CN107033244A - 一种高亲和力的人源化抗cd20单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体。所述抗体包括优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，其中，CD20H为CD20重链可变区与恒定区Fc序列连接得到，CD20L为CD20轻链可变区与恒定区Fc序列连接得到；将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上Hind III酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列。本发明通过大量实验最终确定了一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，该抗体既有低免疫原性又有高亲和力。

Description

一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体的讲是一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体。
背景技术
非霍奇金淋巴(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是临床中常见的淋巴造血系统恶性肿瘤，非霍奇金淋巴瘤是一种常见的B细胞型淋巴瘤。随着NHL发病的逐年增加，化疗药物是治疗NHL的最主要的方式。虽然，放化疗药物对有效控制患者病情、延长缓解期具有重要意义。然而，在对患者进行放化疗时，不但可以杀伤肿瘤细胞，同时也会对人体内的正常细胞产生一定的杀伤作用，继而不同程度的影响患者消化功能、骨髓功能，同时还会产生血小板及白细胞减少、掉发脱发、胃口缺乏、恶心呕吐等一系列的不良反应，致使患者的生活质量水平降低、甚至有的患者因为不能忍受化疗带来的痛苦而停止进行化疗。现代医疗技术中的放化疗技术已经不能满足人类迫切治疗该类疾病的渴求，而具有靶向治疗机制的单克隆抗体方法开始被人们广泛研究和应用。近几年，对NHL的靶向性治疗以及单克隆抗体药物的临床研究取得了较大的突破，可以被人们接受使用的便是抗CD20单克隆抗体药物，并且它的临床治疗效果得到了广泛的认可。CD20分子在B淋巴细胞表面特异性表达，是分子量大小为34-36kDa的膜蛋白，由297个氨基酸组成，在细胞表面以非糖基化的形式呈现。CD20分子包含4个跨膜区，其中羧基端与氨基端都在胞质内侧，而第三跨膜区与第四跨膜区间的含有43个氨基酸的环区，构成了CD20分子的抗原表位。临床NHL 85％为B细胞型淋巴瘤，CD20分子在大多数成熟和恶性B细胞表面表达。并且CD20分子对抗体来说容易接近，结合后不易脱落，不会发生抗原的调变,成为治疗NHL的理想靶点。
抗体的人源化有两大原则：设计高亲和力的抗体；降低抗体的免疫原性。目前，对CD20抗体进行人源化与亲和力的提高都是分别进行的。
在抗体亲和力改造方面，通常只是提高抗体的亲和力，仍含有鼠源序列的框架区，如：2014年，郝庆钦(非专利文献1)等，以人cTnI作为抗原，免疫小鼠，通过杂交瘤技术制备了高亲和力的抗人cTnI单抗；2016年，李若彤(非专利文:2)先构建大鼠抗小鼠CD40单链抗体的噬菌体展示文库并对文库进行不断的筛选得到高亲和力的抗体。赵磊(非专利文献3)(上海抗体药物国家工程研究中心--专利CN102030826A(专利文献1))在前期得到的Rituximab/CD20抗原肽共结晶的基础上，通过基于抗体进化规律的计算机辅助设计，将重链可变区57位天冬氨酸和102位酪氨酸分别突变成谷氨酸和赖氨酸，轻链可变区93位的天冬酰胺突变成精氨酸，这样改造所获得的新抗体比Rituximab的亲和力高了15.47倍。虽然同时对这三点进行突变所得到的抗体的亲和力得到了极大地提高了，但由于其整个可变区都是异源的，在进行临床试用时仍能够被人体的免疫系统识别而产生HAMA反应，因此有必要对鼠单抗可变区作进一步的人源化改造。
而在降低抗体免疫原性方面，通常是将含有鼠源序列的骨架替换成人的骨架，如：2014年，贾茹(非专利文献4)等利用计算机在蛋白质结构数据库中找到与rituximab空间结构最相近的人IgG1为骨架，将其互补决定区(CDR)进行移植，从而得到人源化的CD20抗体。2017年，Zhang YF(非专利文献5)等构建人源化兔单克隆抗体时将含盖大多数抗原接触残基的组合Kabat/IMGT/Paratome的CDR区移植到人种系构架序列中。张海峰(非专利文献6)(永卓博济生物医药有限公司--专利US 20130089540A1(专利文献2))就采用独特的抗体人源化技术，以鼠单抗2B8(Rituximab的原始鼠源单抗)为基础，选择与MHC II结合位点较少的人胚系抗体框架序列，极大的降低了抗体的免疫原性。通过该方法对CD20抗体进行的人源化，其免疫原性具有极大的降低。
由以上可以看出，前人在对抗体改造时，只对其中一方面进行改造，还没有发现将这两者同时进行设计与改造，获得既有低免疫原性又有高亲和力的抗体药物。如将两者同时进行改造，则杀伤肿瘤细胞的效果有可能比只是改造其中一方面的效果要好。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：郝庆,钦周,建平,等.一对高亲和力抗人肌钙蛋白I单克隆抗体的制备及鉴定[J].2014，21(4):462-465.
非专利文献2：刘若彤.抗小鼠CD40单链抗体噬菌体展示文库的构建及高亲和力抗体的筛选[D].天津:天津医科大学,2016.
非专利文献3：赵磊.新型CD20抗体的设计及生物学功能研究[D],上海:第二军医大学,2011.
非转文献4：贾茹,靳彦文,李平,等.新型人源化抗CD20单克隆抗体的表达和活性检测[J].安徽大学,2014,38(11):875-878.
非专利文献5：Zhang YF，Ho M.Humanization of rabbit monoclonalantibodies via grafting combined Kabat/IMGT/Paratome complementarity -determining regions:rationale and examples[J].MAbs,2017,http://dx.doi.org/10.1080/19420862.2017.1289302
非专利文献6：张海峰.新型人源化抗CD20抗体的设计及生物学功能研究[D],上海:第二军医大学,2013.
专利文献
专利文献1：上海抗体药物国家工程研究中心有限公司.一种高亲和力的抗CD20单克隆抗体：中国，CN102030826A[P],2011.04.27.
专利文献2：Jie Liu,Yongke Zhang.New Humanized Anti-CD20MonoclonalAntibody[P],US 20130089540A1.
发明内容
为了获得既有低免疫原性又有高亲和力的抗体药物，本发明通过大量实验最终确定了一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，该抗体既有低免疫原性又有高亲和力。
本发明的目的是由以下技术方案实现的：
一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，所述抗体包括优化的CD20H、CD20L核苷酸序列或优化的CD20H、CD20L编码的氨基酸序列，其中，CD20H为CD20重链可变区与恒定区Fc序列连接得到，CD20L为CD20轻链可变区与恒定区Fc序列连接得到；将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上Hind III酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，优化的CD20H核苷酸序列为SEQ ID NO：1，优化的CD20L核苷酸序列为SEQ ID NO：2，优化的CD20H编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，优化的CD20L编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
进一步的，本发明还提供了一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体的制备方法，所述抗体的制备方法包括如下制备步骤：
所述抗体包括如下制备步骤：
1)将CD20抗体轻、重链可变区与恒定区Fc序列连接，即得到高亲和力的人源化CD20抗体的全长氨基酸序列，分别命名为CD20L、CD20H；
2)将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上Hind III酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，其中，CD20H的引物为5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGGATTCA-3’、5’-CGGGAATTCCTATTATTTACCGGGA GACA-3’，分别命名为FL-H F、FL-H R，CD20L的引物为5’-CCCAAGCTTGCCACCATGG ATTTTCAAGTG-3’、5’-CGGGAATTCCTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAG-3’，分别命名为FL-L F、FL-L R；
3)将优化后的CD20H、CD20L核苷酸序列及质粒载体PCDNA3.1、PCDNA3.1/ZEO经HindIII、EcoRI双酶切，把酶切后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳回收，回收后得到目的基因与载体；
4)将目的基因与载体在22℃条件下用T4DNA连接酶连接2h，经T4DNA连接酶连接后得表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L；
5)把连接后得到的表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L分别转化到感受态细胞DH5α中；
6)利用氨苄西林(Amp)抗性筛选阳性克隆；
7)利用抽屉试剂盒对质粒进行抽提；
8)CHO k1细胞的转染与单克隆细胞的筛选。
进一步的，本发明的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体的制备方法还可以由以下技术方案实现：
所述步骤2)中CD20H的信号肽序列为ATGGGATTCAGCAGGATC TTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC，CD20L的信号肽序列为ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGA。
所述步骤3)中HindIII、EcoRI双酶切酶切体系包括：
目的基因酶切体系2-A：
目的载体酶切体系2-B：
所述步骤4)中T4DNA连接酶的连接体系包括：
连接体系2-A：
所述步骤8)CHO k1细胞的转染与单克隆细胞的筛选包括如下步骤：
A、CHO-K1细胞转染及加压筛选
(1)用含有10％FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2的条件下对CHO-k1细胞进行培养；
(2)测G418、Zeocin的筛选浓度与维持浓度；
(3)以3×104个/孔将CHO-K1细胞接种在24孔板中，细胞在含10％FBS的500ulDMEM/F12的完全培养液中培养至50-70％的汇合度左右；
(4)用jetPEI试剂进行转染：将1ug的DNA溶液和150mM Nacl混合成总体积为50ul的溶液，其中1ug的DNA溶液含重链表达质粒0.4ug、轻链表达质粒0.6ug；
(5)在48ul的150mM Nacl溶液中加入2ul的jetPEI溶液，并混匀；
(6)将步骤(5)的jetPEI溶液加入到步骤(4)的DNA溶液中，涡旋并离心；
(7)将步骤(6)的混合溶液在室温孵育15min；
(8)将孵育了15min的100ul jetPEI/DNA溶液滴入到500ul培养基的细胞中，并混匀；
(9)将转染了表达载体的CHO-K1细胞，放在37℃，5％的CO2孵箱中，未转染的CHOk1细胞作对照；
(10)在转染了24h后，用G418和Zeocin同时进行加压筛选，每3-5d换一次液，培养21d后换维持培养基培养；
B、单克隆筛选
(1)有限稀释法进行单克隆筛选：将经G418和Zeocin加压筛选到的阳性克隆重悬成细胞悬液，计数，并用DMEM/F12完全培养基将其稀释成2个细胞/孔，200ul/孔接种到48孔板中，接种18个孔后，将培养板放在37℃，5％CO2的培养箱中培养；
(2)5天后，即可见单细胞克隆生长，之后用含G418与Zeocin的DMEM/F12培养基进行加压筛选；
(3)再过5-7天后，待细胞生长覆盖孔底90％以上后，用胰酶消化后，以1x104个/孔分别接种于原孔中；
(4)取上清用ELISA法检测蛋白分泌量，从中挑出表达量最高的克隆。
本发明还提供了一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体制剂，含有所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体和可药用的载体。
本发明还提供了一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体的用途，该抗体在制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
进一步的，本发明的用途还包括：
所述B细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。
所述B细胞淋巴瘤为慢性淋巴性白血病。
为了得到高亲和力、低免疫原性的单克隆抗体，本发明做了如下工作：
(1)载体构建：设计并改造了与亲和力和免疫原性有关的个别位点，得到了高亲和力的人源化抗体的轻重链核苷酸序列，并分别与含有不同筛选标记的真核表达载体连接，便于后续的筛选。
(2)细胞中表达：将连接有目的基因的载体转染进CHO-k1细胞，并通过药物加压筛选获得了阳性克隆。
(3)单克隆筛选：通过有限稀释法对筛选的阳性克隆进行单克隆细胞株的筛选，并通过ELISA法检测分泌的蛋白含量，从而筛选获得高表达的单克隆细胞株。
(4)抗原结合活性：将筛选获得的高表达单克隆细胞株所分泌的抗体处理CD20+细胞Raji细胞，通过FCM检测发现该单克隆抗体具有抗原抗体结合活性。
(5)CDC效应：是当抗体对肿瘤细胞杀伤时补体参与的细胞毒作用，将筛选获得的高表达单克隆细胞株所分泌的抗体处理CD20+细胞Raji细胞，具有较高的杀伤毒性，这表明了筛选的细胞株所表达的抗体，对Raji细胞具有补体依赖细胞毒性。
(6)ADCC效应：是抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，将筛选获得的高表达单克隆细胞株所分泌的抗体处理CD20+细胞Raji细胞，具有杀伤毒性，这表明了筛选的细胞株所表达的抗体，对Raji细胞具有抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。
本发明的有益效果：
本发明设计并改造了与亲和力和免疫原性有关的个别位点，得到了既具有较低免疫原性又具有较高亲和力的氨基酸序列，通过生物信息学方法，对优化后的CD20H、CD20L基因序列和蛋白质的氨基酸序列，以及优化后的CD20H、CD20L的二级结构、蛋白质的亲/疏水性进行了分析。通过对这些数据的分析，以便于从功能和结构上得到有用的信息，从而有助于我们可以更好的从分子水平上理解它们的生物学功能以及作用机制。
本发明的氨基酸序列经全基因合成之后，构建真核表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L，将重组载体经jetPEI试剂转染进CHO-K1细胞，通过RT-PCR结果表明目的基因在细胞中进行了成功的转录，ELISA测定培养上清中抗体含量在0.45-4.72μg/mL之间。并通过有限稀释法将高表达的单克隆细胞株用无血清培养基驯化成悬浮生长。通过无血清培养提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响，更利于细胞生长。同时可降低生产成本，简化分离纯化步骤，容易进行纯化和下游加工。将筛选获得的高表达单克隆细胞株所分泌的抗体处理CD20+细胞Raji细胞，通过FCM检测发现该单克隆抗体具有抗原抗体结合活性。利用培养上清检测ADCC与CDC活性时发现，培养上清对Raji细胞表现出较好的ADCC与CDC毒性，同时发现CDC杀伤毒性达86％，ADCC的杀伤毒性达31％，因此，CDC毒性比ADCC的杀伤毒性高。
附图说明
图1A为优化后CD20H的限制性内切酶位点分析图。
图1B为优化后CD20L的限制性内切酶位点分析图。
图2A为CD20H的亲水性/疏水性分析图。
图2B为CD20L的亲水性/疏水性分析图。
图3A为CD20H的二级结构分析图。
图3B为CD20L的二级结构分析图。
图4为HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定图，图中标号：1为DL 2000DNA Marker；2为PCDNA3.1/ZEO-CD20L经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切的产物；3为PCDNA3.1-CD20H经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切的产物。
图5为CHO-K1细胞的加压筛选图，图中标号：A为转染前融合度90％的CHIO-K1细胞；B为转染后经G418与Zeocin加压筛选第3天的细胞；C为转染后经G418与Zeocin加压筛选第10天的细胞。
图6A为真核表达载体总RNA的PCR鉴定图。
图6B为真核表达载体的PCR鉴定图，图中标号：1为DL 2000DNA Marker；2为CD20H在CHO中的表达产物；3为CD20L在CHO中的表达产物。
图7为抗体标准曲线图。
图8为在不同血清含量的DMEM/F12培养基中CHO-K1细胞的生长状态图，图中标号：A-D为单克隆CHO-K1细胞培养的生长状态，FBS浓度分别为10％、5％、2％、1％；E为单克隆CHO-K1细胞悬浮培养。
图9A为经抗Her 2抗体与抗CD20抗体培养上清处理的Raji细胞的荧光强度图。
图9B为倒置显微镜下观察的Raji细胞的荧光显微图，图中标号：a为经绿光激发的CD20抗体处理的Raji细胞，b为经白光激发的CD20抗体处理的Raji细胞，c为将a图与b图的叠加图，d为经绿光激发的Her 2抗体处理的Raji细胞，e为经白光激发的Her 2抗体处理的Raji细胞，f为将d图与e图的叠加图。
图10A为ADCC试验在倒置显微镜下观察到含有目的抗体处理的细胞结果图。
图10B为ADCC效应随着抗体浓度的变化曲线图。
图11A为CDC试验在倒置显微镜下观察到含有目的抗体处理的细胞结果图。
图11B为CDC效应随着抗体浓度的变化曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1
一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，所述抗体包括优化的CD20H、CD20L核苷酸序列或优化的CD20H、CD20L编码的氨基酸序列，其中，CD20H为CD20重链可变区与恒定区Fc序列连接得到，CD20L为CD20轻链可变区与恒定区Fc序列连接得到；将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上Hind III酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，优化的CD20H核苷酸序列为SEQ ID NO：1，优化的CD20L核苷酸序列为SEQ ID NO：2，优化的CD20H编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，优化的CD20L编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体的制备方法，所述抗体的制备方法包括如下制备步骤：
1)将CD20抗体轻、重链可变区与恒定区Fc序列连接，即得到高亲和力的人源化CD20抗体的全长氨基酸序列，分别命名为CD20L、CD20H；
2)将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上Hind III酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，其中，CD20H的引物为5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGGATTCA-3’、5’-CGGGAATTCCTATTATTTACCGGGAGACA-3’，分别命名为FL-H F、FL-H R，CD20L的引物为5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGATTTTCAAGTG-3’、5’-CGGGAATTCCTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAG-3’，分别命名为FL-L F、FL-L R，CD20H的信号肽序列为ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC，CD20L的信号肽序列为ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATA ATGTCCAGAGGA；
优化后的CD20H、CD20L分析方法及结果：
利用生物信息学软件DNAman对优化后的CD20H、CD20L的限制性酶切位点进行分析，结果显示优化后的CD20H有117个限制性酶切位点，最多的是BbvII、Bsc91I分别有五个酶切位点如图1A，优化后的CD20L有117个限制性酶切位点，最多的是Eco57I有三个酶切位点如图1B。
利用在线软件ProtScale对优化后的CD20H、CD20L进行亲水性/疏水性分析，结果显示优化后的CD20H氨基酸序列中疏水性区域和亲水性区域是间隔存在的，其中中性区域占一小部分，并且在第10处氨基酸序列表现出了较高的疏水性，说明此处疏水性氨基酸较多。总体而言，亲水性氨基酸要比疏水性氨基酸多，所以我们可认为优化后的CD20H是一个亲水性蛋白如图2A。根据氨基酸分值正值越高疏水性越强，得分负值越低亲水性越强的原则(正值是疏水性蛋白，负值是亲水性蛋白)，结果表明优化后的CD20L:Position:14，Score:2.644(max)；Position:60，Score:-2.467(min)。优化后的CD20L的氨基酸序列中疏水性区域和亲水性区域是间隔存在的，其中中性区域占一小部分，并且在第9-16处氨基酸序列表现出了较高的疏水性，说明此处疏水性氨基酸较多。总体而言，亲水性氨基酸要比疏水性氨基酸多，所以我们可以认为优化后的CD20L是一个亲水性蛋白，如图2B。优化后CD20H、CD20L编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
利用SOPMA预测优化后的CD20H的二级结构，结果显示，优化后的CD20H的二级结构中α螺旋占11.42％，β折叠30.87％，β转角12.47％，无规则卷曲45.24％，见图3A；优化后的CD20L的二级结构中α螺旋占20.59％，β折叠31.09％，β转角6.72％，无规则卷曲41.60％，见图3B。由此可见，无规则卷曲是优化后的CD20H、CD20L蛋白二级结构中的主要元件。
结论：
本实施例的步骤1)～2)得到既具有较低免疫原性又具有较高亲和力的氨基酸序列，再通过生物信息学方法，对优化后的CD20H、CD20L基因序列和蛋白质的氨基酸序列，以及优化后的CD20H、CD20L的二级结构、蛋白质的亲/疏水性进行了分析。通过对这些数据的分析，以便于从功能和结构上得到有用的信息，从而有助于我们可以更好的从分子水平上理解它们的生物学功能以及作用机制。
3)将优化的CD20H、CD20L核苷酸序列及质粒载体PCDNA3.1、PCDNA3.1/ZEO经HindIII、EcoRI双酶切，把酶切后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳回收，回收后得到目的基因与载体；其中，HindIII、EcoRI双酶切酶切体系包括：
目的基因酶切体系2-A：
目的载体酶切体系2-B：
4)将目的基因与载体在22℃条件下用T4DNA连接酶连接2h，经T4DNA连接酶连接后得表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L；其中，T4DNA连接酶的连接体系包括：
连接体系2-A：
检测方法及结果：
将构建好的PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L质粒分别用HindⅢ、EcoRⅠ进行酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳显示分别在1423bp，717bp处有明显条带，见图4。其中，HindⅢ、EcoRⅠ的酶切体系包括：
酶切体系2-C：
结论：
结果表明成功构建表达载体PCDNA3.1-CD20H和PCDNA3.1/ZEO-CD20L。
5)把连接后得到的表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L分别转化到感受态细胞DH5α中；
6)利用氨苄西林(Amp)抗性筛选阳性克隆；
7)利用抽屉试剂盒对质粒进行抽提；
8)CHO k1细胞的转染与单克隆细胞的筛选；包括如下步骤：
A、CHO-K1细胞转染及加压筛选
(1)用含有10％FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2的条件下对CHO-k1细胞进行培养；
(2)测G418、Zeocin的筛选浓度与维持浓度；
(3)以3×104个/孔将CHO-K1细胞接种在24孔板中，细胞在含10％FBS的500ulDMEM/F12的完全培养液中培养至50-70％的汇合度左右；
(4)用jetPEI试剂进行转染：将1ug的DNA溶液和150mM Nacl混合成总体积为50ul的溶液，其中1ug的DNA溶液含重链表达质粒0.4ug、轻链表达质粒0.6ug；
(5)在48ul的150mM Nacl溶液中加入2ul的jetPEI溶液，并混匀；
(6)将步骤(5)的jetPEI溶液加入到步骤(4)的DNA溶液中，涡旋并离心；
(7)将步骤(6)的混合溶液在室温孵育15min；
(8)将孵育了15min的100ul jetPEI/DNA溶液滴入到500ul培养基的细胞中，并混匀；
(9)将转染了表达载体的CHO-K1细胞，放在37℃，5％的CO2孵箱中，未转染的CHOk1细胞作对照；
(10)在转染了24h后，用G418和Zeocin同时进行加压筛选，每3-5d换一次液，培养21d后换维持培养基培养；
B、单克隆筛选
(1)有限稀释法进行单克隆筛选：将经G418和Zeocin加压筛选到的阳性克隆重悬成细胞悬液，计数，并用DMEM/F12完全培养基将其稀释成2个细胞/孔，200ul/孔接种到48孔板中，接种18个孔后，将培养板放在37℃，5％CO2的培养箱中培养；
(2)5天后，即可见单细胞克隆生长，之后用含G418与Zeocin的DMEM/F12培养基进行加压筛选；
(3)再过5-7天后，待细胞生长覆盖孔底90％以上后，用胰酶消化后，以1x104个/孔分别接种于原孔中；
(4)取上清用ELISA法检测蛋白分泌量，从中挑出表达量最高的克隆。
结果：
以800μg/mL G418，200μg/mL Zeocin为筛选剂量，对共转移CHO-k1细胞加压筛选。在加药筛选第3天左右，细胞开始死亡，而到10天左右，可得到耐药性的细胞集落(见图5)。在获得耐药性细胞株后，经有限稀释法，挑单克隆，约3周后，筛选得到17株单克隆细胞株。
实施例2
最终产品的检测方法及结果
反转录PCR检测CD20mRNA水平的表达
G418和Zeocin对共转移CHO-k1细胞进行加压筛选，经加压筛选获得的稳定表达的细胞株提取总RNA(见图6A)。再将总RNA经逆转录得cDNA，之后再进行PCR鉴定。鉴定结果表明能特异的扩增大小为1423bp，717bp的目的基因(见图6B)。这表明构建的重组表达载体成功的转染进入CHO-k1细胞中，并可成功的表达。
ELISA法测定17株单克隆细胞株上清液中抗体的含量
以Her 2抗体作标准曲线(见图7)，测得上清中抗体的含量在0.45-4.72μg/mL之间(见表2-3)。由表可知，15号单克隆的表达量最大，可用于后续实验。
表2-3单克隆细胞株培养上清的浓度
CHO-K1细胞无血清培养基的培养试验
细胞从一个含有血清的培养基生长的条件下，转入到无血清培养基的条件下生长，需要一个不断适应的过程。因此，在进行无血清培养基地驯化时，本实验采用了逐步降低血清在培养基中含量的方法，使表达量最大的15号单克隆CHO-K1细胞能够在无血清培养基的环境中生长。在驯化的工程中在显微镜下时刻观察细胞的形态(见图8)，含10％与5％FBS培养基养的CHO-K1细胞形态较一致，呈贴壁状态，细胞的活力旺盛并且增殖较快。当培养基中血清含量降为2％时，大多数细胞开始呈悬浮状，极少数仍处于贴壁状态。血清含量为1％和无血清培养基时，在显微镜下观察到细胞表现为悬浮状态，但是悬浮细胞生长的比较缓慢并且伴有细胞结团的现象。由此表明，筛选的单克隆细胞株可再无血清培养基中生长。
无血清培养有益效果：通过无血清培养提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响，更利于细胞生长。同时可降低生产成本，简化分离纯化步骤，容易进行纯化和下游加工。
结论：
本发明根据前人的研究基础，分析得到既具有较低免疫原性又具有较高亲和力的氨基酸序列，经全基因合成之后，构建真核表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L，将重组载体经jetPEI试剂转染进CHO-K1细胞，通过RT-PCR结果表明目的基因在细胞中进行了成功的转录，ELISA测定培养上清中抗体含量在0.45-4.72μg/mL之间，并通过有限稀释法将高表达的单克隆细胞株用无血清培养基驯化成悬浮生长。
抗原结合活性检测
将表达载体基因共转染CHO-K1细胞后，用流式细胞术测定抗体的抗原结合活性。流式检测结果表明，经含4ug/mL CD20抗体的细胞培养上清处理的Raji细胞的平均荧光强度为1519.89，表明培养上清可与CD20阳性细胞Raji结合。而抗Her2抗体处理的Raji细胞的平均荧光强度仅为49.92(图9A)。将含目的基因的培养上清与Her2抗体处理的Raji细胞在荧光倒置显微镜下观察可见，经抗CD20培养上清处理的Raji细胞在绿光激发下可见Raji细胞显示绿色(图9B，a)，并且将绿光与白光激发下的细胞合并重叠时Raji细胞显绿色(图9B，c)。这表明CHO-k1分泌的抗体具有正确的抗原结合特性。而抗Her2抗体处理的Raji细胞在绿光激发下不显示绿色(图9B，d、f)。
体外抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验
在上清对Raji细胞处理24h后，在倒置显微镜下观察到含有目的抗体处理的细胞具有明显的死亡现象(见图10A)。借助乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒证明，在高表达CD20的细胞株Raji细胞中，收集的培养上清具有较强的ADCC活性，并且ADCC效应随着抗体浓度的增高而增强，在4ug/ml的浓度是杀伤毒性达31％(见图10B)。这表明了CHO-K1细胞所表达的目的抗体，对CD20阳性细胞具有抗体依赖细胞介导的细胞毒性。
体外补体依赖细胞毒性(CDC)试验
在上清对Raji细胞处理4h后，在倒置显微镜下观察到含有目的抗体处理的细胞具有明显的裂解和调亡现象(见图11A)。借助乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒证明，在高表达CD20的细胞株Raji细胞中，收集的培养上清具有较强的CDC活性，并且CDC效应随着抗体浓度的增高而增强，在4ug/ml的浓度是杀伤毒性达86％(见图11B)。这表明了CHO-K1细胞所表达的目的抗体，对CD20阳性细胞具有补体依赖细胞毒性。
结论：
抗体能特异性识别结合抗原，抗体与抗原的结合活性是抗体发挥作用的重要条件。本发明利用高表达单克隆细胞株的培养上清处理Raji细胞来检测抗原与抗体的结合活性。利用培养上清检测ADCC与CDC活性时发现，培养上清对Raji细胞表现出较好的ADCC与CDC毒性，同时发现CDC杀伤毒性达86％，ADCC的杀伤毒性达31％，因此，CDC毒性比ADCC的杀伤毒性高。
以上所述是本发明的优选实施方式，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 聊城大学
<120> 一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccaagcttg ccaccatggg attcagcagg atctttctct tcctcctgtc agtaactaca 60
ggtgtccact cccaggtaca actagtgcag agcggggctg aggtgaagaa gcctggggcc 120
tcagtgaagg tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 180
gtacgccagg cccctggtaa gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 240
gagacttcct acaatcagaa gttcaagggc cgcgtgacaa tcactgcaga caaatccacc 300
agcacagcct acatggagct cagcagcctg cgctctgaag acaccgcggt ctattactgt 360
gcaagatcga cttacaaggg cggtgactgg tacttcaatg tctggggcca ggggaccacg 420
gtcaccgtct ctagcgctag caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 480
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720
aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 780
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960
gaagagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1140
ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctcccg gtaaataata ggaattcccg 1440
<210> 2
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccaagcttg ccaccatgga ttttcaagtg cagattttca gcttcctgct aatcagtgct 60
tcagtcataa tgtccagagg agacgtggtt atgacccagt ctccagcatt cctgtctgtg 120
accccagggg agaaggtcac aatcacttgc agggccagct caagtgtaag ttacatccac 180
tggttccagc agaagccagg aaaggccccc aaacccctga tttatgccac atccaacctg 240
gcttctggag tccctagccg cttcagtggc agtgggtctg ggaccgactt caccctcaca 300
atcaacagcc tggaggctga agatgctgcc acttattact gccagcagtg gactagtcgc 360
ccacccacgt tcggtggtgg gaccaaggtg gagatcaaac gaactgtggc tgcaccatct 420
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720
taataggaat tcccg 735
<210> 3
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Gly Phe Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Lys Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Phe Pro
465 470
<210> 4
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe
20 25 30
Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Thr Ser Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Phe Pro
225 230 235

Claims (10)

1.一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括优化的CD20H、CD20L核苷酸序列或优化的CD20H、CD20L编码的氨基酸序列，其中，CD20H为CD20重链可变区与恒定区Fc序列连接得到，CD20L为CD20轻链可变区与恒定区Fc序列连接得到；将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上Hind III酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，优化的CD20H核苷酸序列为SEQ ID NO：1，优化的CD20L核苷酸序列为SEQ ID NO：2，优化的CD20H编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，优化的CD20L编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
2.根据权利要求1所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗体的制备方法包括如下制备步骤：
1)将CD20抗体轻、重链可变区与恒定区Fc序列连接，即得到高亲和力的人源化CD20抗体的全长氨基酸序列，分别命名为CD20L、CD20H；
2)将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上Hind III酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，其中，CD20H的引物为5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGGATTCA-3’、5’-CGGGAATTCCTATTATTTACCGGGAGACA-3’，分别命名为FL-H F、FL-H R，CD20L的引物为5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGATTTTCAAGTG-3’、5’-CGGGAATTCCTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAG-3’，分别命名为FL-L F、FL-L R；
3)将优化的CD20H、CD20L核苷酸序列及质粒载体PCDNA3.1、PCDNA3.1/ZEO经HindIII、EcoRI双酶切，把酶切后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳回收，回收后得到目的基因与载体；
4)将目的基因与载体在22℃条件下用T4DNA连接酶连接2h，经T4DNA连接酶连接后得表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L；
5)把连接后得到的表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L分别转化到感受态细胞DH5α中；
6)利用氨苄西林(Amp)抗性筛选阳性克隆；
7)利用抽屉试剂盒对质粒进行抽提；
8)CHO k1细胞的转染与单克隆细胞的筛选。
3.根据权利要求2所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述步骤2)中CD20H的信号肽序列为ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC，CD20L的信号肽序列为ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGA。
4.根据权利要求2所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述步骤3)中HindIII、EcoRI双酶切酶切体系包括：
目的基因酶切体系2-A：
目的载体酶切体系2-B：
。
5.根据权利要求2所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述步骤4)中T4DNA连接酶的连接体系包括：
连接体系2-A：
。
6.根据权利要求2所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述步骤8)CHO k1细胞的转染与单克隆细胞的筛选包括如下步骤：
A、CHO-K1细胞转染及加压筛选
(1)用含有10％FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2的条件下对CHO-k1细胞进行培养；
(2)测G418、Zeocin的筛选浓度与维持浓度；
(3)以3×104个/孔将CHO-K1细胞接种在24孔板中，细胞在含10％FBS的500ul DMEM/F12的完全培养液中培养至50-70％的汇合度左右；
(4)用jetPEI试剂进行转染：将1ug的DNA溶液和150mM Nacl混合成总体积为50ul 的溶液，其中1ug的DNA溶液含重链表达质粒0.4ug、轻链表达质粒0.6ug；
(5)在48ul的150mM Nacl溶液中加入2ul的jetPEI溶液，并混匀；
(6)将步骤(5)的jetPEI溶液加入到步骤(4)的DNA溶液中，涡旋并离心；
(7)将步骤(6)的混合溶液在室温孵育15min；
(8)将孵育了15min的100ul jetPEI/DNA溶液滴入到500ul培养基的细胞中，并混匀；
(9)将转染了表达载体的CHO-K1细胞，放在37℃，5％的CO2孵箱中，未转染的CHO k1细胞作对照；
(10)在转染了24h后，用G418和Zeocin同时进行加压筛选，每3-5d换一次液，培养21d后换维持培养基培养；
B、单克隆筛选
(1)有限稀释法进行单克隆筛选：将经G418和Zeocin加压筛选到的阳性克隆重悬成细胞悬液，计数，并用DMEM/F12完全培养基将其稀释成2个细胞/孔，200ul/孔接种到48孔板中，接种18个孔后，将培养板放在37℃，5％CO2的培养箱中培养；
(2)5天后，即可见单细胞克隆生长，之后用含G418与Zeocin的DMEM/F12培养基进行加压筛选；
(3)再过5-7天后，待细胞生长覆盖孔底90％以上后，用胰酶消化后，以1x104个/孔分别接种于原孔中；
(4)取上清用ELISA法检测蛋白分泌量，从中挑出表达量最高的克隆。
7.一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体制剂，其特征在于，含有如权利要求1～6任一项所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体和可药用的载体。
8.根据权利要求1～6任一项所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体的用途，其特征在于，该抗体在制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体的用途，其特征在于，所述B细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。
10.根据权利要求8所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体的用途，其特征在于，所述B细胞淋巴瘤为慢性淋巴性白血病。
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