JP2017061454A - アンタゴニスト抗ｉｌ−７受容体抗体および方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】インターロイキン−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）に結合する拮抗性抗体を提供する。
【解決手段】インターロイキン−７受容体アルファ（ＩＬ−７Ｒα）に特異的に結合する単離された抗体であって、特定のアミノ酸配列に存在するCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、かつ特定のアミノ酸配列に存在するCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域（VL）を含む、抗体。２型糖尿病、並びに１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、移植片対宿主疾患およびループスを含めた免疫学的障害の処置及び／又は予防のために、これらの抗体及びその抗原結合部分を使用する治療方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＩＬ−７とのその相互作用を含めた、インターロイキン−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）の活性をアンタゴナイズする抗体、例えば、完全長抗体またはその抗原結合部分に関する。本発明は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体などのＩＬ−７Ｒアンタゴニストを含む組成物、およびＩＬ−７Ｒアンタゴニストを薬物として用いる方法にさらに関する。ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、２型糖尿病、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、ならびに１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチおよびループスを含めた自己免疫障害の予防および／または処置において使用できる。
ＩＬ−７Ｒ複合体は、ＩＬ−７Ｒアルファ鎖（ＩＬ−７Ｒα）および共通のガンマ鎖（γｃ）で構成されるヘテロ二量体受容体である（Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００７、７：１４４〜５４）。ＩＬ−７Ｒには、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の発生および恒常性維持に必須なサイトカインであるインターロイキン−７（ＩＬ−７）が結合する（Ｆｒｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５、１７４：６５７１〜６）。ＩＬ−７ＲへのＩＬ−７の結合は、リンパ球生存、グルコース摂取、増殖および分化を調節する複数の経路を活性化する。
ＩＬ−７Ｒは、樹状細胞上および単球上の両方で発現され、複数の造血性系列で作用するようである（Ｒｅｃｈｅ ＰＡら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、１６７：３３６〜４３）。樹状細胞において、ＩＬ−７Ｒは、免疫調節性の役割を果たし、一方、リンパ球は、生存、増殖および分化のためにＩＬ−７Ｒシグナル伝達を必要とする。Ｊａｋ−ＳｔａｔおよびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路の両方がＩＬ−７ＲへのＩＬ−７の結合によって活性化される（Ｊｉａｎら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、２００５、１６：５１３〜５３３）。これらの経路は、シグナル伝達クロストーク、共有された相互作用ドメイン、フィードバックループ、統合された遺伝子調節、多量体化およびリガンド競合を伴う。Ｂｃｌ２およびＰｙｋ２を含めた、ＩＬ−７シグナル伝達のいくつかの標的は、細胞生存に寄与する。ＰＩ３キナーゼ、ｓｒｃファミリーキナーゼ（ｌｃｋおよびｆｙｎ）およびＳＴＡＴ５などの他の標的は、細胞増殖に寄与する。転写因子ＳＴＡＴ５は、Ｂ細胞およびＴ細胞における複数の異なった下流遺伝子の活性化に寄与し、クロマチン構造の改変を通して、ＶＤＪ組み換えに寄与し得る。ＩＬ−７によって誘導される細胞生存シグナルおよび細胞増殖シグナルは、一体となって正常なＴ細胞発生を誘導する。複雑なＩＬ−７シグナル伝達ネットワーク、および免疫システムの細胞における他のシグナル伝達カスケードとのその相互作用の詳細は、未だに完全に解明されてはいない。
当技術分野において、本発明の前に利用可能な情報からは、ＩＬ−７Ｒを選択的にアンタゴナイズするための、血液循環へのアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の導入が、２型糖尿病、１型糖尿病、ＧＶＨＤ、ループスおよび関節リウマチを処置するのに有効であるかどうか、また、そうだとすれば、ＩＬ−７Ｒ抗体のいかなる特性がｉｎ ｖｉｖｏでそのような有効性に必要であるのかは不明なままであった。
ＩＬ−７Ｒと選択的に相互作用して、ＩＬ−７Ｒ機能を阻害するアンタゴニスト抗体を提供する。ある特定のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が、１型糖尿病、２型糖尿病、関節リウマチ、ＧＶＨＤ、およびループスを処置するのにｉｎ ｖｉｖｏで有効であることが初めて実証される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒと選択的に相互作用して、ＩＬ−７Ｒ機能を阻害するアンタゴニスト抗体が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ−７Ｒに特異的に結合し、かつＩＬ−７Ｒへの結合に関して、Ｃ１ＧＭ、Ｃ２Ｍ３、Ｐ３Ａ９、Ｐ４Ｂ３、Ｐ２Ｄ２、Ｐ２Ｅ１１、ＨＡＬ４０３ａおよびＨＡＬ４０３ｂからなる群から選択されるモノクローナル抗体と競合する抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４２または配列番号４３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、抗体は、ＩＬ−７Ｒに特異的に結合し、かつＣ１ＧＭ、Ｃ２Ｍ３、Ｐ３Ａ９、Ｐ４Ｂ３、Ｐ２Ｄ２、Ｐ２Ｅ１１、ＨＡＬ４０３ａおよびＨＡＬ４０３ｂからなる群から選択されるモノクローナル抗体によって認識される、ＩＬ−７Ｒのエピトープとオーバーラップするエピトープを認識する。いくつかの実施形態では、抗体は、インターロイキン−７受容体アルファ（ＩＬ−７Ｒα）の残基Ｉ８２、Ｋ８４、Ｋ１００、Ｔ１０５およびＹ１９２を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、エピトープは、ヒトＩＬ−７Ｒαの残基Ｄ１９０、Ｈ１９１、およびＫ１９４からなる群から選択される１つまたは複数の追加の残基をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７ＲはヒトＩＬ−７Ｒである。
いくつかの実施形態では、抗体は、インターロイキン−７受容体アルファ（ＩＬ−７Ｒα）に特異的に結合し、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＶＭＨ（式中、Ｘ１がＤまたはＮであり、Ｘ２がＳまたはＹである）（配列番号５０）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＧＸ６Ｘ７ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（式中、Ｘ１がＬまたはＡであり、Ｘ２がＶまたはＩであり、Ｘ３がＧまたはＳであり、Ｘ４がＷまたはＧであり、Ｘ５がＤまたはＳであり、Ｘ６がＦ、ＧまたはＳであり、Ｘ７が、Ｆ、ＡまたはＳである）（配列番号５１）を有するＶＨ ＣＤＲ２と、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（式中、Ｘ１がＱまたはＤであり、Ｘ２がＧまたはＩであり、Ｘ３がＤまたはＳであり、Ｘ４がＹまたはＧであり、Ｘ５がＭ、ＶまたはＧであり、Ｘ６がＧまたはＦであり、Ｘ７がＮ、ＤまたはＭであり、Ｘ８がＮ、ＹまたはＤである）（配列番号５２）を有するＶＨ ＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＴＸ１ＳＳＧＸ２ＩＸ３ＳＳＹＶＱ（式中、Ｘ１がＲまたはＧであり、Ｘ２がＳまたはＲであり、Ｘ３がＤまたはＡである）（配列番号５３）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＥＤＸ１ＱＲＰＳを有し、Ｘ１がＤまたはＮである（配列番号５４）ＶＬ ＣＤＲ２と、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＹＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＸ７（式中、Ｘ１がＱまたはＭであり、Ｘ２がＳまたはＱであり、Ｘ３がＤまたはＡであり、Ｘ４がＦまたはＳであり、Ｘ５がＨまたはＳであり、Ｘ６がＨまたはＳであり、Ｘ７がＶまたはＷである）（配列番号５５）を有するＶＬ ＣＤＲ３とを含み、抗体は、ＳＴＡＴ５活性化アッセイにてＳＴＡＴ５リン酸化を遮断する。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ２とＶＨ ＣＤＲ３の間のフレームワーク領域は、アミノ酸配列アラニン−アルギニンを含み、このアルギニンは、ＶＨ ＣＤＲ３の第１のアミノ酸残基に隣接している。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ２とＶＨ ＣＤＲ３の間のフレームワーク領域は、アミノ酸配列システイン−アラニン−アルギニンを含み、このアルギニンは、ＶＨ ＣＤＲ３の第１のアミノ酸残基に隣接している。
いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＶＭＨ（式中、Ｘ１がＤまたはＮであり、Ｘ２がＳまたはＹである）（配列番号５０）を有する重鎖ＣＤＲ接触領域１と、アミノ酸配列ＧＷＤＧＦＦ（配列番号５７）を有する重鎖ＣＤＲ接触領域２と、アミノ酸配列ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（配列番号５８）を有する重鎖ＣＤＲ接触領域３と、アミノ酸配列ＳＧＳＩＤＳＳＹ（配列番号５９）を有する軽鎖ＣＤＲ接触領域１と、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳＧＶ（配列番号６０）を有する軽鎖ＣＤＲ接触領域２と、アミノ酸配列ＦＨＨＬ（配列番号６１）を有する軽鎖ＣＤＲ接触領域３とを含み、抗体は、ＳＴＡＴ５活性化アッセイにてＳＴＡＴ５リン酸化を遮断する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ−７Ｒαに特異的に結合し、アミノ酸配列ＤＳＶＭＨ（配列番号１９）、ＧＦＴＦＤＤＳ（配列番号４６）、もしくはＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨ（配列番号４７）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列ＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３）もしくはＧＷＤＧＦＦ（配列番号４８）を有するＶＨ ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＧＤＹＭＧＮＮ（配列番号４９）を有するＶＨ ＣＤＲ３、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱ（配列番号２９）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３１）を有するＶＬ ＣＤＲ２、および／もしくはアミノ酸配列ＱＳＹＤＦＨＨＬＶ（配列番号３６）を有するＶＬ ＣＤＲ３、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１９、４６もしくは４７に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２３もしくは４８に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号４９に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ−７Ｒαに特異的に結合し、配列番号１９、４６または４７に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号２３または４８に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２と、配列番号４９に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号２９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１と、配列番号３１に示すアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２と、配列番号３６に示すアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＭＧＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４０）を含み、ＶＬ領域は、アミノ酸配列ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４１）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号４３）を有する軽鎖と、配列番号４２のＣ末端リジンを有する、または有さない、アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＭＧＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４２）を有する重鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体は、定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２Δａサブクラスの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、グリコシル化された定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＦｃガンマ受容体への結合親和性が増大している定常領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒと選択的に相互作用して、ＩＬ−７Ｒ機能を阻害する抗体を含む医薬組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒと選択的に相互作用して、ＩＬ−７Ｒ機能を阻害する抗体を組換え生成する細胞系が提供される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒと選択的に相互作用して、ＩＬ−７Ｒ機能を阻害する抗体をコードする核酸が提供される。
いくつかの実施形態では、個体における血糖レベルを低下させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、そのような処置を必要とする個体に治療有効量のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を投与し、それによって、血糖レベルを低下させるステップを含む。
いくつかの実施形態では、個体における耐糖能を向上させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、そのような処置を必要とする個体に治療有効量のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を投与し、それによって、耐糖能を向上させるステップを含む。
いくつかの実施形態では、個体における１型糖尿病を予防または処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、そのような処置を必要とする個体に治療有効量のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を投与し、それによって、１型糖尿病の１つまたは複数の症候を予防または処置するステップを含む。
いくつかの実施形態では、個体における２型糖尿病を予防または処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、そのような処置を必要とする個体に治療有効量のＩＬ−７Ｒアンタゴニストを投与し、それによって、２型糖尿病の１つまたは複数の症候を予防または処置するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体である。
いくつかの実施形態では、個体における関節リウマチを予防または処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、そのような処置を必要とする個体に治療有効量のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を投与し、それによって、関節リウマチの１つまたは複数の症候を予防または処置するステップを含む。
いくつかの実施形態では、個体における移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を予防または処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、そのような処置を必要とする個体に治療有効量のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を投与し、それによって、ＧＶＨＤの１つまたは複数の症候を予防または処置するステップを含む。
いくつかの実施形態では、ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＨＤまたは急性ＧＶＨＤである。
いくつかの実施形態では、個体におけるループスを予防または処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、そのような処置を必要とする個体に治療有効量のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を投与し、それによって、ループスの１つまたは複数の症候を予防または処置するステップを含む。
いくつかの実施形態では、ループスは、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、薬物誘発性エリテマトーデスまたは新生児ループスである。
いくつかの実施形態では、個体における多発性硬化症を予防または処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、そのような処置を必要とする個体に治療有効量のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を投与し、それによって、多発性硬化症の１つまたは複数の症候を予防または処置し、個体におけるナイーブＴ細胞集団および／または活性化Ｔ細胞集団を低減および／または枯渇させるステップを含む。いくつかの実施形態では、個体における、低減または枯渇されたＴ細胞集団がＴＨ１細胞および／またはＴＨ１７細胞を含む。いくつかの実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の投与が、個体におけるＴＨ１７細胞集団の拡大をもたらさない。
いくつかの実施形態では、抗体は、非経口的に投与することができる。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−７媒介のＳＴＡＴ５リン酸化に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体Ｐ２Ｄ２、Ｐ２Ｅ１１およびＨＡＬ４０３ａの用量依存的効果を示す図である。ｘ軸は、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐ−ＳＴＡＴ）を発現するＣＤ４＋細胞の百分率を示す。 非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの糖尿病発症に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。 （Ａ）血糖レベル（ｍｇ／ｄＬ）および（Ｂ）ＮＯＤマウスの体重（ｇ）に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。 ＮＯＤマウスにおける（Ａ）ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞集団および（Ｂ）メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞集団に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。ｘ軸では、総ＣＤ８＋Ｔ細胞集団が１００％として設定された。 ＮＯＤマウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞集団に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。ｘ軸では、総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団が１００％として設定された。 ＥＡＥ動物の臨床重症度に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｂ６および２８Ｇ９の効果を示す図である。ＥＡＥの臨床重症度は、０〜５点の評点システム：０、正常；１、尾の弛緩；２、後肢の部分的な麻痺；３、後肢の全体的麻痺；４、四肢麻痺；５、瀕死状態または死亡で毎日評価した。 ＥＡＥ動物の臨床重症度に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の用量依存的効果を示す図である。 ＥＡＥ動物の臨床重症度に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。 確立されたＥＡＥを有する動物における、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。 確立されたＥＡＥを有する動物における低用量のアンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。 ＥＡＥ動物の骨髄（ＢＭ）、脾臓、血液およびリンパ節（ＬＮ）の（Ａ）ＣＤ４Ｔ細胞集団および（Ｂ）ＣＤ８Ｔ細胞集団に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９および２８Ｂ６の効果を示す図である。ｘ軸では、総リンパ球集団が１００％として設定された。 図１２Ａは、ＥＡＥ動物の骨髄、脾臓、血液およびリンパ節のナイーブなＴ細胞集団に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。ｘ軸では、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団が１００％として設定された。図１２Ｂは、ＥＡＥ動物の骨髄、脾臓、血液およびリンパ節のメモリーＴ細胞集団に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。ｘ軸では、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団が１００％として設定された。図１２Ｃは、ＥＡＥ動物の骨髄、脾臓、血液およびリンパ節の活性化Ｔ細胞集団に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。ｘ軸では、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団が１００％として設定された。 ＥＡＥ動物の骨髄、脾臓、血液およびリンパ節のＴｅｆｆ細胞集団（左のグラフ）およびＴｒｅｇ細胞集団（右のグラフ）に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。ｘ軸では、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団が１００％として設定された。「＊」は、対照と比較した、Ｐ＜０．０５を示す。 高脂肪食誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける血糖レベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。 高脂肪食誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける耐糖能障害に対する、アンタゴニストＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体２８Ｇ９の効果を示す図である。
ＩＬ−７とのその相互作用を含めた、ＩＬ−７Ｒの機能をアンタゴナイズする抗体を本明細書に開示する。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を作製する方法、これらの抗体を含む組成物、およびこれらの抗体を薬物として用いる方法が提供される。ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト、例えば、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、２型糖尿病、ＧＶＨＤ、ならびに多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、１型糖尿病およびループスを含めた、自己免疫障害の予防および／または処置で使用できる。
一般技法
本発明の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技法が含まれる）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法が用いられ、これらは、当技術分野の技能の範囲内にある。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜１９９８）、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献において十分に説明されている。
定義
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、この用語は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみではなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単一鎖（ＳｃＦｖ）抗体およびドメイン抗体（例えば、サメ抗体およびラクダ科動物抗体が含まれる）ならびに抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）も包含する。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭなど、任意のクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。免疫グロブリンは、その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、異なったクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な、すなわち、その集団を含む個々の抗体が、微量に存在し得る潜在的な自然発生の突然変異を除いて同一である、抗体の集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位を対象としている。さらに、通常は複数の異なった決定基（エピトープ）を対象としている複数の異なった抗体を含んでいるポリクローナル抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象としている。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質の集団から得られたものであるという、抗体の特徴を示し、その抗体の生成が、いかなるものであれ特定の方法によることを必要とすると解釈するべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって作製することも、米国特許第４，８１６，５６７号に記載のものなどの組換えＤＮＡ法によって作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４に記載の技法を用いて作製されたファージライブラリーから単離することもできる。
本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリンから得られる最小限の配列を含有するそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエン抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、望ましい特異性、親和性、および容量を有する、マウス、ラット、またはラビットなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられているヒト免疫グロブリンであることが好ましい。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能をさらに精密化し、最適化するように含められる残基を含みうる。通常、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部も含むであろう。ＷＯ９９／５８５７２に記載のように修飾されているＦｃ領域を有する抗体が好ましい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ「から派生した（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる、元の抗体に比べて改変されている１つまたは複数のＣＤＲ（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、またはＣＤＲ Ｈ３）を有する。
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒトによって生成される抗体の配列に対応するアミノ酸配列を有し、かつ／または当業者に知られているか、本明細書に開示されているヒト抗体を作製する技法のいずれかを用いて作製された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。そのような一例は、マウス軽鎖とヒト重鎖ポリペプチドとを含む抗体である。当技術分野で知られている様々な技法を用いてヒト抗体を生成することができる。一実施形態では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９〜３１４；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１）。ヒト抗体は、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている内因性の遺伝子座の代わりにヒト免疫グロブリン遺伝子座が遺伝子導入によって導入されている動物、例えば、マウスの免疫化によっても作製することができる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号に記載されている。代替として、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を生成するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製されうる（そのようなＢリンパ球は個体から回収されるか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫処置されたものでありうる）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７ページ、１９８５；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ−７Ｒ」は、ＩＬ−７Ｒの活性の少なくとも一部を保持する任意の形態のＩＬ−７Ｒおよびそのバリアントを指す。ヒトＩＬ−７Ｒへの明示的な参照によるなど、別段に示されない限り、ＩＬ−７Ｒには、すべての哺乳動物種、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシのネイティブ配列ＩＬ−７Ｒが含まれる。
本明細書で使用される場合、「ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト」は、ＩＬ−７への結合、ＳＴＡＴ５、Ｓｒｃキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、およびＰｙｋ２のリン酸化、Ｂｃｌ２タンパク質の上方制御を含めた、ＩＬ−７Ｒシグナル伝達によって媒介されるＩＬ−７Ｒ生物活性および／または下流経路（複数可）を阻害できる抗体または分子を指す。ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの例には、限定されるものではないが、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体、ＩＬ−７Ｒ ｓｉＲＮＡ、ＩＬ−７Ｒ ｓｈＲＮＡ、およびＩＬ−７Ｒアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、ＩＬ−７Ｒシグナル伝達によって媒介される下流経路、ＩＬ−７とのそのような相互作用および／またはＩＬ−７に対する細胞反応の誘発を含めた、ＩＬ−７Ｒ生物活性を遮断する、アンタゴナイズする、抑制する、または低減する（相当程度を含めた任意の程度で）抗体を包含する。本発明の目的では、用語「アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体」（同義的に「ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト抗体」、「アンタゴニスト抗ＩＬ−７Ｒ抗体」または「抗ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト抗体」とも呼ばれる）は、それによってＩＬ−７Ｒ自体、ＩＬ−７Ｒ生物活性（限定されるものではないが、ＩＬ−７との相互作用、ＳＴＡＴ５のリン酸化の任意の側面を媒介するその能力、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔ経路活性化、ｐ２７Ｋｉｐ１下方制御、Ｂｃｌ−２上方制御、Ｒｂ過剰リン酸化（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）およびＣＸＣＲ４上方制御が含まれる）、または生物活性の結果が、任意の有意味な程度で実質的に無効にされる、低減される、または中和される、すべての以前に定義された用語、タイトル、機能的状態、および特徴を包含することが明確に理解されよう。一部の実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、ＩＬ−７Ｒに結合し、ＩＬ−７との相互作用を阻止する。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の例は、本明細書に提示されている。
本明細書で使用される場合、「完全アンタゴニスト」は、有効濃度で、ＩＬ−７Ｒの測定可能な効果を本質的に完全に遮断するアンタゴニストである。部分的アンタゴニストは、測定可能な効果を部分的に遮断することができるが、最も高い濃度でさえ完全アンタゴニストではないアンタゴニストを意味する。本質的に完全にとは、測定可能な効果の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％が遮断されることを意味する。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さの、好ましくは、比較的短い（例えば、１０〜１００アミノ酸）アミノ酸鎖を指すのに同義的に用いられる。その鎖は、線形でも分枝していてもよく、それは修飾アミノ酸も含むことができ、かつ／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、天然または介入による修飾、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、標識化コンポーネントとのコンジュゲーションなどの任意の他の操作または修飾を受けたアミノ酸鎖も包含する。この定義の中には、当技術分野で知られている他の修飾に加えて、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などが含まれる）を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単一鎖としても、連合鎖（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｉｎｓ）としても存在しうることが理解されている。
当技術分野で知られている通り、本明細書において同義的に用いられる、「ポリヌクレオチド」、または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼが鎖の中に組み入れることができる任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体など、修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、鎖のアセンブリの前に付与されても、その後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列が、非ヌクレオチドコンポーネントによって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化コンポーネントとのコンジュゲーションによるなど、ポリメリゼーションの後にさらに修飾されてもよい。修飾の他のタイプには、無修飾の形態のポリヌクレオチドに加えて、例えば、「キャップ」、類似体による１つまたは複数の天然存在のヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、無電荷結合によるもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、および荷電結合によるもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、例えばタンパク質などのペンダント部分（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）を含有するもの、介入物を有するもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）が含まれる。さらに、糖に通常に存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えば、標準的な保護基によって保護されているか、追加のヌクレオチドへの追加の結合に備えて活性化されている、ホスホネート基、リン酸基によって置き換えられていてもよく、固体支持体にコンジュゲートされていてもよい。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化されていても、アミンまたは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換されていてもよい。他のヒドロキシルも、標準的な保護基に誘導体化されていてもよい。ポリヌクレオチドは、当技術分野で一般に知られている類似型（ａｎａｌｏｇｏｕｓ ｆｏｒｍ）のリボース糖またはデオキシリボース糖を含有でき、それらには、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、アルファ−または、ベータ−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの無塩基ヌクレオシド類似体が含まれる。１つまたは複数のホスホジエステル結合が代替の連結基で置き換えられていてもよい。これらの代替の連結基には、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）［式中、ＲまたはＲ’のそれぞれは、独立して、Ｈであるか、エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有してもよい置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０個のＣ）である］によって置き換えられている実施形態が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。上の記述は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた、本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を、単独で、または組合せて指す。当技術分野で知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によってつなげられた４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲによって近接してまとめられ、もう片方の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定する技法が少なくとも２つある。すなわち、（１）種をまたぐ配列の可変性（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）に基づいたアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ））；および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づいたアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８）である。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、いずれかのアプローチによって、または両方のアプローチの組合せによって定義されたＣＤＲを指しうる。
当技術分野で知られているように、抗体の「定常領域」は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を、単独で、または組合せて指す。
本明細書で使用される場合、実施例２において本明細書に開示する方法によって測定して、平衡解離定数が２０ｎＭ以下、好ましくは約６ｎＭ未満、より好ましくは約１ｎＭ未満、最も好ましくは約０．２ｎＭ未満であるときに、抗体は、ＩＬ−７Ｒと「相互作用する」。
抗体またはポリペプチドに「選択的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書において同義的に用いられる）エピトープは、当技術分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的または選択的な結合を測定する方法も当技術分野においてよく知られている。分子は、それが、代替の細胞または物質と反応または会合するよりも高い頻度で、迅速に、長い時間、および／または高い親和性で、特定の細胞または物質と反応または会合する場合に、「特異的な結合」または「選択的な結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質に結合するより高い親和性、結合力で、容易に、および／または長い時間、結合する場合に、標的に「特異的に結合する」または「選択的に結合する」。例えば、ＩＬ−７Ｒエピトープに特異的または選択的に結合する抗体は、他のＩＬ−７Ｒエピトープまたは非ＩＬ−７Ｒエピトープに結合するよりも高い親和性、結合力で、容易に、および／または長い時間、このエピトープに結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的または選択的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的または選択的に結合してもよく、またはそうでなくてもよいことも理解される。したがって、「特異的な結合」または「選択的な結合」は、排他的な結合を（含みうるが）必ずしも必要としない。必ずではないが、通常、結合への言及は、選択的な結合を意味する。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、夾雑物を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋である物質を指す。
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチドインサートを取込むためのベクター（複数可）のレシピエントとなりうる、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の後代が含まれ、この後代は、自然な、偶発的な、または意図的な変異のため、元の親細胞に必ずしも完全に同一（形態学的に、またはゲノムＤＮＡ補体（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）でない可能性がある。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（複数可）で、ｉｎ ｖｉｖｏで形質移入された細胞が含まれる。
当技術分野で知られているように、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに用いられる。「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域でも、バリアントＦｃ領域でもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、カルボキシル末端まで続くものと定義される。Ｆｃ領域内の残基の付番は、Ｋａｂａｔにおけるように、ＥＵインデックスの付番である。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常、ＣＨ２およびＣＨ３の２つの定常領域を含む。
当技術分野で用いられるように、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述する。好ましいＦｃＲは、ネイティブ配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、それには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子バリアント型および選択的スプライシング型を含める）が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、主としてそれらの細胞質ドメインに相違がある類似したアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４；ｄｅ Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１で概説されている。「ＦｃＲ」には、新生児受容体であるＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎは、母親のＩｇＧの、胎児への移送を担っている（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書で使用される場合、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２抗体またはその抗原結合部分の結合に十分に類似の様式で、エピトープに結合し、その結果、第２の抗体の非存在下における第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下における、第１の抗体の、その同族エピトープとの結合の結果が検出可能に低減することを意味する。第２の抗体の、そのエピトープへの結合も、第１の抗体の存在下で検出可能に低減するという、その代替は、妥当でありうるが、妥当である必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体の、そのエピトープへの結合を、その第２の抗体が、第１の抗体の、そのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、阻害することができる。しかし、各抗体が、もう片方の抗体の、その同族エピトープまたはリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合、それが、同程度であるか、より大きな程度であるか、またはより少ない程度であるかに関わらず、それらの抗体は、それらのそれぞれのエピトープ（複数可）の結合に関して、互いと「交差競合する」と言われる。抗体の競合および交差競合の両方が本発明によって包含されている。当業者ならば、本明細書に提示される教示に基づいて、そのような競合または交差競合が起こる作用機序（例えば、立体障害、構造変化、または共通のエピトープもしくはその部分への結合）にかかわらず、抗体のそのような競合および／または交差競合が、本明細書に開示の方法に包含され、有用でありうることを理解するであろう。
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と一体化している必要があり、当技術分野で知られているそのような抗体エフェクター機能を評価するための様々なアッセイを用いて決定することができる。
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により、ネイティブ配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むが、なおネイティブ配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持する。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域内に、ネイティブ配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、約１〜約１０のアミノ酸置換、好ましくは、約１〜約５つのアミノ酸置換を有する。本明細書において、バリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは、上記領域と少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％と、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有するであろう。
本明細書で使用される場合、「処置」は、有益または望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益または望ましい臨床結果には、グルコースクリアランスの促進、血糖レベルの低下、耐糖能の向上、１型もしくは２型糖尿病の結果生じる高血糖レベルの発生の低減、関節リウマチの１つもしくは複数の症候の発生の低減もしくは改善、ＧＶＨＤの１つもしくは複数の症候の発生の低減もしくは改善、ループスの１つもしくは複数の症候の発生の低減もしくは改善、および多発性硬化症の１つもしくは複数の症候の発生の低減もしくは改善の１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
「発生の低減」は、任意の重症度の低減を意味する（この状態に通常用いられる他の薬物および／または療法の必要性および／または量（例えば、それへの曝露）の低減が含まれる）。当業者に理解されているように、個体は、処置に対する反応に関して様々でありえ、したがって、例えば、「発生を低減する方法」は、そのような投与がその特定の個体において発生のそのような低減を引き起こす可能性が高いであろうという合理的な期待に基づいて、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの投与を行う。
「改善」は、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストを投与しない場合と比較して、１つまたは複数の症候が減弱または好転することを意味する。「改善」には、症候の時間の短縮または低減も含まれる。
本明細書で使用される場合、薬物、化合物または医薬組成物の「有効用量」または「有効量」は、任意の１つまたは複数の有益または望ましい結果をもたらすのに十分な量である。予防的使用に関して、有益または望ましい結果は、危険性を除去もしくは低減すること、重症度を減弱すること、または疾患の生化学的、組織学的、および／もしくは行動的症候、疾患の発症中に現れるその合併症および中間的病理学的表現型を含めた、疾患の開始を遅延させることが含まれる。治療適用に関して、有益または望ましい結果は、血糖レベルを低減すること、１型糖尿病、２型糖尿病、関節リウマチ、ＧＶＨＤ、ループスもしくは多発性硬化症の１つもしくは複数の症候の発生の低減もしくは改善、疾患を処置するのに必要な他の投薬の用量を低減すること、別の投薬の効果を強化すること、および／または患者の疾患の進行を遅延させることなどの臨床結果が含まれる。有効用量は、１または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的では、薬物、化合物または医薬組成物の有効用量は、予防処置または治療処置を直接的または間接的に実現するために十分な量である。臨床のコンテクストで理解されているように、薬物、化合物または医薬組成物の有効用量は、別の薬物、化合物または医薬組成物とともに達成しても、そうでなくてもよい。したがって、「有効用量」は、１つまたは複数の治療薬を投与するコンテクストで考慮されうるものであり、単剤は、他の１つまたは複数の薬剤とともに望ましい結果が得られうる、または得られる場合に、有効量で与えられていると考慮されうる。
「個体」または「対象」が哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトである。哺乳動物には、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、コンストラクトを意味し、それは、対象とする１つまたは複数の遺伝子または配列を宿主細胞内に送達し、好ましくは発現させることができる。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーターなど、プロモーターまたはエンハンサーでありうる。発現制御配列は、転写させる核酸配列に作用可能に連結される。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる添加剤」は、有効成分と併せた場合にその成分が生物活性を保持するのを可能にし、対象の免疫系と非反応性であるいかなる物質も含まれる。例には、リン酸緩衝溶液、水、油／水型乳剤などの乳剤、および様々なタイプの湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれもが含まれるが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与用の好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または通常（０．９％）の生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００）。
用語「ｋｏｎ」は、本明細書で使用される場合、抗原への抗体の会合の速度定数を指す。詳細には、速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および平衡解離定数は、Ｆａｂ抗体断片（すなわち、一価）およびＩＬ−７Ｒを用いて測定される。
用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書で使用される場合、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を指す。
用語「ＫＤ」は、本明細書で使用される場合、抗体抗原相互作用の平衡解離定数を指す。
「約」の値またはパラメータの言及には、本明細書では、その値またはパラメータそれ自体を指示する実施形態が含まれる（かつ記述される）。例えば、「約Ｘ」と言及する記述には、「Ｘ」の記述が含まれる。数値範囲は、範囲を定義する数について包括的である。
本明細書において、実施形態が言葉「含む」とともに記述される場合は常に、「からなる」および／または、「から本質的になる」という用語で記述される、それ以外の点では類似の実施形態も提供されると理解されている。
本発明の態様または実施形態が、Ｍａｒｋｕｓｈ群または選択肢の他の群化によって記述される場合、本発明は、全体として記述された群全体のみではなく、群の各メンバーそれぞれおよび主群のすべての可能な亜群、それだけでなく群のメンバーの１つまたは複数が欠けている主群も包含する。本発明は、特許請求されている発明における群のメンバーのいずれかの１つまたは複数の明白な除外も想定する。
別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。対立が生じた場合には、定義を含めた本明細書によるものとする。本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、言及されている整数または整数の群の包含を含意し、但し、いかなる他の整数または整数の群の除外も含意しないものと理解される。文脈上別段要求されない限り、単数形の用語には複数が含まれるものとし、複数形の用語には単数が含まれるものとする。
例示的方法および物質を本明細書に記載する。但し、本明細書に記載された方法および物質に類似または同等の方法および物質も、本発明の実施または試行に用いることができる。物質、方法、および例は、単に例示的なものであり、限定的なものとは意図されていない。
２型糖尿病、ＧＶＨＤ、および自己免疫障害を予防または処置する方法
一態様では、本発明は、個体における２型糖尿病を処置または予防する方法であって、例えば、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体などの、有効量のＩＬ−７Ｒアンタゴニストを個体に投与するステップを含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、個体における１型糖尿病、関節リウマチ、ループスまたは多発性硬化症などの自己免疫疾患を処置または予防する方法であって、有効量のＩＬ−７Ｒアンタゴニストを個体に投与するステップを含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、個体におけるＧＶＨＤを処置または予防する方法有効量のＩＬ−７Ｒアンタゴニストを個体に投与するステップを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの治療投与は、血糖レベルの低下および耐糖能の向上を有利にもたらす。他の実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの治療投与は、有利に、血糖を望ましいレベルに維持する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの治療投与は、例えば、限定されるものではないが、関節硬直、関節腫脹、関節痛、ならびに関節の発赤および熱感を含めた、関節リウマチの１つまたは複数の症候の発生の低減および／または改善を有利にもたらす。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの治療投与は、例えば、限定されるものではないが、疲労、熱、体重減、体重増、関節痛、関節硬直、関節腫脹、頬部紅斑、皮膚損傷、口の痛み、鼻の潰瘍、毛髪脱落、レイノー現象、息切れ、胸痛、ドライアイ、挫傷、不安、うつ病、および記憶喪失を含めた、ループスの１つまたは複数の症候の発生の低減および／または改善を有利にもたらす。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの治療投与は、例えば、限定されるものではないが、肢の麻痺、震え、歩行困難、嚥下困難、失明、霧視、および筋力低下を含めた、多発性硬化症の１つまたは複数の症候の発生の低減および／または改善を有利にもたらす。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの治療投与は、例えば、限定されるものではないが、腹痛、腹部疝痛、発熱、黄疸、皮疹、嘔吐、体重減、ドライアイ、口内乾燥、毛髪脱落、肝炎、肺の障害、および消化管障害を含めた、ＧＶＨＤの１つまたは複数の症候の発生の低減および／または改善を有利にもたらす。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの治療投与は、例えば、限定されるものではないが、肺炎、腸炎症、下痢、腹痛、腹部疝痛、発熱、黄疸、悪心、嘔吐、肝損傷、皮疹、皮膚損傷、粘膜への損傷、粘膜脱落、胃腸管への損傷、体重減、斑点状丘疹、ならびにビリルビンレベル、罹患率、および死亡率の上昇を含めた、急性ＧＶＨＤの１つまたは複数の症候の発生の低減および／または改善を有利にもたらす。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの治療投与は、例えば、限定されるものではないが、ドライアイ、口内乾燥、毛髪脱落、肝炎、肺障害、消化管障害、皮疹、口腔潰瘍、口腔萎縮、爪ジストロフィー、乾燥症候群、硬化症、扁平苔癬様病変、多形皮膚萎縮症、食道ウェッブ、筋膜炎および閉塞性細気管支炎、ならびに肝臓、皮膚および粘膜、結合組織、外分泌腺、および／または胃腸管への損傷を含めた、慢性のＧＶＨＤの１つまたは複数の症候の発生の低減および／または改善を有利にもたらす。
血糖レベルの低下を必要とする糖尿病の個体を、例えば、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体などのＩＬ−７Ｒアンタゴニストで処置することができる。抗体療法に適した個体は、当技術分野でよく知られている、糖尿病の臨床診断基準および予後指標を用いて選択される。家族歴、空腹時血糖値、または耐糖能低下などの知られている予後指標によって評価される、糖尿病を発症する危険がある個体も、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの投与を受ける正当性を有する。当業者ならば、糖尿病またはグルコース摂取の調節異常を有する個体を認識するか、またはどのように診断するかを知っているであろう。また、当業者ならば、疾患の程度または重症度に応じて、抗体をいつ投与するべきかに関して適切に決定することができ、投与の最も望ましい様式を選択することもできる。
関節リウマチを患っている個体を、例えば、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体などのＩＬ−７Ｒアンタゴニストで処置することができる。ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト療法に適した個体は、当技術分野でよく知られている関節リウマチの臨床診断基準および予後指標を用いて選択される。関節リウマチの診断または評価は、当技術分野で十分に確立されている。重症度の評価は、関節リウマチ重症度スケール（ＲＡＳＳ）など、当技術分野で知られている尺度に基づいて行うことができる。Ｂａｒｄｗｅｌｌら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２００２、４１：３８〜４５。いくつかの実施形態では、関節リウマチおよび／または関節リウマチの症候の改善、制御、発生の低減、または発症もしくは進行の遅延をＲＡＳＳによって測定する。
ループスを患っている個体を、例えば、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体などのＩＬ−７Ｒアンタゴニストで処置することができる。ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト療法に適した個体は、当技術分野でよく知られているループスの臨床診断基準および予後指標を用いて選択される。当業者ならば、ループスを有する個体を認識するか、またはどのように診断するかを知っているであろう。また、当業者ならば、疾患の程度または重症度に応じて、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストをいつ投与するべきかに関して適切に決定することができ、投与の最も望ましい様式を選択することもできる。
多発性硬化症を患っている個体を、例えば、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体などのＩＬ−７Ｒアンタゴニストで処置することができる。ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト療法に適した個体は、当技術分野でよく知られている多発性硬化症の臨床診断基準および予後指標を用いて選択される。家族歴または症候歴などの知られている予後指標によって評価される、多発性硬化症を発症する危険がある個体も、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの投与を受ける正当性を有する。当業者ならば、多発性硬化症を有する個体を認識するか、またはどのように診断するかを知っているであろう。また、当業者ならば、疾患の程度または重症度に応じて、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストをいつ投与するべきかに関して適切に決定することができ、投与の最も望ましい様式を選択することもできる。
ＧＶＨＤを患っている個体を、例えば、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体などのＩＬ−７Ｒアンタゴニストで処置することができる。ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト療法に適した個体は、当技術分野でよく知られているＧＶＨＤの臨床診断基準および予後指標を用いて選択される。ＧＶＨＤの診断または評価は当技術分野で十分に確立されている。ＧＶＨＤの試験は、通常、症候に依存するが、生検有りまたは無しの胃腸内視鏡検査、肝臓機能試験（ＡＳＴ、ＡＬＰ、およびビリルビンレベルが増大するであろう）、肝生検、肺Ｘ線、および／または、皮膚生検が含まれる。慢性ＧＶＨＤの診断を確立するのに十分な特徴には、例えば、硬化症、扁平苔癬様病変、多形皮膚萎縮症、食道ウェッブ、筋膜炎、および閉塞性細気管支炎が含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＬｅｅｔおよびＦｌｏｗｅｒｓ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ；２００８：１３４〜１４１を参照）。急性肝臓ＧＶＨＤは、例えば、急性患者のビリルビンレベルによって測定できる。急性皮膚ＧＶＨＤは、びまん性斑点状丘疹をもたらしうる。ＧＶＨＤの重症度の評価は、当技術分野で知られている尺度に基づいて行うことができる。いくつかの実施形態では、ＧＶＨＤおよび／またはＧＶＨＤの症候の改善、制御、発生の低減、または発症もしくは進行の遅延を、各器官が個々に、低度の１から高度の４まで病期分類される総合グレード（皮膚−肝臓−腸）によって測定する。いくつかの実施形態では、ＧＶＨＤおよび／またはＧＶＨＤの症候の改善、制御、発生の低減、または発症もしくは進行の遅延を、体重のモニタリングによって測定する。
本明細書に記載のすべての方法に関して、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストへの言及には、１つまたは複数の追加の薬剤を含む組成物が含まれる。これらの組成物は、緩衝剤を含めた薬学的に許容できる添加剤（それらは当技術分野でよく知られている）など、適した添加剤をさらに含みうる。本発明は、単独で、または他の従来の処置方法と組み合わせて用いることができる。
ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、任意の適した経路で個体に投与することができる。本明細書に記載の例が限定を意図するものではなく、利用可能な技法の例示を意図するものであることは、当業者には明らかであろう。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストを、静脈内投与などの知られている方法に従って、例えば、ボーラスとして、またはある期間にわたる持続注入によって、筋肉内に、腹腔内に、脳脊髄内に、経皮的に、皮下に、関節内に、舌下に、滑液嚢内に、インサフレーションによって、髄腔内に、経口的に、吸入によって、または局所的経路によって、個体に投与する。投与は、全身性、例えば、静脈投与でも、局在性でもよい。ジェット噴霧装置および超音波噴霧装置を含めた、液剤用の市販の噴霧装置は投与に有用である。液剤は直接的に噴霧することができ、凍結乾燥散剤は、再構成後に噴霧することができる。代替として、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、フルオロカーボン製剤および定量吸入器を用いてエアロゾル化するか、または凍結乾燥および粉砕された散剤として吸入することができる。
一実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストを、部位特異的または標的指向局所送達技法で投与する。部位特異的または標的指向局所送達技法の例には、注入カテーテル、留置カテーテル、もしくはニードルカテーテル、合成移植片、外膜ラップ（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ ｗｒａｐ）、シャントおよびステントもしくは他の埋め込み可能デバイス、部位特異的担体、直接注射、または直接的適用など、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの様々な埋め込み可能なデポー供給源または局所送達カテーテルが含まれる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照のこと。
ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの様々な製剤を投与に用いることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストを未希釈で投与することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストおよび薬学的に許容できる添加剤は、様々な製剤となりうる。薬学的に許容できる添加剤は、当技術分野で知られており、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、添加剤は、形態もしくは一貫性を与えるか、または希釈剤として作用することができる。適した添加剤には、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変えるための塩、封入剤、緩衝剤、ならびに皮膚浸透増強剤が含まれるが、これらに限定されない。非経口薬物送達および経口薬物送達（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）のための添加剤および製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００に記載されている。
いくつかの実施形態では、これらの薬剤は、注射（例えば、腹腔内に、静脈内に、皮下に、筋肉内になど）による投与のために製剤化される。したがって、これらの薬剤を、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、および同様のものなどの薬学的に許容できるビヒクルと併せることができる。特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミング、および反復は、特定の個体およびその個体の病歴によるであろう。
ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、注射（例えば、腹腔内に、静脈内に、皮下に、筋肉内になど）による方法を含めた、任意の適した方法を用いて投与することができる。ＩＬ−７Ｒ抗体は、本明細書に記載のように、吸入によって投与することもできる。通常、ＩＬ−７Ｒ抗体の投与用には、初期候補用量は、約２ｍｇ／ｋｇでありうる。本発明の目的では、典型的な毎日用量は、上記の因子に応じて、約３μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇまで、３００μｇ／ｋｇまで、３ｍｇ／ｋｇまで、３０ｍｇ／ｋｇまで、１００ｍｇ／ｋｇ以上までのいずれかの範囲をとりうるであろう。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの用量を用いることができる。数日またはそれより長い期間にわたる反復投与には、状態に応じて、処置は、症候の所望の抑制が起こるまで、または十分な治療レベルが得られ、例えば、血糖レベルが低減するまで継続される。例示的な投与レジメンは、ＩＬ−７Ｒ抗体約２ｍｇ／ｋｇの初期用量およびそれに続く約１ｍｇ／ｋｇの毎週維持用量または隔週約１ｍｇ／ｋｇの維持用量の投与を含む。しかし、医者が実現を望む薬物動態学的減衰のパターンに応じて、他の投与レジメンも有用でありうる。例えば、いくつかの実施形態では、１週間あたり１から４回の投与が企図されている。他の実施形態では、１カ月あたり１回または２カ月毎もしくは３カ月毎に１回の投与が企図されている。この療法の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニターされる。投与レジメン（使用されるＩＬ−７Ｒアンタゴニスト（複数可）を含める）は、経時的に変動しうる。
本発明の目的では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの適切な用量は、利用されるＩＬ−７Ｒアンタゴニスト（またはその組成物）、処置する症候のタイプおよび重症度、薬剤を予防目的で投与するのかまたは治療目的で投与するのか、薬歴、患者の病歴および薬剤への反応、投与される薬剤の患者におけるクリアランス速度、ならびに主治医の判断に依存するであろう。通常、臨床医は、所望の結果を与える用量に達するまでＩＬ−７Ｒアンタゴニストを投与するであろう。用量および／または頻度は、処置の過程で変動しうる。半減期などの経験的要件は、通常、用量の決定に寄与するであろう。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体など、ヒト免疫系と適合性のある抗体を、抗体の半減期を長くするため、および宿主の免疫系によって抗体が攻撃されるのを防止するために用いることができる。投与の頻度は、治療の過程で決定および調整することができ、必ずではないが、通常、症候、例えば、高血糖レベル、関節痛などの処置および／または抑制および／または改善および／または遅延に基づく。代替として、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の持続的な連続放出製剤が適切でありうる。持続放出を実現するための様々な製剤およびデバイスが当技術分野で知られている。
一実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの用量を、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの１または複数回の投与を受けた個体で経験的に決定することができる。漸増用量のＩＬ−７Ｒアンタゴニストを個体に与える。有効性を評価するために、疾患の指標を追跡することができる。
本発明における方法によるＩＬ−７Ｒアンタゴニストの投与は、例えば、レシピエントの生理的な状態、投与の目的が治療であるか予防であるか、および当業者に知られている他の因子に応じて、連続的または断続的でありうる。ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的になされても、間隔を置いた一連の投与においてなされてもよい。
いくつかの実施形態では、複数のＩＬ−７Ｒアンタゴニストが存在してもよい。少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なるＩＬ−７Ｒアンタゴニスト、またはそれより多くのＩＬ−７Ｒアンタゴニストが存在していてもよい。通常、それらのＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、互いに悪い影響を与えない相補的な活性を有するものでありうる。例えば、以下のＩＬ−７Ｒアンタゴニスト：アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体、ＩＬ−７Ｒに向けられたアンチセンス分子（ＩＬ−７Ｒをコードする核酸に向けられたアンチセンス分子を含める）、ＩＬ−７Ｒ阻害化合物、およびＩＬ−７Ｒの構造的類似体のうち１つまたは複数を用いることができる。ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、それらの薬剤の有効性の強化および／または補足する働きのある他の薬剤と併用することもできる。
本発明にしたがって用いられるＩＬ−７Ｒアンタゴニストの治療製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、望ましい純度を有する抗体を、任意選択の薬学的に許容できる担体、添加剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００）と混合することによって、貯蔵用に調製される。許容できる担体、添加剤または安定化剤は、利用される用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸などの緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた酸化防止剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなど、塩を形成する対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含みうる。
ＩＬ−７Ｒアンタゴニストを含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８、１９８５；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０、１９８０；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載のものなど、当技術分野で知られている方法で調製される。循環時間の増進したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホズファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発法によって生み出すことができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生成するために、規定の孔径のフィルターを通して押出される。
有効成分は、例えば、それぞれコロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、コアセルベーション技法または界面重合によって調製されたミクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンミクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）ミクロカプセルの中に捕捉することもできる。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００に開示されている。
持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の適した例には、抗体を含有する固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、造形品、例えば、フィルムまたはミクロカプセルの形態にある。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリル酸）または’ポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性酢酸エチレン−ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドで構成された注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、イソ酪酸酢酸スクロース、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロオキシ酪酸が含まれる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過膜を通した濾過によって容易に実現される。治療用ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト組成物は、通常、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静注液バッグまたは皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルに入れられる。
本発明による組成物は、経口、非経口、もしくは直腸投与、または吸入もしくはインサフレーションによる投与のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液、もしくは懸濁液、または座薬などの単位剤形でありうる。
錠剤などの固体組成物を調製するには、主要な有効成分を薬学的担体、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウムまたはゴムなどの従来の錠剤化成分、および他の薬学的希釈剤、例えば、水と混合して、本発明の化合物またはその無毒な薬学的に許容できる塩の均一な混合物を含有する固体予備処方組成物を形成させる。これらの予備処方組成物を均一と呼ぶ場合、錠剤、丸剤およびカプセル剤などの、等しく有効な単位剤形に組成物を容易に細分することができるように、有効成分が組成物全体にわたって均等に分散されていることを意味する。この固体予備処方組成物は、次いで、０．１から約５００ｍｇの本発明の有効成分を含有する、上述のタイプの単位剤形に細分される。新規組成物の錠剤または丸剤は、長時間作用の利点を与える剤形となるようにコーティングするか、または別の方法で調合することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側投与コンポーネント（ｉｎｎｅｒ ｄｏｓａｇｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）および外側投与コンポーネント（ｏｕｔｅｒ ｄｏｓａｇｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を含み、後者が前者を覆うエンベロープの形態のものでありうる。これら２つのコンポーネントを腸溶層によって分離させることができ、腸溶層は、胃での崩壊に抵抗し、内側コンポーネントが、完全なまま十二指腸に入ること、または遅れて放出されることを可能にする働きをする。様々な物質を、そのような腸溶層またはコーティングに用いることができ、そのような物質には、多くの高分子酸、ならびに高分子酸と、シュラック、セチルアルコール、およびセルロースアセテートなどの物質との混合物が含まれる。
適した界面活性剤には、とりわけ、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）など、非イオン性薬剤が含まれる。界面活性剤を伴う組成物は、０．０５から５％の界面活性剤を含むことが好都合であり、これは、０．１から２．５％でありうる。必要に応じて、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルを添加してもよいことが理解されよう。
適した乳剤は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの市販の脂肪乳剤を用いて調製することができる。有効成分は、予め混合された乳剤組成物中に溶解させても、代替的にそれを油（例えば、大豆油、サフラワー油、綿実油、胡麻油、トウモロコシ油またはアーモンド油）に溶解させ、リン脂質（例えば、卵のリン脂質、ダイズリン脂質またはダイズレシチン）と水とを混合する際に乳剤を形成させてもよい。乳剤の張度を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを添加してもよいことが理解されよう。適した乳剤は、通常、最大２０％、例えば、５から２０％の間の油を含有するであろう。脂肪乳剤は、０．１から１．０μｍ、とりわけ０．１から０．５μｍの間の脂肪小滴を含み、５．５から８．０の範囲のｐＨを有するものでありうる。
乳剤組成物は、ＩＬ−７ＲアンタゴニストをＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはそのコンポーネント（大豆油、卵のリン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製されるものでありうる。
吸入またはインサフレーションのための組成物には、薬学的に許容できる水性もしくは有機の溶媒またはそれらの混合物の溶液および懸濁液、ならびに散剤が含まれる。液体または固体の組成物は、上述の適した薬学的に許容できる添加剤を含有しうる。いくつかの実施形態では、組成物を、局所性または全身性作用のための口呼吸または鼻呼吸経路で投与する。好ましくは無菌の薬学的に許容できる溶媒中の組成物は、気体の使用によって噴霧することができる。噴霧溶液を噴霧デバイスから直接的に吸い込んでも、噴霧デバイスを、フェースマスク、テントまたは間欠的陽圧呼吸機に付けてもよい。溶液、懸濁液または散剤組成物は、適切な様式で製剤を送達するデバイスから、好ましくは経口投与または鼻腔内投与することができる。
ＩＬ−７Ｒアンタゴニスト
本発明の方法は、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストを用いる。ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、ＩＬ−７Ｒに対する細胞反応の誘発などのＩＬ−７Ｒシグナル伝達によって媒介される下流経路を含めたＩＬ−７Ｒ生物活性を遮断、抑制、または低減（かなりの低減を含める）するいかなるタンパク質、ペプチドまたは核酸分子も指す。ＩＬ−７Ｒアンタゴニストの例には、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体、ＩＬ−７Ｒ ｓｉＲＮＡ、ＩＬ−７Ｒ ｓｈＲＮＡ、およびＩＬ−７Ｒアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、以下の特徴のうち任意の１つまたは複数を示すべきである：（ａ）ＩＬ−７Ｒに結合する；（ｂ）ＩＬ−７とのＩＬ−７Ｒの相互作用を遮断する；（ｃ）ＩＬ−７媒介のＳＴＡＴ５リン酸化を遮断または低減する；（ｄ）ｉｎ ｖｉｖｏで血糖レベルを低減する；（ｅ）ｉｎ ｖｉｖｏで耐糖能を増大させる；（ｆ）実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における疾患重症度を低減する；（ｇ）ＰＩ３Ｋリン酸化を遮断または低減する；（ｈ）ＡＫＴリン酸化を遮断または低減する；および（ｉ）他のまだ同定されていない因子とのＩＬ−７Ｒの相互作用を遮断する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体である。本発明の目的では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、ＩＬ−７Ｒシグナル伝達機能およびＩＬ−７の相互作用を阻害する様式でＩＬ−７Ｒαと反応することが好ましい。いくつかの実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、霊長類ＩＬ−７Ｒを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、霊長類および齧歯動物のＩＬ−７Ｒに結合する。
本発明で有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単一鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分（例えば、ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に修飾された抗体を含めた、必要な特異性の抗原認識部位を含む、任意の他の修飾された構成の免疫グロブリン分子を包含しうる。抗体は、マウス、ラット、ヒト、またはいかなる他の起源のもの（キメラまたはヒト化抗体を含める）でありうる。
いくつかの実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、モノクローナル抗体である。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、ヒト化抗体でありうる。他の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体は、修飾定常領域、例えば、限定されるものではないが、免疫応答を誘発する潜在能が増大している定常領域などを含む。例えば、定常領域は、Ｆｃガンマ受容体（例えば、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＡなど）に対する親和性が増大するように修飾されたものでありうる。
いくつかの実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性な、すなわち、免疫応答を誘発する潜在能が低減している定常領域など、修飾定常領域を含む。いくつかの実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載のように修飾されている。Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４でありうる。Ｆｃは、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１への変異（ＩｇＧ２Δａ）を含有するヒトＩｇＧ２でありえ、ここで、アミノ酸残基は、野生型ＩｇＧ２配列を基準にして付番されている。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の変異を含むＩｇＧ４の定常領域を含み（Ａｒｍｏｕｒら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４０ ５８５〜５９３）：Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５（ＩｇＧ４Δｃ）、ここで、付番は野生型のＩｇＧ４を基準にしている。さらに別の実施形態では、Ｆｃは、Ｇ２３６の欠失を伴ったＥ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５のヒトＩｇＧ４（ＩｇＧ４Δｂ）である。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｓ２２８からＰ２２８へのヒンジ安定化変異を含有する、任意のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４ΔｂまたはＩｇＧ４Δｃ）である（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５、９〜１９）。別の実施形態では、Ｆｃは、非グリコシル化Ｆｃでありうる。
いくつかの実施形態では、定常領域は、オリゴ糖結合残基（Ａｓｎ２９７など）、および／または定常領域のグリコシル化認識配列の一部である隣接残基に変異導入することによって非グリコシル化される。いくつかの実施形態では、定常領域は、酵素的に、Ｎ−連結グリコシル化について非グリコシル化される。定常領域は、酵素的に、またはグリコシル化欠失宿主細胞における発現によって、Ｎ−連結グリコシル化について非グリコシル化することができる。
ＩＬ−７Ｒ（ヒトＩＬ−７Ｒなど）に対するアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の結合親和性（ＫＤ）は、約０．００２から約２００ｎＭでありうる。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのいずれかである。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのいずれか未満である。
ＩＬ−７Ｒに対する抗体の結合親和性を決定する１つの方法は、抗体の単機能（ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することである。単機能Ｆａｂ断片を得るには、抗体（例えば、ＩｇＧ）をパパインで切断するか、または組換え発現させることができる。抗体のＩＬ−７Ｒ Ｆａｂ断片の親和性は、ＨＢＳ−ＥＰラニングバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）を用いた、前固定のストレプトアビジンセンサーチップ（ＳＡ）を備えた表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）で決定することができる。ビオチン化されたヒトＩＬ−７Ｒ（または任意の他のＩＬ−７Ｒ）を０．５μｇ／ｍｌ未満の濃度にＨＢＳ−ＥＰバッファーで希釈し、詳細な動態研究用の５０〜２００反応単位（Ｒｕ）またはスクリーニングアッセイ用の８００〜１，０００Ｒｕの２つの範囲の抗原密度をもたらすように、様々な接触時間を用いて個々のチップチャネルを横切るように注入することができる。再生研究は、２５ｍＭ ＮａＯＨを含む２５％ｖ／ｖエタノールが、２００回を超える注入にわたって、チップ上にＩＬ−７Ｒの活性を維持しながら、結合したＦａｂを効果的に除去することを示した。通常、精製Ｆａｂ試料の連続希釈（０．１〜１０×推定ＫＤの濃度にわたる）１００μＬ／分で１分間注入し、最大２時間の解離時間にわたって解離させた。Ｆａｂタンパク質の濃度は、既知濃度（アミノ酸分析で決定される）のＦａｂを標準物質として用いて、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって決定する。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いてデータを１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ、Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ、Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６．９９〜１１０）に全体的にフィッティングさせることによって、速度論的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得る。平衡解離定数（ＫＤ）値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。このプロトコールの使用は、異なった型のＩＬ−７Ｒに加えて、ヒトＩＬ−７Ｒ、別の哺乳動物のＩＬ−７Ｒ（マウスＩＬ−７Ｒ、ラットＩＬ−７Ｒ、霊長類ＩＬ−７Ｒなど）を含めた、任意のＩＬ−７Ｒへの抗体の結合親和性を決定するのに適している。抗体の結合親和性は、通常、２５℃で測定されるが、３７℃で測定することもできる。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、実施例１に示される方法を含めた、当技術分野で知られている任意の方法によって作製することができる。ハイブリドーマ細胞系の生成に関して、宿主動物の免疫処置の経路およびスケジュールは、本明細書にさらに記載される、抗体の刺激および生成のための確立されている従来の技法に沿うものである。ヒトおよびマウス抗体の生成のための一般技法は、当技術分野で知られており、かつ／または本明細書に記載されている。
ヒトを含めた哺乳動物のハイブリドーマ細胞系の生成の基礎として働くように、ヒトを含めた任意の哺乳動物対象またはその抗体産生細胞を操作することができることが企図されている。通常、宿主動物は、腹腔内に、筋肉内に、経口的に、皮下に、足底内に、および／または皮内に、本明細書に記載の量を含めた量の免疫原を接種される。
ハイブリドーマは、リンパ球および不死化ミエローマ細胞から、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １８：３７７〜３８１、１９８２による変法を用いて調製することができる。ハイブリダイゼーションには、限定されるものではないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから利用可能なミエローマ系を含めたミエローマ系を用いることができる。通常、この技法は、ポリエチレングリコールなどのフソゲンを用いるか、当業者によく知られている電気的手段による、ミエローマ細胞とリンパ系細胞との融合を伴う。融合の後、細胞を融合培地から分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的増殖培地で増殖させて、ハイブリッド形成していない親細胞を除去する。本明細書に記載の培地のうち任意のものを、血清を補って、または補わずに、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するのに用いることができる。細胞融合技法の別の別法として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を、本発明のＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体を生成するのに用いることができる。望ましい場合には、ハイブリドーマを増殖させ、サブクローニングし、従来のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）によって、上清の抗免疫原活性をアッセイする。
抗体の供給源として使用できるハイブリドーマは、ＩＬ−７Ｒまたはその部分に特異的なモノクローナル抗体を生成する親ハイブリドーマのすべての誘導体、後代細胞を包含する。
そのような抗体を生成するハイブリドーマは、知られている手順を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、望ましい場合、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地または体液から単離することができる。望ましくない活性は、存在する場合、例えば、固相に結合した免疫原でできた吸着剤上に調製物を流し、所望の抗体を免疫原から溶出する、または遊離させることによって、除去することができる。免疫処置される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、スカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害因子に、二機能性薬剤または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を用いてコンジュゲートされた、ヒトＩＬ−７Ｒαまたは標的アミノ酸配列を含有する断片による、宿主動物の免疫処置によって、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団を生成することができる。
望ましい場合、対象とするアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を配列決定することができ、次いで、ポリヌクレオチド配列を発現用または増幅用のベクターにクローニングすることができる。対象とする抗体をコードする配列を、宿主細胞内のベクター中に維持することができ、次いで、宿主細胞を増殖させ、その後の使用のために冷凍することができる。細胞培養における組換え体モノクローナル抗体の生成は、当技術分野で知られている手段によって、Ｂ細胞からの抗体遺伝子のクローニングを介して行うことができる。例えば、Ｔｉｌｌｅｒら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９、１１２；米国特許第７，３１４，６２２号を参照のこと。
別法では、ポリヌクレオチド配列を遺伝子操作に用いて、抗体を「ヒト化する」か、または抗体の親和性もしくは他の特徴を向上させることができる。例えば、抗体がヒトにおける臨床試験および処置に用いられる場合に免疫応答を回避するように、定常領域を、ヒト定常領域により密接に類似するように構築することができる。ＩＬ−７Ｒに対する親和性の増大およびＩＬ−７Ｒを阻害する効力の増大が得られるように、抗体配列を遺伝子操作することが望ましい可能性がある。当業者には、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体に１つまたは複数のポリヌクレオチド変化を加え、なおＩＬ−７Ｒへの結合能を維持することができることは明らかであろう。
モノクローナル抗体をヒト化するための４つの一般的ステップがある。これらは以下の通りである。（１）開始抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計する、すなわち、ヒト化過程中にどの抗体フレームワーク領域を用いるか決定するステップ、（３）実際のヒト化方法論／技法、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；第５，８６６，６９２号；第６，３３１，４１５号；第５，５３０，１０１号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；および第６，１８０，３７０号を参照のこと。
ヒト定常領域に融合した齧歯動物Ｖ領域または修飾齧歯動物Ｖ領域およびそれらに付随するＣＤＲを有するキメラ抗体を含めた、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含む多数の「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３〜２９９、１９９１、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０〜４２２４、１９８９、Ｓｈａｗら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４〜４５３８、１９８７およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７〜３５８３、１９８７を参照のこと。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常領域と融合される前に、支持となるヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に接ぎ合わされた齧歯動物ＣＤＲを記載する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７、１９８８、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６、１９８８、およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５、１９８６を参照のこと。別の参考文献は、組換え構築された齧歯動物フレームワーク領域によって支持された齧歯動物ＣＤＲを記載する。例えば、欧州特許第０５１９５９６号明細書を参照のこと。これらの「ヒト化された」分子は、齧歯動物抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的反応を最小にするように設計される。そのような反応は、ヒトレシピエントにおける、それらの部分の治療適用の期間および有効性を制限する。例えば、抗体定常領域を、それが免疫学的に不活性となる（例えば、補体溶解の引き金とならない）ように構築することができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；英国特許出願第９８０９９５１．８号を参照のこと。同じく利用することのできる、抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２４７１〜２４７６、１９９１によって、ならびに米国特許第６，１８０，３７７号；第６，０５４，２９７号；第５，９９７，８６７号；第５，８６６，６９２号；第６，２１０，６７１号；および第６，３５０，８６１号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０１／２７１６０号において開示されている。
上記考察はヒト化抗体に関するものであるが、論じられた一般的原則は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシにおける使用のための抗体の個別化（ｃｕｓｔｏｍｉｚｉｎｇ）に適用可能であることは明らかである。本明細書に記載の抗体をヒト化する１つまたは複数の態様を、例えば、ＣＤＲグラフティング、フレームワーク変異およびＣＤＲ変異と併用できることもさらに明らかである。
さらに別の別法では、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように構築された市販のマウスを用いることによって、完全ヒト抗体を得ることができる。さらに望ましい（例えば、完全ヒト抗体）またはさらにロバストな免疫応答を生成するように設計されたトランスジェニック動物も、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製に用いることができる。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
別法では、抗体は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて、組換えにより作製し、発現させることができる。別の別法では、抗体は、ファージディスプレイ技術によって、組換えにより作製することができる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号；および第６，２６５，１５０号；およびＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜４５５、１９９４を参照のこと。代替として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５３、１９９０）を用いて、免疫処置されていないドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体断片を生成することができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの繊維状バクテリオファージのメジャーコートタンパク質遺伝子またはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームにクローニングし、ファージ粒子の表面に機能性抗体断片として提示する。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有しているので、抗体の機能特性に基づく選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。したがって、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで行うことができる。概説には、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４〜５７１、１９９３を参照のこと。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８、１９９１は、免疫処置されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、多様なアレイの抗オキサゾロン抗体を単離した。Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７、１９９１、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５〜７３４、１９９３によって記載の技法に本質的に従って、免疫処置されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多様なアレイの抗原（自己抗原を含める）に対する抗体を単離することができる。自然な免疫応答では、抗体遺伝子は高率で変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入される変化のいくつかは、より高い親和性を与えるであろう。そして、高親和性の表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞は、後続の抗原チャレンジ中に選択的に複製され、分化誘導される。この自然の過程は、「鎖シャフリング」として知られる技法を利用することによって模倣することができる（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜７８３、１９９２）。この方法では、免疫処置されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然発生のバリアント（レパートリー）のレパートリーで重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を順次に置き換えることによって、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を向上させることができる。この技法は、ｐＭ〜ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生成を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「すべてのライブラリーの母」としても知られている）を作製するためのストラテジーが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５〜２２６６、１９９３によって記載されている。遺伝子シャフリングは、齧歯動物抗体からヒト抗体を得るために用いることもでき、この場合、ヒト抗体は、開始齧歯動物抗体に類似した親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によると、ファージディスプレイ技法によって得られた齧歯動物抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子または軽鎖Ｖドメイン遺伝子が、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えられ、齧歯動物−ヒトキメラを作り出す。抗原上での選択の結果、機能的な抗原結合部位を回復することができるヒト可変領域が分離される。すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリンティングする）。残っている齧歯動物Ｖドメインを置き換えるために、この過程を反復すると、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０６２１３号を参照）。ＣＤＲグラフティングによる齧歯動物抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、齧歯動物起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基を全くもたない、完全にヒトの抗体を提供する。
最初に、宿主動物からの抗体および抗体産生細胞を単離し、遺伝子配列を取得し、遺伝子配列を用いて宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）で抗体を組換えにより発現することによって、抗体を組換えにより作製することができる。利用することができる別の方法は、抗体配列を植物（例えば、タバコ）、またはトランスジェニック乳の中に発現させることである。植物または乳の中に抗体を組換えにより発現させるための方法は開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７５６、２００１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５、１９９５；ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７、１９９９を参照のこと。抗体の誘導体、例えばヒト化された単一鎖などを作製するための方法は当技術分野で知られている。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などのイムノアッセイおよびフローサイトメトリー選別技法も、ＩＬ−７Ｒに特異的である抗体を単離するのに利用することができる。
抗体は、多くの異なった担体に結合させることができる。担体は、活性および／または不活性でありうる。よく知られている担体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鋼が含まれる。担体の性質は、本発明の目的では、可溶性または不溶性のいずれかでありうる。当業者ならば、通常の実験を用いて、抗体を結合させるのに適した他の担体を知るか、またはそれを確かめることができるであろう。いくつかの実施形態では、担体は心筋を標的とする部分を含む。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定される（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。いったん単離されると、ＤＮＡを発現ベクター（ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示の発現ベクターなど）に挿入することができ、次いで、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞など、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を生成しない宿主細胞に形質移入される。例えばＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号を参照のこと。ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常領域のコード配列を、相同マウス配列の代わりに用いることによって、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１、１９８４、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合によって接続することによって、修飾することができる。このようにして、本明細書におけるＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、当技術分野で知られている方法を用いて同定または特徴付けすることができ、それによって、ＩＬ−７Ｒ生物活性の低減、改善、または中和が検出および／または測定される。いくつかの実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、候補薬剤をＩＬ−７Ｒと共にインキュベートし、ＩＬ−７Ｒの結合および／またはそれに伴う生物活性の低減もしくは中和をモニターすることによって同定される。結合アッセイは、精製されたＩＬ−７Ｒポリペプチド（複数可）と用いて、またはＩＬ−７Ｒポリペプチド（複数可）を自然に発現する、もしくは発現するように形質移入された細胞を用いて行うことができる。一実施形態では、結合アッセイは、競合結合アッセイであり、この場合、ＩＬ−７Ｒ結合に関して、既知のＩＬ−７Ｒアンタゴニストと競合する、候補抗体の能力を評価する。アッセイは、ＥＬＩＳＡフォーマットを含めた、様々なフォーマットで行うことができる。他の実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、候補薬剤をＩＬ−７Ｒと共にインキュベートし、結合およびそれに伴うＳＴＡＴ５リン酸化の阻害をモニターすることによって、同定される。
初期同定に続いて、候補アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の活性を、標的の生物活性を試験することが知られている生物検定によってさらに確認および精密化することができる。代替として、生物検定を用いて、候補を直接的にスクリーニングすることができる。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を同定および特徴付けするための方法のいくつかを、実施例に詳細に記載する。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、当技術分野でよく知られている方法を用いて特徴付けすることができる。例えば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定すること、すなわち「エピトープマッピング」である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９の第１１章に記載される、抗体抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイを含めた、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けする、当技術分野で知られている多くの方法がある。さらなる例では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が結合する配列を決定するのに、エピトープマッピングを用いることができる。エピトープマッピングは、様々な業者、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５、８２１９、ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）から商業的に提供されている。エピトープは、線形エピトープ、すなわち、ひと続き（ａ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒｅｔｃｈ）のアミノ酸に含有されたものでも、必ずしもひと続きに含有されていなくてもよいアミノ酸の三次元相互作用によって形成されたコンフォメーションエピトープでもよい。様々な長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）のペプチドを単離または合成して（例えば、組換えにより）、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体と共に結合アッセイに用いることができる。別の例では、ＩＬ−７Ｒ配列に由来するオーバーラップしたペプチドを用いて、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体による結合を決定することによる系統的なスクリーニングにおいて、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が結合するエピトープを決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、ＩＬ−７Ｒをコードするオープンリーディングフレームが、ランダムに、または特定の遺伝子構築によって断片化され、ＩＬ−７Ｒの発現された断片の、試験される抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲによって生成させ、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、放射性アミノ酸の存在下でタンパク質に翻訳することができる。次いで、放射能標識されたＩＬ−７Ｒ断片への抗体の結合を、免疫沈降反応およびゲル電気泳動によって決定する。ある種のエピトープは、ファージ粒子の表面に提示されたランダムなペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を用いることによっても、同定することができる。代替として、オーバーラップしたペプチド断片の規定のライブラリーを、試験抗体への結合について、単純な結合アッセイで試験することができる。さらなる例では、エピトープ結合に必要な、十分な、かつ／または必須の残基を同定するために、抗原結合ドメインの変異導入、ドメインスワッピング実験、およびアラニンスキャンニング変異導入を行うことができる。例えば、変異体ＩＬ−７Ｒを用いて、ドメインスワッピング実験を行うことができる。ＩＬ−７Ｒポリペプチドの様々な断片が、別の種のＩＬ−７Ｒ、または近縁ではあるが抗原性が異なるタンパク質（プロタンパク質コンバターゼファミリーの別のメンバーなど）由来の配列で置き換えられている（スワッピングされた）。変異体ＩＬ−７Ｒへの抗体の結合を評価することによって、抗体結合に対する特定のＩＬ−７Ｒ断片の重要性を評価することができる。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を特徴付けするのに用いることができるさらに別の方法は、同じ抗原、すなわち、ＩＬ−７Ｒ上の様々な断片に結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを用いて、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうか決定することである。競合アッセイは当業者によく知られている。
発現ベクターを用いて、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の発現を指示することができる。当業者ならば、ｉｎ ｖｉｖｏで外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；第６，４１３，９４２号；および第６，３７６，４７１号を参照のこと。発現ベクターの投与には、注入、経口投与、粒子銃またはカテーテル挿入（ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚｅｄ）投与、および局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与を含めた、局部（ｌｏｃａｌ）投与または全身投与が含まれる。別の実施形態では、発現ベクターを交感神経幹もしくは神経節に、または冠動脈、心房、心室もしくは心嚢の中に直接的に投与する。
発現ベクターまたはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療組成物の標的指向性送達も用いることができる。受容体媒介のＤＮＡ送達技法は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３、１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編、１９９４；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３：６２１；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８７：３６５５；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：３３８に記載されている。遺伝子療法プロトコールにおける局部投与用には、ポリヌクレオチドを含有する治療組成物を、約１００ｎｇから約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与する。遺伝子療法プロトコール中には、約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲を用いることができる。治療用のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス性または非ウイルス性起源のものでありうる（全般的に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、１：５１；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９５、１：１８５；Ｋａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、６：１４８を参照）。そのようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導することができる。コード配列の発現は、構成的または調節的でありうる。
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当技術分野でよく知られている。例示的なウイルスベースのビヒクルには、組換え体レトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６号；第ＷＯ９４／０３６２２号；第ＷＯ９３／２５６９８号；第ＷＯ９３／２５２３４号；第ＷＯ９３／１１２３０号；第ＷＯ９３／１０２１８号；第ＷＯ９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号および第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；ならびに欧州特許第０ ３４５ ２４２号を参照）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、第ＷＯ９３／０３７６９号；第ＷＯ９３／１９１９１号；第ＷＯ９４／２８９３８号；第ＷＯ９５／１１９８４号、および第ＷＯ９５／００６５５号）が含まれるが、これらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７に記載の死滅アデノウイルスに連結したＤＮＡの投与も利用することができる。
限定されるものではないが、死滅アデノウイルスのみに連結された、または連結されていないポリカチオン縮合ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７を参照）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：１６９８５を参照）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０７９９４号；第ＷＯ９６／１７０７２号；第ＷＯ９５／３０７６３号；および第ＷＯ９７／４２３３８）および核酸電荷中和（ｎｕｃｌｅｉｃ ｃｈａｒｇｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）または細胞膜との融合を含めた、非ウイルス性送達ビヒクルおよび方法も利用することができる。裸のＤＮＡも利用することができる。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用できるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１３７９６号；第ＷＯ９４／２３６９７号；第ＷＯ９１／１４４４５号；および欧州特許第０５２４９６８号に記載されている。さらに他のアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９４、１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、９１：１５８１に記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載の方法で作製され、本明細書に記載の特徴を有する抗体を含む、医薬組成物を含めた、組成物を包含する。本明細書で使用される場合、組成物は、ＩＬ−７Ｒの、ＩＬ−７との相互作用をアンタゴナイズする１つもしくは複数の抗体、および／または１つまたは複数のこれらの抗体をコードする配列を含む１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野でよく知られている、緩衝剤を含めた薬学的に許容できる添加剤など、適した添加剤をさらに含みうる。
本発明のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、以下の特徴のうちのいずれか（１つまたは複数）によって特徴付けられる：（ａ）ＩＬ−７Ｒに結合する；（ｂ）ＩＬ−７とのＩＬ−７Ｒの相互作用を遮断する；（ｃ）ＩＬ−７媒介のＳＴＡＴ５リン酸化を遮断または低減する；（ｄ）ｉｎ ｖｉｖｏで血糖レベルを低減する；（ｅ）ｉｎ ｖｉｖｏで耐糖能を向上させる；および（ｆ）ＥＡＥにおける疾患重症度を低減させる。好ましくは、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、これらの特徴のうちの２つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、３つ以上の特徴を有する。より好ましくは、抗体は、４つ以上の特徴を有する。より好ましくは、抗体は、５つ以上の特徴を有する。最も好ましくは、抗体は、６つの特徴すべてを有する。
したがって、本発明は、以下のもののうちいずれか、または以下のもののうちいずれかを含む組成物（医薬組成物を含める）を提供する：（ａ）ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＧＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＮＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＶＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＣ（配列番号１）、ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＧＳＳＧＲＩＡＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＡＰＴＴＶＩＹＥＤＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＡＳＳＳＬＷＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬＳ（配列番号３）、ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＧＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＮＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＶＴＥＤＥＡＤＹＹＣＭＱＹＤＳＳＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＣ（配列番号５）、ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＧＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＮＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＶＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＣ（配列番号７）、ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＧＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＮＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＶＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＣ（配列番号９）、ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＧＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＮＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＶＴＥＤＥＡＤＹＹＣＭＱＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＣ（配列番号１１）、ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＭＱＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４４）、またはＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４１）の軽鎖部分配列を有する抗体；および（ｂ）ＱＶＮＬＲＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＬＶＧＷＤＧＳＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＬＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）、ＱＶＴＬＫＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＩＳＧＧＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４）、ＱＶＮＬＲＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＬＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＶＦＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）、ＱＶＮＬＲＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＬＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＭＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）、ＱＶＮＬＲＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＬＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＭＧＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０）、ＱＶＮＬＲＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＬＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＭＧＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）、またはＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＭＧＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４０）の重鎖部分配列を有する抗体。
Figure 2017061454
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表１において、下線部の配列は、ＫａｂａｔによるＣＤＲ配列であり、太字はＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ配列である。
本発明は、ＩＬ−７Ｒに対する抗体のＣＤＲ部分（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、およびＣＤＲ接触領域を含める）も提供する。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当技術分野における技能の範囲内である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組合せでありうると理解されている（「複合ＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲである。換言すれば、複数のＣＤＲがある実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、複合ＣＤＲ、またはそれらの組合せのうちのいずれでもよい。表２は、本明細書に提供されるＣＤＲ配列の例を提供する。
Figure 2017061454
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ＣＤＲ接触領域は、抗原に対する特異性を抗体に与える、抗体の領域である。一般に、ＣＤＲ接触領域には、ＣＤＲ内に位置する残基と、特異的抗原に結合するための、抗体の適切なループ構造を維持するために拘束されているＶｅｒｎｉｅｒゾーンに位置する残基が含まれる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００７、「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｖｅｒｎｉｅｒ Ｚｏｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照。ＣＤＲ接触領域の決定は、十分に当技術分野の技能の範囲内である。いくつかの実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、ＦＴＦＤＤＳＶＭ（配列番号５６）、ＧＷＤＧＦＦ（配列番号５７）、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は任意のアミノ酸でありうるＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（配列番号５８）、ＳＧＳＩＤＳＳＹ（配列番号５９）、ＥＤＤＱＲＰＳＧＶ（配列番号６０）、およびＦＨＨＬ（配列番号６１）からなる群より選択されるアミノ酸配列含む１つまたは複数のＣＤＲ接触領域を含む。
ＩＬ−７Ｒに対するアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の結合親和性（ＫＤ）は、約０．００２から約２００ｎＭでありうる。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのうちのいずれか未満である。
本発明は、これらの抗体のうちのいずれかを作製する方法も提供する。本発明の抗体は、当技術分野で知られている手順で作製することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解または他の分解によって、上述の組換え法（すなわち、単一または融合ポリペプチド）によって、または化学合成によって、生成することができる。抗体のポリペプチド、とりわけ、約５０アミノ酸までの短いポリペプチドは、化学合成により好都合に作製される。化学合成法は、当技術分野で知られており、商業的に利用可能である。例えば、固相法を利用する自動化されたポリペプチド合成機によって抗体を生成することができよう。米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第６，３３１，４１５号を参照。
別の別法では、当技術分野でよく知られている手順を用いて、抗体を組換え作製することができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、抗体Ｐ３Ａ９、Ｐ４Ｂ３、Ｐ２Ｄ２、Ｐ２Ｅ１１、ＨＡＬ４０３ａ、ＨＡＬ４０３ｂ、Ｃ１ＧＭ、またはＣ２Ｍ３の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする配列を含む。対象とする抗体をコードする配列は、宿主細胞内のベクター中に維持することができ、宿主細胞は、次いで、今後の使用のために増殖させ、冷凍することができる。ベクター（発現ベクターを含める）および宿主細胞は、本明細書にさらに記載されている。
本発明は、本発明の抗体のｓｃＦｖを包含する。単一鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを用いることによって、軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することによって、作製される（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６）。連結ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１３）であり、これは、１つの可変領域のカルボキシ末端ともう片方の可変領域のアミノ末端の間に約３．５ｎｍの橋を架ける。他の配列のリンカーが設計されて、用いられている（Ｂｉｒｄら、１９８８、同上）。リンカーは、短くて、柔軟なポリペプチドであり、好ましくは、約２０未満のアミノ酸残基で構成されているべきである。リンカーは、その次に、薬物の付着または固体支持体への付着など、追加機能のために修飾することができる。単一鎖バリアントは、組換えによって、または合成によって生成することができる。ｓｃＦｖの合成による生成のために、自動化された合成機を用いることができる。ｓｃＦｖの組換え生成には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適したプラスミドを、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞のいずれかの適した宿主細胞に導入することができる。対象とするｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの通常の操作で作製することができる。その結果得られるｓｃＦｖは、当技術分野で知られている標準的なタンパク質精製技法を用いて単離することができる。
ダイアボディーなどの単一鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディーは、二価の二重特異性抗体であり、重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインが、単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いており、それによって、それらのドメインを、別の鎖の相補的なドメインと対合するように強制し、２つの抗原結合部位を作り出す（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１〜１１２３を参照）。
例えば、二重特異性抗体、すなわち少なくとも２つの異なった抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体を、本明細書に開示された抗体を用いて調製することができる。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０を参照）。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生成は、異なった特異性を有する２つの重鎖を伴う、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５３７〜５３９）。
二重特異性抗体を作製するための１つのアプローチによると、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常領域配列に融合させる。融合体は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域との融合体が好ましい。それは、融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体と、望ましい場合には免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、適した宿主生物内に同時形質移入する。これは、構築に用いられる３本のポリペプチド鎖の不均等な比率が、最適な収率をもたらす場合、実施形態における３つのポリペプチド断片の相互割合を調整する際の大きな柔軟性を提供する。しかし、少なくとも２本のポリペプチド鎖の等しい割合での発現が高い収率をもたらす場合、または割合に特別の重要性がない場合、２本または３本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
１つのアプローチでは、二重特異性抗体は、１つの腕における、第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、もう片方の腕における、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）とから構成される。二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖があるこの非対称の構造によって、望ましい二重特異性化合物の、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの分離が容易となる。このアプローチはＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０４６９０号に記載されている。
２つの共有結合によって連結された抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内にある。そのような抗体は、免疫系の細胞を、望ましくない細胞へとターゲティングするため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のため（ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／００３６０号および第ＷＯ９２／２００３７３号；ＥＰ０３０８９）に用いられている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を用いて作製することができる。適した架橋剤および技法は、当技術分野でよく知られており、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
キメラ抗体またはハイブリッド抗体も、架橋剤を用いるものを含めた、合成タンパク質化学の知られている方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することができる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
ヒト化抗体は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて作製することができる。例えば、モノクローナル抗体をヒト化するのに、４つの一般的なステップを用いることができる。これらは、以下の通りである。（１）開始抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計する、すなわち、ヒト化過程中にどの抗体フレームワーク領域を用いるか決定するステップ、（３）実際のヒト化方法論／技法、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；第５，８６６，６９２号；第６，３３１，４１５号；第５，５３０，１０１号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；および第６，１８０，３７０号を参照のこと。
組換えヒト化抗体において、Ｆｃγ受容体、補体、および免疫系との相互作用を避けるために、Ｆｃγ部分を修飾することができる。そのような抗体の調製のための技法は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されている。例えば、抗体がヒトにおける臨床試験および処置に用いられる場合に免疫応答を回避するように、ヒト定常領域により類似するように定常領域を構築することができる。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および第５，８６６，６９２号を参照のこと。
本発明は、表１に示す本発明のバリアントの抗体およびポリペプチドへの修飾を包含し、それらには、それらの特性に重要な影響を与えない機能的に同等な抗体、ならびに活性および／または親和性が増大または低減しているバリアントが含まれる。例えば、ＩＬ−７Ｒに対する望ましい結合親和性を有する抗体を得るように、アミノ酸配列に変異導入することができる。ポリペプチドの修飾は、当技術分野における通常の実技であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。修飾ポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的な活性に大きく有害な変化を与えない、もしくはポリペプチドの、そのリガンドに対する親和性を成熟させる（促進する）１つもしくは複数のアミノ酸欠失もしくは付加を有するポリペプチド、または化学類似体の使用が含まれる。
アミノ酸配列挿入には、長さ１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドにまで及ぶアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一アミノ酸残基または複数アミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントには、血液循環中の抗体の半減期を増大させる酵素またはポリペプチドの、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
置換バリアントは、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なった残基が挿入されている。置換変異導入のための最も大きな関心対照となる部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ改変も企図される。保存的置換は、表３において、「保存的置換」という見出しの下に示されている。そのような置換が生物活性の変化をもたらす場合、表３において「例示的置換」と命名され、アミノ酸のクラスを参照して下記にさらに説明されるより実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングすることができる。
Figure 2017061454
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換の領域のポリペプチドバックボーンの構造、例えば、シートもしくはヘリックスコンフォメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷量もしくは疎水性または（ｃ）側鎖の嵩を維持することへのそれらの影響において有意差がある置換を選択することによって実現される。天然存在の残基は、共通の側鎖特性に基づく群に分けられる：
（１）無極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）無電荷極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（陰電荷）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基（陽電荷）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することによって行われる。
分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を阻止するために、通常、抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基も、セリンで置換することができる。特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に、安定性を向上させるために、逆に、システイン結合（複数可）を抗体に付加することができる。
アミノ酸修飾は、１つまたは複数のアミノ酸の変化または修飾から、可変領域など、領域の再設計の完成にまで及ぶものでありうる。可変領域における変化は、結合親和性および／または特異性を改変するものでありうる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲドメイン内において、１から５つ以下の保存的アミノ酸置換が行われる。他の実施形態では、ＣＤＲドメイン内において、１から３つ以下の保存的アミノ酸置換が行われる。さらに他の実施形態では、ＣＤＲドメインは、ＣＤＲ Ｈ３および／またはＣＤＲ Ｌ３である。
修飾には、グリコシル化ポリペプチドおよび非グリコシル化ポリペプチド、ならびに、例えば、異なる糖によるグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など、他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含まれる。抗体は、それらの定常領域の保存された位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６５：１１１〜１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ １５：２６〜３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１〜１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５〜４１８０）、および糖タンパク質の部分間の分子内相互作用に影響を与え、これは、糖タンパク質のコンフォメーションおよび提示された三次元表面に影響を与えうる（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、同上；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９〜４１６）。オリゴ糖は、特異的な認識構造に基づいて、所与の糖タンパク質を特定の分子にターゲッティングする働きもしうる。抗体のグリコシル化は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えることも報告されている。詳細には、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１、４）−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節性発現を有するＣＨＯ細胞が、ＡＤＣＣ活性を向上させたと報告された（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６〜１８０）。
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−連結またはＯ−連結である。Ｎ−連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分の付着を指す。３ペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）が、アスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素的付着のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおける、これらの３ペプチド配列のいずれかの存在が、潜在的グリコシル化部位を作り出す。Ｏ−連結グリコシル化は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも用いられうるが、最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるヒドロオキシアミノ酸への、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの付着を指す。
グリコシル化部位の抗体への付加は、アミノ酸配列を、それが上述の３ペプチド配列のうちの１つまたは複数（Ｎ−連結グリコシル化部位には）を含有するように改変することによって好都合に実現される。改変は、元の抗体の配列への１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基（Ｏ−連結グリコシル化部位には）の付加または置換によっても行うことができる。
抗体のグリコシル化パターンは、根底にあるヌクレオチド配列を改変しないでも、改変することができる。グリコシル化は、抗体を発現するのに用いられる宿主細胞に大きく依存する。可能性のある療法として、組換え糖タンパク質、例えば、抗体の発現に用いられる細胞型がネイティブの細胞であることは希なので、抗体のグリコシル化パターンのバリエーションを予測することができる（例えば、Ｈｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２〜９０７０を参照）。
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え生成中のグリコシル化に影響を与える因子には、成長様式、培地処方、培養密度、酸素処理、ｐＨ、および精製スキームなどが含まれる。オリゴ糖生成に関与する特定の酵素の導入または過剰発現を含めた様々な方法が、特定の宿主生物で生じたグリコシル化パターンを改変するために提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号；第５，５１０，２６１号および第５，２７８，２９９号）。グリコシル化またはある特定のタイプのグリコシル化を糖タンパク質から、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を用いて、酵素的に除去することができる。加えて、組換え体宿主細胞を、特定のタイプの多糖のプロセシングに欠陥があるように遺伝的に操作することができる。これらの技法および類似の技法は当技術分野でよく知られている。
修飾の他の方法には、限定されるものではないが、酵素的手段、酸化置換、およびキレート化を含めた、当技術分野で知られているカップリング技法を用いるものが含まれる。例えば、イムノアッセイのための標識の付着に、修飾を用いることができる。修飾ポリペプチドは、当技術分野で確立されている手順を用いて作製され、当技術分野で知られている標準的なアッセイを用いてスクリーニングすることができ、それらのいくつかは下記および実施例に記載されている。
本発明のいくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＦｃガンマ受容体に対する親和性が増大している定常領域など、修飾定常領域を含み、免疫学的に不活性または部分的に不活性であり、例えば、補体媒介性の溶解の引き金とならない、抗体依存−細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない、または小膠細胞を活性化しない；または補体媒介性の溶解の引き金となること、抗体依存−細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激すること、または小膠細胞を活性化することのうちのいずれか１つまたは複数における活性が低減している（無修飾の抗体と比較して）。定常領域の様々な修飾は、エフェクター機能の最適のレベルおよび／または組合せを実現するのに用いることができる。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−３２４、１９９５；Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７：４９６３〜４９６９、１９９６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：４１７８〜４１８４、２０００；Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５〜２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９〜７６、１９９８を参照のこと。いくつかの実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載のように修飾される。他の実施形態では、抗体は、次の変異を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２配列を基準にしたアミノ酸付番）。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。さらに他の実施形態では、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化について非グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、定常領域は、グリコシル化されるアミノ酸残基または定常領域中のＮ−グリコシル化認識配列の一部である隣接の残基を変異させることによって、Ｎ−連結グリコシル化について非グリコシル化される。例えば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７は、Ａ、Ｑ、Ｋ、またはＨへと変異させることができる。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５〜２６０１，１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９〜７６，１９９８を参照のこと。いくつかの実施形態では、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化について非グリコシル化されている。定常領域は、酵素的に（酵素ＰＮＧａｓｅによる炭化水素の除去など）、またはグリコシル化欠失宿主細胞における発現によって、Ｎ−連結グリコシル化について非グリコシル化することができる。
他の抗体修飾には、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５８５７２号に記載のように修飾された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域の全体または一部に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の有意な補体依存性溶解または細胞媒介性破壊の引き金とならずに、標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合することができる。これらは、通常、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインをベースにしたものである。この様に修飾された抗体は、炎症および従来の抗体療法に対する他の有害反応を回避するための、慢性抗体療法における使用に特に適している。
本発明には、親和性成熟実施形態が含まれる。例えば、当技術分野で知られている手順によって、親和性成熟抗体を生成することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３；Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３８０９〜３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９；Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６；およびＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０５８１８４号）。
抗体の親和性を調整して、ＣＤＲを特徴付けるのに、次の方法を用いることができる。抗体のＣＤＲを特徴付けるおよび／または抗体など、ポリペプチドの結合親和性を改変する（向上させるなど）１つの方法は、「ライブラリースキャニング変異導入」と呼ばれる。通常、ライブラリースキャニング変異導入は、以下の通りに行われる。当該技術分野において承認されている方法を用いて、２つ以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０など）のアミノ酸で、ＣＤＲ内の１つまたは複数のアミノ酸位置を置き換える。これは、それぞれが２つ以上のメンバーの複雑さを有する（あらゆる位置で２つ以上のアミノ酸が置換された場合）、クローン（いくつかの実施形態では、分析される各アミノ酸位置あたり１つ）からなる小さなライブラリーを作製する。通常、ライブラリーは、ネイティブ（置換されていない）のアミノ酸を含むクローンも含む。各ライブラリーからの少数のクローン、例えば、約２０〜８０クローン（ライブラリーの複雑さに応じて）を、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングし、結合が増強している、同じ、低減している、または無い候補を同定する。結合親和性を決定するための方法は、当技術分野でよく知られている。結合親和性は、約２倍以上の結合親和性の相違を検出するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析を用いて決定することができる。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）は、開始抗体が既に比較的高い親和性、例えば、約１０ｎM以下のＫＤで結合するとき、特に有用である。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴を用いるスクリーニングは、本明細書における実施例に記載されている。
結合親和性は、Ｋｉｎｅｘａ Ｂｉｏｃｅｎｓｏｒ、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫アッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを用いて決定することができる。結合親和性は、適した生物検定を用いてスクリーニングすることもできる。
いくつかの実施形態では、当該技術分野において承認されている変異導入法（それのいくつかは本明細書に記載されている）を用いて、ＣＤＲ内のあらゆるアミノ酸位置を、２０の天然アミノ酸すべてで置き換える（いくつかの実施形態では、一度に１つ）。これによって、それぞれが２０メンバーの複雑さ（あらゆる位置で２０のアミノ酸すべてが置換される場合）を有する、クローン（いくつかの実施形態では、分析される各アミノ酸位置あたり１つ）からなる小さなライブラリーが作製される。
いくつかの実施形態では、スクリーニングされるライブラリーは、２つ以上位置に置換を含み、それらの位置は、同一ＣＤＲ内または２つ以上のＣＤＲ内でありうる。したがって、ライブラリーは、１つのＣＤＲ内の２つ以上の位置に置換を含みうる。ライブラリーは、２つ以上のＣＤＲ内の２つ以上の位置に置換を含みうる。ライブラリーは、３、４、５つ以上の位置に置換を含みえ、前記位置は、２、３、４、５または６つのＣＤＲ内に見出されうる。置換は、重複性が低いコドンを用いて調製することができる。例えば、Ｂａｌｉｎｔら、１９９３、Ｇｅｎｅ １３７（１）：１０９〜１８の表２を参照のこと。
ＣＤＲは、ＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３でありうる。ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２および／またはＣＤＲＨ３のうちの１つまたは複数でありうる。ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲ、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ、または拡張ＣＤＲでありうる。
結合が向上している候補を配列決定し、それによって、向上した親和性をもたらすＣＤＲ置換変異体（「向上した」置換とも呼ばれる）を同定することができる。結合する候補も、配列決定し、それによって結合を保持するＣＤＲ置換を同定することができる。
複数ラウンドのスクリーニングを行うことができる。例えば、結合が向上した候補（それぞれが１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置におけるアミノ酸置換を含む）は、それぞれの向上したＣＤＲ位置（すなわち、置換変異体が結合の向上を示した、ＣＤＲ内のアミノ酸位置）に少なくとも元のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含有する第２のライブラリーの設計にも有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択については、下記にさらに論じる。
結合が向上している、結合が同じ、結合が低減している、または結合しないクローンの頻度が、抗体−抗原複合体の安定性のためのそれぞれのアミノ酸位置の重要性に関する情報も提供する限り、ライブラリースキャニング変異導入は、ＣＤＲを特徴付けるための手段も提供する。例えば、ＣＤＲのある位置が、２０のアミノ酸すべてに変えられた場合に、結合を保持するならば、その位置は、抗原結合に必要でない可能性が高い位置として同定される。逆に、ＣＤＲのある位置が、低い百分率の置換においてのみ結合を保持するならば、その位置は、ＣＤＲ機能に重要な位置として同定される。したがって、ライブラリースキャニング変異導入法は、多くの異なったアミノ酸（２０アミノ酸すべてを含める）に変えることができるＣＤＲ内の位置、および変えることができない、または少数のアミノ酸にのみ変えることができる、ＣＤＲ内の位置に関する情報を生み出す。
親和性が向上している候補は、所望のライブラリーの複雑さ、または所望のスクリーニング法もしくは選択法を用いて許容される複雑さに応じて、その位置における向上したアミノ酸、元のアミノ酸を含み、さらにその位置における追加の置換を含みうる第２のライブラリーに併せることができる。加えて、望ましい場合には、隣接しているアミノ酸位置を、少なくとも２つ以上のアミノ酸にランダム化することができる。隣接しているアミノ酸のランダム化は、変異体ＣＤＲにおけるさらなるコンフォメーション柔軟性を可能にしうる。これは、その次に、より多くの数の向上変異の導入を可能にするか、または容易にする。ライブラリーは、スクリーニングの第１のラウンドにおいて親和性の向上を示さなかった位置における置換も含みうる。
第２のライブラリーは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析を用いたスクリーニング、ならびに、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含めた、当技術分野で知られている任意の選択のための方法を用いた選択を含めた、当技術分野で知られている任意の方法を用いて、結合親和性が向上している、かつ／または改変されているライブラリーメンバーを得るために、スクリーニングまたは選択される。
本発明は、本発明の抗体に由来する１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含する。一実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、４１もしくは４４に示す可変軽鎖領域の少なくとも１０の連続したアミノ酸および／または配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは４０に示す可変重鎖領域の少なくとも１０アミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、もしくは少なくとも約３０の連続したアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、もしくは少なくとも約３０の連続したアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号１および２、３および４、５および６、７および８、９および１０、１１および１２、４１および４０、ならびに４４および４０の中から選択された配列対のいずれかに示す、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、１つまたは複数のＣＤＲを含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＣＤＲ Ｈ３（ＶＨ ＣＤＲ３）および／またはＣＤＲ Ｌ３（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む。本発明の目的では、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗体と、ネイティブ分子内では抗体が結合していない別のアミノ酸配列、例えば、異種配列または別の領域由来の同種配列とを含有している。例示的異種配列には、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」が含まれるが、これらに限定されない。タグは、当技術分野でよく知られている。
融合ポリペプチドは、当技術分野で知られている方法によって、例えば、合成または組換えによって、作り出すことができる。本発明の融合タンパク質は、例えば化学合成を含めた当技術分野で知られている他の手段によってそれらを調製することもできるが、通常、本明細書に記載の組換え方法を用いて、それらをコードするポリヌクレオチドの発現を調製することによって作製される。
本発明は、固体支持体（ビオチンまたはアビジンなど）へのカップリングを容易にする薬剤にコンジュゲートした（例えば、連結した）抗体を含む組成物も提供する。単純にするために、本明細書に記載のＩＬ−７Ｒ結合実施形態および／またはアンタゴニスト実施形態のいずれにもこれらの方法が適用されるという理解の下に、抗体に一般的に言及する。コンジュゲーションは、本明細書に記載されるこれらのコンポーネントを連結することを指す。連結（これは、通常、これらのコンポーネントを、少なくとも投与のために、近接して固定すること）は、いろいろな方法で行うことができる。例えば、薬剤と抗体のそれぞれが、もう片方と反応することができる置換基を保持する場合、薬剤と抗体との間の直接的反応が可能である。例えば、一方における、アミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基は、もう片方における、無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、または良い離脱基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することができるであろう。
本発明の抗体またはポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子または当技術分野で知られている任意の他の標識などの標識化剤に連結することができる。標識は当技術分野で知られており、通常、シグナルを（直接的または間接的に）生成する。
本発明は、この開示が明らかにするように、本明細書に記載の抗体および／またはポリペプチドのいずれかまたはすべてを含む、組成物（医薬組成物を含める）およびキットも提供する。
本発明は、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。
したがって、本発明は、抗体Ｃ１ＧＭ、Ｃ２Ｍ３、Ｐ３Ａ９、Ｐ４Ｂ３、Ｐ２Ｄ２、Ｐ２Ｅ１１、ＨＡＬ４０３ａおよびＨＡＬ４０３ｂのいずれか、またはＩＬ−７Ｒをアンタゴナイズする能力を有する任意の断片もしくはその部分をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（または、医薬組成物を含めた、組成物）を提供する。
別の態様では、本発明は、抗体およびエフェクター機能が損なわれているポリペプチドなど、本明細書に記載の抗体（抗体断片を含める）およびポリペプチドのうちの任意のものをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている手順によって作製し、発現させることができる。
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのうち任意のものを含む組成物（医薬組成物などの）を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体のうちの任意のものをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の実施形態では、組成物は、下記の配列番号３８および配列番号３９に示すポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
Ｃ１ＧＭ重鎖可変領域
ＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＡＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＴＴＡＣＡＴＧＧＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３８）
Ｃ２ＧＭ軽鎖可変領域
ＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＡＡＴＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号３９）。
さらに他の実施形態では、組成物は、下記の配列番号１４および配列番号１５に示すポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
ＨＡＬ４０３ａ重鎖可変領域
ＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＴＡＡＧＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＴＴＡＣＡＴＧＧＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１４）
ＨＡＬ４０３ａ軽鎖可変領域
ＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＴＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＴＧＴ（配列番号１５）。
発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与は、本明細書にさらに記載されている。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの任意のものを作製する方法を提供する。
任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも、本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）でも、二本鎖でもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）分子でも、ＲＮＡ分子でもよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子と一対一の様式で対応する、ＨｎＲＮＡ分子と、イントロンを含有しない、ｍＲＮＡ分子とが含まれる。追加のコーディング配列または非コーディング配列も、本発明のポリヌクレオチドの内に、存在していることが必要ではないが、存在してよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体物質に、連結されていることが必要ではないが、連結されていてもよい。
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体またはその部分をコードする内因性の配列）を含んでも、そのような配列のバリアントを含んでもよい。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの免疫応答性がネイティブな免疫反応性の分子と比較して低減しないような１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされたポリペプチドの免疫応答性に対する効果は、概ねここに記載の通りに評価することができる。バリアントは、ネイティブ抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。
２つポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、下記に記載するように、最大の一致が得られるようにアラインメントされた場合に、２つの配列におけるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が同一であるならば、「同一である」と言われる。２つの配列間の比較は、通常、比較ウインドウにわたって配列を比較して、局所領域の配列の類似性を同定および比較することによって行われる。本明細書で使用される「比較ウインドウ」は、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、同数の連続した位置の参照配列と配列を比較することができる、少なくとも約２０、通常３０から約７５、または４０から約５０の連続した位置のセグメントを指す。
比較のための最適な配列のアラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅスーツの生命情報工学ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用い、デフォルトパラメータを用いて行うことができる。このプログラムは、次の参考文献に記載のいくつかのアラインメントスキームを具体化するものである：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、第５巻、補３、３４５〜３５８ページにおけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．； Ｈｅｉｎ Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５ページ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ； Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５； Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６〜７３０。
好ましくは、「配列同一性の百分率」は、最適にアラインメントされた２つの配列を少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって比較することによって決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常５から１５パーセント、または１０から１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得、一致している位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウのサイズ）で割り、その結果に１００に掛けて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。
バリアントは、同じく、または代わりに、ネイティブ遺伝子またはその部分もしくは相補体に実質的に相同でありうる。そのようなポリヌクレオチドバリアントは、ネイティブ抗体をコードする天然存在のＤＮＡ配列（または相補配列）に、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成することができる
適した「中程度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、終夜でのハイブリッド形成；それに続く、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣのそれぞれで６５℃、２０分間の２回の洗浄が含まれる。
本明細書で使用される、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、以下の条件である：（１）洗浄に低イオン強度および高温を利用する条件、例えば、５０℃における、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドなどの変性剤を利用する条件、例えば、４２℃における０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む、ｐＨ６．５の５０ｍＭナトリウムリン酸バッファーを含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド；または（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理したサケ精液ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、４２℃における洗浄、および５５℃における５０％ホルムアミド、それに続く、５５℃におけるＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄と共に利用する条件。当業者ならば、プローブ長などの因子に対応するのに必要な温度、イオン強度などをどのように調整するかを認識するであろう。
遺伝コードの縮重の結果、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを当業者ならば理解するであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に最小限の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の相違により異なるポリヌクレオチドは、本発明によって明確に企図されている。さらに、本明細書に提示されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内にある。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換など、１つまたは複数の変異の結果、改変された内因性遺伝子である。その結果生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、改変された構造または機能を、有する必要はないが、有しうる。対立遺伝子は、標準的な技法（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を用いて同定することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。化学ポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野でよく知られており、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者ならば、本明細書に提供される配列と、市販のＤＮＡ合成機を用いて、所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
組換え法を用いてポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適したベクターに挿入することができ、その次に、本明細書にさらに論じる、複製および増幅に適した宿主細胞にベクターを導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている任意の手段によって、宿主細胞内に挿入することができる。細胞は、直接的摂取、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合またはエレクトロポレーションによって、外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、形質転換される。ひとたび導入されたならば、外因性ポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持するか、または宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野でよく知られている方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと。
代替として、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の再生を可能にする。ＰＣＲ技術は、当技術分野でよく知られており、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号、および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４に記載されている。
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離ＤＮＡを用い、それを適した宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されたならば、次いで、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、同上に記載される、当業者によく知られている方法を用いて、ＲＮＡを単離することができる。
適したクローニングベクターは、標準的な技法によって構築することもでき、当技術分野で利用可能な多くのクローニングベクターから選択することもできる。選択されたクローニングベクターは、使用が意図されている宿主細胞にしたがって異なりうるが、有用なクローニングベクターは、通常、自己複製する能力を有することになり、特定の制限酵素のための単一の標的を有するものでありえ、かつ／またはベクターを含有するクローンを選択するのに用いることができるマーカーの遺伝子を保持しうる。適した例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが含まれる。これらおよび他の多くのクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的供給業者から入手可能である。
発現ベクターは、通常、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチドコンストラクトである。発現ベクターは、宿主細胞内で、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの構成部分として、複製可能でなければならないことが含意されている。適した発現ベクターには、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示の発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。ベクターコンポーネントは、通常、シグナル配列；複製開始点；１つまたは複数のマーカー遺伝子；適した転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサーおよびターミネータなど）のうちの１つまたは複数が含まれうるが、これらに限定されない。発現（すなわち、翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなどの１つまたは複数の翻訳制御エレメントも、通常、必要である。
対象とするポリヌクレオチドを含有するベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を利用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染体である場合）を含めた、多くの適切な手段のうちの任意のものによって、宿主細胞内に導入することができる。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、しばしば、宿主細胞の特徴に依存することになる。
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの任意のものを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができるいかなる宿主細胞も、対照とする抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的に用いることができる。哺乳動物宿主細胞の非限定な例には、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号も参照のこと。適した非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓなど）および酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓなど）が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、ｃＤＮＡを、対応する内因性抗体または対象とするタンパク質の、存在する場合、宿主細胞内におけるレベルより、約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらに好ましくは２０倍高いレベルで発現する。ＩＬ−７ＲまたはＩＬ−７Ｒドメインへの特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、免疫アッセイまたはＦＡＣＳによって行われる。抗体または対象とするタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
組成物
本発明の方法で用いられる組成物は、有効な量のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体由来のポリペプチド、または本明細書に記載の他のＩＬ−７Ｒアンタゴニストを含む。そのような組成物、およびどのように処方するかの例は、前出のセクション内および下記に記載されている。いくつかの実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＩＬ−７Ｒアンタゴニスト抗体を含む。他の実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、ヒトＩＬ−７Ｒαを認識する。他の実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、ヒト抗体である。他の実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、抗体媒介性溶解およびＡＤＣＣなど、所望の免疫応答の引き金となることができる定常領域を含む。他の実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、抗体媒介性溶解またはＡＤＣＣなど、所望されないまたは望ましくない免疫応答の引き金とならない定常領域を含む。他の実施形態では、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはいくつかの実施形態では、６つすべてのＣＤＲ）を含む。
組成物は、複数のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体（例えば、ＩＬ−７Ｒの異なったエピトープを認識するアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の混合物）を含むことができると理解されている。他の例示的組成物は、同じエピトープ（複数可）を認識する複数のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体、またはＩＬ−７Ｒの異なったエピトープに結合する異なった種のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を含む。
本発明で用いられる組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、薬学的に許容できる担体、添加剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）をさらに含むことができる。許容できる担体、添加剤または安定化剤は、用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、ホスフェート、シトレートおよび他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた、単糖、二糖、および他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオンの界面活性物質を含みうる。薬学的に許容できる添加剤は、さらに本明細書に記載されている。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体およびその組成物は、薬剤の有効性を強化および／または補足する働きをする他の薬剤と併せて用いることもできる。
Ｄ．キット
本発明は、本方法で使用のためのキットを提供する。本発明のキットは、本明細書に記載のＩＬ−７Ｒアンタゴニスト（例えば、ヒト抗体など）を含む１つまたは複数の容器と、本明細書に記載の本発明の方法の任意のものによる使用のための説明書とを含む。通常、これらの説明書は、上記の治療処置のためのＩＬ−７Ｒアンタゴニストの投与の説明を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７Ｒアンタゴニストは、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の使用に関する説明書は、通常、用量、投与スケジュール、および意図された処置のための投与経路に関する情報を含む。容器は、単位服用量、バルクパッケージ（例えば、多用量パッケージ）またはサブ単位服用量（ｓｕｂ−ｕｎｉｔ ｄｏｓｅ）でありうる。本発明のキットで供給される説明書は、通常、ラベルまたは添付文書における書かれた説明書（例えば、キット内に含まれる紙のシート）であるが、機械読み取り可能な説明書（例えば、磁気または光記憶ディスクに保持された説明書）も許容できる。
本発明のキットは、適したパッケージングに入れられる。適したパッケージングには、バイアル、ボトル、瓶、フレキシブルパッケージング（例えば、密封マイラーまたはポリ袋）などが含まれるが、これらに限定されない。吸入器、鼻腔投与デバイス（例えば、噴霧器）、またはミニポンプなどの注入デバイスなど、特定のデバイスと組み合わせた使用のためのパッケージも、企図される。キットは、無菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静注液バッグまたはバイアルでありうる）。容器も、無菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静注液バッグまたはバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体である。容器は、第２の薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。
キットは、場合によって、バッファーおよび説明に役立つ情報などの追加のコンポーネントを提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器上の、または容器に付随するラベルまたは添付文書（複数可）とを含む。
変異および修飾
本発明のＩＬ−７Ｒ抗体を発現するために、最初に、上述の方法のうちの任意のものを用いて、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片を入手することができる。当業者にとって知られている標準法を用いて、様々な修飾、例えば、変異、欠失および／または付加をＤＮＡ配列に導入することができる。例えば、ＰＣＲ産物が所望の変異を含有するように、ＰＣＲプライマーに変異導入されたヌクレオチドが組み込まれている、ＰＣＲ媒介の変異導入、または部位特異的変異導入など、標準法を用いて変異導入を行うことができる。
例えば、導入できる置換の１つのタイプは、抗体内の１つまたは複数のシステイン（化学的に反応性でありうる）を、限定されるものではないが、アラニンまたはセリンなどの別の残基に変えることである。例えば、非カノニカルシステインの置換が存在しうる。置換は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域内に、または定常領域内に導入することができる。いくつかの実施形態では、システインがカノニカルである。
抗体は、例えば、抗体の結合特性を改変するために、例えば、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン内で修飾することもできる。例えば、ＩＬ−７Ｒに対する抗体のＫＤを増大もしくは低減させるために、ｋｏｆｆを増大もしくは低減させるために、または抗体の結合特異性を改変するために、１つまたは複数のＣＤＲ領域内に変異を導入することができる。部位特異的変異導入における技法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌら、同上を参照のこと。
ＩＬ−７Ｒ抗体の半減期を増大させるために、フレームワーク領域または定常領域内に、修飾または変異を導入することができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０９５６０号を参照のこと。抗体の免疫原性を改変するため、別の分子に共有結合もしくは非共有結合するための部位を提供するため、または補体結合、ＦｃＲ結合、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害などの特性を改変するために、フレームワーク領域または定常領域内に変異を導入することができる。本発明によれば、単一抗体は、可変ドメインのＣＤＲのうちの任意の１つもしくは複数またはフレームワーク領域内、あるいは定常領域内に変異を有しうる。
「生殖系列化」として知られる過程において、生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列で天然に見出される配列と一致するように、ＶＨ配列およびＶＬ配列における特定のアミノ酸を変異させることができる。詳細には、抗体が投与された際の免疫原性の危険性を低減させるために、ＶＨ配列およびＶＬ配列におけるフレームワーク領域のアミノ酸配列を、生殖系列配列に一致するように変異させることができる。ヒトＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照；Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７〜８３６も参照）。
導入することができるアミノ酸置換の別のタイプは、抗体における潜在的タンパク質分解部位を除去することである。そのような部位は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域、または定常領域内に存在しうる。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体産物における異質性の危険性を低減させ、それによって、その均質性を増大させうる。アミノ酸置換の別のタイプは、アスパラギン−グリシン対を、これらの残基の一方または両方を改変することによって、消失させることである。アスパラギン−グリシン対は、潜在的な脱アミド部位を形成する。別の例では、本発明のＩＬ−７Ｒ抗体の重鎖のＣ末端リジンを切断することができる。本発明の様々な実施形態において、ＩＬ−７Ｒ抗体の重鎖および軽鎖は、場合によって、シグナル配列を含みうる。
本発明のＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片がひとたび得られれば、標準的な組換えＤＮＡ技法によって、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するように、これらのＤＮＡ断片をさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬコーディングＤＮＡ断片またはＶＨコーディングＤＮＡ断片は、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作用可能に連結される。このコンテクストで用いられる、用語「作用可能に連結される」は、２つのＤＮＡ断片によってコードされたアミノ酸配列がインフレームのまま残るように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味するものとする。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨコーディングＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結することによって、完全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域でありうるが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域が最も好ましい。ＩｇＧ定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）など、異なった個体間で存在しうることが知られている様々な対立遺伝子またはアロタイプのうちの任意のものでありうる。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域における天然存在のアミノ酸置換を表す。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡが、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結されうる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のうちの任意のものからも得ることができる。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結することによって、完全長軽鎖の遺伝子に（Ｆａｂ軽鎖遺伝子にも）変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパかλ定常領域でありうる。カッパ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）などの異なった個体間で存在しうることが知られている様々な対立遺伝子のうちの任意のものでありうる。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のうちの任意のものから得ることができる。
ｓｃＦｖ遺伝子を作り出すには、フレキシブルリンカーによって連結されたＶＬ領域およびＶＨ領域を有する連続した単一鎖タンパク質としてＶＨ配列およびＶＬ配列を発現することができるように、ＶＨをコードするＤＮＡ断片およびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、フレキシブルリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号１６）をコードする別の断片に作用可能に連結させる（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４を参照のこと）。単一鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが使用された場合には一価、２つのＶＨおよびＶＬが使用された場合には二価、３つ以上のＶＨおよびＶＬが使用された場合には多価でありうる。ＩＬ−７Ｒに、および別の分子に特異的に結合する二重特異性または多価の抗体を作製することができる。
別の実施形態では、別のポリペプチドに連結された、本発明のＩＬ−７Ｒ抗体のすべてまたは一部を含む融合抗体またはイムノアドヘシンを作製することができる。別の実施形態では、ＩＬ−７Ｒ抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに連結される。別の実施形態では、ＩＬ−７Ｒ抗体のＶＨドメインは、第１のポリペプチドに連結され、一方、ＩＬ−７Ｒ抗体のＶＬドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインがお互いに相互作用して抗原結合部位を形成できるような様式で第１のポリペプチドと会合する第２のポリペプチドに連結される。別の好ましい実施形態では、ＶＨとＶＬドメインがお互いと相互作用できるように、ＶＨドメインが、リンカーによってＶＬドメインから分離される。次いで、ＶＨ−リンカーＶＬ抗体が、対象とするポリペプチに連結される。加えて、２つ（または３つ以上）の単一鎖抗体がお互いに連結されている融合抗体を作り出すことができる。これは、単一ポリペプチド鎖上に２価または多価の抗体を作り出したい場合、または二重特異性抗体を作り出したい場合に有用である。
他の実施形態では、ＩＬ−７Ｒ抗体をコードする核酸分子を用いて他の修飾抗体を調製することができる。例えば、「カッパボディー」（Ｉｌｌら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１０：９４９〜５７）、「ミニボディー」（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：５３０３〜９）、「ダイアボディー」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８）、または「ヤヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５〜３６５９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１〜５２）を、本明細書の教示に従って、標準的な分子生物学的技法を用いて、調製することができる。
二重特異性抗体または抗原結合性断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた、様々な方法によって生成することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照のこと。加えて、二重特異性抗体は、「ダイアボディー」または「ヤヌシン」として形成することができる。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩＬ−７Ｒの２つの異なったエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、上述の修飾抗体は、本明細書に提示するヒトＩＬ−７Ｒ抗体からの可変ドメインまたはＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数を用いて調製される。
抗原特異的抗体の作製
組換え体マウスＩＬ−７Ｒα／ＣＤ１２７／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号７４７−ＭＲ）に対して生成されたモノクローナル抗体および組換えＩＬ−７Ｒαを用いたヒトナイーブ抗体ライブラリーのバイオパニングによって得られたヒト抗体を、マウスおよびヒトＩＬ−７Ｒに結合するそれらの能力について評価した。抗体を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／またはサルＰＢＭＣにおけるＩＬ−７媒介性のＳＴＡＴ５リン酸化を遮断するそれらの能力について、さらにスクリーニングした。この方法の抗体調製によって、実施例１に示すように、ＩＬ−７媒介性のＳＴＡＴ５リン酸化の遮断を示すアンタゴニスト抗体が得られた。
本発明の代表的材料は、２０１１年２月９日にＡＴＣＣ（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−を有するベクターＣ１ＧＭ−ＶＨは、Ｃ１ＧＭ重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−を有するベクターＣ１ＧＭ−ＶＬは、Ｃ１ＧＭ軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定に従って行った。これは、寄託日から３０年間の寄託物の生存培養物の維持を保証するものである。寄託物は、ブダペスト条約の条項に従って、ＡＴＣＣにより利用可能にされ、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの同意に付され、これにより、いずれが先になるとしても、当米国特許の発行時、またはいずれかの米国または外国特許出願の公衆への公開時に、寄託物の培養物の後代の恒久的かつ無制限な利用可能性が保証され、米国特許および商標庁長官によって決定された、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２およびそれにしたがう長官令（ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ’ｓ ｒｕｌｅｓ）（特に８８６ ＯＧ ６３８に関して３７Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．１４を含む）により権利を有する者に対する後代の利用性が保証される。
本出願の代理人は、この寄託時の物質の培養物が、適した条件下で培養された場合に、死滅するか、または失われるか、もしくは破壊されたならば、この物質を、通知時に迅速に、別の同物質で置き換えることに同意した。この寄託物質の利用可能性は、いずれかの政府の、その特許法にしたがう権限下に認められた権利に違反して、本発明を実施するためのライセンスとして考えられるべきではない。
以下の実施例は、例示のみを目的として提供するものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。実際、本明細書中に示され、記載されるものに加えて、当業者には、本発明の様々な修飾が以上の記載から明らかとなるであろう。このような修飾も、添付の特許請求の範囲に含まれる。
（実施例１）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の作製およびスクリーニング
この実施例は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の作製およびスクリーニングを例示する。
モノクローナル抗体を作製するための動物の免疫処置の一般手順：
マウスＩＬ−７Ｒα（Ｇｌｕ２１〜Ａｓｐ２３９）、ｈＣＤ３３シグナルペプチド（Ｍｅｔ１〜Ａｌａ１６）、およびヒトＩｇＧ（Ｐｒｏ１００〜Ｌｙｓ３３０）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号７４７−ＭＲ）を含む、組換え体マウスＩＬ−７Ｒα／ＣＤ１２７／Ｆｃキメラ５０μｇで２月齢の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを免疫処置した。抗原は、抗原５０μｇを含むＰＢＳ １００μｌを、Ｓｉｇｍａアジュバントシステム（カタログ番号Ｓ６３２２）１００μｌと混合することによって、免疫処置用に調製した。抗原混合物をボルテックスし、０、２、５、および７日目に、後肢足蹠および腹膜に注射した。９日目に、アジュバントの無しの抗原５０μｇを、生理食塩水中、全容積１５０μｌで静脈注射した。１３日目に、脾細胞を単細胞懸濁液として調製し、４０％ＰＥＧ１５００（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、＃７８３６４１）を用いる標準的な融合プロトコールに従って、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３マウスミエローマ細胞と融合させた。融合した細胞を、１８％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ０２６２）、ならびに１０％ハイブリドーマ融合およびクローニングサプリメント（ＨＦＣＳ）（カタログ番号１１ ３６３ ７３５ ００１、Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中に再懸濁し、次いで、５４枚の９６ウェルプレートに２００μｌ／ウェルでプレーティングした。融合後７日目に、培地１５０μｌを各ウェルから吸引し、新たな培地２００μｌをウェルに再補給した。１１〜１３日目に、ＩＬ−７ＲおよびヒトＦｃに対する抗体があるかどうか、各ウェルの上清を、ＥＬＩＳＡ（下記）を用いて試験した。
抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング：
増殖中のハイブリドーマクローンの上清培地を、組換え体マウス（ｒｍ）ＩＬ−７Ｒに結合するそれらの能力について別々にスクリーニングした。アッセイは、抗原の１μｇ／ｍｌ溶液５０μｌで終夜コーティングされた９６ウェルプレートで行った。コーティングされた５５枚のプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで４回洗浄し、次いで、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ５０μｌを各ウェルに添加した。ハイブリドーマプレートの各ウェルから５μｌをアッセイプレートに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートして、結合を行わせた。各ステップの間に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで、過剰な試薬をウェルから洗浄した。ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウス、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１１５−０３６−００８）５０μｌを添加して、抗原に結合したマウス抗体に結合させた。検出のため、ＡＢＴＳ、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩５０μｌを基質として添加した。３０分後に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＴＨＥＲＭＯｍａｘ（商標）機器を用いて、４０５ｎｍでプレートのリーディングを行った。マウスＩＬ−７Ｒに結合することができた抗体を分泌したハイブリドーマクローンを、さらなる分析用に選択した。次いで、これらの陽性ハイブリドーマ上清をハイブリドーマプレートから収集し、ヒトＦｃ、ヤギ抗ラットＩｇＭ、および組換え体ヒト（ｒｈ）ＩＬ−７Ｒに対するＥＬＩＳＡアッセイで試験した。次いで、ｒｍ ＩＬ−７Ｒに結合した抗体、ならびにｒｍ ＩＬ−７Ｒおよびｒｈ ＩＬ−７Ｒの両方に結合した抗体の精製抗体を調製した。
ファージディスプレイを用いた完全ヒトモノクローナル抗体を作製するための一般手順：
ヒトＩＬ−７Ｒα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））に対する４ラウンドのバイオパニング１シリーズによって、抗ヒトＩＬ−７Ｒαヒト抗体を、ヒトナイーブｓｃＦｖ抗体のファージディスプレイライブラリー（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ Ｇ．ら、２００９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６（４８）：２０２１６〜２０２２１）から単離した。パニングの各ラウンドあたり、ＩＬ−７Ｒα（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）１ｍｌをイムノチューブに、４℃で終夜コーティングした。ＩＬ−７ＲαコーティングされたイムノチューブをＰＢＳＴで３回洗浄した。１０１３のファージ（１ｍｌ）をイムノチューブに添加し、室温で１時間インキュベートして、結合を行わせた。結合後、イムノチューブをＰＢＳＴで８回洗浄した。結合したファージを溶出させ、新たに増殖したＴＧ１細胞に感染させた。パニングの第４のラウンドの後に、陽性の結合体を、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＩＬ−７ＲαおよびマウスＩＬ−７Ｒの両方に対してスクリーニングした。ヒトＩＬ−７ＲおよびマウスＩＬ−７Ｒの両方に結合する抗体を、それらの親和性および遮断機能についてさらに研究し、抗体を親和性成熟用に選択した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイ：
ヒトＩＬ−７Ｒ結合抗体またはマウスＩＬ−７Ｒ結合抗体を分泌するハイブリドーマクローンを増殖させ、上清を採取した。総ＩｇＧを、プロテインＡビーズを用いて、上清約１０ｍｌから精製し、ＰＢＳバッファー中に透析し、０．７〜１ｍｇ／ｍｌの抗体を含む溶液を得るように、最終容積を減らした。次いで、精製された抗体を、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−７媒介性のＳＴＡＴ５リン酸化を遮断するそれらの能力を試験するのに用いた。ＰＢＭＣ調製用に、フィコール勾配を通して全血細胞を収集した。ＩＬ−２による刺激の前１〜２時間にわたって、細胞を円錐管内で５％ＣＯ２中３７℃で維持した（単球／マクロファージ接着を阻止するため）。
機能スクリーニングのため、ＩＬ−７の添加の前に、ヒトＰＢＭＣを試験抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に５分間プレインキュベートした。非反応性のアイソタイプ適合抗体を陰性対照（アイソタイプ対照）として用いた。細胞をヒトＩＬ−７（０．１ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））で１５分間刺激した。ＩＬ−７刺激を停止するため、ホルムアルデヒドを最終濃度１．６％となるように培養培地に直接的に添加した。細胞を室温で１５分間固定した。次いで、メタノールを最終濃度８０％となるように直接的に添加し、試料を、免疫染色される前に４℃で３０分間から１時間保存した。細胞を、抗リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐ−ＳＴＡＴ）抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｙ６９４クローン４７）および抗ＣＤ４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＲＰＡ−Ｔ４）で染色した。フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ、ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＣＤ４＋ゲーティングされた細胞を、ｐ−ＳＴＡＴ５染色について分析した。アイソタイプ対照を１００％ｐ−ＳＴＡＴとして設定した。
図１は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ完全ヒトモノクローナル抗体Ｐ２Ｄ２およびＰ２Ｅ１１ならびにＨＡＬ４０３ａの、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−７媒介性のＳＴＡＴ５リン酸化に対する効果を示す。マウス抗ヒトＩＬ−７Ｒモノクローナル抗体１３Ａ２Ｆ４を陽性対照として用い、非反応性のアイソタイプ適合抗体を陰性対照（アイソタイプ対照）として用いた。ヒトＰＢＭＣを、濃度：０．００１、０．０１、０．１、１、および１０μｇ／ｍｌにおける、それぞれの試験抗体または１３Ａ２Ｆ４と共に５分間プレインキュベートした。アイソタイプ対照抗体は、最も高濃度である１０μｇ／ｍｌで用いた。細胞をヒトＩＬ−７（０．１ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激し、次いで、上述の通りに固定および免疫染色した。
ｐ−ＳＴＡＴ５染色によって測定すると、ヒト抗体Ｐ２Ｄ２、Ｐ２Ｅ１１、ＨＡＬ４０３ａ Ｃ１ＧＭ、Ｃ１ＧＭ−２、およびＣ２Ｍ３はヒトＩＬ−７媒介性シグナル伝達を用量依存的に遮断した（図１および示されていないデータ）。アイソタイプ対照を１００％ｐ−ＳＴＡＴ５染色として設定した。１０μｇ／ｍｌ抗体で、ＨＡＬ４０３ａは、非常に効果的にＳＴＡＴ５リン酸化を遮断した（図１）。Ｃ１ＧＭ、Ｃ１ＧＭ−２、およびＣ２Ｍ３は、ＨＡＬ４０３ａに匹敵する程度に、ＳＴＡＴ５リン酸化を遮断した（示されていないデータ）。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体Ｃ１ＧＭ重鎖のアミノ酸配列（配列番号４２）を下記に示す。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＭＧＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４２）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体Ｃ１ＧＭ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４３）を下記に示す。
ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号４３）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体Ｃ１ＧＭ−２重鎖のアミノ酸配列（配列番号４５）を下記に示す。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＭＧＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４５）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体Ｃ１ＧＭ−２軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４３）を下記に示す。
ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号４３）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体ＨＡＬ４０３ａ重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７）を下記に示す。
ＱＶＮＬＲＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＬＶＧＷＤＧＦＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＬＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＤＹＭＧＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１７）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体ＨＡＬ４０３ａ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）を下記に示す。
ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＧＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＤＳＳＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＮＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＶＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＦＨＨＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１８）
（実施例２）
抗体結合親和性の決定
この実施例は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の抗体結合親和性の決定を例示する。
ヒトＩＬ−７Ｒに対するアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の親和性は、研究グレードのＣＭ５センサーチップを備えた表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００または３０００バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン−現在はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定した。ＨＢＳ−Ｐランニングバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）製）中において、標準的なＮ−ヒドロキシサクシニミド／エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）化学を用いて、ヤギポリクローナル抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片（Ｆｃ特異的）を、４つのフローセルすべてに飽和レベルでアミンカップリングさせた。バッファーを、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有するＨＢＳ−Ｐに切り換えた。ヒトＩＬ−７Ｒ−ｈＦｃ抗原（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国）を約３０μｇ／ｍｌに希釈し、１フローセルあたり約５００〜１０００Ｒｕのレベルとなるように５μｌ／分で３分間捕捉させ、参照チャネルとして働くように１つをブランクのままにした。抗体のＦａｂ、ｈＩｇＧ１、またはｈＩｇＧ２ΔＡフォーマットを、２μＭで開始する５員、３重シリーズとして、および０．４μＭで開始する５員、４重シリーズとして、デュプリケートで、２０〜５０μＬ／分で３分間注入した。解離は、５分間モニターした。捕捉チップは、各滴定の最終注入の後に、３０秒間、パルスの７５ｍＭリン酸または１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．７で再生させた。バッファーサイクルは、結合反応データを二重参照するためのブランクを提供し、次いで、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ．４．１を用いて、単純な可逆結合モデルに全体的に適合させ、速度論的会合速度定数および解離速度定数、すなわちそれぞれｋａおよびｋｄを推定した。親和性は、それらの比率（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）から推定した。表４の結果は、これらの抗体がヒトＩＬ−７Ｒに対してピコモルまたはナノモルの親和性を有することを示す。
Figure 2017061454
（実施例４）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、１型糖尿病のマウスモデルである非肥満糖尿病（ＮＯＤ）動物における疾患発生を低減させる
この実施例は、１型糖尿病のマウスモデルにおけるアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の効果を例示する。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の、糖尿病誘発性過程へのｉｎ ｖｉｖｏにおける効果を研究するために、ＮＯＤマウスにおいて、ラット抗マウスアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体（２８Ｇ９（Ｒｉｎａｔ））を試験した。ＮＯＤマウスは、自己免疫性インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、１型糖尿病）の自然発症に感受性を示す（Ｋｉｋｕｔａｎｉら、１９９２、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：２８５〜３２２）。２８Ｇ９は、マウス脾細胞におけるＩＬ−７媒介性のＳＴＡＴ５リン酸化を遮断し、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）において、アンタゴニストＩＬ−７Ｒヒト抗体Ｃ１ＧＭ、Ｃ２Ｍ３、ＨＡＬ４０３ａ、ＨＡＬ４０３ｂ、Ｐ３Ａ９、Ｐ４Ｂ３、Ｐ２Ｄ２、およびＰ２Ｅ１１と交差競合する。
６〜８週齢の雌性ＮＯＤマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、３または１０ｍｇ／ｋｇ体重の２８Ｇ９を、９週齢（ｔ＝０）で開始して、毎週１回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＰＢＳまたは非反応性のアイソタイプ一致ラットモノクローナル抗体（アイソタイプ）を陰性対照として用いた。アイソタイプ抗体は１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。マウスの体重および血糖を１週間あたり２回モニターした。血糖レベルが陽性リーディング以上であった場合、すなわち、２回の連続したモニタリングにわたって２５０ｍｇ／ｄＬ超であった場合に、糖尿病が確立されたと考えた。糖尿病の開始は、逐次測定の第１日目からの日を数えた。
図２に示すように、１０ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９で処置されたマウスはいずれも、１８週齢においてさえ、糖尿病にならなかった。対照的に、ＰＢＳおよびアイソタイプ処置のマウスの７５〜８０％が糖尿病になった（図２）。３ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９で処置されたマウスは、すべてが研究の終わりに非糖尿病であったわけではないが、ＰＢＳおよびアイソタイプ対照と比較して有意に低減した糖尿病発症が観察され、これは、糖尿病発症への２８Ｇ９の用量依存的抑制効果を実証するものである（図２）。１０ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９による処置は、アイソタイプまたはＰＢＳ対照と比較して有意に血糖レベルを低減させた（図３Ａ）。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置中のマウスの発達は、体重および死亡率を追跡することによってモニターした。図３Ｂに示すように、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９の多回投与は、マウスの成長に有意な影響を与えず、１０ｍｇ／ｋｇにおいても死亡はなかった。したがって、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、ＮＯＤ動物における血糖レベルを低減させ、糖尿病の進行を阻害する。これらの結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が１型糖尿病の進行を阻止し、遅らせるのに有効であることを実証する。
末梢Ｔ細胞調節へのアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の効果を調査するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、活性化マーカーＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌで免疫染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＰＢＳ処置、２８Ｇ９処置、またはアイソタイプ処置したマウス末梢血から単離した。アイソタイプ対照と比較して、１０ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９で処置されたマウスにおけるナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ２２０−ＣＤ８＋ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）の百分率は有意に低く、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ２２０−ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｈｉ）の百分率は有意に高かった（図４Ａおよび４Ｂ）。対照的に、アイソタイプ対照と比較して、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体で処置されたマウスにおけるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｂ２２０−ＣＤ４＋ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）は、有意に枯渇していなかった（図５）。これらの結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を介して血糖レベルを低減させることを示す。
（実施例５）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は自己免疫疾患の開始を遅らせる
この実施例は、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルにおける、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の効果を例示する。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を同定するのに、ＳＴＡＴ５活性化アッセイを用いた。Ｂ６またはＢＡＬＢ／ｃの脾臓をＰＢＳ中でホモジナイズし、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２分間溶解させ、次いで、１００μｍ孔径のメッシュを通して濾過し、ペレットにし、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およびＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ １６４０中に、室温から３７℃で、５×１０６細胞／ｍｌに再懸濁した。刺激の前１〜２時間にわたって、細胞を円錐管内で５％ＣＯ２中３７℃で維持した（単球／マクロファージ接着を阻止するため）。ＩＬ−７による刺激の前５分間にわたって、細胞を試験抗体と共にプレインキュベートした。細胞を、マウスＩＬ−７（ｍＩＬ−７、０．１ｎｇ／ｍｌ）で１５分間処置した。ホルムアルデヒドを最終濃度１．６％となるように培養培地に直接的に添加し、細胞を室温で１５分間固定した。次いで、メタノールを最終濃度８０％となるように直接的に添加し、試料を免疫染色の前に３０分間から１時間にわたって４℃で保存した。次の抗体を免疫染色に用いた：ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ（Ｍ１／７０）、Ｂ２２０−Ｃｙ５．５ＰｅｒＣＰ、ＴＣＲβ−ＦＩＴＣ、ｐ−ＳＴＡＴ５（Ｙ６９４、クローン４７）−Ａｌｅｘａ６４７（ＢＤ（商標）Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。ＴＣＲβ＋およびＣＤ１１ｂ＋細胞は、リン酸化ＳＴＡＴ５のために染色した。ＩＬ−７刺激されたＳＴＡＴ５リン酸化は、フローサイトメトリーにおいて、ＴＣＲβでゲーティングすることによって観察された。モノクローナル抗体２８Ｂ６および２８Ｇ９を含めて、ＳＴＡＴ５リン酸化を遮断した多くの抗体が同定された。
０日目における、熱殺されたヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ）１ｍｇ／ｍｌを含有するＣＦＡ中に乳化されたＭＯＧ３５−５５ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号１５））１００μｇによる皮下免疫処置により、６から８週齢の雌性Ｂ６マウスにおいて活動性ＥＡＥを誘導した（ＳｔｅｉｎｍａｎおよびＺａｍｖｉｌ、２００６を参照）。加えて、０および２日目に、百日咳毒素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）４００ｎｇを含むＰＢＳ ０．１ｍｌをマウスにｉ．ｖ．投与した。動物を、ＭＯＧ免疫処置後７日目に開始する、毎週２回のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体２８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体２８Ｇ９（１０ｍｇ／ｋｇ）または非反応性のアイソタイプ適合抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。アイソタイプ対照と比較して、２８Ｇ９または２８Ｂ６のいずれかによる処置は、免疫処置後１５日目という早い時期にＥＡＥ活性を有意に低減させた（図６）。この結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が、ＥＡＥの進行を遅らせるのに有効であることを実証する。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が用量依存的に有効であるかどうかを試験するために、ＭＯＧ免疫処置されたＥＡＥ動物を、免疫処置後７日目および１４日目に１または３ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９で処置した。非反応性のアイソタイプ適合抗体（１ｍｇ／ｋｇ）を陰性対照として用いた。アイソタイプ対照と比較して、両用量レベルにおける２８Ｇ９処置は、疾患ピークにおけるＥＡＥの重症度を低減させた（図７）。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体のこの抑制効果は、約１週間持続した。この結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が１および３ｍｇ／ｋｇの両方で防御を与えたことを実証する。別々の研究では、ＭＯＧ免疫処置されたＥＡＥ動物を、７日目に開始する、毎週１回の１、３または１０ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９で処置した。１ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９で処置されたマウスは、有意な効力を示し、死亡しなかった（図８）。これらの結果は、１ｍｇ／ｋｇのアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置が、ＥＡＥの進行を遅らせるのに有効であり、十分に忍容性であることを実証する。
確立された疾患におけるアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の効力を調査するために、ＭＯＧ免疫処置されたＥＡＥ動物を、免疫処置後１４日目に開始する、毎週２回の１０ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９で処置した。非反応性のアイソタイプ適合抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を陰性対照として用いた。対照と比較して、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体による処置は、ＥＡＥの重症度を有意に低減させた（図９）。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体を用いた場合、死亡は観察されなかった。この結果は、確立された、進行中のＥＡＥを改善するのにアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が有効であることを実証する。
介入が遅く、用量が低い場合に、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体がＥＡＥを低減させることができるかどうかをさらに決定するために、ＭＯＧ免疫処置されたＥＡＥ動物を、免疫処置後の１４日目に開始する、毎週１回の３ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９で処置した。非反応性のアイソタイプ適合抗体（３ｍｇ／ｋｇ）を陰性対照として用いた。対照と比較して、疾患重症度の高度に有意な低減がアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置で観察された（図１０）。この結果は、介入が遅く、用量が低い場合でさえ、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置が、疾患活性を低減させるのに有効であることを実証する。
（実施例６）
自己免疫疾患におけるアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体療法後の免疫学的変化
この実施例は、アンタゴニストＩＬ７Ｒ抗体処置後のＥＡＥマウスにおける免疫学的変化を例示する。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体がマウスモデルにおけるＥＡＥを改善するように作用する機序に関する洞察を得るために、処置動物および対照動物のリンパ球集団を、免疫染色およびフローサイトメトリーによって分析した。この例における免疫学的研究のために、ＭＯＧ免疫処置されたＥＡＥ動物を、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体２８Ｇ９（１０ｍｇ／ｋｇ）、２８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（非反応性のアイソタイプ適合抗体、１０ｍｇ／ｋｇ）で毎週処置した。選択された研究では、ＭＯＧ免疫処置されたＥＡＥ動物の群を、２８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）で毎週処置した。免疫処置後の２１日目に動物を屠殺し、中枢リンパ器官を収集した。リンパ球は、下に記載のように、器官から調製し、染色した。免疫染色されたリンパ球は、フローサイトメトリーによって分析した。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体で処置されたＥＡＥ動物のＢＭ、脾臓、血液、および胸腺におけるＴ細胞集団は、ビヒクル対照と比較して有意に低減していた。図１１に示すように、ＢＭ、脾臓、血液、およびリンパ節のＣＤ４Ｔ細胞（図１１Ａ）集団およびＣＤ８Ｔ細胞（図１１Ｂ）集団の両方が、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体で処置されたＥＡＥ動物において有意に低減した。これは、ＣＤ４Ｔ細胞発生およびＣＤ８Ｔ細胞発生の両方におけるＩＬ−７Ｒの役割と一致している。しかし、Ｂ細胞集団は、末梢リンパ器官のすべてにおいて有意に低減していなかった。この結果は、ＩＬ−７Ｒノックアウトのマウスの遺伝的データとは異なっている。ＩＬ−７Ｒノックアウトは、Ｔ細胞およびとＢ細胞の両方を欠失している。
ＩＬ−７Ｒシグナル伝達はナイーブＴ細胞の生存、およびメモリーＴ細胞増殖のために極めて重要であるので、末梢Ｔ細胞の調節における、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の効果を、活性化マーカーであるＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌを用いた免疫染色によって分析した。ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉは、ナイーブＴ細胞を代表し、ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏは活性化Ｔ細胞を代表し、ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ＬｈｉはメモリーＴ細胞を代表する。ビヒクル（非反応性のアイソタイプ適合抗体）処置された動物と比較して、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置されたマウスは、ナイーブＴ細胞集団および活性化Ｔ細胞集団が有意に枯渇していた（図１２Ａおよび１２Ｃ）。しかし、メモリーＴ細胞集団は、有意に枯渇していなかった（図１２Ｂ）。ナイーブＴ細胞集団および活性化Ｔ細胞集団のこの選択的な枯渇は、ナイーブＴ細胞の枯渇が新生の自己Ａｇ特異的（ａｕｔｏＡｇ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｔ細胞活性化を遮断することができ、その次に、ＥＡＥを予防するという点で、利点を提供しうる。メモリーＴ細胞は枯渇しておらず、したがって、抗感染免疫は保持されている。
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置されたＥＡＥ動物におけるＮＫ細胞の低減は観察されなかった。おそらくＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の百分率の低減による、ＮＫ細胞の百分率のわずかな増加が観察された。このデータは、ＩＬ−７／ＩＬ−７Ｒシグナル伝達が、ＮＫ細胞の発生でなく、Ｔ細胞の発生を調節するという観察と一致している。
ＥＡＥ動物におけるＴｒｅｇ細胞集団に対するアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置の効果を決定するために、リンパ球をＦｏｘｐ３について染色してＴｒｅｇ細胞を同定し、ＭＯＧ−ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）四量体について染色してＭＯＧ特異的なＴ細胞を検出した。２８Ｇ９処置されたＥＡＥ動物のリンパ節で検出されたＭＯＧ特異的ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞の集団は、対照（非反応性のアイソタイプ適合抗体で処理された）動物の集団に類似していた（図１３、左のグラフ）。しかし、Ｔｒｅｇ細胞集団の増大が、２８Ｇ９処置で観察された（図１３、右のグラフ）。これらの結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体によるＥＡＥ動物の処置によって、Ｔｒｅｇ細胞集団の増大が起こることを実証する。有利なことに、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置は、ＩＬ−２Ｒα抗体療法で観察された副作用である、他の炎症性疾患の発症を引き起こさない可能性がある。
リンパ球の調製および免疫蛍光染色
上記研究のために、脾臓、末梢リンパ節（対の腋窩、気管支および鼠径部）、胸腺および両側大腿骨骨髄（ＢＭ）の単細胞白血球懸濁液を穏やかな切開により生成させた。ＰＢＳによる心臓潅流の後に、中枢神経系（ＣＮＳ）の単核細胞を単離した。簡潔には、ＣＮＳ組織をコラゲナーゼＤ（２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびＤＮａｓｅＩ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて３７℃で４５分間消化させた。組織を７０μｍ細胞濾過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通し、それに続いてパーコール勾配（７０％／３７％）遠心分離を行うことによって、単核細胞を単離した。リンパ球を３７％／７０％の界面から収集し、洗浄した。次の抗体を免疫染色に用いた：ＦＩＴＣ結合型、ＰＥ結合型、またはＰＥ−Ｃｙ５結合型のＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ４（Ｈ１２９．１９）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ１４）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、Ｂ２２０（Ｈ１．２Ｆ３）、ＩｇＭ（ＩＩ／４１）、ＤＸ５（ＣＤ４９ｂ）（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。細胞内サイトカインを染色するために、染色前の５時間にわたって、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）（モネンジン）（５μｇ／ｍｌ）の存在下で、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。ＭＯＧ３８−４９／ＩＡｂ四量体および対照四量体（ＣＬＩＰ／ＩＡｂ）は、ＮＩＨ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって構築され、供給された。バックグランド染色は、非反応性のアイソタイプ適合対照ｍＡｂを用いて評価した。２色または３色免疫蛍光分析のために、所定の最適濃度のｍＡｂを用いて、単細胞懸濁液（１０６細胞）を４℃で２０分間染色した。四量体染色のために、リンパ球を３７℃で３時間染色した。
（実施例７）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）動物における耐糖能障害を改善する
この実施例は、２型糖尿病のマウスモデルにおける、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の効果を例示する。
ＤＩＯマウスで予め確立された脂肪炎症へのアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける効果を研究するために、Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、６週齢から開始する、高脂肪食（ＨＦＤ、Ｄ１２４９２、６０Ｋｃａｌ％脂肪、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を与えた。１０週間の高脂肪食の後、１６週齢の肥満マウスをアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体２８Ｇ９（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＳ、または非反応性のアイソタイプ適合対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．投与群にランダムに割り当てた。抗体処置の４日後に、マウスの糖負荷試験（ｉ．ｐ．１ｇ／ｋｇ、１６時間の絶食後）を行い、耐糖能障害を評価した。表５は、処置群（ＰＢＳ、アイソタイプまたは２８Ｇ９処置マウス）のそれぞれの平均体重および血糖レベルを示す。各群の動物は、同様の体重を有した。
Figure 2017061454
糖負荷試験の結果を図１４に示す。高脂肪食によって誘導された耐糖能障害が、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置によって改善された。糖負荷試験では、２８Ｇ９で処置されたＤＩＯマウスは、アイソタイプまたはＰＢＳで処置されたマウスと比較して、有意に低い血糖レベルを有した（図１４）。この結果は、２型糖尿病の動物モデルにおいて、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が有効であることを実証する。
（実施例８）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は関節リウマチのマウスモデルにおける疾患重症度を低減させる
この実施例は、関節リウマチ（ＲＡ）のマウスモデルにおける、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の効果について例示する。
コラーゲン誘導された関節炎（ＣＩＡ）は、ＲＡと多くの病理学的および組織学的類似性を共有する広く用いられている動物モデルである。ＣＩＡへの、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体のｉｎ ｖｉｖｏの効果を研究するために、０日目および１５日目に、６〜８週齢の雄性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウス（ストック＃０００４５７、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、熱殺されたヒト結核菌Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ）４ｍｇ／ｍｌを含有するフロインド完全アジュバント中に乳化されたタイプＩＩコラーゲン（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）１５０μｇで免疫処置した。−１日目、１日目、８日目、１５日目、および２２日目に、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体２８Ｇ９または非反応性のアイソタイプ適合対照抗体をマウスにｉ．ｐ．注射した。
ＣＩＡの臨床徴候は、０〜５点の評点システムで毎日評価した：０、正常；１、後肢もしくは前肢関節に影響、または最小限のびまん性紅斑および腫脹；２、後肢もしくは前肢関節に影響、または軽度のびまん性紅斑および腫脹；３、後肢もしくは前肢関節に影響、または中程度のびまん性紅斑および腫脹；４、著しいびまん性紅斑および腫脹；５、足全体のびまん性紅斑および重度の腫脹、指の屈曲不能。アイソタイプ対照と比較して、３ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９による処置は、ＣＩＩ免疫処置されたマウスのＣＩＡの重症度を有意に低減させた（図１５）。１ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９による処置は、有意な低減を示さなかった。この結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が、関節リウマチの動物モデルにおける疾患の進行を遅らせるのに有効であることを実証する。
（実施例９）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、確立されたＥＡＥのマウスモデルにおける疾患の重症度を低減させる
この実施例は、確立されたＥＡＥのマウスモデルにおけるアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の有効性を例示する。
熱殺されたヒト結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）４ｍｇ／ｍｌを含有する完全フロインドアジュバントに溶解させたＰＬＰ（ｐ１３９−１５１）２００μｇによる免疫処置によって、ＳＪＬ／ＪマウスにＥＡＥを誘導した。マウスの体重測定値およびＥＡＥの臨床徴候を毎日検査し、以下の通りに評点を付けた：０、麻痺がない；１、弛緩した尾部；２、後肢脱力；３、後肢麻痺；４、後肢および前肢麻痺；５、瀕死または死亡。
２〜３のＥＡＥ臨床評点を有するマウスを２８Ｇ９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、ＳＢ／１４（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）または対照ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で、１週間に１回２週間にわたって（０、７、および１４日目に）処置した。２８Ｇ９は、ラットＩｇＧ１抗体であり、ＳＢ／１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ラットＩｇＧ２ａ抗体である。臨床評点は、６１日目まで毎日モニターした。
７日目までに、２８Ｇ９で処置されたマウスは、臨床評点が２未満となった（Ｎ＝７）。２８Ｇ９で処置されたマウスは、研究の終わり（６１日目）まで約２の臨床評点を維持した。これと比較して、対照ＩｇＧ処置された動物は、研究を通して３〜４の臨床評点を有した。ＳＢ／１４処置では、対照と比較して、疾患の重症度の低減は観察されなかった。
２８Ｇ９アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置された動物において、疾患の重症度の高度に有意な低減が観察された。これらの結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が、確立された自己免疫疾患における疾患重症度の低減に有効であることを実証する。
（実施例１０）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は、新規発症の糖尿病を有する動物の血糖レベルを低減する
この実施例は、１型糖尿病のマウスモデルにおける新規発症の糖尿病を回復させることにおける、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の有効性を例示する。
１型糖尿病のマウスモデルにおいて、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体のパネルを試験した。２８Ｇ９は、ラットＩｇＧ１モノクローナル抗体であり、２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａは、マウスＩｇＧ２ａ定常領域を伴う２８Ｇ９可変領域を有する抗体であり、ａｇｌｙ−２８Ｇ９は、マウスＩｇＧ２ａ Ｎ２９７Ａを伴う２８Ｇ９可変領域を有する非グリコシル化抗体である。２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａの構築および発現のために、ラットモノクローナル抗体２８Ｇ９のＶＨおよびＶｋ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐＡＲＣマウスＩｇＧ２ａおよびｐＡＲＣマウスカッパ哺乳動物発現ベクターにクローニングし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））によって、２９３Ｆ細胞内に同時形質移入した。トランスフェクション後５日後に、培養培地を採取し、２８Ｇ９マウスＩｇＧ２ａをＭａｂｓｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ）樹脂を用いることによって精製した。ａｇｌｙ−２８Ｇ９の構築および発現のために、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７がＡｌａによって置き換えられている、操作されたｐＡＲＣマウスＩｇＧ２ａベクター（ｐＡＲＣマウスＩｇＧ２ａ−Ｎ２９７Ａ）に、ラット２８Ｇ９のＶＨをクローニングした。非グリコシル化ｍ２８Ｇ９（ａｇｌｙ−２８Ｇ９）は、ｐＡＲＣマウスＩｇＧ２ａ−Ｎ２９７ＡおよびｐＡＲＣ−２８Ｇ９マウスカッパベクターで２９３Ｆ細胞を同時形質移入することによって得た。
自然に新規発症した糖尿病のＮＯＤマウス（すなわち、２回の連続した血糖濃度が２５０ｍｇ／ｄｌ超）を、２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、２８Ｇ９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、ａｇｌｙ−２８Ｇ９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）または対照ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で毎週ｉ．ｐ．処置した。疾患発症後の１４０日間にわたって血糖レベルを毎日モニターした。２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａで処置されたマウスでは、１００％の寛解が観察された。２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａ処置されたＮＯＤマウスでは、毎週の２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａ注射で、血糖レベルが２５０ｍｇ／ｄｌ未満に維持された。２８Ｇ９は、対照ＩｇＧと比較して、血糖レベルの低減においてもいくらかの有効性を示した。Ａｇｌｙ−２８Ｇ９処置されたマウスおよび対照ＩｇＧ処置されたマウスは、研究を通して２５０ｍｇ／ｄｌ超の血糖レベルを有した。これらの結果は、２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が、確立された１型糖尿病を有するマウスにおいて血糖レベルを低減させるのに高度に有効であることを実証する。
別の研究では、自然に新規発生した糖尿病のＮＯＤマウスを、疾患発症に開始し、表６に示す投与回数にわたる、毎週の２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で処置した。血糖レベルは、毎日モニターした。
Figure 2017061454
表６に示す結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の２回の投与が、最大８９日間にわたって２５０ｍｇ／ｄＬ未満の血糖レベルを維持するのに十分であったことを示す。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の３回の投与は、少なくとも１１７日間にわたって、２５０ｍｇ／ｄＬ未満の血糖レベルを維持するのに十分であった。この研究では、２５０ｍｇ／ｄＬ未満に維持された血糖レベルが、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置の後、最大５カ月まで観察された。
上述の研究の結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａが、新規発症の糖尿病を有する動物における血糖レベルを低減するのに高度に有効であったことを実証する。さらに、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の若干２回または３回の投与で処置されたマウスは、抗体が投与された後、数カ月にわたって２５０ｍｇ／ｄＬ未満の血糖レベルを維持した。
（実施例１１）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体は移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）のマウスモデルにおける疾患重症度を低減させる
この実施例は、急性および慢性の移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）のマウスモデルにおけるアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の効果を例示する。
急性ＧＶＨＤ
急性ＧＶＨＤのマウスモデルには、非照射のＮＯＤ．ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒγ−／−マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、８〜１２週齢）に、１０×１０６のヒトＰＢＭＣ（新たに単離されたもの）を注射した。注射の１４日後に、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇのアンタゴニストＩＬ−７Ｒ完全ヒトＩｇＧ１抗体ＨＡＬ４０３ｂ（ｎ＝１０）またはアイソタイプ対照（ｎ＝１０）で毎週１回処置した。ＧＶＨＤの臨床徴候および体重を１週間に２回モニターした。アイソタイプ対照で処置された動物のうち、生き残ったものは５０％のみであったのとは対照的に、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置された動物は、その１００％が、処置後の４０日間、生存していた。この結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が、急性ＧＶＨＤの動物モデルにおける死亡率を低減するのに有効であることを示す。
慢性ＧＶＨＤ
慢性ＧＶＨＤマウスモデルには、低い（１〜５％）百分率でＣＤ３＋Ｔ細胞を含有するヒト臍帯血細胞を、照射された新生仔ＮＯＤ．ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒγ−／−マウスに移植した。簡潔には、ヒトＣＤ３選択ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍＢＨ、独国、ＣＡＴ＃１３０−０５０−１０１）を用いて、ヒトＣＤ３４＋臍帯血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＬＬＣ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）からＣＤ３＋Ｔ細胞を枯渇させた。移植のために、照射された新生仔ＮＯＤ．ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒγ−／−マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、１匹あたり、約１〜５％のＣＤ３＋Ｔ細胞を含有する約３００，０００〜４００，０００のＣＤ３４＋細胞（容積５０μｌ）を心臓内注射した。移植後１６〜２０週間でｃＧＶＨＤが発症した。
ｃＧＶＨＤを有するマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのアンタゴニストＩＬ−７Ｒ完全ヒトＩｇＧ１抗体ＨＡＬ４０３ｂ（ｎ＝４）またはＰＢＳ（ｎ＝４）を、２４週齢に開始して、屠殺まで毎週１回注射した。
約４〜８週間のアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置またはＰＢＳの処置の後に、約２８〜３２週齢でマウスを屠殺した。アンタゴニストＩＬ−７Ｒ完全ヒトＩｇＧ１抗体で処置されたマウスは、ＰＢＳを注射されたマウスより、有意に毛髪脱落が少なかった。組織学分析は、ＰＢＳ処置されたマウスの腎臓が、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体処置されたマウスの腎臓より、概して、重度に患っていることを示した。例えば、対照（ＰＢＳ処置された）マウスの腎臓は、好酸性物質の量の増大により著しく肥厚した毛細血管ループを有した。対照的に、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体で処置されたマウスの腎臓は、好酸性物質の量の増大により軽度に肥厚した毛細血管ループを有した。加えて、アイソタイプ対照で処置されたマウスの腎臓は多数の細管拡張を示したが、これと比較して、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体で処置されたマウスの腎臓は、少数の細管拡張を有した。肺組織学は、対照マウスの肺にはいくらかの気管関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）が存在し、これと比較して、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体で処置されたマウスの肺における、ＢＡＬＴの大幅な低減を明らかにした。ＰＢＳで処置されたマウスの脾臓における軽度から中程度の変化と比較して、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体で処置されたマウスの脾臓では、重度のリンパ球萎縮が観察された。
これらの結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が、慢性ＧＶＨＤの動物モデルにおける疾患重症度の低減に有効であることを示す。
（実施例１２）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体はループスのマウスモデルにおける疾患の重症度を低減させる
この実施例は、ループスのマウスモデルにおける、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体の効果を例示する。
ループスのマウスモデルには、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いた。ｌｐｒ変異体と一般的に呼ばれるように、これらのマウスは、リンパ球増殖の自然変異（Ｆａｓｌｐｒ）のホモ接合型であり、全身性自己免疫、異常なＴ細胞の増殖に関連した大規模なリンパ節腫脹、関節炎、および免疫複合体性糸球体腎炎を示す。したがって、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊマウスは、全身性エリテマトーデスのモデルとして有用である。
マウスに、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａアンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体（実施例１０を参照）、１ｍｇ／ｋｇのａｇｌｙ−２８Ｇ９アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体、アイソタイプ対照ＩｇＧ（陰性対照）またはシクロホスファミド（陽性対照）を、疾患発症時に開始する、毎週ｉ．ｐ．投与した。各処置群あたり、１０匹のマウスを用いた（ｎ＝１０）。疾患の重症度を、タンパク尿レベル、活動レベルの測定、および立ち直り反射の評価によってモニターした。立ち直り反射の評価では、３０秒以内に立ち直ることができなかったマウスを屠殺した。生存率を下記の表７に要約する。
Figure 2017061454
表７に示すように、アイソタイプ対照ＩｇＧで処置されたマウスと比較して、１ｍｇ／ｋｇのａｇｌｙ−２８Ｇ９、３ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａまたは１０ｍｇ／ｋｇの２８Ｇ９−ｍＩｇＧ２ａで処置されたマウスは、生存率が増大していた。これらの結果は、アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体が、ループスの動物モデルの疾患重症度の低減に有効であることを示す。
（実施例１３）
アンタゴニストＩＬ−７Ｒ抗体のエピトープマッピング／結合
この実施例は、抗体結合エピトープをマッピングするための構造主導の変異導入を例示する。
ＩＬ−７／ＩＬ−７Ｒα複合体の結晶構造およびＩＬ−７結合における特定の残基の可能性の高い関与（ＭｃＥｌｒｏｙら、２００９、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１７（１）：５４〜６５）に基づいて、２３のＩＬ−７Ｒα表面残基変異体（Ｎ２９Ｄ、Ｖ５８Ｓ、Ｅ５９Ｒ、Ｒ６６Ｎ、Ｋ７７Ｓ、Ｌ８０Ｓ、Ｉ８２Ｓ、Ｋ８４Ｓ、Ｋ１００Ｓ、Ｔ１０５Ａ、Ｎ１３１Ｓ、Ｑ１３６Ｋ、Ｋ１３８Ｓ、Ｙ１３９Ｆ、Ｋ１４１Ｓ、Ｍ１４４Ａ、Ｄ１９０Ｓ、Ｈ１９１Ｎ、Ｙ１９２Ａ、Ｙ１９２Ｆ、Ｋ１９４Ｓ、Ｋ１９４Ａ、およびＦ１９６Ｓ）を、抗体結合エピトープをマッピングするための変異に選択した。変異体の付番（すなわち、Ｎ２９Ｄ、Ｖ５８Ｓ、Ｅ５９Ｒなど）は、最初の２０アミノ酸は数えないという、プロセシング後のタンパク質の慣例に従っている。
ＩＬ−７Ｒαの単一点変異体（ｈｉｓタグ付き）のパネルを以下の通り調製した。上述した２３のＩＬ−７Ｒαの単一のポイント変異体は、以前に記載されている野生型ＤＮＡコンストラクト（ＭｃＥｌｒｏｙら、２００９、同上）から、標準的なＤＮＡ技法を用いて作製した。変異体タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性形質移入を用いて発現され、細胞培地中に分泌された。変異体タンパク質は、Ｎｉ２＋カラムクロマトグラフィーによって精製した。タンパク質濃度は、分光測定（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標））によって測定した。
ＩＬ−７Ｒαの相互作用分析は、ＧＬＭセンサーチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）を備えた、表面プラズモン共鳴ベースのＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いて２５℃で行った。全体を通して、ＨＢＳＴラニングバッファー（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いた。標準的なＥＤＣ／スルフホ−ＮＨＳ媒介化学によって、約２０００〜５０００ＲＵのレベルまで、完全長ＩＬ−７Ｒ抗体（ＨＡＬ４０３ａまたはＨＡＬ４０３ｂ）を、チップの別々の「垂直」チャネル上にアミンカップリングさせた。３０μＬ／分における、それぞれ３分および１０分の会合フェーズおよび解離フェーズを用いて、ＩＬ−７Ｒα変異体（野生型ＩＬ−７Ｒαを含める）のパネルを１００ｎＭで「水平」方向にスクリーニングした。表面は、２／１ｖ／ｖ Ｐｉｅｒｃｅ ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ溶出バッファー（ｐＨ２．８）／４Ｍ ＮａＣｌで再生させた。ほとんどの注入を２連で行い、アッセイが再現可能であることを確認した。
表８は、野生型ＩＬ−７Ｒαと比較した、ＩＬ−７Ｒα変異体における単一点変異の、抗体結合へのインパクトを要約する。
Figure 2017061454
野生型ＩＬ−７Ｒαと比較して、減弱した抗体結合を示すＩＬ−７Ｒα変異体を、ｍＡｂ結合に関与する残基における点変異を有するものとして同定した。抗体ＨＡＬ４０３ａへのＩＬ−７Ｒαの結合残基は、変異体効果の降順で、以下の通りに同定された：Ｉ８２（結合への大きなインパクト）、Ｋ８４（中程度のインパクト）、Ｋ１００（中程度のインパクト）、Ｔ１０５（中程度のインパクト）、Ｙ１９２（中程度のインパクト）、Ｄ１９０（小さなインパクト）、Ｈ１９１（小さなインパクト）、およびＫ１９４（小さなインパクト）。抗体ＨＡＬ４０３ｂへのＩＬ−７Ｒαの結合残基は、変異体効果の降順で、以下の通りに同定された：Ｉ８２（結合への大きなインパクト）、Ｋ８４（中程度のインパクト）、Ｋ１００（中程度のインパクト）、Ｔ１０５（中程度のインパクト）、Ｙ１９２（中程度のインパクト）、Ｄ１９０（小さなインパクト）、Ｈ１９１（小さなインパクト）、およびＫ１９４（小さなインパクト）。
様々な適用、方法、キット、および組成物に関連して、開示の教示を記載したが、本明細書および下記の特許請求される本発明の教示から逸脱することなく、様々な変化および修飾を加えることができることが理解されよう。以上の例は、開示の教示をより明解に例示するために提供されており、本明細書に提示する教示の範囲を限定するものではない。本教示を、これらの例示的実施形態に関して記載したが、当業者ならば、これらの例示的実施形態の多数の変形および修飾が、過度の実験を行わないでも可能であることを容易に理解するだろう。そのようなすべての変形および修飾が本教示の範囲に包含される。
特許、特許出願、文書、教科書などを含めた、本明細書に引用されたすべての参考文献、およびそこに引用されている参考文献は、それらが既になされている程度を超えて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。組み込まれた文献の１つまたは複数および同様のものが、限定されるものではないが、定義語、用語用法、記載の技法などを含めた、本出願と相違している、または矛盾する場合、本出願が優先される。
以上の説明および実施例は、本発明のある種の特定の実施形態を詳述し、本発明者らが企図する最良の形態を記載するものである。しかし、上記が本文でいかに詳細に記載されようとも、本発明は、様々な様態で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらのいずれかの均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１６７８
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１６７９

Claims (8)

  1. インターロイキン−７受容体アルファ（ＩＬ−７Ｒα）に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号40のアミノ酸配列に存在するCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、かつ配列番号41のアミノ酸配列に存在するCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域（VL）を含む、抗体。
  2. 請求項１に記載の単離された抗体であって、配列番号１９、配列番号４６、または配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号２３または配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２と、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３とを含む、抗体。
  3. 請求項２に記載の単離された抗体であって、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１と、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２と、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３とを含む、抗体。
  4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、それぞれのCDRが、Kabatの定義、Chothiaの定義、Kabatの定義とChothiaの定義の組み合わせ、AbM定義またはCDRの接触定義に従って定義される、抗体。
  5. 定常領域をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２Δａサブクラスの抗体である、請求項５に記載の抗体。
  7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
  8. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体を組換え生成する細胞系。
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