JP2015205883A - Pcsk9拮抗薬 - Google Patents
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Abstract
Description
ATCC受託番号PTA−8985を有する4A5、
ATCC受託番号PTA−8986を有する5A10、
ATCC受託番号PTA−8984を有する6F6、および
ATCC受託番号PTA−8983を有する7D4
からなる群から選択される。
本発明の実施では、別段に指定しない限りは、当分野の技術範囲内にある分子生物学(組換え技術が含まれる)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用技術を用いる。そのような技術は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Sambrookら、1989)、Cold Spring Harbor Press、Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984)、Methods in Molecular Biology、Humana Press、Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、1998)、Academic Press、Animal Cell Culture(R.I.Freshney編、1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、1998)、Plenum Press、Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths、およびD.G.Newell編、1993〜1998)、J.Wiley and Sons、Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)、Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987)、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編、1987)、PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullisら編、1994)、Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganら編、1991)、Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons、1999)、Immunobiology(C.A.JanewayおよびP.Travers、1997)、Antibodies(P.Finch、1997)、Antibodies:a practical approach(D.Catty編、IRL Press、1988〜1989)、Monoclonal antibodies:a practical approach(P.ShepherdおよびC.Dean編、Oxford University Press、2000)、Using antibodies:a laboratory manual(E.HarlowおよびD.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999)、The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D.Capra編、Harwood Academic Publishers、1995)等の文献中に完全に記載されている。
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的と特異的結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用する場合、この用語には、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片(Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、単鎖(ScFv)およびドメイン抗体等)、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置も包含される。抗体には、IgG、IgA、またはIgM等の任意のクラス(またはそのサブクラス)の抗体が含まれ、抗体は任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを様々なクラスに割り当てることができる。5つの主要な免疫グロブリンクラス、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2へとさらに分類し得る。様々な免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。様々な免疫グロブリンクラスのサブユニットの構造および三次元立体配置は周知である。
J.Immunol.、117:587、およびKimら、1994、J.Immunol.、24:249)。
一態様では、本発明は、個体に、循環PCSK9に拮抗する有効量のPCSK9拮抗抗体またはペプチドまたはアプタマーを投与することを含む、個体において高コレステロール血症、および/または異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、CVDもしくは冠状動脈性心疾患の少なくとも1つの症状を処置または予防するための方法を提供する。
本発明の方法では、PCSK9に対する細胞応答の誘発等のPCSK9シグナル伝達によって媒介される下流経路を含めた、PCSK9生物活性を遮断、抑制または低下させる(有意に低下させることが含まれる)任意のペプチドまたは核酸分子をいう、PCSK9拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを使用する。
(1)非極性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)荷電なしの極性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性(負荷電):Asp、Glu、
(4)塩基性(正荷電):Lys、Arg、
(5)鎖の配向に影響を与える残基:Gly、Pro、および
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe、His。
本発明の方法中で使用する組成物は、有効量のPCSK9拮抗抗体、PCSK9拮抗抗体に由来するポリペプチド、または本明細書中に記載の他のPCSK9拮抗薬を含む。そのような組成物の例、およびそれらを配合する方法も、既出のセクションおよび以下に記載されている。一実施形態では、組成物はPCSK9拮抗薬をさらに含む。別の実施形態では、組成物は1つまたは複数のPCSK9拮抗抗体を含む。他の実施形態では、PCSK9拮抗抗体はヒトPCSK9を認識する。さらに他の実施形態では、PCSK9拮抗抗体はヒト化されている。さらに他の実施形態では、PCSK9拮抗抗体は、抗体に媒介される溶解またはADCC等の望まないまたは望ましくない免疫応答を始動しない定常領域を含む。他の実施形態では、PCSK9拮抗抗体は抗体の1つまたは複数のCDR(1個、2個、3個、4個、5個、または一部の実施形態では6個すべてのCDR等)を含む。一部の実施形態では、PCSK9拮抗抗体はヒトである。
また、本発明は、本方法で使用するためのキットも提供する。本発明のキットには、PCSK9拮抗抗体(ヒト化抗体等)または本明細書中に記載のペプチド、および本明細書中に記載の本発明の方法のうちの任意のものに従った使用説明書を含む、1つまたは複数の容器が含まれる。一般に、これらの指示書は、上述の治療処置のためのPCSK9拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーの投与の説明を含む。
本発明のPCSK9抗体を発現させるために、上述の方法のうちの任意のものを用いて最初にVHおよびVL領域をコードしているDNA断片を得ることができる。様々な改変、たとえば、突然変異、欠失、および/または付加も、当業者に知られている標準の方法を用いてDNA配列内に導入することができる。たとえば、突然変異誘発は、PCR産物が所望の突然変異または部位特異的突然変異誘発を含有するように、突然変異したヌクレオチドをPCRプライマー内に取り込ませる、PCR媒介突然変異誘発等の標準の方法を用いて実施することができる。
組換え完全長ヒトPCSK9、組換え完全長マウスPCSK9、および様々な合成ペプチドに対して産生された500個を超えるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を、培養Huh7ヒト肝細胞中の全LDLRタンパク質をダウンレギュレーションするその能力について評価した。これらの抗体には、とりわけ、PCSK9の構造に基づいてタンパク質表面の大部分を覆うと予測された12〜20個のアミノ酸残基のポリペプチドの組に対して産生し、それと反応性のある抗体の組が存在していた。最高濃度で、最良の抗体は約60%の遮断活性しか示さなかった。
PCSK9拮抗抗体の作製およびスクリーニング
モノクローナル抗体を作製するための動物の免疫化の一般手順:
Balb/cまたは129/bl6 pcsk9−/−マウスに、13日間のスケジュールで100μgの抗原を5回注射した。PCSK9−/−(すなわちヌルまたはノックアウトマウス)は、Rashidら、2005、Proc Natl Acad Sci USA、102:5374から、またはそれによって記載されているように得ることができる。米国特許第7,300,754号も参照されたい。最初の4回の注射では、組換えタンパク質をアジュバントと混合することによって抗原を調製した。免疫原を首筋、足蹠および腹腔内への注射によって約3日ごとに11日間にわたって与え、最後のブーストは静脈内でアジュバントを用いずに投与した。13日目にマウスを安楽死させ、その脾臓を取り出した。標準のハイブリドーマ技術を用いて、リンパ球を確立された細胞系との融合によって不死化してハイブリドーマクローンを作製し、96ウェルプレート内に分配した。クローンを成長させ、その後、以下のように免疫化抗原を用いたELISAスクリーニングによって選択した。
成長中のハイブリドーマクローンからの上清培地を、組換えヒトPCSK9または組換えマウスPCSK9と結合するその能力について別々にスクリーニングした。アッセイは、100μlの抗原のうちの1つの1μg/ml溶液で終夜コーティングした96ウェルプレートで行った。0.05%のTween−20を含有するPBSを用いて、各ステップの間にウェルから過剰の試薬を洗浄した。その後、プレートを0.5%のBSAを含有するPBSで遮断した。上清をプレートに加え、室温で2時間インキュベーションした。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とコンジュゲートしたヤギ抗マウスFcを加えて、抗原と結合したマウス抗体と結合させた。その後、テトラメチルベンジジンをHRPの基質として加えて、上清中に存在するマウス抗体の量を検出した。反応を停止させ、450nmでの吸光度を読み取ることによって抗体の相対量を定量した。マウスまたはヒトPCSK9のどちらかと結合することができる抗体を分泌したハイブリドーマクローンを、さらなる分析のために選択した。
ヒトまたはマウスPCSK9結合抗体を分泌するハイブリドーマクローンを拡大し、上清を収集した。タンパク質Aビーズを用いて全IgGを約10mlの上清から精製し、PBS緩衝液中で透析し、最終体積を低下させて、0.7〜1mg/mlの抗体を有する溶液が得られた。その後、精製した抗体を用いて、Huh7細胞においてLDLRのダウンレギュレーションを媒介するPCSK9の能力を阻害する、その能力について試験した。Huh7細胞をプレートし、10%のFBS、4mMのグルタミン、ならびにペニシリンおよびストレプトアビジンを含有するRPMI培地中、96ウェルプレート中で80%コンフルエントまで成長させた。培地を10%の脱脂FBSを含有するものに8〜16時間変えて、LDLRの発現を誘導した。その後、6μg/mlのヒト(好ましくは)またはマウスPCSK9を添加した40μl/ウェルの293発現培地を用いて、70〜100μg/mlの試験抗体を用いてまたは用いずに、細胞を8〜16時間インキュベーションした。インキュベーションの終わりにPCSK9および抗体を含有する培地を除去し、17μlの溶解緩衝液と共に4Cで1時間振盪することによって細胞を溶解した。溶解緩衝液は、50mMのリン酸グリセロール、10mMのHEPES、pH7.4、1%のTriton X−100、20mMのNaCl、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche)からなっていた。細胞溶解液を収集し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウエスタンブロットの染色によって、LDLRタンパク質レベルについて分析した。LDLRレベルを部分的にまたは完全に救出することができる抗体を産生するハイブリドーマクローンを、さらなる分析のために選択した。「LDLRダウンレギュレーションアッセイ」とは、Huh7細胞を用いた上記アッセイを意味する。
抗体の結合親和性の決定
PCSK9に対するPCSK9抗体の親和性を、研究グレードのセンサーチップを備えた表面プラズモン共鳴Biacore3000バイオセンサー上で、HBS−EPランニング緩衝液(Biacore AB、Uppsala、スウェーデン、現在はGE Healthcare)を用いて測定した。標準のN−ヒドロキシスクシンイミド/エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(NHS/EDC)化学を用いて、ウサギポリクローナル抗Ms IgGを飽和レベルでチップ上にアミンカップリングさせた。緩衝液をHBS−EP+1mg/mLのBSA+1mg/mLのCM−デキストランに交換した。完全長PCSK9 IgGを約15μg/mLまで希釈し、約500RU/フローセルのレベルを得るために1分間、5μL/分で補足し、1つを参照チャネルとしてブランクとして残した。3.73〜302nMのhPCSK9または2.54〜206nMのmPCSK9を、5つのメンバーの3倍シリーズとして、1分間、100μL/分で注入した。解離を5分間監視した。それぞれの力価の最後の注入後に、100mMのリン酸を用いた2回の30秒間のパルスでチップを再生した。緩衝液サイクルによりデータを二重参照するためのブランクが提供され、その後、Biaevaluationソフトウェアv.4.1を用いたこれを単純結合モデルに包括的に当てはめた。親和性は動力学的速度定数(KD=koff/kon)の指数から演繹した。実施例2の結果を表4に示す。これらのデータは、抗体が示したようにネズミPCSK9またはヒトPCSK9に対して優れた親和性を有することを示す。
PCSK9−LDLRの相互作用に対するPCSK9抗体の効果の分析
PCSK9は、中性pH下において180nMの親和性でLDLRと結合することが示されている(Cunninghamら、2007、Nat Struct Mol Biol、14(5):413〜9)。Pierce試薬を用いて、製造の指示に従って、組換えマウスまたはヒトPCSK9タンパク質をビオチン標識した。ELISAプレート(Corning Mixisorb)をそれぞれのウェル中で1μg/mlの組換えLDLR細胞外ドメイン(R&D Systems)の溶液を用いて4Cで終夜コーティングし、2%のBSA+PBSを用いて2時間、室温で遮断し、その後、洗浄緩衝液(1×PBS+0.05%のTween−20)で5回洗浄した。ウェルを、50μlの示した濃度のビオチン標識したPCSK9タンパク質と共に1時間、室温でインキュベーションした。LDLR−PCSK9の結合は、50μlの4%のFDH+4%のスクロース+PBS溶液を加えることによって安定化することができ、5分間インキュベーションした。ウェルを洗浄緩衝液5回洗浄し、1:2000の希釈率のHRPとコンジュゲートしたStrepavidin(Invitrogen)と共に1時間、室温でインキュベーションし、洗浄緩衝液で5回洗浄した。TMB基質をウェルに加え、溶液を20〜30分間、室温でインキュベーションし、1Mのリン酸を用いて反応を停止させた。シグナルを450nmで読み取った。
L1L3:PCSK9の複合体の結晶構造、Biacore、および突然変異誘発を用いた、抗体のエピトープマッピング/結合
a.L1L3:PCSK9の複合体の結晶構造。残基は、L1L3:PCSK9の結晶構造およびPCSK9構造単独の間の接近可能な表面積の差を計算することによって同定する。L1L3抗体との複合体の形成時に埋もれた表面積を示すPCSK9残基は、エピトープの一部として含まれる。タンパク質の溶媒接近可能表面は、それがタンパク質のファンデルワールス表面上を転がる際のプローブ球(1.4Åの半径の溶媒分子を表す)の中心の位置として定義される。溶媒接近可能表面積は、プログラムAREAIMOLによって実行して、それぞれの原子の周りの拡張球上に表面点を作成し(原子とプローブ半径の和に等しい原子中心からの距離で)、隣接原子と会合した等価な球内にあるものを排除することによって計算する(Briggs,P.J.、2000、CCP4 Newsletter、第38号、CCLRC、Daresbury)。
mAb 突然変異体効果の降順の結合残基
4A5 R237、F379、369、R194、R199およびD238
5A10 R194、R237、I369、D238、R199
6F6 R237、R194、F379、D238、I369、T377、R199
7D4 R237、R194、F379、I369、R199
抗体のクローニングおよび配列決定
QIAshredderスピンカラムを用いて百万個のハイブリドーマ細胞をホモジナイズし、QIAGENのRNAeasy Microキットに従って全RNAを抽出した。InvitrogenのSuperScript III RTキットを用いてcDNAを合成した。PCSK9抗体からの可変領域を、マウスIgG重鎖遺伝子およびマウスカッパまたはラムダ軽鎖をクローニングするために縮重プライマーからなる、NovagenのマウスIgG−プライマー組を用いてクローニングした。PCRサイクル条件は以下のとおりである:92Cで2分間を1サイクル、94Cで30秒間、44Cで30秒間および72Cで2分間を2サイクル、94Cで30秒間、46Cで30秒間および72Cで2分間を2サイクル、94Cで30秒間、48Cで30秒間および72Cで2分間を2サイクル、94Cで30秒間、50Cで30秒間および72Cで2分間を2サイクル、94Cで30秒間、52Cで30秒間および72Cで2分間を2サイクル、続いて、94Cで30秒間、54Cで30秒間および72Cで45秒間を35サイクル。生じたPCR産物をInvitrogenからのTopo−TAクローニングベクター内にクローニングし、配列決定した。クローニングした抗体配列は、腹水から産生させた元の抗体の最初の10個のアミノ酸のN末端配列決定によって確認された。
免疫化のための抗原の作製
組換えヒトPCSK9タンパク質を報告されているように産生したCunninghamら、2007、Nat Struct Mol Biol、14(5):413〜9。組換えマウスPCSK9タンパク質を産生するために、当分野で知られている方法によって、C末端に6−Hisタグを付加してマウスPCSK9のcDNAを哺乳動物発現ベクターPRK5内にクローニングし、一過性にトランスフェクトし、HEK293細胞中で発現させた。Niカラムを用いて組換えタンパク質を馴化培地から精製した。
PCSK9拮抗薬としてのPCSK9に特異的な抗体
1.PCSK9に特異的な拮抗抗体の同定
a.PCSK9を遮断する抗体の同定
ヒトおよび/またはマウスPCSK9に対するネズミ抗体は、マウスを実施例6で調製したヒト−PCSK9およびマウス−PCSK9合成ペプチドまたは組換えタンパク質で免疫化し、実施例1に記載したヒトおよび/またはマウスPCSK9組換えタンパク質を抗原として用いたELISAアッセイならびに他の標準のハイブリドーマ手順によって抗体をスクリーニングすることによって、産生した。500個を超える陽性クローンが得られ、6ウェルプレート中、10mlの培地を用いてコンフルエントまで成長させた。培地上清を収集し、mAb Select(Pierce)を用いて馴化培地中の全IgGを精製した。マウスおよびヒトPCSK9の機能を阻害する精製および濃縮したマウスIgGの能力を、Huh7細胞において実施例1に記載の方法を用いて試験した。ある程度の遮断を示したIgGを発現するハイブリドーマクローンを拡大し、再試験した。60個の有望なクローンをサブクローニングし、拡大し、Balb/cまたはヌードマウスのどちらかに注射して腹水を産生させた。腹水から精製した抗体を、Huh7細胞においてヒトまたはマウスPCSK9によってLDLRのダウンレギュレーションを阻害するその能力について再試験した。4個のハイブリドーマクローン、4A5、5A10、6F6、および7D4が、ヒトPCSK9の機能を完全に阻害する、およびマウスPCSK9の機能を少なくとも部分的に阻害することができると同定された。これらの遮断抗体のそれぞれのIC50を決定するために、100μg/mlから開始して3.125μg/mlまでのIgGの段階希釈液をアッセイで使用し、ヒトおよびマウスPCSK9の濃度は6μg/mlの一定とした。
PCSK9は、LDLRと共に細胞区画中に同時局在化することが示されている(Lagaceら、2006、J Clin Inv、116(11):2995〜3005。また、組換えPCSK9タンパク質はin vitroでLDLR細胞外ドメインとも結合する(Fisherら、2007、JBC、282(28):20502〜12。PCSK9に媒介されるLDLRのダウンレギュレーションの阻害と抗体によるPCSK9−LDLRの結合の阻害との関係性を決定するために、LDLRに対するPCSK9の機能を部分的にまたは完全に遮断したPCSK9抗体および遮断しない抗体の代表例を試験した。また、1つ以外のすべての部分拮抗抗体は、LDLR細胞外ドメインとPCSK9との結合も部分的に阻害した。PCSK9の機能を完全に遮断することができる拮抗抗体、すなわち4A5、5A10、6F6および7D4は、LDLR細胞外ドメインとPCSK9との結合も完全に阻害した(表5)。これら4つの抗体のIC50値はPCSK9に対するその結合親和性に相関している。
図4は、抗PCSK9抗体のエピトープビニング(binning)を例示する。パートA)は、Biacoreによる合成13〜18量体ペプチドまたはエピトープ結合との結合によって決定した、抗PCSK9 mAbのエピトープ情報を示す。パートB)は、Biacoreアッセイによる、y軸に示したmAbと事前に混合したヒトPCSK9と結合する、固定した抗体6F6、5A10および4A5の能力を示す。
抗PCSK9抗体の種特異性を決定するために、抗体を様々な種に由来する血漿と共にインキュベーションし、生じた複合体を精製し、ウエスタンブロット上の独立した抗PCSK9抗体によってプロービングした。抗体4A5、5A10、6F6、および7D4はヒト、カニクイザル、マウス、およびラットのPCSK9を認識した。図5を参照されたい。抗体6G7はネズミPCSK9のみを認識し、非関連の対照抗体42H7は試験したどのPCSK9も認識しなかった。同上。
実施例5に記載の方法を用いてPCSK9抗体4A5、5A10、6F6、および7D4の可変ドメインのアミノ酸配列を決定した。配列は、抗体は関連しているが、互いに異なることを示す。表1は、それぞれの抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。表7は、カバットおよびコチア(Chotia)の方法によって同定した、表1の軽鎖および重鎖のCDR配列を示す。
a.PCSK9拮抗抗体はマウスにおいて血清コレステロールを下降させる
PCSK9拮抗モノクローナル抗体が細胞外PCSK9の機能を阻害することによってin vivoでコレステロールレベルに影響を与えることができるかどうかを決定するために、7D4の効果を、in vitroでマウスPCSK9に対して、マウス内に注射した場合の血清コレステロールにおいて試験した。6〜7週齢の雄のC57/bl6マウスを12時間の明/暗サイクルで保ち、−7日目に出血させて約70μlの血清を収集した。拮抗PCSK9抗体7D4、およびモノクローナル抗体に一致する対照アイソタイプを、雄の7週齢のC57/bl6マウスに、腹腔内注射によって0、1、2、および3日目に注射した。マウスを絶食させずに4日目に屠殺し、血清試料を収集した。すべての凍結血清試料を総コレステロール、トリグリセリド、HDLコレステロールおよびLDLコレステロールの測定のためにIDEXX laboratoriesに送った。図6は、7D4は血清コレステロールを48%下げた一方で、対照抗体は有意な影響を全く与えなかったことを示す。量および低下のパーセンテージはどちらもPCSK9−/−マウス(PCSK9ノックアウトマウス)で報告されていたものに類似しており、これは、細胞外PCSK9のみを遮断することでPCSK9の機能の完全またはほぼ完全な阻害を達成することができ、細胞内PCSK9は正常な生理的条件下におけるLDLRのダウンレギュレーションにわずかな役割しか果たさないまたは役割を果たさないことを示唆している。予測どおり、対照抗体で処置したものと比較して、7D4で処置した動物では肝臓LDLRレベルが誘導されていた(図6)。
図7は、部分拮抗薬ポリクローナル抗PCSK9 mAb CRN6がマウスにおいてコレステロールレベルに影響を与えないことを例示する。−7日目に2つの群の8週齢のC57/bl6マウス(n=10匹のマウス/群)を出血させ、コレステロールレベルについて試験し、0、1、2および3日目に15mg/kg/日のCRN6または対照抗体を静脈内投与によって投与し、その後、出血させ、最終用量の24時間後にコレステロールレベルについて試験した。図7Aは、CRN6抗体がHuh7細胞においてPCSK9に媒介されるLDLRのダウンレギュレーションをin vitroで部分的に遮断することを示す。図7Bは、CRN6抗体の投与がマウスにおいて血清コレステロールレベルに影響を与えないことを示す。
マウスにおけるPCSK9拮抗抗体のコレステロール下降効果の発生時および持続期間を決定するために時間経過研究を行った。mAb 7D4または生理食塩水対照をそれぞれ48匹の6週齢のC57/bl6マウスに10mg/kgまたは3ml/kgで静脈内注射した。それぞれの処置群からの8匹のマウスを注射後の1、2、4、7、14および21日目に屠殺した。7D4の単一の注射により、血清コレステロールに対する急速かつ持続した下降効果が生じた。血清コレステロールの25%の低下が注射後24時間で見られた。図8を参照されたい。血清コレステロールの最大降下が7日の時点で観察された。21日で、コレステロールの低下が統計的に有意でなくなった。パートB)はHDLコレステロールを示す。LDLコレステロールレベルは非常に低かった。
図10は、抗PCSK9拮抗抗体5A10がマウスにおいてコレステロールレベルを用量依存的に下げることを例示する。図10Aは、示した用量の抗体または生理食塩水を0、1、2、および3日目に1日1回静脈内ボーラス注射によって投与した、6つの群の8週齢のC57/bl6マウス(n=8匹/群)を示す。血清試料を収集し、最後の用量の24時間後にコレステロールレベルについて試験し、漸増する用量の抗体に伴った漸進的な減少が示された。図10Bは、示した用量の抗体または生理食塩水を0日目に腹腔内ボーラス注射によって投与した、5つの群の8週齢のC57/bl6マウス(n=8匹/群)を示す。血清試料を収集し、7日目にコレステロールレベルについて試験し、やはり漸増する用量の抗体に伴った漸進的な減少が示された。
PCSK9拮抗抗体が非ヒト霊長類において血清LDLを下降させる
PCSK9に対する抗体のin vivo効果を試験するために、抗体7D4をカニクイザルにおいて試験した。4匹の3〜4歳のカニクイザルに、ビヒクル(PBS+0.01%のTween20)を0日目に、および10mg/kgの7D4を7日目に注射した。血漿脂質プロフィールを、終夜の絶食後に0、2、7、9、11、14、21および28日目に分析した。10mg/kgの7D4の単一の注射により、4匹の動物すべてにおいて血漿LDL(60%)(図15A)およびLDL粒子数(図15D)の劇的な低下が生じた一方で、そのHDLレベル(図15B)およびHDL粒子数(図15E)には最小限の影響しか与えられなかった。総コレステロール(図15C)も7D4の処置後に低下した一方で、トリグリセリドレベル(図15F)には有意な影響が与えられなかった。全7D4(G)および全PCSK9レベル(H)も測定した。
ヒト化抗PCSK9抗体
ネズミモノクローナル抗体5A10をヒト化および親和性成熟してL1L3抗体をもたらした。L1L3は、Biacoreによって測定した場合に、ネズミPCSK9に対する親和性が200pMであり、ヒトPCSK9に対する親和性が100pMである。L1L3は、100nMのヒトまたはネズミPCSK9抗体と共にインキュベーションした場合に、培養Huh7細胞においてLDLRのPCSK9に媒介されるダウンレギュレーションを完全に阻害する。図19を参照されたい。
ATCC PTA−8985
ATCC PTA−8984
ATCC PTA−8983
Claims (8)
- 約1mg/mlから約200mg/mlの、配列番号188のアミノ酸配列を含むPCSK9に対し特異的に結合するアンタゴニスト抗体;
約1mMから約100mMの緩衝液;
約0.01mg/mlから約10mg/mlの界面活性剤;および
約100mMから約400mMの安定化剤;
を含み、約5.0から約6.5のpHを有する、水性製剤。 - 約1mg/mlから約200mg/mlの、配列番号188のアミノ酸配列を含むPCSK9に対し特異的に結合するアンタゴニスト抗体;
約1mMから約100mMの緩衝液;
約0.01mg/mlから約10mg/mlの界面活性剤;
約100mMから約400mMの安定化剤;および
約0.01mMから約1.0mMのキレート化剤;
を含み、約5.0から約6.5のpHを有する、水性製剤。 - 抗体が、配列番号8、59、もしくは60に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(VH)相補性決定領域1(CDR1)、配列番号61もしくは9に示すアミノ酸配列を有するVH CDR2、配列番号10に示すアミノ酸配列を有するVH CDR3、配列番号11に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(VL)CDR1、配列番号12に示すアミノ酸配列を有するVL CDR2、および配列番号13に示すアミノ酸配列を有するVL CDR3、を含む、請求項1または2に記載の製剤。
- 抗体がVHおよびVL領域を含み、VH領域が配列番号54に示すアミノ酸配列を含みVL領域が配列番号53に示すアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の製剤。
- 緩衝液がヒスチジン緩衝液である、請求項1から4のいずれか1項に記載の製剤。
- 界面活性剤がポリソルベート80である、請求項5に記載の製剤。
- 安定化剤がトレハロースである、請求項6に記載の製剤。
- キレート化剤がEDTAである、請求項7に記載の製剤。
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