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, o más de 100 aminoácidos de longitud. Los fragmentos conservan la capacidad de unión a CD47. Preferentemente, los polipéptidos de variante de SIRP-a D1 y fragmentos de estos se unen a CD47 con una afinidad más elevada que aquella con la que un polipéptido SIRP-a se une a CD47.
Los polipéptidos de la variante de SIRP-a D1 mencionados anteriormente pueden unirse o fusionarse con un segundo polipéptido. El segundo polipéptido puede incluir, pero sin limitación, un polipéptido de Fc, una variante de Fc, un polipéptido de HSA, un péptido de albúmina, un polímero de PEG o un fragmento de los anteriores.
El polipéptido puede incluir un dominio D1 de SIRP-a de afinidad elevada que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia) con respecto a cualquier variante proporcionada en la Tabla 4.
Generación de anticuerpos en pollos
Determinados aspectos de la presente divulgación hacen referencia a métodos para producir un anticuerpo anti-SIRP-a que se une a los dominios extracelulares (por ejemplo, los dominios D1) de dos o más polipéptidos variantes de SIRP-a humanos. Sin limitarse a la teoría, se cree que el uso de pollos es particularmente ventajoso debido a la mayor diversidad entre SIRP-a de pollo y SlRP-a de mamífero (por ejemplo, humano, mono, ratón, etc.). Además, la distancia filogenética entre pollos y mamíferos hace posible identificar anticuerpos con reacción cruzada, por ejemplo, con polipéptidos SIRP-a humanos o de ratón, lo que puede ser difícil de lograr mediante la producción de anticuerpos en ratones debido a autotolerancia.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen la inmunización de un pollo con un péptido que comprende al menos una parte de un dominio extracelular SIRP-a humano (por ejemplo, el dominio D1). Más adelante se describe un ejemplo de cronograma de inmunización. Se describen métodos de inmunización de pollos, por ejemplo, en Mette Izquierdo, S. et al. (2016) Microscopy (Oxf) 1-16. En algunas realizaciones, el método incluye obtener un anticuerpo de una célula productora de anticuerpos del pollo inmunizado.
Los métodos pueden incluir detectar la unión entre el anticuerpo obtenido a partir de la célula y los dominios extracelulares (por ejemplo, el dominio D1) de dos o más polipéptidos variantes de SIRP-a humanos diferentes. Por ejemplo, se usan SIRP-a v i y v2 humana, por ejemplo, tal como se describió en el presente documento. Ejemplos de técnicas de detección se describen en el presente documento e incluyen, pero sin limitación, el ensayo de GEM (véase, por ejemplo, el documento WO2009111014 y Mettler Izquierdo, S. et al. (2016) Microscopy (Oxf) 1-16), SPR y ELISA.
Métodos de tratamiento
Determinados aspectos de la presente divulgación hacen referencia al tratamiento de una enfermedad o trastorno con un anticuerpo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la enfermedad es cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria.
Por ejemplo, se describe en el presente documento un anticuerpo de la presente divulgación para su uso en los métodos para el tratamiento o el retraso de la progresión del cáncer en un individuo mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo. Sin limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, mediante la eliminación de la capacidad del cáncer para inhibir la fagocitosis y la supervisión inmunitaria a través del eje de señalización CD47:SIRP-a o mediante la activación del sistema inmunitario por otro medio (tal como mediante la activación de células dendríticas).
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se administra en combinación con un agente quimioterapéutico.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se administra en combinación con un segundo anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un antígeno expresado por el cáncer. Se conocen en la técnica ejemplos de antígenos expresados por cánceres e incluyen, pero sin limitación, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, mucina 1, mucina 16, PTK7, PD-L1, STEAP1, receptor de endotelina B, mesotelina, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nectina 4, NaPi2b, LIV-1A, guanilil ciclasa C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrina aVp3, integrina a5p1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, una mucina, CAIX, EPHA3, receptor de folato a, GD2, GD3 y un complejo de MHC/péptido que comprende un péptido de NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, una proteína de la familia MAGE, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirosinasa, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, receptor de laminina inmaduro, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, p-catenina, TGF-pRII, HPV E6 o HPV E7. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se administra un anticuerpo de la presente divulgación en combinación con un anticuerpo monoclonal que se une a CD123 (también conocido como receptor alfa de IL-3), tal como talacotuzumab (también conocido como CSL362 y JNJ-56022473). En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se administra en combinación con un anticuerpo monoclonal que se une a EGFR (tal como cetuximab). En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo incluye una o más funciones efectoras, por ejemplo, funciones efectoras que se asocian con la interacción con el receptor de Fc (FcR) en células inmunitarias, lo que incluye, pero sin limitación, ADCC o ADCP y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Sin limitarse a la teoría, se cree que la combinación de un anticuerpo tal con un anticuerpo de la presente divulgación es particularmente ventajosa, por ejemplo, para dirigir los leucocitos que expresan FcR a una célula tumoral a la que se une el segundo anticuerpo, al tiempo que se inhibe la capacidad de respuesta de SIRP-a expresado por el leucocito a cualquier CD47 expresado por la célula tumoral con el anticuerpo SIRP-a.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se administra en combinación con un agente inmunoterapéutico. Un agente inmunoterapéutico puede hacer referencia a cualquier agente terapéutico que selecciona como diana el sistema inmunitario y promueve un redireccionamiento terapéutico del sistema inmunitario, tal como un modulador de una vía de coestímulo, vacuna contra el cáncer, célula inmunitaria modificada de forma recombinante, etc. En algunas realizaciones, el agente inmunoterapéutico comprende un anticuerpo. Se conocen en la técnica ejemplos de antígenos de anticuerpos inmunoterapéuticos e incluyen, pero sin limitación, PD-1, PD-L1, Ox 40, CTLA-4, CD137/4-1BB, B7-H3, FZD7, CD27, TNFR2, CCR4, CSF1R, CSF, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, CCR2, IDO, A2R, CD39, CD73, TIGIT, CD80, CD47, arginasa, TDO y PVRIG. Los agentes inmunoterapéuticos aprobados o en etapa tardía de ensayo clínico incluyen, pero sin limitación, ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab y similares. Sin desear limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos de la presente divulgación son adecuados para su uso con agentes inmunoterapéuticos debido a mecanismos complementarios de acción, por ejemplo, en la activación tanto de macrófagos como de células Tefectoras para seleccionar células tumorales como diana. En determinadas realizaciones, se administra un anticuerpo de la presente divulgación en combinación con un inhibidor de la vía PD-L1/PD-1, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1 o anti-PD-1. Tal como se demuestra en el presente documento, la administración combinada de un anticuerpo anti-SIRP-a de la presente divulgación y un inhibidor de la vía de PD-L1/PD-1 puede generar actividad antitumoral sinérgica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-SIRP-a bloqueador de la presente divulgación se administra en combinación con un anticuerpo anti-PD-1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador de la presente divulgación se administra en combinación con un anticuerpo anti-PD-1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-SIRP-a bloqueador de la presente divulgación se administra en combinación con un anticuerpo anti-PD-LI. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador de la presente divulgación se administra en combinación con un anticuerpo anti-PD-LI.
Se puede incluir cualquier tipo de cáncer conocido en la técnica, tal como, pero sin limitación, carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, linfoma y blastoma. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen, pero sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer de células escamosas, tumores cerebrales, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer colorrectal (por ejemplo, cánceres de colon o rectal), cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer gástrico o de estómago, cáncer pancreático, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de la vía urinaria, cáncer de mama, cáncer peritoneal, cáncer de útero, cáncer de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de linfocitos B (lo que incluye linfomas no hodgkiniano (NHL)), leucemia linfoblástica aguda (a Ll ), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mieloide aguda (AML), carcinoma de células de Merkel, leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica (CML) y metástasis asociadas.
Además de terapias contra el cáncer, los anticuerpos provistos en el presente documento son útiles en terapias en las que los anticuerpos monoclonales se administran con el fin de eliminar las células, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades inflamatorias para la eliminación de células inmunitarias. Con dichos fines, un anticuerpo de la presente se administra en combinación con un segundo anticuerpo terapéutico, por ejemplo, con rituximab para el consumo de linfocitos B en enfermedades inflamatorias y afecciones autoinmunitarias, alemtuzumab para esclerosis múltiple, OKT3 para inmunosupresión, otros para acondicionamiento para trasplante de médula y similares.
Además, se describe en el presente documento un anticuerpo de la presente divulgación para su uso en los métodos para el tratamiento o el retraso de la progresión de una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria en un individuo mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo. Las enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias susceptibles de tratamiento de acuerdo con la divulgación incluyen, pero sin limitación, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, una espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria mediada por anticuerpos, enfermedad del injerto contra el hospedador, sepsis, diabetes, psoriasis, ateroesclerosis, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica progresiva, escleroderma, síndrome coronario agudo, reperfusión isquémica, enfermedad de Crohn, endometriosis, glomerulonefritis, miastenia grave, fibrosis pulmonar idiopática, asma, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), vasculitis y miositis autoinmunitaria inflamatoria. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se administra en combinación con un agente terapéutico, tal como un agente inmunosupresor, antiinflamatorio o inmunomodulador. En algunas realizaciones, un anticuerpo provisto en el presente documento se usa en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria, por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, una espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria mediada por anticuerpos, enfermedad de injerto contra huésped, sepsis, diabetes, psoriasis, artritis psoriásica, ateroesclerosis, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica progresiva, esclerodermia, síndrome coronario agudo, reperfusión isquémica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, endometriosis, glomerulonefritis, fibrosis pulmonar idiopática, asma, dermatitis atópica, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), vasculitis o miositis autoinmunitaria inflamatoria.
Es posible preparar las formulaciones y composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento mediante la mezcla de los ingredientes activos (tal como un anticuerpo o un polipéptido) con el grado deseado de pureza con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los transportadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosis y las concentraciones empleadas e incluyen, pero sin limitación: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteína y Zn) y/o tensioactivos no iónicos como polietilenglicol (PEG). Un anticuerpo de la presente divulgación puede liofilizarse.
Ejemplos
Se comprenderá en forma más detallada la presente divulgación con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no se debería considerar que los ejemplos limitan el alcance de la presente divulgación Ejemplo 1: Identificación de anticuerpos con especificidades de unión novedosas a proteínas SIRP-a Métodos
Producción de anticuerpo
Las proteínas siguientes se usaron para inmunización. Cada una incluye un péptido de SIRP-a humano o de ratón fusionado a una región Fc modificada (ya sea una Fc de IgG4 humana S228P o una Fc de IgG1 humana L234A/L235A/G237A/N297A designada como IgG1_AAA_N297A) para aumentar la inmunogenicidad.
Tabla A. Secuencias de inmunógenos.
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Las proteínas anteriores se usaron para inmunizar pollos de tipo silvestre, pollos SynVH que son pollos transgénicos que contienen VH de humanos y VL de pollo, o pollos con locus de inmunoglobulina HuMAB completamente humana (Crystal Bioscience; véase, por ejemplo, los documentos WO2012162422, WO2011019844 y WO2013059159). Se inmunizaron pollos con varios cronogramas con dosis alternadas de antígeno. El siguiente es un ejemplo de cronograma de inmunización: dosis de 100 |jg de antígeno con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 en la semana 1, refuerzo de 100 jg de antígeno con la secuencia de la SEQ ID NO: 2 en la semana 3, extracción en la semana 4, refuerzo con una dosis de 50 jg de antígeno con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 en la semana 5, extracción en la semana 6, refuerzo con 50 jg de antígeno con la secuencia de la SEQ ID NO: 2 en la semana 7 y extracción en la semana 8. Se pueden encontrar descripciones adicionales de inmunización de pollos, por ejemplo, en Mettler Izquierdo, S. et al. (2016) Microscopy (Oxf) 1-16.
Exploración y expresión de clones de anticuerpo
Se generaron y se exploraron clones de acuerdo con el ensayo de GEM (véase Mettler Izquierdo, S. et al. (2016) Microscopy (Oxf) 1-16). Los clones se evaluaron en un formato de scFv-Fc en el cual se fusiona la cadena ligera mediante enlazador con la cadena pesada. La scFv se fusionó al extremo N de Fc-IgG1 humana. Se expresaron clones en células 293-FS FreeStyle™ (Thermo Fisher) y se usaron medios secretados para caracterización de unión por SPR y ELISA.
SPR
Se determinó la unión de los clones de anticuerpos a varias proteínas SIRP mediante detección por resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA) con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) complementada con Tween-20 al 0,01 % (PBST) como tampón de corrida. El medio prefiltrado que contenía los anticuerpos secretados se usó directamente para el ensayo. En primer lugar, se sometió Fc de IgG antihumana (BR-1008-39, GE Healthcare) a acoplamiento con amina en un chip de sensor de GLC para generar las superficies de captura para los anticuerpos. Se logran aproximadamente 4000 UR por celda de flujo de Fc de IgG antihumana inmovilizada. Se explora cada clon con el mismo método, tal como se indica más adelante. Los analitos de SIRP usados para el análisis se enumeran en la Tabla C.
(1) Inyección de ~5-10 ul de medios prefiltrados en tampón de acetato de sodio 10 mM (pH 4,5) durante 2 minutos a 30 ul/min.
(2) Flujo de tampón durante 1 minuto a 100 ul/min.
(3) Inyección de analito de SIRP (100 nM) durante 1 minuto a 100 ul/min, seguido de un ciclo de disociación de 10 minutos.
(4) Regeneración de superficie de chip mediante flujo de cloruro de magnesio 3M durante 1 minuto a 25 ul/min en ambas orientaciones.
(5) Flujo de tampón durante 1 minuto a 100 ul/min.
Se obtuvieron dos referencias para los datos de los biosensores mediante la sustracción de los datos de entre puntos (que no contenían Fc de IgG antihumana inmovilizada) de los datos de los puntos de reacción (Fc de IgG antihumana inmovilizada) y la posterior sustracción de la respuesta de una inyección de analito "blanco" de tampón a la de una inyección de analito. Se ajustó la unión con 1:1 Langmuir y se calcularon valores de Koff (1/S). Todos los ensayos de SPR se realizaron a 25 °C.
ELISA
Se llevaron a cabo ensayos ELISA para analizar la unión de clones de anticuerpo a analitos de SIRP y complejo de SIRP-a:CD47. Se recubrieron placas de 96 pocilios y fondo plano con unión elevada (Greiner Bio-One n.° 655061) con las proteínas siguientes en experimentos ELISA independientes: Avidina (Sigma A9275) (2 ug/ml) seguida de SlRPa V1 humana biotinilada (0,5 ug/ml), avidina (2 ug/ml) seguida de biotina SIRPa V2 humana (0,5 ug/ml), SIRPa de ratón NOD (2 ug/ml), SIr Py humana (2 ug/ml), CD47 (2 ug/ml) seguido de SIRPa V1 y V2 humana con afinidad elevada (cada uno a 2 ug/ml) o anti-hFc (2 ug/ml, Rockland 609-4103). Las placas se bloquearon con PBSTM (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, Tween20 al 0,05 %, leche 3 %) y se agregaron 50 ul de sobrenadante que contenía scFv-Fc secretada durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBST. Se agregaron 50 ul de anti-hFc-HRP (1:5000 Rockland 609-4303) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBST. Se reveló TMB durante 5 minutos y se detuvo con HCl 1 N. Los resultados de ELISA se leyeron con un lector BioTek Synergy H1 Hybrid Reader. Las proteínas correspondientes usadas para el ensayo y descritas en el presente documento son: SIRPa V1 humana (SEQ ID nO: 5); SIRPa V2 humana (SEQ ID NO: 6); SIRPa de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 11); SIRPa de ratón NOD (SEQ ID NO: 8); SIRP y humana (SEQ ID NO: 15); CD47 (SEQ ID NO: 16); SIRPa V1 con afinidad elevada (SEQ ID NO: 42); SIRPa V2 con afinidad elevada (SEQ ID NO: 17).
Resultados
SIRP-a es una proteína muy polimórfica en humanos, monos y ratones. Por ejemplo, se han identificado 20 diferencias de aminoácidos entre proteínas SIRP-a en las cepas de ratón NOD y C57BL/6, y dichos polimorfismos llevan a consecuencias funcionales vinculadas a la unión a CD47 y los injertos de células madre hematopoyéticas humanas en dichas cepas de ratón. En humanos, se han identificado al menos 10 alelos diferentes de SIRPA y se encuentran variaciones de aminoácidos que distinguen los alelos en los restos de unión a CD47 previstos (Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol. 8:1313-23). Se proporciona un alineamiento de 10 secuencias de proteína SIRP-a variantes humanas en la FIG. 1A. La identificación de anticuerpos con especificidades de unión diferentes con reactividad cruzada intraespecie y/o interespecies es de gran interés para el desarrollo de candidatos clínicos que son eficaces en poblaciones humanas y la caracterización de dichos candidatos en varios modelos animales.
Los dominios D1 de proteínas SIRP-a de humanos (variantes v1 y v2), mono cynomolgus y ratón 129 se alinearon para identificar aminoácidos conservados (FIG. 1B). Aunque las secuencias de mono cynomolgus y ratón 129 son mucho más divergentes de v1 y v2 humanas que las variantes v3-v10 humanas tal como se muestra en la FIG. 1A, estas alineaciones demuestran cierto grado de conservación entre las cuatro proteínas, lo que sugiere que quizá sería posible identificar anticuerpos con reactividad cruzada. Sin embargo, cada proteína también presenta polimorfismos únicos, lo que sugiere que también fueron posibles anticuerpos específicos.
Tal como se muestra en la FIG. 1C, también se alinearon secuencias de proteína SIRP-a que representan múltiples variantes humanas y cepas de ratón (por ejemplo, 129, NOD, C57BL/6 y BALB/c). r 1, R2, R3 delinean los restos ubicados alrededor de sitios de unión de SIRPa a CD47. Estas alineaciones demostraron que R2 y R3 divergían considerablemente más entre secuencias humanas y de ratón que R1. Sin limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos anti-SIRP-a que se unen a proteínas SIRP-a pueden ser útiles, por ejemplo, para ensayos farmacocinéticos (tales como aquellos que usan ratones CD-1), el desarrollo de ratones transgénicos (tales como aquellos en una referencia de C57BL/6) y/o la caracterización en SCID (por ejemplo, en una referencia NOD) o modelos de ratón singénicos (por ejemplo, en una referencia de BALB/c o C57BL/6).
También se alinearon dominios D1 de SIRP-a de mamífero anteriormente descritos con el dominio D1 de SIRP-a de pollo que comprende la secuencia DFKLQQPQSSVVVIKGDTLTLNCTASGSGPIGAVKWVKGWGSDNQTVYEHKGSFPRVMRAVPDPTNDFTIRI SNVSLEDAGTYYCVKLRKGIVDDVVFTR GGGTEVSVHA (SEQ ID NO: 84) (FIG. 2). En comparación con las secuencias de SIRP-a de mamíferos, se observó que la secuencia de SIPRa de pollo fue significativamente más divergente. Las comparaciones en pares de porcentaje de identidad de secuencia entre varias proteínas SIRP-a se muestran en la Tabla B.
Tabla B. Identidades de secuencia en pares (%) entre proteínas SIRP-a.
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Sin limitarse a la teoría, se consideró que dicha divergencia proporcionaría oportunidades únicas para generar anticuerpos que reaccionaran de forma cruzada en múltiples proteínas SIRP-a de mamíferos. Por ejemplo, puede ser difícil generar anticuerpos anti-SIRP-a que reaccionen de forma cruzada con la secuencia murina de un hospedador ratón debido a inmunotolerancia. Asimismo, la mayor divergencia entre los sistemas inmunitarios de pollos y mamíferos puede llevar a una mayor diversidad en la producción de anticuerpos.
Para identificar los anticuerpos con especificidades de unión novedosas a proteínas SIRP-a, se caracterizaron los clones de anticuerpo en el formato scFv-Fc tal como se describió anteriormente. Se analizó cada clon de anticuerpo a concentraciones entre 0,008 y 1,0 pg/ml para determinar la unión con ELISA a las siguientes dianas: el dominio D1 de SIRP-a v i humana (secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 5), el dominio Di de SIRP-a v2 humana (secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 ), el dominio Di de una variante de SIRP-a de mono cynomolgus (secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 11), el dominio Di de SIRP-a de ratón 129 (secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 7) y una isoforma de SIRPy humana (secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 15). Tal como se usa en adelante, se hace referencia a los clones del anticuerpo mediante el número de identificación del clon. Además, la notación "S[número de clon]" hace referencia a un formato sc-Fv-Fc; la notación "AB[número de clon]" hace referencia a un formato de anticuerpo IgG completo; la notación "AB[número de clon]a" hace referencia a una IgG1 humana con mutaciones L234A, L235A, G237A y N297A; "AB[número de clon]b" hace referencia a un formato de N297A de IgG1 de ratón; "AB[número de clon]c" hace referencia a un formato de IgG2a de ratón y "[número de clon] Fab" hace referencia a un formato de fragmento Fab.
Además, se caracterizó la unión de cada clon de anticuerpo a un precomplejo preparado con una mezcla 1:1 de dos variantes de SIRP-a de afinidad elevada (SEQ ID NO: 42 y SEQ ID No : 18 ) unidas con el dominio de IgSF de CD47 (secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 16). De manera ventajosa, dado que la afinidad entre el dominio D1 de SIRP-a de tipo silvestre y el dominio IgSF de CD47 es relativamente baja, el uso de un complejo que comprende una variante de SIRP-a de afinidad elevada hace posible la identificación de anticuerpos que se unen a SIRP-a mientras que forma complejos con CD47 (por ejemplo, un anticuerpo no bloqueador). También hace posible la identificación de anticuerpos incapaces de unirse a SIRP-a mientras que forma complejos con CD47, lo que sugiere que el anticuerpo y CD47 compiten por la misma interfaz de unión en SIRP-a (por ejemplo, un anticuerpo bloqueador). Las dos variantes de SIRPa usadas (SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 19) corresponden al dominio D1 de SIRPa de afinidad elevada modificado por la variante 1 y la variante 2 de polipéptido SIRPa humano, respectivamente.
La figura 3A muestra la curva de unión de ELISA para el clon S130 (SEQ ID NO: 71). Este clon demostró reactividad cruzada en proteínas SIRP-a de mamíferos, con unión a múltiples variantes humanas, así como a proteínas de mono cynomolgus y murinas (FIG. 3B). Sin embargo, su unión también fue específica para la isoforma, dado que no se observó unión con SIRPy humana. También se identificó este clon como un bloqueador de la interacción entre SIRP-a y CD47, dado que no se detectó unión a un complejo preformado que contiene CD47 unido a una variante de SIRP-a de afinidad elevada.
La figura 4A muestra la curva de unión de ELISA para el clon S121 (SEQ ID NO: 75). Este clon también demostró reactividad cruzada en proteínas SIRP-a de mamíferos, pero está unido a SIRPy humana, lo que indica unión panisofórmica (FIG. 4b ). Este clon también se identificó como un bloqueador de la interacción entre SIRP-a y CD47.
La figura 5A muestra la curva de unión de ELISA para el clon S137 (SEQ ID NO: 73). Al igual que el clon mostrado en las FIG. 3A y 3B, este clon demostró reactividad cruzada en proteínas SIRP-a de mamífero con unión específica para la isoforma, dado que no se une a SIRPy humana (FIG. 5B). Sin embargo, este clon se identificó como un no bloqueador de la interacción entre SIRP-a y CD47, dado que se unen al complejo preformado.
La figura 6 A muestra la curva de unión de ELISA para el clon S128 (SEQ ID NO: 70). Este clon demostró reactividad cruzada específica para la isoforma en proteínas SIRP-a de primates, pero no se unió a la proteína murina (FIG. 6B). Este clon también se identificó como un bloqueador de la interacción entre SIRP-a y CD47.
La figura 7A muestra la curva de unión de ELISA para el clon S135 (SEQ ID NO: 72). De manera similar al clon mostrado en las FIG. 6A y 6B, este clon bloqueador demostró reactividad cruzada en proteínas SIRP-a de primates, pero no se unió a la proteína murina (FIG. 7B). A diferencia del clon S128, se observó la reacción cruzada de este clon con SIRPy humana.
La figura 8A muestra la curva de unión de ELISA para el clon S126 (SEQ ID NO: 69). Se observó que este clon era específico para humanos, con unión a variantes de SIRP-a humana, pero no a los otros péptidos (FIG. 8B). Este clon se identificó como un bloqueador de la interacción entre SIRP-a y CD47.
La figura 9A muestra la curva de unión de ELISA para el clon S138 (SEQ ID NO: 74). Este clon solamente se une a la variante 1 de SIRP-a humana, lo que demuestra que un grado elevado de especificidad de unión intraespecies e interespecies (FIG. 9B). Este clon se identificó como un bloqueador de la interacción entre SIRP-a y CD47.
En conclusión, se caracterizaron anticuerpos novedosos con múltiples especificidades de unión a proteínas SIRP-a. La figura 10A proporciona un alineamiento que muestra las secuencias del dominio variable de scFv-Fc obtenidas a partir de un pollo que produce anticuerpos de pollo (se indican las CDR). La figura 10B proporciona un alineamiento que muestra las secuencias del dominio variable de scFv-Fc obtenidas a partir de un pollo que produce anticuerpos humanos (se indican las CDR). Estos ensayos destacan la utilidad del pollo como una fuente de diversidad de anticuerpos para la identificación de anticuerpos anti-SIRP-a.
Para evaluar si los anticuerpos pueden bloquear la unión de SIRPa a CD47, también se llevó a cabo un análisis SPR, además del análisis mediante ELISA. La captura de anticuerpo se llevó a cabo con una superficie de GLC inmovilizada con Fc-IgG antihumana preparada tal como se describió anteriormente. Se usó una variante de SIRPa (SEQ ID NO: 17) modificada para unirse a CD47 (SEQ ID NO: 16) con afinidad nM elevada para el análisis en lugar de SIRP-a de tipo silvestre. Esto se debe a que la variante de SIRP-a de tipo silvestre tiene baja afinidad de unión uM a CD47, lo que no permite interacción de complejos estable para evaluar la formación de sándwich. Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) complementada con Tween-20 al 0,01 % (PBST) como tampón de corrida.
En primer lugar, se inyectaron aproximadamente 5-10 ul de medios prefiltrados que contenían los anticuerpos en tampón de acetato de sodio 1o mM (pH 4,5) durante 2 minutos a 30 ul/min y se capturó en la superficie de GLC inmovilizada con Fc-IgG antihumana, seguido por flujo breve de tampón durante 1 minuto a 100 ul/min. Luego, se inyectó una variante de SIRP-a con afinidad elevada 100 nM (SEQ ID NO: 17) premezclada con CD47 (SEQ ID NO: 16) a concentraciones diferentes de 0, 20, 55, 500 o 1500 nM por separado durante un minuto a 100 ul/min con un tiempo de disociación de 10 minutos. En la divulgación que se encuentra más adelante, "SIRP-a" hace referencia a la SEQ ID NO: 17.
En el caso de un anticuerpo que no bloquea la unión de SIRP-a a CD47, se esperaría que se uniera al complejo SIRP-a/CD47 y formara un sándwich. Por consiguiente, al aumentar la concentración de CD47, la resonancia aumentó de forma acorde debido al aumento de formación de sándwich. Se determinó que el clon de anticuerpo S123 correspondía a este perfil. Se muestra un ejemplo del perfil para S123 en la FIG. 12A. En el caso de un anticuerpo que bloquea la unión de SIRP-a a CD47, el perfil será diferente del de un anticuerpo no bloqueador. Al aumentar la concentración de CD47, se esperaría que se encontraran disponibles menos moléculas de SIRP-a para unirse al anticuerpo dado que el anticuerpo compite por el mismo sitio de unión que CD47 y que la mayoría o la totalidad de SIRP-a forma complejos con CD47. Por consiguiente, se esperaría que la resonancia (UR) se redujera al aumentar la concentración de CD47 en la mezcla. Se determinó que el clon de anticuerpo S119 correspondía a este perfil. Se muestra un ejemplo del perfil para S119 en la f Ig .12B.
Además de bloqueadores y no bloqueadores, se aisló una tercera categoría de anticuerpos con un perfil "de partida". Se determinó que el clon de anticuerpo S118 correspondía a este perfil. Se muestra un ejemplo del perfil para S118 en la FIG. 12C. A una concentración mayor de CD47 (por ejemplo, CD47 500 nM y 1500 nM), se formó un sándwich transitorio entre el anticuerpo, SIRP-a y CD47, tal como lo indica la mayor resonancia de 300 UR, la cual se redujo con el transcurso del tiempo. Dicha reducción de unidades de resonancia indica que el anticuerpo pudo unirse a SIRP-a en el complejo y se produjo "la partida de SIRP-a" de la unión a CD47.
Las tasas ko ff de unión de cada clon a cada analito de SIRP se determinaron con SPR (Tabla C). Se han descrito en el presente documento condiciones de análisis de SPR y se determinaron los valores de Koff con ajustes cinéticos de Langmuir. Las propiedades de bloqueo de CD47 (bloqueo, no bloqueo, partida) se describen en la última columna de la Tabla C. Cada anticuerpo se identifica de acuerdo con su SEQ ID NO correspondiente. Las secuencias de analito de SIRP son las siguientes: CV1-3, SEQ ID NO: 18; v1, SEQ ID NO: 5; v2, SEQ ID NO: 6; cynol, SEQ ID NO: 11; cyno2, SEQ ID NO: 12; m129, SEQ ID NO: 7; NOD, SEQ ID NO: 8; BL6, SEQ ID NO: 9; sirpb1, SEQ ID NO: 13; sirpg, SEQ ID NO: 15.
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Estos datos indican que los clones de anticuerpo con una variedad de especificidades de unión para proteínas SIRP-a en especies diferentes y se identificaron variantes intraespecies. Se caracterizaron adicionalmente las especificidades de unión de anticuerpos seleccionados mediante ELISA tal como se describió anteriormente al generar curvas de unión con respecto a los dominios D1 de SIRP-a v i humana (SEQ ID NO: 5), v2 humana (SEQ ID NO: 6), de ratón NOD (SEQ ID NO: 8) y de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 11), así como SIRPy humana (SEQ ID NO: 15) y un complejo preformado de una mezcla 1:1 de dos variantes de SIRP-a de afinidad elevada (SEQ ID NO: 17 y 19) unidos al dominio IgSF de CD47 (SEQ ID NO: 16).
Las secuencias de clones de scFv-Fc evaluadas se proporcionan en la Tabla D.
Tabla D. Secuencias de scFv-Fc.
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Sin limitarse a la teoría, se considera que los anticuerpos con unión cruzada entre proteínas humanas, de mono cynomolgus y/o murinas puede posibilitar la caracterización de anticuerpos tanto en modelos animales como en ensayos clínicos. Los anticuerpos con unión específica para isoforma y/o variante pueden ser útiles para enfoques médicos personalizados para poblaciones humanas específicas y/o ensayos en variantes de interés específicas. Además de determinar los perfiles de especificidades de unión intraespecie e interespecie, los métodos descritos en el presente documento también hacen posible identificar anticuerpos que bloquean o no bloquean la unión entre SIRP-a y CD47, así como anticuerpos con "partida de SIRPa" de la unión a CD47.
Ejemplo 2: Identificación de anticuerpos adicionales con especificidades de unión novedosas a proteínas SIRP-a
Métodos
Determinación de Kd
Se analizaron las interacciones de anticuerpos anti-SIRPa con SIPRa de varias especies (v1 humana, v2 humana, mono cynomolgus, ratón 129, BL6, BALBc, NOD), SIRPp y SIRPy mediante dos métodos: inmovilización directa de los anticuerpos (vía chip de GLC) o captura mediante proteína A (vía chip de NLC), de acuerdo con los protocolos siguientes. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C con un biosensor con base en SPR ProteOn XPR36 (BioRad, Inc, Hercules, CA) equipado con chips de detección GLC o NLC. Los anticuerpos se expresaron con células 293-FS FreeStyle™ (Thermo Fisher) tal como se describió en el ejemplo 1. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna de afinidad de proteína A estándar y los anticuerpos en elución se almacenaron en tampón PBS.
El tampón de corrida fue PBS a pH 7,4 con Tween-20 al 0,01 % (PBST+). Todos los analitos se usaron en sus concentraciones nominales tal como se determinó por absorbancia A280 y con su coeficiente de extinción molar calculado. Se inyectaron analitos en un modo cinético "único" tal como se describe en otro documento (véase, por ejemplo, Bravman, T. et al. (2006) Anal. Biochem. 358:281-288).
En el caso del método que usa chip de GLC, los analitos se inyectaron y fluyeron en anticuerpos anti-SIRPa inmovilizados (~1000 UR) en chips GLC con kit de acoplamiento de amina Proteon Amine Coupling Kit. En la etapa de inmovilización, se activó el chip de GLC con EDAC/Sulpho-NHS 1:1 (Biorad) en dilución 1/100 durante 300 segundos a 25 pl/min. Se diluyeron anticuerpos anti-SIRPa a una concentración de 80 nM en tampón de acetato de sodio 10 mM a pH 4,5 y se inmovilizaron en el chip a 30 pl/min durante 50 segundos. El chip se inactivó con etanolamina durante 300 segundos a 25 pl/min. Se inyectaron los analitos (por ejemplo, SIRP-a de especies diferentes, SIRP-p, SIRP-y) en un modo cinético "único" a concentraciones nominales de 100, 33, 11, 3,7, 1,2 y 0 nM. Se monitorearon los tiempos de asociación durante 90 s a 100 pL/min y los tiempos de disociación durante 1200 s. Las superficies se regeneraron con una mezcla 2:1 v/v de tampón de elución de IgG de Pierce/NaCl 4 M.
De manera alternativa, la determinación de Kd se llevó a cabo con captura de anticuerpo mediante un chip de NLC. En este caso, se inyectaron 15 ug/ml de proteína A biotinilada (Thermofisher) a 30 ul/min durante 120 s en el chip de NLC para obtener una respuesta de inmovilización de ~1000-1200 UR. Luego, se inyectaron anticuerpos anti-SIRPa (~160 nM) durante 80 s a 30 ul/min. Posteriormente, se inyectaron los analitos (SIRPa de especies diferentes, SIRP-p y SIPR-y) en un modo cinético "único" a concentraciones nominales de 100, 33, 11, 3,7, 1,2 y 0 nM. Se monitorearon los tiempos de asociación durante 60 s a 25 pL/min y los tiempos de disociación durante 120 s. Las superficies se regeneraron con una mezcla 2:1 v/v de tampón de elución de IgG de Pierce/NaCl 4 M.
Se obtuvieron dos referencias para los datos de los biosensores mediante la sustracción de los datos de los entre puntos (que no contenían proteína inmovilizada) de los datos de los puntos de reacción (proteína inmovilizada) y la posterior sustracción de la respuesta de una inyección de analito "blanco" de tampón a la de una inyección de analito. Se ajustaron los datos de doble referencia globalmente a un modelo de Langmuir simple y se calculó el valor de Kd a partir de la relación de las constantes de velocidad cinética aparentes (Kd = kd/ka ).
Resultados
Se caracterizaron adicionalmente tres anticuerpos representativos (un anticuerpo bloqueador, no bloqueador y de partida) para la unión a varias proteínas SIRP-a, SIRP-p, SIRP-y tal como se describió anteriormente. Los tres anticuerpos contienen secuencias humanas y se derivaron de los experimentos de inmunización de pollo de HuMab. Estos anticuerpos se evaluaron como anticuerpos IgG1 de longitud completa con mutaciones L234A, L235A, G237A y N297A. Las proteínas SIRP-a evaluadas en estos experimentos corresponden a SIRP-a v i humana (SeQ ID NO: 5), SIRP-a v2 humana (SEQ ID NO: 6), SIRP-a de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 11), isoforma 1 de SIRPp humana (SEQ ID NO: 13), isoforma 2 de SIRPp humana (SeQ ID NO: 14) e isoforma 1 de SIRPy humana (SeQ ID NO: 15). La isoforma 1 de SIRPp humana (SEQ ID NO: 13) también se conoce en la técnica como "isoforma 1 de SIRPp1".
Los valores de Kd obtenidos para los tres anticuerpos se indican en la tabla E a continuación.
Tabla E. Resumen de valores de Kd (M)
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Luego, se determinaron las propiedades cinéticas de unión de varios clones de anticuerpo a proteínas SIRP-a de ratón seleccionadas tal como se describió anterior. Las proteínas de ratón evaluadas incluyen las proteínas SIRP-a de BALBc (SEQ ID NO: 10), BL6 (SEQ ID NO: 9), NOD (SEQ ID NO: 8) y m129 (SEQ ID NO: 7). Los resultados se resumen en las Tablas F-I que se encuentran a continuación. Los clones de anticuerpo marcados como "c" se evaluaron como anticuerpos IgG2a de ratón de longitud completa. Los clones de anticuerpo marcados como "a" se evaluaron como anticuerpos IgG1 humanos de longitud completa con las mutaciones L234A, L235A, G237A y N297A.
Tabla F. Resumen de propiedades cinéticas para la unión de anticuerpos seleccionados a proteína SIRP-a de ratón BALBc (SEQ ID NO: 10)
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Tabla G. Resumen de propiedades cinéticas para la unión de anticuerpos seleccionados a proteína SIRP-a en ratón BL6 (SEQ ID NO: 9)
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Tabla H. Resumen de propiedades cinéticas para la unión de anticuerpos seleccionados a proteína SIRP-a en ratón NOD (SEQ ID NO: 8)
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Tabla I. Resumen de propiedades cinéticas para la unión de anticuerpos seleccionados a proteína SIRP-a en ratón m129 (SEQ ID NO: 7)
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En el caso de los anticuerpos anteriores, las secuencias de dominio VH y VL (respectivamente) fueron las siguientes: AB136a: SEQ ID NO: 133 y 134; AB3c: SEQ ID NO: 242 y 243; AB21c: SEQ ID NO: 135 y 136; AB25c: SEQ ID NO: 137 y 138; AB27c: SEQ ID NO: 139 y 140; AB66c: SEQ ID NO: 141 y 142.
Estos resultados demostraron que múltiples clones de anticuerpos se unen a las cuatro proteínas SIRP-a de ratón, lo que hace que estos anticuerpos sean adecuados para caracterización en modelos de ratón in vivo. Ejemplo 3: Propiedades funcionales de anticuerpos anti-SIRP-a
Los ejemplos anteriores describen la identificación y la caracterización de anticuerpos anti-SIRP-a con una gama diversa de propiedades, tales como especificidad de unión a varias proteínas SIRP-a, SIRP-p y SIRP-y humanas, de mono cynomolgus y/o murinas, y si los anticuerpos bloquean o no la unión entre SIRP-a y CD47. Después, se evaluaron los anticuerpos que representan categorías particulares de interés de ensayos funcionales in vitro e in vivo con el fin de caracterizar sus efectos en las funciones biológicas de SIRP-a. En particular, se caracterizaron los anticuerpos "bloqueadores" (es decir anticuerpos que bloquean la unión entre SIRP-a y CD47) y "no bloqueadores" (es decir, anticuerpos que no bloquean la unión entre SIRP-a y CD47) para actividades en varios ensayos in vitro e in vivo.
Tal como se mencionó anteriormente, los clones de anticuerpo marcados como "a" se evaluaron como anticuerpos IgG1 humanos de longitud completa con mutaciones L234A, L235A, G237A y N297A. Los clones de anticuerpo marcados como "b" se evaluaron como anticuerpos IgG1 de ratón de longitud completa con una mutación N297A. Los clones de anticuerpo marcados como "c" se evaluaron como anticuerpos IgG2a de ratón de longitud completa.
Métodos
Cultivo de línea de células tumorales
Se mantuvieron células DLD-1 (adenocarcinoma colorrectal humano) y OE19 (carcinoma esofágico humano) en medio de crecimiento que comprendía RPMI (Gibco) complementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10 % (Gibco), penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco) y Glutamax al 1 % (Gibco).
Obtención y cultivo de macrófagos obtenidos de monocitos humanos
Se recibieron remanentes de Trima de hemocentros y se diluyeron a 1:4 con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Gibco). La sangre diluida se dividió en cuatro tubos y se colocó sobre una base de 20 ml de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a 400 x g. Se recogieron CMSP de la interfaz y se resuspendieron en tampón de FACS (PBS con albúmina de suero bovino al 0,5 % (Gibco)). Los monocitos CD14+ se purificaron mediante selección negativa con el kit de aislamiento de monocitos II (Miltenyi Biotec) y columnas de LS (Miltenyi Biotec) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En el caso de macrófagos no polarizados, los monocitos CD14+ se colocaron en placas de cultivo de tejidos de 15 cm (Corning) en una proporción de 10 millones de células por placa en 25 ml de IMDM (Gibco) complementado con suero AB humano al 10 % (Corning), penicilina/estreptomicina al 1 % y Glutamax al 1 %. Las células se cultivaron durante entre siete y diez días.
En el caso de macrófagos polarizados M2, los monocitos CD14+ se colocaron en placas de cultivo de tejidos de 15 cm (Corning) en una proporción de 6 millones de células por placa en 25 ml de RPMI (Gibco) complementado con suero fetal bovino al 10 % (Thermo Fisher), penicilina/estreptomicina al 1 %, Glutamax al 1 % y 50 ng/ml de M-CSF (Miltenyi). Las células se cultivaron durante entre siete y diez días.
Ensayos de fagocitosis in vitro
Las células DLD-1 y OE19 se separaron de las placas de cultivo mediante lavado doble con 20 ml de PBS e incubación en 10 ml de TrypLE Select (Gibco) durante 10 minutos a 37 °C. Las células se centrifugaron, se lavaron en PBS y se resuspendieron en medio. Las células se marcaron con el kit de proliferación celular Celltrace CFSE (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se resuspendieron en IMDM. Los macrófagos se separaron de placas de cultivo mediante lavado doble con 20 ml de PBS e incubación en 10 ml de TrypLE Select durante 20 minutos a 37 °C. Las células se removieron con un raspador de células (Corning), se lavaron en PBS y se resuspendieron en IMDM.
Los ensayos de fagocitosis se montaron en placas de 96 pocillos con fondo en forma de U de acoplamiento ultrabajo (Corning) que contenían 100 000 células DLD-1 o OE19, 50 000 macrófagos, diluciones en serie quíntuples de anticuerpo anti-SIRP-a de 100 nM a 6,4 pM, y cetuximab (Absolute Antibody) a 1 o 0,01 ug/ml, trastuzumab a 0,01 ug/ml o anticuerpo de control del mismo isotipo (Southern Biotech). Todos los anticuerpos anti-SIRP-a evaluados presentaron una IgG1 humana con mutaciones L234A, L235A, G237A y N297a , excepto por AB136c que tuvo una IgG2a de ratón. Las placas se incubaron durante dos horas a 37 °C en un incubador humidificado con 5 % de dióxido de carbono. Las células se sedimentaron mediante centrifugado durante cinco minutos a 400 x g y se lavaron en 250 pl de tampón de FACS. Los macrófagos se tiñeron en hielo durante 15 minutos en 50 pl de tampón de FACs que contenía 10 pl de reactivo de bloqueo de FcR humano (Miltenyi Biotec), 0,5 pl de BV421 anti-CD33 (Biolegend) y 0,5 pl de APC-Cy7 anti-CD206 (Biolegend). Las células se lavaron en 200 pl de tampón de FACS, se lavaron en 250 pl de PBS y se tiñeron en hielo durante 30 minutos en 50 pl de tinte de viabilidad de fijación eFluor 506 (ebioscience) en dilución 1:1000 en PBS. Las células se lavaron dos veces en 250 pl de solución tamponadora de FACS y se fijaron durante 30 minutos en hielo en 75 pl de Cytofix (BD Biosciences). Las células se lavaron en 175 pl de tampón de FACS y se resuspendieron en 75 pl de tampón de FACS. Las células se analizaron en FACS Canto II (BD Biosciences) con un análisis de datos posterior mediante Flowjo 10.7 (Treestar). Las células muertas se excluyeron mediante regulación en la población con e506 negativo. Se identificaron los macrófagos con células tumorales fagocitadas como células positivas para CD33, CD206 y CFSE.
Activación de células dendríticas in vivo
Los ratones Balb/c (n=3/grupo) recibieron inyecciones intravenosas de anticuerpo antagonista anti-SIRP-a antirratón de rata de control (clon p84), control de IgG de rata, AB136b (AB136 con una región Fc de IgG1 de ratón con una mutación N297A), control de IgG de ratón o vehículo (PBS) a 10 mg/kg. Cinco horas después de la inyección, se recogieron los bazos y se procesaron en suspensiones celulares únicas mediante disociación mecánica a través de un filtro celular de 70 pM. Se lavaron las células dos veces con PBS y se llevó a cabo lisis de glóbulos rojos. Posteriormente, se lavaron las células dos veces más con PBS/SFB al 10 % y se prepararon para tinción celular. Se tiñeron las células con fluorocromo conjugado con MHC-II, CD8, 33D1, c D4, CD11c, CD86, CCR7 y tinte de viabilidad a 4 grados durante una hora. Se lavaron dos veces las células, se analizaron con un citómetro de flujo BD Canto II y se procesaron datos con Flowjo. Actividad antitumoral in vivo
En el caso de modelo de carcinoma de colon de ratón singénico CT26, se implantaron de forma subcutánea células CT26 en ratones BALB/c y se asignaron de forma aleatoria a grupos (8-9 ratones/grupo). Los grupos de tratamiento incluyeron vehículo (PBS) y AB136b. AB136 anti-SIRP-a presentó una región Fc de IgG1 de ratón con una mutación N297A. El tratamiento inició cuando los tumores tuvieron un tamaño promedio de 75­ 80 mm3, el día 7 u 8 después del implante. Se administraron dosis intraperitoneales (IP) de 3 mg/kg de AB136b dos veces por semana a los ratones durante tres semanas. Cuando los tumores llegaron a un volumen de ~2000 mm3, se sacrificaron los animales.
En el caso de modelo de carcinoma de colon de ratón singénico MC38, se implantaron células MC38 de forma subcutánea en ratones C57BL/6 y se asignaron de forma aleatoria a grupos (8-10 ratones/grupo). Los grupos de tratamiento incluyen vehículo (PBS), AB25b, AB25c, AB27b, AB3b y AB136b. Todos los anticuerpos anti-SIRPa presentaron una región Fc de IgG1 de ratón con una mutación N297A, excepto por AB25c con IgG2a de ratón. El tratamiento inició cuando los tumores tuvieron un tamaño promedio de 60­ 65 mm3, el día 7 después del implante. Se administraron dosis intraperitoneales (IP) de 10 mg/kg de anti-SIRPa dos veces por semana a los ratones durante tres semanas. Cuando los tumores llegaron a un volumen de ~2000 mm3, se sacrificaron los animales.
Resultados
Se evaluaron varios anticuerpos anti-SIRP-a para determinar la inducción de la fagocitosis en ensayos de fagocitosis in vitro con macrófagos polarizados y no polarizados.
Se evaluaron anticuerpos anti-SIRP-a adicionales AB3 y AB45 en los experimentos que se describen más adelante. Ambos son anticuerpos no bloqueadores. Las velocidades koff de unión de cada clon (en formato scFv-Fc) a cada analito de SIRP se determinaron con SPR (Tabla J1). Se han descrito en el presente documento condiciones de análisis de SPR y se determinaron los valores de Koff con ajustes cinéticos de Langmuir. Las secuencias de analito de SIRP son las siguientes: CV1-3, SEQ ID NO: 18; v1, SEQ ID NO: 5; v2, SEQ ID NO: 6; cyno1, SEQ ID NO: 11; cyno2, SEQ ID NO: 12; m129, SEQ ID NO: 7; NOD, SEQ ID NO: 8; BL6, SEQ ID NO: 9; sirpb1, SEQ ID NO: 13; sirpg, SEQ ID NO: 15.
Tabla J1. Ajustes cinéticos de Langmuir de Kd (M) para AB3 y AB45
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NB - Sin unión.
*Véanse los dominios VH y VL en las SEQ ID NO: 242 y 243, respectivamente.
**Véanse los dominios VH y VL en las SEQ ID NO: 244 y 245, respectivamente.
Tal como se muestra en las FIG. 13A y 13B, se observó que el anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador AB3a induce fagocitosis de las células tumorales DLD-1 en macrófagos polarizados M2. En particular, el tratamiento de macrófagos con cetuximab (anticuerpo anti-EGFR) y AB3a llevó a una inducción importante de fagocitosis de células tumorales. De manera similar, se observó que el anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador AB45a induce la fagocitosis de células tumorales DLD-1 en macrófagos polarizados M2 y el tratamiento de macrófagos con cetuximab (anticuerpo anti-EGFR) y AB45a llevó a una inducción importante de fagocitosis de células tumorales (FIG. 13C y 13D). También se observó que los anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores AB119a (FIG. 13E) y AB135a (FiG. 13F) inducen la fagocitosis de células tumorales OE19 cuando se coadministran con trastuzumab (anticuerpo anti-HER2). Además, se observó que el anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador AB136c induce fagocitosis de las células tumorales DLD-1 (FIG. 13G).
Se usó un ensayo de activación de células dendríticas para caracterizar los efectos in vivo de anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador AB136b (SEQ ID NO: 133 y 134 para las secuencias de dominio VH y VL, respectivamente). La ausencia de interacción con el receptor de SIRP-a de ratón en células dendríticas esplénicas a través de unión a CD47 lleva a la activación de las células dendríticas esplénicas. El anticuerpo p84 antagonista anti-SIRP-a activó células dendríticas esplénicas cuando se inyectó a ratones por vía intravenosa (FIG. 14). El no bloqueo del anticuerpo anti-SIRP-a AB136b se evaluó in vivo para determinar si lleva a la activación de células dendríticas. Cabe destacar que el tratamiento con AB136b llevó a la activación de células dendríticas esplénicas a un nivel similar que el de p84 (FIG. 14).
Luego, se realizaron ensayos de los efectos antitumorales in vivo de varios anticuerpos anti-SIRP-a en dos modelos de carcinoma de colon de ratón singénicos. Las actividades antitumorales de los anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores AB25b, AB25c y AB27b y los anticuerpos anti-SIRP-a no bloqueadores AB3b y AB136b se examinaron en un modelo de carcinoma de colon de ratón singénico MC38 para evaluar sus actividades de agente simple. Tanto los anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores (AB25b, AB25c y AB27b) como no bloqueadores (AB3b y AB136b) retrasaron la formación de tumores a 10 mg/kg en comparación con el vehículo solo (FIG. 15) en el modelo de ratón singénico MC38. El día 25, los grupos tratados con anticuerpos anti-SIRPa tuvieron tres ratones por debajo de 600 mm3 para AB25b y AB27b, cuatro ratones por debajo de 600 mm3 para AB25c y AB3b, y cinco ratones por debajo de 600 mm3 para AB136b, al tiempo que el grupo tratado con vehículo tuvo solamente dos ratones por debajo de 600 mm3.
Luego, se evaluó la actividad antitumoral de AB136b no bloqueador en un modelo de carcinoma de colon CT26 singénico para evaluar la actividad de un agente simple. Estos resultados confirmaron que el tratamiento con 3 mg/kg de AB136b demoró la formación de tumores en comparación con el vehículo solo en el modelo de ratón singénico CT26 (FIG. 16).
En conjunto, estos resultados demuestran la eficacia del tratamiento con anticuerpo anti-SIRP-a para inducir la fagocitosis de células tumorales mediante macrófagos, activar células dendríticas e inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Se determinó que múltiples anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores promueven la fagocitosis de células tumorales, activan las células dendríticas y bloquean el crecimiento tumoral in vivo. Sin embargo, sorprendentemente, también se observó que el tratamiento con anticuerpo anti-SIRP-a no bloqueador activa las células dendríticas esplénicas e inhibe el crecimiento tumoral in vivo en dos modelos tumorales de ratones singénicos diferentes. La observación de que los anticuerpos anti-SIRP-a no bloqueadores fueron capaces de aumentar la fagocitosis y bloquear el crecimiento tumoral in vivo fue sorprendente e inesperada. Trabajo anterior sugería que únicamente los anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores serían capaces de inhibir el crecimiento tumoral in vivo (véase Yanagita, T. et al. (2017) JCI Insight 2:e89140).
Ejemplo 4: Análisis estructural de epítopos de anticuerpo anti-SIRP-a en SIRP-a
Tal como se describió en los ejemplos 1-3 anteriores, se han generado anticuerpos anti-SIRP-a con una variedad de especificidades y modos de unión a SIRP-a, por ejemplo, anticuerpos que bloquean la unión de CD47 a SIRP-a, anticuerpos que no bloquean la unión de CD47 a SIRP-a y anticuerpos que se unen a SIRP-a y reducen su afinidad de unión a CD47 (anticuerpos de partida). Se realizaron análisis estructurales con el fin de comprender cómo estos tipos de anticuerpos se unen al dominio D1 de SIRP-a en comparación con CD47 y caracterizar los epítopos de anticuerpos anti-SIRP-a seleccionados.
Métodos
Cristalografía y análisis estructural
La expresión de Fabs y SIRPa fue similar a protocolos previamente establecidos e involucró métodos tradicionales de cromatografía por afinidad y exclusión molecular para la purificación de proteínas. Se usó una SIRP-a v i humana con una mutación N80A en comparación con la s Eq ID NO: 5 por su facilidad para producir proteínas en Expi293 (SEQ ID NO: 296). El fin de usar una SIRPa N80A fue producir una forma homogénea y no glucosilada de SIRPa que sería más adecuada para cristalización. El tampón de purificación final es mínimo, con únicamente Tris l0 mM, pH 7,5, y NaCl 50 mM. La muestra de complejo purificado se mantiene estable a 4 °C y se concentró a 10-12 mg/ml en la preparación de experimentos de cristalización y la eventual determinación de estructura.
Los métodos para el proyecto de complejo de Fab:SIRPa siguieron principios establecidos de cristalografía a partir de la técnica de matriz dispersa, lo cual llevó a condiciones optimizadas adaptadas que establecen un protocolo de rutina. La cristalización se llevó a cabo con la técnica de difusión de vapor por goteo en reposo. Para el análisis de matriz de dispersión inicial, se utilizaron kits de acondicionamiento comercialmente disponibles de Qiagen® (Tabla J2). Dichos experimentos de cristalización se configuraron en gotas con diferentes relaciones de proteína a cristalizante. Las relaciones determinadas se encontraron en el rango de 1:1, 2:1 y 3:1 de proteína a acondicionar en un volumen total de 1 pL en los subpocillos de la bandeja de 96 pocillos (8 x 12). Se colocaron 100 ul de condición de cristalización en el depósito de pocillo. Dichas gotas se configuran mediante un robot de configuración de gota Mosquito y las placas completas se sellaron y se almacenaron en una incubadora a 12°C . Se monitoreó el experimento mediante observación de las placas/gotas en microscopio para ver el desarrollo que incluye precipitación, agregado, separación de fase, formación amorfa, así como cristales proteicos iniciales.
Tabla J2. Kits usados para análisis de matriz dispersa inicial.
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Resumen de cristalización y cosecha de cristales
Se logró la cristalización de los 4 complejos con obtenidos de dos condiciones principales, tal como se muestra en la Tabla J3. La cosecha de cristales se llevó a cabo en formas de cristales óptimas, de forma que la manipulación y la crioconservación en nitrógeno líquido no pusieran en peligro la integridad del cristal antes de su análisis mediante difracción de rayos X y la posible recopilación de datos. Para prevenir la formación de hielo, se implementó un crioprotector durante el congelamiento. El crioprotector usual incluyó una adición de glicerol al 20 % a la condición de cristalización que formó el cristal. Cuando se formaron cristales en condiciones con PEG 4000 30 % o más, no fue necesaria la adición de glicerol. El porcentaje elevado de PEG 4000 actuó como un crioprotector viable. Los cristales de complejos se manipularon con CryoLoops de nylon o de estilo Mitigen®. Se aislaron cristales individuales y se escindieron de la gota en la que se formaron y se transfirieron a crioprotector durante un período de tiempo breve antes de sumergirlos en nitrógeno líquido para su congelamiento ultrarrápido.
Tabla J3. Condiciones de cristalización para formar cristales de complejo Fab:SIRP-a.
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Recopilación y procesamiento de datos
Se recopilaron datos de los cristales congelados de forma ultrarrápida en nitrógeno líquido tal como se describió anteriormente. Estas muestras permanecieron en condiciones de criogenia cuando se exploraron para determinar difracción de retícula proteica antes de la posterior recolección de datos mediante método de oscilación. La recolección se produjo ya sea en la fuente de fotones avanzada o en la fuente de iluminación de diamante. Los conjuntos de datos se redujeron mediante el uso de la suite xia2. La suite xia2 es un script de envoltura que hace posible la reducción automática de los datos cristalográficos macromoleculares. El programa puede utilizar múltiples programas de reducción de datos, tales como XDS, DIALS, MOsfilm y Aimles. Estos programas permiten indexar los datos de difracción en los grupos espaciales y celdas unitarias adecuados, la integración de intensidades y el escalamiento para producir un estimado de intensidad de cada reflejo único. En el caso del conjunto de datos de complejo 1 inicial, las fases se calcularon mediante reemplazo molecular (MR) con Phaser MR de la suite CCP4 que utiliza modelos homólogos de SIRPa, así como Fab (véanse código PDB: 2UV3 y código PDB: 4NM4, respectivamente). En el caso de los conjuntos de datos posteriores de complejos 2, 3 y 4, las coordenadas del modelo estructural completo de complejo 1 se usaron como modelo de búsqueda para el cálculo de fase y la construcción del modelo inicial.
Construcción de estructura y refinamiento.
La construcción de modelos empleó el programa Coot. Por ejemplo, se calculó que el complejo 1 tiene 4 moléculas en ASU y, por consiguiente, se deben construir 4 pares de AB119f en complejo con SIRPa para completar el modelo de estructura. La estrategia de construcción de estructuras fue la construcción de restos aminoácidos en densidad de electrones conforme a la secuencia conocida de las proteínas diana. La calidad de los datos se relaciona directamente con el ajuste del modelo de estructura en el conjunto de datos de cristales observados. Por consiguiente, la construcción de la estructura terciaria del complejo siguió el protocolo establecido. Inicialmente, se construyó la columna peptídica del resto. Luego, se colocaron las cadenas laterales de restos correctas, si el mapa de densidad de electrones lo permite. En el caso de que no se modelara un aminoácido original en la secuencia proteica, esto se debería a la carencia de densidad para la cadena lateral respectiva, por lo que solamente es posible modelar la estructura peptídica del aminoácido y se construye en el lugar una cadena lateral de restos alanina. Tramos de la secuencia pueden ser regiones desordenadas que no se pueden construir debido a carencia de densidad, incluso para loa ubicación de la estructura de aminoácidos. Luego de la construcción, siguieron rondas posteriores de refinamiento mediante el programa Refmac, una parte de la suite CCP4. El programa de refinamiento se utiliza para minimizar parámetros de coordenadas a través de los restos de máxima probabilidad. Se finalizó el refinamiento cuando los parámetros del modelo quedaron comprendidos dentro de tolerancias estadísticas favorables para parámetros que incluyen: el valor R, la longitud y los ángulos de enlace, y el ajuste de Ramachandran. Además, para comprobar las tolerancias físicas del modelo, también se utilizó Molprobity para garantizar la determinación de una estructura completa y adecuada.
Mapeo de epítopos y análisis de superposición
Se calculó el área superficial no expuesta del antígeno para el epítopo como la diferencia entre el área superficial accesible para el solvente del antígeno solo y el antígeno en complejo con fragmento Fab del anticuerpo. Por el contrario, el área superficial no expuesta de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo para el parátopo se calculó como la diferencia entre el área superficial accesible para el solvente del fragmento Fab solo y en complejo con su antígeno. El área superficial accesible se calculó mediante el método de rodamiento con un radio de sonda de 1,4 A. El área superficial no expuesta se informa en A2. Todos los complejos de anticuerpo:SIRPa se superponen mediante la selección de SIRPa de cada estructura y la superposición de sus átomos de carbono. CD47: La estructura de complejo de CD47:SIRPa (variante V1) usada para el análisis es PDB:4CMM. La superposición y el cálculo de RMSD se llevaron a cabo con PYMOL.
Resultados
En primer lugar, se determinó la estructura del anticuerpo bloqueador 119 unido por Fab a SIRP-a y se comparó con la unión de CD47 a SIRP-a. Tal como se muestra en la FIG. 17A, el anticuerpo 119 y CD47 se une a un epítopo similar del dominio D1 de SIRP-a. El 56 % de los restos de SIRP-a en el epítopo de anticuerpo 119 también se encontró en el epítopo CD47, mientras que 75 % de los restos de SIRP-a en el epítopo CD47 también se encontró en el epítopo de anticuerpo 119. Los restos de SIRP-a que participan en la interacción con el anticuerpo 119 (determinados por los cambios en el área superficial no expuesta anteriormente descritos) se sombrean y se muestran como modelos con espacios rellenos en la FIG. 17B. También se muestran los restos clave del parátopo de Fab de anticuerpo 119 (barras negras), lo que incluye los restos de cadena pesada N31, S53, D55, Y57, T99, S101 y W102 (N31 no se encuentra visible en la orientación de estructura que se muestra en la FIG. 17B) y los restos de cadena ligera Y92 y W94 (con base en las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de acuerdo con las SEQ ID NO: 335 y 97, respectivamente).
La figura 18A muestra una comparación entre la unión de CD47 al dominio D1 de SIRP-a y de Fab de anticuerpo no bloqueador 136 al dominio D1 de SIRP-a. Se observó que los epítopos de unión de SIRP-a del anticuerpo 136 y CD47 no se superpusieron. Los restos de SIRP-a que participan en la interacción con el anticuerpo 136 se sombrean y se muestran como modelos con espacios rellenos en la FIG. 18B. También se muestran los restos clave del parátopo Fab de anticuerpo 136 (barras negras), lo que incluye los restos de cadena pesada E56, Y59 y R102 y los restos de cadena ligera Y92 y R94 (con base en las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de acuerdo con las SEQ ID NO: 133 y 134, respectivamente).
La figura 19A muestra una comparación entre la unión de CD47 al dominio D1 de SIRP-a y de Fab de anticuerpo no bloqueador 3 al dominio D1 de SIRP-a. También se observó que los epítopos de unión de SIRP-a del anticuerpo 3 y CD47 no se superpusieron. Los restos de SIRP-a que participan en la interacción con el anticuerpo 3 se sombrean y se muestran como modelos con espacios rellenos en la FIG. 19B. También se muestran los restos clave del parátopo Fab de anticuerpo 3 (barras negras), lo que incluye los restos de cadena pesada R56 y G100 y los restos de cadena ligera R24, R26, Y86 y G88 (con base en las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de acuerdo con las SEQ ID NO: 242 y 243, respectivamente).
La figura 19C muestra una comparación entre la unión de CD47 al dominio D1 de SIRP-a y de Fab de anticuerpo de partida 115 al dominio D1 de SIRP-a. Se observó que el epítopo de unión a SIRP-a del anticuerpo 115 se encontraba adyacente al epítopo de CD47. Aunque se observó que el mAb 115 se unía al dominio D1 de SIRP-a adyacente al de CD47, es probable que partes del epítopo 115 se superpongan con CD47 en sí mismo. Al comparar ambos epítopos, existen 2 restos idénticos, lo que sugiere que las interacciones de las partes no superpuestas de cada epítopo permiten la unión de Fab 115 y CD47 a SIRP-a de forma simultánea. Los análisis cinéticos descritos en el presente documento demuestran que el anticuerpo 115 forma un complejo transitorio con SIRP-a y CD47, pero reduce la afinidad de CD47 por el dominio D1 de SIRP-a. Los restos de SIRP-a que participan en la interacción con el anticuerpo 115 se sombrean en la FIG.
19D. También se muestran los restos clave del parátopo Fab de anticuerpo 115, lo que incluye los restos de cadena pesada S31, Y32, N52, Y100 y W102 y los restos de cadena ligera K32 y Y92 (con base en las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de acuerdo con las SEQ ID NO: 273 y 274, respectivamente).
La figura 20A muestra los anticuerpos de unión 119, 136, 3 y 115 a SIRP-a, en comparación con la unión de CD47 a SIRP-a. Se observó que el anticuerpo bloqueador 119 se unía a un epítopo de SIRP-a totalmente no superpuesto, en comparación con los epítopos de SIRP-a de ambos anticuerpos no bloqueadores 136 y 3. Los restos de anticuerpo y SIRP-a que participan en dichas interacciones se resumen en la Tabla K1. Se determinó que los restos de SIRP-a que interactuaron con CD47 fueron los siguientes: 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 50, 51, 52, 53, 54, 66, 67, 68, 69, 74, 93, 96, 97, 98, 99 y 101 (de acuerdo con la SEQ ID NO: 5). La figura 20B resumen los epítopos de CD47 y Fab anti-SIRP-a 119, 136, 3 y 115 que se unen a SIRP-a (restos de acuerdo con la SEQ ID NO: 296) y enumera cambios de área superficial no expuesta. Tal como se describió en el presente documento, la numeración de los restos aminoácidos de un anticuerpo usada para indicar el parátopo se basa en la numeración de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o ligera, y no, por ejemplo, en la numeración de Kabat o Chothia de los restos del anticuerpo.
Figure imgf000117_0001
Tabla K2. Parátopos de anticuerpo anti-SIRP-a y cálculos de área superficial no expuesta.
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continuación
Figure imgf000119_0001
continuación
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Estos resultados muestran las interfaces de unión entre el dominio D1 de SIRP-a y varios anticuerpos anti-SIRP-a, así como la interfaz de unión entre CD47 y SIRP-a. También proporcionan la base estructural para las observaciones de que el anticuerpo 119 bloquea la unión entre CD47 y SIRP-a (dado que comparten epítopos de SIRP-a superpuestos), que los anticuerpos 136 y 3 no bloquean la unión (dado que sus epítopos no se superponen con los de CD47) y que el anticuerpo 115 produce la "partida de CD47" de la unión a SIRP-a (dado que comparten epítopos de SIRP-a que solo se superponen levemente). Estos ensayos destacan adicionalmente restos de SIRP-a y anticuerpos específicos que participan en cada interacción. Cuando se definen los epítopos de unión de SIRPa de anticuerpos no bloqueadores (3, 136), bloqueadores (119) y de partida (115) mediante cristalografía, es posible caracterizar las ubicaciones de unión de anticuerpos anti-SIRPa adicionales mediante la asignación de epítopos a grupos que se describe en el ejemplo 5. Por ejemplo, en el caso de cualesquiera anticuerpos anti-SIRPa que compiten con el no bloqueador 136 por la unión a SIRPa, es posible predecir que dichos anticuerpos compartirían epítopos de unión similares a 136 según se define mediante cristalografía.
Ejemplo 5: Agrupamiento de epítopos de anticuerpos anti-SIRP-a
Los anticuerpos anti-SIRP-a anteriormente descritos se sometieron a ensayos en experimentos de agrupamiento de epítopos con SIRP-a para categorizar anticuerpos con epítopos compartidos y diferentes. Métodos
Agrupamiento de epítopos
En pocas palabras, el agrupamiento de epítopos se llevó a cabo tal como se muestra en la FIG. 21A. Se inmovilizó un primer anticuerpo anti-SIRP-a en un chip y después se inyectó SIRP-a v1 humana (SEQ ID NO: 5). Luego, se inyectó un segundo anticuerpo anti-SIRP-a. Si el segundo anticuerpo fuera capaz de unirse al complejo formado entre el primer anticuerpo anti-SIRP-a y SIRP-a, se determinaría que el primer y el segundo anticuerpo se unen a epítopos diferentes. Si el segundo anticuerpo no fuera capaz de unirse, se determinaría que el primer y el segundo anticuerpo compartirían un epítopo.
Ejemplos de resultados de un ensayo de agrupamiento con anticuerpo anti-SIRP-a (A) inmovilizado en el chip y la inyección de anticuerpos anti-SIRP-a (B-F) se muestran en la FIG. 21B. El anticuerpo anti-SIRPa (B), (E) y (F) forma sándwiches con el complejo y el aumento de UR a 60 segundos indica esto (luego de la inyección de anticuerpos anti-SIRPa respectivos). De esa forma, se determina que se unen a epítopos diferentes que anti-SIRPa (A) y se indican con recuadros blancos en la gráfica de agrupamiento (FIG. 22A y 22B). En el caso de anticuerpos anti-SIRPa (C) y (D), no formaron un sándwich y UR estable luego de la inyección de anticuerpos anti-SIRPa respectivos lo indica. De esa forma, se determina que se unen al mismo epítopo que anti-SIRPa (A) y se indican con sombreado gris en la gráfica de agrupamiento (FIG. 22A y 22B). El número de clon para el ligando (anti-SIRPa) unido al chip se indica como filas y el número de clon para los analitos (anti-SIRPa) inyectados en el chip se indica como columnas en las FIG. 22A y 22B. "X" indica casos en los que los datos de una orientación discrepan de los de la otra.
En primer lugar, se inmovilizaron anticuerpos anti-SIRPa en chips de GLC con un kit de acoplamiento de aminas de Proteon tal como se describió anteriormente. En pocas palabras, para la etapa de inmovilización, se activó el chip de GLC con EDAC/Sulpho-NHS 1:1 (Biorad) en dilución 1/80 durante 300 segundos a 25 pl/min. Se diluyeron anticuerpos anti-SIRPa a una concentración de 80 nM en tampón de acetato de sodio 10 mM a pH 4,5 y se inmovilizaron en el chip a 30 pl/min durante 50 segundos. El chip se inactivó con etanolamina durante 300 segundos a 25 pl/min. Luego, se inyectó SIRP-a v1 (SEQ ID NO: 5, 100 nM) en primer lugar a 100 ul/min durante 60 segundos, seguido de la inyección de anticuerpos anti-SIRP-a en ensayo (100-150 nM) a 100 ul/min durante 60 segundos. Las superficies se regeneraron con una mezcla 2:1 v/v de tampón de elución de IgG de Pierce/NaCl 4 M. Los sensogramas resultantes se usaron para calificar y agrupar los anticuerpos en grupos diferentes de acuerdo con sus perfiles de unión.
Resultados
Los siguientes clones de anticuerpo anti-SIRP-a se asignaron a grupos: 3, 21, 25, 27, 45, 66, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 132, 135, 136, 137, 149, 161, 162, 173, 194, 209, 213 y 218. Tal como se muestra en las FIG. 22A y 22B, los resultados demostraron que cada modo de anticuerpo anti-SIRP-a (B: bloqueador, NB: no bloqueador y KO: de partida) unido a SIRP-a v1 humana se agrupó de forma independiente. En el caso de no bloqueadores, los anticuerpos anti-SIRPa se podrían separar adicionalmente en 4 grupos con base en sus perfiles de unión. Por ejemplo, los anticuerpos anti-SIRPa 123, 149, 161, 162, 194 y 218 se agruparon como Grupo 5. Los anticuerpos anti-SIRPa 3, 173, 209 y 213 se agruparon como Grupo 4. Los anticuerpos anti-SIRPa 136 y 137 se agruparon como Grupo 2. El anticuerpo anti-SIRPa 45 tiene un perfil de unión único y se agrupa como Grupo 6.
En combinación con los análisis estructurales descritos en el ejemplo 4, estos resultados llevan al modelo de unión de anticuerpo y CD47 al dominio D1 de SIRP-a que se muestra en la FIG. 23. Por ejemplo, se propone que varios anticuerpos anti-SIRPa en los Grupos 1, 2, 3 y 4 comparten epítopos de unión similares con anti-SIRPa 119, 136, 115 y 3 que se categorizan en los grupos respectivos. Los epítopos de unión para anti-SIRPa 119, 136, 115 y 3 se obtienen de soluciones cristalinas tal como se describe en el ejemplo 4.
Además, se propone que los anticuerpos anti-SIRPa en el Grupo 5 se unen de forma adyacente a anti-SIRPa 136 (Grupo 2) y 115 (Grupo 3) respectivamente y comparten epítopos superpuestos. Esto se basa en datos de agrupamiento que muestran que los anticuerpos anti-SIRPa en el Grupo 5 compitieron con los anticuerpos en los Grupos 2 y 3 por la unión a SIRPa V1 y no compitieron con los anticuerpos en los Grupos 1, 4 y 6 (FIG. 22B).
Se propone que el anticuerpo anti-SIRPa 45 (Grupo 6) se une de forma adyacente a anti-SIRPa 3 (Grupo 4) y 136 (Grupo 2) respectivamente y comparte epítopos superpuestos. Esto se basa en datos de agrupamiento que muestran que los anticuerpos anti-SIRPa 45 compitieron con los anticuerpos en los Grupos 2 y 4 por la unión a SIRPa V1 y anti-SIRPa 45 no compitió con los anticuerpos en los Grupos 1, 3 y 5 (FIG. 22B).
El modelo en la FIG. 23 ilustra el epítopo de cada grupo de anticuerpos con base en análisis estructurales y de agrupamiento, y demuestra la superposición entre varios grupos de anticuerpo con ejemplos de clones de anticuerpos. Los anticuerpos anti-SIRP-a aislados en el presente documento se agrupan en familias y grupos con base en sus perfiles de mapeo de epítopos, homologías en sus secuencias de dominio VH/VL, especificidades de unión a proteínas SIRP y las fuentes de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-SIRP-a en la familia 1/Grupo 1 son bloqueadores de CD47 que comparten homologías de secuencia elevadas en sus dominios VH y VL (Tabla P y FIG. 11J). VH y VL son secuencias completamente humanas. Los anticuerpos anti-SIRP-a en la familia 2/Grupo 1 también son bloqueadores de CD47. Sus VH y VL comparten homologías elevadas y son de fuentes humanas y de pollo, respectivamente (Tabla P, FIG. 11A). Los anticuerpos anti-SIRP-a en la familia 3/Grupo 2 incluyen no bloqueadores de CD47 y sus VH/VL muy homólogas son secuencias completamente humanas (Tabla P, FIG. 11B). Los anticuerpos anti-SIRP-a en la familia 4/Grupo 3 incluyen anticuerpos de partida y sus VH/VL muy homólogas son secuencias completamente humanas (Tabla P, FIG. 11C). La familia 5 incluye no bloqueadores de CD47 que se mapean independientemente en los Grupos 4, 5 y 6. Las alineaciones de secuencias de dichos anticuerpos y sus perfiles de unión se muestran en las FIG. 11D-11I y la Tabla P, respectivamente. Los valores de unión de Koff de varios polipéptidos SIRP-a, SIRP-p y SIRP-y de los anticuerpos anti-SIRPa correspondiente en las familias 1-5 se presentan en la Tabla T.
Ejemplo 6: Variantes de mutación de riesgo y línea germinal de anticuerpos anti-SIRP-a
Algunos anticuerpos anti-SIRP-a descritos anteriormente son anticuerpos completamente humanos generados en un pollo (por ejemplo, anticuerpos 119, 135 y 136). De esa forma, algunos de dichos anticuerpos pueden contener mutaciones en las secuencias armazón de dominio variable, en comparación con secuencias de línea germinal humana de tipo silvestre, en virtud de la generación de dichos anticuerpos en linfocitos B de pollo. Por consiguiente, es conveniente una retromutación de dichos restos respectivos para corresponder a una secuencia de línea germinal humana con el fin de limitar la inmunogenicidad cuando se evalúan dichos anticuerpos anti-SIRPa en humanos como posibles agentes terapéuticos. Además de las retromutaciones de línea germinal, se analizaron las CDR y regiones armazón de los anticuerpos 119, 135 y 136 para determinar la probabilidad de puntos clave. Estos análisis identificaron sitios en los que puede ser conveniente realizar modificaciones para limitar el riesgo debido a modificaciones que se pueden producir durante la fabricación, almacenamiento y/o desarrollo de fármaco de los anticuerpos anti-SIRPa.
Métodos
Mutaciones de riesgo/línea germinal
Se determinaron las Kd para las mutaciones de riesgo y de línea germinal que se unen a SIRP mediante inmovilización directa con chip de GLC tal como se describió anteriormente.
Los anticuerpos mutantes y de tipo silvestre se expresaron en Expi293 y se purificaron mediante cromatografía en columna de afinidad de proteína A tal como se describió anteriormente. Todos los anticuerpos se expresaron como anticuerpos Fc de IgG1 de humanos L234A/L235A/G237A/N297A. La mutagénesis se llevó a cabo con un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightning Site Directed Mutagenesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante (n.° de catálogo Agilent 210518).
Resultados
Se evaluaron los anticuerpos 119, 135 y 136. Secuencias de anticuerpos seleccionadas se alinearon con secuencias de líneas germinales humanas disponibles con IgBlast (NCBI). Por ejemplo, se identificó un total de 7 sitios en las cadenas pesada y ligera de 119. Tal como se muestra en la FIG. 24A, los restos no comúnmente presentes en la secuencia de línea germinal de VH de 119 (por ejemplo, D1, E43 y L112) se sometieron a retromutación para corresponder a la secuencia de línea germinal humana (por ejemplo, D1E, E43K y L112Q) mientras que se mantienen las secuencias de CDR intactas. En el caso de VL de 119 (FIG.
24B), los restos no comúnmente presentes en la secuencia de línea germinal humana de VL de 119 (por ejemplo, F21, R39, E60 y T76) se sometieron a retromutación para corresponder a la secuencia de línea germinal (por ejemplo, F21L, R39K, E60A y T76S) mientras que las secuencias de CDR se mantienen intactas. Tal como se usan en el presente documento, las expresiones "all mut" y "mut" hacen referencia a dominios variables que contienen todas las mutaciones de línea germinal descritas en el presente documento para un dominio variable de anticuerpo particular. Las numeraciones de aminoácidos usadas para describir las mutaciones de riesgo y línea germinal se basan en la numeración secuencial de acuerdo con las identificaciones de secuencia respectivas.
Además, también se analizaron las secuencias de anticuerpo para determinar puntos clave de riesgo, lo que incluye restos que pueden ser susceptibles de oxidación, desamidación, isomerización, hidrólisis y glucosilación a N. Se indican posibles puntos clave en la Tabla L. En particular, se generaron las variantes M34V y M34L de HVR-H1 para el dominio VH de múltiples anticuerpos.
Tabla L. Puntos clave posibles y conocidos
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Se generaron variantes de anticuerpo 119 con dominios variables de cadena pesada y/o ligera con retromutaciones de riesgo y de línea germinal. Se generó un dominio VH mutante ("mut") 119 con las retromutaciones de línea germinal D1E, E43K y L112Q, así como mutaciones de M34V en CDR-H1 que remueven un resto de metionina que se podría oxidar (véase la SEQ ID NO: 246 para las secuencias de VH). Otra variante se generó con las retromutaciones de línea germinal D1E, E43K y L112Q (véase SEQ ID NO: 258 para la secuencia VH). Las alineaciones entre las secuencias parentales y variantes se muestran en la FIG. 24A. También se generó una cadena ligera mutante (mut) 119 con las retromutaciones de línea germinal F21L, R39K, E60A y T76S. Se muestra un alineamiento entre la secuencia parental y la secuencia variante en la FIG. 24B.
Las variantes de anticuerpo 119 con la cadena pesada y/o ligera mutante se compararon con el anticuerpo 119 parental con una región Fc de IgG1 con las mutaciones L234A, L235A, G237A y N297A (numeración EU) y un anticuerpo 119 parental con una región Fc de IgG4 con una mutación S228P (numeración EU), para determinar la afinidad de unión a SIRP-a v1 humana (SEQ ID NO: 5), SIRP-a v2 humana (SEQ ID nO: 6) y SIRP-a de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 11). Se observó que tanto las cadenas pesadas como ligeras mutantes de 119 provocaron reducciones leves de afinidad de unión a las tres proteínas SIRP-a. Sin embargo, la variante de anticuerpo 119 con cadenas pesada y ligera mutadas presentó unión fuerte a ambas proteínas SIRP-a humanas con una Kd de aproximadamente 30 nM (Tabla M). En comparación con el anticuerpo parental, el rendimiento de la variante de anticuerpo 119 con cadenas pesada y ligera mutadas también se redujo aproximadamente 4,5 veces (Tabla M).
Se generaron mutaciones simples M34V y M34L en la referencia de tipo silvestre de VH de 119 y se combinaron con la cadena ligera de tipo silvestre de 119 para investigar el efecto de la metionina en HVR-H1 en la unión a SIRPa 119. Tanto wt 119/wt_M34V como 119 wt/wt_M34L tuvieron afinidades comparables (Kd , M) a SIRPa v1 y v2 humanas en comparación con 119 wt/wt. Esto indica que el resto M34 no es crítico para la unión a SIRP-a y se puede sustituir con mutaciones M34L o M34V. Las secuencias de VH correspondientes para mutaciones simples de M34V y M34L generadas en la referencia de tipo silvestre de VH de 119 fueron las SEQ ID NO: 421 y 420, respectivamente.
Tabla M. Afinidades de unión (Kd , M) de anticuerpos de variante 119 a proteínas SIRP-a humana y cyno
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NT = no evaluado
Luego, se generaron variantes similares del anticuerpo 135. Se generó una cadena pesada mutante ("mut") 135 con las retromutaciones de línea germinal D1E, R13Q, E16G, E43K y L112Q, así como la mutación M34V en CDR-H1 que remueve un resto de metionina que se podría oxidar (véase la SEQ ID NO: 247 para la secuencia de VH). Se construyó una variante similar sin la mutación M34V en CDR-H1 (véase SEQ ID NO: 259 para la secuencia VH). Se generó una cadena ligera (mut) mutante 135 con las retromutaciones de línea germinal F21L y D60A (véase SEQ ID NO: 248 para la secuencia VL). Las alineaciones entre las secuencias parentales y variantes se muestran en las FIG. 25A y 25B.
Las variantes de anticuerpo 135 con la cadena pesada y/o ligera mutante se compararon con el anticuerpo 135 parental para determinar la afinidad de unión a SIRP-a v1 humana (SEQ ID NO: 5), SIRP-a v2 humana (SeQ ID NO: 6), SIRP-a de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 11) y SIRP-y v1 humana (SEQ ID NO: 15). Las cadenas pesada y ligera mutantes 135 tuvieron afinidad de unión comparable para las cuatro proteínas SIRP-a, así como rendimientos comparables (Tabla N1).
Se generaron mutaciones simples M34V y M34L en la referencia de tipo silvestre de VH 135 y se combinaron con la cadena ligera de tipo silvestre 135 para investigar el efecto de la metionina en HVR-H1 de 135 en la unión a SIRP-a. Tanto wt 135/wt_M34V como 135 wt/wt_M34L tuvieron afinidades comparables (Kd , M) a SIRPa v1 y v2 humanas en comparación con 135 wt/wt. Esto indica que el resto M34 no es crítico para la unión a SIRP-a y se puede sustituir con una mutación M34L o M34V. Las secuencias de VH correspondientes para mutaciones simples de M34V y M34L generadas en la referencia de tipo silvestre de VH de 135 fueron las SEQ ID NO: 423 y 422, respectivamente.
Tabla N1. Afinidades de unión (Kd , M) de anticuerpos variantes 135 a proteínas SIRP-a humana y cyno y proteína SIRP-y humana
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NT = no evaluado
Se generaron variantes similares del anticuerpo 136. Se generó una cadena pesada mutante ("mut") 136 con las retromutaciones de línea germinal D1E, R13Q, E16R, E43K y L111Q, así como la mutación M34V en CDR-H1 que remueven un resto de metionina que se podría oxidar (véase la SEQ ID NO: 249 para la secuencia de VH). Se construyó una variante similar sin la mutación M34V en CDR-H1 (véase SEQ ID NO: 260 para la secuencia VH). Se generó una cadena ligera (mut) mutante 136 con las retromutaciones de línea germinal T2I, T12S, T22s y E38Q (véase SEQ ID NO: 25o para VL). Las alineaciones entre las secuencias parentales y variantes se muestran en las FIG. 26A y 26B.
Tal como se muestra en la FIG. 27A, las variantes de anticuerpo 136 con la cadena pesada y/o ligera mutante se compararon con el anticuerpo 136 parental (wt) como IgG1_AAA_N297A en cuanto a afinidad de unión a SIRP-a v i humana (SEQ ID NO: 5), SIRP-a v2 humana (SEQ ID NO: 6), SIRP-a de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 11), SIRP-a de ratón NOD (SEQ ID NO: 8), SIRP-a de ratón BL/6 (SEQ ID NO: 9) y SIRP-a de ratón BALB/c (s Eq ID NO: 10). En la Figura 27A, el eje Y muestra la relación KDmut/KDwt de unión a varias SIRP. Si la relación fuera 1, indicaría la ausencia de cambio en Kd en comparación con la unión a anticuerpo parental. Si la relación fuera mayor o igual que 1 y menor que 1, indicaría afinidad de unión a SIRPa con reducción y aumento en comparación con el anticuerpo parental. Aunque el anticuerpo 136 wt (VL)/mut (VH) se comportó de manera similar a wt (VL)/wt(VH), ambas variantes con la cadena ligera mutada presentaron afinidades de unión más débiles, lo que indica falta de tolerancia a algunas mutaciones de VL.
Para analizar el efecto de cada retromutación de cadena ligera en la afinidad de unión, se construyeron variantes de anticuerpo 136 adicionales y se caracterizaron por su afinidad de unión a SIRP-a de ratón BL/6 (SEQ ID NO: 9), SIRP-a de ratón NOD (SEQ ID NO: 8), SIRP-a de ratón BALB/c (SEQ ID NO: 10), SIRP-a v1 humana (SEQ ID NO: 5), SIRP-a v2 humana (SEQ ID NO: 6), SIRP-a de mono cynomolgus (SeQ ID NO: 11) y SIRP-y v1 humana (SEQ ID NO: 15). Se revirtió cada mutación individual a partir de la referencia con mutaciones totales. Se evaluaron individualmente las mutaciones I2T, S12T, S22T y Q38E en cadenas ligeras con mutaciones totales en otro respecto, tal como se muestra en la FIG. 27B. La mutación I2T en una referencia con mutaciones totales en otro respecto presentó una afinidad de unión consistentemente similar en comparación con el anticuerpo wt/wt parental (véanse la SEQ ID NO: 251 por I2T en referencia con mutaciones totales y la FIG. 27A para anticuerpos 136 parentales y mutantes). Sin embargo, las otras tres retromutaciones (S12T, S22T y Q38E) presentaron consistentemente afinidades de unión más similares a mut/mut 136, lo que indica que la mutación T2I es responsable por la reducción de afinidad de unión a varias proteínas SIRP. Se proporcionan datos adicionales de dichos experimentos en la Tabla Q que se encuentra más adelante.
Tabla N2. Afinidades de unión (Kd , M) de anticuerpos variantes 136 a proteínas SIRP-a humana, de ratón y cyno y proteína SIRP-y humana
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Ejemplo 7: Humanización de anticuerpos anti-SIRP-a
Los ejemplos anteriores describen la generación de anticuerpos anti-SIRP-a con una cadena pesada completamente humana y una cadena ligera de pollo. Para humanizar las cadenas ligeras obtenidas de pollo, se realizaron injertos de HVR de pollo de dichos anticuerpos en varios armazones de cadena ligera lambda humanos.
Métodos
Humanización
Los anticuerpos se humanizaron mediante técnicas estándares Para medir el rendimiento de producción, se purificaron volúmenes iguales de cultivos de Expi293 que expresan anticuerpos anti-SIRPa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. Luego del intercambio de tampón en PBS, se determinó la concentración de proteína mediante A280 y se expresó en mg/ml.
Resultados
Se alineó cada secuencia de cadena ligera de pollo al armazón de línea germinal humana más cercano mediante IgBLAST (NCBI) con el fin de diseñar cadenas ligeras humanizadas. Conforme a dicho análisis, el resultado más próximo al armazón de cadena ligera lambda de pollo es IGLV3 humano (véanse las SEQ ID NO: 314-317).
En otro enfoque, se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica para determinar las secuencias armazón de cadena ligera lambda humana óptimas para aparear con secuencias de VH3 humanas (la cadena pesada humana usada para estos anticuerpos). Con base en dichos análisis, se cree que la VH3 humana se aparearía bien con IGLV1 e IGLV2 humanas. Véase Glanville, J. et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci.
106:20216-20221; Lloyd, C. et al. (2009) Protein Eng. Des. Sel. 22:159-168; y Jayaram, N. et al. (2012) Protein Eng. Des. Sel. 25:523-529.
Por consiguiente, se crearon seis cadenas ligeras humanizadas: Hum1 (armazón de IGLV3 humana HVR de AB25), Hum2 (armazón de IGLV1 humana HVR de AB25), Hum3 (armazón de IGLV3 humana HVR de AB66), Hum4 (armazón de IGLV1 humana HVR de AB66), Hum5 (armazón de IGLV2 humana HVR de AB25) y Hum6 (armazón de IGLV1 humana HVR de AB21). Las secuencias de los dominios variables de cadena ligera resultantes se proporcionan en la Tabla O1.
Tabla O1. Secuencias de dominios de cadena ligera variable humanizada evaluadas. Las secuencias de HVR se indican en negrita y subrayadas.
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continuación
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Cada una de las 6 cadenas ligeras humanizadas se emparejó con cada una de las cuatro cadenas pesadas (obtenidas de AB21, AB25, AB27 y AB66), lo que genera 24 anticuerpos únicos. Los anticuerpos se expresaron como se describió anteriormente. Sorprendentemente, las secuencias armazón de IGLV1 humanas produjeron una reducción de la expresión del anticuerpo independientemente de la cadena pesada. Esto hace referencia a todos los apareamientos de cadena pesada con Hum2, Hum4 y Hum6 (excepto cuando el apareamiento se lleva a cabo con una cadena pesada de AB66). Los resultados se resumen en la FIG. 28 como "rendimiento proteico" (fila 1). En contraste, los anticuerpos con cadenas ligeras que incluyen armazones de IGLV2 e IGLV3 humanas (Hum 1, Hum3, Hum5) presentaron niveles mayores de expresión independientemente de la cadena pesada.
Luego, se caracterizaron anticuerpos seleccionados conforme a su unión a una variedad de proteínas SIRP (por ejemplo, a SIRP-a v i humana, SIRP-a v2 humana, SIRP-a de mono cynomolgus, SIRP-a de mono BALB/c y SIRP-y humana). Estos datos también se resumen en la FIG. 28. Cadenas ligeras humanizadas seleccionadas provocaron una reducción de la unión a uno o más antígenos. Por ejemplo, se observó que el armazón de IGLV3 humana (representado por Humi y Hum3) permite niveles superiores de producción de anticuerpo sin perturbar la afinidad de unión. Por ejemplo, dominios variables de cadena ligera con los armazones IGLV3 y las secuencias de HVR ya sea de anticuerpo 25 o anticuerpo 66 (representadas por Humi y Hum3, respectivamente) se combinaron bien con una variedad de cadenas pesadas (por ejemplo, dominios variables pesados de los anticuerpos 21, 25, 27 y 66) y presentaron unión similar a proteínas SIRP-a y SIRP-y diferentes. En contraste, se determinó que los armazones de IGLV1 e IGLV2 (representados por Hum2, Hum4, Hum5 y Hum6) redujeron la expresión y/o redujeron la unión a SIRP cuando se emparejaron con cadenas pesadas de anticuerpos 21, 25, 27 y 66. Se proporcionan datos de unión adicionales de dichos experimentos en la Tabla R que se encuentra más adelante. El armazón de IGLV3 humana se seleccionó para evaluación adicional.
Otro objetivo de la humanización de dichos anticuerpos fueron las secuencias de anticuerpos con 85 % de identidad o más con las secuencias de cadena ligera/cadena pesada de línea germinal humana. Se generó un dominio VL adicional de Hum9 y Hum8 con base en el dominio VL de Hum1. En comparación con Hum1, Hum9 contiene 4 sustituciones de aminoácidos en HVR-L1 y HVR-L2, o cerca de estas, que aumentan la humanidad de la cadena ligera a 85 % o más de identidad con la secuencia de cadena ligera humana (FIG.
29). En comparación con Hum1, Hum8 contiene 5 sustituciones de aminoácidos respectivamente en HVR-L1 y HVR-L2, o cerca de estas, que aumentan la humanidad de la cadena ligera a 85 % o más de identidad con la secuencia de cadena ligera humana (FIG. 29). Cuando las VL de Hum1, Hum8 y Hum9 se aparean con all_mut_AB21 de cadena pesada (con mutaciones de línea germinal), producen anticuerpos anti-SIRPa que se unen a v1 humana con una afinidad de 10 pM o mejor (Tabla S). De manera similar, cuando las VL de Hum1, Hum8 y Hum9 se aparean con all_mut_AB25 de cadena pesada (con mutaciones de línea germinal), los anticuerpos anti-SIRPa se unen a v1 humana con una afinidad de 10 pM o mejor. Se proporcionan datos de unión adicionales de dichos experimentos en la Tabla S que se encuentra más adelante. Dichas cadenas ligeras se pueden combinar de forma indistinta con los dominios VH de anticuerpo 21, 25 y 27 (así como variantes de estos, los cuales se modificaron tal como se describió anteriormente para los anticuerpos 119, 135 y 136, FIG. 30). Sin limitarse a la teoría, se cree que el proceso de humanización anteriormente descrito se puede aplicar a la cadena ligera de cualquier anticuerpo de la familia 2 (grupo 1).
Ejemplo 8: Inducción de fagocitosis y activación de células dendríticas mediante anticuerpos anti-SIRP-a Luego, se evaluaron varios anticuerpos anti-SIRP-a que representan modos diferentes de unión a SIRP-a (por ejemplo, anticuerpos bloqueadores, no bloqueadores y de partida) en ensayos de fagocitosis.
Ensayos de unión a CD47-Fc
CD47-Fc se conjugó con Alexa Fluor 647 (AF647) con el kit Alexa Fluor 647 Microscale Protein Labeling Kit (Thermo Fisher Scientific). Se suspendieron 100000 CMSP en 100 j l de CD47-Fc marcado con AF6470,25 |jM y 1 j l de anticuerpo PE anti-CD14 (Biolegend) en tampón de FACS en placas de polipropileno de 96 pocillos (Corning). Se incubaron las células en hielo durante 30 minutos, se lavaron en tampón de FACS y se incubaron en diluciones seriales de 10 veces de anticuerpo anti-SIRP-a de 1,25 jM a 25 pM. Las células se incubaron en hielo durante 30 minutos, se lavaron en tampón de FACS y se fijaron en 75 j l de formaldehído al 0,5 %. Las células se analizaron en FACS Canto II (BD Biosciences) con un análisis de datos posterior mediante Flowjo 10.7 (Treestar). Se determinó la media geométrica de la intensidad de fluorescencia de la señal de CD47-Fc en la población de monocitos positivos para CD14.
Ensayos de activación de células dendríticas
Los ensayos de activación de células dendríticas se llevaron a cabo tal como se describió en el presente documento. Los ratones Balb/c (n=3/grupo) recibieron inyecciones intravenosas de anticuerpo antagonista anti-SIRP-a antirratón de rata de control (clon p84), control de IgG1 humana, varios anticuerpos anti-SIRP-a, control de IgG de ratón o vehículo (PBS) a 10 mg/kg. Cinco horas después de la inyección, se recogieron los bazos y se procesaron en suspensiones celulares únicas mediante disociación mecánica. Se midió el nivel de marcador de activación CD86, MHCII y CCR7 en células dendríticas esplénicas CD4+ mediante citometría de flujo.
Ensayos de adhesión celular
El ensayo de adhesión se llevó a cabo con células isogénicas con expresión de CD47 humana o que carecen de este. Se generaron células CHO de inactivación de CD47 de hámster (CHOCD47 KO) con tecnología CRISPR. Se generaron células isogénicas que expresan CD47 humana mediante la transfección transitoria de CD47 humana en CHOCD47 KO. Una vez que transcurrieron 24 horas desde la transfección, se volvieron a colocar células CHOCD47 KO transfectadas con CD47 humana (4 x 105) en placas tratadas para cultivo de tejidos de 24 pocillos y se permitió que se volvieran a adherir y llegaran a la confluencia durante la noche a 37 °C.
Se separaron las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de la sangre periférica de donantes sanos mediante centrifugado con gradiente de Ficoll. Se aislaron las células CD3+ y CD14+ de las CMSP mediante selección negativa con esferas magnéticas. Las células CD3+ y CD14+ aisladas (5 x 106) se preincubaron con anticuerpos wt/mut 136, Hum1/AB21mutall o Hum9/AB21mutall que contienen IgG1 mutada (L234A L235A G237a y N297A) (20 ug/ml) a 37 °C durante 20 minutos, antes de colocarse en placas sobre células CHOCD47 KO y CHOhCD47+ y permitir su adherencia durante 1 hora a 37 °C. Las células no adherentes se removieron mediante lavados suaves con PBS. Las células adherentes se separaron con tripsina y se neutralizaron con SFB al 10 %. Se transfirieron las células a una placa de 96 pocillos y se lavaron 2 veces con PBS BSA al 0,5 % mediante marcaje de superficie celular con anticuerpos CD3, CD4, CD8 y CD14 humanos conjugados a fluorocromo. Se agregaron esferas y se cuantificó la adhesión celular con un citómetro de flujo b D Canto II. Se realizó el análisis de los datos de citometría de flujo con Flowjo. Resultados
Se examinaron los efectos de cinco anticuerpos de partida de CD47 de la unión a SIRP-a en la fagocitosis de células OE19 HER2(+) mediante macrófagos M2 en combinación con el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab (FIG. 31). Se observó que los 5 anticuerpos de partida potenciaron la fagocitosis inducida por trastuzumab. Se examinaron los efectos de cinco anticuerpos que no bloquean la unión de CD47 a SIRP-a en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2 en combinación con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (FIG. 32). Se determinó que todos los anticuerpos no bloqueadores potenciaron la fagocitosis inducida por cetuzimab.
Luego, se examinaron los efectos de los anticuerpos humanizados anteriormente descritos en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2 en combinación con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (FIG. 33A). Se observó que todos los anticuerpos humanizados potenciaron la fagocitosis inducida por cetuzimab. Se examinaron los efectos de variantes adicionales del anticuerpo 136 (anteriormente descrito) en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2 en combinación con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (FIG. 33B). Todas las variantes del anticuerpo 136 potenciaron la fagocitosis inducida por cetuximab, pero en medidas diferentes. Se examinaron los efectos de los anticuerpos humanizados adicionales anteriormente descritos (variantes de cadena pesada de anticuerpo 25 y 27 combinadas con cadena ligera de Hum1 y Hum9) en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2 en combinación con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (FIG. 33C). Se observó que todos los anticuerpos humanizados potenciaron la fagocitosis inducida por cetuximab.
Con el fin de investigar el efecto de las regiones Fc del anticuerpo anti-SIRP-a en la fagocitosis, se evaluaron dos anticuerpos no bloqueadores ya sea como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos F(ab)2 para determinar sus efectos en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2 en combinación con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (FIG. 34). Estos resultados indicaron que los anticuerpos no bloqueadores pierden la capacidad de inducir fagocitosis como fragmentos F(ab)2 , lo que sugiere que la región Fc de esta clase de anticuerpo es necesaria para la inducción de fagocitosis.
Se examinaron los efectos de tres variantes del anticuerpo 119 (anteriormente descrito) en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2 en combinación con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (FIG. 35). Los resultados demostraron que las tres variantes potenciaron la fagocitosis inducida por cetuximab.
Se examinaron los efectos de dos variantes del anticuerpo 135 (anteriormente descrito) en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2 en combinación con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (FIG. 36). Los resultados demostraron que ambas variantes potenciaron la fagocitosis inducida por cetuximab.
Se examinaron los efectos de anticuerpos no bloqueadores adicionales (anteriormente descrito) en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2 en combinación con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (FIG. 37). Se determinó que todos los anticuerpos no bloqueadores potenciaron la fagocitosis inducida por cetuximab.
Luego, se evaluaron los efectos de varios anticuerpos anti-SIRP-a en la activación de células dendríticas in vivo (FIG. 38A-38B), lo que incluye el anticuerpo p84 anti-SIRP-a (véase, por ejemplo, Tangsheng, Y. et al. (2015) Immunity 433:1-12). La no interacción con el receptor de SIRP-a de ratón en células dendríticas esplénicas a través de unión de CD47 lleva a la activación de las células dendríticas esplénicas. El anticuerpo p84 antagonista anti-SIRP-a activó células dendríticas esplénicas cuando se inyectó a ratones por vía intravenosa. Los anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores (AB136b, AB3b y AB136 wt/mut) y los anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores (Hum1/AB21mutall, Hum8/AB21mutall y Hum9/AB21mutall) se sometieron a ensayo in vivo para determinar si llevan a la activación de células dendríticas. Tal como se determinó mediante expresión de CD86 y MHCII, tanto los bloqueadores como los no bloqueadores de SIRP-a inducen la expresión de células dendríticas. Estos resultados sugieren que los anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores y no bloqueadores inducen la activación de células dendríticas.
Se generaron dos variantes del anticuerpo 218, 218-Hum13/VH_wt y 218-Hum14/VH_wt, mediante la expresión de cadenas ligeras humanizadas (Hum13 y Hum14, respectivamente) con la cadena pesada de tipo silvestre del anticuerpo 218. Hum13 usó el armazón de IGLV2 humana, al tiempo que Hum14 usó el armazón de IGLV3 humana (véanse la SEQ ID NO: 333 y 334 para las secuencias de Hum13 y Hum14, respectivamente. Ambos clones presentaron unión a v1 y v2 con menor afinidad (Kd es ~29,3 a 53,1 nM), tal como se muestra en la Tabla O2.
Tabla O2. Afinidad de unión (Kd , M) de las variantes de anticuerpo 218 y 218 para SIRP-a v1 y v2 humana.
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Se evaluaron ambos anticuerpos en un ensayo de fagocitosis en combinación con cetuximab en células DLD-1. Cabe destacar que ninguna de las variantes humanizadas pudo potenciar la fagocitosis sobre el anticuerpo AB218a parental (FIG. 39A). Sin limitarse a la teoría, estos resultados sugieren que los anticuerpos con Kd en un rango aproximado de 30-50 nM o por debajo de este pueden ser más eficaces para inducir la fagocitosis que los anticuerpos que se unen con menor afinidad.
Se analizaron ejemplos de anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores, no bloqueadores y de partida para evaluar la inducción de fagocitosis como agentes simples. En primer lugar, se evaluaron tres anticuerpos que bloquean la unión de CD47 a SIRP-a, AB119a, AB120a y AB122a, para determinar sus efectos como agentes simples en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2 (tal como se describió anteriormente). Se determinó que todos los anticuerpos bloqueadores inducen la fagocitosis como agentes simples (FIG. 39B). Luego, se evaluaron los efectos de dos anticuerpos que no bloquean la unión de SIRP-a, AB136a y AB137a, a CD47 como agentes simples en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2. Se determinó que todos los anticuerpos no bloqueadores inducen la fagocitosis como agentes simples (FIG. 39C). Finalmente, se evaluaron los efectos de cinco anticuerpos anti-SIRP-a de partida, AB115a, AB116a, AB117a, AB118a y AB132a, como agentes simples en la fagocitosis de células DLD-1 EGFR(+) mediante macrófagos M2. Se determinó que todos los anticuerpos de partida inducen la fagocitosis como agentes simples (FIG. 39D).
Ejemplo 9: Efectos antitumorales sinérgicos de la combinación de anticuerpos anti-SIRP-a bloqueadores o no bloqueadores con inhibición de la vía PD-L1/PD-1
Métodos
Actividad antitumoral in vivo
En el caso de modelo de carcinoma de colon de ratón singénico CT26, se implantaron de forma subcutánea células CT26 en ratones BALB/c y se asignaron de forma aleatoria a grupos (8-9 ratones/grupo). Los grupos de tratamiento incluyen vehículo (PBS), AB25b, anti-PD-LI y AB25b/anti-PD-L1. El anti-pD-L1 se generó mediante la fusión del dominio VH y VL de atezolizumab con una región Fc de IgG1 de ratón con una mutación N297A. Todos los anti-SIRP-a también presentan una región Fc de IgG1 con una mutación N297A. El tratamiento inició cuando los tumores tuvieron un tamaño promedio de 75-80 mm3, el día 7 u 8 después del implante. Se administraron dosis intraperitoneales (IP) de 3 mg/mg o 10 mg/kg a ratones dos veces por semana durante tres semanas para anticuerpos anti-SIRPa y tres dosis de 3 mg/kg con una separación de cinco días para anti-PD-LI. Cuando los tumores llegaron a un volumen de ~2000 mm3, se sacrificaron los animales.
En el caso de modelo de carcinoma de colon de ratón singénico MC38, se implantaron de forma subcutánea células MC38 en ratones C57BL/6 y se asignaron de forma aleatoria a grupos (8-10 ratones/grupo). Los grupos de tratamiento incluyeron vehículo (PBS), AB25b, AB136b, anti-PDl (clon RMP1-14, BioXCell), ABl36b/anti-PD1 y AB25b/anti-PD1. Todos los anticuerpos anti-SIRPa presentaron una región Fc de IgG1 murina con una mutación N297A, excepto por AB25c. El tratamiento inició cuando los tumores tuvieron un tamaño promedio de 60-65 mm3, el día 7 después del implante. Se administraron dosis intraperitoneales (IP) de 10 mg/kg de anti-SIRPa dos veces por semana a los ratones durante tres semanas y tres dosis de 2 mg/kg para anti-PD1. Cuando los tumores llegaron a un volumen de ~2000 mm3, se sacrificaron los animales.
Resultados
Se evaluó la actividad antitumoral del anticuerpo anti-SIRP-a AB25b bloqueador por sí solo y en combinación con un anticuerpo anti-PD-L1 en el modelo de carcinoma de colon de ratón singénico CT26. Tal como se muestra en la FIG. 40, la administración de AB25b a 10 mg/kg en combinación con anti-PD-LI a 3 mg/kg demoró la formación de tumores en comparación con el tratamiento con cada control de vehículo o agente simple. El día 27 de ensayo, el grupo de tratamiento con combinación tuvo seis ratones con tumores con un tamaño menor de 600 mm3, en comparación con dos, dos y dos ratones con tumores de menos de 600 mm3 en los grupos de tratamiento con vehículo, agente simple anti-PD-L1 y agente simple anti-SIRP-a, respectivamente.
Luego, se evaluaron las actividades antitumorales del anticuerpo anti-SIRP-a AB25b bloqueador y el anticuerpo anti-SIRP-a AB136b no bloqueador por sí solos y en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 en el modelo de carcinoma de colon de ratón singénico MC38. Tal como se muestra en la FIG. 41, la combinación de AB25b o AB136b (a 10 mg/kg) con anti-PD-1 a 5 mg/kg demoró la formación de tumores cuando se compara con el tratamiento con cada agente simple o vehículo de control. El día 27 del ensayo, el grupo de tratamiento con combinación AB25b/PD-1 presentó siete ratones con tumores de menos de 600 mm3 de tamaño y el grupo de tratamiento con combinación de AB136b/PD-1 tuvo tumores de menos de 600 mm3 en comparación con uno, cinco, dos y un ratón con tumores de menos de 600 mm3 de tamaño en los grupos de tratamiento de vehículo, agente simple anti-PD-1, agente simple AB25b y agente simple AB136b, respectivamente.
Se proporciona un resumen de los anticuerpos descritos en el presente documento y sus propiedades en la Tabla P. Se proporcionan datos de unión adicionales en la Tabla T.
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Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano, en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v1 humano, al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a v2 humano, al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a de mono y al dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a murino; y en donde el anticuerpo comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende:
(i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2AX3S, en donde Xi es S o T; X2 es N, Y, H o D; y X3 es M, L o V (SEQ ID NO: 297);
(ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISX1X2X3X4X5X6YYX7X8SX9KG, en donde Xi es A o S; X2 es G, S o está ausente; X3 es S, D o G; X4 es G o S; X5 es D, S o G; X6 es T o A; X7 es P, G, V, I, A o S; X8 es A, D o G; y X9 es V o M (SEQ ID NO: 298); y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende:
(i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGX1X2X3SX4YYX5, en donde X1 es D, G, S, I o está ausente; X2 es S, W, G, Y, D o está ausente; X3 es S, Y, T o D; X4 es H, T, S o Y; y X5 es G o A (SEQ ID NO: 299);
(ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDX1X2RPX3, en donde X1 es D o N; X2 es E, K o Q; y X3 es S o P (SEQ ID NO: 300); y
(iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2YDX3X4X5YX6NX7, en donde X1 es G o A; X2 es G o A; X3 es G, Y, Q, S o A; X4 es S, R o T; X5 es T o S; X6 es A, I, V, L o T; y X7 es T, A, D o P (SEQ ID NO: 301).
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado generado por u obtenido de un pollo.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo bloquea la unión entre un dominio extracelular de un polipéptido SIRP-a humano y un dominio IgSF de un polipéptido CD47 humano.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende:
(i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SX1AX2S, en donde X1 es N o Y; y en donde X2 es M, L o V (SEQ ID NO: 302);
(ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISX1GX2X3DTYYX4X5SVKG, en donde X1 es A o S; X2 es G o está ausente; X3 es S o G; X4 es P, G o V; y X5 es A o D (SEQ ID NO: 303); y
(iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende:
(i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGX1YSSYYYA, en donde X1 es S o A (SEQ ID NO: 304);
(ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336); y
(iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172).
5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde el dominio VH comprende:
(a) (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SEQ ID NO: 318), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISAGGSDTYYPASVKG (SeQ ID NO: 195), y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID nO: 193);
(b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135, 263, 264 o 330;
(c) (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SEQ ID NO: 318), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISSg SdTYYGDSVKG (s EQ ID NO: 197) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID nO: 193);
(d) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137, 265, 266 o 331;
(e) (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SYAMS (SEQ ID NO: 200), SYAVS (SEQ ID NO: 272) o SYALS (SEQ ID NO: 319), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISSg GdTYYVDSVKG (s EQ ID NO: 201) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); o
(f) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139, 267, 268 o 332.
6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en donde el dominio VL comprende:
(a) (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO: 170), (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172);
(b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(c) (i) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO: 261), (ii) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336) y (iii) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172); o
(d) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
en donde opcionalmente el dominio VL comprende la secuencia FW1—HVR-L1—FW2—HVR-L2—FW3— HVR-L3—FW4 (extremo N a extremo C), en donde FW1 comprende la secuencia de aminoácidos SYELTQPPSVSVSPGQTARITC (SEQ ID NO: 314), FW2 comprende la secuencia de aminoácidos WYQQKPGQAPVTLIY (SEQ ID NO: 315), fW3 comprende la secuencia de aminoácidos NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC (SEQ ID NO: 316) y FW4 comprende la secuencia de aminoácidos FGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 317); y
en donde opcionalmente el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 325, 326 o 426.
7. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde
(a) el dominio VH comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SEQ ID NO: 318), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISAGGSDTYYPASVKG (s EQ ID NO: 195) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193), y el dominio VL comprende (iv) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGSYSSYYYA (s Eq ID nO: 170), (v) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336) y (vi) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172);
(b) el dominio VH comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SEQ ID NO: 318), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISSGSDTYYGDSVKG (SeQ ID NO: 197) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193) y el dominio VL comprende (iv) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGSYSSYYYA (s Eq ID NO: 170), (v) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336) y (vi) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172);
(c) el dominio VH comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SYAMS (SEQ ID NO: 200), SYAVS (SEQ ID NO: 272) o SYALS (SEQ ID NO: 319), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISSg GdTYYVDSVKG (s EQ ID NO: 201) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193), y el dominio VL comprende (iv) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGSYSSYYYA (s Eq ID nO: 170), (v) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336), y (vi) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172);
(d) el dominio VH comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SEQ ID NO: 318), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISAGg SdTYYPASVKG (SEQ ID NO: 195), y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193), y el dominio VL comprende (iv) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGAYSSYYYA (SeQ ID NO: 261), (v) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336), y (vi) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172);
(e) el dominio VH comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO: 271) o SNALS (SEQ ID NO: 318), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISSGSDTYYGDSVKG (SeQ ID NO: 197) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193) y el dominio VL comprende (iv) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGAYSSYYYA (s Eq ID nO: 261), (v) una secuencia de HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336), y (vi) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172); o
(f) el dominio VH comprende (i) una secuencia de HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SYAMS (SEQ ID NO: 200), SYAVS (SEQ ID NO: 272) o SYALS (SEQ ID NO: 319), (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GISSg GdTYYVDSVKG (SeQ ID NO: 201) y (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193), y el dominio VL comprende (iv) una secuencia de HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SGGAYSSYYYA (SEQ ID nO: 261), (v) una secuencia de Hv R-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SDDKRPS (SEQ ID NO: 336) y (vi) una secuencia de HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172)
8. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde
(a) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(b) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 264 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(c) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 330 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(d) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(e) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(f) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(g) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 265 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(h) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(i) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 331 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(j) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 267 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(k) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 268 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(l) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 332 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(j) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(m) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 264 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(n) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 330 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(o) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 265 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(p) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(q) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 331 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(r) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 267 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(s) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 268 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(t) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 332 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(u) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262;
(v) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262; o
(w) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 139 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 262.
9. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo se une a un polipéptido SIRP-a v1 humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 y K96 de acuerdo con la SEQ ID NO: 296;
en donde opcionalmente:
(a) el anticuerpo se une al polipéptido SIRP-a v1 humano en I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 y K96 de acuerdo con la SEQ ID NO: 296;
(b) el anticuerpo se une además al polipéptido SIRP-a v1 humano en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 y r95, de acuerdo con la SEQ ID NO: 296;
(c) el anticuerpo se une además al polipéptido SIRP-a v1 humano en L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 y r95 de acuerdo con la SEQ ID NO: 296; y/o
(d) el polipéptido SIRP-a v1 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, el polipéptido SIRP-a v2 humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, el polipéptido SIRP-a de mono comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, y el polipéptido SIRP-a murino comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.
10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo es:
(a) un anticuerpo monoclonal; o
(b) un anticuerpo scFv-Fc.
11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo comprende una región Fc; en donde opcionalmente:
(a) el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 320-324;
(b) la región Fc es una región Fc humana seleccionada del grupo que consiste en una región Fc de IgG1, una región Fc de IgG2 y una región Fc de IgG4;
(c) la región Fc comprende una región Fc de IgG1 humana que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en L234A, L235A, G237A y N297A, de acuerdo con la numeración de EU;
(d) la región Fc comprende una región Fc de IgG2 humana que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en A330S, P331S y N297A, de acuerdo con la numeración de EU; (e) la región Fc comprende una región Fc de IgG2 humana que comprende una mutación N297A, de acuerdo con la numeración de EU;
(f) la región Fc comprende una región Fc de IgG2 humana que comprende las mutaciones A330S y/o P331S, de acuerdo con la numeración de EU; o
(g) la región Fc comprende una región Fc de IgG4 humana que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en S228P, E233P, F234V, L235A, L235E, delG236 y N297A, de acuerdo con la numeración de EU.
12. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 263, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252; en donde el anticuerpo comprende además una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 325, 326 o 426; y en donde el anticuerpo comprende además una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 320-324.
13. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde;
(a) el anticuerpo se conjuga con un marcador o agente citotóxico; o
(b) el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
14. Uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
15. Uno o más vectores que comprenden los polinucleótidos de la reivindicación 14.
16. Una o más células hospedadoras que comprenden los polinucleótidos de la reivindicación 14 o los vectores de la reivindicación 15.
17. Un método para producir un anticuerpo, comprendiendo el método cultivar las células hospedadoras de la reivindicación 16 de forma que el anticuerpo se produzca; en donde opcionalmente el método comprende además recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora.
18. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en (a) un método para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un individuo o (b) un método para tratar o retrasar la progresión de una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo.
20. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 19(a), en donde el método comprende además administrar al individuo:
(a) una cantidad eficaz de un segundo anticuerpo que se une a un antígeno expresado por el cáncer, en donde opcionalmente el antígeno expresado por el cáncer se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, Mucina 1, Mucina 16, PTK7, STEAP1, receptor de endotelina B, mesotelina, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nectina 4, NaPi2b, LIV-1A, Guanilil ciclasa C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrina aVp3, integrina a5p1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascina, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, una mucina, CAIX, EPHA3, receptor de folato a, GD2, GD3 y un complejo de MHC/péptido que comprende un péptido de NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, una proteína de la familia MAGE, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirosinasa, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, receptor de laminina inmaduro, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, p-catenina, TGF-PRII, HPV E6 o HPV E7; o
(b) una cantidad eficaz de un agente inmunoterapéutico, en donde opcionalmente el agente inmunoterapéutico comprende un segundo anticuerpo, y en donde opcionalmente el segundo anticuerpo se une a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, OX40, CTLA-4, CD137/4-1BB, TNFR2, B7-H3, FZD7, CD27, CCR4, CSF1R, CSF, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, CCR2, IDO, A2R, CD39, CD73, TIGIT, CD80, CD47, arginasa, TDO y PVRIG.
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