JP5573156B2 - 癌の治療及び予防用医薬組成物 - Google Patents
癌の治療及び予防用医薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5573156B2 JP5573156B2 JP2009530726A JP2009530726A JP5573156B2 JP 5573156 B2 JP5573156 B2 JP 5573156B2 JP 2009530726 A JP2009530726 A JP 2009530726A JP 2009530726 A JP2009530726 A JP 2009530726A JP 5573156 B2 JP5573156 B2 JP 5573156B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- cd179b
- human
- cells
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3015—Breast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3061—Blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明で用いられるCD179bに対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ウシ、マウス、ラットなど、その由来となる動物種に制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、CD179bがヒトCD179bの場合、ヒトCD179bタンパク質やその部分ペプチド、ヒトCD179bを発現する細胞などを用いることができる。
抗体は通常少なくとも2本の重鎖及び2本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。IgMは別として、2本の同一の軽(L)鎖及び2本の同一の重(H)鎖で構成される約150kDaのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は1つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン(VH領域)を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれ軽鎖は可変ドメイン(VL領域)を有し、その反対の端に1つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは特定の領域が相補性決定領域(CDR)と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域の相対的に保存されている部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれている。完全な重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ3つのCDRにより連結された4つのFRを含む。3つのCDRは重鎖ではそのN末から順にCDRH1,CDRH2,CDRH3、同様に軽鎖ではCDRL1,CDRL2,CDRL3と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、CDRH3が最も重要である。また、各鎖のCDRはFR領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのCDRと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞性細胞障害活性(ADCC)への関与、Fcγ受容体への結合を介した食作用、新生児Fc受容体(FcRn)を介した半減期/クリアランス速度、補体カスケードのC1q構成要素を介した補体依存性細胞障害(CDC)を示す。
本発明における抗CD179b抗体とは、CD179bタンパク質の全長又は断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で抗体とCD179b抗原とが結合する特性を意味し、このような結合を介して腫瘍を障害(例えば、死滅、抑制又は退縮)する機能、が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、CD179bタンパク質と結合して腫瘍、例えば白血病、リンパ腫及び乳癌、を障害することができるならば、その種類を問わない。
CD179b発現細胞の補体依存的細胞障害性(CDC)。
本発明の癌の治療及び/又は予防のための医薬組成物の標的は、CD179b遺伝子を発現している癌(細胞)であれば特に限定されないが、好ましくは白血病、リンパ腫、乳癌からなる群より選択される癌(細胞)であり、これらの癌には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肥満細胞腫、慢性型リンパ球性白血病、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、等も包含される。
本発明は更に、上記抗体に関わる以下のポリペプチド及びDNAも提供する。
(1)cDNAライブラリーの作製
手術により摘出したイヌの乳腺癌組織から酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法(Acid guanidium−Phenol−Chloroform法)により全RNAを抽出し、Oligotex−dT30 mRNA purification Kit(宝酒造社製)を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリA RNAを精製した。
上記作製したイヌ乳腺癌由来cDNAファージライブラリを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ90×15mmのNZYアガロースプレートに2340クローンとなるように宿主大腸菌(XL1−Blue MRF')に感染させ、42℃、3〜4時間培養し、溶菌斑(プラーク)を作らせ、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトシド)を浸透させたニトロセルロースメンブレン(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio−Science社製)でプレートを37℃で4時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し0.5%脱脂粉乳を含むTBS(10mM Tris−HCl,150mM NaCl pH7.5)に浸し4℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを500倍希釈した患犬血清と室温で2〜3時間反応させた。
上記方法により単離した45個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌(XL1−Blue MRF')を吸光度OD600が1.0となるよう調製した溶液200μlと、精製したファージ溶液250μl、さらにExAssist helper phage(STRATAGENE社製)1μlを混合した後37℃で15分間反応後、LB培地を3ml添加し37℃で2.5〜3時間培養を行い、直ちに70℃の水浴にて20分間保温した後、4℃、1000×g、15分間遠心を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌(SOLR)を吸光度OD600が1.0となるよう調製した溶液200μlと、精製したファージ溶液10μlを混合した後37℃で15分間反応させ、50μlをアンピシリン(終濃度50μg/ml)含有LB寒天培地に播き37℃一晩培養した。トランスフォームしたSOLRのシングルコロニーを採取し、アンピシリン(終濃度50μg/ml)含有LB培地37℃にて培養後、QIAGEN plasmid Miniprep Kit(キアゲン社製)を使って目的のインサートを持つプラスミドDNAを精製した。
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ及びヒトの正常組織及び各種細胞株における発現をRT−PCR(Reverse Transcription−PCR)法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織50〜100mg及び各細胞株5〜10×106個の細胞からTRIZOL試薬(invitrogen社製)を用いて添付のプロトコールに従い全RNAを抽出した。この全RNAを用いてSuperscript First−Strand Synthesis System for RT−PCR(invitrogen社製)により添付のプロトコールに従いcDNAを合成した。ヒト正常組織(脳、海馬、精巣、結腸、胎盤)のcDNAは、ジーンプールcDNA(invitrogen社製)、QUICK−Clone cDNA(クロンテック社製)及びLarge−Insert cDNA Library(クロンテック社製)を用いた。PCR反応は、取得したイヌ遺伝子に特異的なプライマー(配列番号96及び97に記載)及びそのヒト相同遺伝子に特異的なプライマー(配列番号98及び99に記載)を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル0.25μl、上記プライマーを各2μM、0.2mM各dNTP、0.65UのExTaqポリメラーゼ(宝酒造社製)となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を25μlとし、Thermal Cycler(BIO RAD社製)を用いて、94℃−30秒、60℃−30秒、72℃−30秒のサイクルを30回繰り返して行った。なお、上記した配列番号96及び97に示す塩基配列を有する遺伝子特異的プライマーは、配列番号4の塩基配列中の32番〜341番を増幅するものであり、配列番号4〜92の偶数番号に示されるイヌCD179b遺伝子全てに共通の領域を増幅するものであった。また、配列番号98及び99に示す塩基配列を有する遺伝子特異的プライマーは配列番号1の塩基配列中の216番〜738番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、GAPDH特異的なプライマー(配列番号100及び101に記載)も同時に用いた。その結果、図1に示すように、取得したイヌ遺伝子は、健常なイヌ組織では全く発現が見られず、一方イヌ乳癌組織で強い発現が見られた。ヒト相同遺伝子の発現では、ヒト正常組織で発現が確認できたのは骨髄のみで、ヒト癌細胞では白血病細胞株及び乳癌細胞株で発現が検出され、CD179bが白血病細胞株と乳癌細胞株に特異的に発現していることが確認された。
次にCD179b遺伝子の発現が確認された各癌細胞株について、その細胞表面上にCD179bタンパクが発現しているかどうかを調べた。上記で遺伝子発現が認められた各ヒト癌細胞株それぞれ106細胞を1.5mlのミクロ遠心チュ−ブにて遠心した。これに5μlのマウス抗ヒトCD179b抗体(クローン名:GA170、Santa Cruz Biotechnology社製)を添加し、さらに95μlの0.1%牛胎児血清を含むPBSで懸濁後、氷上で1時間静置した。PBSで洗浄した後、5μlのFITC標識ラビット抗マウスIgG2aモノクロ−ナル抗体(BD Pharmingen社製)及び95μlの0.1%牛胎児血清を含むPBSで懸濁し、氷上で1時間静置した。PBSで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のFACSキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、マウス抗ヒトCD179b抗体の代わりにマウスIgG2a Isotype control(MBL社製)を用いて調製し、コントロールとした。その結果、抗ヒトCD179b抗体を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が10%以上強く、このことから、上記ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にCD179bタンパクが発現していることが確認された。
(1)ADCC活性
次にCD179bに対する抗体が、CD179bを発現する腫瘍細胞を障害することができるかどうかを検討した。市販のヒトCD179bに対するマウス抗体(クローン名:GA170)を用いて評価を行った。実施例1(5)でCD179bの発現が確認された3種類のヒト白血病細胞、Namalwa、BDCM及びRPMI1788(いずれもATCCから購入)をそれぞれ106個50ml容の遠心チューブに集め、100μCiのクロミウム51を加え37℃で2時間インキュベートした。その後10%牛胎児血清を含むRPMI培地で3回洗浄し、96穴V底プレート1穴あたり103個ずつ添加した。これにGA170をそれぞれ1μgずつ添加し、さらにマウスの脾臓から分離したリンパ球をそれぞれ2x105個ずつ添加して、37℃、5%CO2の条件下で4時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム51の量を測定し、GA170による各癌細胞に対するADCC活性を算出した。その結果、Namalwa、BDCM及びRPMI1788それぞれに対して、それぞれ32.6%、32.3%及び28.3%のADCC活性が確認された。一方、GA170のアイソタイプコントロール(クローン名:6H3)を用いて同様の操作を行ったところ、上記活性は検出されなかった。従って、CD179bに対する抗体を用いたADCC活性により、CD179bを発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。
ウサギから採血した血液をエッペンドルフチューブに入れ、室温で60分間、静置した後3000rpmで5分間、遠心分離することで、CDC活性測定用の血清を調製した。3種類のヒト白血病細胞、Namalwa、BDCM及びRPMI1788をそれぞれ106個50ml容の遠心チューブに集め、100μCiのクロミウム51を加え37℃で2時間インキュベートした後、10%牛胎児血清を含むRPMI培地で3回洗浄した。その後上記で調製したウサギ血清を50%含むRPMI培地で懸濁し、96穴V底プレート1穴あたり103個ずつ添加した。これにGA170をそれぞれ1μgずつ添加して、37℃、5%CO2の条件下で4時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム51の量を測定し、GA170による各癌細胞に対するCDC活性を算出した。その結果、Namalwa、BDCM及びRPMI1788それぞれに対して、それぞれ30.5%、21.2%及び30.5%のCDC活性が確認された。一方、GA170のアイソタイプコントロール(クローン名:6H3)を用いて同様の操作を行ったところ、上記活性は検出されなかった。従って、CD179bに対する抗体を用いたCDC活性により、CD179bを発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。
(1)抗原タンパクの調製
ヒトCD179bタンパクは動物細胞へのリポフェクション法により調製した。ヒトCD179b遺伝子(配列番号22)を制限酵素サイトXhoI及びBamHIを介して、ヒトIgG1Fc領域をコードするベクターであるSRaIgG1Fcベクターに導入した。SRaIgG1Fcベクターは、pcDL−SRa296ベクター(DNAX社製)に、ヒトIgG1Fc領域の遺伝子を導入したベクターである。次に、プラスミド24μgをLipofectamine2000 (インビトロジェン社製)60μlと混合し、さらにOPTI−MEM(インビトロジェン社製)を添加し、総量3mlになるように調製し室温で20分以上静置した。予め2×106cells/12mlOPTI MEMに調製したCHO−K1細胞に上述のプラスミドの混合液3mlを添加し、37℃、5%CO2条件下8時間以上培養し、CHO−S−SFM培地(インビトロジェン社製)10mlに置き換え4〜5日培養を行った。得られた培養上清中に生産される抗原タンパクの精製をProteinA sepharose HP(GEヘルスケア社製)を用いて行った。ProteinA sepharose HPを20mMリン酸緩衝液(pH7.4)/0.15M NaCl(平衡化緩衝液・洗浄緩衝液)で十分に平衡化し、培養上清に平衡化緩衝液を1:1で混合した溶液を導入した。次に、洗浄緩衝液で十分に洗浄した後、0.2M Glycine 緩衝液(pH2.5)で溶出を行った。溶出液には1M Tris(pH9)を添加して中和し、さらに限外濾過により20mMリン酸緩衝液(pH7.4)/0.15M NaClを用いてバッファー交換操作を行い、ヒトCD179bタンパクを調製した。
(1)で調製した抗原タンパク(ヒトCD179bタンパク)100μgを等量のMPL+TDMアジュバント(シグマ社製)と混合し、これをマウス1匹当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を6週齢Balb/cマウス(日本SLC社製)の腹腔内に投与後、1週間毎にさらに3回の投与を行い、免疫を完了した。最後の免疫から3日後に摘出した脾臓を、滅菌した2枚のスライドガラスに挟んで擂り潰し、PBS(−)(日水社製)を用いて洗浄し1500rpmで10分間遠心して上清を除去する操作を3回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞SP2/0(ATCCから購入)とを10:1の比率にて混和し、そこに37℃に加温した10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地200μlとPEG1500(ベーリンガー社製)800μlを混和して調製したPEG溶液を加えて5分間静置して細胞融合を行った。1700rpmで5分間遠心し、上清を除去後、Gibco社製のHAT溶液を2%当量加えた15%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地(HAT選択培地)150mlで細胞を懸濁し、96穴プレート(ヌンク社製)各ウェル当たり100μlずつ、プレート15枚に播種した。7日間、37℃、5%CO2環境にて培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。
作製したハイブリドーマが産生する抗体のヒトCD179bタンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。上記(1)で調製したヒトCD179bタンパク溶液1μg/mlを96穴プレート1ウェル当たりに100μl添加し、4℃にて18時間静置した。各ウェルをPBS−Tで3回洗浄後、0.5%BSA(Bovine Serum Albumin)溶液(シグマ社製)を1ウェル当たり400μl添加して室温にて3時間静置した。溶液を除いて、1ウェル当たり400μlのPBS−Tでウェルを3回洗浄後、上記(2)で得られたハイブリドーマの各培養上清を1ウェル当たり100μl添加し、室温にて2時間静置した。PBS−Tで各ウェルを3回洗浄した後、PBSで5000倍に希釈したHRP標識抗マウスIgG(H+L)抗体(インビトロジェン社製)を1ウェル当たり100μl添加して室温にて1時間静置した。PBS−Tでウェルを3回洗浄した後、TMB基質溶液(Thermo社製)を1ウェル当たり100μl添加して15〜30分間静置して発色反応を行った。発色後、1規定硫酸を1ウェル当たり100μl添加して反応を停止させ吸光度計を用いて450nm−595nmの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が最も高かった抗体を産生するハイブリドーマを選抜した。
(1)抗CD179bモノクローナル抗体#8の調製
ハイブリドーマ株#8をハイブリドーマSFM(インビトロジェン社製)により培養した。培養液は1500rpm 10min遠心後、フィルターシステム0.22μmに通した。抗体の精製には、Hitrap ProteinA SepharoseFF(GEヘルスケア社製)カラムを使用した。カラムをPBSで洗浄し、平衡化した。次に、培養上清をカラムに導入し、その後PBSにて洗浄を行った。0.1MGlycine−HCl(pH2.5)で溶出を行い、精製抗体を得た。
ADCC活性
抗CD179bモノクローナル抗体#8が、ヒトCD179bを発現する腫瘍細胞を障害することができるかどうかを検討した。ヒトCD179bの発現が確認されているヒト白血病細胞、Namalwaを106個50ml容の遠心チューブに集め、100μCiのクロミウム51を加え37℃で2時間インキュベートした。その後10%牛胎児血清を含むRPMI培地で3回洗浄し、96穴V底プレート1穴あたり103個ずつ添加した。これに抗CD179bモノクローナル抗体#8を2μg添加し、さらにマウスの脾臓から分離したリンパ球をそれぞれ2x105個ずつ添加して、37℃、5%CO2の条件下で4時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム51の量を測定し、抗CD179bモノクローナル抗体#8によるNamalwa細胞に対するADCC活性を算出した。その結果、Namalwaに対して、それぞれ60.6%のADCC活性が確認された。一方、アイソタイプコントロール(クローン名:ME07)を用いて同様の操作を行ったところ、上記活性は検出されなかった。従って、抗CD179モノクローナル抗体#8は、ADCC活性によりCD179bを発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。
ウサギから採血した血液をエッペンドルフチューブに入れ、室温で60分間、静置した後3000rpmで5分間、遠心分離することで、CDC活性測定用の血清を調製した。ヒト白血病細胞であるNamalwaを106個50ml容の遠心チューブに集め、100μCiのクロミウム51を加え37℃で2時間インキュベートした後、10%牛胎児血清を含むRPMI培地で3回洗浄した。その後上記で調製したウサギ血清を50%含むRPMI培地で懸濁し、96穴V底プレート1穴あたり103個ずつ添加した。これに抗CD179bモノクローナル抗体#8を2μg添加して、37℃、5%CO2の条件下で4時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム51の量を測定し、抗CD179bモノクローナル抗体#8によるNamalwa細胞に対するCDC活性を算出した。その結果、Namalwaに対して、30.5%のCDC活性が確認された。一方、アイソタイプコントロール(クローン名:ME07)を用いて同様の操作を行ったところ、上記活性は検出されなかった。従って、抗CD179bモノクローナル抗体#8は、CDC活性によりCD179bを発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。
抗CD179bモノクローナル抗体#8の担癌マウス生体内における抗腫瘍活性を評価した。使用した抗体は、上記と同様にハイブリドーマ株#8の培養上清をカラム精製したものを用いた。
ハイブリドーマ株#8からmRNAを抽出し、マウス・リーダー配列及びIgG3の抗体定常領域に特異的なプライマーを使用したRT−PCR法により、抗CD179bモノクローナル抗体#8の重鎖可変(VH)領域及び軽鎖可変(VL)領域の遺伝子を取得した。配列決定のために、それら遺伝子をpCR2.1ベクター(インビトロジェン社製)にクローニングした。
106個のハイブリドーマ株#8から、mRNA micro purification kit(GEヘルスケア社製)を用いてmRNAを調製し、SuperScriptII1st strand synthesis kit(インビトロジェン社製)を用いて、得られたmRNAを逆転写してcDNAを合成した。これら操作は各キットの添付プロトコールに従って行った。
VH領域の遺伝子取得のために、マウス・リーダー配列に特異的なプライマー(配列番号112)及びマウスIgG3定常領域に特異的なプライマー(配列番号113)を使用した。またVL領域の遺伝子取得のために、マウス・リーダー配列に特異的なプライマー(配列番号114)及びマウスκ鎖定常領域に特異的なプライマー(配列番号115)を使用した。これらプライマーはJones ST and Bending MM Bio/technology9,88−89(1991)を参考に設計した。PCRは、Ex−taq(タカラバイオ社製)を用いた。10×EX Taq Buffer5μl、dNTP Mixture(2.5mM)4μl、プライマー(1.0μM)各2μl,Ex taq(5units/μl)0.25μlにcDNAサンプルを加え、滅菌水により総量50μlとした。94℃で2分処理後、変性94℃1分、アニーリング58℃30秒、伸張反応72℃1分の組み合わせで30サイクルの条件で行った。
上記で得られた各PCR産物を用いてアガロースゲルにて電気泳動を行い、VH領域及びVL領域それぞれのDNAバンドを切り出した。DNA断片はQIAquickGelpurificationkit(キアゲン社製)を用いてその添付プロトコールに従って行った。精製した各DNAはTAクローニングキット(インビトロジェン社製)を用いてpCR2.1ベクターにクローニングした。連結したベクターをDH5aコンピテントセル(TOYOBO社製)に定法に従い形質転換を行った。各形質転換体それぞれ10クローンを培地(100μg/mlアンピシリン)で37℃一晩培養後、各プラスミドDNAをQiaspin Miniprep kit(キアゲン社製)を用いて精製した。
VH領域及びVL領域の遺伝子配列解析は、(2)のプラスミドDNAをM13フォワードプライマー(配列番号116)及びM13リバースプライマー(配列番号117)を用いて、蛍光シーケンサー(ABI社製DNAシーケンサー3130XL)により、ABI社製のビッグダイターミネーターver3.1サイクルシーケンシングキットを用いて、その添付プロトコールに従い行った。その結果、各々の遺伝子配列が決定された(各々10クローンで一致)。抗CD179bモノクローナル抗体#8のVH領域のアミノ酸配列を配列番号105に、VL領域のアミノ酸配列を配列番号109に示す。
配列番号95:T7プライマー
配列番号100及び101:GAPDHプライマー
配列番号116及び117:プライマー
Claims (6)
- 白血病細胞の細胞表面に発現している配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するCD179bタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体を有効成分として含むことを特徴とする、白血病の治療及び/又は予防のための医薬組成物。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項1又は2のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 配列番号103、104及び102のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号106、107及び108のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、かつ、CD179bタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体を有効成分として含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の白血病の治療及び/又は予防のための医薬組成物。
- 配列番号105のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号109のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、かつ、CD179bタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体を有効成分として含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の白血病の治療及び/又は予防のための医薬組成物。
- 前記抗体がヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項4又は5に記載の白血病の治療及び/又は予防のための医薬組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009530726A JP5573156B2 (ja) | 2008-07-10 | 2009-07-10 | 癌の治療及び予防用医薬組成物 |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008180057 | 2008-07-10 | ||
JP2008180057 | 2008-07-10 | ||
JP2009087379 | 2009-03-31 | ||
JP2009087379 | 2009-03-31 | ||
PCT/JP2009/062573 WO2010005068A1 (ja) | 2008-07-10 | 2009-07-10 | 癌の治療及び予防用医薬組成物 |
JP2009530726A JP5573156B2 (ja) | 2008-07-10 | 2009-07-10 | 癌の治療及び予防用医薬組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2010005068A1 JPWO2010005068A1 (ja) | 2012-01-05 |
JP5573156B2 true JP5573156B2 (ja) | 2014-08-20 |
Family
ID=41507178
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009530726A Active JP5573156B2 (ja) | 2008-07-10 | 2009-07-10 | 癌の治療及び予防用医薬組成物 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10611835B2 (ja) |
EP (1) | EP2305300B1 (ja) |
JP (1) | JP5573156B2 (ja) |
KR (1) | KR101669834B1 (ja) |
CN (1) | CN102089004B (ja) |
AU (1) | AU2009270181B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0910509B8 (ja) |
CA (1) | CA2730201C (ja) |
DK (1) | DK2305300T3 (ja) |
ES (1) | ES2575430T3 (ja) |
HU (1) | HUE028589T2 (ja) |
MX (1) | MX2011000117A (ja) |
PL (1) | PL2305300T3 (ja) |
PT (1) | PT2305300E (ja) |
RU (1) | RU2533460C2 (ja) |
WO (1) | WO2010005068A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016115559A1 (en) | 2015-01-16 | 2016-07-21 | Juno Therapeutics, Inc. | Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1 |
CA2983030A1 (en) | 2015-04-16 | 2016-10-20 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Use of anti-pacap antibodies and antigen binding fragments thereof for treatment, prevention, or inhibition of photophobia |
AU2016255255B2 (en) * | 2015-04-30 | 2021-07-22 | Toray Industries, Inc. | Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer |
WO2017136607A1 (en) | 2016-02-02 | 2017-08-10 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Anti-ror1 antibodies and uses thereof |
KR102444717B1 (ko) | 2016-04-15 | 2022-09-16 | 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 | 인간화 항-pacap 항체 및 그의 용도 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10513348A (ja) * | 1995-01-26 | 1998-12-22 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | ヒトgp39の種々のエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体およびその診断および治療における使用 |
WO2006117910A1 (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体 |
WO2007128231A1 (en) * | 2006-04-30 | 2007-11-15 | Beijing Cotimes Biotech, Ltd. | Trail receptor-binding agents and uses of the same |
JP2007535301A (ja) * | 2003-05-09 | 2007-12-06 | デューク ユニバーシティ | Cd20特異的抗体およびその使用方法 |
WO2007143098A2 (en) * | 2006-06-02 | 2007-12-13 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Hepatocyte growth factor (hgf) binding proteins |
WO2008034076A2 (en) * | 2006-09-15 | 2008-03-20 | The Johns Hopkins University | Cyclophosphamide in combination with immune therapeutics |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2014073A (en) * | 1935-09-10 | Stovepipe | ||
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
AU640397B2 (en) | 1989-08-25 | 1993-08-26 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Dog-mouse heterohybridoma and gene fragment coding for constant region of canine immunoglobulin |
US5595756A (en) * | 1993-12-22 | 1997-01-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents |
WO1996002576A1 (fr) | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine |
US5698396A (en) | 1995-06-07 | 1997-12-16 | Ludwig Institute For Cancer Research | Method for identifying auto-immunoreactive substances from a subject |
FR2761994B1 (fr) | 1997-04-11 | 1999-06-18 | Centre Nat Rech Scient | Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires |
EP1001020A4 (en) * | 1997-07-29 | 2005-03-02 | Sumitomo Electric Industries | NON-HUMAN PRE-B CELL RECEPTOR ANTIBODIES |
US6677436B1 (en) | 1998-04-03 | 2004-01-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Humanized antibody against human tissue factor (TF) and process of production of the humanized antibody |
US6703360B2 (en) | 2000-04-07 | 2004-03-09 | Heska Corporation | Compositions and methods related to canine IgG and canine IL-13 receptors |
CA2469833C (en) | 2001-12-21 | 2008-05-20 | Idexx Laboratories, Inc. | Canine immunoglobulin variable domains, caninized antibodies, and methods for making and using them |
US20040110933A1 (en) | 2002-09-13 | 2004-06-10 | Dyax Corporation | CD44-binding ligands |
AU2003298786A1 (en) | 2002-11-26 | 2004-06-18 | Protein Design Labs, Inc. | Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators |
JPWO2005083074A1 (ja) | 2004-03-01 | 2007-11-22 | 有限会社金沢大学ティ・エル・オー | 腫瘍抗原ペプチド |
DK1730191T3 (da) | 2004-03-30 | 2011-10-17 | Glaxo Group Ltd | Immunglobulin som binder HOSM |
WO2005118869A2 (en) | 2004-05-28 | 2005-12-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cancer |
JP4547197B2 (ja) | 2004-06-30 | 2010-09-22 | 公正 安元 | 癌特異的腫瘍抗原 |
US8227455B2 (en) | 2005-04-18 | 2012-07-24 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating cell proliferative disorders |
JP2007053501A (ja) | 2005-08-16 | 2007-03-01 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 管理装置、ip電話装置、ip電話システム及び更新方法 |
WO2008034074A2 (en) * | 2006-09-15 | 2008-03-20 | The Johns Hopkins University | Cyclosphosphamide in combination with anti-idiotypic vaccines |
US20100233167A1 (en) | 2007-05-10 | 2010-09-16 | Ramesh Bhatt | Chain reaction creating oligomers from repeat units of binding molecules |
AU2009270182B2 (en) * | 2008-07-10 | 2015-01-22 | Toray Industries, Inc. | Immunity-inducing agent and method for detection of cancer |
TWI516501B (zh) * | 2008-09-12 | 2016-01-11 | 禮納特神經系統科學公司 | Pcsk9拮抗劑類 |
EP3907242A1 (en) * | 2010-01-29 | 2021-11-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-dll3 antibody |
NZ604510A (en) * | 2010-08-17 | 2013-10-25 | Csl Ltd | Dilutable biocidal compositions and methods of use |
-
2009
- 2009-07-10 BR BRPI0910509A patent/BRPI0910509B8/pt active IP Right Grant
- 2009-07-10 US US13/002,636 patent/US10611835B2/en active Active
- 2009-07-10 PL PL09794512.5T patent/PL2305300T3/pl unknown
- 2009-07-10 JP JP2009530726A patent/JP5573156B2/ja active Active
- 2009-07-10 ES ES09794512.5T patent/ES2575430T3/es active Active
- 2009-07-10 CN CN200980126629.8A patent/CN102089004B/zh active Active
- 2009-07-10 AU AU2009270181A patent/AU2009270181B2/en active Active
- 2009-07-10 WO PCT/JP2009/062573 patent/WO2010005068A1/ja active Application Filing
- 2009-07-10 DK DK09794512.5T patent/DK2305300T3/en active
- 2009-07-10 RU RU2011104709/15A patent/RU2533460C2/ru active
- 2009-07-10 MX MX2011000117A patent/MX2011000117A/es active IP Right Grant
- 2009-07-10 PT PT09794512T patent/PT2305300E/pt unknown
- 2009-07-10 EP EP09794512.5A patent/EP2305300B1/en active Active
- 2009-07-10 KR KR1020107029569A patent/KR101669834B1/ko active IP Right Grant
- 2009-07-10 HU HUE09794512A patent/HUE028589T2/en unknown
- 2009-07-10 CA CA2730201A patent/CA2730201C/en active Active
-
2020
- 2020-02-25 US US16/800,852 patent/US11993650B2/en active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10513348A (ja) * | 1995-01-26 | 1998-12-22 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | ヒトgp39の種々のエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体およびその診断および治療における使用 |
JP2007535301A (ja) * | 2003-05-09 | 2007-12-06 | デューク ユニバーシティ | Cd20特異的抗体およびその使用方法 |
WO2006117910A1 (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体 |
WO2007128231A1 (en) * | 2006-04-30 | 2007-11-15 | Beijing Cotimes Biotech, Ltd. | Trail receptor-binding agents and uses of the same |
WO2007143098A2 (en) * | 2006-06-02 | 2007-12-13 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Hepatocyte growth factor (hgf) binding proteins |
WO2008034076A2 (en) * | 2006-09-15 | 2008-03-20 | The Johns Hopkins University | Cyclophosphamide in combination with immune therapeutics |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6009042933; 清河信敬 他: 'B前駆細胞性リンパ芽球性リンパ腫の診断マーカーとしてのCD179a/bの有用性' 日本病理学会会誌 Vol.93, No.1, 2004, p.413 * |
JPN6013046157; KIYOKAWA,N. et al.: Mod Pathol Vol.17, No.4, 2004, p.423-9 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HUE028589T2 (en) | 2016-12-28 |
CN102089004A (zh) | 2011-06-08 |
BRPI0910509B1 (pt) | 2021-05-04 |
US10611835B2 (en) | 2020-04-07 |
BRPI0910509A2 (pt) | 2015-09-29 |
EP2305300B1 (en) | 2016-04-06 |
EP2305300A4 (en) | 2011-11-02 |
EP2305300A1 (en) | 2011-04-06 |
CA2730201A1 (en) | 2010-01-14 |
ES2575430T3 (es) | 2016-06-28 |
PL2305300T3 (pl) | 2016-09-30 |
JPWO2010005068A1 (ja) | 2012-01-05 |
CN102089004B (zh) | 2018-06-01 |
DK2305300T3 (en) | 2016-06-06 |
AU2009270181A1 (en) | 2010-01-14 |
RU2533460C2 (ru) | 2014-11-20 |
PT2305300E (pt) | 2016-06-16 |
KR20110039423A (ko) | 2011-04-18 |
BRPI0910509B8 (pt) | 2021-05-25 |
CA2730201C (en) | 2019-02-05 |
MX2011000117A (es) | 2011-02-25 |
RU2011104709A (ru) | 2012-08-20 |
US20200247888A1 (en) | 2020-08-06 |
AU2009270181B2 (en) | 2014-05-29 |
US11993650B2 (en) | 2024-05-28 |
US20110129478A1 (en) | 2011-06-02 |
KR101669834B1 (ko) | 2016-10-27 |
WO2010005068A1 (ja) | 2010-01-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5930004B2 (ja) | 癌の治療及び予防用医薬組成物 | |
JP5845899B2 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP5923985B2 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP6003650B2 (ja) | 膵臓癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP5742714B2 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP5906739B2 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP5742713B2 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP6107654B2 (ja) | 肝臓癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP6070191B2 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP6107655B2 (ja) | 胆嚢癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP6065591B2 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JP6065590B2 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
WO2013018892A1 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
US11993650B2 (en) | Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancer | |
WO2016175307A1 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
WO2017170334A1 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 | |
JPWO2017170322A1 (ja) | 癌の治療及び/又は予防用医薬組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120704 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120704 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130924 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131122 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140204 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140424 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20140509 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140603 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140616 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5573156 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |