KR20140033246A - 길항제 항-ｉｌ-7 수용체 항체 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터류킨-7 수용체 (IL-7R)에 결합하는 길항작용 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체 및 항체-코딩 핵산을 수득하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 제2형 당뇨병 및 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 이식편대숙주병 및 루푸스를 비롯한 면역 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 상기 항체 및 그의 항원-결합 부분을 사용하는 치료적 방법에 관한 것이다.

Description

길항제 항-ＩＬ-7 수용체 항체 및 방법 {ANTAGONIST ANTI-IL-7 RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS}

본 발명은 인터류킨-7 수용체 (IL-7R)의 활성 (IL-7과의 상호작용 포함)에 대해 길항작용하는 항체, 예를 들어 전장 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 본 발명은 또한 IL-7R 길항제, 예컨대 길항제 IL-7R 항체를 포함하는 조성물 및 의약으로서 IL-7R 길항제를 사용하는 방법에 관한 것이다. IL-7R 길항제는 제2형 당뇨병, 이식편대숙주병 (GVHD), 및 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 루푸스를 비롯한 자가면역 장애의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

IL-7R 복합체는 IL-7R 알파쇄 (IL-7Rα) 및 통상적인 감마쇄 (γc)로 구성된 이종이량체성 수용체이다 (문헌 [Mazzucchelli et al., Nat Rev Immunol., 2007, 7:144-54] 참조). IL-7R은 T 및 B 림프구의 발생 및 항상성 유지에 필수적인 사이토카인인 인터류킨-7 (IL-7)에 의해 결합된다 (문헌 [Fry et al., J Immunol., 2005, 174:6571-6] 참조). IL-7의 IL-7R에 대한 결합은 림프구 생존, 글루코스 흡수, 증식 및 분화를 조절하는 다수의 경로를 활성화시킨다.

IL-7R은 수지상 세포 및 단핵구 둘 다에서 발현되며, 다수의 조혈계에서 작용하는 것처럼 보인다 (문헌 [Reche PA, et al., J Immunol., 2001, 167:336-43] 참조). 수지상 세포에서, IL-7R은 면역조절 역할을 하는 반면, 림프구는 생존, 증식 및 분화를 위한 IL-7R 신호전달을 필요로 한다. Jak-Stat 및 PI3K Akt 경로 둘 다는 IL-7의 IL-7R에 대한 결합에 의해 활성화된다 (문헌 [Jian et al., Cytokine Growth Factor Rev., 2005, 16:513-533] 참조). 이들 경로는 신호전달 혼선, 공유된 상호작용 도메인, 피드백 루프, 통합된 유전자 조절, 다량체화 및 리간드 경쟁을 포함한다. Bcl2 및 Pyk2를 비롯한 IL-7 신호전달의 일부 표적은 세포 생존에 기여한다. 다른 표적, 예컨대 PI3 키나제, src 패밀리 키나제 (lck 및 fyn) 및 STAT5는 세포 증식에 기여한다. 전사 인자 STAT5는 B 및 T 세포의 다수의 상이한 하류 유전자의 활성화에 기여하며, 염색질 구조의 변형을 통한 VDJ 재조합에 기여할 수 있다. IL-7에 의해 유도된 세포 생존 및 세포 증식 신호는 조합되어 정상적인 T 세포 발생을 유도한다. 면역계의 세포에서 복합적 IL-7 신호전달 네트워크 및 이와 다른 신호전달 캐스케이드와의 상호작용에 대한 상세내용은 아직 완전히 밝혀지지 않았다.

당업계에서 이용가능한 정보로부터, 그리고 본 발명의 이전에, IL-7R을 선택적으로 길항작용하기 위한 혈액 순환 내로의 길항제 IL-7R 항체의 도입이 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, GVHD, 루푸스 및 류마티스 관절염을 치료하는데 유효한지 여부 및 만약 유효하다면 IL-7R 항체의 어떠한 성질이 상기 생체내 유효성에 필요한지 여부가 불명확하게 남아있었다.

IL-7R과 선택적으로 상호작용하며 IL-7R 기능을 억제하는 길항체 항체가 제공된다. 특정 길항제 IL-7R 항체가 생체내에서 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 류마티스 관절염, GVHD 및 루푸스를 치료하는데 유효하다는 것이 처음으로 입증된다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R과 선택적으로 상호작용하며 IL-7R 기능을 억제하는 길항체 항체가 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 IL-7R에 특이적으로 결합하며, IL-7R에의 결합에 대해 C1GM, C2M3, P3A9, P4B3, P2D2, P2E11, HAL403a 및 HAL403b로 이루어진 군으로부터 선택된 모노클로날 항체와 경쟁하는 항원 결합 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 42 또는 서열 43에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체는 IL-7R에 특이적으로 결합하고, C1GM, C2M3, P3A9, P4B3, P2D2, P2E11, HAL403a 및 HAL403b로 이루어진 군으로부터 선택된 모노클로날 항체에 의해 인식되는 IL-7R의 에피토프와 중복되는 에피토프를 인식한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인터류킨-7 수용체 알파 (IL-7Rα)의 잔기 I82, K84, K100, T105 및 Y192를 포함하는 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 에피토프는 인간 IL-7Rα의 잔기 D190, H191 및 K194로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 잔기를 더 포함한다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R은 인간 IL-7R이다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 인터류킨-7 수용체 알파 (IL-7Rα)에 특이적으로 결합하고, 아미노산 서열 X₁X₂VMH (여기서 X₁은 D 또는 N이고; X₂는 S 또는 Y임) (서열 50)를 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 X₁X₂X₃X₄X₅GX₆X₇TYYADSVKG (여기서 X₁은 L 또는 A이고; X₂는 V 또는 I이고; X₃은 G 또는 S이고; X₄는 W 또는 G이고; X₅는 D 또는 S이고; X₆은 F, G 또는 S이고; X₇은 F, A 또는 S임) (서열 51)를 갖는 VH CDR2, 및 아미노산 서열 X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈ (여기서 X₁은 Q 또는 D이고; X₂는 G 또는 I이고; X₃은 D 또는 S이고; X₄는 Y 또는 G이고; X₅는 M, V 또는 G이고; X₆은 G 또는 F이고; X₇은 N, D 또는 M이고; X₈은 N, Y 또는 D임) (서열 52)을 갖는 VH CDR3을 포함하고, 아미노산 서열 TX₁SSGX₂IX₃SSYVQ (여기서 X₁은 R 또는 G이고; X₂는 S 또는 R이고; X₃은 D 또는 A임) (서열 53)를 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 아미노산 서열 EDX₁QRPS (여기서 X₁은 D 또는 N임) (서열 54)를 갖는 VL CDR2, 및 아미노산 서열 X₁X₂YX₃X₄X₅X₆LX₇ (여기서 X₁은 Q 또는 M이고; X₂는 S 또는 Q이고; X₃은 D 또는 A이고; X₄는 F 또는 S이고; X₅는 H 또는 S이고; X₆은 H 또는 S이고; X₇은 V 또는 W임) (서열 55)을 갖는 VL CDR3을 포함하며, STAT5 활성화 검정에서 STAT5 인산화를 차단한다. 몇몇 실시양태에서, VH CDR2와 VH CDR3 사이의 프레임워크 영역은 아미노산 서열 알라닌-아르기닌을 포함하며, 상기 아르기닌은 VH CDR3의 첫번째 아미노산 잔기에 인접한다. 몇몇 실시양태에서, VH CDR2와 VH CDR3 사이의 프레임워크 영역은 아미노산 서열 시스테인-알라닌-아르기닌을 포함하며, 상기 아르기닌은 VH CDR3의 첫번째 아미노산 잔기에 인접한다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열 X₁X₂VMH (여기서 X₁은 D 또는 N이고; X₂는 S 또는 Y임) (서열 50)를 갖는 중쇄 CDR 접촉 영역 1, 아미노산 서열 GWDGFF (서열 57)를 갖는 중쇄 CDR 접촉 영역 2, 및 아미노산 서열 ARX₁X₂X₃X₄ (서열 58)를 갖는 중쇄 CDR 접촉 영역 3, 아미노산 서열 SGSIDSSY (서열 59)를 갖는 경쇄 CDR 접촉 영역 1, 아미노산 서열 EDDQRPSGV (서열 60)를 갖는 경쇄 CDR 접촉 영역 2, 및 아미노산 서열 FHHL (서열 61)을 갖는 경쇄 CDR 접촉 영역 3을 포함하며, STAT5 활성화 검정에서 STAT5 인산화를 차단한다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 IL-7Rα에 특이적으로 결합하며, 아미노산 서열 DSVMH (서열 19), GFTFDDS (서열 46) 또는 GFTFDDSVMH (서열 47)를 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 아미노산 서열 LVGWDGFFTYYADSVKG (서열 23) 또는 GWDGFF (서열 48)를 갖는 VH CDR2, 및 아미노산 서열 QGDYMGNN (서열 49)을 갖는 VH CDR3을 포함하거나, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 1개 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열 TRSSGSIDSSYVQ (서열 29)를 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 아미노산 서열 EDDQRPS (서열 31)를 갖는 VL CDR2, 및/또는 아미노산 서열 QSYDFHHLV (서열 36)를 갖는 VL CDR3을 포함하거나, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 1개 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 또한 서열 19, 46 또는 47에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 23 또는 48에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열 49에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하거나, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 1개 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 IL-7Rα에 특이적으로 결합하며, 서열 19, 46 또는 47에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 서열 23 또는 48에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열 49에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3, 서열 29에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열 31에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열 36에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, VH 영역은 아미노산 서열

(서열 40)를 포함하고, VL 영역은 아미노산 서열

(서열 41)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열

(서열 43)를 갖는 경쇄 및 아미노산 서열

(서열 42) (서열 42의 C-말단 리신은 존재하거나 부재함)를 갖는 중쇄를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메릭 항체일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 불변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1 또는 IgG2Δa 하위부류의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 글리코실화 불변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Fc 감마 수용체에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 불변 영역을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R과 선택적으로 상호작용하며 IL-7R 기능을 억제하는 항체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R과 선택적으로 상호작용하며 IL-7R 기능을 억제하는 항체를 재조합적으로 생산하는 세포주가 제공된다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R과 선택적으로 상호작용하며 IL-7R 기능을 억제하는 항체를 코딩하는 핵산이 제공된다.

몇몇 실시양태에서, 개체에서 혈액 글루코스 수준을 낮추는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 길항제 IL-7R 항체를 치료가 필요한 개체에게 투여하여 혈액 글루코스 수준을 낮추는 것을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 개체에서 글루코스 내성을 개선시키는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 길항제 IL-7R 항체를 치료가 필요한 개체에게 투여하여 글루코스 내성을 개선시키는 것을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 개체에서 제1형 당뇨병을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 길항제 IL-7R 항체를 치료가 필요한 개체에게 투여하여 제1형 당뇨병의 하나 이상의 증상을 예방하거나 치료하는 것을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 개체에서 제2형 당뇨병을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 IL-7R 길항제를 치료가 필요한 개체에게 투여하여 제2형 당뇨병의 하나 이상의 증상을 예방하거나 치료하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제는 길항제 IL-7R 항체이다.

몇몇 실시양태에서, 개체에서 류마티스 관절염을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 길항제 IL-7R 항체를 치료가 필요한 개체에게 투여하여 류마티스 관절염의 하나 이상의 증상을 예방하거나 치료하는 것을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 개체에서 이식편대숙주병 (GVHD)을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 길항제 IL-7R 항체를 치료가 필요한 개체에게 투여하여 GVHD의 하나 이상의 증상을 예방하거나 치료하는 것을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, GVHD는 만성 GVHD 또는 급성 GVHD이다.

몇몇 실시양태에서, 개체에서 루푸스를 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 길항제 IL-7R 항체를 치료가 필요한 개체에게 투여하여 루푸스의 하나 이상의 증상을 예방하거나 치료하는 것을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 루푸스는 피부 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 약물-유도된 홍반성 또는 신생아 루푸스이다.

몇몇 실시양태에서, 개체에서 다발성 경화증을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 길항제 IL-7R 항체를 치료가 필요한 개체에게 투여하여 다발성 경화증의 하나 이상의 증상을 예방 또는 치료하고, 개체에서 미접촉(

) 및/또는 활성화 T 세포 집단을 감소 및/또는 고갈시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 개체에서의 감소 또는 고갈된 T 세포 집단은 T_H1 및/또는 T_H17 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체의 투여는 개체에서 T_H17 세포 집단을 확대시키지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 비경구로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다.

도 1은 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 IL-7-매개된 STAT5 인산화에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 P2D2, P2E11 및 HAL403a의 투여량-의존성 효과를 도시한다. x-축은 포스포-STAT5 (p-STAT)를 발현하는 CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다.
도 2는 자연발증 당뇨병 (NOD) 마우스에서 당뇨병의 발생에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다.
도 3은 NOD 마우스에서 (A) 혈액 글루코스 수준 (mg/dL) 및 (B) 체중 (g)에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다.
도 4는 NOD 마우스에서 (A) 미접촉 CD8+ T 세포 및 (B) 메모리 CD8+ T 세포 집단에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다. x-축에 대해, 전체 CD8+ T 세포 집단을 100％로 설정하였다.
도 5는 NOD 마우스에서 미접촉 CD4+ T 세포 집단에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다. x-축에 대해, 전체 CD4+ T 세포 집단을 100％로 설정하였다.
도 6은 EAE 동물의 임상 중증도에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28B6 및 28G9의 효과를 도시한다. EAE의 임상 중증도는 매일 0점 내지 5점 점수화 체계로 평가하였다: 0, 정상; 1, 이완된 꼬리; 2, 부분적인 뒷다리 마비; 3, 전체 뒷다리 마비; 4, 사지마비; 5, 빈사 상태 또는 사망.
도 7은 EAE 동물의 임상 중증도에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 투여량-의존성 효과를 도시한다.
도 8은 EAE 동물의 임상 중증도에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다.
도 9는 확립된 EAE를 갖는 동물에서 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다.
도 10은 확립된 EAE를 갖는 동물에서 저 투여량의 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다.
도 11은 EAE 동물의 골수 (BM), 비장, 혈액 및 림프절 (LN)로부터의 (A) CD4 T 세포 및 (B) CD8 T 세포 집단에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9 및 28B6의 효과를 도시한다. x-축에 대해, 전체 림프구 집단을 100％로 설정하였다.
도 12a 내지 12c는 EAE 동물의 골수, 비장, 혈액 및 림프절로부터의 (A) 미첩촉 T 세포, (B) 메모리 T 세포, 및 (C) 활성화 T 세포 집단에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다. x-축에 대해, CD8+ T 세포 집단을 100％로 설정하였다.
도 13은 EAE 동물의 골수, 비장, 혈액 및 림프절로부터의 T_eff 세포 (좌측 그래프) 및 T_reg 세포 (우측 그래프) 집단에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다. x-축에 대해, CD4+ T 세포 집단을 100％로 설정하였다. "*"은 대조군과 비교시 P<0.05를 나타낸다.
도 14는 고 지방 식이-유도된 비만 (DIO) 마우스에서 혈액 글루코스 수준 (mg/dL)에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다.
도 15는 고 지방 식이-유도된 비만 (DIO) 마우스에서 글루코스 불내성에 대한 길항제 IL-7R 모노클로날 항체 28G9의 효과를 도시한다.

본원에서 IL-7과의 상호작용을 비롯한 IL-7R의 기능을 길항작용하는 항체가 개시된다. 길항제 IL-7R 항체의 제조 방법, 이들 항체를 포함하는 조성물, 및 이들 항체를 의약으로서 사용하는 방법이 제공된다. IL-7R 길항제, 예를 들어 길항제 IL-7R 항체는 제2형 당뇨병, GVHD, 및 다발성 경화증 (MS), 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병 및 루푸스를 비롯한 자가면역 장애의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

일반 기술

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 분자 생물학 (재조합 기술을 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 전형적인 기술을 이용할 것이며, 당업계의 숙련범위 내에 있다. 상기 기술은 문헌, 예컨대

에 자세히 설명되어 있다.

정의

"항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 1개 이상의 항원 인식 부위를 통해, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 이들의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일쇄 (ScFv) 및 도메인 항체 (예를 들어, 상어 및 낙타과 항체를 포함), 및 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항체는 임의의 부류, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 이들의 하위부류)의 항체를 포함하며, 항체는 임의의 특정 부류의 것일 필요는 없다. 항체의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 이뮤노글로불린의 5개 주요 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류 (아아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다.

본원에 사용된 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하며, 즉 그 집단을 구성하는 개별 항체는 극소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연-발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특성을 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득한 것으로 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 모노클로날 항체는 먼저 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

본원에 사용된 "인간화" 항체는, 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 이들의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)인 비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 수용된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않지만 항체 성능을 더 정제하고 최적화하기 위해 포함된 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 이뮤노글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화 항체는 최적으로는 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 갖는 항체가 바람직하다. 다른 형태의 인간화 항체는 본래 항체에 대해 변형된 1개 이상의 CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 또는 CDR H3) (이들은 또한 본래 항체로부터의 1개 이상의 CDR"로부터 유래된" 1개 이상의 CDR로 지칭됨)을 갖는다.

본원에 사용된 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 및/또는 당업자에게 공지되거나 본원에 개시된 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체를 의미한다. 이러한 인간 항체의 정의는 하나 이상의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 하나 이상의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 이러한 한 예는 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다 (문헌 [Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581] 참조). 인간 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자좌가 내인성 유전자좌 대신에 트랜스제닉적으로 도입된 동물, 예를 들어 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스를 면역화시켜 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,545,807호; 동 제5,545,806호; 동 제5,569,825호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 및 동 제5,661,016호에 기재되어 있다. 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 인간 B 림프구를 불멸화시켜 제조할 수 있다 (이러한 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나 시험관내에서 면역화될 수 있다). 예를 들어, 문헌 [Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국 특허 제5,750,373호 참조.

본원에 사용된 용어 "IL-7R"은 IL-7R의 임의의 형태 및 IL-7R의 활성의 적어도 일부를 보유하는 그의 변이체를 지칭한다. 인간 IL-7R이라는 특정 언급과 같이 달리 나타내지 않는 한, IL-7R은 모든 포유동물 종, 예를 들어 인간, 개, 고양이, 말 및 소의 천연 서열 IL-7R을 포함한다.

본원에 사용된 "IL-7R 길항제"는 IL-7R 생물학적 활성 및/또는 IL-7R 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로(들), 예를 들어 IL-7에의 결합, STAT5, src 키나제, PI3 키나제 및 Pyk2의 인산화, 및 Bcl2 단백질의 상향조절을 억제할 수 있는 항체 또는 분자를 지칭한다. IL-7R 길항제의 예로는 길항제 IL-7R 항체, IL-7R siRNA, IL-7R shRNA 및 IL-7R 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

길항제 IL-7R 항체는 IL-7과의 상호작용 및/또는 IL-7에 대한 세포 반응의 유도와 같은 IL-7R 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로를 비롯한 IL-7R 생물학적 활성을 (유의한 정도를 포함한 임의의 정도로) 차단하거나, 길항작용하거나, 저해하거나, 감소시키는 항체를 포함한다. 본 발명의 목적상, 용어 "길항제 IL-7R 항체" ("IL-7R 길항제 항체," "길항제 항-IL-7R 항체" 또는 "항-IL-7R 길항제 항체"로 상호교환적으로 칭함)는, IL-7R 그 자체, IL-7R 생물학적 활성 (IL-7과의 상호작용, STAT5의 인산화의 임의의 측면을 매개하는 그의 능력, 포스파티딜이노시톨-3-키나제 (PI3K)-Akt 경로 활성화, p27^Kip1 하향조절, Bcl-2 상향조절, Rb 과인산화, 및 CXCR4 상향조절), 또는 생물학적 활성의 순서를 임의의 의미있는 정도로 실질적으로 무효화, 감소 또는 중립화시키는 상기 확인된 용어, 제목 및 기능성 상태 및 특징 모두를 포함한다고 명백히 이해될 것이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 IL-7R에 결합하여 IL-7과의 상호작용을 방지한다. 길항제 IL-7R 항체의 예가 본원에 제공된다.

본원에 사용된 "완전 길항제"는 유효한 농도에서 IL-7R의 측정가능한 효과를 본질적으로 완전히 차단하는 길항제이다. 부분 길항제는 측정가능한 효과를 부분적으로 차단할 수 있지만 최고의 농도에서도 완전 길항제는 아닌 길항제를 의미한다. 본질적으로 완전히란, 측정가능한 효과의 약 80％ 이상, 바람직하게는 약 90％ 이상, 더 바람직하게는 약 95％ 이상, 가장 바람직하게는 약 98％ 이상을 차단하는 것을 의미한다.

용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이, 바람직하게는 비교적 짧은 아미노산 (예를 들어, 10 내지 100개 아미노산)의 쇄를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/거나 비-아미노산에 의해 방해될 수 있다. 상기 용어들은 또한 천연으로 또는 개입에 의해; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 쇄를 포함한다. 또한, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 상기 정의에 포함된다. 폴리펩티드는 단일쇄 또는 관련쇄에 따라 생길 수 있다고 이해된다.

당업계에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호교환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 쇄를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 쇄에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 쇄의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 방해될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형으로는, 예를 들어 "caps", 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체에 의한 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 비하전된 결합 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)을 갖는 변형 및 하전된 결합 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 변형, 펜던트 모이어티, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 변형, 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 변형, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 변형, 알킬레이터를 함유하는 변형, 변형된 결합 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 변형, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형 형태가 포함된다. 또한, 당류에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기는 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 결합을 만들기 위해 활성화될 수 있거나, 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나, 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실은 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당류의 유사 형태, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르복실 당류 유사체, 알파- 또는 베타-아노머 당류, 에피머 당류, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당류, 푸라노스 당류, 세도헵툴로스, 아크릴 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보사이드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 다른 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이들 다른 연결기로는, 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (-O-) 결합을 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄킬임)에 의해 대체된 실시양태가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 비롯한 본원에 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역의 단독 또는 조합을 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역이라고도 알려진 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어져 있다. 각 쇄에서의 CDR은 FR에 의해 근접하게 함께 유지되며, 이때 다른 쇄로부터의 CDR은 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하는 기술이 적어도 두 가지 존재한다: (1) 교차-종 서열 변이성을 토대로 한 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 토대로 한 접근법 (문헌 [Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948]). 본원에 사용된 CDR은 어느 하나의 접근법 또는 두 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.

당업계에 공지된 바와 같이 항체의 "불변 영역"은 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역의 단독 또는 조합을 지칭한다.

본원에 사용된 항체는 본원 실시예 2에 개시된 방법에 의해 측정시 평형 해리 상수가 20 nM 이하, 바람직하게는 약 6 nM 미만, 더 바람직하게는 약 1 nM 미만, 가장 바람직하게는 약 0.2 nM 미만일 때 IL-7R과 "상호작용한다."

항체 또는 폴리펩티드에 "우선적으로 결합" 또는 "특이적으로 결합" (본원에서 상호교환적으로 사용됨)하는 에피토프는 당업계에서 널리 이해되는 용어이고, 상기 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한 당업계에 널리 알려져 있다. 분자는 다른 세포 또는 물질보다도 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 오랜 기간동안 및/또는 더 큰 친화도로 특정 세포 또는 물질과 반응하거나 연관되는 경우 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타낸다고 칭해진다. 항체는 다른 물질에 결합하는 경우보다 더 큰 친화도, 친화력(avidity)으로, 더 신속하게 및/또는 더 오랜 기간동안 결합하는 경우 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, IL-7R 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는, 다른 IL-7R 에피토프 또는 비-IL-7R 에피토프에 결합하는 경우보다 더 큰 친화도, 친화력으로, 더 신속하게 및/또는 더 오랜 기간동안 IL-7R 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한, 이러한 정의를 읽음으로써, 예를 들어 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합할 수 없다고 이해된다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수 있지만) 반드시 필요로 하지 않는다. 일반적으로, 반드시는 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.

본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 50％ 이상 순도 (즉, 오염물이 없음), 더 바람직하게는 90％ 이상 순도, 더 바람직하게는 95％ 이상 순도, 보다 더 바람직하게는 98％ 이상 순도, 가장 바람직하게는 99％ 이상 순도인 물질을 지칭한다.

"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)에 대해 수용자일 수 있거나 수용자인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 천연, 우연 또는 고의의 돌연변이로 인해 본래 모 세포에 대해 (모폴로지 또는 게놈 DNA 보체에서) 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)에 의해 생체내에서 형질감염된 세포를 포함한다.

당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 그의 카르복실 말단으로의 연장부를 정의한다. Fc 영역에서의 잔기의 넘버링은 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 영역인 CH2 및 CH3을 포함한다.

당업계에서 사용되는 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 다르게는 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92]; [Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34]; 및 [de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]에서 검토된다. "FcR"은 또한 엄마의 IgG를 태아에게 전달하는 역할을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 (문헌 [Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587] 및 [Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249]).

항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는 제1 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 제2 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하여, 제1 항체의 그의 동족 에피토프와의 결합의 결과가 제2 항체 부재시 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체 존재시에 검출가능하게 감소함을 의미한다. 또한 제2 항체의 그의 에피토프에 대한 결합이 제1 항체 존재시에 검출가능하게 감소하는 다른 경우도 해당될 수 있지만 그럴 필요는 없다. 즉, 제1 항체는, 제2 항체가 제1 항체의 그의 각 에피토프에 대한 결합을 억제함 없이 제2 항체의 그의 에피토프에 대한 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드와의 결합을 동일한 정도, 더 큰 정도 또는 더 작은 정도로 검출가능하게 억제하는 경우, 상기 항체는 그의 각 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "상호-경쟁한다"고 칭해진다. 경쟁 및 상호-경쟁 항체 둘 다 본 발명에 포함된다. 상기 경쟁 또는 상호-경쟁이 일어나는 메카니즘 (예를 들어, 입체적 장애, 구성 변화, 또는 통상의 에피토프나 이의 일부분에 대한 결합)에 관계없이, 당업자는 본원에 제공된 교시를 토대로 상기 경쟁 및/또는 상호-경쟁 항체가 포함되며 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있음을 이해할 것이다.

"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 이펙터(effector) 기능을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"으로는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향조절 등이 포함된다. 상기 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구하며, 상기 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 당업계에 공지된 다수의 검정을 사용하여 평가될 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이하지만 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 이펙터 기능을 보유하고 있는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교시 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 바람직하게는 약 80％ 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 약 90％ 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 95％ 이상, 약 96％ 이상, 약 97％ 이상, 약 98％ 이상, 약 99％ 이상의 서열 동일성을 가질 것이다.

본원에 사용된 "치료"는 유익한 또는 목적하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 글루코스 제거율의 향상, 혈액 글루코스 수준의 감소, 글루코스 내성의 개선, 제1형 또는 제2형 당뇨병으로 인한 고 혈액 글루코스 수준의 발병률 감소, 류마티스 관절염의 하나 이상의 증상의 발병률 감소 또는 개선, GVHD의 하나 이상의 증상의 발병률 감소 또는 개선, 루푸스의 하나 이상의 증상의 발병률 감소 또는 개선, 및 다발성 경화증의 하나 이상의 증상의 발병률 감소 또는 개선.

"발병률 감소"는 상기 상태에 일반적으로 사용되는 다른 약물 및/또는 치료법에 대한 필요성 및/또는 그의 양 (예를 들어, 그에 대한 노출)을 감소시키는 것을 포함할 수 있는 임의의 중증도 감소를 의미한다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 개체는 치료에 대한 그의 반응의 관점에서 변할 수 있으므로, 예를 들어 "발병률 감소 방법"은 투여로 인해 특정 개체에서의 발병률을 감소시킬 수 있을 것 같은 합리적인 예상을 토대로 IL-7R 길항제를 투여하는 것을 반영한다.

"개선"은 IL-7R 길항제를 투여하지 않았을 때와 비교하여 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선을 의미한다. "개선"은 또한 증상 지속기간의 단축 또는 감소를 포함한다.

본원에 사용된, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효한 용량" 또는 "유효량"은 임의의 하나 이상의 유익한 또는 목적하는 결과를 나타내기에 충분한 양이다. 예방 용도의 경우, 유익한 또는 목적하는 결과는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상, 그의 합병증 및 질환의 발생 동안 존재하는 중간의 병리학적 표현형을 비롯한, 질환의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 질환의 중증도를 경감시키거나, 질환의 개시를 지연시키는 것을 포함한다. 치료적 용도의 경우, 유익한 또는 목적하는 결과는 임상 결과, 예컨대 혈액 글루코스 수준의 감소, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 류마티스 관절염, GVHD, 루푸스 또는 다발성 경화증의 하나 이상의 증상의 발병률 감소 또는 개선, 질환을 치료하는데 필요한 다른 투약 용량의 감소, 또다른 투약 효과의 향상, 및/또는 환자의 질환 진행의 지연을 포함한다. 유효한 용량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효한 용량은 직접적으로 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 치료를 수행하기에 충분한 양이다. 임상 문맥에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효한 용량은 또다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 관련하여 달성될 수 있거나 달성될 수 없다. 따라서, "유효한 용량"은 하나 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 작용제는 하나 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우 유효량으로 제공된다고 고려될 수 있다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 또한 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 관련된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 생산자 세포와 같은 특정 진핵 세포가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된, "발현 대조군 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 대조군 서열은 프로모터, 예컨대 항시성 또는 유도성 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 발현 대조군 서열은 전사될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합될 때 그 성분이 생물학적 활성을 보유하도록 하며 대상체의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예로는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 유/수형 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 표준 (0.9％) 염수이다. 상기 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 전형적인 방법에 의해 제형화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조).

본원에 사용된 용어 "k_on"은 항체의 항원에의 결합에 대한 속도 상수를 지칭한다. 구체적으로, 속도 상수 (k_on 및 k_off) 및 평형 해리 상수는 Fab 항체 단편 (즉, 1가) 및 IL-7R을 사용하여 측정된다.

본원에 사용된 용어 "k_off"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 속도 상수를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "K_D"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.

본원에서 "약"의 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대해 지시된 실시양태를 포함한다 (및 기재한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 수치 범위는 그 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.

본원에서 언어 "포함하는"으로 기재된 어떠한 실시양태이든지, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 관점에서 기재된 다른 유사의 실시양태가 또한 제공된다고 이해된다.

본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬(Markush) 그룹 또는 다른 별법 그룹의 관점에서 기재되는 경우, 본 발명은 나열된 전체 그룹을 총체적으로 포함할 뿐만 아니라, 그룹의 각 구성원을 개별적으로 포함하고 주된 그룹의 모든 가능한 하위그룹을 포함하며, 또한 하나 이상의 그룹 구성원이 부재하는 주된 그룹을 포함한다. 본 발명은 또한 청구된 발명의 그룹 구성원 중 임의의 하나 이상을 명백히 배제하는 것을 구상한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 업계의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분쟁이 있는 경우, 정의를 비롯한 본 발명의 명세서가 제어할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함" 또는 변형어, 예컨대 "포함하다" 또는 "포함하는"은 임의의 다른 정수 또는 정수 그룹을 배제하는 것이 아니라 기재된 정수 또는 정수 그룹을 포함함을 암시한다고 이해될 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다.

예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한적임을 의도하지 않는다.

제2형 당뇨병, GVHD 및 자가면역 장애를 예방 또는 치료하는 방법

한 측면에서, 본 발명은 유효량의 IL-7R 길항제, 예를 들어 길항제 IL-7R 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 제2형 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 IL-7R 길항제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 자가면역 질환, 예컨대 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 루푸스 또는 다발성 경화증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 IL-7R 길항제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 GVHD를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제의 치료적 투여는 유리하게는 혈액 글루코스 수준을 낮추고 글루코스 내성을 개선시킨다. 다른 실시양태에서, IL-7R 길항제의 치료적 투여는 유리하게는 혈액 글루코스를 바람직한 수준으로 유지시킨다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제의 치료적 투여는 유리하게는, 예를 들어 관절 강직, 관절 종창, 관절 통증, 및 관절 발적 및 열감을 포함한 (이에 제한되지 않음) 류마티스 관절염의 하나 이상의 증상의 발병률을 감소시키고/거나 개선한다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제의 치료적 투여는 유리하게는, 예를 들어 피로, 열, 체중 감소, 체중 증가, 관절 통증, 관절 강직, 관절 종창, 뺨 홍반, 피부 병변, 입 상처, 코 궤양, 탈모, 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 호흡 단축, 가슴 통증, 안구 건조, 멍, 불안, 우울 및 기억 상실을 포함한 (이에 제한되지 않음) 루푸스의 하나 이상의 증상의 발병률을 감소시키고/거나 개선한다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제의 치료적 투여는 유리하게는, 예를 들어 사지 마비, 진전, 보행 곤란, 연하 곤란, 실명, 흐릿한 시야 및 근육 약화를 포함한 (이에 제한되지 않음) 다발성 경화증의 하나 이상의 증상의 발병률을 감소시키고/거나 개선한다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제의 치료적 투여는 유리하게는, 예를 들어 복부 통증, 복부 경련, 열, 황달, 피부 발진, 구토, 체중 감소, 안구 건조, 구강 건조, 탈모, 간염, 폐 장애 및 소화관 장애를 포함한 (이에 제한되지 않음) GVHD의 하나 이상의 증상의 발병률을 감소시키고/거나 개선한다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제의 치료적 투여는 유리하게는, 예를 들어 폐렴, 장염, 설사, 복부 통증, 복부 경련, 열, 황달, 오심, 구토, 간 손상, 피부 발진, 피부 손상, 점막 손상, 점막 멤브레인의 탈피, 위장관 손상, 체중 감소, 반구진성 발진, 상승된 빌리루빈 수준, 이환률 및 사망률을 포함한 (이에 제한되지 않음) 급성 GVHD의 하나 이상의 증상의 발병률을 감소시키고/거나 개선한다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제의 치료적 투여는 유리하게는, 예를 들어 안구 건조, 구강 건조, 탈모, 간염, 폐 장애, 소화관 장애, 피부 발진, 구강 궤양, 구강 위축, 손발톱이영양증, 건조 증후군, 경화증, 편평태선 유사 병변, 다형피부증, 식도웹, 근막염 및 폐쇄성 세기관지염, 및 간, 피부 및 점막, 연결 조직, 외분비선 및/또는 위장관에 대한 손상을 포함한 (이에 제한되지 않음) 만성 GVHD의 하나 이상의 증상의 발병률을 감소시키고/거나 개선한다.

낮은 혈액 글루코스 수준을 요하는 당뇨병성 개체는 예를 들어 길항제 IL-7R 항체와 같은 IL-7R 길항제로 치료될 수 있다. 항체 치료법에 적합한 개체는 당업계에 널리 공지된 당뇨병의 임상 기준 및 예후 지시자를 사용하여 선택된다. 공지된 예후 지시자, 예컨대 가족력, 공복 혈액 글루코스 수준 또는 감소된 글루코스 내성에 의해 평가된 당뇨병의 발생 위험이 있는 개체 또한 IL-7R 길항제의 투여가 정당화된다. 당업자는 당뇨병 또는 이상조절된 당 흡수를 갖는 개체를 진단하는 방법을 인식하거나 알 것이며, 질환의 정도 또는 중증도에 따라 항체를 투여하는 시기의 적절한 결정을 내릴 수 있고, 또한 가장 바람직한 투여 방식을 선택할 수 있다.

류마티스 관절염에 걸린 개체는 예를 들어 길항제 IL-7R 항체와 같은 IL-7R 길항제로 치료될 수 있다. IL-7R 길항제 치료법에 적합한 개체는 당업계에 널리 공지된 류마티스 관절염의 임상 기준 및 예후 지시자를 사용하여 선택된다. 류마티스 관절염의 진단 또는 평가는 당업계에 널리 확립되어 있다. 중증도의 평가는 당업계에 공지된 척도, 예컨대 류마티스 관절염 중증도 스케일 (RASS)을 기준으로 수행될 수 있다 (문헌 [Bardwell et al., Rheumatology, 2002, 41:38-45]). 몇몇 실시양태에서, 류마티스 관절염 및/또는 류마티스 관절염 증상을 개선하거나, 제어하거나, 그의 발병률을 감소시키거나, 그의 발생 또는 진행을 지연시키는 것이 RASS에 의해 측정된다.

루푸스에 걸린 개체는 예를 들어 길항제 IL-7R 항체와 같은 IL-7R 길항제로 치료될 수 있다. IL-7R 길항제 치료법에 적합한 개체는 당업계에 널리 공지된 루푸스의 임상 기준 및 예후 지시자를 사용하여 선택된다. 당업자는 루푸스에 걸린 개체를 진단하는 방법을 인식하거나 알 것이며, 질환의 정도 또는 중증도에 따라 IL-7R 길항제를 투여하는 시기의 적절한 결정을 내릴 수 있고, 또한 가장 바람직한 투여 방식을 선택할 수 있다.

다발성 경화증에 걸린 개체는 예를 들어 길항제 IL-7R 항체와 같은 IL-7R 길항제로 치료될 수 있다. IL-7R 길항제 치료법에 적합한 개체는 당업계에 널리 공지된 다발성 경화증의 임상 기준 및 예후 지시자를 사용하여 선택된다. 공지된 예후 지시자, 예컨대 가족력 또는 증상력에 의해 평가된 다발성 경화증의 발생 위험이 있는 개체 또한 IL-7R 길항제의 투여가 정당화된다. 당업자는 다발성 경화증에 걸린 개체를 진단하는 방법을 인식하거나 알 것이며, 질환의 정도 또는 중증도에 따라 IL-7R 길항제를 투여하는 시기의 적절한 결정을 내릴 수 있고, 또한 가장 바람직한 투여 방식을 선택할 수 있다.

GVHD에 걸린 개체는 예를 들어 길항제 IL-7R 항체와 같은 IL-7R 길항제로 치료될 수 있다. IL-7R 길항제 치료법에 적합한 개체는 당업계에 널리 공지된 GVHD의 임상 기준 및 예후 지시자를 사용하여 선택된다. GVHD의 진단 또는 평가는 당업계에 널리 확립되어 있다. GVHD에 대한 시험은 통상 증상에 좌우되지만, 생검 존재 또는 부재 하의 위장 내시경, 간 기능 시험 (AST, ALP, 및 빌리루빈 수준이 증가할 것임), 간 생검, 폐 x-선, 및/또는 피부 생검을 포함할 수 있다. 만성 GVHD의 진단을 확립하는데 충분한 특징은, 예를 들어 경화증, 편평태선 유사 병변, 다형피부증, 식도웹, 근막염 및 폐쇄성 세기관지염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 문헌 [Leet and Flowers, Hematology, January 2008; 2008:134-141] 참조). 급성 간 GVHD는 예를 들어 급성 환자에서 빌리루빈 수준에 의해 측정될 수 있다. 급성 피부 GVHD는 미만성 반구진성 발진을 초래할 수 있다. GVHD 중증도의 평가는 당업계에 공지된 척도를 기준으로 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, GVHD 및/또는 GVHD 증상을 개선하거나, 제어하거나, 그의 발병률을 감소시키거나, 그의 발생 또는 진행을 지연시키는 것은 전체 등급 (피부-간-장)으로 측정되며, 이때 각 기관은 최저 1에서 최고 4로 개별적으로 행해진다. 몇몇 실시양태에서, GVHD 및/또는 GVHD 증상을 개선하거나, 제어하거나, 그의 발병률을 감소시키거나, 그의 발생 또는 진행을 지연시키는 것은 체중을 모니터링함으로써 측정된다.

본원에 기재된 모든 방법과 관련하여, IL-7R 길항제에 대한 언급은 또한 하나 이상의 추가 작용제를 포함하는 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 당업계에 널리 공지된 적합한 부형제, 예컨대 완충제를 포함한 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로 또는 다른 전형적인 치료 방법과 조합되어 사용될 수 있다.

IL-7R 길항제는 임의의 적합한 경로를 통해 개체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 실시예는 제한적임을 의도하지 않으며 이용가능한 기술을 예시한 것임은 당업자에게 자명할 것이다.

그에 따라, 몇몇 실시양태에서 IL-7R 길항제는 공지된 방법에 따라서, 예컨대 정맥내 투여, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해 근육내, 복강내, 뇌척수액내, 경피, 피하, 관절내, 설하, 윤활액내, 통기를 통해, 척수강내, 경구로, 흡입 또는 외용 경로에 의해 개체에 투여된다. 투여는 전신, 예를 들어 정맥내 투여되거나, 또는 국소적일 수 있다. 제트 분무기 및 초음파 분무기를 비롯하여 액체 제형을 위해 시판되는 분무기가 투여를 위해 유용하다. 액체 제형은 직접적으로 분무될 수 있고, 동결건조된 분말은 재구성 후 분무될 수 있다. 별법으로, IL-7R 길항제는 플루오르화탄소 제형 및 계량식 투여 흡입기를 사용하여 에어로졸화 될 수 있거나, 또는 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.

한 실시양태에서, IL-7R 길항제는 부위-특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술을 통해서 투여된다. 부위-특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술의 예는 IL-7R 길항제의 다양한 이식가능한 데포 (depot) 공급원 또는 국소 전달 카테터, 예컨대 주입 카테터, 유치 (indwelling) 카테터, 또는 바늘 카테터, 합성 이식, 외막 랩(wrap), 션트 (shunt) 및 스텐트 (stent) 또는 다른 이식가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사, 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공보 제WO 00/53211호 및 미국 특허 제5,981,568호를 참조한다.

IL-7R 길항제의 다양한 제형은 투여를 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제는 그 자체로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제 및 제약상 허용되는 부형제는 다양한 제형 중에 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 약리학상 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 비교적 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 경도 (consistency)를 제공하거나, 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤화제 및 유화제, 삼투압 변화를 위한 염, 캡슐화제, 완충액, 및 피부 침투 증진제를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 비경구적 및 경구적 약물 전달을 위한 부형제 및 제형은 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]에 기재되어 있다.

몇몇 실시양태에서, 이들 작용제는 주사에 의한 (예를 들어, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등의) 투여를 위해 제형화된다. 그에 따라, 이들 작용제는 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특정한 용량 용법 (regimen), 즉 투여량, 시기 및 반복은 특정한 개체 및 개체의 의학적 히스토리에 따라 달라질 것이다.

IL-7R 길항제는 주사 (예를 들어, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등)를 비롯하여 임의의 적합한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. IL-7R 항체는 또한 본원에 기재된 바와 같이, 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, IL-7R 항체의 투여를 위해, 초기 후보물질 용량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적상, 전형적인 일일 용량은 상기 언급한 인자에 따라서 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg, 내지 100 mg/kg 또는 초과의 대략 임의의 범위일 수 있다. 예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 및 약 25 mg/kg의 용량이 사용될 수 있다. 상태에 따라서 몇 일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 치료는 예를 들어 혈액 글루코스 수준을 감소시키기 위해 증상의 목적하는 저해가 발생할 때까지 또는 충분한 치료적 수준이 달성될 때까지 지속된다. 예시적인 투여 용법은 약 2 mg/kg의 초기 투여량에 이어서, 약 1 mg/kg의 IL-7R 항체의 매주 지속 투여량, 또는 이어서 약 1 mg/kg의 매 다른 주마다 지속 투여량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 의사가 달성하기 원하는 약역학 쇠퇘의 패턴에 따라서 다른 용량 용법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 일주일에 1 내지 4회의 투여가 예상된다. 다른 실시양태에서, 한달에 한 번 투여, 또는 1개월 마다 또는 3개월 마다 한 번이 예상된다. 이 치료법의 진행은 전형적인 기술 및 검정에 의해서 쉽게 모니터링된다. (사용된 IL-7R 길항제(들)을 포함하여) 투여 용법은 시간에 따라서 다양할 수 있다.

본 발명의 목적상, IL-7R 길항제의 적절한 용량은 사용된 IL-7R 길항제 (또는 그의 조성물), 치료될 증상의 유형 및 중증도에 따라 달라질 것이고, 작용제는 예방적 또는 치료적 목적, 이전 치료법, 환자의 임상 히스토리 및 작용제에 대한 반응, 투여된 작용제에 대한 환자의 제거율, 및 담당 의사의 재량에 따라서 투여된다. 전형적으로 임상의는 목적하는 결과가 달성되는 용량에 도달할 때까지 IL-7R 길항제를 투여할 것이다. 투여량 및/또는 빈도는 치료 과정에 따라 다양할 수 있다. 실험적 고려, 예컨대 반감기는 일반적으로 용량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체와 상용성인 항체는, 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 예방하는데 사용될 수 있다. 투여 빈도는 치료 과정에 따라 결정되고 조정될 수 있고, 일반적으로, 예를 들어 높은 혈액 글루코스 수준, 관절 통증 등의 치료 및/또는 저해 및/또는 개선 및/또는 지연에 따라 다르지만 반드시 그렇지만은 않다. 별법으로, 길항제 IL-7R 항체의 지속된 연속 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속된 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.

한 실시양태에서, IL-7R 길항제에 대한 용량은 IL-7R 길항제의 하나 이상의 투여(들)이 주어진 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 개체는 IL-7R 길항제의 증가 용량을 받는다. 효능을 평가하기 위해, 질환의 지시자가 뒤따를 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 IL-7R 길항제의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리적 상태, 투여의 목적이 치료적인지 예방적인지 여부, 숙련된 의사에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. IL-7R 길항제의 투여는 본질적으로 사전선택된 시간의 기간에 걸쳐 연속적일 수 있거나, 또는 일련의 간격을 둔 투여일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 1개 초과의 IL-7R 길항제가 존재할 수 있다. 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상, 다섯 이상 또는 그 이상의 다른 IL-7R 길항제가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이들 IL-7R 길항제는 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완적인 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 하기 IL-7R 길항제의 하나 이상이 사용될 수 있다: 길항제 IL-7R 항체, IL-7R에 지시된 안티센스 분자 (IL-7R을 코딩하는 핵산에 지시된 안티센스 분자를 포함함), IL-7R 억제 화합물, 및 IL-7R 구조 유사체. IL-7R 길항제는 또한 작용제의 효과를 향상 및/또는 보완하는데 도움을 주는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 IL-7R 길항제의 치료적 제형은 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체와 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합하여 저장을 위해 제조된다 (문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 염, 예컨대 염화 나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤즈알코늄, 염화 벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)^TM, 플루로닉스(PLURONICS)^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.

IL-7R 길항제를 함유하는 리포솜은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030, 1980]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재된 방법에 의해서 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포솜은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 특별히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로의 역상 증발 방법에 의해서 생성될 수 있다. 리포솜은 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 목적하는 지름을 갖는 리포솜을 얻는다.

활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중, 예를 들어 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포집될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]에 개시되어 있다.

지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 (여기서 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재함)를 포함한다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 '폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)^TM (젖산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균되어야 한다. 이는 예를 들어, 멸균 여과 막을 통과하는 여과에 의해 손쉽게 완수된다. 치료적 IL-7R 길항제 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 바이알로 배치된다.

본 발명에 따른 조성물은 단위 용량 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제로, 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 통기를 통해 투여될 수 있다.

고체 조성물, 예컨대 정제를 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 제약상 담체, 예를 들어 전형적인 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산 이칼슘 또는 검, 및 다른 제약상 희석제, 예를 들어 물과 혼합하여 본 발명의 화합물의 동종 혼합물 또는 그의 무독성 제약상 허용되는 염을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성한다. 이들 예비제형 조성물을 동종으로 지칭하는 경우, 조성물이 동등하게 유효 단위 용량 형태, 예컨대 정제, 환제 및 캡슐로 손쉽게 세분될 수 있도록 활성 성분이 조성물 전체에 걸쳐 균등하게 분산되는 것을 의미한다. 이 고체 예비제형 조성물은 그 후, 본 발명의 활성 성분 0.1 내지 약 500 mg을 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 용량 형태로 세분된다. 신규 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나, 그렇지 않으면 배합되어 연장된 작용의 이점을 제공하는 용량 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 용량 및 외부 용량 성분을 포함할 수 있고, 후자는 전자를 감싸는 형태로 존재한다. 2개의 성분은 위에서의 붕해에 저항하는데 도움을 주고, 내부 성분이 십이지장으로 손상 없이 통과하게 허용하거나 또는 방출이 지연되게 하는 장용층에 의해서 분리될 수 있다. 다양한 물질이 상기 장용층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 상기 물질은 많은 수의 중합체 산 및 중합체 산과 셀락(shellac), 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 상기 물질의 혼합물을 포함한다.

적합한 표면-활성제는 특히, 비이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어 트윈(Tween)^TM 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어 스판(Span)^TM 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5％ 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5％일 수 있다. 필요한 경우, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

적합한 에멀젼은 시판되는 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)^TM, 리포신(Liposyn)^TM, 인포뉴트롤(Infonutrol)^TM, 리포푼딘(Lipofundin)^TM 및 리피파이산(Lipiphysan)^TM을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리-혼합된 에멀젼 조성물 중 용해될 수 있거나, 또는 별법으로 오일 (예를 들어 대두유, 홍화유, 목화씨유, 참깨유, 옥수수유 또는 아몬드유) 및 인지질 (예를 들어 난(egg) 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합하여 형성된 에멀젼 중에서 용해될 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가되어 에멀젼의 강성을 조정할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 20％ 이하의 오일, 예를 들어 5 내지 20％ 오일을 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 μm, 특정하게는 0.1 내지 0.5 μm의 지방 액적을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0의 범위의 pH를 갖는다.

에멀젼 조성물은 IL-7R 길항제를 인트라리피드(Intralipid)^TM 또는 그의 성분 (대두유, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합하여 제조될 수 있다.

흡입 또는 통기를 위한 조성물은 제약상 허용되는 수성 또는 유기 용매, 또는 그의 혼합물 중 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 기재된 바와 같이 적합한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구로 또는 코 호흡 경로로 투여된다. 바람직하게는 멸균된 제약상 허용되는 용매 중 조성물은 기체를 사용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나, 또는 분무 장치는 안면 마스크, 텐트 또는 간헐적인 양압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구로 또는 코로 투여될 수 있다.

IL-7R 길항제

본 발명의 방법은 IL-7R 신호전달에 의해 매개된 하류 경로, 예를 들어 IL-7R에 대한 세포의 반응의 유도를 비롯하여 IL-7R 생물학적 활성을 차단하고, 저해하거나 또는 감소시키는 (상당히 감소시키는 것 포함) 임의의 단백질, 펩티드 또는 핵산 분자를 지칭하는 IL-7R 길항제를 사용한다. IL-7R 길항제의 예는 길항제 IL-7R 항체, IL-7R siRNA, IL-7R shRNA, 및 IL-7R 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.

IL-7R 길항제는 임의의 하나 이상의 하기 특징을 나타내야 한다: (a) IL-7R에 결합; (b) IL-7과 IL-7R의 상호작용 차단; (c) IL-7-매개 STAT5 인산화 차단 또는 감소; (d) 생체내 혈액 글루코스 수준 감소; (e) 생체내 글루코스 내성 증가; (f) 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)의 질환 중증도 감소; (g) PI3K 인산화 차단 또는 감소; (h) AKT 인산화 차단 또는 감소; 및 (i) 다른 확인될 인자와 IL-7R과의 상호작용 차단.

몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제는 길항제 IL-7R 항체이다. 본 발명의 목적상, 길항제 IL-7R 항체는 바람직하게는 IL-7R 신호전달 기능 및 IL-7 상호작용을 억제하는 방식으로 IL-7Rα와 반응한다. 몇몇 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 특이적으로 영장류 IL-7R을 인식한다. 몇몇 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 영장류 및 설치류 IL-7R과 결합한다.

본 발명에 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메릭 항체, 이중특이적 항체, 이종접합 항체, 단일쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 부분 (예를 들어, 도메인 항체)을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열, 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간 또는 임의의 다른 기원 (키메릭 또는 인간화 항체를 포함)일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 모노클로날 항체이다. 길항제 IL-7R 항체는 또한 인간화될 수 있다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간이다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 면역 반응을 유발하는 증가된 잠재성을 갖는 불변 영역 (이에 제한되지 않음)을 포함한다. 예를 들어, 불변 영역은 Fc 감마 수용체, 예를 들어 FcγRI 또는 FcγRIIA에 대한 증가된 친화도를 갖도록 변형될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 면역적으로 불활성인, 즉 면역 반응을 유발하기 위한 감소된 잠재성을 갖는 불변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; PCT 출원 제PCT/GB99/01441호; 및/또는 UK 특허 출원 제9809951.8호에 기재된 바와 같이 변형된다. Fc는 인간 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4일 수 있다. Fc는 돌연변이 A330P331 내지 S330S331 (IgG2Δa)을 함유하는 인간 IgG2일 수 있고, 아미노산 잔기는 야생형 IgG2 서열을 참고로 넘버링되어 있다. 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]. 몇몇 실시양태에서, 항체는 하기 돌연변이 E233F234L235 내지 P233V234A235 (IgG4Δc)를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함하고 (문헌 [Armour et al., 2003, Molecular Immunology 40 585-593]), 넘버링은 야생형 IgG4를 참고한다. 또다른 실시양태에서, Fc는 결실 G236 (IgG4Δb)을 갖는 인간 IgG4 E233F234L235 내지 P233V234A235이다. 또다른 실시양태에서, Fc는 힌지 안정화 돌연변이 S228 내지 P228을 함유하는 임의의 인간 IgG4 Fc (IgG4, IgG4Δb 또는 IgG4Δc)이다 (문헌 [Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9-19]). 또다른 실시양태에서, Fc는 비글리코실화된 Fc일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 불변 영역은 불변 영역 중 글리코실화 인식 서열의 일부인 올리고당 부착 잔기 (예컨대 Asn297) 및/또는 플랭킹 (flanking) 잔기를 돌연변이 시켜 비글리코실화된다. 몇몇 실시양태에서, 불변 영역은 효소적으로 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화된다. 불변 영역은 효소적으로 또는 글리코실화 결핍숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화 될 수 있다.

IL-7R (예컨대 인간 IL-7R)에 대한 길항제 IL-7R 항체의 결합 친화도 (K_D)는 약 0.002 내지 약 200 nM일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합 친화도는 임의로 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM이다. 몇몇 실시양태에서, 결합 친화도는 임의로 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM 보다 적다.

IL-7R에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는 한가지 방법은 항체의 단일기능성 Fab 단편의 결합 친화도를 측정하는 것이다. 단일기능성 Fab 단편을 얻기 위해, 항체 (예를 들어, IgG)는 파파인으로 절단되거나 또는 재조합적으로 발현될 수 있다. 항체의 IL-7R Fab 단편의 친화도는 HBS-EP 러닝 완충액 (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ v/v 계면활성제 P20)을 사용하는 예비-고정된 스트렙타비딘 센서 칩 (SA)이 장착된 표면 플라스몬 공명 (비아코어(Biacore)™3000™ 표면 플라스몬 공명 (SPR) 시스템, 비아코어™, INC, 피스카타웨이 NJ)에 의해 결정될 수 있다. 바이오티닐화된 인간 IL-7R (또는 임의의 다른 IL-7R)은 0.5 μg/mL 미만의 농도로 HBS-EP 완충액으로 희석될 수 있고, 가변 접촉 시간을 사용하는 개별 칩 채널을 따라 주사되어 상세한 역학적 연구를 위한 50-200 반응 단위 (RU) 또는 스크리닝 검정을 위한 800-1,000 RU의 두 가지 항원 밀도의 범위를 달성한다. 재생 연구는 200 주사에 걸쳐 칩 상에서 IL-7R의 활성을 유지하면서 25％ v/v 에탄올 중 25 mM NaOH가 결합 Fab를 효과적으로 제거하는 것을 나타냈다. 전형적으로, 정제된 Fab 샘플의 계열 희석 (0.1-10x 추정된 K_D의 스패닝(spanning) 농도)은 100 μL/분에서 1분 동안 주사되고, 2시간 이하의 해리 시간이 허용된다. Fab 단백질의 농도는 표준으로서 공지된 농도의 Fab (아미노산 분석에 의해 결정됨)를 사용하는 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 결정된다. 역학적 결합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off)는 비아이밸류에이션 (BIAevaluation) 프로그램을 사용하여 1:1 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델에 전체적으로 데이터를 피팅 (fitting)하여 동시에 수득된다 (문헌 [Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110]). 평형 해리 상수 (K_D) 값은 k_off/k_on으로서 계산된다. 이 프로토콜은 인간 IL-7R, 또다른 포유동물의 IL-7R (예컨대 마우스 IL-7R, 래트 IL-7R, 영장류 IL-7R) 및 상이한 형태의 IL-7R을 비롯하여 임의의 IL-7R에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는데 사용하기 위해 적합하다. 항체의 결합 친화도는 일반적으로 25℃에서 측정되지만, 37℃에서도 또한 측정될 수 있다.

길항제 IL-7R 항체는 실시예 1에 제공된 것과 같은 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 하이브리도마 세포주의 생산을 위해, 숙주 동물의 면역화 경로 및 스케쥴은 일반적으로 본원에 추가로 기재한 바와 같이 항체 자극 및 생산을 위한 확립된 기술 및 전형적인 기술로 유지된다. 인간 및 마우스 항체의 생산을 위한 일반 기술이 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다.

인간을 비롯한 임의의 포유동물 대상체 또는 그로부터의 항체 생산 세포가 인간을 비롯한 포유동물, 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기반으로서 제공하기 위해 조작될 수 있다는 것이 예상된다. 전형적으로, 숙주 동물은 본원에 기재된 바를 포함하여 많은 면역원과 함께 복강내로, 근육내로, 경구로, 피하로, 발바닥내, 및/또는 피내로 접종된다.

하이브리도마는 문헌 [Kohler, B. and Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497]의 일반 체세포 하이브리드화 기술을 사용하거나 또는 문헌 [Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982]에 의해 변형된 바와 같이 림프구 및 불멸화된 골수 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 미국 칼리프 샌 디에고 셀 디스트리뷰션 센터 솔크 인스티튜트 (the Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA)로부터의 골수종 세포주 (이들로만 제한되지는 않음)을 비롯한, 이용가능한 골수종 세포주가 하이브리드화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 기술은 융합제 (fusogen), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하거나, 또는 당업자에게 잘 알려진 전기적 수단에 의해 융합 골수종 세포 및 림프구 세포를 포함한다. 융합 후, 세포는 융합 배지로부터 분리되고, 선택적 성장 배지, 예컨대 히포크산틴-아미놉테린-티미딘 (HAT) 배지 중 성장시켜, 비하이브리드화된 모 세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 또는 보충되지 않은, 본원에 기재된 임의의 배지는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는데 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또다른 별법으로서, EBV 불멸화된 B 세포는 본 발명의 IL-7R 모노클로날 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마는 확대되고, 서브클론되고, 필요한 경우, 상등액은 전형적인 면역검정 절차에 의해 항-면역원 활성에 대해 검정된다 (예를 들어, 방사성면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광 면역검정).

항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 IL-7R에 대해 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 일부분을 생산하는 모 하이브리도마의 자손 세포인 모든 유도체를 포함한다.

그러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 성장할 수 있다. 모노클로날 항체는 필요한 경우, 전형적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 황산 암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 존재하는 경우, 목적하지 않는 활성은 고체 상에 부착된 면역원으로 제조된 흡착제 상에서 제제를 영동시키고, 면역원으로부터 목적하는 항체를 용출하거나 방출하여 제거될 수 있다. 인간 IL-7Rα로, 또는 면역화될 종들에서 면역성인 단백질에 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편, 예를 들어, 이중기능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서 R 및 R¹은 상이한 알킬기임)을 사용하는, 키홀 림펫 헤모사이아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 (thyroglobulin), 또는 대두 트립신 억제제로 숙주 동물을 면역화시켜 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 집단을 수득할 수 있다.

필요한 경우, 관심 길항제 IL-7R 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)는 서열분석될 수 있고, 폴리뉴클레오티드 서열은 그 후, 발현 또는 증식을 위해 벡터로 클로닝될 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 중 벡터에서 유지될 수 있고, 숙주 세포는 그 후, 나중의 사용을 위해 증대 및 냉동될 수 있다. 세포 배양 중 재조합 모노클로날 항체의 생산은 당업계에 공지된 수단에 의해서 B 세포로부터 항체 유전자의 클로닝을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Tiller et al., 2008, J. Immunol. Methods 329, 112]; US 특허 제7,314,622호를 참조한다.

별법으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"하거나 또는 친화도 또는 항체의 다른 특징을 개선하기 위한 유전적 조작을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체가 임상 시험 및 인간의 치료에 사용되는 경우, 불변 영역은 더욱 더 유사한 인간 불변 영역으로 조작되어 면역 반응을 피할 수 있다. IL-7R에 대한 더 큰 친화도 및 IL-7R 억제에 있어서의 더 큰 효능을 수득하기 위해 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 길항제 IL-7R 항체에 대해 만들어질 수 있고, IL-7R에 대한 그의 결합 능력이 여전히 유지된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

모노클로날 항체를 인간화하기 위한 네 가지 일반적인 단계가 존재한다. 이것은 하기와 같다: (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 예상된 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 결정 (2) 인간화 항체 고안, 즉 인간화 과정 동안 사용하기 위한 항체 프레임워크 영역 결정 (3) 실제 인간화 방법론/기술 및 (4) 인간화 항체의 발현 및 형질감염. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 제5,807,715호; 제5,866,692호; 제6,331,415호; 제5,530,101호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,585,089호; 및 제6,180,370호를 참조한다.

설치류 또는 변형된 설치류 V 영역 및 인간 불변 영역에 융합된 그들의 연관 CDR을 갖는 키메릭 항체를 비롯하여, 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위를 포함하는 많은 수의 "인간화된" 항체 분자가 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Winter et al. Nature 349:293-299, 1991, Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224, 1989, Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538, 1987] 및 [Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583, 1987]을 참조한다. 다른 참고문헌은 적절한 인간 항체 불변 영역과의 융합 전 인간 지지 프레임워크 영역 (FR)으로 그라프팅된 설치류 CDR을 기재한다. 예를 들어, 문헌 [Riechmann et al. Nature 332:323-327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536, 1988] 및 [Jones et al. Nature 321:522-525, 1986]을 참조한다. 또다른 참고문헌은 재조합적으로 조작된 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지된 설치류 CDR을 기재한다. 예를 들어, 유럽 특허 공보 제0519596호를 참조한다. 이들 "인간화" 분자는 인간 수용자에서 이들 모이어티의 치료적 적용의 지속기간 및 효과를 제한하는 설치류 항-인간 항체 분자에 대해 원하지 않는 면역학적 반응을 최소화하도록 고안된다. 예를 들어, 항체 불변 영역은 면역적으로 불활성이도록 (예를 들어, 보체 용균을 촉발시키지 않음) 조작될 수 있다. 예를 들어 PCT 공보 제PCT/GB99/01441호; UK 특허 출원 제9809951.8호를 참조한다. 또한 이용될 수 있는 인간화 항체의 다른 방법이 문헌 [Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, 1991], 및 미국 특허 제6,180,377호; 제6,054,297호; 제5,997,867호; 제5,866,692호; 제6,210,671호; 및 제6,350,861호; 및 PCT 공보 제WO 01/27160호에 개시되어 있다.

비록 상기 논의가 인간화 항체와 관련될지라도, 논의된 일반적인 원리는, 예를 들어 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에 사용하기 위한 항체를 최적화시키는데 적용가능하다는 것이 명백하다. 본원에 기재된 항체를 인간화하는 하나 이상의 측면이, 예를 들어 CDR 그라프팅, 프레임워크 돌연변이 및 CDR 돌연변이와 조합될 수 있다는 것이 또한 명백하다.

또다른 별법에서, 완전 인간 항체는 특이적 인간 이뮤노글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 시판용 마우스를 사용하여 수득될 수 있다. 더 바람직한 (예를 들어, 완전한 인간 항체) 또는 더 강한 면역 반응을 생성하도록 고안된 트랜스제닉 동물은 또한 인간화 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 그러한 기술의 예는 아브게닉스, 인크. (Abgenix, Inc.) (Fremont, CA)의 제노마우스(Xenomouse)™ 및 메다렉스, 인크. (Medarex, Inc.) (Princeton, NJ)의 HuMAb-Mouse® 및 티씨 마우스(TC Mouse)™이다.

별법으로, 항체는 재조합적으로 제조될 수 있고, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 발현될 수 있다. 또다른 별법으로, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 문헌 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994]를 참조한다. 별법으로, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990])은 비면역화된 공여자로부터 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 뼈대 내 (in-frame) 섬유질의 박테리오파지의 주요 또는 비주요 코팅 단백질 유전자, 예컨대 M13 또는 fd로 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이된다. 섬유질의 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능성 특성에 기초한 선택은 또한 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 야기한다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부처럼 보인다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고; 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993]을 참조한다. V-유전자 절편의 몇몇 공급원은 파지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합의 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리시킨다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 항원 (셀프-항원을 포함함)의 다양한 배열에 대한 항체는 문헌 [Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991], 또는 문헌 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993]에 의해 기재된 기술에 따라 본질적으로 단리될 수 있다. 자연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율에서 돌연변이를 축적한다 (신체의 과잉돌연변이). 도입된 변화의 일부는 더 높은 친화도를 부여할 것이고, 높은-친화도 표면 이뮤노글로불린을 디스플레이하는 B 세포는 우선적으로 복제되고, 후속 항원 챌린지 동안 분화된다. 이 자연적인 방법은 "체인 셔플링"으로 공지된 기술을 이용하여 모방될 수 있다 (문헌 [Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992]). 이 방법으로, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "주요" 인간 항체의 친화도는 비면역화된 공여자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체 (레퍼토리)의 레퍼토리를 갖는 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 순차적으로 대체하여 개선될 수 있다. 이 기술은 pM-nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 허용한다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리 ("모든 라이브러리의 모체 (the mother-of-all libraries)"로도 공지됨)를 제조하기 위한 전략은 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993]에 기재되어 있다. 유전자 셔플링은 또한 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발 설치류 항체에 대해 유사한 친화도 및 특이성을 가진다. "에피토프 각인"으로도 지칭되는 이 방법에 따라, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자는 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되고, 설치류-인간 키메라를 생성한다. 항원 상에서의 선택은 기능성 항원-결합 부위를 회복시킬 수 있는 인간 가변 영역의 단리를 야기하고, 즉, 에피토프는 파트너의 선택을 지배 (각인)한다. 남아있는 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 방법이 반복되는 경우, 인간 항체가 수득된다 (PCT 공보 제WO 93/06213호 참조). CDR 그라프팅에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와 달리, 이 기술은 설치류 기원의 CDR 잔기 또는 프레임워크를 갖지 않는 인간 항체를 완전하게 제공한다.

항체는 먼저 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생산 세포를 단리시키고, 유전자 서열을 수득하고, 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 재조합적으로 항체를 발현시켜 재조합적으로 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 또다른 방법은 식물 (예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 밀크에서 항체 서열을 발현하는 것이다. 식물 또는 밀크에서 재조합적으로 항체를 발현하기 위한 방법이 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001; Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995] 및 [Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999]를 참조한다. 항체의 유도체 (예를 들어, 인간화, 단일쇄 등)를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

면역검정 및 유동 세포계산 분류 기술, 예컨대 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)는 또한 IL-7R에 대해 특이적인 항체를 단리하기 위해 사용될 수 있다.

항체는 많은 상이한 담체에 결합될 수 있다. 담체는 활성 및/또는 불활성일 수 있다. 잘 알려진 담체의 예는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 글라스, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철석을 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적상 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자는 결합 항체에 대해 다른 적합한 담체를 알 것이거나, 또는 일상적인 실험을 사용하여 그를 확인할 수 있을 것이다. 몇몇 실시양태에서, 담체는 심근을 표적으로 하는 모이어티를 포함한다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 전형적인 절차 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합이 가능한 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여)를 사용하여 손쉽게 단리되고, 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 단리된 경우, DNA는 발현 벡터 (예컨대, PCT 공보 제WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터)로 배치될 수 있고, 그 후 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 예를 들어, PCT 공보 제WO 87/04462호를 참조한다. DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 코딩 서열을 대체하거나 (문헌 [Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984]) 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 대해 공유결합적으로 연결하여 변형될 수 있다. 그러한 방식으로, 본원의 IL-7R 모노클로날 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메릭" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

길항제 IL-7R 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 확인되거나 또는 특징지어질 수 있고, 여기서 IL-7R 생물학적 활성의 감소, 개선 또는 중화가 검출되고/되거나 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 후보제를 IL-7R과 함께 인큐베이션하고, 결합 및/또는 IL-7R의 생물학적 활성의 수반되는 감소 또는 중화를 모니터링하여 확인된다. 결합 검정은 정제된 IL-7R 폴리펩티드(들) 또는 IL-7R 폴리펩티드(들)을 천연적으로 발현시키거나 발현시키도록 형질감염된 세포로 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 검정은 경쟁적인 결합 검정이고, 여기서 IL-7R 결합에 대해 공지된 IL-7R 길항제와 경쟁하는 후보 항체의 능력이 평가된다. 검정은 ELISA 포맷을 비롯하여 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 후보제를 IL-7R과 함께 인큐베이션하고, 결합 및 STAT5 인산화의 수반되는 억제를 모니터링하여 확인된다.

초기 확인에 이어서, 후보 길항제 IL-7R 항체의 활성은 표적 생물학적 활성을 시험하는 것으로 공지된 생물검정에 의해 추가로 확인되고 정제될 수 있다. 별법으로, 생물검정은 직접적으로 후보물질을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 길항제 IL-7R 항체를 확인하고 특징짓는 방법의 일부가 실시예에 상세하게 기재되어 있다.

길항제 IL-7R 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 한가지 방법은 그것이 결합하는 에피토프 또는 "에피토프 맵핑 (mapping)"을 확인하는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조의 해결, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기초 검정을 비롯하여 단백질 상에서 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징짓기 위해 공지된 많은 방법이 존재한다. 추가의 예로, 에피토프 맵핑은 길항제 IL-7R 항체가 결합하는 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들어, 펩스캔 시스템즈 (Pepscan Systems) (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands)로부터 시판된다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 연장부 중 함유될 수 있는 것이거나 또는 단일 연장부 중 반드시 함유될 필요는 없는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 구조적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 4-6개 이상의 아미노산 길이)는 단리되거나 합성될 수 있고 (예를 들어, 재조합적으로), 길항제 IL-7R 항체와의 결합 검정을 위해 사용될 수 있다. 또다른 예로, 길항제 IL-7R 항체가 결합하는 에피토프는 IL-7R 서열로부터 유래된 오버랩핑 (overlapping) 펩티드를 사용하고, 길항제 IL-7R 항체에 의한 결합을 결정하여 체계적인 스크리닝으로 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따라서, IL-7R을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 랜덤하게 또는 특이적 유전자 구축물에 의해 단편화되고, IL-7R의 발현된 단편의 시험될 항체와의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은, 예를 들어 PCR에 의해서 생산될 수 있고, 그 후 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관내에서 단백질로 전사되고 번역될 수 있다. 방사성 표지된 IL-7R 단편에의 항체의 결합은 그 후, 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 또한 파지 입자의 표면상에 디스플레이된 랜덤 펩티드 서열의 큰 라이브러리 (파지 라이브러리)를 사용하여 확인될 수 있다. 별법으로, 오버랩핑 펩티드 단편의 한정된 라이브러리는 단순 결합 검정에서 시험 항체에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가의 예로, 항원 결합 도메인의 돌연변이생성, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이생성은 에피토프 결합을 위해 충분하고/하거나 필요한, 목적 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 도메인 스와핑 실험은 돌연변이체 IL-7R을 사용하여 수행될 수 있고, IL-7R 폴리펩티드의 다양한 단편은 또다른 종으로부터의 IL-7R, 또는 밀접하게 관련되지만 항원과 관련하여 별개의 단백질 (예컨대, 전구단백질 전환효소 패밀리의 또다른 구성원)로부터의 서열로 대체 (스와핑) 된다. 돌연변이체 IL-7R에 대한 항체의 결합을 평가하여, 항체 결합에 대한 특정 IL-7R 단편의 중요도가 평가될 수 있다.

길항제 IL-7R 항체를 특징짓는데 사용될 수 있는 또다른 방법은, 동일한 항원, 즉, IL-7R 상의 다양한 단편에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체와의 경쟁 검정을 사용하여, 길항제 IL-7R 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 결정하는 것이다. 경쟁 검정은 당업자에게 잘 알려져 있다.

발현 벡터는 길항제 IL-7R 항체의 직접 발현에 사용될 수 있다. 당업자는 생체내 외인성 단백질의 발현을 얻기 위한 발현 벡터의 투여에 대해 친숙하다. 예를 들어, 미국 특허 제6,436,908호; 제6,413,942호; 및 제6,376,471호를 참조한다. 발현 벡터의 투여는 주사, 경구 투여, 입자 총(gun) 또는 카테터화 투여 및 외용 투여를 비롯하여 국소 또는 전신 투여를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감신경줄기 또는 결절종으로, 또는 심장 동맥, 심방, 심실, 또는 심막으로 직접 투여된다.

발현 벡터를 함유하는 치료적 조성물의 표적 전달 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드가 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은, 예컨대 문헌 [Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 1988, 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:338]에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료적 조성물은 유전자 치료법 프로토콜 중 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 범위의 DNA로 투여된다. 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg의 농도 범위의 DNA가 또한 유전자 치료법 프로토콜 동안 사용될 수 있다. 치료적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51; Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845; Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185; and Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148]을 참조). 그러한 코딩 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성되거나 조절될 수 있다.

목적하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 목적하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스성-기초 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 바이러스성-기초 비히클은 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공보 제WO 90/07936호; 제WO 94/03622호; 제WO 93/25698호; 제WO 93/25234호; 제WO 93/11230호; 제WO 93/10218호; 제WO 91/02805호; 미국 특허 제5, 219,740호 및 제4,777,127호; GB 특허 제2,200,651호; 및 EP 특허 제0 345 242호 참조), 알파바이러스-기초 벡터 (예를 들어, 신드비스 (Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키 삼림열 (Semliki forest) 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 강 (Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공보 제WO 94/12649호, 제WO 93/03769호; 제WO 93/19191호; 제WO 94/28938호; 제WO 95/11984호 및 제95/00655호 참조)를 포함하지만 이들로만 제한되지는 않는다. 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147]에 기재된 바와 같은, 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.

비-바이러스성 전달 비히클 및 방법이 또한, 단독으로 사멸된 아데노바이러스에 연결되거나 연결되지 않은 다가양이온성 축합 DNA (예를 들어, 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147] 참조); 리간드-연결된 DNA (예를 들어, 문헌 [Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985] 참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 제5,814,482호; PCT 공보 제WO 95/07994호; 제WO 96/17072호; 제WO 95/30763호; 및 제WO 97/42338호 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합(이들을 포함하지만 이들로만 제한되지는 않음)이 사용될 수 있다. 네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법이 PCT 공보 제WO 90/11092호 및 미국 특허 제5,580,859호에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜이 미국 특허 제5,422,120호; PCT 공보 제WO 95/13796호; 제WO 94/23697호; 제WO 91/14445호; 및 EP 제0524968호에 기재되어 있다. 추가의 접근법이 문헌 [Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411], 및 [Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581]에 기재되어 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재되거나 본원에 기재된 방법에 의해 제조되고, 본원에 기재된 특징을 갖는 항체를 포함하는, 제약 조성물을 비롯한 조성물을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 IL-7R과 IL-7 및/또는 하나 이상의 이들 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 상호작용을 길항작용하는 하나 이상의 항체를 포함한다. 이들 조성물은 당업계에 잘 알려진 완충액을 비롯한 적합한 부형제, 예컨대 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 길항제 IL-7R 항체는 임의의 (하나 이상의) 하기 특징에 의해 특징지어진다: (a) IL-7R에 결합; (b) IL-7R과 IL-7과의 상호작용 차단; (c) IL-7-매개된 STAT5 인산화 차단 또는 감소; (d) 생체내 혈액 글루코스 수준 감소; (e) 생체내 글루코스 내성 개선; 및 (f) EAE의 질환 중증도 감소. 바람직하게는, 길항제 IL-7R 항체는 이들 특징의 둘 이상을 갖는다. 더 바람직하게는, 항체는 이들 특징의 셋 이상을 갖는다. 더 바람직하게는, 항체는 이들 특징의 넷 이상을 갖는다. 더 바람직하게는, 항체는 상기 특징의 다섯 이상을 갖는다. 가장 바람직하게는, 항체는 여섯 개 특징 모두를 갖는다.

그에 따라, 본 발명은

(a)

의 부분 경쇄 서열을 갖는 항체, 및

(b)

의 부분 중쇄 서열을 갖는 항체, 또는 이들 임의의 항체를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다.

<표 1>

표 1에서, 밑줄친 서열은 Kabat에 따른 CDR 서열이고, 굵은 글씨체는 Chothia에 따른다.

본 발명은 또한 IL-7R에 대한 항체의 CDR 부분을 제공한다 (Chothia, Kabat CDR, 및 CDR 접촉 영역 포함). CDR 영역의 결정은 당업계의 기술 내에 잘 공지되어 있다. 몇몇 실시양태에서, CDR이 Kabat 및 Chothia CDR의 조합일 수 있다는 것 (또한 "조합된 CR" 또는 "확장된 CDR"의 용어로 지칭됨)이 이해된다. 몇몇 실시양태에서, CDR은 Kabat CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 Chothia CDR이다. 다시 말해서, 하나 초과의 CDR을 포함하는 실시양태에서, CDR은 임의의 Kabat, Chothia, 조합 CDR, 또는 이들의 조합일 수 있다. 표 2는 본원에 제공된 CDR 서열의 예를 제공한다.

<표 2>

CDR 접촉 영역은 항원에 대한 항체에의 특이성을 주입시키는 항체의 영역이다. 일반적으로, CDR 접촉 영역은 CDR 및 버니어 존 (Vernier zones) 중 잔기 위치를 포함하며, 이들은 특정 항원에 결합하는 항체에 대해서 적합한 루프 구조를 유지하기 위하여 제약된다. 예를 들어, 문헌 [Makabe et al., 2007, "Thermodynamic Consequences of Mutations in Vernier Zone Residues of a Humanized Anti-human Epidermal Growth Factor Receptor Murine Antibody," Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166]을 참조한다. CDR 접촉 영역의 결정은 당업계의 기술 내에 잘 공지되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 FTFDDSVM (서열 56), GWDGFF (서열 57), ARX₁X₂X₃X₄ (여기서 X₁, X₂, X₃, 및 X₄는 임의의 아미노산일 수 있음) (서열 58), SGSIDSSY (서열 59), EDDQRPSGV (서열 60) 및 FHHL (서열 61)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR 접촉 영역을 포함한다.

IL-7R에 대한 길항제 IL-7R 항체의 결합 친화도 (K_D)는 약 0.002 내지 약 200 nM일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합 친화도는 임의로 약 200 nM, 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM이다. 몇몇 실시양태에서, 결합 친화도는 임의로 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM 보다 적다.

본 발명은 또한 임의의 이들 항체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 단백질분해 또는 항체의 다른 분해에 의해서 또는 상기 기재된 바와 같은 재조합 방법 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드)에 의해서 또는 화학적 합성에 의해서 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩티드 (특히 더 짧은 약 50개 이하의 아미노산의 폴리펩티드)는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 시판된다. 예를 들어, 항체는 고체 상 방법을 사용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 생산될 수 있다. 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 6,331,415호를 또한 참조한다.

또다른 별법에서, 항체는 당업계에 잘 알려진 절차를 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 P3A9, P4B3, P2D2, P2E11, HAL403a, HAL403b, C1GM, 또는 C2M3의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 중 벡터에서 유지될 수 있고, 그 후 숙주 세포는 나중에 사용하기 위해 증대 및 냉동될 수 있다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포가 또한 본원에 기재된다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 scFv를 포함한다. 단일쇄 가변 영역 단편은 단 연결 펩티드 (문헌 [Bird et al., 1988, Science 242:423-426])를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결시켜 제조된다. 연결 펩티드의 예는 (GGGGS)₃ (서열 13)이고, 이는 한 가변 영역의 카르복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이에 대략 3.5 nm를 가교한다. 다른 서열의 링커가 고안되고 사용된다 (상기 문헌 [Bird et al., 1988] 참조). 링커는 짧은 가요성 폴리펩티드이어야 하고, 바람직하게는 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 구성되어야 한다. 링커는 추가 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체로의 부착을 위해 차례로 변형될 수 있다. 단일쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. scFv의 합성적 생산을 위해, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산을 위해, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 진핵 세포, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포, 또는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli)로 도입될 수 있다. 관심 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일상적인 조작, 예컨대 폴리뉴클레오티드의 라이게이션에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.

단일쇄 항체의 다른 형태, 예컨대 디아바디 (diabody)가 또한 포함된다. 디아바디는 2가의, 이중특이적 항체이고, 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 도메인은 단일 폴리펩티드쇄 상에서 발현되지만, 너무 짧아서 동일 쇄 상에서 두 개의 도메인 사이에 짝을 이루는 것을 허용할 수 없는 링커를 사용하여 도메인이 또다른 쇄의 상보적 도메인과 짝을 이루도록 촉진하고, 두 개의 항원 결합 부위를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123] 참조).

예를 들어, 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체, 모노클로날 항체는 본원에 개시된 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210] 참조). 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 상이한 특이성을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기초로 하였다 (문헌 [Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539]).

이중특이적 항체를 제조하는 한가지 접근법에 따라, 목적하는 결합 특이성 을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 이뮤노글로불린 불변 영역 서열에 융합된다. 융합은, 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 하나 이상의 융합 중 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합 및, 필요한 경우, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 분리 발현 벡터로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체로 공동 형질감염된다. 구축물에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 동등하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 경우, 이것은 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 우수한 유연성을 제공한다. 그러나, 동등한 비율 중 2개 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 가져오는 경우, 또는 비율이 특정한 유의성이 없는 경우, 한 개의 발현 벡터 중 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 쇄에 대해 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

한 가지 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암 (arm) 중 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 아암 중 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 오직 반에서만 이뮤노글로불린 경쇄를 갖는 이 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합으로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다. 이 접근법은 PCT 공보 제WO 94/04690호에 기재되어 있다.

두 개의 공유결합적으로 연결된 항체를 포함하는 이종접합 항체는 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 그러한 항체는 원치않는 세포에 대해 면역계 세포를 표적화하고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염을 치료하는데 (PCT 공보 제WO 91/00360호 및 제WO 92/200373호; EP 03089) 사용되어 왔다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.

키메릭 또는 하이브리드 항체는 또한 가교제를 포함하는 것을 비롯하여 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디술파이드 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 구축될 수 있다. 이 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.

인간화 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 네 가지 일반적인 단계가 모노클로날 항체를 인간화하는데 사용될 수 있다. 이는 다음과 같다: (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 예상 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 결정 (2) 인간화 항체 고안, 즉 인간화 과정 동안 사용하기 위한 항체 프레임워크 영역 결정 (3) 실제 인간화 방법론/기술 및 (4) 인간화 항체의 발현 및 형질감염. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 제5,807,715호; 제5,866,692호; 제6,331,415호; 제5,530,101호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,585,089호; 및 제6,180,370호 참조.

재조합 인간화 항체에서, Fcγ 부분은 Fcγ 수용체와의 상호작용 및 보완 및 면역계를 피하기 위하여 변형될 수 있다. 그러한 항체의 제조를 위한 기술은 공보 제WO 99/58572호에 기재되어 있다. 예를 들어, 항체가 임상 시험 및 인간의 치료에 사용되는 경우, 불변 영역은 면역 반응을 피하기 위해 보다 유사한 인간 불변 영역으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,997,867 및 5,866,692를 참조.

본 발명은 그의 특성에 유의하게 영향을 주지 않는 기능적으로 등가인 항체 및 활성 및/또는 친화도를 향상 또는 감소시키는 변이체를 비롯하여 표 1에 나타낸 본 발명 변이체의 폴리펩티드 및 항체의 변형을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열은 IL-7R에 대해 목적하는 결합 친화도를 갖는 항체를 수득하기 위해 돌연변이될 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 당업계에서 일상적으로 실행되고, 본원에 상세하게 기재될 필요가 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 첨가를 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 이는 기능성 활성에 대해 유의하게 유해한 변화를 주지 않거나, 또는 그의 리간드에 대한 폴리펩티드의 친화도, 또는 화학 유사체의 용도를 성숙 (향상)시킨다.

아미노산 서열 삽입은 한 개의 잔기부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체, 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환에서 항체의 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.

치환 변이체는 그의 위치 (place)에서 삽입된 상이한 잔기 및 제거된 항체 분자 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환적 돌연변이생성을 위한 가장 관심있는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 예상된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 제목 아래 표 3에 나타낸다. 그러한 치환이 생물학적 활성에 있어서 변화를 야기하는 경우, 표 3에 명명된 "예시적인 치환", 또는 아미노산 분류를 참고로 하기 추가로 기재된 바와 같이 보다 실질적은 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.

<표 3> 아미노산 치환

항체의 생물학적 특성에서의 실질적 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형태와 같은, 치환 영역에서의 폴리펩티드 주쇄의 구조 (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 그들의 효과에 있어서 유의하게 다른 치환을 선택하여 완수된다. 천연 발생 잔기는 통상적인 하기 측쇄 특성을 기초로 그룹별로 나누어진다:

(1) 비극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 전하 없는 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성 (음 하전됨): Asp, Glu;

(4) 염기성 (양 하전됨): Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.

비-보존적 치환은 또다른 분류에 대해서 이들 분류의 하나의 구성원을 교환하여 만들어질 수 있다.

항체의 적합한 형태를 유지하는데 있어서 포함되지 않은 임의의 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 대체되어, 분자의 산화 안정성을 개선하고, 이상 가교를 방지할 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)이 항체에 첨가되어 그의 안정성을 개선시킬 수 있으며, 특히 여기서 항체는 항체 단편, 예컨대 Fv 단편이다.

아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산을 변화 또는 변형시키는 것부터 영역, 예컨대 가변 영역의 재-고안을 완료하는 것까지 범위가 다양할 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 1개 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환은 CDR 도메인 내에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 1개 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환은 CDR 도메인 내에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, CDR 도메인은 CDR H3 및/또는 CDR L3이다.

변형은 또한 글리코실화된 폴리펩티드 및 글리코실화되지 않은 폴리펩티드, 및 다른 번역-후 변형, 예컨대, 상이한 당류에 의한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 그들의 불변 영역 중 보존된 위치에서 글리코실화된다 (문헌 [Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32]). 이뮤노글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능에 영향을 주고 (문헌 [Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180]), 당단백질의 부분 사이에서의 분자내 상호작용은 형태 및 제시된 당단백질의 3차원 표면에 영향을 줄 수 있다 (문헌 [Jefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416]). 올리고당은 또한 특이적 인식 구조를 기초로 특정 분자에 대해 소정의 당단백질을 표적화하는데 제공될 수 있다. 항체의 글리코실화는 또한 항체-의존 세포의 세포독성 (ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되어 왔다. 특히, 2등분한 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글루코실트랜스퍼라제인, β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라실린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는다는 것이 보고되었다 (문헌 [Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176-180]).

항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나, 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기 측쇄로의 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌, 및 아스파라긴-X-시스테인 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 중 이들 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용될 수도 있지만, 히드록시아미노산, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌에 당류 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나가 부착되는 것을 지칭한다.

항체로의 글리코실화 부위의 첨가는 (N-연결된 글리코실화 부위에 대해) 하나 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경하여 편리하게 완수된다. 변경은 또한 (O-연결된 글리코실화 부위에 대해) 본래 항체의 서열로의 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다.

항체의 글리코실화 패턴은 또한 밑줄친 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수 있다. 글리코실화는 대체로 항체 발현을 위해 사용된 숙주 세포에 의존한다. 잠재적인 치료물질로서 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현을 위해 사용된 세포 유형은 거의 천연 세포가 아니기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴에서의 변화가 예상될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참조).

숙주 세포의 선택에 추가로, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 방식, 배지 제형, 배양 밀도, 산화, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고당 생산과 관련된 특정 효소의 도입 또는 과발현을 비롯하여 특정 숙주 유기체에서 달성된 글리코실화 패턴을 변경하기 위해 다양한 방법이 제안되어 왔다 (미국 특허 제5,047,335호; 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 글리코실화, 또는 글리코실화의 특정 유형은 예를 들어 엔도글리코시다제 H (엔도 H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 사용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 다당류의 특정 유형을 가공하는 중 결함에 대해 유전적으로 조작될 수 있다. 이들 및 유사한 기술이 당업계에 잘 알려져 있다.

변형의 다른 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화 (이들로만 제한되지는 않음)를 비롯하여 당업계에 공지된 커플링 기술을 사용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들어 면역검정에 대한 표지 부착을 위해 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 당업계에 확립된 절차를 사용하여 제조되고, 당업계에 공지된 표준 검정을 사용하여 스크리닝 될 수 있으며, 이들 중 일부는 하기 및 실시예에 기재되어 있다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 인간 Fc 감마 수용체에 대해 친화도가 증가된 불변 영역을 포함하고, 면역적으로 불활성 또는 부분적으로 불활성이며, 예를 들어 보체 매개 용균을 촉발시키지 않거나, 항체-의존 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않거나, 또는 소교세포를 활성화하지 않거나; 또는 보체 매개 용균 촉발, 항체-의존 세포 매개 세포독성 (ADCC) 자극, 또는 소교세포 활성화 중 하나 이상에서 (변형되지 않은 항체에 비해) 활성을 감소시킨다. 불변 영역의 상이한 변형은 이펙터 기능의 최적의 수준 및/또는 조합을 달성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995]; [Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996]; [Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000]; [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 몇몇 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; PCT 출원 No. PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 No. 9809951.8에 기재된 바와 같이 변형된다. 다른 실시양태에서, 항체는 하기 돌연변이: A330P331 내지 S330S331 (야생형 IgG2 서열을 참고하여 아미노산 넘버링)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역을 포함한다. 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624] 참조. 다른 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화된다. 몇몇 실시양태에서, 불변 영역은 불변 영역 중 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 글리코실화된 아미노산 잔기 또는 플랭킹 잔기의 돌연변이에 의해 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화된다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은 A, Q, K, 또는 H로 돌연변이 될 수 있다. 문헌 [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 문헌 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 몇몇 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화된다. 불변 영역은 효소적으로 (예컨대, 효소 PNGase에 의해 탄수화물 제거) 또는 글리코실화 결핍숙주 세포 중 발현에 의해 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화될 수 있다.

다른 항체 변형은 PCT 공보 제WO 99/58572호에 기재된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자에서 지시된 결합 도메인 외에, 인간 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역 모두 또는 일부에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이들 항체는 유의한 보체 의존 용균의 촉발 또는 표적의 세포-매개된 파괴 없이 표적 분자에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로, 둘 이상의 인간 이뮤노글로불린 중쇄 C_H2 도메인으로부터 유래된 키메릭 도메인을 기초로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 전형적인 항체 치료법에 대한 염증 및 다른 부작용을 피하기 위해, 만성 항체 치료법에서 사용하기 에 특히 적합하다.

본 발명은 친화도 성숙 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다 (문헌 [Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783]; [Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813]; [Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155]; [Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004]; [Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9]; [Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896]; 및 PCT 공보 제WO2004/058184호).

하기 방법은 항체의 친화도를 조정하고, CDR을 특징짓기 위해 사용될 수 있다. 항체의 CDR을 특징짓고/짓거나 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화도를 변경 (예컨대, 개선)하는 한가지 방법은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이생성"으로 지칭된다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이생성은 하기와 같이 수행한다. 당업계에 인식된 방법을 사용하여 CDR 중 하나 이상의 아미노산 위치가 둘 이상의 (예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20) 아미노산으로 대체된다. 이것은 각각 둘 이상의 구성원 (둘 이상의 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우)의 복합성을 갖는, 클론의 작은 라이브러리 (몇몇 실시양태에서, 분석된 모든 아미노산 위치를 위한 것)를 생성한다. 일반적으로, 라이브러리는 또한 천연 (치환되지 않은) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각각의 라이브러리로부터 작은 수의 클론, 예를 들어 약 20-80개의 클론 (라이브러리의 복합성에 따라)은 표적 폴리펩티드 (또는 다른 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝되고, 증가된, 동일한, 감소된, 또는 결합 없는 후보물질이 확인된다. 결합 친화도를 결정하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 결합 친화도는 약 2-배 또는 초과의 결합 친화도에서 상이점을 검출하는, 비아코어™ 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 비아코어™는 출발 항체가 상대적으로 높은 친화도, 예를 들어, 약 10 nM 이하의 K_D로 이미 결합하는 경우, 특히 유용하다. 비아코어™ 표면 플라스몬 공명을 사용하는 스크리닝은 본원의 실시예에 기재된다.

결합 친화도는 키넥사 바이오센서 (Kinexa Biocensor), 섬광 근접 검정, 엘리사(ELISA), 오리겐(ORIGEN) 면역검정 (IGEN), 형광 켄칭, 형광 전달, 및/또는 효모 디스플레이를 사용하여 결정될 수 있다. 결합 친화도는 또한 적합한 생물검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, CDR에서의 모든 아미노산 위치는 당업계에 인식된 돌연변이생성 방법 (이들 중 일부는 본원에 기재되어 있음)을 사용하여 모든 20개의 천연 아미노산으로 대체될 수 있다 (몇몇 실시양태에서, 한번에 하나씩). 이것은 20개의 구성원 (20개의 아미노산 모두가 모든 위치에서 치환되는 경우)의 복합성을 갖는, 클론의 작은 라이브러리 (몇몇 실시양태에서, 분석된 모든 아미노산 위치를 위한 것)를 생성한다.

몇몇 실시양태에서, 스크리닝 될 라이브러리는 둘 이상의 위치에서의 치환을 포함하고, 이는 동일한 CDR 또는 둘 이상의 CDR에서 존재할 수 있다. 따라서, 라이브러리는 하나의 CDR 중 둘 이상의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 둘 이상의 CDR 중 둘 이상의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 3, 4, 5, 또는 그 이상의 위치에서의 치환을 포함할 수 있고, 상기 위치는 2, 3, 4, 5 또는 6 CDR에서 발견되었다. 치환은 낮은 중복 코돈을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Balint et al., 1993, Gene 137(1):109-18]의 표 2를 참조한다.

CDR은 CDRH3 및/또는 CDRL3일 수 있다. CDR은 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, 및/또는 CDRH3의 하나 이상일 수 있다. CDR은 Kabat CDR, Chothia CDR, 또는 확장된 CDR일 수 있다.

개선된 결합을 갖는 후보물질은 서열분석되어, 개선된 친화도 (또한 "개선된" 치환으로도 지칭됨)를 야기하는 CDR 치환 돌연변이체를 확인할 수 있다. 결합하는 후보물질은 또한 서열분석되어, 결합을 유지하는 CDR 치환을 확인할 수 있다.

다중 라운드의 스크리닝이 수행될 수 있다. 예를 들어, 개선된 결합을 갖는 후보물질 (각각은 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함함)은 또한 각각의 개선된 CDR 위치에서 적어도 본래 및 치환된 아미노산을 함유하는 제2 라이브러리의 고안을 위해 유용하다 (즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타내는 CDR 중 아미노산 위치). 이 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선택은 하기에 추가로 논의된다.

라이브러리 스캐닝 돌연변이생성은 또한 개선된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합 또는 비결합을 갖는 클론의 빈도가 또한 항체-항원 복합체의 안정성을 위한 각각의 아미노산 위치의 중요도에 관한 정보를 제공하는 한, CDR을 특징짓기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 모든 20개의 아미노산에 대해 변화하는 경우 CDR의 위치가 결합을 유지한다면, 그 위치는 항원 결합을 위해 필요할 개연성이 낮은 위치로서 확인된다. 역으로, 오직 작은 백분율의 치환에서 CDR의 위치가 결합을 유지한다면, 그 위치는 CDR 기능에 대해 중요한 위치로서 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이생성 방법은 많은 상이한 아미노산 (모든 20개의 아미노산을 포함함)을 변화시킬 수 있는 CDR 중의 위치에 관한 정보를 생성하고, CDR 중 위치는 변화할 수 없거나 또는 단지 소수의 아미노산에 대해서 변화할 수 있다.

개선된 친화도를 갖는 후보물질은 그 위치에서 개선된 아미노산, 본래 아미노산을 포함하는 제2 라이브러리 중 조합될 수 있고, 목적하는 스크리닝 또는 선택 방법을 사용하여 목적하는, 또는 허용되는 라이브러리의 복합성에 따라 그 위치에서 추가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 필요한 경우, 인접한 아미노산 위치는 적어도 둘 이상의 아미노산에 대해 랜덤화될 수 있다. 인접한 아미노산의 랜덤화는 돌연변이체 CDR 중 추가 형태 유연성을 허용할 수 있고, 이는 대규모의 돌연변이의 개선의 도입을 차례로 허용하거나 또는 용이하게 할 수 있다. 라이브러리는 또한 스크리닝의 제1 라운드에서 개선된 친화도를 나타내지 않는 위치에서 치환을 포함할 수 있다.

제2 라이브러리는 비아코어™ 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하는 스크리닝 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 및 리보솜 디스플레이를 비롯하여, 선택을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하는 선택을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결합 친화도를 개선하고/하거나 변경하는 라이브러리 구성원을 위해 스크리닝 되거나 또는 선택된다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 41 또는 44에 나타낸 가변 경쇄 영역의 10개 이상 아미노산 및/또는 서열 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 40에 나타낸 가변 중쇄 영역의 10개 이상 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 또는 약 30개 이상 인접 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 또는 약 30개 이상 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 41 및 40, 및 44 및 40으로부터 선택된 임의의 서열 쌍에서 나타난 바와 같은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 CDR H3 (VH CDR3) 및/또는 CDR L3 (VL CDR3)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 융합 단백질은 천연 분자에 부착되지 않는 하나 이상의 항체 및 또다른 아미노산 서열, 예를 들어, 또다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 상동 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열은 "태그", 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함하지만 이들로만 제한되지는 않는다. 태그는 당업계에 잘 공지되어 있다.

융합 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 또한 예를 들어, 화학적 합성을 비롯하여 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 제조될 수 있지만, 본원에 기재된 재조합 방법을 사용하여 그들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 제조에 의해 제조된다.

본 발명은 또한 고체 지지체 (예컨대 비오틴 또는 아비딘)에 대한 커플링을 용이하게 하는 작용제에 접합된 (예를 들어, 연결된) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 간단히, 이들 방법이 본원에 기재된 임의의 IL-7R 결합 및/또는 길항제 실시양태에 적용되는 점을 이해하면서 일반적으로 항체를 참조할 것이다. 접합은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 이들 성분을 연결하는 것을 지칭한다. 연결 (이는 일반적으로, 적어도 투여를 위해 이들 성분을 밀접하게 고정함)은 임의의 수의 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 각각이 다른 것과 반응 가능한 치환체를 소유하는 경우, 작용제 및 항체 사이의 직접 반응이 가능하다. 예를 들어, 한쪽 상에서 친핵성기, 예컨대 아미노 또는 술프히드릴 기는 다른쪽 상에서 카르보닐-함유 기, 예컨대 무수물 또는 산 할라이드, 또는 우수한 이탈기 (예를 들어, 할라이드)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 표지화제, 예컨대 형광성 분자, 방사성 분자 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 표지에 연결될 수 있다. 표지는 당업계에 공지되고, 일반적으로 (직접적으로 또는 간접적으로) 신호를 제공한다.

본 발명은 또한, 이 개시에서 명백하게 하는 바와 같이, 임의의 또는 모든 본원에 기재된 항체 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물 (제약 조성물을 포함함) 및 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.

따라서, 본 발명은 임의의 항체 C1GM, C2M3, P3A9, P4B3, P2D2, P2E11, HAL403a 및 HAL403b, 또는 IL-7R을 길항작용하는 능력을 갖는 임의의 단편 또는 그의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (또는 제약 조성물을 포함하는 조성물)를 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 임의의 본원에 기재된 항체 (항체 단편을 포함함) 및 폴리펩티드, 예컨대 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체 및 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조 및 발현될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 임의의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 (예컨대, 제약 조성물)을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 임의의 본원에 기재된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 38 및 서열 39에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다:

C1GM 중쇄 가변 영역

C2GM 경쇄 가변 영역

또다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 14 및 서열 15에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다:

HAL403a 중쇄 가변 영역

HAL403a 경쇄 가변 영역

발현 벡터 및 폴리뉴클레오티드 조성물의 투여가 본원에서 추가로 기재된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 제조하는 방법을 제공한다.

임의의 이같은 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 또한 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자에는 인트론을 함유하고 1-대-1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자가 포함된다. 추가적인 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드가 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다.

폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 이의 일부분을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 이같은 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩되는 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자와 비교하여 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩되는 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 천연 항체 또는 이의 일부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 바람직하게는 약 70％ 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 약 90％ 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 동일성을 나타낸다.

2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 하기 기재되는 바와 같이 최대로 상응하도록 정렬될 때 2개의 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 동일한 경우에 "동일"한 것으로 일컬어진다. 2개의 서열 간의 비교는 서열들을 비교 창(window)에 걸쳐 비교하여 국소적인 서열 유사성 영역을 확인하고 비교함으로써 전형적으로 수행된다. 본원에서 사용된 "비교 창"은 약 20개 이상의 인접한 위치, 일반적으로는 30개 내지 약 75개, 또는 40개 내지 약 50개의 절편을 지칭하고, 여기에서 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 하나의 서열이 인접한 위치의 개수가 동일한 기준 서열에 비교될 수 있다.

비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 디폴트 파라메터를 사용하여, 레이저진(Lasergene) 생물정보학 소프트웨어 묶음 (디엔에이스타 인코포레이티드(DNASTAR, Inc.), 위스콘신주 매디슨) 내의 메갈린(Megalign) 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로그램은 하기의 참고문헌에 기재된 여러 정렬 기법을을 구현한다: 문헌 [Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358]; [Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA]; [Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153]; [Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17]; [Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105]; [Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425]; [Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA]; [Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].

바람직하게는, "서열 동일성 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 위치 20개 이상의 비교 창에 걸쳐 비교함으로써 결정되고, 이때 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20％ 이하, 일반적으로는 5 내지 15％ 또는 10 내지 12％의 부가 또는 결실 (즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에 존재하는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 기준 서열 내의 위치의 전체 개수 (즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 백분율이 계산된다.

또한 또는 별법으로, 변이체는 천연 유전자, 또는 이의 일부분 또는 보체에 대해 실질적으로 상동성일 수 있다. 이같은 폴리뉴클레오티드 변이체는 중등도로 엄격한 조건 하에 천연 항체를 코딩하는 천연 발생 DNA 서열 (또는 상보적인 서열)에 하이브리드화될 수 있다.

적절한 "중등도로 엄격한 조건"은 5× SSC, 0.5％ SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액에서 예비세정하고, 50℃-65℃, 5× SSC에서 하룻밤 동안 하이브리드화시킨 후, 65℃에서 20분 동안 0.1％ SDS를 함유하는 2×, 0.5×및 0.2× SSC 각각으로 2회 세정하는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고-엄격성 조건"은 (1) 세정을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도를 사용하는 것, 예를 들어, 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 것; (2) 하이브리드화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드를 사용하는 것, 예를 들어, 42℃에서 50％ (v/v) 포름아미드 + 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜(Ficoll)/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 사용하는 것; 또는 (3) 42℃에서 50％ 포름아미드, 5× SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5× 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA (50 ㎍/㎖), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2× SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 55℃에서 50％ 포름아미드로 세정한 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1× SSC로 구성된 고-엄격성 세정이 이어지는 것이다. 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요하다면, 당업자는 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인지할 것이다.

당업자는, 유전자 코드 축중성(degeneracy)의 결과로서, 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소의 상동성을 지닌다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드들이 본 발명에 명확하게 포함된다. 추가로, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자가 본 발명의 범주 내에 속한다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 뉴클레오티드의 결실, 부가 및/또는 치환 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질의 구조 또는 기능이 변경될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 표준 기술 (예컨대 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 대립유전자를 확인할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 수득할 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법이 당업계에 주지되어 있고, 본원에 상세하게 기재될 필요가 없다. 당업자는 본원에서 제공된 서열 및 시판되는 DNA 합성기를 사용하여 원하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.

재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해, 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 차례로 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적절한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 삽입할 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드를 직접적인 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-메이팅(mating) 또는 전기천공에 의해 도입함으로써 세포가 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합 벡터 (예컨대 플라스미드)로서 세포 내에서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오티드를 당업계에 주지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989] 참조.

별법으로, PCR이 DNA 서열의 재생산을 허용한다. PCR 기술은 당업계에 주지되어 있고, 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202, 뿐만 아니라 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.

적합한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하고 이를 적절한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 RNA를 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 상기 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 예를 들어 기재된 바와 같이, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.

적절한 클로닝 벡터가 표준 기술에 따라 구축될 수 있거나, 또는 당업계에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택되는 클로닝 벡터는 사용하려는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가 복제 능력이 있을 것이고/이거나, 특정 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 대한 단일 표적이 있을 수 있고/있거나, 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적절한 예로는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript) (예를 들어, pBS SK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28이 포함된다. 이러한 클로닝 벡터 및 다수의 기타 클로닝 벡터가 바이오래드(BioRad), 스트라타진(Stratagene), 및 인비트로젠(Invitrogen)과 같은 시판원으로부터 입수가능하다.

일반적으로 발현 벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하여야 한다는 것이 암시된다. 적절한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 포함), 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 벡터 성분은 하기의 것들 중 하나 이상을 일반적으로 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 적절한 전사 제어 요소 (예컨대 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)을 위해, 하나 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 또한 일반적으로 요구된다.

관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 기타 물질을 사용하는 형질감염, 미세발사체(microprojectile) 포격, 리포펙션(lipofection), 및 감염 (예를 들어, 벡터가 우두 바이러스와 같은 감염성 작용제인 경우)이 포함되는 다수의 적합한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 숙주 세포의 특색에 종종 좌우될 것이다.

본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 또한 제공한다. 이종 DNA를 과다발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 목적에 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비-제한적인 예로는 COS, HeLa 및 CHO 세포가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. PCT 공개 번호 WO 87/04462를 또한 참조한다. 적절한 비-포유동물 숙주 세포에는 원핵생물 (예컨대 이. 콜라이 또는 바실루스 서브틸리스(B. subtillis)) 및 효모 (예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisae), 스키조사카로마이세스 폼베(S. pombe); 또는 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis))가 포함된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내의 상응하는 내인성 항체 또는 관심 단백질 (존재하는 경우)의 수준보다 약 5배, 더욱 바람직하게는 10배, 더욱 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. IL-7R 또는 IL-7R 도메인에 대한 특이적 결합에 대한 숙주 세포의 스크리닝이 면역검정 또는 FACS에 의해 실행된다. 관심 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포가 확인될 수 있다.

조성물

본 발명의 방법에 사용된 조성물은 유효량의 길항제 IL-7R 항체, 길항제 IL-7R 항체 유래된 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 다른 IL-7R 길항제를 포함한다. 이러한 조성물의 예 및 어떻게 제제화하는지는 또한 이전의 부분 및 하기에 기재된다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 IL-7R 길항제 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 인간 IL 7Rα를 인식한다. 다른 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 인간화 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 목적하는 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용균 또는 ADCC를 촉발할 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 원하지않거나 또는 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용균 또는 ADCC를 촉발하지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 길항제 IL-7R 항체는 항체의 하나 이상의 CDR(들) (예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 몇몇 실시양태에서, 모든 6개의 CDR)을 포함한다.

조성물은 하나 초과의 길항제 IL-7R 항체 (예를 들어, IL-7R의 상이한 에피토프를 인식하는 길항제 IL-7R 항체의 혼합물)를 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)을 인식하는 하나 초과의 길항제 IL-7R 항체, 또는 IL-7R의 상이한 에피토프에 결합하는 길항제 IL-7R 항체의 상이한 종을 포함한다.

본 발명에 사용된 조성물은 추가로 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제 (문헌 [Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover])를 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 잔기 미만임) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 표면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 추가로 본원에 기재된다.

길항제 IL-7R 항체 및 그의 조성물은 또한 작용제의 효과를 향상시키고/시키거나 보완하는 역할을 하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.

D. 키트

본 발명은 또한 본 방법에 사용되는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에 기재된 IL-7R 길항제 (예컨대, 인간 항체)를 포함하는 하나 이상의 용기 및 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 따라 사용되는 지시사항을 포함한다. 일반적으로, 이들 지시사항은 상기 기재된 치료학적 치료를 위한 IL-7R 길항제의 투여의 설명을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, IL-7R 길항제는 길항제 IL-7R 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 길항제 IL-7R 항체의 사용에 관련된 지시사항은 일반적으로 대상 치료를 위한 용량, 투여 스케쥴, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 투여, 대량 패키지 (예를 들어, 다중-투여 패키지) 또는 하위-단위 투여일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 지시사항은 전형적으로 표지 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지시사항이지만, 기계-판독형 지시사항 (예를 들어, 자성 또는 시각적 저장 디스크 상의 지시사항)이 또한 허용된다.

본 발명의 키트는 적절한 포장재 내에 존재한다. 적절한 포장재에는 바이알, 병, 단지, 가요성 포장재 (예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 분무기) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 포장재가 또한 고려된다. 키트에 무균성 접근 포트(port)가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기가 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 바이알일 수 있다). 용기에 또한 무균성 접근 포트가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기가 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 하나 이상의 활성제가 길항제 IL-7R 항체이다. 용기는 제2의 제약상 활성인 작용제를 추가로 포함할 수 있다.

키트는 추가적인 성분, 예컨대 완충제 및 설명 정보를 임의적으로 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다.

돌연변이 및 변형

본 발명의 IL-7R 항체를 발현시키기 위해, VH 및 VL 영역을 코딩하는 DNA 단편은 먼저 상기 기재된 임의의 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 다양한 변형, 예를 들어 돌연변이, 결실, 및/또는 첨가는 또한 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 DNA 서열 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이생성은 돌연변이화된 뉴클레오티드가 PCR 프라이머 내에 도입되어 PCR 생성물이 목적하는 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이생성을 함유하도록 표준 방법, 예컨대 PCR-매개된 돌연변이생성을 사용하여 만들어질 수 있다.

예를 들어, 만들어질 수 있는 치환의 하나의 유형은 다른 잔기, 예컨대, 이들로 한정되지는 않지만, 알라닌 또는 세린에 화학적으로 반응성일 수 있는 항체에서 하나 이상의 시스테인을 교체하는 것이다. 예를 들어, 넌 캐노니컬(non-canonical) 시스테인의 치환이 있을 수 있다. 치환은 항체의 CDR 또는 가변 도메인의 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 시스테인은 캐노니컬(canonical)이다.

항체는 또한 예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 예를 들어, 항체의 결합 성질을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 CDR 영역 중 하나 이상에서 IL-7R에 대한 항체의 K_D를 증가시키거나 또는 감소시키기 위해, k_off를 증가시키거나 또는 감소시키기 위해, 또는 항체의 결합 특이성을 변경시키기 위해 만들어 질 수 있다. 부위-지정 돌연변이생성 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook et al. and Ausubel et al.]을 참조한다.

변형 또는 돌연변이는 또한 IL-7R 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 만들어 질 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 00/09560를 참조한다. 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한 항체의 면역원성을 변경시키거나, 또다른 분자에의 공유 결합 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하거나, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성과 같은 특성을 변경시키기 위해 만들어 질 수 있다. 본 발명에 따라, 단일 항체는 임의의 CDR 또는 가변 도메인의 프레임워크 영역 또는 불변 영역 중 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수 있다.

"배선화(germlining)"라고 알려진 절차에서, VH 및 VL 서열에서의 특정 아미노산은 배선 VH 및 VL 서열에서 천연에서 발견되는 아미노산과 일치되도록 돌연변이화될 수 있다. 특히, VH 및 VL 서열에서의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 배선 서열과 일치되도록 항체가 투여되는 경우 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 돌연변이화될 수 있다. 인간 VH 및 VL 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, "브이베이스(Vbase)" 인간 배선 서열 데이터베이스를 참조함; 또한 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836]을 참조함).

만들어질 수 있는 또다른 유형의 아미노산 치환은 항체에서 잠재적인 단백질분해 부위를 제거하는 것이다. 상기 부위는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 또는 항체의 불변 영역에서 발생할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질분해 부위의 제거는 항체 생산물에서의 이질성의 위험을 감소시킬 수 있고, 따라서 그의 균질성을 증가시킨다. 또다른 유형의 아미노산 치환은 하나 또는 잔기 둘다를 변경함으로써 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글라이신 쌍을 제거하는 것이다. 또다른 예에서, 본 발명의 IL-7R 항체의 중쇄의 C-말단 리신은 절단될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, IL-7R 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의로 신호 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편을 수득한 후, 이들 DNA 단편은 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자, 또는 scFv 유전자로 변환시키기 위해 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩하는 DNA 단편은 또다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이 맥락에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편이 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 여전히 인-프레임(in-frame)이도록 연결된 것을 의미하도록 의도된다.

VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩하는 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 변환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]을 참조함), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 불변 영역이다. IgG 불변 영역 서열은 상이한 개체, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17) 사이에서 발생하는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립유전자 또는 동종이형일 수 있다. 이들 동종이형은 IgG1 불변 영역에서 천연 발생 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, VH-코딩하는 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변 영역은 임의의 중쇄 유전자로부터 유래될 수 있다.

VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 전장 경쇄 유전자 (및 Fab 경쇄 유전자)로 VL-코딩하는 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 변환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]을 참조함), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 상이한 개체, 예컨대 Inv(1), Inv(2), 및 Inv(3) 사이에서 발생하는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립유전자일 수 있다. 람다 불변 영역은 임의의 3개의 람다 유전자로부터 유래될 수 있다.

scFv 유전자를 제작하기 위해, VH- 및 VL-코딩하는 DNA 단편은 가요성 링커, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly₄ -Ser)₃, (서열 16)을 코딩하는 또다른 단편에 작동가능하게 연결되어 VH 및 VL 서열이 인접 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988, Science 242:423-426]; [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]을 참조함). 단일쇄 항체는 단일 VH 및 VL만이 사용된 경우 일가항체일 수 있거나, 2개의 VH 및 VL이 사용된 경우 이가항체일 수 있거나, 또는 2개 초과의 VH 및 VL이 사용된 경우 다가항체일 수 있다. IL-7R 및 또다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 또는 다가항체는 생성될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 또다른 폴리펩티드에 연결된 본 발명의 IL-7R 항체의 모두 또는 부분을 포함하는 융합 항체 또는 면역접착체가 만들어질 수 있다. 또다른 실시양태에서, IL-7R 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 연결된다. 또다른 실시양태에서, IL-7R 항체의 VH 도메인이 제1 폴리펩티드에 연결되며, IL-7R 항체의 VL 도메인이 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드와 연관된 제2 폴리펩티드에 연결된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, VH 도메인은 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 VL 도메인으로부터 링커에 의해 분리되어 있다. VH-링커- VL 항체는 이어서 관심 폴리펩티드에 연결된다. 추가로, 2개 (또는 2개 초과)의 단일-쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 쇄 상에 이가항체 또는 다가항체를 생성하기를 원하는 경우, 또는 이중특이적 항체를 생성하기를 원하는 경우 유용하다.

다른 실시양태에서, 다른 변형된 항체는 핵산 분자를 코딩하는 IL-7R 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, "카파 바디(Kappa bodies)" (문헌 [Ill et al., 1997, Protein Eng. 10:949-57]), "미니바디(Minibodies)" (문헌 [Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-9]), "디아바디(Diabodies)" (문헌 [Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]), 또는 "자누신스(Janusins)" (문헌 [Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659] 및 [Traunecker et al., 1992, Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52])은 명세서의 교시에 따른 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai ＆ Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321], [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553]을 참조한다. 추가로, 이중특이적 항체는 "디아바디" 또는 "자누신스"로서 형성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IL-7R의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 기재된 변형된 항체는 본원에 제공된 인간 IL-7R 항체의 가변 도메인 또는 CDR 영역 중 하나 이상을 사용하여 제조된다.

항원-특이적 항체의 생성

재조합 마우스 IL-7Rα/CD127/Fc 키메라 (알앤디 시스템즈(R＆D Systems) 목록 번호 747-MR)에 대해 수득된 모노클로날 항체, 및 재조합 IL-7Rα로 인간 미접촉 항체 라이브러리의 바이오패닝(biopanning)에 의해 수득된 인간 항체를 마우스 및 인간 IL-7R에 결합하는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 항체를 추가로 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및/또는 원숭이 PBMC에서의 IL-7-매개된 STAT5 인산화를 차단하는 그들의 능력에 대해 스크리닝하였다. 이 방식의 항체 제조는 실시예 1에 나타낸 바와 같이 IL-7-매개된 STAT5 인산화의 차단을 나타내는 길항제 항체를 수득하였다.

본 발명의 대표적인 물질을 2011년 2월 9일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC))에 기탁하였다. ATCC 기탁 번호(Accession No.) PTA-11679를 갖는 벡터 C1GM-VH는 C1GM 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, ATCC 기탁 번호 PTA-11678을 갖는 벡터 C1GM-VL은 C1GM 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 (부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조건하에, 그리고 화이자, 인크.(Pfizer, Inc.)와 ATCC 간의 협약을 조건으로 ATCC로부터 입수가능할 것이고, 상기 협약은 관련된 미국 특허의 허여 시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 시 (어느 것이든지 먼저인 것), 기탁된 배양물의 자손을 영구적이고 비제한적으로 공중이 입수할 수 있는 것을 보장하고, 35 U.S.C. 122항 및 이에 따른 특허상표청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정 참조와 함께 37 C.F.R. 1.14항 포함)에 따라 자격이 있는 것으로 미국 특허상표청장에 의해 결정된 이가 자손을 입수할 수 있는 것을 보장한다.

본 출원의 양수인은 적합한 조건하에 배양된 경우 기탁증 상의 물질의 배양물이 사망하는 경우 또는 이를 잃어버리는 경우 또는 이가 파괴되는 경우, 통지하면서 물질이 또다른 물질로 즉시 대체될 것임에 동의하였다. 기탁된 물질의 입수용이성은 임의의 정부의 권한하에 그의 특허법에 따라 부여된 권리를 위반하여 본 발명을 실시하는 허가로서 해석되어서는 안된다.

하기의 실시예는 설명의 목적을 위해서만 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하도록 의도되지 않는다. 실제로, 본원에서 제시되고 설명된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기의 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이고, 첨부된 청구항의 범주 내에 속할 것이다.

실시예

실시예 1: 길항제 IL-7R 항체의 생성 및 스크리닝

이 실시예는 길항제 IL-7R 항체의 생성 및 스크리닝을 설명한다.

모노클로날 항체를 생성하기 위한 동물의 면역화를 위한 일반적 절차:

2개월령 암컷 스프래그 돌리(Sprague Dawley) 래트를 마우스 IL-7Rα (Glu21-Asp239), hCD33 신호 펩티드 (Met 1-Ala 16), 및 인간 IgG (Pro100-Lys330) (R＆D Systems 목록 번호 747-MR)를 포함하는 50 ug 재조합 마우스 IL-7Rα/CD127/Fc 키메라로 면역화시켰다. 항원을 면역화를 위해 50 ug 항원을 100 ul PBS 중에 100 ul 시그마 아쥬반트 시스템(Sigma Adjuvant System) (목록 번호 S6322)과 혼합함으로써 제조하였다. 항원 혼합물을 볼텍싱하고 0, 2, 5 및 7일차에 뒤 발바닥 및 복막 내에 주사하였다. 9일차에, 아쥬반트 없이 50 ug의 항원을 생리학적 염수 중에 150 ul의 총 부피로 정맥내 주사하였다. 13일차에, 비장 세포를 단일 세포 현탁액으로서 제조하고, 40％ PEG 1500 (Boeringer Mannheim Biochemicals #783641)을 사용한 표준 융합 프로토콜 후 P3x63Ag8.653 마우스 골수종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포를 18％ FBS, 2 mM L-글루타민, 펜/스트렙(pen/strep), 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT) (Sigma H0262) 및 10％ 하이브리도마 융합 및 클로닝 보충제 (HFCS) (목록 번호 11 363 735 001, Sigma)를 함유하는 배지 중에 재현탁시키고, 이어서 200 ul/웰로 54개의 96-웰 플레이트에 플레이트 아웃(plated out) 하였다. 융합 후 7일차에, 150 ul의 배지를 각각 웰로부터 흡입하고, 웰을 200 ul의 신선한 배지로 재-공급하였다. 11-13차에, 각각 웰로부터의 상등액을 ELISA를 사용하여 IL 7R 및 인간 Fc에 대한 항체에 대해 시험하였다 (하기 기재됨).

항체의 ELISA 스크리닝:

성장하는 하이브리도마 클론으로부터의 상등액 배지를 재조합 마우스 (rm) IL-7R에 결합하는 그들의 능력에 대해 별도로 스크리닝하였다. 검정을 50 μl의 1 μg/ml 용액의 항원으로 밤새 코팅된 96-웰 플레이트에 의해 수행하였다. 55개의 코팅된 플레이트를 0.05％ 트윈 함유 PBS로 4회 세척하고, 이어서 0.5％ BSA 함유 50 ul PBS를 각각 웰에 첨가하였다. 하이브리도마 플레이트의 각각 웰로부터의 5 ul를 검정 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 결합될 수 있도록 인큐베이션하였다. 과량의 시약을 웰로부터 각각 단계 사이에서 0.05％ 트윈-20을 함유하는 PBS로 세척하였다. 50 ul 호스래디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase) (HRP) 접합된 염소-항 마우스, F(ab')2, Fc 특이적 (Jackson #115-036-008)을 항원에 결합된 마우스 항체에 결합시키기 위해 첨가하였다. 검출을 위해, 50 ul ABTS, 2,2'-아지노-비스(3-에틸 벤조티아졸린-6-술폰산) 디암모늄 염을 기질로서 첨가하였다. 플레이트를 30분 후 405 nm에서 분자 장치 써모맥스(Molecular Devices THERMOmax)™ 기구를 사용하여 판독하였다. 마우스 IL-7R에 결합할 수 있는 항체를 분비한 하이브리도마 클론을 추가의 분석을 위해 선택하였다. 이들 양성 하이브리도마 상등액을 이어서 하이브리도마 플레이트로부터 수집하고, 인간 Fc, 염소 항 래트 IgM, 및 재조합 인간 (rh) IL-7R에 대해 ELISA 검정에서 시험하였다. 정제된 항체를 이어서 rm IL-7R에 결합한 항체 및 rm IL-7R 및 rh IL-7R 둘다에 결합한 항체에 대해 제조하였다.

파지 디스플레이를 사용한 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 일반적 절차:

항-인간 IL-7Rα 인간 항체를 파지 디스플레이 인간 미접촉 scFv 항체 라이브러리 (문헌 [Glanville G. et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106(48):20216-20221])로부터 인간 IL-7Rα (R＆D Systems^®)에 대한 연속된 4차례의 바이오-패닝(bio-panning)에 의해 단리하였다. 패닝의 각각 차례를 위해, 1 ml IL-7Rα (PBS 중의 10 ug/ml)를 면역튜브 상에서 4℃에서 밤새 코팅하였다. IL-7Rα 코팅된 면역튜브를 3회 PBST로 세척하였다. 10¹³ 파지 (1 ml)를 면역튜브에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 결합될 수 있도록 인큐베이션하였다. 결합 후, 면역튜브를 PBST로 8회 세척하였다. 결합된 파지를 용출하고, 신선하게 성장된 TG1 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 패닝의 4번째 차례 후, 양성 결합제를 인간 IL-7Rα 및 마우스 IL-7R 둘다에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 인간 및 마우스 IL-7R 둘다에 결합하는 항체를 그들의 친화도 및 차단 기능에 대해 추가로 연구하고, 항체를 친화도 성숙에 대해 선택하였다.

시험관내 기능성 검정:

인간 또는 마우스 IL-7R 결합 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 확장시키고, 상등액을 수거하였다. 총 IgG를 단백질 A 비드를 사용하여 상등액의 대략 10 ml로부터 정제하고, PBS 완충액 내에 투석하고, 최종 부피를 감소시켜 0.7-1 mg/ml의 항체를 갖는 용액을 수득하였다. 정제된 항체를 이어서 인간 PBMC에서 IL-7-매개된 STAT5 인산화를 차단하는 그들의 능력을 시험하기 위해 사용하였다. PBMC 제조를 위해, 전체 혈액 세포를 피콜(Ficoll) 구배를 통해 수집하였다. 세포를 37℃에서 5％ CO₂에서 코니칼 튜브 중에서 1-2시간 동안 유지하고 (단핵구/대식세포 접착을 방지하기 위함), 이어서 IL-2로 자극시켰다.

기능성 스크리닝을 위해, 인간 PBMC를 5분 동안 시험 항체 (10 μg/ml)로 IL-7의 첨가 전에 예비인큐베이션시켰다. 비-반응성 아이소타입-일치된 항체를 음성 대조군 (아이소타입 대조군)으로서 사용하였다. 세포를 인간 IL-7 (0.1 ng/ml, R＆D Systems^®)로 15분 동안 자극시켰다. IL-7 자극을 종료하기 위해, 포름알데히드를 1.6％의 최종 농도로 배양 배지에 직접 첨가하였다. 세포를 실온에서 15분 동안 고정시켰다. 메탄올을 이어서 80％의 최종 농도로 직접 첨가하고, 샘플을 4℃에서 30분 내지 1시간 동안 저장하고, 이어서 면역염색하였다. 세포를 항-포스포-STAT5 (p-STAT) 항체 (BD Pharmingen, Y694 클론 47) 및 항-CD4 항체 (BD Pharmingen, RPA-T4)로 염색하였다. 유동 세포계수법 (LSRII, BD™ Biosciences)을 사용하여, CD4+ 관문 세포를 p-STAT5 염색에 대해 분석하였다. 아이소타입 대조군을 p-STAT의 100％로서 설정하였다.

도 1은 길항제 IL-7R 완전 인간 모노클로날 항체 P2D2 및 P2E11, 및 HAL403a의 인간 PBMC에서의 IL-7-매개된 STAT5 인산화에 대한 효과를 설명한다. 마우스 항-인간 IL-7R 모노클로날 항체, 13A2F4를 양성 대조군으로서 사용하고, 비반응성 아이소타입-일치된 항체를 음성 대조군 (아이소타입 대조군)으로서 사용하였다. 인간 PBMC를 5분 동안 각각의 시험 항체 또는 13A2F4의 농도 0.001, 0.01, 0.1, 1, 및 10 μg/ml에서 예비인큐베이션시켰다. 아이소타입 대조군 항체를 가장 높은 농도, 10 μg/ml로 사용하였다. 세포를 인간 IL-7 (0.1 ng/ml)로 15분 동안 자극시키고, 이어서 고정시키고, 상기 기재된 바와 같이 면역염색하였다.

p-STAT5 염색에 의해 측정된 바와 같이, 인간 항체 P2D2, P2E11, HAL403a C1GM, C1GM-2 및 C2M3은 인간 IL-7 매개된 신호전달을 투여량-의존적 방식으로 차단한다 (도 1 및 데이터는 나타내지 않음). 아이소타입 대조군을 100％ p-STAT5 염색으로서 설정하였다. 10 μg/ml 항체에서 HAL403a는 STAT5 인산화를 매우 효과적으로 차단하였다 (도 1). C1GM, C1GM-2 및 C2M3은 STAT5 인산화를 HAL403a에 필적하게 차단하였다 (데이터는 나타내지 않음).

길항제 IL-7R 항체 C1GM 중쇄의 아미노산 서열 (서열 42)은 하기에 나타낸다.

길항제 IL-7R 항체 C1GM 경쇄의 아미노산 서열 (서열 43)은 하기에 나타낸다.

길항제 IL-7R 항체 C1GM-2 중쇄의 아미노산 서열 (서열 45)은 하기에 나타낸다.

길항제 IL-7R 항체 C1GM-2 경쇄의 아미노산 서열 (서열 43)은 하기에 나타낸다.

길항제 IL-7R 항체 HAL403a 중쇄의 아미노산 서열 (서열 17)은 하기에 나타낸다.

길항제 IL-7R 항체 HAL403a 경쇄의 아미노산 서열 (서열 18)은 하기에 나타낸다.

실시예 2: 항체 결합 친화도의 결정

이 실시예는 길항제 IL-7R 항체에 대한 항체 결합 친화도의 결정을 설명한다.

인간 IL-7R에 대한 길항제 IL-7R 항체의 친화도를 연구-등급 CM5 센서 칩 (Biacore™ AB, Uppsala, Sweden - 현재는 GE Healthcare)이 갖추어진 표면 플라스몬 공명 비아코어(Biacore)™ 2000 또는 3000 바이오센서 상에서 측정하였다. 염소 폴리클로날 항-인간 F(ab')2 단편 (Fc 특이적)을 포화 수준에서 모든 4개의 유동 세포 상에 HBS-P 영동 완충액 (비아코어™으로부터 얻음) 중의 표준 N-히드록시숙신이미드/ 에틸디메틸아미노프로필 카르보디이미드 (NHS/EDC) 화학을 사용하여 아민-커플링하였다. 완충액을 1 mg/mL BSA를 함유하는 HBS-P로 바꾸었다. 인간 IL-7R-hFc 항원 (R＆D Systems, Minneapolis, USA)을 약 30 μg/mL로 희석하고, 3분 동안 5 μL/분으로 포획하여 유동 세포 당 약 500-1000 RU의 수준을 수득하고, 참조 채널로서의 역할을 하기 위해 하나의 공백을 남겨두었다. 항체의 Fab, hIgG1, 또는 hIgG2ΔA 형식을 2 μM에서 시작하는 5-원 3-배 계열 및 0.4 μM에서 시작하는 5-원 4-배 계열로서 3분 동안 20-50 μL/분에서 2벌로 주사하였다. 해리를 5분 동안 모니터링하였다. 포획 칩을 75 mM 인산 또는 10 mM 글라이신-HCl (pH 1.7)의 2회 30초 펄스로 마지막 각 적정 주사 후에 재생하였다. 완충액 주기는 결합 반응 데이터를 2중-참조하기 위한 공백을 제공하였고, 이를 이어서 비아이밸류에이션 소프트웨어 v.4.1을 사용하여 단순 가역성 결합 모델에 포괄적으로 적응시켜 각각 역학적 결합 및 해리 속도 상수 ka 및 kd를 추론하였다. 친화도를 그들의 비율로부터 추론하였다 (KD = kd/ka). 표 4의 결과는 이들 항체가 인간 IL-7R에 대해 피코몰 또는 나노몰의 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다.

<표 4>

실시예 4: 길항제 IL-7R 항체는 자연발증 당뇨병 (NOD) 동물, 제1형 당뇨병에 대한 마우스 모델에서 질환 발병률을 감소시킨다

이 실시예는 제1형 당뇨병에 대한 마우스 모델에서의 길항제 IL-7R 항체의 효과를 설명한다.

당뇨병발생 절차에 대한 길항제 IL-7R 항체의 생체내 효과를 연구하기 위해, 래트 항-마우스 길항제 IL-7R 항체, 28G9 (Rinat)를 NOD 마우스에서 시험하였다. NOD 마우스는 자가면역 인슐린 의존형 당뇨병 (IDDM, 제1형 당뇨병) (문헌 [Kikutani et al., 1992, Adv. Immunol. 51: 285-322])의 자발적 발생에 대한 감수성을 나타낸다. 28G9는 마우스 비장세포에서 IL-7-매개된 STAT5 인산화를 차단하고, 비아코어™에서의 길항제 IL-7R 인간 항체 C1GM, C2M3, HAL403a, HAL403b, P3A9, P4B3, P2D2 및 P2E11과 상호-경쟁한다.

6-8 주령 NOD 암컷 마우스 (The Jackson Laboratory)를 9 주령 (t = 0)에서 28G9의 체중 1 kg 당 3 또는 10 mg으로 시작하여 매주 복강내 주사하였다 (i.p.). PBS 또는 비-반응성 아이소타입과 맞는 래트 모노클로날 항체 (아이소타입)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 아이소타입 항체를 체중 1 kg 당 10 mg으로 투여하였다. 마우스를 1주일 당 2회 체중 및 혈액 글루코스에 대해 모니터링하였다. 당뇨병은 혈액 글루코스 수준이 양성 측정값 이상, 즉 2회의 연속된 모니터링에 대해 250 mg/dL 초과인 경우 확립된 것으로 고려되었다. 당뇨병의 발병은 순차적 측정의 초기부터 날짜를 기입하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 28G9 10 mg/kg으로 처리된 마우스 중 심지어 18 주령에서도 당뇨병이 발병된 마우스는 없었다. 이와 대조적으로, PBS 및 아이소타입-처리된 마우스의 75-80％에서 당뇨병이 발병되었다 (도 2). 비록 연구 말기에 28G9 3 mg/kg으로 처리된 마우스가 모두 당뇨병이 없는 것은 아니었지만, PBS 및 아이소타입 대조군과 비교하여 유의하게 감소된 당뇨병 발병률이 관찰되었으며, 당뇨병 발병에 대한 28G9의 억제 효과는 투여량-의존적이라는 것을 입증하였다 (도 2). 28G9 10 mg/kg으로의 처리는 아이소타입 또는 PBS 대조군에 비해 혈액 글루코스 수준을 유의하게 감소시켰다 (도 3a). 길항제 IL-7R 항체 치료 중의 마우스 발생을 체중 및 사망률을 추적함으로써 모니터링하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 3 또는 10 mg/kg 28G9의 다중 투여는 마우스 성장에 대해 유의한 효과를 갖지 않았고, 10 mg/kg에서 사망이 발견되지 않았다. 따라서, 길항제 IL-7R 항체는 혈액 글루코스 수준을 감소시키고, NOD 동물에서 당뇨병 진행을 억제한다. 이들 결과는 길항제 IL-7R 항체가 제1형 당뇨병의 진행의 예방 및 지연에 효과적이라는 것을 입증한다.

말초 T 세포 조절에 대한 길항제 IL-7R 항체의 효과를 조사하기 위해, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 활성화 마커 CD44 및 CD62L에 대해 면역염색하고, 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 PBS-처리되거나, 28G9-처리되거나, 또는 아이소타입-처리된 마우스의 말초 혈액으로부터 단리하였다. 아이소타입 대조군과 비교하여, 28G9로 10 mg/kg으로 처리된 마우스에서의 미접촉 CD8+ T 세포 (B220-CD8+CD44^loCD62L^hi)의 백분율은 유의하게 더 낮았고, 메모리 CD8+ T 세포 (B220-CD8+CD44^hiCD62L^hi)의 백분율은 유의하게 더 높았다 (도 4a 및 4b). 이와 대조적으로, 미접촉 CD4+ T 세포 (B220-CD4+CD44^loCD62L^hi)는 아이소타입 대조군과 비교하여 길항제 IL-7R 항체 처리된 마우스에서 유의하게 고갈되지 않았다 (도 5). 이들 결과는 길항제 IL-7R 항체가 혈액 글루코스 수준을 미접촉 CD8+ T 세포 고갈을 통해 감소시키다는 것을 나타낸다.

실시예 5: 길항제 IL-7R 항체는 자가면역 질환의 발병을 지연시킨다

이 실시예는 다발성 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)에 대한 마우스 모델에서의 길항제 IL-7R 항체의 효과를 설명한다.

STAT5 활성화 검정을 길항제 IL-7R 항체를 확인하기 위해 사용하였다. B6 또는 BALB/c로부터의 비장을 PBS 중에 균질화시키고, ACK 용균 완충액 (Invitrogen) 중에 2분 동안 용균시키고, 이어서 100-μm 구멍 크기의 메쉬(mesh)를 통해 여과시키고, 펠렛화시키고, 5 x 10⁶ 세포/ml로 실온에서 10％ FBS, 페니실린 (100 U/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 및 L-글루타민을 함유하는 37℃ RPMI 1640로 재현탁시켰다. 세포를 37℃에서 5％ CO₂ 중에 코니칼 튜브 중에 자극 전 1-2시간 동안 유지하였다 (단핵구/대식세포 접착을 방지하기 위함). 세포를 IL-7로의 자극 전 5분 동안 시험 항체와 함께 예비인큐베이션시켰다. 세포를 뮤린 IL-7 (mIL-7, 0.1 ng/ml)로 15분 동안 처리하였다. 포름알데히드를 배양 배지에 1.6％의 최종 농도로 직접 첨가하고, 세포를 15분 동안 실온에서 고정시켰다. 메탄올을 이어서 80％의 최종 농도로 직접 첨가하고, 샘플을 4℃에서 면역염색 전 30분 내지 1시간 동안 저장하였다. 다음 항체를 면역염색을 위해 사용하였다: CD11b-FITC (M1/70), B220-Cy5.5PerCP, TCRβ-FITC, p-STAT5 (Y694, 클론 47)-알렉사(Alexa) 647 (BD™ Pharmingen). TCRβ+ 및 CD11b+ 세포를 포스포-STAT5에 대해 염색하였다. IL-7-자극된 STAT5 인산화를 유동 세포계수법에서의 TCRβ와의 동기에 의해 관찰하였다. 모노클로날 항체 28B6 및 28G9를 포함하는, STAT5 인산화를 차단한 수많은 항체를 확인하였다.

활성 EAE를 6- 내지 8-주령 암컷 B6 마우스에서 1 mg/ml의 열-사멸된 마이코박테리엄 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37RA (Difco)를 함유하는 CFA 중에 에멀젼화된 100 μg의 MOG_35-55 펩티드 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (서열 15))로 피하 면역화하여 0일차에 유도하였다 (문헌 [Steinman and Zamvil, 2006]을 참조함). 추가로, 마우스는 0.1 ml의 PBS 중의 400 ng의 백일해 독소 (Calbiochem)를 0 및 2일차에 정맥내 투여받았다. MOG 면역화 후 7일차에서 시작하여, 동물을 주 2회 길항제 IL-7R 항체 28B6 (10 mg/kg), 길항제 IL-7R 항체 28G9 (10 mg/kg), 또는 비-반응성 아이소타입-일치된 항체 (10 mg/kg)로 처리하였다. 아이소타입 대조군과 비교하여, 28G9 또는 28B6로의 처리는 EAE 활성을 빠르면 면역화 후 15일차에 유의하게 감소시켰다 (도 6). 이 결과는 길항제 IL-7R 항체가 EAE의 진행을 지연시키는데 효과적이라는 것을 입증한다.

길항제 IL-7R 항체가 투여량-의존적 방식으로 효과적인지 아닌지를 시험하기 위해, MOG 면역화된 EAE 동물을 면역화 후 7일차 및 14일차에 1 또는 3 mg/kg의 28G9로 처리하였다. 비-반응성 아이소타입-일치된 항체 (1 mg/kg)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 아이소타입 대조군과 비교하여, 두 용량 수준 모두에서의 28G9 처리는 질환 피크에서의 EAE 중증도를 감소시켰다 (도 7). 길항제 IL-7R 항체의 이 억제 효과는 약 1주일 동안 지속되었다. 이 결과는 길항제 IL-7R 항체가 1 및 3 mg/kg 둘다에서 보호를 부여하였다는 것을 입증하였다. 별도의 연구에서, MOG 면역화된 EAE 동물을 7일차에 시작하여 1, 3 또는 10 mg/kg의 28G9로 매주 처리하였다. 28G9 1 mg/kg로 처리된 마우스는 유의한 효능을 사망률 없이 나타냈다 (도 8). 이들 결과는 1 mg/kg의 길항제 IL-7R 항체 처리가 EAE의 진행을 지연시키는데 효과적이고, 잘 견딜만하다는 것을 입증한다.

확립된 질환에서의 길항제 IL-7R 항체 효능을 조사하기 위해, MOG 면역화된 EAE 동물을 면역화 후 14일차에 시작하여 주 2회 28G9 10 mg/kg로 처리하였다. 비-반응성 아이소타입-일치된 항체 (10 mg/kg)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 대조군에 비해, 길항제 IL-7R 항체로의 처리는 EAE 중증도를 유의하게 감소시켰다 (도 9). 길항제 IL-7R 항체에 의한 사망률은 관찰되지 않았다. 이 결과는 길항제 IL-7R 항체가, 확립된 진행 중의 EAE를 완화시키는데 효과적이라는 것을 입증하였다.

길항제 IL-7R 항체가 늦은 개입시 더 낮은 투여량에서 EAE를 감소시킬 수 있는 지를 추가로 결정하기 위해, MOG 면역화된 EAE 동물을 면역화 후 14일차에 시작하여 매주 1회 28G9 3mg/kg으로 처리하였다. 비-반응성 아이소타입-일치된 항체 (3 mg/kg)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 대조군에 비해, 길항제 IL-7R 항체 치료에 의해 질환 중증도의 매우 유의한 감소가 관찰되었다 (도 10). 이 결과는 심지어 늦은 개입 및 더 낮은 투여량에서도 길항제 IL-7R 항체 치료가 질환 활성을 감소시키는데 효과적이라는 것을 입증한다.

실시예 6: 자가면역 질환에서의 길항제 IL-7R 항체 치료법 후의 면역학적 변화

이 실시예는 길항제 IL 7R 항체 치료 후 EAE 마우스에서의 면역학적 변화를 설명한다.

길항제 IL-7R 항체가 마우스 모델에서 EAE를 완화시키는 작용을 하는 기전을 통찰하기 위해, 처리군 및 대조군 동물로부터의 림프구 집단을 면역염색 및 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 이 실시예에서의 면역학적 연구를 위해, MOG 면역화된 EAE 동물을 매주 길항제 IL-7R 항체 28G9 (10 mg/kg), 28B6 (10 mg/kg) 또는 비히클 (비-반응성 아이소타입-일치된 항체, 10 mg/kg)로 처리하였다. 선택된 연구에서, MOG 면역화된 EAE 동물의 군을 매주 28B6 (10 mg/kg)으로 처리하였다. 동물을 면역화 후 21일차에 희생시키고, 중추 림프 기관을 수집하였다. 림프구를 기관으로부터 준비하고, 하기 기재된 바와 같이 염색하였다. 면역염색된 림프구를 유동 세포계수법에 의해 분석하였다.

길항제 IL-7R 항체로 처리된 EAE 동물로부터의 BM, 비장, 혈액 및 흉선에서의 T 세포 집단은 비히클 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, BM, 비장, 혈액 및 림프절로부터의 CD4 T 세포 (도 11a) 및 CD8 T 세포 (도 11b) 집단 둘다는 길항제 IL 7R 항체 처리된 EAE 동물에서 유의하게 감소하였다. 이는 CD4 및 CD8 T 세포 둘다의 발생에서의 IL-7R의 역할과 일관된다. 그러나, B 세포 집단은 모든 말초 림프 기관에서 유의하게 감소하지 않았다. 이 결과는 T 및 B 세포가 둘다 없는 IL-7R 녹아웃으로부터의 마우스 유전 데이터와 다르다.

IL-7R 신호전달이 미접촉 T 세포 생존 및 메모리 T 세포 증식을 위해 중요하기 때문에, 말초 T 세포의 조절에서의 길항제 IL-7R 항체의 효과를 활성화 마커 CD44 및 CD62L을 사용하여 면역염색에 의해 분석하였다. CD44^loCD62L^hi는 미접촉 T 세포를 나타내고, CD44^hiCD62L^lo는 활성화된 T 세포를 나타내고, CD44^hiCD62L^hi는 메모리 T 세포를 나타낸다. 비히클 (비반응성 아이소타입-일치된 항체) 처리된 동물에 비해, 길항제 IL-7R 항체 처리된 마우스는 유의하게 고갈된 미접촉 T 세포 및 활성화된 T 세포 집단을 가졌다 (도 12a 및 12c). 그러나, 메모리 T 세포 집단은 유의하게 고갈되지 않았다 (도 12b). 이 미접촉 및 활성화된 T 세포 집단의 선택적 고갈은 미접촉 T 세포 고갈이 초기의 자가Ag-특이적 T 세포 활성화를 차단하고, 이어서 EAE를 방지할 수 있다는 점에서 이점을 제공할 수 있다. 메모리 T 세포는 고갈되지 않았으며, 따라서 항-감염 면역성은 보존된다.

길항제 IL-7R 항체 처리된 EAE 동물에서의 NK 세포의 감소는 관찰되지 않았다. 아마 CD4 및 CD8 T 세포의 감소된 퍼센트로 인한 NK 세포의 퍼센트의 약간의 증가가 관찰되었다. 이 데이터는 IL-7/IL-7R 신호전달이 T 세포를 조절하지만, NK 세포 발생은 조절하지 않는다는 관찰과 일관된다.

EAE 동물에서의 T_reg 세포 집단에 대한 길항제 IL-7R 항체 치료의 효과를 결정하기 위해, 림프구를 T_reg 세포 및 MOG-MHC 부류 II (I-Ab) 사량체를 확인하여 MOG-특이적 T 세포를 검출하기 위해 Foxp3에 대해 염색하였다. 28G9 처리된 EAE 동물로부터의 림프절에서 검출된 MOG-특이적 CD4+ T_eff 세포의 집단은 대조군 (비반응성 아이소타입-일치된 항체-처리된) 동물의 집단과 유사하였다 (도 13, 좌측 그래프). 그러나, T_reg 세포 집단의 증가가 28G9 처리로 관찰되었다 (도 13, 우측 그래프). 이들 결과는 길항제 IL-7R 항체로의 EAE 동물의 처리는 T_reg 세포 집단의 증가를 야기한다는 것을 입증한다. 유리하게, 길항제 IL-7R 항체 치료는 IL-2Rα 항체 치료법으로 관찰된 부작용인 다른 염증성 질환을 발병시키지 않을 수 있다.

림프구 제제 및 면역형광 염색

상기 연구를 위해, 비장, 말초 림프절 (대립 겨드랑, 기관지 및 샅굴), 흉선 및 양측 대퇴골 골수 (BM)로부터의 단일-세포 백혈구 현탁액을 가벼운 절제에 의해 생성하였다. 중추신경계 (CNS)로부터의 단핵 세포를 PBS에 의한 심장 관류 후 단리하였다. 요컨대, CNS 조직을 콜라게나제 D (2.5 mg/ml; Roche Diagnostics) 및 DNaseI (1 mg/ml; Roche Diagnostics)로 37℃에서 45분 동안 소화시켰다. 단핵 세포를, 조직을 70-μm 세포 여과기 (BD Biosciences)를 통해 통과시키고, 이어서 퍼콜(Percoll) 구배 (70％/37％) 원심분리하여 단리하였다. 림프구를 37％/70％ 경계면으로부터 수집하고, 세척하였다. 다음 항체를 면역염색을 위해 사용하였다: FITC-, PE- 또는 PE-Cy5-접한된 CD3 (17A2), CD4 (H129.19), CD8 (53-6.7), CD62L (MEL14), CD44 (IM7), B220 (H1.2F3), IgM (II/41), DX5 (CD49b) (모두 BD Biosciences로부터 얻음). 세포내 사이토킨 염색을 위해, 림프구를 시험관내에서 골지스톱(GolgiStop)™ (모넨신) (5ug/ml)의 존재하에 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (20 ng/ml; Sigma-Aldrich) 및 이오노마이신 (1 μg/ml; Sigma-Aldrich)으로 염색 전 5시간 동안 자극시켰다. MOG_38-49/IAb 사량체 및 대조군 사량체 (CLIP/IAb)는 NIH 사량체 코어 퍼실리티(Tetramer Core Facility)에 의해 구축되고 공급되었다. 배경 염색을 비반응성, 아이소타입-일치된 대조군 mAbs를 사용하여 평가하였다. 2- 또는 3-색 면역형광 분석을 위해, 단일-세포 현탁액 (10⁶개 세포)을 4℃에서 mAb의 예비 결정된 최적 농도를 사용하여 20분 동안 염색하였다. 사량체 염색을 위해, 림프구를 37℃에서 3시간 동안 염색하였다 .

실시예 7: 길항제 IL-7R 항체는 식이-유도된 비만 (DIO) 동물에서 글루코스 불내성을 완화시킨다

이 실시예는 제2형 당뇨병에 대한 마우스 모델에서의 길항제 IL-7R 항체의 효과를 설명한다.

길항제 IL-7R 항체의 DIO 마우스에서의 예비-확립된 지방 염증에 대한 생체내 효과를 연구하기 위해, C57BL/6 수컷 마우스 (The Jackson Laboratory)에 고지방 식이 (HFD, D12492, 60 Kcal％ 지방, Research Diets)를 6주령부터 먹였다. 고지방 식이 10주 후, 16-주령 비만 마우스를 길항제 IL-7R 항체 28G9 (10 mg/kg), PBS, 또는 비반응성 아이소타입-일치된 대조군 항체 (10 mg/kg)의 i.p. 투여를 위해 그룹별로 무작위로 배정하였다. 항체 치료 4일 후, 마우스를 글루코스 불내성을 평가하기 위해 글루코스 내성 시험 (16시간 공복 후 i.p. 1 g/kg)에 적용시켰다. 표 5는 각각 처리군 (PBS-, 아이소타입- 또는 28G9-처리된 마우스)에 대한 평균 체중 및 글루코스 수준을 나타낸다. 각 군의 동물은 유사한 체중을 가졌다.

<표 5>

글루코스 내성 시험의 결과를 도 14에 나타냈다. 고지방 식이에 의해 유도된 글루코스 불내성을 길항제 IL-7R 항체 치료에 의해 개선시켰다. 글루코스 내성 시험에서, 28G9로 처리된 DIO 마우스는 아이소타입 또는 PBS로 처리된 마우스에 비해 유의하게 더 낮은 혈액 글루코스 수준을 가졌다 (도 14). 이 결과는 길항제 IL-7R 항체가 제2형 당뇨병에 대해 동물 모델에서 효과적이라는 것을 입증하였다.

실시예 8: 길항제 IL-7R 항체는 류마티스 관절염에 대한 마우스 모델에서의 질환 중증도를 감소시킨다

이 실시예는 류마티스 관절염 (RA)에 대한 마우스 모델에서의 길항제 IL-7R 항체의 효과를 설명한다.

콜라겐 유도된 관절염 (CIA)은 RA와 많은 병리학적 및 조직학적 유사성을 공유하는 널리 사용되는 동물 모델이다. CIA에 대한 생체내 길항제 IL-7R 항체의 효과를 연구하기 위해, 6-8 주령 수컷 B10.RIII 마우스 (stock # 000457, The Jackson Laboratory)를 4 mg/ml의 열-사멸된 마이코박테리엄 튜버큘로시스 H37RA (Difco)를 함유하는 프로인트 완전 아쥬반트 중에 에멀젼화된 150 ug의 유형 II 콜라겐 (Elastin Products)으로 0일차 및 15일차에 면역화시켰다. 마우스를 1, 3 또는 10 mg/kg의 길항제 IL-7R 항체 28G9 또는 비반응성 아이소타입-일치된 대조군 항체로 -1일차, 1일차, 8일차, 15일차 및 22일차에 i.p. 주사하였다.

CIA의 임상적 징후를 0 내지 5점 점수화 체계로 매일 평가하였다: 0, 정상; 1, 뒷발 또는 앞발 관절이 영향받거나 또는 최소 광범위 홍반 및 부기; 2, 뒷발 또는 앞발 관절이 영향받거나 또는 가벼운 광범위 홍반 및 부기; 3, 뒷발 또는 앞발 관절이 영향받거나 또는 중등도 광범위 홍반 및 부기; 4, 현저한 광범위 홍반 및 부기; 5, 광범위 홍반 및 발 전체의 심한 부기, 발가락을 굽히지 못함. 28G9 3 mg/kg으로의 처리는 아이소타입 대조군과 비교하여 CII-면역화된 마우스에서 CIA의 중증도를 유의하게 감소시켰다 (도 15). 28G9 1 mg/kg으로의 처리는 유의한 감소를 나타내지 않았다. 이 결과는 길항제 IL-7R 항체가 류마티스 관절염에 대해 동물 모델에서 질환 진행을 지연시키는데 효과적이라는 것을 입증한다.

실시예 9: 길항제 IL-7R 항체는 확립된 EAE에 대한 마우스 모델에서의 질환 중증도를 감소시키다

이 실시예는 확립된 EAE에 대한 마우스 모델에서의 길항제 IL-7R 항체의 효능을 설명한다.

EAE를 SJL/J 마우스에서 4 mg/ml의 열-사멸된 마이코박테리엄 튜버큘로시스 H37Ra (Difco Laboratories)를 함유하는 완전 프로인트 아쥬반트 중에 용해된 200 μg의 PLP(p139-151)로 면역화시킴으로써 유도하였다. 마우스를 EAE의 체중 측정 및 임상적 징후를 위해 매일 검사하였고, 다음과 같이 점수를 매겼다: 0, 마비되지 않음; 1, 꼬리 색조의 손실; 2, 뒷다리의 쇠약; 3, 뒷다리의 마비; 4, 뒷다리 및 앞다리의 마비; 5, 빈사 또는 사망.

2-3의 EAE 임상적 점수를 갖는 마우스를 28G9 (10 mg/kg, i.p.), SB/14 (10 mg/kg, i.p.) 또는 대조군 IgG (10 mg/kg, i.p.)으로 1주일에 1회 2주 동안 (0, 7 및 14일차에) 처리하였다. 28G9는 래트 IgG1 항체이고, SB/14 (BD Biosciences)는 래트 IgG2a 항체이다. 임상적 점수를 매일 61일차 까지 모니터링하였다.

7일차가 되었을 때, 28G9로 처리된 마우스는 2보다 더 낮은 임상적 점수를 가졌다 (N=7). 28G9로 처리된 마우스는 연구의 종말 (61일차)까지 약 2의 임상적 점수를 유지하였다. 이와 비교하여, IgG-처리된 동물 대조군은 연구 내내 3 및 4 사이의 임상적 점수를 가졌다. 대조군에 비해 SB/14 치료로의 질환 중증도의 감소는 관찰되지 않았다.

질환 중증도의 매우 유의한 감소가 28G9 길항제 IL-7R 항체 처리된 동물에서 관찰되었다. 이들 결과는 길항제 IL-7R 항체가 확립된 자가면역 질환에서 질환 중증도를 감소시키는데 효과적이라는 것을 입증한다.

실시예 10: 길항제 IL-7R 항체는 새롭게 발병한 당뇨병을 갖는 동물에서 혈액 글루코스 수준을 감소시킨다

이 실시예는 제1형 당뇨병에 대한 마우스 모델에서 새롭게 발병한 당뇨병을 반전시키는 길항제 IL-7R 항체의 효능을 설명한다.

길항제 IL-7R 항체의 패널을 제1형 당뇨병에 대한 마우스 모델에서 시험하였다. 28G9는 래트 IgG1 모노클로날 항체이고, 28G9-mIgG2a는 마우스 IgG2a 불변 영역을 갖는 28G9 가변 영역을 갖는 항체이고, agly-28G9는 마우스 IgG2a N297A를 갖는 28G9 가변 영역을 갖는 비글리코실화된 항체이다. 28G9-mIgG2a의 구축 및 발현을 위해, 래트 모노클로날 항체 28G9의 VH 및 Vk 유전자를 PCR에 의해 증폭시키고, pARC 마우스 IgG2a 및 pARC 마우스 카파(kappa) 포유동물 발현 벡터 내에 클로닝하고, 리포펙타민(Lipofectamin)™ (Invitrogen™)에 의해 293F 세포 내에 공동형질감염시켰다. 형질감염 후 5일 후, 배양 배지를 수거하고, 28G9 마우스 IgG2a를 마브셀렉트(Mabselect)™ (GE) 수지를 사용함으로써 정제하였다. agly-28G9의 구축 및 발현을 위해, 래트 28G9의 VH를 CH2 도메인의 Asn-297이 Ala에 의해 대체된 유전자조작된 pARC 마우스 IgG2a 벡터 (pARC 마우스 IgG2a-N297A) 내에 클로닝하였다. 비글리코실화된 m28G9 (agly-28G9)를 pARC 마우스 IgG2a-N297A 및 pARC-28G9 마우스 카파 벡터에 의한 293F 세포의 공동형질감염에 의해 수득하였다.

자발적으로 새롭게 발병한 당뇨병성 NOD 마우스 (즉, 250 mg/dl 초과의 2회의 연속된 혈액 글루코스 농도)를 28G9-mIgG2a (10 mg/kg, i.p.), 28G9 (10 mg/kg, i.p.), agly-28G9 (10 mg/kg, i.p.) 또는 대조군 IgG (10 mg/kg, i.p.)로 매주 i.p. 처리하였다. 혈액 글루코스 수준을 질환 발병 후 140일 동안 매일 모니터링하였다. 28G9-mIgG2a로 처리된 마우스에서, 100％ 완화가 관찰되었다. 28G9-mIgG2a 처리된 NOD 마우스에서, 혈액 글루코스 수준을 매주 28G9-mIgG2a 주사와 함께 250 mg/dl 미만으로 유지하였다. 28G9는 또한 대조군 IgG에 비해 혈액 글루코스 수준을 감소시키는 일부 효능을 나타냈다. Agly-28G9-처리된 마우스 및 IgG-처리된 대조군 마우스는 연구 내내 250 mg/dl 초과의 혈액 글루코스 수준을 가졌다. 이들 결과는 28G9-mIgG2a 길항제 IL-7R 항체가 확립된 제1형 당뇨병을 갖는 마우스에서 혈액 글루코스 수준을 감소시키는데 매우 효과적이라는 것을 입증한다.

별도의 연구에서, 자발적으로 새롭게 발병한 당뇨병성 NOD 마우스를 질환 발병에서 시작하여 매주 28G9-mIgG2a (10 mg/kg i.p.)로 표 6에 나타낸 투여량의 수로 처리하였다. 혈액 글루코스 수준을 매일 모니터링하였다.

<표 6>

표 6에 나타낸 결과는 길항제 IL-7R 항체의 2회 투여량은 혈액 글루코스 수준을 89일 이하 동안 250 mg/dL 미만으로 유지하기에 충분하였다는 것을 나타낸다. 길항제 IL-7R 항체의 3회 투여량은 혈액 글루코스 수준을 적어도 117일 동안 250 mg/dL 미만으로 유지하기에 충분하였다. 이 연구에서, 250 mg/dL 미만으로 유지된 혈액 글루코스 수준은 길항제 IL-7R 항체 치료 후 5개월 이하 동안 관찰하였다.

상기 기재된 연구의 결과는 길항제 IL-7R 항체 28G9-mIgG2a가 새롭게 발병한 당뇨병을 갖는 동물에서 혈액 글루코스 수준을 감소시키는데 매우 효과적이었다는 것을 입증한다. 추가로, 단지 길항제 IL-7R 항체의 2회 또는 3회 투여량으로 처리된 마우스는 혈액 글루코스 수준을 항체 투여 후 수개월 동안 250 mg/dL 미만으로 유지하였다.

실시예 11: 길항제 IL-7R 항체는 이식편대숙주병 (GVHD)에 대한 마우스 모델에서 질환 중증도를 감소시킨다

이 실시예는 급성 및 만성 이식편대숙주병 (GVHD)에 대한 마우스 모델에서의 길항제 IL-7R 항체의 효과를 설명한다.

급성 GVHD

급성 GVHD의 마우스 모델에 대해, 10x10⁶개 인간 PBMC (신선하게 단리됨)를 비-조사 NOD.SCID IL2Rγ-/- 마우스 (The Jackson Laboratory, 8-12주령) 내에 주사하였다. 주사 14일후, 마우스를 10 mg/kg 길항제 길항제 IL-7R 완전 인간 IgG1 항체 HAL403b (n=10) 또는 아이소타입 대조군 (n=10)으로 1주일에 1회 처리하였다. GVHD의 임상적 징후 및 체중을 1주일에 2회 모니터링하였다. 치료 40일 후, 아이소타입 대조군-처리된 동물의 50％만이 생존한 것과 대조적으로 길항제 IL-7R 항체-처리된 동물의 100％가 생존하였다. 이 결과는 길항제 IL-7R 항체가 급성 GVHD에 대한 동물 모델에서 사망률을 감소시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다.

만성 GVHD

만성 GVHD 마우스 모델을 위해, CD3+ T 세포의 작은 (1-5％) 백분율을 함유하는 인간 제대혈 세포를 신생 조사 NOD.SCID IL2Rγ-/- 마우스 내에 이식하였다. 요컨대, 인간 CD34+ 제대혈 (AllCells, LLC, Emeryville, CA)에서 CD3+ T 세포를 인간 CD3 선택 비드 (Miltenyi Biotec GmBH, Germany, CAT #130-050-101)를 사용하여 고갈시켰다. 이식을 위해, 약 300,000 내지 400,000개 CD34+ 세포를 함유하는 약 1-5％ CD3+ T 세포 (50 μl의 부피 중)를 신생 조사 NOD.SCID IL2Rγ-/- 마우스 (The Jackson Laboratory)에 심장내 주사하였다. cGVHD는 이식 16-20주 후 발병하였다.

24주령에서 시작하여, cGVHD를 갖는 마우스를 10 mg/kg 길항제 IL-7R 완전 인간 IgG1 항체 HAL403b (n = 4) 또는 PBS (n = 4)로 1주일에 1회 희생될 때까지 주사하였다.

마우스를 약 28-32주령에서 길항제 IL-7R 항체 또는 PBS 치료 약 4 내지 8주 후 희생시켰다. 길항제 IL-7R 완전 인간 IgG1 항체로 처리된 마우스는 PBS로 주사된 마우스보다 유의하게 더 적은 털 손실을 가졌다. 조직학적 분석은 PBS-처리된 마우스의 신장이 길항제 IL-7R 항체-처리된 마우스의 신장보다 일반적으로 더 심하게 영향받은 것을 나타냈다. 예를 들어, 대조군 (PBS-처리된) 마우스의 신장은 증가된 양의 호산구 물질과 함께 현저하게 두꺼워진 모세혈관 루프를 가졌다. 이와 대조적으로, 길항제 IL-7R 항체로 처리된 마우스의 신장은 증가된 양의 호산구 물질과 함께 약간 두꺼워진 모세혈관 루프를 가졌다. 추가로, 길항제 IL-7R 항체로 처리된 마우스의 신장은 많은 확장된 세관을 나타낸 아이소타입 대조군으로 처리된 마우스의 신장에 비해 더 적은 확장된 세관을 가졌다. 폐 조직학은 일부 기관지 연관된 림프 조직 (BALT)이 존재한 대조군 마우스의 폐와 비교하여 길항제 IL-7R 항체로 처리된 마우스의 폐에서의 실질적으로 감소된 BALT를 밝혔다. 심한 림프 위축이 PBS로 처리된 마우스의 비장에서의 가벼운 변화 내지 중등도 변화에 비해 길항제 IL-7 R 항체로 처리된 마우스의 비장에서 관찰되었다.

이들 결과는 길항제 IL-7R 항체가 만성 GVHD에 대한 동물 모델에서 질환 중증도를 감소시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다.

실시예 12: 길항제 IL-7R 항체는 루푸스에 대한 마우스 모델에서 질환 중증도를 감소시킨다

이 실시예는 루푸스에 대한 마우스 모델에서의 길항제 IL-7R 항체의 효과를 설명한다.

루푸스의 마우스 모델을 위해, MRL/MpJ-Fas^lpr/J 마우스 (The Jackson Laboratory)를 사용하였다. 일반적으로 lpr 돌연변이체로 지칭되는 이들 마우스는 림프증식 자발적 돌연변이 (Fas^lpr)에 대해 동형접합이고, 전신성 자가면역성, 이상 T 세포의 증식과 연관된 대량 림프절병증, 관절염, 및 면역 복합체 사구체신증을 나타낸다. 따라서, MRL/MpJ-Fas^lpr/J 마우스는 전신성 홍반성 루푸스에 대한 모델로서 유용하다.

질환 발병의 시기에서 시작하여, 마우스를 매주 1, 3, 또는 10 mg/kg 28G9-mIgG2a 길항제 IL-7R 항체 (실시예 10을 참조함), 1 mg/kg agly-28G9 길항제 IL-7R 항체, 아이소타입 대조군 IgG (음성 대조군) 또는 시클로포스파미드 (양성 대조군)로 i.p. 투여하였다. 각각 치료 군에 대해, 10마리의 마우스 (n=10)를 사용하였다. 질환 중증도를, 단백뇨 수준, 활성 수준을 측정하고, 직립 반사를 평가함으로써 모니터링하였다. 직립 반사의 평가에서, 그들 자신을 30초 내에 직립시키는데 실패한 마우스는 희생시켰다. 생존율은 하기 표 7에 요약된다.

<표 7>

표 7에 나타낸 바와 같이, 1 mg/kg agly-28G9, 3 mg/kg 28G9-mIgG2a 또는 10 mg/kg 28G9-mIgG2a로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군 IgG로 처리된 마우스에 비해 증가된 생존율을 가졌다. 이들 결과는 길항제 IL-7R 항체가 루푸스에 대한 동물 모델에서 질환 중증도를 감소시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다.

실시예 13: 길항제 IL-7R 항체의 에피토프 맵핑/결합

이 실시예는 항체 결합 에피토프를 맵핑하기 위한 구조-유도 돌연변이생성을 설명한다.

IL-7/IL-7Rα 복합체의 결정 구조 및 IL-7 결합에서의 특정 잔기의 예상되는 관여를 기반으로 하여 (문헌 [McElroy et al., 2009, Structure, 17(1):54-65]), 23개 IL-7Rα 표면-잔기 돌연변이체 (N29D, V58S, E59R, R66N, K77S, L80S, I82S, K84S, K100S, T105A, N131S, Q136K, K138S, Y139F, K141S, M144A, D190S, H191N, Y192A, Y192F, K194S, K194A 및 F196S)를 항체 결합 에피토프를 맵핑하기 위한 돌연변이에 대해 선택하였다. 돌연변이체 (즉, N29D, V58S, E59R 등)에 대한 넘버링은 초기 20개 아미노산을 계수하지 않는 처리-후 단백질의 관례를 따른다.

IL-7Rα 단일 점 돌연변이체 (his-태그됨)의 패널을 다음과 같이 제조하였다. 상기 기재된 23개 IL-7Rα 단일 점 돌연변이체를 표준 DNA 기술을 사용하여 이전에 기재된 야생형 DNA 구축물 (상기 문헌 [McElroy et al., 2009])로부터 생성하였다. 돌연변이체 단백질을 HEK293T 세포에서의 일과성 형질감염을 사용하여 발현시켰고, 세포 배지 내에 분비시켰다. 돌연변이체 단백질을 Ni²⁺ 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단백질 농도를 분광광도법(NanoDrop™)에 의해 측정하였다.

IL-7Rα의 상호작용 분석을 25℃에서 GLM 센서 칩 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 갖춘 표면-플라스몬 공명-기반 프로테온(ProteOn)™ XPR36 바이오센서를 사용하여 수행하였다. HBST 영동 완충액 (10 mM 헤페스(Hepes) pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05％ v/v 트윈-20)을 내내 사용하였다. 전장 IL-7R 항체 (HAL403a 또는 HAL403b)를 약 2000-5000 RU의 수준으로 표준 EDC/술포-NHS-매개된 화학을 통해 칩의 별도의 "수직" 채널 상에 아민-커플링하였다. IL-7Rα 돌연변이체의 패널 (야생형 IL-7Rα를 포함함)을 "수평" 방향으로 100 nM에서 각각 30 uL/분의 3 및 10분의 결합 및 해리 상을 사용하여 스크리닝하였다. 표면을 2/1 v/v 피어스(Pierce) 이뮤노퓨어(immunopure) 용출 완충액 (pH2.8) /4M NaCl로 재생하였다. 대부분의 주사를 검정이 재현가능한 것을 확인하기 위해 중복하였다.

표 8은 야생형 IL-7Rα에 비해 항체 결합에 대한 IL-7Rα 돌연변이체에서의 단일 점 돌연변이의 영향을 요약한다.

<표 8>

야생형 IL-7Rα에 비해 약화된 항체 결합을 나타내는 IL-7Rα 돌연변이체는 mAb 결합에 관여하는 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 것으로 확인되었다. 항체 HAL403a에의 IL-7Rα의 결합 잔기를 돌연변이체 효과의 하향 순서로 다음과 같이 확인하였다: I82 (결합에 대한 큰 영향), K84 (중간 영향), K100 (중간 영향), T105 (중간 영향), Y192 (중간 영향), D190 (작은 영향), H191 (작은 영향), 및 K194 (작은 영향). 항체 HAL403b에의 IL-7Rα의 결합 잔기를 돌연변이체 효과의 하향 순서로 다음과 같이 확인하였다: I82 (결합에 대한 큰 영향), K84 (중간 영향), K100 (중간 영향), T105 (중간 영향), Y192 (중간 영향), D190 (작은 영향), H191 (작은 영향), 및 K194 (작은 영향).

개시된 교시내용이 다양한 용도, 방법, 키트 및 조성물과 관련하여 기술되었지만, 본원의 교시내용 및 하기의 청구된 발명을 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기의 예들은 개시된 교시내용을 더 잘 설명하기 위해 제공되고, 본원에 제시된 교시내용의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 교시내용이 이러한 예시적인 실시양태들의 관점에서 기술되었지만, 이러한 예시적인 실시양태들의 수많은 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다. 모든 이같은 변경 및 변형이 현재의 교시내용의 범주 내에 속한다.

특허, 특허 출원, 논문, 교재 등을 비롯한 본원에서 인용된 모든 참고문헌 및 이에 인용된 참고문헌은, 이들이 이미 포함되어 있지 않는 정도로, 참고로 전문이 본원에 포함된다. 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기술 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 포함된 문헌 및 유사한 자료들 중 하나 이상이 본 출원과 다르거나 모순되는 경우, 본 출원이 우선한다.

상기의 설명 및 실시예는 본 발명의 특정한 구체적인 실시양태를 상술하고, 본 발명자들에 의해 구현된 최적의 양식을 기술한다. 그러나, 상기의 것들이 문서에서 아무리 상세하게 나타날 수 있을지라도, 본 발명이 다수의 방식으로 실행될 수 있고, 첨부된 청구항 및 이의 임의의 등가물에 따라 본 발명이 해석되어야 함이 이해될 것이다.

ATCC PTA-11678 20110209 ATCC PTA-11679 20110209

SEQUENCE LISTING <110> Rinat Neuroscience Corporation <120> ANTAGONIST ANTI-IL-7 RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS <130> PC33990A <140> 61/438,205 <141> 2011-01-31 <150> 61/307,670 <151> 2010-02-24 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Asn Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Val Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser 85 90 95 Ser His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Cys 100 105 110 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser 20 25 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<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Ser or Tyr <400> 50 Xaa Xaa Val Met His 1 5 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Leu or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Gly or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be Trp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Asp or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be Phe, Gly or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Phe, Ala or Ser <400> 51 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Gln or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Gly or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Asp or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be Tyr or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Met, Val or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Gly or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be Asn, Asp or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn, Tyr or Asp <400> 52 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Arg or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Ser or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asp or Ala <400> 53 Thr Xaa Ser Ser Gly Xaa Ile Xaa Ser Ser Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Asp or Asn <400> 54 Glu Asp Xaa Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Gln or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Ser or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be Asp or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Phe or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be His or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be His or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Val or Trp <400> 55 Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Phe Thr Phe Asp Asp Ser Val Met 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gly Trp Asp Gly Phe Phe 1 5 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any amino acid <400> 58 Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Tyr 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val 1 5 <210> 61 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Phe His His Leu 1

Claims (1)

1. 인터류킨-7 수용체 (IL-7R)에 특이적으로 결합하며, IL-7R에의 결합에 대해 P3A9, P4B3, P2D2, P2E11, HAL403a, HAL403b, C1GM 및 C2M3으로 이루어진 군으로부터 선택된 모노클로날 항체와 상호-경쟁하는 항원 결합 영역을 포함하는 단리된 IL-7R 항체의 자가면역 장애를 치료하기 위한 용도.

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