BR112020001885A2

BR112020001885A2 - sistemas e métodos para preparação em tempo real de uma amostra de polipeptídeo para análise com espectrometria de massa

Info

Publication number: BR112020001885A2
Application number: BR112020001885-6A
Authority: BR
Inventors: Chao-Hsiang Wu
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 2017-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2020-08-04
Also published as: KR20200035093A; KR102560646B1; EP3662287B1; CA3071676A1; JP7237022B2; CL2020000248A1; CN110869768A; US20200355582A1; WO2019028187A1; MA49757A; CN110869768B; IL271499A; JP2020530103A; EP3662287A1; IL271499B1; EA202090399A1; US12104995B2; ES2978396T3; SG11202000727SA; AU2018309027A1

Abstract

Sistemas e métodos que facilitam o desempenho de um ensaio de uma amostra substancialmente em tempo real. Assim, o ensaio pode ser realizado, e o resultado desejado obtido, muito mais rapidamente do que o permitido pelos sistemas e métodos convencionais.

Description

SISTEMAS E MÉTODOS PARA PREPARAÇÃO EM TEMPO REAL DE UMA AMOSTRA DE POLIPEPTÍDEO PARA ANÁLISE COM ESPECTROMETRIA DE MASSA REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisória dos E.U.A. N.º 62/539,803, intitulado “Systems and Methods for Performing a Real-Time Assay of a Sample” e depositado a 1 de agosto de 2017, a divulgação inteira do qual é deste modo aqui incorporada a título de referência.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[0002] A presente divulgação se relaciona geralmente com ensaios e, mais especificamente, com a realização de um ensaio em tempo real de uma amostra.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0003] O presente pedido está sendo depositado com uma listagem de sequências em formato eletrônico. A listagem de sequências proporcionada como um ficheiro intitulado ”51800_Seqlisting.txt” criado a 31 de julho de 2018 e tem

263.964 bytes em tamanho. A informação no formato eletrônico da listagem de sequências é incorporada aqui por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES

[0004] Ensaios são comumente realizados para quantificar um ou mais atributos de um analito tal como um fármaco, uma substância bioquímica ou uma célula. Um exemplo de um tal ensaio é o ensaio de método multiatributos (MAM), que pode detectar e quantificar Atributos Críticos de Qualidade (CQA),

identificados pelo Perfil de Produtos Alvo de Qualidade (QTPP), de uma amostra (Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics. Rogers RS, Nightlinger NS, Livingston B, Campbell P, Bailey R, Balland A. MAbs. 2015; 7 (5): 881-90). O ensaio MAM é um processo manualmente operado que é realizado em, por exemplo, um laboratório de Teste de Liberação de Moléculas Grandes (LMRT). MAM é um método de mapeamento de peptídeos à base de cromatografia líquida (LC) - espectrometria de massa (MS), compreendendo três etapas: (1) preparação de amostras (tal como desnaturação, redução, alquilação e digestão de polipeptídeos); (2) separação dos polipeptídeos digeridos por LC e detecção por MS; e (3) análise dos dados quanto a CQA visados e detecção de novo sinal (isto é, picos) em comparação com um padrão de referência.

[0005] Os CQA são propriedades químicas, físicas ou biológicas que estão presentes dentro de um valor ou gama valores específico. Por exemplo, para moléculas terapêuticas de polipeptídeos grandes, os atributos físicos e modificações de aminoácidos (os blocos de construção de polipeptídeos) são CQA importantes que são monitorizados durante a e após a fabricação, bem como durante o desenvolvimento de fármacos. Ao contrário de ensaios analíticos convencionais que acompanham mudanças no tamanho de pico e forma de pico de polipeptídeos inteiros ou parciais, MAM detecta CQA específicos ao nível dos aminoácidos.

[0006] No entanto, embora o MAM seja um avanço importante na avaliação de CQA de moléculas terapêuticas polipeptídicas durante o desenvolvimento, fabricação e armazenamento (avaliação, p. ex., estabilidade), a análise pode consumir sete a dez dias, desde a preparação da amostra até a análise final, tempo que gera custos e atrasos no desenvolvimento e liberação de medicamentos. Por exemplo, a terapêutica polipeptídica é habitualmente produzida por células cultivadas que expressam o polipeptídeo alvo. Tais sistemas de produção não são facilmente "suspensos" enquanto a análise de MAM de CQA está pendente, resultando nas células que produzem o polipeptídeo alvo com CQA que não atendem às especificações - um desperdício de tempo, materiais e mão de obra. Além disso, atrasos de sete a dez dias se acumulam durante o desenvolvimento de fármacos, por exemplo, quando se otimizam condições de cultura, impedindo distribuição de farmacêuticos de polipeptídeos importantes e novos a pacientes. Assim, existe uma necessidade de métodos eficientes e mais rápidos para facilitar a análise de CQA utilizando MAM.

SUMÁRIO

[0007] Um aspecto da presente divulgação proporciona um método para realizar um ensaio em tempo real. O método inclui as etapas de: (a) mover uma amostra de um produto contendo polipeptídeos para uma coluna de ligação de polipeptídeos através de uma primeira bobina de retenção; (b) ligar os polipeptídeos na amostra à coluna de ligação de polipeptídeos, separando assim os polipeptídeos na amostra de um restante da amostra; (c) mover uma solução de tampão de eluição de uma fonte de tampão para a coluna de ligação de polipeptídeos, através da primeira bobina de retenção e através de uma segunda bobina de retenção a jusante da coluna de ligação de polipeptídeos, eluindo assim os polipeptídeos ligados à coluna de ligação de polipeptídeos e movendo uma mistura de eluição/polipeptídeos compreendendo a solução de tampão de eluição e os polipeptídeos eluídos para a segunda bobina de retenção; (d) mover a mistura de eluição/polipeptídeos da segunda bobina de retenção para uma câmara de reação; (e) incubar os polipeptídeos na mistura de eluição/polipeptídeos na câmara de reação, resultando em polipeptídeos desnaturados; (f) mover um reagente redutor que cliva reticulações de ligações dissulfeto para a câmara de reação através da primeira bobina de retenção após (e); (g) incubar os polipeptídeos desnaturados com o reagente redutor na câmara de reação, resultando em polipeptídeos desnaturados e reduzidos; (h) mover um reagente alquilante que alquila sulfidrilas para a câmara de reação após (g); (i) incubar os polipeptídeos desnaturados e reduzidos com o reagente alquilante na câmara de reação, alquilando assim os polipeptídeos desnaturados e reduzidos; (j) mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente redutor e o reagente alquilante da câmara de reação para uma coluna de dessalinização através da primeira bobina de retenção, a coluna de dessalinização equilibrada com um tampão de proteólise; (k) aplicar os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados à coluna de dessalinização, separando assim os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados dos reagentes redutores e alquilantes e resultando em polipeptídeos dessalinizados; (l) mover os polipeptídeos dessalinizados para uma coluna de enzima proteolítica a jusante da coluna de dessalinização; (m) digerir os polipeptídeos dessalinizados na terceira coluna de polipeptídeos, resultando em polipeptídeos digeridos; e (n) mover os polipeptídeos digeridos para um dispositivo analítico para análise dos polipeptídeos digeridos.

[0008] Outro aspecto da presente divulgação proporciona um método para realizar um ensaio em tempo real usando um sistema fechado, incluindo uma válvula multiportas, uma primeira bobina de retenção a montante da válvula multiportas, uma coluna de ligação de polipeptídeos fluidamente acoplada a, e a jusante de, uma primeira porta da válvula multiportas, uma segunda bobina de retenção fluidamente acoplada à, e a jusante da, coluna de ligação de polipeptídeos, uma câmara de reação fluidamente acoplada às e a jusante das segundas e terceiras portas da válvula multiportas, uma coluna de dessalinização fluidamente acoplada a, e a jusante de, uma quarta porta da válvula multiportas, e uma coluna de enzima proteolítica a jusante da coluna de dessalinização. O método inclui: (a) movimento, através de um controlador acoplado comunicativamente ao sistema fechado, de uma amostra de um produto contendo polipeptídeos para a primeira bobina de retenção; (b) posicionamento, através do controlador, da válvula multiportas em uma primeira posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à coluna de ligação de polipeptídeos através da primeira porta da válvula multiportas, de modo que a amostra flua para a primeira coluna, por meio da qual os polipeptídeos na amostra se ligam à coluna de ligação de polipeptídeos; (c) quando a válvula multiportas está na primeira posição, movimento, através do controlador, de uma solução de tampão de eluição de uma fonte de solução de tampão de eluição para a segunda bobina de retenção através da coluna de ligação de polipeptídeos, de modo que a solução de tampão de eluição elui substancialmente todos os polipeptídeos ligados à coluna de ligação de polipeptídeos; (d) movimento, através do controlador, da válvula multiportas para uma segunda posição na qual a segunda bobina de retenção está conectada à câmara de reação através da segunda porta da válvula multiportas; (e) quando a válvula multiportas estiver na segunda posição, movimento, através do controlador, de uma mistura de eluição/polipeptídeos compreendendo a solução de tampão de eluição e os polipeptídeos eluídos para a câmara de reação, por meio da qual os polipeptídeos na mistura de eluição/polipeptídeos são desnaturados; (f) movimento, através do controlador, da válvula multiportas para uma terceira posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas; (g) após (f), movimento, através do controlador, de um reagente redutor que cliva as reticulações de ligações dissulfeto para a primeira bobina de retenção e movimento, através do controlador, do reagente redutor da primeira bobina de retenção para a câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas, reduzindo assim os polipeptídeos desnaturados; (h) após (g), movimento, através do controlador, de um reagente alquilante que alquila grupos sulfidrila para a primeira bobina de retenção e movimento, através do controlador, do reagente alquilante da primeira bobina de retenção para a câmara de reação através da terceira porta, alquilando assim os polipeptídeos desnaturados e reduzidos; (i) movimento, através do controlador, dos polipeptídeos alquilados, da solução de tampão de eluição, do reagente redutor e do reagente alquilante da câmara de reação para a primeira bobina de retenção através da terceira porta; (j) movimento, através do controlador, da válvula multiportas para uma quarta posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à coluna de dessalinização através da quarta porta da válvula multiportas e, quando a válvula multiportas está na quarta posição, movimento dos polipeptídeos alquilados, da solução de tampão de eluição, do reagente redutor e do reagente alquilante da primeira bobina de retenção para a coluna de dessalinização, por meio da qual os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados são aplicados à coluna de dessalinização, separando assim os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados dos reagentes redutores e alquilantes, resultando em polipeptídeos dessalinizados; (k) movimento, através do controlador, dos polipeptídeos dessalinizados para a coluna da enzima proteolítica, por meio da qual os polipeptídeos dessalinizados são digeridos; e (l) passar, através do controlador, os polipeptídeos digeridos para um dispositivo analítico, por meio do qual os polipeptídeos digeridos são analisados.

[0009] Outro aspecto da presente divulgação proporciona um sistema fechado para realizar um ensaio em tempo real, on-line. O sistema inclui: uma primeira bobina de retenção disposta fluidamente para receber uma amostra de um produto contendo polipeptídeos; uma válvula multiportas acoplada fluidamente à, e localizada a jusante da, primeira bobina de retenção; uma coluna de ligação de polipeptídeos fluidamente acoplada à válvula multiportas e disposta para receber a amostra da primeira bobina de retenção através de uma primeira porta da válvula multiportas, a coluna de ligação de polipeptídeos configurada para ligar os polipeptídeos da amostra; uma fonte de tampão fluidamente acoplada à válvula multiportas e disposta para fornecer solução de tampão de eluição a uma segunda bobina de retenção localizada a jusante da coluna de ligação de polipeptídeos, de modo que a solução de tampão de eluição é adaptada para eluir substancialmente todos os polipeptídeos da coluna de ligação de polipeptídeos; uma câmara de reação fluidamente acoplada à válvula multiportas e disposta a jusante da coluna de ligação de polipeptídeos, a câmara de reação adaptada para receber uma mistura da coluna de ligação de polipeptídeos através de uma segunda porta da válvula multiportas, a mistura compreendendo a solução de tampão de eluição e os polipeptídeos eluídos, em que os polipeptídeos da mistura são desnaturados na câmara de reação, em que a câmara de reação é disposta para receber um reagente redutor que cliva reticulações de ligações dissulfeto através da primeira bobina de retenção e uma terceira porta da válvula multiportas, o reagente redutor reduz os polipeptídeos desnaturados e em que a câmara de reação é ainda disposta para receber um reagente alquilante que alquila sulfidrilas através da primeira bobina de retenção e da terceira porta da válvula multiportas, em que o reagente alquilante alquila os polipeptídeos desnaturados e reduzidos na câmara de reação; uma coluna de dessalinização fluidamente acoplada à válvula multiportas e disposta para receber os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição e o reagente alquilante da câmara de reação, a coluna de dessalinização configurada para separar os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados da solução de tampão de eluição, do reagente redutor e do reagente alquilante; e uma coluna de enzima proteolítica fluidamente acoplada à, e disposta a jusante da, segunda coluna de polipeptídeo para obter os polipeptídeos separados da coluna de dessalinização, a coluna de enzima proteolítica configurada para digerir os polipeptídeos dessalinizados.

[0010] Outro aspecto da presente divulgação proporciona um sistema fechado para realizar um ensaio em tempo real. O sistema inclui: uma válvula multiportas; uma primeira bobina de retenção a montante da válvula multiportas; uma coluna de ligação de polipeptídeos fluidamente acoplada a, e a jusante de, uma primeira porta da válvula multiportas; uma segunda bobina de retenção fluidamente acoplada à, e a jusante da, coluna de ligação de polipeptídeos; uma câmara de reação fluidamente acoplada à, e a jusante da, segunda e terceira portas da válvula multiportas; uma coluna de dessalinização fluidamente acoplada a, e a jusante de, uma quarta porta da válvula multiportas; uma coluna de enzima proteolítica a jusante da coluna de dessalinização; e um controlador comunicativamente acoplado à válvula multiportas. O controlador inclui uma memória, um processador e lógica armazenada na memória e executável pelo processador para: (a)

mover uma amostra de um produto contendo polipeptídeos para a primeira bobina de retenção; (b) posicionar a válvula multiportas em uma primeira posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à coluna de ligação de polipeptídeos através da primeira porta da válvula multiportas, de modo que a amostra flua para a primeira coluna, por meio da qual os polipeptídeos na amostra se ligam à coluna de ligação de polipeptídeos; (c) quando a válvula multiportas estiver na primeira posição, mover uma solução de tampão de eluição de uma fonte de solução de tampão de eluição para a segunda bobina de retenção através da coluna de ligação de polipeptídeos, de modo que a solução de tampão de eluição elua substancialmente todos os polipeptídeos ligado à coluna de ligação de polipeptídeos; (d) mover a válvula multiportas para uma segunda posição na qual a segunda bobina de retenção está conectada à câmara de reação através da segunda porta da válvula multiportas; (e) quando a válvula multiportas estiver na segunda posição, mover uma mistura de eluição/polipeptídeos compreendendo a solução de tampão de eluição e os polipeptídeos eluídos para a câmara de reação, por meio da qual os polipeptídeos na mistura de eluição/polipeptídeos são desnaturados; (f) mover a válvula multiportas para uma terceira posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas; (g) após (f), mover um reagente redutor que cliva as ligações dissulfeto à primeira bobina de retenção e mover o reagente redutor da primeira bobina de retenção para a câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas,

reduzindo assim os polipeptídeos desnaturados; (h) após (g), mover um reagente alquilante que alquila sulfidrilas para a primeira bobina de retenção e mover o reagente alquilante da primeira bobina de retenção para a câmara de reação através da terceira porta, alquilando assim os polipeptídeos desnaturados e reduzidos; (i) mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente redutor e o reagente alquilante da câmara de reação para a primeira bobina de retenção através da terceira porta; (j) mover a válvula multiportas para uma quarta posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à coluna de dessalinização através da quarta porta da válvula multiportas e, quando a válvula multiportas estiver na quarta posição, mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente redutor e o reagente alquilante da primeira bobina de retenção para a coluna de dessalinização, por meio da qual os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados são dessalinizados; (k) mover os polipeptídeos dessalinizados para a coluna da enzima proteolítica, por meio da qual os polipeptídeos dessalinizados são digeridos; e (l) passar os polipeptídeos digeridos para um dispositivo de análise de glicanas, por meio do qual os polipeptídeos digeridos são separados e quantificados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A FIG. 1 é um diagrama esquemático de um sistema para realização de um ensaio em tempo real, on-line, montado de acordo com os ensinamentos da presente divulgação.

[0012] A FIG. 2 é um digrama esquemático de um controlador do sistema ilustrado na FIG. 1.

[0013] As FIGS. 3A e 3B são gráficos ilustrando os resultados de um estudo monitorizando a eficácia do sistema da FIG. 1 ao longo de uma operação de produção de 40 dias.

[0014] A FIG. 3C é um gráfico ilustrando um instantâneo dos resultados da FIG. 3B ao longo de um período de tempo de 8 dias.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[0015] A presente divulgação proporciona ensaios e métodos em tempo real que permitem o monitoramento e controle de CQA em tempo real, de modo que o produto terapêutico polipeptídico final desejado possa ser produzido. Os ensaios e métodos divulgados podem facilitar o tempo de resposta dos resultados do MAM, de modo que os resultados estejam disponíveis dentro de algumas horas (p. ex., duas a três horas) em vez de um resultado típico de medição off-line, operado manualmente, de sete a dez dias. Assim, os ensaios e métodos divulgados melhoram o tempo de rotação em aproximadamente 54 a 120 vezes. Esses resultados "on-the-fly" (em tempo real) permitem, por exemplo, ajustar variáveis de produção para fabricar com eficiência (on-line) produtos tendo CQA apropriados.

[0016] A FIG. 1 ilustra um diagrama esquemático de um sistema 100 montado de acordo com os ensinamentos da presente divulgação. O sistema 100, que pode estar localizado junto de ou em um laboratório (p. ex., um laboratório de Teste da Liberação de Moléculas Grandes) é um sistema fechado para a realização automática ou substancialmente automática de um ensaio de uma amostra de um produto contendo polipeptídeos, como descrito em mais detalhes abaixo. Por automatização (ou automatização substancial) deste processo usando o sistema 100, o ensaio pode ser realizado em tempo real (ou substancialmente em tempo real), de tal forma que o processo inteiro possa ser realizado, e o resultado desejado obtido, em uma questão de horas (p. ex., 2 a 3 horas), uma melhoria significativa em relação aos 7 a 10 dias tipicamente requeridos pelos ensaios de MAM manualmente operados, convencionalmente conhecidos. Além disso, a natureza fechada do processo que utiliza o sistema 100 mantém condições estéreis.

[0017] Nesta versão, os polipeptídeos podem ser polipeptídeos terapêuticos, os quais são discutidos mais abaixo

[0018] O sistema 100 ilustrado na FIG. 1 inclui geralmente uma válvula multiportas 104, uma primeira bobina de retenção 108, uma primeira coluna 112, uma segunda bobina de retenção 116, uma câmara de reação 120, uma segunda coluna 124, uma terceira coluna 128 e um controlador 132. Na versão ilustrada na FIG. 1, o sistema 100 também inclui um recipiente 136, uma bomba 140, uma primeira câmara de resíduos 144, uma segunda câmara de resíduos 148, uma terceira câmara de resíduos 152 e um dispositivo analítico 156 para analisar os polipeptídeos. Em outras versões, no entanto, o sistema 100 pode não incluir um ou mais destes componentes. Como um exemplo, o sistema 100 pode não incluir o recipiente 136 e/ou o dispositivo analítico

156. Em qualquer caso, o encanamento geralmente convencional se estende entre cada um dos componentes do sistema 100 de modo a facilitar a comunicação fluida entre os componentes do sistema 100 quando desejado, como é descrito em mais detalhe em baixo. A válvula multiportas 104 está geralmente configurada para controlar a comunicação fluida entre os vários componentes do sistema 100. Em esta versão, a válvula multiportas 104 é uma porta com doze satélites e uma válvula de porta partilhada central. Por outras palavras, a válvula multiportas 104 tem uma porta central 160 e doze portas de satélite 164-175 que estão seletivamente fluidamente acopladas à porta central 160. A válvula multiportas 104 é movimentável entre doze posições diferentes que acoplam fluidamente a porta central 160 com as doze portas de satélite diferentes 164-175, respectivamente (algumas das quais não são utilizadas na operação do sistema 100 da FIG. 1). Em outras versões, a válvula multiportas 104 pode incluir mais ou menos portas de satélite, pode ser um tipo diferente de válvula ou pode estar substituída por uma ou mais válvulas diferentes (tendo cada uma uma ou mais portas). Como um exemplo, a válvula multiportas 104 pode estar substituída por uma pluralidade de válvulas de porta única separadamente conectadas ao e controladas pelo controlador 132, com cada uma das válvulas de porta única substituindo efetivamente uma das portas de satélite 164-175.

[0019] O recipiente 136 está geralmente configurado para reter ou armazenar o produto contendo polipeptídeos a ser analisado. O recipiente 136 em esta versão toma a forma de um biorreator que retém ou armazena o produto. Em outras versões, no entanto, o recipiente 136 pode ao invés tomar a forma de um vaso de cultura de células, como um balão, uma placa, etc.. O recipiente 136 está fluidamente acoplado à porta de satélite 164 da válvula 104 através de uma conduta 180 do encanamento, tal que a válvula 104 possa, quando desejado, obter uma amostra do produto contido no recipiente 136 a partir do recipiente

136.

[0020] A primeira bobina de retenção 108 está localizada a montante da válvula 104 e está fluidamente acoplada à porta central 160 da válvula 104 através de uma conduta 184 do encanamento. A primeira bobina de retenção 108 está assim disposta para receber a amostra do produto a partir do recipiente 136, através da válvula 104, quando a válvula 104 está em uma primeira posição na qual a porta central 160 está fluidamente acoplada à porta de satélite 164.

[0021] A primeira coluna 112 está localizada a jusante da válvula 104 e está fluidamente acoplada à porta de satélite 165 da válvula 104 através de uma conduta 188 do encanamento. A primeira coluna 112 está assim disposta para receber a amostra a partir da primeira bobina de retenção 108, através da válvula 104, quando a válvula 104 está em uma segunda posição na qual a porta central 160 está fluidamente acoplada à porta de satélite 165. Quando a primeira coluna 112 recebe a amostra, a primeira coluna 112 é configurada para ligar polipeptídeos da amostra à medida que a amostra flui através desta. Desta maneira, a primeira coluna 112 separa os polipeptídeos na amostra a partir de um restante da amostra, que pode ser passado para a primeira câmara de resíduos 144 através da segunda bobina de retenção 116.

[0022] A primeira coluna 112, que pode ser também referida aqui como uma coluna de ligação de polipeptídeos, é selecionada a partir do grupo consistindo em uma coluna de proteína A, uma coluna de proteína G, uma coluna de proteína A/G, uma coluna de proteína L, uma coluna de aminoácidos, uma coluna de avidina, uma coluna de estreptavidina, uma coluna de ligação de carboidratos, uma coluna de carboidratos, uma coluna de glutationa, uma coluna de heparina, uma coluna de interação hidrofóbica, uma coluna de imunoafinidade, uma coluna de nucleotídeos/coenzimas, uma coluna de especialidade e uma coluna de cromatografia de afinidade com metais imobilizados (IMAC). Por exemplo, no caso de polipeptídeos que são IgGs humanas das subclasses 1, 2 ou 4, IgM, IgA ou IgE (e compreendendo uma porção Fc humana e/ou uma região Fab da família de VH3 humanas), colunas de proteína A são úteis. As colunas de proteína G podem ser usadas para purificar IgGs humanas das subclasses 1-4. As colunas de proteína de fusão recombinante A/G podem ser também usadas para purificar todas estas classes de anticorpos humanos, pois a proteína de fusão proporciona locais de ligação à proteína A e à proteína G. Assim, proteínas de fusão de proteína A/G podem ser usadas para purificar IgG, IgA, IgE e IgM humanas. Além do mais, as colunas de proteína L podem ser usadas para purificar IgG, IgM, IgA, IgE e IgD humanas, contanto que os anticorpos alvo tenham uma cadeia leve subtipo kappa (κ) apropriada (isto é, subtipos VκI, VκIII e VκIV); as colunas de proteína L podem ser também usadas para purificar fragmentos Fab e scFv tendo também subtipo de cadeia κ apropriado, pois a proteína L se liga à cadeia variável (V) de anticorpos.

[0023] A bomba 140 está localizada a montante da, e fluidamente acoplada à, primeira bobina de retenção 108 através de uma conduta 192 do encanamento. A bomba 140 nesta versão assume a forma de uma bomba de seringa que está fluidamente acoplada a uma primeira fonte de tampão 196 e uma segunda fonte de tampão 200. Nesta versão, a primeira fonte de tampão 196 é uma fonte de tampão de eluição que pode fornecer uma solução de tampão de eluição 204, p. ex., no caso de anticorpos ligados à proteína A, um tampão ácido; ou no caso de anticorpos ligados à proteína G, tampão muito ácido (pH 3 ou menos); um perito na técnica é capaz de otimizar e selecionar tampões de eluição apropriados para anticorpos ligados, à bomba 140 (e, em última instância, à primeira bobina de retenção 108), e a segunda fonte de tampão 200 é uma fonte de tampão de desnaturação (contendo um desnaturante que interrompe a estrutura quaternária, terciária ou secundária de polipeptídeos) que pode fornecer um reagente desnaturante 208 para a bomba 140 (e, em última instância, para a primeira bobina de retenção 108). Em outras versões, a bomba 140 pode ser um tipo diferente de bomba e/ou bombas diferentes 140 podem ser usadas para cada uma das fontes de tampão 196, 200.

[0024] Em algumas versões, o reagente desnaturante pode ser ou incluir um detergente desnaturante ou um caotrópio (agente caotrópico). Nessas versões em que o reagente desnaturante é ou inclui um detergente desnaturante, o detergente desnaturante é preferencialmente selecionado do grupo consistindo em dodecil sulfato de sódio (SDS), colato de sódio, desoxicolato de sódio, glicocolato de sódio, taurocolato de sódio, taurodesoxicolato de sódio, N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB) e brometo de trimetil(tetradecil) amônio (TTAB). Mais preferencialmente, o detergente desnaturante é SDS. Nessas versões em que o reagente desnaturante é ou inclui um caotrópio, o caotrópio é preferencialmente selecionado do grupo consistindo em ureia, n-butanol, etanol, cloreto de guanidínio, perclorato de lítio, acetato de lítio, cloreto de magnésio, fenol, 2-propanol, e tioureia. Alternativa ou adicionalmente, o reagente desnaturante pode ser ou incluir um fluido aquecido que tem uma temperatura adequada para atingir, se não manter, uma temperatura pré-determinada (p. ex., cerca de 22 °C a cerca de 120 °C) na câmara de reação 120 quando o reagente desnaturante é passado para a câmara de reação 120.

[0025] Uma válvula 212 está localizada entre a bomba 140 e a primeira e a segunda fontes de tampão 196, 200 para, seletivamente, acoplar fluidamente a bomba 140 a apenas uma das fontes de tampão 196, 200 de cada vez. Mais particularmente, a válvula 212 é movimentável entre uma primeira posição, na qual a bomba 140 está fluidamente acoplada à primeira fonte de tampão 196 e a bomba 140 está fluidamente isolada a partir da segunda fonte de tampão 200, e uma segunda posição, na qual a primeira coluna 140 está fluidamente acoplada à fonte de tampão 200 e a bomba 140 está fluidamente isolada da câmara de resíduos 196. Por outras palavras, a bomba

140 está, seletivamente, acoplada fluidamente à primeira fonte de tampão 196 e à segunda fonte de tampão 200 dependendo da posição da válvula 212.

[0026] Como observado acima, a bomba 140 nesta versão é uma bomba de seringa. A bomba de seringa 140 está geralmente configurada para obter um tampão de uma das fontes de tampão 196, 200 e enviar esse tampão para a primeira bobina de retenção

108. Quando a válvula 212 está na primeira posição, a bomba 140 pode obter (p. ex., absorver) a solução de tampão de eluição 204 da primeira fonte de tampão 196 e, quando desejado, pode produzir (p. ex., ejetar) essa solução de tampão de eluição 204 para a primeira bobina de retenção 108. Inversamente, quando a válvula 212 está na segunda posição, a bomba 140 pode obter (p. ex., absorver) o reagente desnaturante 208 a partir da segunda fonte de tampão 200 e, quando desejado, pode produzir (p. ex., ejetar) esse reagente desnaturante 208 para a primeira bobina de retenção 108.

[0027] A segunda bobina de retenção 116 está localizada a jusante da válvula 104, da primeira bobina de retenção 108 e da primeira coluna 112. A segunda bobina de retenção 116 está também fluidamente acoplada à porta de satélite 166 da válvula 104 através de condutas 216, 220 do encanamento. A segunda bobina de retenção 116 também é seletivamente acoplada fluidamente à primeira coluna 112 através da conduta 220 e uma conduta 224. Uma válvula de três vias 228 é disposta entre as condutas 216, 220, 224 para facilitar o acoplamento seletivo, a fim de produzir o fluxo de fluido desejado, como descrito em mais detalhe abaixo.

[0028] A segunda bobina de retenção 116 é, assim, disposta para receber a solução de tampão de eluição 204 da primeira bobina de retenção 108, por meio da válvula 104 e através da primeira coluna 112, quando a bomba 140 produz a solução de tampão de eluição 204 da maneira descrita acima, a válvula 104 está na segunda posição, na qual a porta central 160 está fluidamente acoplada à porta de satélite 165. À medida que a solução de tampão de eluição 204 passa através da primeira coluna 112, a solução de tampão de eluição 204 elui substancialmente todos os polipeptídeos ligados à primeira coluna 112. A válvula de três vias 228 é operada para conectar as condutas 220, 224, desse modo acoplando fluidamente a primeira coluna 112 com a segunda bobina de retenção 116, de tal modo que uma mistura de eluição/polipeptídeos incluindo a solução de tampão de eluição 204 e os polipeptídeos eluídos flua a partir da primeira coluna 112 para a segunda bobina de retenção 116 através das condutas 220, 224.

[0029] A câmara de reação120 está localizada a jusante da válvula 104 e da primeira coluna 112 e está fluidamente acoplada à porta de satélite 167 da válvula 104 através de uma conduta 232 do encanamento. Nesta versão, a câmara de reação 120 é parcialmente, se não completamente, pré-cheia com o reagente de desnaturação 208 (isto é, preenchido antes da operação do sistema 100) a partir da segunda fonte de tampão 200 usando a bomba 140 para produzir o reagente de desnaturação 208 para a primeira bobina de retenção 108 e mover a válvula multiportas 104 para uma quarta posição, na qual a porta central 160 é acoplada fluidamente à porta de satélite 167 da válvula 167, facilitando desse modo o movimento do reagente desnaturante 208 a partir da primeira bobina de retenção 108 para a câmara de reação 120. Em outras versões, no entanto, a câmara de reação 120 pode ser parcialmente ou completamente preenchida com o reagente desnaturante 208 durante a operação do sistema 100 (p. ex., após a segunda bobina de retenção 116 receber a solução de tampão de eluição 204), parcialmente ou completamente preenchida com um reagente desnaturante de outra fonte de tampão e/ou de uma maneira diferente, ou a câmara de reação 120 poderá não ser totalmente preenchida, caso em que o calor pode ser aplicado à câmara de reação 120 por um elemento de aquecimento 236 conectado à câmara de reação 120.

[0030] Após a mistura de eluição/polipeptídeos atingir a segunda bobina de retenção 116, a mistura de eluição/polipeptídeos é movida para a câmara de reação 120. Nesta versão, a câmara de reação 120 recebe indiretamente a mistura de eluição/polipeptídeos a partir da segunda bobina de retenção 116. Mais particularmente, a válvula de três vias 228 é operada para conectar as condutas 216, 224, a mistura de eluição/polipeptídeos é movida da segunda bobina de retenção 116 para a porta de satélite 166 da válvula multiportas 104 através das condutas 216, 224, a válvula 104 é movida para uma terceira posição na qual a porta central 160 é fluidamente acoplada à porta de satélite 166, de modo que a mistura se move para a primeira bobina de retenção 108 e a válvula 104 é movida para uma quarta posição na qual a porta central 160 é fluidamente acoplada à porta de satélite 167 da válvula 104, de modo que a mistura se move da primeira bobina de retenção

108 para a câmara de reação 120. Em outras versões, a câmara de reação 120 pode receber diretamente a mistura de eluição/polipeptídeos a partir da segunda bobina de retenção 116 ou indiretamente pode receber a mistura da segunda bobina de retenção 116 utilizando um ou mais componentes diferentes e/ou em uma ordem diferente.

[0031] Em qualquer caso, assim que a mistura de eluição/polipeptídeos atinge a câmara de reação 120, os polipeptídeos na mistura são incubados na câmara de reação 120, desnaturando assim os polipeptídeos na câmara de reação 120. Quando, por exemplo, a câmara de reação 120 é pelo menos parcialmente preenchida com o reagente desnaturante, os polipeptídeos na mistura, ao atingir a câmara de reação 120 e reagir com o reagente desnaturante, sofrerão desnaturação. Em alguns casos, a câmara de reação 120 pode, ao mesmo tempo ou em todos os momentos, ser aquecida pelo elemento de aquecimento 236 conectado à (p. ex., posicionado imediatamente adjacente à, rodeando a) câmara de reação 120 para ajudar a facilitar o processo de desnaturação. Por outras palavras, o elemento de aquecimento 236 pode aplicar calor, preferencialmente calor tendo uma temperatura de cerca de 22 °C a cerca de 120 °C e, mais preferencialmente, calor tendo uma temperatura de cerca de 40 °C, à câmara de reação 120 para encorajar a desnaturação. O elemento de aquecimento 236 pode, por exemplo, tomar a forma de um bloco de aquecimento, bobina de aquecimento, um aquecedor de indução, uma bomba de calor, um aquecedor de cartucho, um fio de resistência elétrico, um fluido aquecido, ou outro elemento adequado para aquecimento de uma ou mais porções da câmara de reação 120. Em qualquer caso, ao aplicar calor do elemento de aquecimento 236 para a câmara de reação 120, o processo de desnaturação pode ser facilitado. Em outros casos, no entanto, a câmara de reação 120 não pode ser preenchida com o reagente desnaturante e o processo de desnaturação pode ser facilitado apenas pela aplicação de calor do elemento de aquecimento 236.

[0032] Após a desnaturação dos polipeptídeos na mistura, a câmara de reação 120 é configurada para receber um reagente redutor que cliva reticulações de ligações dissulfeto, reduzindo assim os polipeptídeos desnaturados. O reagente redutor pode ser selecionado do grupo consistindo em ditiotreitol (DTT), glutationa, β-mercaptoetanol (β-ME) e tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) e geralmente é fornecido pelo recipiente de resfriamento 240, o qual pode, por exemplo, tomar a forma de um resfriador tendo temperatura de 4 °C. Nesta versão, o recipiente de resfriamento 240 está localizado a jusante da válvula 104 e tem uma primeira câmara 242 que contém o reagente redutor e está acoplada fluidamente à porta de satélite 168 da válvula 104 através da conduta 244 do encanamento. A primeira câmara 242 fornece o reagente de redução para a primeira bobina de retenção 108 quando a válvula 104 está em uma quinta posição, na qual a porta central 160 está acoplada fluidamente à porta de satélite 168 da válvula 104, e o reagente de redução é então movido da primeira bobina de retenção 108 para a câmara de reação 120 quando a válvula 104 está na (ou retorna para a) quarta posição (na qual a porta central 160 está fluidamente acoplada à porta de satélite 167).

Assim, nesta versão, o reagente redutor é indiretamente fornecido à câmara de reação 120 através da primeira bobina de retenção 108. Em outras versões, no entanto, a primeira câmara 242 pode fornecer diretamente o reagente redutor para a câmara de reação 120 (isto é, sem mover o reagente redutor para a primeira bobina de retenção 108).

[0033] Após a redução dos polipeptídeos desnaturados, a câmara de reação 120 é configurada para receber um agente alquilante que alquila sulfidrilas na câmara de reação 120, alquilando assim os polipeptídeos desnaturados e reduzidos na câmara de reação 120. O agente alquilante é preferencialmente um reagente alquilante, tal como o ácido indol-3-acético (IAA), embora outros agentes alquilantes possam ser utilizados. Nesta versão, o recipiente de resfriamento 240 tem uma segunda câmara 248 que contém o agente alquilante e está acoplada fluidamente à porta de satélite 169 da válvula 104 através da conduta 252 do encanamento. A segunda câmara 248 fornece o agente alquilante à primeira bobina de retenção 108 quando a válvula 104 está na sexta posição, na qual a porta central 160 é acoplada fluidamente à porta de satélite 169 da válvula 104 e o agente alquilante é então movido da primeira bobina de retenção 108 para a câmara de reação 120 quando a válvula 104 está na (ou retorna à) quarta posição. Assim, nesta versão, o agente alquilante é indiretamente fornecido à câmara de reação 120 através da primeira bobina de retenção 108. Em outras versões, no entanto, a segunda câmara 248 pode fornecer diretamente o agente alquilante para a câmara de reação 120 (isto é, sem mover o agente alquilante para a primeira bobina de retenção 108) e/ou o agente alquilante pode ser fornecido a partir de um recipiente de resfriamento diferente (p. ex., um recipiente de resfriamento separado do recipiente de resfriamento 240).

[0034] Nesta versão, o sistema 100 inclui adicionalmente uma primeira válvula normalmente aberta 256 que está fluidamente acoplada e localizada a jusante da câmara de reação 120. A válvula normalmente aberta 256 tem uma porta de entrada 260 que está conectada fluidamente a uma saída 264 da câmara de reação 120, uma primeira porta de saída 268 que está conectada fluidamente à segunda câmara de resíduos 148 e uma segunda porta de saída 272 que está conectada fluidamente à atmosfera. A válvula normalmente aberta 256 normalmente opera em uma posição aberta, ou primeira posição, quando o sistema 100 está em operação e, mais particularmente, a câmara de reação 120 está recebendo e sendo preenchida com a mistura de eluição/polipeptídeos, o reagente redutor, o agente alquilante e, em alguns casos, o reagente desnaturante, a válvula 256. Nesta posição aberta, a porta de entrada 260 está acoplada fluidamente à primeira porta de saída 268 e a porta de entrada 260 está isolada fluidamente da segunda porta de saída 272, de modo que quando a câmara de reação 120 está preenchida além de seu volume fixo, quaisquer conteúdos em excesso são dirigidos para a segunda câmara de resíduos 148. No entanto, a válvula normalmente aberta 256 é movimentável (p. ex., aplicando uma corrente à válvula 256) da posição aberta para uma posição fechada, ou segunda posição, quando, por exemplo, a câmara de reação 120 não está mais recebendo o conteúdo descrito acima e é hora de limpar a câmara de reação 120. Nesta posição fechada, a porta de entrada 260 está acoplada fluidamente à segunda porta de saída 272 e a porta de entrada 260 está isolada fluidamente da primeira porta de saída 268, de modo que a saída 264 da câmara de reação 120 está exposta à atmosfera. Por sua vez, o ar pode fluir para a câmara de reação 120, facilitando assim a remoção do conteúdo da câmara de reação 120.

[0035] A segunda coluna 124, também referida aqui como a coluna de dessalinização 124, toma preferencialmente a forma de uma coluna de cromatografia por exclusão de tamanhos que está localizada a jusante da válvula 104 e está acoplada fluidamente à porta de satélite 170 da válvula 104 através de uma conduta 276 do encanamento. A segunda coluna 124 é assim disposta para receber os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição 204, o agente alquilante, o reagente redutor e o reagente desnaturante (quando um é utilizado) a partir da câmara de reação 120. Nesta versão, a segunda coluna 124 recebe indiretamente esses materiais da câmara de reação 120. Mais particularmente, esses materiais são movidos da câmara de reação 120 para a primeira bobina de retenção 108, através da válvula 104, quando a válvula 104 está na (ou é movida para a) quarta posição (na qual a porta central 160 está fluidamente acoplada à porta de satélite 167) e a válvula 104 é movida para uma sétima posição na qual a porta central 160 está acoplada fluidamente à porta de satélite 170, de modo que os materiais se movam da primeira bobina de retenção 108 para a segunda coluna 124. Em outras versões, a segunda coluna 124 pode receber diretamente esses materiais a partir da câmara de reação 120 ou indiretamente pode receber esses materiais utilizando um ou mais componentes diferentes e/ou em uma ordem diferente.

[0036] Em qualquer caso, quando a segunda coluna 124 recebe os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição 204, o agente alquilante, o reagente redutor e o reagente desnaturante (quando um é utilizado), a segunda coluna 124 é configurada para separar os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados da solução de tampão de eluição 204, o agente alquilante, o reagente redutor e o reagente desnaturante (quando usado), os quais são em última instância movidos para a terceira câmara de resíduos

152. Assim, a segunda coluna 124 pode ser aqui referida como a coluna de dessalinização 124. Ao mesmo tempo, a segunda coluna 124 é configurada para troca de tampão de polipeptídeos para uma condição de tampão desejada que permita à terceira coluna 128 executar a funcionalidade descrita abaixo.

[0037] Nesta versão, o sistema 100 inclui ainda uma segunda válvula normalmente aberta 280 que está fluidamente acoplada a e localizada entre a segunda coluna 124 e a terceira coluna

128. A válvula normalmente aberta 280 tem uma porta de entrada 284 que está conectada fluidamente a uma saída 288 da segunda coluna 124, uma primeira porta de saída 292 que está conectada fluidamente à terceira câmara de resíduos 152 e uma segunda porta de saída 296 que está conectada fluidamente à terceira coluna 128. A válvula normalmente aberta 280 opera normalmente em uma posição aberta, ou primeira posição, quando o sistema 100 está em operação. Nesta posição aberta, a porta de entrada

284 está fluidamente acoplada à primeira porta de saída 292 e a porta de entrada 284 está isolada fluidamente da segunda porta de saída 296, de modo que a solução de tampão de eluição 204, o agente alquilante, o reagente redutor e o reagente desnaturante são dirigidos para a terceira câmara de resíduos

152. No entanto, a válvula normalmente aberta 280 é movimentável (p. ex., aplicando uma corrente à válvula 280) a partir da posição aberta para uma posição fechada, ou segunda posição, quando se deseja mover os polipeptídeos dessalinizados da segunda coluna 124 para a terceira coluna 128, a qual está localizada a jusante da segunda coluna 124. Nesta posição fechada, a porta de entrada 284 está acoplada fluidamente à segunda porta de saída 296 e a porta de entrada 284 está isolada fluidamente da primeira porta de saída 292, de modo que a segunda coluna 124 está acoplada fluidamente à terceira coluna 128, de modo que o dessalinizado pode passar da segunda coluna 124 para a terceira coluna 128. Nesta versão, a terceira coluna 128 inclui uma enzima proteolítica (p. ex., uma endopeptidase selecionada do grupo consistindo em tripsina, quimotripsina, elastase, termolisina, pepsina, glutamil endopeptidase, neprilisina, Lys-C protease e protease Staphylococcus aureus V8), de modo que a terceira coluna 128 pode ser aqui referida como uma coluna de enzima proteolítica. Em qualquer caso, a terceira coluna 128 digere os polipeptídeos dessalinizados obtidos a partir da segunda coluna 124.

[0038] Após os polipeptídeos terem sido digeridos na terceira coluna 128, os polipeptídeos digeridos podem ser movidos para o dispositivo analítico 156, o qual pode, por exemplo, tomar a forma de um dispositivo de cromatografia líquida, um dispositivo de cromatografia líquida de elevado desempenho, um dispositivo de cromatografia líquida de ultraelevado desempenho, um dispositivo de espectrometria de massa, um dispositivo de análise de glicanas, outro dispositivo de análise ou uma sua combinação. Nesta versão, o dispositivo analítico 156 está localizado a jusante da terceira coluna 128 e está fluidamente acoplado à terceira coluna 128 através de uma conduta 298 do encanamento. Assim, em esta versão, os polipeptídeos digeridos podem ser automaticamente movimentados para o dispositivo analítico 156 para análise (p. ex., para quantificação e separação). Em outras versões, no entanto, o dispositivo analítico 156 não faz parte do sistema 100 (p. ex., não fluidamente acoplado à terceira coluna 128), caso esse em que os polipeptídeos digeridos podem ser movimentados para o dispositivo analítico 156 de uma maneira diferente (p. ex., manualmente).

[0039] Como brevemente notado acima, o sistema 100 inclui também o controlador 132, que em esta versão está comunicativamente acoplado ou conectado a vários componentes do sistema 100 para monitorizar e facilitar ou dirigir a operação acima descrita do sistema 100 por transmissão de sinais (p. ex., sinais de controle, dados) para os e recepção de sinais (p. ex., dados) a partir dos vários componentes do sistema 100. O controlador 132 pode estar localizado imediatamente adjacente os outros componentes do sistema 100 (p. ex., no mesmo ambiente que o sistema 100) ou pode estar localizado remotamente a partir dos outros componentes do sistema 100. Como ilustrado, o controlador 132 está comunicativamente acoplado ou conectado à válvula multiportas 104 através de uma rede de comunicação 300, a bomba 140 através de uma rede de comunicação 328, o dispositivo analítico 156 através de uma rede de comunicação 332, o elemento de aquecimento 236 através de uma rede de comunicação 340, a primeira válvula normalmente aberta 256 através de uma rede de comunicação 344, e a segunda válvula normalmente aberta 280 através de uma rede de comunicação 348. Em outras versões, o controlador 132 pode estar comunicativamente acoplado ou conectado a mais ou menos componentes do sistema 100, p. ex., a primeira bobina de retenção 108, a primeira coluna 112, a segunda bobina de reação 116, a câmara de reação 120, a segunda coluna 124, a terceira coluna 128, o recipiente 136, a válvula de três vias 228 e/ou o recipiente de resfriamento 240.

[0040] Como usadas aqui, as frases “comunicativamente acoplado” e “conectado” são definidas para significar diretamente acoplado ou conectado a ou indiretamente acoplado ou conectado através de um ou mais componentes intermediários. Tais componentes intermediários podem incluir componentes à base de hardware e/ou software. É apreciado que as redes 300- 348 podem ser redes sem fio, redes com fio ou combinações de uma rede com fio e uma sem fio (p. ex., uma rede de telefone celular e/ou rede compatível com 802.11x) e podem incluir uma rede publicamente acessível, tal como a Internet, uma rede privada ou uma sua combinação. O tipo e a configuração das redes 300-348 são dependentes da implementação e pode ser usado qualquer tipo de redes de comunicações que facilite as comunicações descritas entre o controlador 132 e os componentes do sistema 100, disponíveis agora ou posteriormente desenvolvidos.

[0041] Como mostrado na FIG. 2, o controlador 132 inclui um processador 352, uma memória 356, uma interface de comunicações 360 e lógica de computação 364. O processador 352 pode ser um processador geral, um processador de sinal digital, um circuito integrado específico da aplicação (ASIC), rede de portas programáveis em campo, unidade de processamento gráfico, circuito analógico, circuito digital ou qualquer outro processador conhecido ou posteriormente desenvolvido. O processador 352 opera de acordo com as instruções na memória

356. A memória 356 pode ser uma memória volátil ou uma memória não volátil. A memória 356 pode incluir uma ou mais de uma memória somente de leitura (ROM), memória de acesso aleatório (RAM), uma memória flash, uma memória somente de leitura de programa apagável eletrônica (EEPROM) ou outro tipo de memória. A memória 356 pode incluir um dispositivo óptico, magnético (disco rígido) ou qualquer outra forma de dispositivo de armazenamento de dados.

[0042] A interface de comunicações 360 é proporcionada para ativar ou facilitar a comunicação eletrônica entre o controlador 132 e os componentes do sistema de refrigeração 100 através das redes 300-348. A interface de comunicações 360 pode ser ou incluir, por exemplo, uma ou mais portas de universal serial bus (USB), uma ou mais portas de Ethernet e/ou uma ou mais outras portas ou interfaces. A comunicação eletrônica pode ocorrer através de qualquer protocolo de comunicações conhecido, incluindo, a título de exemplo, USB, RS-232, RS-485, WiFi, Bluetooth e/ou qualquer outro protocolo de comunicações adequado.

[0043] A lógica 364 inclui geralmente uma ou mais rotinas de controle e/ou uma ou mais sub-rotinas incorporadas como instruções legíveis por computador armazenadas na memória 356. As rotinas de controle e/ou sub-rotinas podem executar tipo de controle PID (derivada proporcional-integral), lógica difusa, não linear ou qualquer outro adequado. O processador 352 executa geralmente a lógica 364 para realizar ações relacionadas com a operação do sistema 100.

[0044] Falando geralmente, a lógica 364, quando executada, faz com que o processador 352 controle componentes do sistema 100, particularmente a válvula multiportas 104, a bomba 140, o elemento de aquecimento 236, as primeira e segunda válvulas normalmente abertas 256, 280 e o dispositivo analítico 156, tal que o sistema 100 opere da maneira desejada discutida aqui. Mais particularmente, a lógica 364 pode, quando executada, fazer com que o processador 352 (i) mova a válvula multiportas 104 para ou entre qualquer uma das posições aqui descritas, acoplando desse modo fluidamente vários componentes do sistema 100, como descrito acima (ii) controlar a bomba 140 (p. ex., fazer com que a bomba 140 obtenha e produza a solução de tampão de eluição 204 ou o reagente desnaturante 208), (iii) controlar o elemento de aquecimento 236 (quando empregue no sistema 100) para aplicação seletiva de calor à câmara de reação 120 (e o conteúdo da mesma), (iv) controlar a primeira válvula normalmente aberta 256, (v) controlar a segunda válvula normalmente aberta 280, (vi) controlar o dispositivo analítico 156 e executar outra funcionalidade desejada.

[0045] Quando, por exemplo, é desejado realizar um ensaio em tempo real de uma amostra de um produto contendo polipeptídeos, a lógica 364 é executável pelo processador 352 para posicionar a válvula 104 na primeira posição descrita acima, mover a amostra do produto do recipiente 136 para a primeira bobina de retenção 108 através da conduta 180, a porta 164, a porta 160, posicionar a válvula 104 na segunda posição descrita acima e mover a amostra da primeira bobina de retenção 108 para e através da coluna de ligação de polipeptídeos 112 através da conduta 184, das portas 160, 164 e da conduta 188. Por sua vez, substancialmente todos os polipeptídeos da amostra se ligam à coluna 112, de modo que os polipeptídeos da amostra são separados do restante da amostra, que passa para a primeira câmara de resíduos 144 através das condutas 220, 224 e da segunda bobina de retenção 116.

[0046] A lógica 364 é ainda executável pelo processador 352 para fazer com que a bomba 140 obtenha a solução de tampão de eluição 204 a partir da primeira fonte de tampão 196 e envie a solução de tampão de eluição 204 para a primeira bobina de retenção 108 através da conduta 192. Em alguns casos, a bomba 140 pode precisar ser movida da segunda posição para a primeira posição (para acoplar fluidamente a bomba 140 com a primeira fonte de tampão 196), mas em outros casos, a bomba 140 já pode estar na primeira posição. Em qualquer caso, a lógica 364 é executável pelo processador 352 para mover a solução de tampão de eluição 204 da primeira bobina de retenção 108 para e através da primeira coluna 112 e para a segunda bobina de retenção 116, através da conduta 184, as portas 160, 165 e as condutas 188, 220 e 224. Dessa maneira, a solução de tampão de eluição 204 elui substancialmente todos os polipeptídeos ligados à primeira coluna 112, e uma mistura de eluição/polipeptídeos, incluindo a solução de tampão de eluição 204 e os polipeptídeos eluídos, flui da primeira coluna 112 para a segunda bobina de retenção

116.

[0047] A lógica 364 é ainda executável pelo processador 352 para mover a válvula 104 para a terceira posição descrita acima, mover a mistura de eluição/polipeptídeos da segunda bobina de retenção 116 para a primeira bobina de retenção 108, através das condutas 224, 216, as portas 166, 160 e a conduta 184, movem a válvula 104 para a quarta posição descrita acima e movem a mistura de eluição/polipeptídeos da primeira bobina de retenção 108 para a câmara de reação 120, através da conduta 184, das portas 160, 167, e da conduta 232. Por sua vez, os polipeptídeos na mistura de eluição/polipeptídeos são incubados na câmara de reação 120 com o reagente desnaturante 208 e/ou na presença de calor aplicado pelo elemento de aquecimento 236, que assim desnatura os polipeptídeos.

[0048] A lógica 364 é ainda executável pelo processador 352 para mover a válvula 104 para a quinta posição descrita acima, mover o reagente redutor da primeira câmara 242 do recipiente de resfriamento 240 para a primeira bobina de retenção 108 através da conduta 244, das portas 168, 160 e da conduta 184, mover a válvula 104 de volta para a quarta posição, e mover o reagente redutor da primeira bobina de retenção 108 para a câmara de reação 120, através da conduta 184, das portas 160, 167 e da conduta 232. Ao atingir a câmara de reação 120, o reagente redutor cliva reticulações de ligações dissulfeto, o que reduz assim os polipeptídeos desnaturados na câmara de reação 120.

[0049] A lógica 364 é ainda executável pelo processador 352 para mover a válvula 104 para a sexta posição descrita acima, mover o agente alquilante da segunda câmara 248 do recipiente de resfriamento 240 para a primeira bobina de retenção 108 através da conduta 252, das portas 169, 160 e da conduta 184, mover a válvula 104 de volta para a quarta posição, e mover o agente alquilante da primeira bobina de retenção 108 para a câmara de reação 120, através da conduta 184, das portas 160, 167 e da conduta 232. Ao atingir a câmara de reação 120, o agente alquilante alquila sulfidrilas na câmara de reação 120, que alquila deste modo os polipeptídeos desnaturados e reduzidos na câmara de reação 120.

[0050] A lógica 364 é ainda executável pelo processador 352 para mover a válvula 104 para a quarta posição (se ainda não estiver lá), mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição 204, o agente alquilante, o reagente redutor, e o reagente desnaturante (quando usado) da câmara de reação 120 para a primeira bobina de retenção 108, através da conduta 232, das portas 167, 160 e da conduta 184, mover a válvula 104 para a sétima posição descrita acima, e mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição 204, o agente alquilante, o reagente redutor e o reagente desnaturante

(quando usado) da primeira bobina de retenção 108 para a coluna de dessalinização 124 através da conduta 184, das portas 160, 170 e da conduta 276. Por sua vez, a coluna de dessalinização 124 separa os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados da solução de tampão de eluição 204, o agente alquilante, o reagente redutor e o reagente desnaturante, os quais são passados ou movidos para a terceira câmara de resíduos 152.

[0051] Em algum momento após os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição 204, o agente alquilante, o reagente redutor e o reagente desnaturante (quando usado) são movidos da câmara de reação 120 para a primeira bobina de retenção 108, a lógica 364 é ainda executável pelo processador 352 para mover a válvula normalmente aberta 256 de sua primeira posição aberta, em que a saída 264 da câmara 120 está acoplada fluidamente à segunda câmara de resíduos 148, de modo a direcionar conteúdos que não cabem na câmara de reação 120 (como resultado de ser preenchida além do seu volume fixo) para a segunda câmara de resíduos 148, para sua segunda posição fechada, em que a saída 264 é fluidamente acoplada à atmosfera, de modo que o ar possa fluir para a câmara de reação 120, facilitando, assim, a remoção do conteúdo da câmara de reação 120. A válvula normalmente aberta 256 pode retornar à primeira posição aberta imediatamente após a câmara de reação 120 ter sido esvaziada ou pode retornar à primeira posição aberta em um momento posterior.

[0052] Após a coluna de dessalinização 124 separar os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados dos outros materiais, a lógica 364 é ainda executável pelo processador 352 para mover a válvula normalmente aberta 280 de sua primeira posição aberta, em que a porta de entrada da válvula 280 é acoplada fluidamente à terceira câmara de resíduos 152, à sua segunda posição fechada, em que a porta de entrada da válvula 280 está acoplada fluidamente à coluna da enzima proteolítica

128. Por sua vez, a lógica 364 é executável pelo processador 352 para mover os polipeptídeos dessalinizados (ou separados) da coluna de dessalinização 124 para a coluna da enzima proteolítica 128, a qual digere os polipeptídeos dessalinizados.

[0053] Após a digestão dos polipeptídeos, a lógica 364 é, pelo menos nesta versão, executável posteriormente pelo processador 352 para mover os polipeptídeos digeridos da coluna de enzima proteolítica 128 para o dispositivo analítico 156 para análise dos polipeptídeos e fazer com que o dispositivo analítico 156 execute a análise desejada. Como exemplo, a lógica 364 pode, quando executada pelo processador 352, fazer com que o dispositivo analítico 156 separe e quantifique os polipeptídeos.

[0054] Em outras versões, a lógica 364 pode, quando executada pelo processador 352, fazer com que funcionalidades adicionais, menos funcionalidades e/ou funcionalidades diferentes adicionais sejam realizadas. Como um exemplo, a lógica 364, quando executada pelo processador 352, não poderá movimentar os polipeptídeos digeridos a partir da segunda coluna 128 para o dispositivo analítico 156 ou fazer com que o dispositivo analítico 156 realize a análise desejada. Além do mais, em outras versões, a lógica 364 pode ser executada pelo processador 352 em uma ordem diferente do que descrito aqui. Finalmente é apreciado que a lógica 364 pode ser executada pelo processador 352 qualquer número de vezes diferentes, pois o sistema 100 pode ser usado para realizar análises em tempo real de múltiplas amostras (do mesmo produto e/ou de um produto diferente).

[0055] As FIGS. 3A-3C ilustram os resultados de um estudo de ensaio MAM on-line e em tempo real projetado para monitorar a eficácia do sistema 100 na preparação de uma amostra de um produto contendo uma molécula Bispecific T-cell Engager (BiTE®) (acoplante de células T biespecíficas). Em particular, o estudo monitorizou a eficácia do sistema 100 ao longo de uma operação de produção de 40 dias. O estudo começou a monitorar e coletar dados de CQA, como porcentagem de área para 2 locais de desamidação, DS1 e DS2, e a frequência de uma fragmentação, FF, ilustrada na FIG. 3A e altura do pico do MS (expressa como um número de contagens de íons) para quatro peptídeos de referência RP1, RP2, RP3 e RP4, ilustrados nas FIGS. 3B e 3C, no dia 6 do ciclo de produção de 40 dias. Como ilustrado na FIG. 3A, o sistema 100 executou capazmente e eficazmente a funcionalidade pretendida discutida aqui ao longo da duração inteira da operação de produção de 40 dias e, como ilustrado nas FIGS. 3B e 3C, os dados de CQA coletados entre o dia 6 e o dia 40 foram substancialmente consistentes, isto é, não existiu mudança significativa na qualidade do produto ao longo do tempo, e a qualidade do produto realmente aumentou após o dia 32, demonstrando assim a robustez do sistema 100 na preparação automática da amostra. De fato, como ilustrado na FIG. 3C, os dados de CQA coletados para RP1, RP2, RP3 e RP4 durante esse período de tempo foram melhores que os dados de CQA obtidos durante um ensaio MAM manual típico. Polipeptídeos terapêuticos

[0056] As proteínas, incluindo aquelas que se ligam a um ou mais dos seguintes, podem ser úteis nos dispositivos e métodos divulgados. Estas incluem proteínas CD, incluindo CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD30 e CD34; incluindo aquelas que interferem com ligação ao receptor. Proteínas de família de receptores de HER, incluindo HER2, HER3, HER4 e o receptor de EGF. Moléculas de adesão de células, por exemplo, LFA-I, MoI, pl50, 95, VLA-4, ICAM-I, VCAM e alfa v/beta 3 integrina. Fatores de crescimento, tais como fator de crescimento endotelial vascular (“VEGF”), hormônio do crescimento, hormônio estimulante da tireoide, hormônio estimulante dos folículos, hormônio luteínizante, fator de liberação do hormônio do crescimento, hormônio da paratireoide, substância inibidora Mülleriana, proteína inflamatória de macrófagos humanos (MIP-I -alfa), eritropoietina (EPO), fator de crescimento nervoso, tal como NGF-beta, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fatores de crescimento de fibroblastos, incluindo, por exemplo, aFGF e bFGF, fator de crescimento epidérmico (EGF), fatores transformantes de crescimento (TGF), incluindo, entre outros, TGF-α e TGF-β, incluindo TGF-βl, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 ou TGF-β 5, fatores de crescimento tipo insulina-I e - II (IGF-I e IGF-II), des(l- 3)-IGF-I (IGF-I do cérebro) e fatores osteoindutores. Insulinas e proteínas relacionadas com a insulina, incluindo insulina, cadeia A da insulina, cadeia B da insulina, pró-insulina e proteínas de ligação ao fator de crescimento tipo insulina.

Proteínas de coagulação e relacionadas com a coagulação, tais como, entre outras, fator VIII, fator de tecidos, fator de von Willebrands, proteína C, alfa-1-antitripsina, ativadores de plasminogênio, tais como uroquinase e ativador de plasminogênio de tecidos (“t-PA”), bombazina, trombina e trombopoietina; (vii) outras proteínas do sangue e soro, incluindo mas não se limitando a albumina, IgE e antígenos de grupos sanguíneos.

Fatores estimulantes de colônias e seus receptores, incluindo os seguintes, entre outros, M-CSF, GM-CSF e G-CSF e seus receptores, tal como receptor de CSF-1 (c-fms). Receptores e proteínas associadas a receptores, incluindo, por exemplo, receptor de flk2/flt3, receptor da obesidade (OB), receptor de LDL, receptores do hormônio do crescimento, receptores de trombopoietina (“TPO-R”, “c-mpl”), receptores de glucagon, receptores de interleucina, receptores de interferon, receptores de células T, receptores de fatores de células- tronco, tais como c-Kit, e outros receptores.

Ligantes de receptor, incluindo, por exemplo, OX40L, o ligante para o receptor OX40. Fatores neurotróficos, incluindo fator neurotrófico derivado de osso (BDNF) e neurotrofina-3, -4, -5 ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6). Cadeia A de relaxina, cadeia B de relaxina e pró-relaxina; interferons e receptores de interferon, incluindo, por exemplo, interferon-α, -β e -γ e seus receptores.

Interleucinas e receptores de interleucina, incluindo receptores de IL-I a IL-33 e IL-I a IL-33, tais como o receptor de IL-8, entre outros. Antígenos virais, incluindo um antígeno viral do envelope de AIDS. Lipoproteínas, calcitonina, glucagon, fator natriurético atrial, tensoativo pulmonar, fator de necrose tumoral alfa e beta, encefalinase, RANTES (regulado após ativação, normalmente expressa e secretada por células T), peptídeo associado à gonadotrofina de camundongo, DNAse, inibina e activina. Integrina, proteína A ou D, fatores reumatoides, imunotoxinas, proteína morfogenética óssea (BMP), superóxido dismutase, proteínas da membrana superficial, fator de aceleração de decaimento (DAF), envelope de AIDS, proteínas de transporte, receptores de retorno, adressinas, proteínas reguladoras, imunoadesinas, anticorpos. Miostatinas, proteínas TALL, incluindo TALL-I, proteínas amiloides, incluindo mas não se limitando a proteínas beta amiloides, linfopoietinas estromais tímicas (“TSLP”), ligante de RANK (“OPGL”), c-kit, receptores de TNF, incluindo Receptor TNF Tipo 1, TRAIL-R2, angiopoietinas e fragmentos ou análogos ou variantes biologicamente ativos de qualquer um dos anteriores.

[0057] Polipeptídeos e anticorpos exemplificativos incluem Activase® (Alteplase); alirocumab, Aranesp® (Darbepoetina- alfa), Epogen® (Epoetina alfa ou eritropoietina); Avonex® (Interferon β-Ia); Bexxar® (Tositumomab); Betaseron® (Interferon-β); bococizumab (anticorpo monoclonal anti-PCSK9 designado como L1L3, ver US8080243); Campath® (Alemtuzumab); Dynepo® (Epoetina delta); Velcade® (bortezomib); MLN0002 (mAb anti-α4β7); MLN1202 (mAb contra receptor de quimiocina anti- CCR2); Enbrel® (etanercept); Eprex® (Epoetina alfa); Erbitux®

(Cetuximab); evolocumab; Genotropin® (Somatropina); Herceptin® (Trastuzumab); Humatrope® (somatropina [oridem em rDNA] para injeção); Humira® (Adalimumab); Infergen® (Interferon Alfacon- 1); Natrecor® (nesiritida); Kineret® (Anakinra), Leukine® (Sargamostim); LymphoCide® (Epratuzumab); BenlystaTM (Belimumab); Metalyse® (Tenecteplase); Mircera® (metóxi polietileno glicol-epoetina beta); MyIotarg® (Ozogamicin de gemtuzumab); Raptiva® (efalizumab); Cimzia® (certolizumab pegol); SolirisTM (Eculizumab); Pexelizumab (Complemento Anti- C5); MEDI-524 (Numax®); Lucentis® (Ranibizumab); Edrecolomab (Panorex®); Trabio® (lerdelimumab); TheraCim hR3 (Nimotuzumab); Omnitarg (Pertuzumab, 2C4); Osidem® (IDM-I); OvaRex® (B43.13); Nuvion® (visilizumab); Mertansina de cantuzumab (huC242-DMl); NeoRecormon® (Epoetina beta); Neumega® (Oprelvequina); Neulasta® (Filgastrim peguilado, G-CSF peguilado, hu-Met-G-CSF peguilado); Neupogen® (Filgrastim); Orthoclone OKT3® (Muromonab-CD3), Procrit® (Epoetina alfa); Remicade® (Infliximab), Reopro® (Abciximab), Actemra® (mAb anti-Receptor de IL6), Avastin® (Bevacizumab), HuMax-CD4 (zanolimumab), Rituxan® (Rituximab); Tarceva® (Erlotinib); Roferon-A®- (Interferon alfa-2a); Simulect® (Basiliximab); StelaraTM (Ustekinumab); Prexige® (lumiracoxib); Synagis® (Palivizumab); 146B7-CHO (anticorpo anti-IL15, ver US7153507), Tysabri® (Natalizumab); Valortim® (MDX-1303, mAb anti-Antígeno Protetor de B. anthracis); ABthraxTM; Vectibix® (Panitumumab); Xolair® (Omalizumab), ETI211 (mAb anti-MRSA), IL-I Trap (a porção Fc de IgGl humana e os domínios extracelulares de ambos os componentes do receptor de IL-I (o receptor Tipo I e proteína acessória de receptor)), Armadilha de VEGF (Ig domains of VEGFRl fused to IgGl Fc), Zenapax® (Daclizumab); Zenapax® (Daclizumab), Zevalin® (Ibritumomab tiuxetano), Zetia (ezetimibe), Atacicept (TACI-Ig), mAb anti-α4β7 (vedolizumab); galiximab (anticorpo monoclonal anti-CD80), mAb anti-CD23 (lumiliximab); BR2-Fc (proteína de fusão huBR3/huFc, antagonista de BAFF solúvel); SimponiTM (Golimumab); Mapatumumab (mAb anti-Receptor-1 de TRAIL humano); Ocrelizumab (mAb humano anti-CD20); HuMax-EGFR (zalutumumab); M200 (Volociximab, mAb anti-α5β1 integrina); MDX-010 (Ipilimumab, mAb anti-CTLA-4 e VEGFR-I (IMC-18F1); mAb anti-BR3; mAbs anti- Toxina A e Toxina B C de C. difficile MDX-066 (CDA-I) e MDX- 1388); conjugados de dsFv-PE38 anti-CD22 (CAT-3888 e CAT-8015); mAb anti-CD25 (HuMax-TAC); anticorpos anti-TSLP; anticorpo anti-receptor anti-TSLP (US8101182); anticorpo anti-TSLP designado como A5 (US7982016); (mAb anti-CD3 (NI-0401); Adecatumumab (MT201, mAb anti-EpCAM-CD326); MDX-060, SGN-30, SGN-35 (mAbs anti-CD30); MDX-1333 (anti- IFNAR); HuMax CD38 (mAb anti-CD38); mAb anti-CD40L; mAb anti-Cripto; anti- Fibrinogênio de Fase I de Fibrose Pulmonar Idiopática CTGF (FG- 3019); mAb anti-CTLA4; mAb antieotaxinl (CAT-213); mAb anti- FGF8; mAb antigangliosídeo GD2; anticorpos antiesclerostina (ver US8715663 ou US7592429), anticorpo antiesclerostina designado como Ab-5 (US8715663 ou US7592429); mAb antigangliosídeo GM2; mAb humano anti-GDF-8 (MYO-029); mAb anti-Receptor de GM-CSF (CAM-3001); mAb anti-HepC (HuMax HepC); MEDI-545, MDX-1103 (mAb anti-IFNα); mAb anti-IGFIR; mAb anti- IGF-IR (HuMax-Inflam); mAb anti-IL12/IL23p40 (Briakinumab);

mAb anti-IL-23p19 (LY2525623); mAb anti-IL13 (CAT-354); mAb anti-IL-17 (AIN457); mAb anti-IL2Ra (HuMax-TAC); mAb anti- Receptor de IL5; mAb anti-receptores de integrina (MDX-Ol8, CNTO 95); mAb anti-IPIO Colite Ulcerativa (MDX- 1100); anticorpo anti-LLY; BMS-66513; mAb anti-Receptor de Manose/hCGβ (MDX-1307); conjugado anti-mesotelina dsFv-PE38 (CAT-5001); mAb anti-PDl (MDX-1 106 (ONO- 4538)); anticorpo anti-PDGFRα (IMC-3G3); mAb anti-TGFβ (GC-1008); mAb humano anti-Receptor de TRAIL-2 (HGS-ETR2); mAb anti-TWEAK; mAb anti- VEGFR/Flt-1; mAb anti-ZP3 (HuMax-ZP3); e um anticorpo monoclonal contra a amiloide-beta compreendendo as sequências SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:6 (US7906625).

[0058] Exemplos de anticorpos adequados para os métodos e formulações farmacêuticas incluem os anticorpos mostrados na Tabela 1. Outros exemplos de anticorpos adequados incluem infliximab, bevacizumab, cetuximab, ranibizumab, palivizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab pegol, ald518, alemtuzumab, alirocumab, altumomab, amatuximab, anatumomab mafenatox, anruquinzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, altinumab, atlizumab, atorolimiumab, tocilizumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bivatuzumab, mertansina de bivatuzumab, blinatumomab, blosozumab, vedotina de brentuximab, briacinumab, brodalumab, canacinumab, mertansina de cantuzumab, mertansina de cantuzumab, caplacizumab, pendetida de capromab, carlumab, catumaxomab, cc49, cedelizumab,

certolizumab pegol, cetuximab, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazaquizumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetano, conatumumab, crenezumab, cr6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, dorlimomab aritox, drozitumab, duligotumab, dupilumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enavatuzumab, enlimomab pegol, enoquizumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab cituxetano, epratuzumab, erenumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, evolocumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, fbta05, felvizumab, fezaquinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, ozogamicina de gemtuzumab, gevoquizumab, girentuximab, vedotina de glembatumumab, golimumab, gomiliximab, gs6624, ibalizumab, ibritumomab tiuxetano, icrucumab, igovomab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, ravtansina de indatuximab, infliximab, intetumumab, inolimomab, ozogamicina de inotuzumab, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixequizumab, queliximab, labetuzumab, lebriquizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, mertansina de lorvotuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonab-

cd3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentan, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, oloquizumab, omalizumab, onartuzumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pateclizumab, patritumab, pemtumomab, peraququizumab, pertuzumab, pexelizumab, pidilizumab, pintumomab, placulumab, ponezumab, priliximab, pritumumab, PRO 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, pendetida de satumomab, secuquinumab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirucumab, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, tefibazumab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, tezepelumab, TGN1412, tremelimumab, ticilimumab, tildraquizumab, tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab, toralizumab, tositumomab, traloquinumab, trastuzumab, TRBS07, tregalizumab, celmoleucina de tucotuzumab, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustequinumab, vapaliximab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab,

mafodotina de vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab, zolimomab aritox.

[0059] Os anticorpos incluem também adalimumab, bevacizumab, blinatumomab, cetuximab, conatumumab, denosumab, eculizumab, erenumab, evolocumab, infliximab, natalizumab, panitumumab, rilotumumab, rituximab, romosozumab, tezepelumab e trastuzumab e anticorpos selecionados da Tabela 1. Tabela 1 Exemplos de anticorpos terapêuticos

SEQ SEQ Visco- Tipo de HC ID ID Alvo (nome Concentração LC sidade (incluindo pI NO NO informal) (mg/mL) Tipo (cP) alotipos) de de

LC HC IgG1 (f) antiamiloide 142,2 5,0 Kappa 9,0 1 2 (R;EM) GMCSF (247) 139,7 5,6 IgG2 Kappa 8,7 3 4 CGRPR 136,6 6,3 IgG2 Lambda 8,6 5 6 RANKL 152,7 6,6 IgG2 Kappa 8,6 7 8 Esclerostina 145,0 6,7 IgG2 Kappa 6,6 9 10 (27H6) IL-1R1 153,9 6,7 IgG2 Kappa 7,4 11 12 IgG1 (z) Miostatina 141,0 6,8 Kappa 8,7 13 14 (K;EM) B7RP1 137,5 7,7 IgG2 Kappa 7,7 15 16 IgG1 (za) Amiloide 140,6 8,2 Kappa 8,7 17 18 (K;DL)

LC HC

GMCSF 156,0 8,2 IgG2 Kappa 8,8 19 20 (3.112) CGRP (32H7) 159,5 8,3 IgG2 Kappa 8,7 21 22 CGRP (3B6.2) 161,1 8,4 IgG2 Lambda 8,6 23 24 PCSK9 150,0 9,1 IgG2 Kappa 6,7 25 26 (8A3.1) PCSK9 (492) 150,0 9,2 IgG2 Kappa 6,9 27 28 CGRP 155,2 9,6 IgG2 Lambda 8,8 29 30 Hepcidina 147,1 9,9 IgG2 Lambda 7,3 31 32 TNFR p55 157,0 10,0 IgG2 Kappa 8,2 33 34 OX40L 144,5 10,0 IgG2 Kappa 8,7 35 36 HGF 155,8 10,6 IgG2 Kappa 8,1 37 38 GMCSF 162,5 11,0 IgG2 Kappa 8,1 39 40 Glucagon R 146,0 12,1 IgG2 Kappa 8,4 41 42

GMCSF 144,5 12,1 IgG2 Kappa 8,4 43 44 (4.381) Esclerostina 155,0 12,1 IgG2 Kappa 7,8 45 46 (13F3) IgG1 (f) CD-22 143,7 12,2 Kappa 8,8 47 48 (R;EM) IgG1 (za) INFgR 154,2 12,2 Kappa 8,8 49 50 (K;DL) Ang2 151,5 12,4 IgG2 Kappa 7,4 51 52

LC HC IgG1 (f) TRAILR2 158,3 12,5 Kappa 8,7 53 54 (R;EM) EGFR 141,7 14,0 IgG2 Kappa 6,8 55 56 IL-4R 145,8 15,2 IgG2 Kappa 8,6 57 58 IgG1 (f) IL-15 149,0 16,3 Kappa 8,8 59 60 (R;EM) IgG1 (za) IGF1R 159,2 17,3 Kappa 8,6 61 62 (K;DL) IL-17R 150,9 19,1 IgG2 Kappa 8,6 63 64 Dkk1 159,4 19,6 IgG2 Kappa 8,2 65 66 (6.37.5) Esclerostina 134,8 20,9 IgG2 Kappa 7,4 67 68 TSLP 134,2 21,4 IgG2 Lambda 7,2 69 70 Dkk1 (11H10) 145,3 22,5 IgG2 Kappa 8,2 71 72 PCSK9 145,2 22,8 IgG2 Lambda 8,1 73 74 GIPR IgG1 (z) 150,0 23,0 Kappa 8,1 75 76 (2G10.006) (K;EM) Activina 133,9 29,4 IgG2 Lambda 7,0 77 78 Esclerostina 150,0 30,0 IgG2 Lambda 6,7 79 80 (2B8) Esclerostina 141,4 30,4 IgG2 Kappa 6,8 81 82 c-fms 146,9 32,1 IgG2 Kappa 6,6 83 84 α4β7 154,9 32,7 IgG2 Kappa 6,5 85 86

* Uma concentração exemplificativa adequada para administração a pacientes; ^HC – cadeia pesada de anticorpo; LC – cadeia leve de anticorpo.

[0060] Com base na descrição anterior, deve-se considerar que os dispositivos, sistemas e métodos descritos neste documento facilitam o desempenho de um ensaio de uma amostra substancialmente em tempo real. Assim, o ensaio pode ser realizado, e o resultado desejado obtido, muito mais rapidamente do que o permitido pelos processos convencionais.

[0061] Deve ser também apreciado que os dispositivos, sistemas e métodos descritos aqui permitem que o processo de preparação do teste on-line em tempo real, usando o sistema 100, seja facilmente monitorado, o que por sua vez pode mitigar o risco e estender uma operação de produção do produto. Em particular, este processo pode ser monitorizado por determinação, p. ex., usando um controlador tal como o controlador 132 e/ou manualmente por um operador do sistema 100, se as condições no sistema 100 forem ótimas, isto é, se satisfazerem um limiar de desempenho predeterminado. Como ilustrado nas FIGS. 3B e 3C, por exemplo, MS Altura do Pico, expresso em contagens de íons, para os quatro peptídeos de referência RP1, RP2, RP3 e RP4 podem ser obtidos e comparados com valores históricos para esses peptídeos de referência durante a qualificação do método para se determinar se as condições no sistema 100 são ótimas (e são), tal que a operação de produção possa ser iniciada, continuada ou estendida. No entanto, quando é determinado que as condições no sistema 100 não são ótimas, pelo menos um componente de cultura de células pode ser ajustado até as condições no sistema fechado serem ótimas. Exemplos de componentes de cultura de células que podem ser ajustados incluem, mas não estão limitados a: pH, pressão, temperatura, fluxo de meios (p. ex., caudal de meios, taxa de alimentação de meios), conteúdo de meios (incluindo aminoácidos, nutrientes, açúcares, tampão), estratégia de gaseamento (p. ex., mistura de oxigênio e dióxido de carbono, taxa de gás), agitação (p. ex., taxa de agitação), aditivos (p. ex., aditivos de metal, aditivos de açúcar), taxa de alimentação de aditivos (p. ex., antiespumante) e taxa de perfusão. Em alguns casos, somente um componente de cultura de células pode necessitar de ser ajustado tal que as condições no sistema fechado sejam ótimas, enquanto, em outros casos, múltiplos componentes de cultura de células podem necessitar de ser ajustados. Alternativamente, quando é determinado que as condições não são ótimas, ou quando as condições no sistema 100 não são ótimas mesmo após ajuste de pelo menos um componente de cultura de células, o controlador e/ou o operador do sistema 100 podem desligar o sistema 100.

[0062] Desta maneira, os dispositivos, sistemas e métodos descritos aqui também mitigam o risco envolvido na operação continuada do sistema 100 quando as condições não são ótimas ou quando é de outro modo indesejável continuar a operação do sistema 100. Em particular, o risco pode ser mitigado por determinação (p. ex., cálculo ou obtenção) de parâmetros de processo e dados de qualidade do produto, p. ex., pH, temperatura, dissolução de oxigênio, viabilidade celular, densidade celular, título, agregação, variante de carga,

glicosilação, etc., associados à operação corrente do sistema 100, determinação de se o parâmetro do processo e dados de qualidade do produto satisfazem um limiar de risco predeterminado (determinado antes da operação do sistema 100 por um controlador tal como o controlador 132 e/ou responsivo à entrada a partir do operador do sistema 100) e, depois, determinação de se se continua, cessa ou ajusta a operação do sistema 100 com base em se o parâmetro do processo e dados de qualidade do produto satisfazem o limiar de risco predeterminado.

O limiar de risco predeterminado poderá, por exemplo, ser determinado observando (1) a aplicação de dados de parâmetros de processo e dados de qualidade do produto disponíveis se para calcularem dados multivariados (MV) históricos médios associados à operação prévia do sistema 100 ou algum outro sistema similar e, depois, (2) estabelecimento dos dados MV históricos médios calculados como o limiar (o limiar poderá ser os próprios dados MV históricos médios calculados ou algum valor ou conjunto de valores com base nos dados MV históricos médios calculados). Em um exemplo, o limiar de risco predeterminado pode representar um desvio aceitável (p. ex., três desvios padrão) a partir dos dados MV históricos médios calculados.

Alternativamente ou adicionalmente, o limiar de risco predeterminado pode ser determinado com base na entrada a partir do operador do sistema 100. Em alguns casos, o sistema 100 pode ser desligado quando o parâmetro do processo e dados de qualidade do produto associados à operação corrente do sistema 100 não satisfazem (p. ex., excedem) o limiar de risco predeterminado.

Em outros casos, no entanto, o sistema 100 pode ser ajustado quando o parâmetro do processo e dados de qualidade do produto associados à operação corrente do sistema 100 não satisfazem (p. ex., excedem) o limiar de risco predeterminado ou mesmo quando o parâmetro do processo e dados de qualidade do produto satisfazem, mas estão próximos do limiar de risco predeterminado.

[0063] Adicionalmente, o Requerente descobriu que os dispositivos, sistemas e métodos descritos aqui também permitem que as operações de produção usando o sistema 100 sejam estendidas. Os processos convencionais permitem tipicamente operações de produção de 32 a 40 dias, no máximo. No entanto, o Requerente descobriu que os dispositivos, sistemas e métodos descritos aqui permitem 50-80 se não 100 duplicações da população, isto é, aproximadamente operações de produção de 50-80 se não 100 dias. Assim, mais produto pode ser obtido, enquanto a operação inteira do sistema 100 é monitorizada para assegurar que o produto satisfaz os objetivos de qualidade e o risco seja mitigado.

[0064] Modalidades preferenciais desta divulgação são descritas aqui, incluindo o melhor modo ou modos conhecidos pelos inventores para levar a cabo a divulgação. Embora numerosos exemplos sejam mostrados e descritos aqui, aqueles peritos na técnica entenderão prontamente que os detalhes das várias modalidades não necessitam de ser mutuamente exclusivos. Ao invés, aqueles peritos na técnica após leitura dos ensinamentos aqui devem ser capazes de combinar uma ou mais características de uma modalidade com uma ou mais características das modalidades restantes. Adicionalmente deve ser entendido que as modalidades ilustrativas são somente exemplificativas e não devem ser interpretadas como limitando o escopo da divulgação.

Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a não ser que de outro modo indicado aqui ou de outro modo contradito pelo contexto.

O uso de todos os e quaisquer exemplos, ou linguagem exemplificativa (p. ex., “tal como”) proporcionada aqui, se destina meramente a melhor iluminar os aspectos da modalidade ou modalidades exemplificativas da divulgação e não representa uma limitação no escopo da divulgação.

Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da divulgação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para realizar um ensaio em tempo real, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) movimentar uma amostra de um produto contendo polipeptídeos para uma coluna de ligação de polipeptídeos através de uma primeira bobina de retenção; (b) ligar os polipeptídeos na amostra à coluna de ligação de polipeptídeos, separando assim os polipeptídeos na amostra de um restante da amostra; (c) mover uma solução de tampão de eluição de uma fonte de tampão para a coluna de ligação de polipeptídeos, através da primeira bobina de retenção e através de uma segunda bobina de retenção a jusante da coluna de ligação de polipeptídeos, eluindo assim os polipeptídeos ligados à coluna de ligação de polipeptídeos e movendo uma mistura de eluição/polipeptídeos compreendendo a solução de tampão de eluição e os polipeptídeos eluídos para a segunda bobina de retenção; (d) mover a mistura de eluição/polipeptídeos da segunda bobina de retenção para uma câmara de reação; (e) incubar os polipeptídeos na mistura de eluição/polipeptídeos na câmara de reação, resultando em polipeptídeos desnaturados; (f) mover um reagente redutor que cliva reticulações de ligações dissulfeto para a câmara de reação através da primeira bobina de retenção após (e); (g) incubar os polipeptídeos desnaturados com o reagente redutor na câmara de reação, resultando em polipeptídeos desnaturados e reduzidos;

(h) mover um reagente alquilante que alquila sulfidrilas para a câmara de reação após (g); (i) incubar os polipeptídeos desnaturados e reduzidos com o reagente alquilante na câmara de reação, alquilando assim os polipeptídeos desnaturados e reduzidos; (j) mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente redutor e o reagente alquilante da câmara de reação para uma coluna de dessalinização através da primeira bobina de retenção, a coluna de dessalinização equilibrada com um tampão de proteólise; (k) aplicar os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados à coluna de dessalinização, separando assim os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados dos reagentes redutores e alquilantes, e resultando em polipeptídeos dessalinizados; (l) mover os polipeptídeos dessalinizados para uma coluna de enzima proteolítica a jusante da coluna de dessalinização; (m) digerir os polipeptídeos dessalinizados na terceira coluna de polipeptídeos, resultando em polipeptídeos digeridos; e (n) mover os polipeptídeos digeridos para um dispositivo analítico para análise dos polipeptídeos digeridos.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais de (a), (c), (d), (f), (h), (i), (l) e (n) são realizados automaticamente.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que (a) até (n) são realizados num sistema fechado.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que (a) compreende o posicionamento de uma válvula multiportas em uma primeira posição na qual a primeira bobina de retenção e a coluna de ligação de polipeptídeos são acopladas fluidamente através de uma primeira porta da válvula multiportas.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que (d) compreende o posicionamento da válvula multiportas em uma segunda posição na qual a segunda bobina de retenção e a câmara de reação são acopladas fluidamente através de uma segunda porta da válvula multiportas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que (f) e (h) compreendem cada um o posicionamento da válvula multiportas em uma terceira posição na qual a primeira bobina de retenção e a câmara de reação são acopladas fluidamente através de uma terceira porta da válvula multiportas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que (j) compreende: mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente redutor e o reagente alquilante da câmara de reação para a coluna de dessalinização através da terceira porta da válvula multiportas; e posicionar a válvula multiportas em uma quarta posição na qual a primeira bobina de retenção e a coluna de dessalinização são acopladas fluidamente através de uma quarta porta da válvula multiportas.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes ou durante (d), mover uma primeira válvula fluidamente acoplada e localizada a jusante da câmara de reação para uma primeira posição, na qual a primeira válvula direciona o conteúdo recebido da primeira bobina de retenção em excesso de um volume da câmara de reação para uma câmara de resíduos.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, após (i), o movimento da primeira válvula da primeira posição para uma segunda posição na qual a primeira válvula direciona o ar para a câmara de reação.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, após (k) e antes de (l), (o) mover uma segunda válvula fluidamente acoplada e localizada entre as colunas de dessalinização e enzima proteolítica de uma primeira posição, na qual a segunda válvula direciona o conteúdo recebido da coluna de dessalinização para uma câmara de resíduos, para uma segunda posição, na qual a segunda válvula direciona o conteúdo recebido da coluna de dessalinização para a coluna da enzima proteolítica.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10, caracterizado pelo fato de que

(a) compreende mover a amostra a partir de um recipiente contendo os polipeptídeos para a coluna de ligação de polipeptídeos através da primeira bobina de retenção.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes de (d), encher pelo menos parcialmente a câmara de reação com um reagente desnaturante, e em que (e) compreende incubar os polipeptídeos na mistura de eluição/polipeptídeos com o reagente desnaturante na câmara de reação.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que preencher pelo menos parcialmente a câmara de reação com o reagente desnaturante compreende mover o reagente desnaturante de uma fonte de tampão desnaturante para a câmara de reação através da primeira bobina de retenção.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a aplicação de calor à câmara de reação.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que (j) compreende ainda mover o reagente desnaturante da câmara de reação para a coluna de dessalinização através da primeira bobina de retenção e em que (k) separa ainda mais os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados do reagente desnaturante.

16. Método para realizar um ensaio em tempo real usando um sistema fechado caracterizado pelo fato de que compreende uma válvula multiportas, uma primeira bobina de retenção a montante da válvula multiportas, uma coluna de ligação de polipeptídeos fluidamente acoplada a, e a jusante de, uma primeira porta da válvula multiportas, uma segunda bobina de retenção fluidamente acoplada à, e a jusante da, coluna de ligação de polipeptídeos, uma câmara de reação fluidamente acoplada à, e a jusante das, segundas e terceiras portas da válvula multiportas, uma coluna de dessalinização fluidamente acoplada a, e a jusante de, uma quarta porta da válvula multiportas, e uma coluna de enzima proteolítica a jusante da coluna de dessalinização, o método compreendendo: (a) mover, através de um controlador comunicativamente acoplado ao sistema fechado, uma amostra de um produto contendo polipeptídeos para a primeira bobina de retenção; (b) posicionar, através do controlador, a válvula multiportas em uma primeira posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à coluna de ligação de polipeptídeos através da primeira porta da válvula multiportas, tal que a amostra flua para a primeira coluna, por meio da qual os polipeptídeos na amostra se ligam à coluna de ligação de polipeptídeos; (c) quando a válvula multiportas está na primeira posição, mover, através do controlador, uma solução de tampão de eluição de uma fonte de solução de tampão de eluição para a segunda bobina de retenção através da coluna de ligação de polipeptídeos, de modo que a solução de tampão de eluição elua substancialmente todos os polipeptídeos ligados à coluna de ligação de polipeptídeos;

(d) mover, através do controlador, a válvula multiportas para uma segunda posição na qual a segunda bobina de retenção está conectada à câmara de reação através da segunda porta da válvula multiportas; (e) quando a válvula multiportas estiver na segunda posição, mover, através do controlador, uma mistura de eluição/polipeptídeos compreendendo a solução de tampão de eluição e os polipeptídeos eluídos para a câmara de reação, por meio da qual os polipeptídeos na mistura de eluição/polipeptídeos são desnaturados; (f) mover, através do controlador, a válvula multiportas para uma terceira posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas; (g) após (f), mover, através do controlador, um reagente redutor que cliva as reticulações de ligações dissulfeto à primeira bobina de retenção e mover, através do controlador, o reagente redutor da primeira bobina de retenção para a câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas, reduzindo assim os polipeptídeos desnaturados; (h) após (g), mover, através do controlador, um reagente alquilante que alquila grupos sulfidrila para a primeira bobina de retenção, e mover, através do controlador, o reagente alquilante da primeira bobina de retenção para a câmara de reação através da terceira porta, alquilando assim os polipeptídeos desnaturados e reduzidos; (i) mover, através do controlador, os polipeptídeos alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente redutor e o reagente alquilante da câmara de reação para a primeira bobina de retenção através da terceira porta; (j) mover, através do controlador, a válvula multiportas para uma quarta posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à coluna de dessalinização através da quarta porta da válvula multiportas e, quando a válvula multiportas está na quarta posição, mover os polipeptídeos alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente redutor e o reagente alquilante da primeira bobina de retenção para a coluna de dessalinização, por meio da qual os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados são aplicados à coluna de dessalinização, separando assim os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados dos reagentes redutores e alquilantes, resultando em polipeptídeos dessalinizados; (k) mover, através do controlador, os polipeptídeos dessalinizados para a coluna da enzima proteolítica, por meio da qual os polipeptídeos dessalinizados são digeridos; e (l) passar, através do controlador, os polipeptídeos digeridos para um dispositivo analítico, por meio da qual os polipeptídeos digeridos são analisados.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que (a) compreende mover, através do controlador, a amostra de um recipiente contendo os polipeptídeos para a primeira bobina de retenção.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 e 17, caracterizado pelo fato de que (k) compreende a passagem dos polipeptídeos digeridos para um dispositivo analítico selecionado do grupo consistindo em um dispositivo de cromatografia líquida, um dispositivo de cromatografia líquida de elevado desempenho, um dispositivo de cromatografia líquida de ultraelevado desempenho, um dispositivo de espectrometria de massa e um dispositivo de análise de glicanas ou uma sua combinação.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16, 17 e 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes de (e), mover, através do controlador, a válvula multiportas para a terceira posição e mover, através do controlador, um reagente desnaturante para a câmara de reação.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o movimento do reagente desnaturante para a câmara de reação compreende: mover, através do controlador, o reagente desnaturante de uma fonte de tampão desnaturante para a primeira bobina de retenção através de uma bomba, e mover, através do controlador, o reagente desnaturante da primeira bobina de retenção à câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 e 20, caracterizado pelo fato de que (i) compreende ainda mover o reagente desnaturante da câmara de reação para a primeira bobina de retenção através da terceira porta, e em que (j) compreende ainda mover o reagente desnaturante da primeira bobina de retenção para a coluna de dessalinização, e por meio da qual quando os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados são aplicados à coluna de dessalinização, os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados são ainda separados do reagente desnaturante.

22. Sistema fechado para a realização de um ensaio on- line em tempo real, o sistema caracterizado pelo fato de que compreende: uma primeira bobina de retenção disposta fluidamente para receber uma amostra de um produto contendo polipeptídeos; uma válvula multiportas fluidamente acoplada à, e localizada a jusante da, primeira bobina de retenção; uma coluna de ligação de polipeptídeos fluidamente acoplada à válvula multiportas e disposta para receber a amostra a partir da primeira bobina de retenção através de uma primeira porta da válvula multiportas, a coluna de ligação de polipeptídeos configurada para ligar os polipeptídeos da amostra, uma fonte de tampão fluidamente acoplada à válvula multiportas e disposta para fornecer solução de tampão de eluição a uma segunda bobina de retenção localizada a jusante da coluna de ligação de polipeptídeos, de modo que a solução de tampão de eluição seja adaptada para eluir substancialmente todos os polipeptídeos da coluna de ligação de polipeptídeos; uma câmara de reação fluidamente acoplada à válvula multiportas e disposta a jusante da coluna de ligação de polipeptídeos, a câmara de reação adaptada para receber uma mistura da coluna de ligação de polipeptídeos através de uma segunda porta da válvula multiportas, a mistura compreendendo a solução de tampão de eluição e os polipeptídeos eluídos, em que os polipeptídeos da mistura são desnaturados na câmara de reação, em que a câmara de reação é disposta para receber um reagente redutor que cliva reticulações de ligações dissulfeto através da primeira bobina de retenção e uma terceira porta da válvula multiportas, o reagente redutor reduz os polipeptídeos desnaturados e em que a câmara de reação é ainda disposta para receber um reagente alquilante que alquila sulfidrilas através da primeira bobina de retenção e da terceira porta da válvula multiportas, em que o reagente alquilante alquila os polipeptídeos desnaturados e reduzidos na câmara de reação; uma coluna de dessalinização fluidamente acoplada à válvula multiportas e disposta para receber os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição e o reagente alquilante da câmara de reação, a coluna de dessalinização configurada para separar os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados da solução de tampão de eluição, do reagente redutor e do reagente alquilante; e uma coluna de enzima proteolítica fluidamente acoplada à, e disposta a jusante da, segunda coluna de polipeptídeos para obter os polipeptídeos separados da coluna de dessalinização, a coluna de enzima proteolítica configurada para digerir os polipeptídeos dessalinizados.

23. Sistema, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um biorreator configurado para produzir o produto contendo polipeptídeos, em que a primeira bobina de retenção é fluidamente acoplada ao biorreator.

24. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 e 23, caracterizado pelo fato de que a válvula multiportas compreende uma porta de satélites 12 e uma válvula de porta partilhada central.

25. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23 e 24, caracterizado pelo fato de que a coluna de ligação de polipeptídeos é selecionada a partir do grupo consistindo em uma coluna de proteína A, uma coluna de proteína G, uma coluna de proteína A/G, uma coluna de proteína L, uma coluna de aminoácidos, uma coluna de avidina, uma coluna de estreptavidina, uma coluna de ligação de carboidratos, uma coluna de carboidratos, uma coluna de glutationa, uma coluna de heparina, uma coluna de interação hidrofóbica, uma coluna de imunoafinidade, uma coluna de nucleotídeos/coenzimas, uma coluna de especialidade e uma coluna de cromatografia de afinidade com metais imobilizados (IMAC).

26. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24 e 25, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma bomba configurada para bombear a amostra do produto do biorreator para a primeira bobina de retenção.

27. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25 e 26, caracterizado pelo fato de que o reagente redutor é selecionado do grupo consistindo em ditiotreitol (DTT), glutationa, β-mercaptoetanol (β-ME) e tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP).

28. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26 e 27, caracterizado pelo fato de que o reagente alquilante é um ácido indol-3-acético (IAA).

29. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27 e 28, caracterizado pelo fato de que a coluna de dessalinização é uma coluna de cromatografia por exclusão de tamanhos.

30. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29, caracterizado pelo fato de que a coluna da enzima proteolítica compreende uma enzima proteolítica e em que a enzima proteolítica é uma endopeptidase.

31. Sistema, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a endopeptidase é selecionada do grupo consistindo em tripsina, quimotripsina, elastase, termolisina, pepsina, glutamil endopeptidase, neprilisina, Lys-C protease e protease Staphylococcus aureus V8.

32. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 e 31, caracterizado pelo fato de que a câmara de reação é pelo menos parcialmente pré-cheia com um reagente desnaturante.

33. Sistema, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma bomba configurada para bombear o reagente desnaturante de uma fonte de tampão desnaturante para a câmara de reação através da primeira bobina de retenção.

34. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 e 33, caracterizado pelo fato de que o reagente desnaturante compreende um detergente desnaturante ou um caotrópio.

35. Sistema, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o caotrópio é selecionado do grupo consistindo em ureia, n-butanol, etanol, cloreto de guanidínio, perclorato de lítio, acetato de lítio, cloreto de magnésio, fenol, 2-propanol e tioureia.

36. Sistema, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o detergente desnaturante é selecionado a partir do grupo consistindo em dodecil sulfato de sódio (SDS), colato de sódio, desoxicolato de sódio, glicocolato de sódio, taurocolato de sódio, taurodesoxicolato de sódio, N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB) e brometo de trimetil(tetradecil) amônio (TTAB).

37. Sistema, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o detergente desnaturante é SDS.

38. Sistema, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o reagente desnaturante compreende um fluido aquecido.

39. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 e 38, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um elemento de aquecimento posicionado imediatamente adjacente à câmara de reação, o elemento de aquecimento configurado para aplicar calor à câmara de reação.

40. Sistema, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o calor tem uma temperatura entre cerca de 22 °C e cerca de 120 °C.

41. Sistema, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o calor tem uma temperatura de cerca de 40 °C.

42. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 e 41, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma primeira válvula fluidamente acoplada à, e localizada a jusante da, câmara de reação, em que a primeira válvula é operável em uma primeira posição, na qual a primeira válvula direciona o conteúdo recebido da primeira bobina de retenção em excesso de um volume da câmara de reação a ser desperdiçada e em uma segunda posição, na qual a primeira válvula direciona o ar para a câmara de reação.

43. Sistema, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um controlador acoplado comunicativamente à primeira válvula para controlar uma posição da primeira válvula, em que o controlador move a primeira válvula da primeira posição para a segunda posição antes de mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente desnaturante, o reagente redutor e o reagente alquilante da câmara de reação para a coluna de dessalinização.

44. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma segunda válvula fluidamente acoplada a e localizada entre as colunas de dessalinização e enzima proteolítica, em que a segunda válvula é operável em uma primeira posição, na qual a segunda válvula direciona o conteúdo recebido a partir da coluna de dessalinização para desperdício, e em uma segunda posição, na qual a segunda válvula direciona o conteúdo recebido da coluna de dessalinização para a coluna da enzima proteolítica.

45. Sistema, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um controlador acoplado comunicativamente à segunda válvula para controlar uma posição da segunda válvula, em que o controlador move a segunda válvula da primeira posição para a segunda posição após a coluna de dessalinização separar os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados da solução de tampão de eluição, do reagente desnaturante, do reagente redutor e do reagente alquilante.

46. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 e 41, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um controlador acoplado comunicativamente à câmara de reação, o controlador configurado para manter a câmara de reação a uma temperatura de aproximadamente 40 graus Celsius.

47. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 e 41, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um controlador comunicativamente acoplado à válvula multiportas, o controlador configurado para abrir e fechar seletivamente as primeira, segunda, terceira e quarta portas da válvula multiportas.

48. Sistema fechado para a realização de um ensaio em tempo real, o sistema caracterizado pelo fato de que compreende: uma válvula multiportas;

uma primeira bobina de retenção a montante da válvula multiportas; uma coluna de ligação de polipeptídeos fluidamente acoplada a, e a jusante de, uma primeira porta da válvula multiportas; uma segunda bobina de retenção fluidamente acoplada à, e a jusante da, coluna de ligação de polipeptídeos; uma câmara de reação fluidamente acoplada a, e a jusante de, uma segunda e terceira portas da válvula multiportas; uma coluna de dessalinização fluidamente acoplada a, e a jusante de, uma quarta porta da válvula multiportas; uma coluna de enzima proteolítica a jusante da coluna de dessalinização; e um controlador comunicativamente acoplado à válvula multiportas e compreendendo uma memória, um processador e lógica armazenada na memória e executável pelo processador para: (a) movimentar uma amostra de um produto contendo polipeptídeos para a primeira bobina de retenção; (b) posicionar a válvula multiportas em uma primeira posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à coluna de ligação de polipeptídeos através da primeira porta da válvula multiportas, tal que a amostra flua para a primeira coluna, por meio da qual os polipeptídeos na amostra se ligam à coluna de ligação de polipeptídeos; (c) quando a válvula multiportas está na primeira posição, mover uma solução de tampão de eluição de uma fonte de solução de tampão de eluição para a segunda bobina de retenção através da coluna de ligação de polipeptídeos, de modo que a solução de tampão de eluição elua substancialmente todos os polipeptídeos ligados à coluna de ligação de polipeptídeos; (d) mover a válvula multiportas para uma segunda posição na qual a segunda bobina de retenção está conectada à câmara de reação através da segunda porta da válvula multiportas; (e) quando a válvula multiportas estiver na segunda posição, mover uma mistura de eluição/polipeptídeos compreendendo a solução de tampão de eluição e os polipeptídeos eluídos para a câmara de reação, por meio da qual os polipeptídeos na mistura de eluição/polipeptídeos são desnaturados; (f) mover a válvula multiportas para uma terceira posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas; (g) após (f), mover um reagente redutor que cliva as ligações dissulfeto à primeira bobina de retenção, e mover o reagente redutor da primeira bobina de retenção para a câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas, reduzindo assim os polipeptídeos desnaturados; (h) após (g), mover um reagente alquilante que alquila sulfidrilas para a primeira bobina de retenção, e mover o reagente alquilante da primeira bobina de retenção para a câmara de reação através da terceira porta, alquilando assim os polipeptídeos desnaturados e reduzidos;

(i) mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente redutor e o reagente alquilante da câmara de reação para a primeira bobina de retenção através da terceira porta; (j) mover a válvula multiportas para uma quarta posição na qual a primeira bobina de retenção está conectada à coluna de dessalinização através da quarta porta da válvula multiportas e, quando a válvula multiportas está na quarta posição, mover os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados, a solução de tampão de eluição, o reagente redutor e o reagente alquilante da primeira bobina de retenção para a coluna de dessalinização, por meio da qual os polipeptídeos desnaturados, reduzidos e alquilados são dessalinizados; (k) mover os polipeptídeos dessalinizados para a coluna da enzima proteolítica, por meio da qual os polipeptídeos dessalinizados são digeridos; e (l) passar os polipeptídeos digeridos para um dispositivo de análise de glicanas, por meio do qual os polipeptídeos digeridos são separados e quantificados.

49. Sistema, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a coluna de ligação de polipeptídeos é selecionada a partir do grupo consistindo em uma coluna de proteína A, uma coluna de proteína G, uma coluna de proteína A/G, uma coluna de proteína L, uma coluna de aminoácidos, uma coluna de avidina, uma coluna de estreptavidina, uma coluna de ligação de carboidratos, uma coluna de carboidratos, uma coluna de glutationa, uma coluna de heparina, uma coluna de interação hidrofóbica, uma coluna de imunoafinidade, uma coluna de nucleotídeos/coenzimas, uma coluna de especialidade e uma coluna de cromatografia de afinidade com metais imobilizados (IMAC).

50. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 e 49, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma bomba configurada para bombear a amostra do produto de um biorreator contendo o produto para a primeira bobina de retenção.

51. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48, 49 e 50, caracterizado pelo fato de que o reagente redutor é selecionado do grupo consistindo em ditiotreitol (DTT), glutationa, β-mercaptoetanol (β-ME) e tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP).

52. Sistema, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o reagente alquilante é ácido indol-3-acético (IAA).

53. Sistema, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a coluna de dessalinização é uma coluna de cromatografia por exclusão de tamanhos.

54. Sistema, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a coluna da enzima proteolítica compreende uma enzima proteolítica e em que a enzima proteolítica é uma endoprotease.

55. Sistema, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a endopeptidase é selecionada do grupo consistindo em tripsina, quimotripsina, elastase, termolisina, pepsina, glutamil endopeptidase, neprilisina, Lys-C protease e protease Staphylococcus aureus V8.

56. Sistema, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que antes de (e), a lógica é executável pelo processador para mover a válvula multiportas para a terceira posição e mover um reagente desnaturante para a câmara de reação.

57. Sistema, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a lógica é executável pelo processador para mover o reagente desnaturante de uma fonte de tampão desnaturante para a primeira bobina de retenção através de uma bomba disposta a montante da primeira bobina de retenção, e para mover o reagente desnaturante da primeira bobina de retenção à câmara de reação através da terceira porta da válvula multiportas.

58. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 e 57, caracterizado pelo fato de que o reagente desnaturante compreende um detergente desnaturante ou um caotrópio.

59. Sistema, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o caotrópio é selecionado do grupo consistindo em ureia, n-butanol, etanol, cloreto de guanidínio, perclorato de lítio, acetato de lítio, cloreto de magnésio, fenol, 2-propanol e tioureia.

60. Sistema, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o detergente desnaturante é selecionado a partir do grupo consistindo em dodecil sulfato de sódio (SDS), colato de sódio, desoxicolato de sódio, glicocolato de sódio, taurocolato de sódio, taurodesoxicolato de sódio, N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB) e brometo de trimetil(tetradecil) amônio (TTAB).

61. Sistema, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o detergente desnaturante é SDS.

62. Sistema, de acordo com a reivindicação 57 e 58, caracterizado pelo fato de que o reagente desnaturante compreende calor.

63. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56, 57, 58, 59, 60, 61 e 62, caracterizado pelo fato de que antes ou durante (e), a lógica é executável pelo processador para aplicar calor à câmara de reação.

64. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 e 63, caracterizado pelo fato de que o calor tem uma temperatura de cerca de 22 °C a cerca de 120 °C.

65. Sistema, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o calor tem uma temperatura de cerca de 40 °C.

66. Sistema, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma primeira válvula fluidamente acoplada à, e localizada a jusante da, câmara de reação, em que a primeira válvula é operável em uma primeira posição, na qual a primeira válvula direciona o conteúdo recebido da primeira bobina de retenção em excesso de um volume da câmara de reação para uma câmara de resíduos e em uma segunda posição, na qual a primeira válvula direciona o ar para dentro da câmara de reação, em que o controlador é acoplado comunicativamente à primeira válvula para controlar uma posição da primeira válvula, em que o controlador move a primeira válvula da primeira posição para a segunda posição após (h).

67. Sistema, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma segunda válvula fluidamente acoplada e localizada entre as colunas de dessalinização e enzima proteolítica, em que a segunda válvula é operável em uma primeira posição, na qual a segunda válvula direciona o conteúdo recebido a partir da coluna de dessalinização para uma câmara de resíduos, e em uma segunda posição, na qual a segunda válvula direciona o conteúdo recebido da coluna de dessalinização para a coluna da enzima proteolítica, em que o controlador é acoplado comunicativamente à segunda válvula para controlar uma posição da segunda válvula, em que o controlador move a segunda válvula da primeira posição para a segunda posição após (j).

68. Sistema, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o controlador é acoplado comunicativamente à câmara de reação, o controlador configurado para manter a câmara de reação a uma temperatura de aproximadamente 40 °C.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20 e 21, ou o sistema, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 e 68, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do produto é um polipeptídeo terapêutico.

70. Método ou sistema, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo terapêutico é selecionado do grupo consistindo em um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, um derivado de um anticorpo ou fragmento de anticorpo e um polipeptídeo de fusão.

71. Método ou sistema, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo consistindo em infliximab, bevacizumab, ranibizumab, cetuximab, ranibizumab, palivizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab pegol, ald518, alemtuzumab, alirocumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab mafenatox, anruquinzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, altinumab, atlizumab, atorolimiumab, tocilizumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bivatuzumab, mertansina de bivatuzumab, blinatumomab, blosozumab, vedotina de brentuximab, briacinumab, brodalumab, canacinumab, mertansina de cantuzumab, mertansina de cantuzumab, caplacizumab, pendetida de capromab, carlumab, catumaxomab, cc49, cedelizumab, certolizumab pegol, cetuximab, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazaquizumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetano, conatumumab, crenezumab, cr6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, dorlimomab aritox, drozitumab, duligotumab, dupilumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enavatuzumab,

enlimomab pegol, enoquizumab, enoquizumab, enoticumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab cituxetano, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, exbivirumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, fbta05, felvizumab, fezaquinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, ozogamicina de gemtuzumab, gevoquizumab, girentuximab, vedotina de glembatumumab, golimumab, gomiliximab, gs6624, ibalizumab, ibritumomab tiuxetano, icrucumab, igovomab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, ravtansina de indatuximab, infliximab, intetumumab, inolimomab, ozogamicina de inotuzumab, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixequizumab, queliximab, labetuzumab, lebriquizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, mertansina de lorvotuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonab- cd3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentan, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, oloquizumab, omalizumab, onartuzumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab,

panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pateclizumab, patritumab, pemtumomab, peraquizumab, pertuzumab, pexelizumab, pidilizumab, pintumomab, placulumab, ponezumab, priliximab, pritumumab, PRO 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, pendetida de satumomab, secuquinumab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirucumab, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, tezepelumab, TGN1412, tremelimumab, ticilimumab, tildraquizumab, tigatuzumab, TNX- 650, tocilizumab, toralizumab, tositumomab, traloquinumab, trastuzumab, TRBS07, tregalizumab, tremelimumab, celmoleucina de tucotuzumab, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustequinumab, vapaliximab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, mafodotina de vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab, zolimomab aritox e aqueles anticorpos mostrados na Tabela 1.

72. Método ou sistema, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo terapêutico é um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em uma glicoproteína, polipeptídeo CD, um polipeptídeo receptor de

HER, um polipeptídeo de adesão celular, um polipeptídeo de fator de crescimento, um polipeptídeo de insulina, um polipeptídeo relacionado com a insulina, um polipeptídeo de coagulação, um polipeptídeo relacionado com a coagulação, albumina, IgE, um antígeno do grupo sanguíneo, um fator estimulante de colônias, um receptor, um fator neurotrófico, um interferon, uma interleucina, um antígeno viral, uma lipoproteína, calcitonina, glucagon, fator natriurético atrial, tensoativo pulmonar, fator de necrose tumoral-alfa e beta, encefalinase, peptídeo associado à gonadotrofina de camundongo, DNAse, inibina, activina, uma integrina, proteína A, proteína D, um fator reumatoide, uma imunotoxina, uma proteína morfogenética óssea, uma superóxido dismutase, um polipeptídeo de membrana superficial, um fator acelerador de decaimento, um envelope de AIDS, um polipeptídeo de transporte, um receptor de retorno, uma adressina, um polipeptídeo regulador, uma imunoadesina, uma miostatina, um polipeptídeo TALL, um polipeptídeo amiloide, uma linfopoietina estromal tímica, um ligante de RANK, um polipeptídeo c-kit, um receptor de TNF e uma angiopoietina e seus fragmentos, análogos ou variantes biologicamente ativos.

73. Método de monitorização do ensaio em tempo real on- line realizado pelo sistema fechado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 e 48, o método caracterizado pelo fato de que compreende: determinação de se as condições no sistema fechado satisfazem um limiar de desempenho predeterminado; e quando for determinado que as condições no sistema fechado não satisfazem o limiar de desempenho predeterminado, o ajuste de pelo menos um componente de cultura de células até as condições no sistema fechado satisfazerem o limiar de desempenho predeterminado.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o ajuste de pelo menos um componente de cultura de células compreende o ajuste de um ou mais de pH, pressão, temperatura, fluxo de meios, conteúdo de meios, estratégia de gaseamento, agitação, conteúdo de aditivos, taxa de alimentação de aditivas ou taxa de perfusão.

75. Método de extensão de uma operação de produção usando o sistema fechado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 e 48, caracterizado pelo fato de que compreende: determinação de se as condições no sistema fechado satisfazem um limiar de desempenho predeterminado; e quando for determinado que as condições no sistema fechado não satisfazem o limiar de desempenho predeterminado, ajuste de pelo menos um componente de cultura de células até as condições no sistema fechado satisfazerem o limiar de desempenho predeterminado.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o ajuste de pelo menos um componente de cultura de células compreende o ajuste de um ou mais de pH, pressão, temperatura, fluxo de meios, conteúdo de meios, estratégia de gaseamento, agitação, conteúdo de aditivos, taxa de alimentação de aditivas ou taxa de perfusão.

77. Método de mitigação de risco, caracterizado pelo fato de que compreende: determinação de dados de qualidade do processo e produto associados à operação do sistema fechado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 e 48; determinação de se os dados de qualidade do processo e produto satisfazem um limiar de risco predeterminado; e determinação de se se continua, ajusta ou cessa a operação do sistema fechado com base em se os dados de qualidade do processo e produto satisfazem o limiar de risco predeterminado.