CN118027211A - 一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种识别重组EGF‑CRM197疫苗的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体的轻链VL‑CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，轻链VL‑CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，轻链VL‑CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3；所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列为VH‑SEQ ID NO.4，重链CDR2的氨基酸序列为VH‑SEQ ID NO.5，重链CDR3的氨基酸序列为VH‑SEQ ID NO.6。本发明可用于重组EGF‑CRM197疫苗放行效价检测以及用于评估免疫重组EGF‑CRM197疫苗后的免疫效能。

Description

一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体说涉及一种用于识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体及其应用。
背景技术
人表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种由53个氨基酸组成的单链低分子量多肽，主要分布于人体各种组织的细胞外液中。EGF主要通过EGFR发挥其功能，EGF与EGFR结合后，可激活包括Ras-Raf-MAPK、 JAK-STAT、PI(3)K-Akt等在内的多条信号通路。近年来研究显示：在许多实质性肿瘤如神经胶质细胞瘤、乳腺癌肺癌、卵巢癌、头颈部磷癌、宫颈癌、食管癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌等中EGF及EGFR均有过度表达。多种肿瘤通过自分泌和旁分泌的方式产生大量EGF，从而使EGFR通路过度活化。过度活化的EGFR通过多条传导信号通路，增强转录、转录后活动或基因表达，使细胞表型发生转化，进而导致肿瘤的发生、发展。因此，降低肿瘤细胞内EGF 的含量，对于抑制肿瘤细胞的增殖、肿瘤细胞间的信号传导，进而抑制肿瘤的发展具有举足轻重的作用。
重组EGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗（以下简称“重组EGF-CRM197疫苗”）是一种EGF与载体蛋白CRM197交联而成的新型结合疫苗，由上海惠盾生物技术有限公司研发，该疫苗已通过CDE审评，获得了国家I类新药的临床试验批文（批件号：2017L04930），目前已完成Ⅰ期临床试验，正在开展Ⅱ期临床试验。该疫苗的主要机制是诱导患者体内产生高水平的抗EGF抗体，中和体内的EGF，从而抑制EGF/EGFR信号通路，进而抑制依赖该信号通路的肿瘤细胞的生长，达到治疗肿瘤的目的。
疫苗效价是重组EGF-CRM197疫苗的最重要的放行质量标准。常用的检测疫苗效价的方法为将疫苗免疫小鼠或豚鼠后，进行体内攻毒实验或获取血清进行抗体滴度测定，该方法操作复杂且耗时较长。参照2020年版中国药典“甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检查法”，通过比对不同批次重组EGF-CRM197疫苗中抗原（EGF）量与理化对照品的比值，我们建立了重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力的测定方法，该方法中采用的捕获抗体为重组EGF-CRM197疫苗免疫小鼠后制备的单克隆抗体，该抗体可有效的与包被疫苗中的抗原结合，敏感度远高于商用购买的单克隆抗体。
此外，在临床使用中，重组EGF-CRM197疫苗免疫后诱导产生的中和抗体，中和患者血清中的EGF，从而发挥抗肿瘤效应，因此，血清中EGF浓度的下调也是评价疫苗免疫效能的重要衡量指标，研发一种特异性识别重组EGF-CRM197的单克隆抗体，作为EGF定量ELISA检测试剂盒的捕获或检测抗体，可用于定量检测免疫重组EGF-CRM197疫苗的患者，血清中EGF的浓度，进而评估重组EGF-CRM197疫苗的有效性，为患者加强免疫提供依据。
综上所述，研发一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，可用于检测重组EGF-CRM197疫苗的体外相对效力，为重组EGF-CRM197临床使用前进行质量控制提供了一种有力的手段；此外，一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，可用于人EGF定量ELISA检测试剂盒的制备。因此，伴随重组EGF-CRM197疫苗的开发及临床应用，研发一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供了一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够结合重组EGF-CRM197疫苗，在评价重组EGF-CRM197相对效价和临床分析中，评价疫苗免疫效能方面发挥了重要作用。
为达到此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面：本发明提供一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链VL-CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，轻链VL-CDR2的氨基酸序列为SEQ IDNO.2，轻链VL-CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3；
所述单克隆抗体的重链VH-CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，重链VH-CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，重链VH-CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
所述SEQ ID NO.1如下所示：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS KSVITSGYSY
所述SEQ ID NO.2如下所示：
MHWYQQKPGQPPKLLIY LAS
所述SEQ ID NO.3如下所示：
NLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QHSRELPFT
所述SEQ ID NO.4如下所示：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKAS GYTFTSYI
所述SEQ ID NO.5如下所示：
LHWVKQRPGQGLDWIGY INPYNDGT
所述SEQ ID NO.6如下所示：
KYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYC ARWGWVVATDYTMDY
进一步的，所述抗体的轻链包括三个轻链CDR以及连接轻链CDR的轻链框架区；所述抗体的重链包括三个重链CDR以及用于连接重链CDR的重链框架区；
进一步的，所述单克隆抗体用于制备评估重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力的试剂盒或定量检测血清中EGF浓度的ELISA试剂盒。
本发明还提供了一种制备单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
步骤1：动物免疫：采用6周龄的BALB/c 小鼠，抗原为重组EGF-CRM197疫苗。免疫途径为皮下注射；每周给药1次，共给药4次。
步骤2：细胞融合：将步骤（1）中优选出的小鼠，制备脾细胞悬液。取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞开始融合，采用PEG介导的融合法进行融合。
步骤3：杂交瘤细胞的筛选：扩增步骤（2）中的杂交瘤细胞，取上清检测ELISA效价及抗体亚型，选取针对EGF抗原呈阳性的细胞进行克隆。为保证杂交瘤细胞株的阳性率和稳定地产生抗体，进行3-4次克隆，选取3-4次筛选均为100%阳性的克隆。
步骤4：杂交瘤细胞的克隆化：将步骤（3）筛选出的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞S-172-4细胞；
步骤5：单克隆抗体的制备：裸鼠腹腔提前一周注射液体石蜡0.5 ml，将步骤（4）得到的S-172-4细胞用生理盐水调整至5×106/ml，腹腔注射200 µl，7-10天后，收集小鼠腹水。腹水通过Protein A层析柱纯化，先用A液 PB PH7.0 平衡层析柱，腹水样品上柱后，采用B液 0.1 M 甘氨酸-HCl PH2.7，线性洗脱，直至出现抗体的峰型，最终用1M PH 8.0Tris-Hcl将纯化后的抗体PH调节至7.2，过膜除菌，获得S-72-4单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明的优势之处在于：本发明提供的单克隆抗体能够特异性的识别重组EGF-CRM197疫苗，具有中和EGF能力，能够用于可用于检测重组EGF-CRM197疫苗的体外相对效力，为重组EGF-CRM197临床使用前进行质量控制提供了一种有力的手段；此外，在临床使用中，重组EGF-CRM197疫苗免疫后诱导产生的中和抗体，中和患者血清中的EGF，从而发挥抗肿瘤效应，因此，血清中EGF浓度的下调也是评价疫苗免疫效能的重要衡量指标，研发一种特异性识别重组EGF-CRM197的单克隆抗体，作为EGF定量ELISA检测试剂盒的捕获或检测抗体，可用于定量检测免疫重组EGF-CRM197疫苗的患者，血清中EGF的浓度，进而评估重组EGF-CRM197疫苗的有效性，为患者加强免疫提供依据。评价疫苗免疫效能方面发挥了重要作用。
附图说明
图1为本发明的单克隆抗体S-172-4与商品化购买的抗人EGF抗体分别检测重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力结果图。
图2为本发明的单克隆抗体S-172-4制备的人EGF定量ELISA检测试剂盒，标准品曲线。
具体实施方式
为更一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
在本发明中，EGF即人EGF，也可以表示为hEGF。
实施例1：单克隆抗体S-172-4的制备过程
本实施例的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、杂交瘤细胞的克隆化和抗体制备等。
（1）动物免疫：采用6周龄的BALB/c 小鼠，抗原为重组EGF-CRM197疫苗。用10μg重组EGF-CRM197疫苗与Montanide ISA51VG佐剂（法国Seppic化学试剂公司，货号：T02621）等体积混合乳化后，于小鼠背部皮下注射；每周给药1次，共给药4次，末次免疫后一周，取脾脏进行融合。
（2）细胞融合：末次免疫后一周制备；
脾细胞悬液的制备：于细胞融合当天制备，取已经免疫EGF-CRM197疫苗的BALB/c小鼠，摘取眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清，同时颈脱位致死小鼠，取其脾脏，制备脾细胞悬液。
骨髓瘤细胞悬液的制备：提前两周复苏细胞，保证使用时细胞处于对数生长期；
饲养层细胞的制备：提前两天获得小鼠腹腔巨噬细胞，加入96孔板培养；
细胞融合：采用PEG介导融合细胞方法，取脾细胞与骨髓瘤细胞按照5:1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5分钟，去掉上清，用力振动离心管，振散细胞，在1分钟内加入1ml 50%PEG（pH8.0，40℃），边加边摇动，加完后静置90秒，加入无血清的DMEM培养基终止融合，1500rpm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。
（3）杂交瘤细胞的筛选
细胞培养5天后，用HAT培养基换液1次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。用EGF包板，检测杂交瘤细胞培养上清，二抗为酶标记羊抗鼠抗体，小鼠抗血清为阳性对照，筛选出抗体表达量最高的杂交瘤细胞。
（4）杂交瘤细胞克隆化
筛选出特异性强阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单克隆抗体细胞株S-172-4。
从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或者多个杂交瘤细胞，他们分泌的抗体是不同质的，为了得到完全同质的单克隆抗体，必须并杂交瘤细胞进行克隆化；
制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至8个细胞/ml，同时在杂交瘤细胞悬液中加入小鼠腹腔细胞，每毫升加入5E4个细胞。按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔0.8个杂交瘤细胞；37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取出上清做抗体检测。
取抗体检测阳性孔细胞扩大培养，并冻存，同时，再进一步对阳性孔的细胞进行克隆化，用ELISA的方法对克隆化的单抗进行鉴别，筛选出分泌抗体。
（5）制备抗体
将筛选出的杂交瘤细胞进行扩大培养，取6周龄左右的裸鼠，裸鼠腹腔提前一周注射液体石蜡0.5 ml，将步骤（4）得到的S-172-4细胞用生理盐水调整至5×106/ml，腹腔注射200 µl，7-10天后，收集小鼠腹水。腹水通过Protein A层析柱纯化，先用A液 PB PH7.0 平衡层析柱，腹水样品上柱后，采用B液 0.1 M 甘氨酸-HCl PH2.7，线性洗脱，直至出现抗体的峰型，最终用1M PH 8.0 Tris-Hcl将纯化后的抗体PH调节至7.2，过膜除菌，最终获纯化后的S-172-4单克隆抗体。
所述单克隆抗体的轻链VL-CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，轻链VL-CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，轻链VL-CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3；
所述单克隆抗体的重链VH-CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，重链VH-CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，重链VH-CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
所述SEQ ID NO.1如下所示：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS KSVITSGYSY
所述SEQ ID NO.2如下所示：
MHWYQQKPGQPPKLLIY LAS
所述SEQ ID NO.3如下所示：
NLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QHSRELPFT
所述SEQ ID NO.4如下所示：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKAS GYTFTSYI
所述SEQ ID NO.5如下所示：
LHWVKQRPGQGLDWIGY INPYNDGT
所述SEQ ID NO.6如下所示：
KYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYC ARWGWVVATDYTMDY
实施例2：单克隆抗体S-172-4/商品化单克隆抗体用于检测重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力
（1）将重组EGF-CRM197疫苗供试品、重组EGF-CRM197疫苗参比品用Na2CO3-NaHCO3缓冲液分别稀释至1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8pg/ml，将稀释好的8个梯度的重组EGF-CRM197疫苗供试品和参比品包被酶标板，每个稀释度2个复孔，每孔100 μl， 2-8℃过夜。然后PBST洗板、拍干。用200 μl封闭液进行封闭，37℃孵育2h。
（2）取已包被好的酶标板，加入适宜浓度的S-172-4杂交瘤单克隆抗体或者商品化的兔抗人EGF单克隆抗体1号（货号ab184265，abcam），或商品化的兔抗人EGF单克隆抗体2号（货号AF5148，affinity bioseience），37℃孵育1 h。洗板后，1μg/ml羊抗鼠IgG-HRP或羊抗兔IgG-HRP，每孔100 μl ，37℃孵育1h。
（3）洗板后，加入100 μl/孔的TMB，避光孵育15min后，加50 μl/孔终止液，450nm读数。
（4）结果计算
将线性最好的8个浓度点中选取5个浓度的重组EGF-CRM197疫苗供试品品和理化对照品的OD值记录于下表1。
表1.
疫苗包被浓度 参比疫苗OD（S） 供试品疫苗OD（T）
500 S5 T5
250 S4 T4
125 S3 T3
62.5 S2 T2
31.25 S1 T1
体外相对效价=供试品抗原含量/参比疫苗抗原相对含量
供试品抗原含量/参比抗原含量=antilg(V/W×lg2)
V=0.2(T1+T2+T3+T4+T5-S1-S2-S3-S4-S5)
W=0.1(T5-T1+S5-S1)+0.05(T4-T2+S4-S2)
本发明的单克隆抗体S-172-4与商品化购买的抗人EGF抗体分别检测重组EGF-CRM197疫苗，OD响应值如图1所示：使用本发明的S-172-4单克隆抗体，重组EGF-CRM197浓度在7.8~1000pg/ml之间，都显示出良好的线性关系；而商品化购买的抗人单克隆抗体仅在125~1000pg/ml之间，存在一定的线性关系，灵敏度远低于本发明的S-172-4抗体。
采用重组EGF-CRM197样品作为供试品，3人次检测，每人次检测3次，每批样品3人次共检测9次。分析结果显示，采用本发明的S-172-4单克隆抗体检测重组EGF-CRM197疫苗的体外相对效力，结果稳定，重复性较好，变异系数CV在10%以内。而采用商品化的抗人EGF抗体，重复性差，变异系数CV在25%以上。
表2. S-172-4单克隆抗体/市售抗人EGF抗体检测重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力结果对比
实施例2：单克隆抗体S-172-4用于制备人EGF检测试剂盒
健康人外周血血清中EGF浓度约在0~300pg/ml（中位值约150pg/ml），肺癌患者外周血血清中EGF浓度约在0~500pg/ml（中位值约250pg/ml）。重组EGF-CRM197疫苗作用机制为诱导机体产生针对EGF的中和抗体，进而降低血清中EGF的浓度，从而达到抗肿瘤的作用，因此血清中EGF的监测是评估重组EGF-CRM197疫苗免疫效能的重要临床指标。目前市售的抗人EGF抗体用于制备人EGF定量ELISA检测试剂盒，一般仅能识别纳克级别（ng/ml）的EGF，无法满足临床的需求。市面上进口的R&D公司的定量ELISA检测试剂盒，可用于人血清中EGF含量的测定，但定价较高，且仅用于科学研究，并未获得医疗器械许可，无法应用于重组EGF-CRM197疫苗上市后的临床检测。因此，伴随开发适用于重组EGF-CRM197疫苗临床应用的人EGF定量检测试剂盒，具有重要意义。
本实施例中，我们采用了本发明的S-172-4单克隆抗体作为捕获抗体，选用市售的兔抗人EGF多克隆抗体（货号ab9695，abcam）作为检测抗体。选取市售的兔抗人EGF单克隆抗体（货号AF5148，affinity bioseience）作为捕获抗体，市售的兔抗人EGF多克隆抗体（货号ab9695，abcam）作为检测抗体同样进行如下操作。
用pH9.6的NaCO3-NaHCO3缓冲液，将S-172-4单克隆抗体稀释至终浓度5μg/ml，加入96微孔板中，100μl/孔，2-8℃度包被过夜。
将S-172-4单克隆抗体包被好的PBST洗板、拍干，加入200 μl封闭液进行封闭，37℃孵育2h。
标准品/样品的配置：将EGF标准品用缓冲液稀释为梯度500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8pg/ml，缓冲液作为空白“0”点。
将标准品和待测血清样本分别加入封闭后的96孔板中，200μl/孔，平行做2孔，盖上封板膜，37℃孵育1小时。
PBST洗板3次、拍干，加入10μg/ml 市售的兔抗人EGF多克隆抗体作为检测抗体，100μl/孔，37℃孵育1小时。
PBST洗板3次、拍干，加入1μg/ml羊抗鼠IgG-HRP，100μl/孔，37℃孵育1小时。
PBST洗板3次、拍干，加入100 μl/孔的TMB，避光孵育15min后，加50 μl/孔终止液，450nm/650nm读数。
结果计算：将标准品溶液和供试品的OD值取平均值后扣除空白对照平均值的OD值，用标准品溶液做四参数逻辑曲线，带入供试品的OD值，计算样品孔的EGF浓度。
本发明的单克隆抗体S-172-4，制备的人EGF定量检测试剂盒绘制的标准曲线OD读数，如下表所示，S-172-4单克隆抗体制备的人EGF定量ELISA检测试剂盒标准品OD读数，根据标准曲线OD读数绘制的标准曲线见图2。结果显示，用S-172-4制备的人EGF定量检测试剂盒，在15.6-500pg/ml之间，具有良好的线性关系，R2>0.95，而市售的抗EGF单克隆抗体仅在500pg/ml浓度时有响应。
表3. S-172-4单克隆抗体/市售抗人EGF抗体制备的人EGF定量ELISA检测试剂盒测定EGF标准品OD值对比
标准品EGF浓度（pg/ml） S-172-4单克隆抗体组 市售抗EGF单克隆抗体组
500 2.025 0.35
250 1.295 0.18
125 0.781 0.16
62.5 0.425 0.152
31.25 0.227 0.143
15.625 0.142 0.14
7.8125 0.143 0.14

Claims (5)

1.一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链VL-CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，轻链VL-CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，轻链VL-CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3；
所述单克隆抗体的重链VH-CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，重链VH-CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，重链VH-CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的轻链包括三个轻链CDR以及连接轻链CDR的轻链框架区；所述抗体的重链包括三个重链CDR以及用于连接重链CDR的重链框架区。
3.一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述单克隆抗体用于制备评估重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力的试剂盒或定量检测血清中EGF浓度的ELISA试剂盒。
4.根据权利要求3所述的识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体的应用，其特征在于，当所述单克隆抗体用于制备评估重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力的试剂盒时，重组EGF-CRM197浓度在7.8~1000pg/ml之间，显示出良好的线性关系。
5.根据权利要求3所述的识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体的应用，其特征在于，当所述单克隆抗体用于定量检测血清中EGF浓度的ELISA试剂盒时，重组EGF-CRM197浓度在15.6-500pg/ml之间，具有良好的线性关系。
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