CN105801699A

CN105801699A - 一种重组抗egfr单克隆抗体

Info

Publication number: CN105801699A
Application number: CN201410857145.3A
Authority: CN
Inventors: 黎健荣; 朱晓丹
Original assignee: SHENZHEN SCIPROGEN BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: SHENZHEN SCIPROGEN BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2016-07-27

Abstract

本发明涉及基因工程产品领域，更具体地，本发明公开了一种重组的抗EGFR单克隆抗体和其在制备抗肿瘤药物中的用途；所述抗体包括如SEQ ID NO:5所示的重链可变区的第60、100位位点上的氨基酸被取代和/或如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区的第95位位点上的氨基酸被取代。本发明的突变抗体，比原未突变抗体具有更高的亲和力，具有更好的抗肿瘤效果。

Description

一种重组抗EGFR单克隆抗体

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗EGFR单克隆抗体。

背景技术

EGFR(英语：epidermalgrowthfactorreceptor，简称为EGFR、ErbB-1或HER1)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170Kda，其靠与配体结合来激活，激活后，EGFR由单体转化为二聚体，而且EGFR还可与ErbB受体家族的其他成员聚合来激活，EGFR二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路，包括Y992,Y1045,Y1068,Y1148andY1173等激活位点。这个自磷酸化可以引导下游的磷酸化，包括MPAK，Akt和JNK通路,诱导细胞增殖。

研究表明，EGFR在多种人上皮组织来源的癌症(如膀胱、乳腺、宫颈、结肠、头颈、肾、肺、胰腺、以及前列腺等)中有不同水平的表达，EGFR在结肠直肠癌表达率高达25－77％，且与肿瘤的恶化以及不良预后相关。EGFR的特异性配体为EGF和EGF相关多肽，包括转化生长因子α(TGF-α)，双调蛋白以及肝素结合EGF样生长因子。为了激活EGFR，配体EGF(单体)同时结合并连接两个相邻的受体链，使受体的胞内激酶局域在多个酪氨酸上相互磷酸化，酪氨酸激酶活性提高从而可以激活数个信号通路如ras-MAPK通路，PI3激酶通路以及JAK/STAT通路等。EGFR受体过表达或突变后结构激活(不需要配体)以及自分泌刺激导致的过度EGFR功能与多种癌症发生相关。EGFR的致瘤效应包括DNA合成启动，促进细胞生长、侵袭以及转移，特异性敲除EGFR可导致细胞周期俘获、细胞凋亡以及癌细胞的分化。

Cetuximab(C225)是Imclone公司开发的一种鼠/人嵌合的单克隆抗EGFR抗体。Cetuximab可以与EGFR受体以高出内源配体约5到10倍的亲和力与EGFR特异结合，从而竞争性拮抗配体与EGFR的结合，封锁受体与配体的结合继而抑制配体介导的EGFR酪氨酸激酶的激活，从而使肿瘤细胞或肿瘤微环境中的基质细胞中多种由EGFR信号通路调节的细胞过程被阻断，包括EGFR下调，细胞内信号的抑制，细胞周期的抑制，凋亡的诱导，DNA修复的抑制，血管生成的抑制，肿瘤细胞运动性、侵袭性以及转移性的抑制等等。美国FDA于2004年2月批准该抗体用于结直肠癌的治疗，2006年又增加头颈部肿瘤的适应症。

虽然目前已经有相关的抗EGFR单克隆抗体应用于临床，为了增强抗体的特异性，提高检测灵敏度，增强抗体的功能同时降低抗体的用量，进而提高对肿瘤的杀伤效果，更高亲和力的抗EGFR单克隆抗体仍是目前所急需的。

发明内容

本发明的申请人经过大量的研究实验，构建了一种具有高亲和力的重组抗EGFR单克隆抗体。所述抗体与Cetuximab相比具有更高的亲和力活性，能够更加有效的识别EGFR抗原。具体地，本发明公开了：

1.一种重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括如SEQIDNO:5所示的重链可变区的第60、100位位点、和/或如SEQIDNO:6所示的轻链可变区的第95位位点上的氨基酸被取代。

2.上述1所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述位点上的氨基酸是被谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。

3.上述2所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7-12或SEQIDNO:15任一所示，和/或轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13或SEQIDNO:14所示。

4.上述3所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7-12或SEQIDNO:15任一所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13或SEQIDNO:14所示；或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示。

5.上述4所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示。

6.上述1-5任一所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

7.一种制剂，含有上述权利要求1至6任一所述的重组抗EGFR单克隆抗体和可药用的载体。

8.上述1至6任一所述的抗EGFR单克隆抗体或权利要求7所述制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

9.上述8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌。

10.上述9所述的用途，其特征在于，所述治疗还包括与其他的抗肿瘤药组合施用。

更具体地，本发明的申请人首先根据美国专利US7060808公开的抗EGFR单抗资料及序列,构建了抗EGFR嵌合抗体C225(Cetuxiamb)的轻、重链可变区和恒定区基因，然后通过表达、纯化，最终获得抗EGFR嵌合抗体C225。根据图1所示的氨基酸突变位点，采用overlapPCR的方式对序列突变的嵌合抗体进行构建，其构建、表达、纯化的方法与未突变的嵌合抗体C225相同。所述突变抗体包括C225重链可变区和/或轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第60、100位，轻链可变区第95位氨基酸的位置，取代氨基酸为谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

对于本发明，任何合适的真核表达载体都可以使用，这些载体可以为pcDNA3.1(+)，pDR1，pDHFF之一。

本发明的申请人对上述C225的突变抗体进行了亲和力检测。实验结果表明，申请人构建的C225抗体的亲和力比市售的Cetuxiamb有了很大的提高，其中重链可变区第60位苏氨酸或精氨酸取代的突变抗体(H60NT或H60NR)，亲和力提高了至少3倍；重链可变区第100位精氨酸或丝氨酸取代的突变抗体(H100TR或H100TS)，亲和力提高至少提高8倍；轻链可变区第95位精氨酸取代的突变抗体(L95PK)，其亲和力提高了6倍；针对上述重链可变区和轻链可变区的突变点进行两点或三点的组合突变，其中H60NT、H100TS和L95PK三点突变，其亲和力提高近25倍。

申请人还针对Cetuximab突变体的功能进行研究。通过对Cetuximab突变体的ADCC功能检测，随着Cetuximab突变体亲和力的提高，ADCC功能也显著增强，通过高亲和力Cetuximab突变体体内小鼠生存实验，结果显示，H60PT、H100YR和L93NR三点突变抗体较Ceuximab在A431细胞动物模型上，显示出良好的肿瘤治疗效果(P<0.01)。

本发明公开上述高亲和力的C225突变抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述C225突变抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使C2B8突变抗体颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含高亲和力的C225突变抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为预防和/或治疗肿瘤的药物使用。

本发明公开的C225突变抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT－207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤(6－MP)和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素－2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin)；5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的C2B8突变抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

本发明所指的肿瘤包括结直肠癌、头颈部肿瘤及肺鳞状细胞癌等EGFR阳性的上皮来源肿瘤，这里不再一一列举。

附图说明

图1.C225抗体重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列(图中第一行序列表示Cetuxiamb的重链、轻链的碱基序列，第二行序列表示氨基酸序列，框线的地方表示构建的突变体的突变位点)；

图2.C225突变抗体抗肿瘤效果对比实验结果图。

具体实施方式

以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，2^ndedition，ColdspringHarborLaboratoryPress.

实施例1.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液(购自鼎国生物技术发展公司)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，根据文献(ClonedhumanandmousekappaimmunoglobulinconstantandJregiongenesconservehomologyinfunctionalsegments.HieterPA,MaxEE,SeidmanJG,MaizelJVJr,LederP.Cell.1980Nov；22(1Pt1):197-207.)和文献(ThenucleotidesequenceofahumanimmunoglobulinCgamma1gene.EllisonJW,BersonBJ,HoodLE.NucleicAcidsRes.1982Jul10；10(13):4071-9.)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链恒定区和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(购自promega公司)中，测序验证后确认获得了正确的克隆，其中，SEQIDNO：1和SEQIDNO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。将本例中的重链恒定区的正确克隆记作pGEM-T/CH，轻链恒定区的正确克隆记作pGEM-T/CL。

实施例2.抗EGFR嵌合抗体C225的表达载体构建

参照美国专利US7060808公开的抗EGFR单抗资料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗EGFR单克隆抗体C225重链可变区基因(C225VH)及轻链可变区基因(C225VL)。图1显示了C225重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。

以C225VH基因和pGEM-T/CH载体为模板通过重叠PCR合成嵌合抗体重链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。得到PCR产物C225VHCH，其5'端含有限制酶位点HindⅢ和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoRⅠ，信号肽基因序列如SEQIDNO：16所示。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindⅢ和EcoRⅠ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收嵌合抗体重链片段C225VHCH，与用HindⅢ和EcoRⅠ酶切的质粒pcDNA3.1(+)(购自美国Invitrogen公司)进行连接，构建成嵌合重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(C225VHCH)。

以C225VL基因和pGEM-T/CL载体为模板通过重叠PCR合成嵌合抗体轻链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。得到PCR产物C225VLCL，其5'端含有限制酶位点HindⅢ和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoRⅠ，信号肽基因序列如SEQIDNO：17所示。挑选测序正确的克隆用HindⅢ和EcoRⅠ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收嵌合抗体轻链片段C225VLCL，与用HindⅢ和EcoRⅠ酶切的质粒pcDNA3.1载体(购自美国Invitrogen公司)进行连接，构建成嵌合轻链真核表达载体pcDNA3.1(C225VLCL)。

实施例3.嵌合抗体的稳定表达与纯化

于加有含血清培养基的3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵CHO-K1细胞(ATCCCRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染，具体转染过程如下：

取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(C225VHCH)4μg和质粒pcDNA3.1(C225VLCL)6μg)和20μlLipofectamine2000Reagent(购自Invitrogen公司)分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到培养皿中，置于CO₂孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。

转染进行24h后，用含600μg/mlG418选择培养基筛选抗性克隆，其中，筛选方法为取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆，筛选过程如下：

将羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品HumanmyelomaIgG1,κ(购自Sigma公司)，37℃温育2h，加入HRP－羊抗人IgG(κ)(购自SouthernBiotechnologyAssociates公司)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB(四甲基联苯胺)于37℃作用5分钟，最后用H₂SO₄终止反应，测A₄₅₀值。

将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用ProteinA亲和柱(购自GE公司)分离纯化嵌合抗体C225。

将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。

实施例4.C225抗体突变体的构建及表达

采用overlapPCR的方式进行C225抗体突变体的构建，其构建、表达、纯化的方法与C225嵌合抗体相同，构建的抗体突变体共10个，分别命名为Cmut1～Cmut10，各突变抗体的突变位点分别如表1所示，其中，抗体的重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)的氨基酸序列分别见SEQIDNO：2和SEQIDNO：4，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列分别见SEQIDNO：5～15，其中，SEQIDNO：5为C225的重链可变区氨基酸序列，SEQIDNO：6为C225轻链的可变区氨基酸序列，SEQIDNO：7为C225重链可变区氨基酸序列的60位氨基酸残基由N突变为T的突变序列，SEQIDNO：8为C225重链可变区氨基酸序列的60位氨基酸残基由N突变为R的突变序列，SEQIDNO：9为C225重链可变区氨基酸序列的60位氨基酸残基由N突变为S的突变序列，SEQIDNO：10为C225重链可变区氨基酸序列的100位氨基酸残基由T突变为R的突变序列，SEQIDNO：11为C225重链可变区氨基酸序列的100位氨基酸残基由T突变为S的突变序列，SEQIDNO：12为C225重链可变区氨基酸序列的100位氨基酸残基由T突变为E的突变序列，SEQIDNO：13为C225轻链可变区氨基酸序列的95位氨基酸残基由P突变为K的突变序列，SEQIDNO：14为C225轻链可变区氨基酸序列的95位氨基酸残基由P突变为R的突变序列,SEQIDNO：15为C225重链可变区氨基酸序列的60位氨基酸残基由N突变为T，100位氨基酸残基由T突变为R的突变序列。

实施例5.C225及突变体的biacore鉴定

将SA芯片(购自GE公司)在50μl/min的PBS溶液中25℃平衡30min，然后用1MNaCl和50mMNaOH的活化液活化3次，每次1min；将biotin标记的人EGFR分子(购自R&D公司)稀释成终浓度为1μg/ml，以10μl/min的流速进行包被(ΔRu＝1000)；然后用PBS缓冲液50μl/min平衡10min。将平衡后的芯片用0.04％的生物素溶液封闭芯片。将抗体以等两倍比稀释五个浓度，50μl/min上样75秒，然后用PBS解离10分钟。在相同样品浓度下，突变抗体Cmut1-10的亲和力的相对值如表1所示。

表1.biacore检测抗体突变体的亲和力

WT表示申请人自行构建的未突变的C225抗体；Cetu表示市售Cetuximab，mutant表示C225的突变抗体。

实验结果表明，申请人构建的C225抗体的亲和力与市售的Cetuxiamb的亲和力相似。相对于申请人自行构建的未突变的C225抗体或市售的Cetuxiamb，仅进行重链单点突变的抗体Cmut1和Cmut2亲和力均提高了3倍以上；仅进行轻链单点突变的Cmut7亲和力提高近6倍；仅进行重链单点突变的Cmut4和Cmut5亲和力提高8倍多；仅进行重链双点突变的Cmut9亲和力仅提高2倍，而同时进行轻链和重链三点突变体的抗体Cmut10，其亲和力提高了近25倍。

实施例6.C225突变抗体抗肿瘤效果实验

取30只SCID小鼠(购自必凯公司)，3.5×10⁶的人结肠癌细胞NCI-H716(ATCC,CCL-251)皮下注射上述SCID小鼠；5天后将小鼠随机分为3组，每组10只；分别静脉注射100μg本发明的Cmut10突变抗体、市售Cetuximab和PBS，观察小鼠的生存时间。每日观察小鼠状况，当肿瘤体积大于2000mm³时，处死该小鼠。生存曲线做图参照Kaplan-Meier的方法进行，组间比较采用log-rank检验进行分析[BlandJM,AltmanDG.Survivalprobabilities(theKaplan-Meiermethod).BMJ.1998；317:1572.]，实验结果如图2所示，本发明的突变抗体对NCI-H716细胞肿瘤小鼠模型显示出较强的抗肿瘤效果(P<0.001)。其它C225突变抗体也进行相同实验，实验结果表明，除Cmut3和Cmut8外，其它C225突变抗体均显示出比市售Cetuximab更强的抗肿瘤效果。

以上实验结果表明，本发明的重组抗EGFR抗体比市售的Cetuximab表现出更强的亲和力，具有较强的抗肿瘤效果，可用于制备治疗肿瘤，特别是制备抗结肠癌等肿瘤的药物。

Claims

2.根据权利要求1所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述位点上的氨基酸是被谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。

3.根据权利要求2所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7-12或SEQIDNO:15任一所示，和/或轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13或SEQIDNO:14所示。

4.根据权利要求3所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7-12或SEQIDNO:15任一所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13或SEQIDNO:14所示；或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示。

5.根据权利要求4所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示。

6.根据权利要求1-5任一所述的重组抗EGFR单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

8.根据权利要求1至6任一所述的抗EGFR单克隆抗体或权利要求7所述制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述治疗还包括与其他的抗肿瘤药组合施用。