CN109311992A

CN109311992A - 用于治疗t细胞介导疾病的新型抗cd6抗体

Info

Publication number: CN109311992A
Application number: CN201780037525.4A
Authority: CN
Inventors: 林峰
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Current assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 2016-06-15
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: US20200140566A1; US10562975B2; US20170362331A1; US11597773B2; CN109311992B; WO2017218750A1; US20230416393A1

Abstract

描述了一种通过给受试者施用治疗有效量的特异性结合到CD6的抗体或其片段来治疗所述受试者中T细胞介导的疾病的方法。本发明还描述了用于所述方法的人源化抗体。

Description

用于治疗T细胞介导疾病的新型抗CD6抗体

政府资助

该项工作至少部分得到了美国国立卫生研究院健康与人类服务部的NIHNS081443和AI47392奖项的支持。美国政府享有在本发明中的一定权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年6月15日提交的、序列号为62/350,218的美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用结合于此。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。在2017年6月8日创建的所述ASCII复件命名为CCF-024421WOORD_SL.txt，大小为37492字节。

背景技术

CD6主要在T细胞上表达。Kamoun等，J Immunol 127：987-991(1981)。使用不同CD6特异性单克隆抗体(mAb)的先前的体外研究的结果是矛盾的，表明CD6可以刺激或抑制T细胞活化。Bott等，Int Immunol 5：783-792(1993)；Singer等，Immunology 88：537-543(1996)。CD6也被长期提出作为治疗自身免疫疾病的潜在靶标，尽管对CD6的功能缺乏清楚的认识，但最近在印度已经批准了针对CD6的人源化mAb用于治疗牛皮癣。Jayaraman，K.，Nature Biotechnology 31：1062-1063(2013)。然而，从历史上看，在美国，第一波旨在使用CD6靶向试剂治疗人类疾病的计划已被放弃或放缓，部分原因是缺乏证实体外和离体研究的体内数据以及不存在CD6基因工程化的动物来进行CD6靶向试剂的体内测试。Pinto，M.&Carmo，A.M.，BioDrugs：clinical immunotherapeutics，biopharmaceuticals and genetherapy27：191-202(2013)。到目前为止，只有一份关于使用转基因动物进行CD6体内研究的报告(Orta-Mascaró，M.等，J Exp Med 213(8)：1387-1397(2016))，CD6在多发性硬化症(MS)中的潜在作用仍是缺失的。最近几组的基因组广泛关联研究将CD6认定为MS的风险基因(De Jager等，Nat Genet 41：776-782(2009)；Heap等，Hum Mol Genet 19：122-134(2010))，讨论了CD6在MS发病机制中的重要作用。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种通过向受试者施用治疗有效量的特异性结合到CD6的抗体或其片段来治疗受试者中T细胞介导的疾病或障碍(disorder)的方法。在一些实施方案中，所述疾病或障碍是自身免疫疾病或移植排斥。在其他一些的实施方案中，T细胞介导的疾病是多发性硬化。

特异性结合到CD6的多种抗体或其片段可用于治疗T细胞介导的疾病或障碍。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些其他实施方案中，特别是如果受试者是人的情况下，则抗体是人源化抗体。在另外一些实施方案中，人源化抗体选自由Fab2、Fab4和Fab6组成的抗体的群组、或它们仅包括保守序列修饰的变体。

本发明的另一方面提供了对CD6具有结合特异性的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体选自由Fab2、Fab4和Fab6组成的抗体组或它们仅包括保守序列修饰的变体。在一些实施方案中，人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：1的重链、含有SEQ ID NO：2的轻链、或它们仅包含保守序列修饰的变体。在一些其他实施方案中，人源化抗体包括：含有SEQID NO：3的重链、含有SEQ ID NO：4的轻链、或它们仅包含保守序列修饰的变体。在另外的一些实施方案中，人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：5的重链、含有SEQ ID NO：6的轻链、或它们仅包含保守序列修饰的变体。

本发明的另一方面提供了一种试剂盒，其包含特异性结合到CD6的人源化抗体或其片段以及用于保存抗体的包装。在一些实施方案中，所述试剂盒包括说明书，该说明书用于：使用所述试剂盒通过向受试者施用治疗有效量的特异性结合到CD6的人源化抗体或其片段来实施治所述疗受试者中的T细胞介导的疾病或障碍。在另外一些实施方案中，所述疾病是自身免疫疾病，例如多发性硬化。在更进一步的实施方案中，所述抗体选自由Fab2、Fab4和Fab6组成的抗体的组、或它们仅包括保守序列修饰的变体。

附图说明

通过参考以下附图可以更容易地理解本发明，其中：

图1A-1C提供了显示CD6 KO小鼠发育的图表和图像。A.同源重组后，CD6编码区的外显子5-7由新霉素基因盒取代。Southern印迹杂交(Southern blot)证实了重组事件。B.CD6 KO小鼠基因分型。用双重PCR对所有mCD6 KO小鼠进行基因分型。新的插入物可通过PCR用新的引物(正向5′-CTT GGG TGG AGA GGC TAT TC-3′)(SEQ ID NO：7)和外显子8(反向-5′-AGC CAA CCT TTC TTC TGA GAG CCA-3′)(SEQ ID NO：8)鉴定。新插入物所用的杂合小鼠将还含有小鼠CD6外显子5(正向5′-TGG GCC CAA AGC ATT TAG CTT GAC-3′)(SEQ IDNO：9)和(反向-5′-TAC AGA GAG CTT GGC AGT GCT TGA-3′)(SEQ ID NO：10)。含有在外显子5-7(泳道1)之间的neo但也具有外显子5(泳道5)的小鼠是杂合的KO。相反，同源KO具有neo(泳道2)但不含外显子5(泳道6)。泳道3是100碱基对梯，泳道4是PCR阴性对照。C.CD6 KO小鼠淋巴细胞上缺失CD6蛋白。通过流式细胞法分析来自WT小鼠、杂合(Het)KO小鼠和同源(homo)KO小鼠的淋巴细胞的CD6表达，显示het KO小鼠中CD6水平降低(中间虚线)，并且在同源KO小鼠中缺失CD6(左实线)。Neg，阴性对照。

图2A-2E提供了显示CD6 KO小鼠被保护免受EAE的图表和图像。A.WT小鼠(圆形)和CD6KO小鼠(正方形)的临床评分。四个实验的组合结果。每组n＝15。*P＜0.01；B.在CD6 KO小鼠中MOG特异性的Th1和Th17应答降低(*p＜0.05)。免疫后21天来自WT和CD6KO小鼠的脾细胞在没有肽(白色柱)、有10μg/mL非相关肽(IRBP_1-20，灰色柱)、或有10μg/mL的MOG_79-96肽(黑色柱)的情况下培养72小时。通过ELISA测量培养上清液中的IFN-γ上和IL-17水平(每组n＝14，*p＜0.05)。C.通过H&E染色评价，CD6 KO小鼠中的脊髓具有显著减少的白细胞浸润。D.在H&E染色后，来自EAE小鼠的脊髓切片的代表性图像，显示CD6 KO小鼠具有显着减少的细胞浸润。(放大倍数：上部，4倍；插入物显示在下部，20倍)。E.在Luxol Blue染色后，来自EAE小鼠的脊髓切片的代表性图像，显示与WT小鼠中的严重脱髓鞘相比，CD6 KO小鼠具有完整无损的髓鞘(蓝色染色)。(放大倍数：4倍)。

图3A-3D提供了显示CD6缺失导致Thl和Thl 7发育受损的图表和图像。来自幼小的WT和CD6 KO小鼠的纯化的CD4⁺T细胞在Thl或Thl 7极化条件下活化并培养5天。随后，通过细胞内的IFN-γ或IL-17a染色来评估Thl和Thl7的发育。A和B.分化T细胞内的细胞内IFN-γ或IL-17a染色的代表性结果。C和D.三个不同实验的组合结果，n＝3，数据为平均值±SEM，*p＜0.05。

图4A-4B提供了显示CD6缺失导致增强的T细胞活化的图表。通过与1μg/mL抗CD3和抗CD28 mAb一起培养来活化来自幼小的WT和CD6 KO小鼠的纯化的CD4⁺T细胞，随后通过使用流式细胞法分析测量活化标记物CD25(A)和CD69(B)的上调来评估5小时后细胞的活化。灰色柱，活化前；黑色柱，活化后5小时，n＝5，数据为平均值±SEM，*p＜0.05。

图5A-5D提供了显示CD6缺失导致活化T细胞增殖减少和凋亡增强的图表。通过与平板结合的抗CD3和抗CD28 mAb一起培养，活化来自幼小的WT和CD6 KO小鼠的纯化的CD4⁺T细胞，然后在Th1或Th17极化条件下培养。在5、24、48和72小时的时间点，通过使用BrdUELISA试剂盒测量BrdU掺入(BrdU incorporation)来评估活化细胞的增殖(A和B)，并通过用膜联蛋白V(annexin V)对细胞染色接着进行流式细胞法分析来评估活化T细胞的凋亡(C和D)。每组n＝3，数据为平均值±SEM，*p＜0.05。

图6A-6C提供了显示CD6缺失减少T细胞通过BMEC单层的迁移的图表和图像。首先通过遵循建立的方案(A)WT DBA-1小鼠BMEC得到分离并且基于CD34染色(B)为约90％纯度。将分离的BMEC在培养插件(culture inserts)上生长直至形成单层，然后将来自幼小的WT和CD6 KO小鼠的0.6×10⁶个CFSE标记的并抗CD3/CD28mAb活化的T细胞加入到带有20ng/mL培养物的培养插件中，对保留在培养物插件中的细胞和迁移到下部室中的细胞进行定量(C)。每组n＝4，数据是平均值±SEM，*pp＜0.05。

图7A-7G提供了显示小鼠抗人CD6 mAb(UMCD6)治疗在CD6人源化小鼠中EAE的图表和图像。A和B.CD6人源化小鼠不表达小鼠CD6(A)但表达人CD6(B)。C.用UMCD6和对照小鼠IgG处理的人源化小鼠的EAE临床评分。将CD6人源化小鼠免疫以诱导EAE。在小鼠显示出轻微的临床症状后，将它们随机分成两组，一组接受0.4mg/每小鼠的抗人CD6 IgG(UMCD6)(圆形)，另一组接受0.4mg纯化的小鼠IgG(正方形)。每天记录临床评分。每组n＝14，*p＜0.05。D和E.用UMCD6或对照IgG处理的CD6人源化小鼠中的Thl(D)和Thl7(E)记忆分析(recallassay)。在处理实验结束时(第14天)，收集来自小鼠的脾细胞并在没有肽(浅灰色柱)、有10μg/mL非相关肽(IRBP_1-20，灰色柱)、或有10μg/mL的MOG_79-96肽(黑色柱)的情况下培养72小时。通过ELISA测量培养上清液中的IFN-γ上和IL-17水平。每组n＝7，*p＜0.05。F和G.脊髓切片的代表性图像，显示出与对照相比UMCD6处理的小鼠中细胞浸润(F)和脱髓鞘(G)显着减少。(放大倍数：4倍)。

图8A-8B提供了显示UMCD6处理不会耗尽T细胞的图表和图像。在处理研究结束时通过流式细胞法在UMCD6和对照IgG处理的CD6人源化小鼠中分析外周血中的CD4⁺和CD8⁺T细胞百分比，显示两组小鼠之间没有差异，每组n＝14。A.FSC/SSC显示分析的淋巴细胞群。B.用UMCD6处理的小鼠(黑色柱)或对照IgG处理的小鼠(灰色柱)的CD4⁺和CD8⁺T细胞百分比。

图9提供了显示分泌的针对rhCD6-Fc的Fab抗体的解离速率分析(off-rateanalysis)的传感图。选择前六个最高亲和力的结合物用于单循环动力学分析。

图10提供了分泌的针对rhCD6-Fc的Fab抗体的单循环动力学分析的传感图。只有Fab2的亲和力与WT Fab(亲本嵌合抗体(parent chimeric antibody))相当。

图11提供了使用Jurkat细胞通过FACS对11个选定的人源化克隆进行细胞结合验证的图表。

图12提供了使用Jurkat细胞通过FACS对6个选定的Fab克隆进行细胞结合验证的图表。

图13提供了三种纯化的人源化抗体的SDS-PAGE分析。泳道1，非还原条件下的2非还纯化的人源化IgG2；泳道2，非还原条件下的2μg非还纯化的人源化IgG4；泳道3，非还原条件下的2μg非还纯化的人源化IgG6；泳道4，还原条件下的2μg还原纯化的人源化IgG2；泳道5，还原条件下的2μg还原条纯化的人源化IgG4；泳道6，在还原条件下的2μg还纯化的人源化IgG6；泳道M，page ruler预染色的蛋白梯(Thermo Science，分类号：26616)。

图14提供了显示BIAcore实验数据与1∶1结合模型的拟合的图表。

图15提供了显示由温度引起的亲体嵌合抗体和人源化抗体的变性的图表，通过202和208nm处的椭圆度变化监测。光滑曲线是CD实验数据与两态模型的拟合。

图16A和16B提供了V_H2-hIgG1C_H抗体片段的(A)DNA(SEQ ID NO：18)和(B)氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。

图17A和17B提供了V_H4-hIgG1C_H抗体片段的(A)DNA(SEQ ID NO：20)和(B)氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。

图18A和18B提供了V_H4-hIgG1C_H抗体片段的(A)DNA(SEQ ID NO：22)和(B)氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。

图19A和19B提供V_L-hIgKC_L抗体片段的(A)DNA(SEQ ID NO：24)和(B)氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与这些示例性实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在此描述中使用的术语仅用于描述特定示例性实施例，并不旨在限制示例性实施例。如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“所述”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示组分的量、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本实施方案寻求获得的所需性质而变化。至少，并不是试图将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数应该根据有效数字的数量和普通的舍入方法来解释。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，在该范围的上限和下限之间的之间的、直到下限单位的十分之一的每个中间值、以及该范围中的任何其它所述值及或中间值都包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在这些较小范围中，并且也包括在本发明内，但受所述范围内的任何具体排除的限制的限制。如果所述范围包括所述极限值中的一个或两个，则在本发明中也包括排除这些包含的极限值中的一个或两个的范围。

“治疗”，如本文所用，是指改善、延缓、停止或逆转疾病或障碍的进展。该词包括减少疾病或障碍的严重程度和/或疾病或障碍的症状的频率。

“受试者”，如本文所用的，可以是人类或非人类的动物。例如，非人类动物包括家畜和宠物，如绵羊、牛、猪、犬、猫，和鼠类哺乳动物，以及爬行动物、鸟和鱼。优选地，受试者是人。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指在本发明的实践中使用的无毒但足够量的组合物，其对于提供受试者的有效治疗是有效的。其结果可以是减少和/或减轻疾病或障碍的迹象、症状或原因，或者生物系统的任何其他期望的改变。在任何个别情况下，适当的治疗量可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。

如本文所用并且除非进一步限制，术语抗体是指属于多克隆、单克隆、嵌合和异源免疫球蛋白类别的单链、双链和多链蛋白质和糖蛋白。它还包括这些免疫球蛋白的合成和基因工程变体。术语“抗体片段”包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段，以及对所需靶表位或表位具有特异性的抗体的任何部分。

如本文所用，术语单克隆抗体是指从基本上同源的抗体的群体获得的抗体，即，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了在单克隆抗体的生产过程中可能出现的可能的变体之外，这些变体通常以少量存在。与通常包括指向不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体指向抗原上的单个表位。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同源的抗体群体中获得的。

如本文所用，术语嵌合抗体是指包含衍生自两种不同抗体(通常属于不同的种类)的序列的抗体。最典型地，嵌合抗体包括人抗体片段和非人抗体片段，通常是人恒定区和非人可变区。

如本文所用，术语人源化抗体是指一类嵌合抗体，其衍生自非人抗体和保留或基本上保留亲本抗体的抗原结合特性但在人中具有较低免疫原性的人抗体。

如本文所用，术语抗原是指能够被抗体结合的分子或分子的一部分，该抗体另外能够诱导动物产生能够结合该抗原的表位的抗体。抗原可具有一个或多个表位。上面提到的特异性反应意味着抗原将以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不与能被其他抗原诱发的大量其他抗体反应。

如本文所用，术语表位是指能够被抗体识别并被抗体结合的任何分子的部分。通常，表位由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。本发明感兴趣的表位是包含氨基酸的表位。

如本文所用，如果抗体的可变框架区是获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，则人源化抗体包含重链或轻链可变框架区，该区域是特定人种系序列(人基因)的“产物”或“衍生自”特定人种系序列(人基因)。此类系统包括用感兴趣的抗原使携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫或用感兴趣的抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因库。包含重链或轻链可变框架区(是人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列)的人源化抗体可以通过比较人源化抗体的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列来鉴定。包含作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”的重链或轻链可变框架区的人源化抗体具有重链或轻链可变框架区，其氨基酸序列与特定人种系免疫球蛋白序列的重链或轻链可变框架区是100％相同的。与所述特定种系序列的重链或轻链可变框架区相比，包含“衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的重链或轻链可变框架区的人源化抗体可以含有氨基酸差异，由于，例如，天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变。然而，选择的人源化抗体通常在重链或轻链可变框架区的氨基酸序列方面与由人种系免疫球蛋白基因的重链或轻链可变框架区编码的氨基酸序列至少90％相同并含有氨基酸残基，当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)相比时，所述氨基酸残基将人源化抗体鉴定为是源自人。在某些情况下，在重链或轻链可变框架区的氨基酸序列方面，与由所述种系免疫球蛋白基因编码的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列相比，人源化抗体可以优选为至少95％、更优选至少96％、最优选至少97％、特别是至少98％、最特别是至少99％的相同。通常，源自特定人种系序列的人源化抗体的重链或轻链可变框架区与由人种系免疫球蛋白基因编码的重链或轻链可变框架区的氨基酸序列相比将显示不超过10个氨基酸，优选不超过5个氨基酸，或甚至更优选不超过4个、3个、2个或1个氨基酸的差异。

如本文所用的术语“Fab”或“Fab区”包括含有VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以单独指代该区域，或者在全长抗体或抗体片段的背景下指该区域。

如本文所用的术语“Fc”或“Fc区”包括含有除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体的恒定区的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的柔性铰链N-末端。

本文所使用的术语“变体抗体”或“抗体变体”包括抗体序列，该抗体序列与亲本抗体序列的区别在于与亲本相比有至少一个氨基酸修饰。本文的变体抗体序列与亲本抗体序列相比将优选地具有至少约80％、最优选地至少约90％、更优选地至少约95％的氨基酸序列同一性。抗体变体可指抗体本身、包含抗体变体的组合物、或编码抗体变体的氨基酸序列。

抗体片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，包括Fab′和Fab′-SH，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward等，Nature 341：544-546(1989))，其由单个可变物(variable)组成，(v)F(ab′)2片段，其为包含两个连接的Fab片段的二价片段，(vi)单链Fv分子(scFv)，其中，VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，该肽接头允许这两个结构域缔合以形成抗原结合位点(Bird等，Science 242：423-426(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883(1988))，(vii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)，(viii)“双体(diabodies)”或“三体(triabodies)”，通过基因融合构建的多价或多特异性(multi-specific)片段(Tomlinson等，Methods Enzymol.326：461-479(2000)；WO94/13804；Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448)(1993))和(ix)遗传融合至相同或不同的抗体的scFv(Coloma&Morrison，Nature Biotechnology 15，159-163(1997))。

抗体被分组成类，也称为同种型，遗传得由恒定区决定。人恒定轻链分类为kappa(Cκ)轻链和lambda(Cλ)轻链。重链分类为mu、delta、gamma、alpha或epsilon，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG类是最常用于治疗目的。在人类中，该类包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类包括亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA具有几个亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。因此，如本文所用的“同种型”是指由其恒定区的化学和抗原特征限定的免疫球蛋白的任何类或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。

如本文所使用的，抗体“特异性结合”是指抗体与靶结构结合，意为抗体结合靶结构或其亚单元不结合非靶结构的生物分子。特异性结合靶结构的抗体或其亚单元不会与靶结构家族之外的生物分子交叉反应。对CD6有特异性的抗体可以是能够与该特异性蛋白结合的抗体或抗体片段，特异性亲和力介于10^-8M和10^-11M之间。在一些实施方案中，抗体或抗体片段以大于10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、或10^-11M，介于10^-8M至10^-11M之间、介于10^-9M至10^- ¹⁰M之间、以及介于10^-10M至10^-11M之间的特异性亲和力结合到选定的抗原。在优选的方面，使用Ausubel FM，(1994)中所述的竞争结合试验来测定比活性(specific activity)。Current Protocols in Molecular Biology.Chichester：John Wiley和Sons(“Ausubel”)，其通过引用并入于此。

本文的术语“氨基酸修饰”包括多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”是指用另一种氨基酸取代亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。例如，取代R94K是指变体多肽，在这种情况下是重链可变框架区变体，其中，位点94处的精氨酸被赖氨酸取代。对于前面的例子，94K表示用赖氨酸取代位点94。出于本文的目的，通常用斜线分隔多个取代。例如，R94K/L78V是指包含取代R94K和L78V的双变体。本文所用的“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列的特定位置添加氨基酸。例如，插入-94表示位点94处的插入。本文所用的“氨基酸缺失”或“缺失”是指移除亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。例如，R94-表示在位点94的精氨酸的缺失。

如本文所用，术语“保守修饰”或“保守序列修饰”意指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入本发明的抗体中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸，色氨酸)，非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，β氨支链侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的恒定区或可变区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以测试改变的抗体(变体抗体)的保留功能。

治疗T细胞介导的疾病的方法

在一个方面，本发明提供一种通过给受试者施用治疗有效量的特异性结合到CD6的抗体或其片段来治疗受试者中T细胞介导的疾病或障碍的方法。

在本发明的一些实施方案中，T细胞介导的疾病或障碍是自身免疫疾病。T细胞介导的自身免疫疾病的实例包括多发性硬化、多发性肌炎、急性播散性脑脊髓炎、Balo病、临床孤立综合征(clinically isolated syndrome)、HTLV-I相关性脊髓病、视神经脊髓炎、Schilder病和横贯性脊髓炎。在一些其他实施方案中，T细胞介导的疾病或障碍是移植排斥。在移植排斥反应中，移植的组织被接受者的免疫系统排斥，这会损害或破坏移植的组织。同种异体活性杀伤T细胞，也称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，具有停靠于移植组织的MHCI类分子的CD8受体，显示供体的自身肽，并通过细胞凋亡触发靶细胞的程序性细胞死亡。T细胞介导的移植排斥通常是急性排斥。

在一些实施方案中，T细胞介导的疾病或障碍是多发性硬化。多发性硬化症是一种炎症性疾病，其中，脑和脊髓中的神经细胞的隔离覆盖物被损坏。这种损害会破坏神经系统的部分的通信的能力。多发性硬化症的具体症状由神经系统内病变的位置决定，可能包括敏感性丧失或感觉变化，如麻刺痛、针刺或麻木、肌肉无力、非常明显的反射、肌肉痉挛或移动困难；协调和平衡困难(共济失调)；言语或吞咽问题、视觉问题(眼球震颤，视神经炎或复视)、感觉疲倦、急性或慢性疼痛以及膀胱和肠道困难等。

抗体(例如，人源化免疫球蛋白)以有效量施用，其抑制CD6与其配体的结合。对于治疗，有效量将足以实现期望的治疗(包括预防性的)效果(例如足以减少或阻止CD6介导的结合和/或信号传导的量)。抗体可以以单剂量或多剂量施用。剂量可以通过本领域已知的方法决定，并且可以取决于例如个体的年龄、敏感性、耐受性和总体健康状况。抗体的合适剂量可以是每次治疗约0.1mg/kg体重至约10.0mg/kg体重。

根据该方法，抗体(例如，人源化免疫球蛋白)可以单独地或与另一种药剂联合给予个体(例如人)。人源化免疫球蛋白可以在施用另外的药剂之前，同时或之后施用。因此，本发明包括药物组合物，其包含本发明的抗CD6抗体或其片段和合适的载体。在一个实施方案中，施用抑制CD6与其配体结合的一种以上的抗CD6抗体。在另一个实施方案中，额外的药理活性成分(例如，适用于治疗多发性硬化的药物活性成分，例如干扰素、芬戈莫德、特立氟胺、富马酸二甲酯、醋酸格拉替雷、甲氨蝶呤或那他珠单抗)可以与本发明的抗CD6抗体联合给药。多种给药途径是可能的，包括但不限于肠胃外给药(例如，静脉内、动脉内、肌肉内、皮下注射)、口服(例如，饮食)、局部、吸入(例如，支气管内、鼻内或口腔吸入，鼻内滴入)或直肠给药，取决于待治疗的疾病或条件。肠胃外给药是优选的给药方式。

制剂可根据所选择的给药途径而变化(例如溶液、乳液)。可以在生理可接受的介质或载体中制备包含待施用的抗CD6抗体的适当组合物。对于溶液或乳液，合适的载体包括例如水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外给药介质可以包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖注射液(Ringer’s dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。静脉注射介质可以包括各种添加剂、防腐剂或液体、营养剂或电解质补充剂(一般参见，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，MackPublishing Co.，PA，1985)。对于吸入给药，化合物可被溶解并装载到合适的分配器中以供给药(例如，喷雾器、雾化器或加压气溶胶分配器)。

抗体通常多次给药。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。如通过测量患者中针对靶抗原的抗体的血液水平所指示的，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中约25-300μg/ml。替代性地，抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较低频率的给药。剂量和频率取决于患者中抗体的半衰期而变。给药的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低的剂量在较长时间内以相对不频繁的间隔给药。一些患者在余生中持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对短的间隔给药相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止。

选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物的活性、给药途径、给药时间、所用的特定抗体的排泄速率、治疗持续时间、其他药物、与所用特定组合物组合使用的化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史以及医学领域中众所周知的类似因素。

CD6抗体

本发明涉及向受试者施用治疗有效量的特异性结合到CD6的抗体或其片段。CD6(分化6的簇群)是由CD6基因编码的人蛋白质，存在于T淋巴细胞的外膜以及一些其他免疫细胞上。编码的蛋白质含有三个清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)结构域和活化的白细胞粘附分子的一个结合位点。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。免疫抗原的制备以及多克隆和单克隆抗体的产生可以如本文所述地进行，或使用其他合适的技术进行。已经描述了多种方法(参见例如Kohler等，Nature，256：495-497(1975)和Eur.J.Immun0l.6：511-519(1976)；Milstein等，Nature 266：550-552(1977)；Koprowski等，美国专利号4,172,124；Harlow，E.and D.Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，N.Y.)；Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2(Supplement 27，Summer′94)，Ausubel，F.M.等，Eds.，(John Wiley&Sons：New York，N.Y.)，Chapter 11，(1991))。通常，杂交瘤可以通过将合适的永生细胞系(例如，诸如SP2/0的骨髓瘤细胞系)与产生抗体的细胞融合来产生。产生抗体的细胞，优选脾或淋巴结的细胞，是从用待研究的抗原而免疫的动物中获得的。可以使用选择性培养条件分离融合细胞(杂交瘤)，并通过有限稀释克隆。可以通过合适的测试方法(例如ELISA)选择产生具有所需结合特性的抗体的细胞。

在一些实施方案中，抗CD6抗体是人源化抗体。人源化抗体最好用于人类受试者，以避免产生针对抗体本身的免疫应答。人源化抗体的例子包括那些从由Fab2、Fab4和Fab6组成的抗体组中选择的抗体，或它们仅包括保守序列修饰的变体。人源化抗体的其他例子包括发明人所制备的抗体，如本文所述。

在一些实施方案中，人源化抗体包括：重链，所述重链包含氨基酸序列

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGLIWGGGFTDYNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGVAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)；轻链，所述轻链包含氨基酸序列DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLNSDGRTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO：2)；或它们仅包括保守序列修饰的变体。

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSISRYSVHWIRQPPGKGLEWIGLIWGGGFTDYNSALKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGVAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：3)；轻链，该轻链包含氨基酸序列DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLNSDGRTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO：4)；或它们仅包括保守序列修饰的变体。

在一些实施方案中，人源化抗体包含：重链，所述重链包含氨基酸序列

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSRYSVHWIRQPPGKGLEWIGLIWGGGFTDYNSALKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGVAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)；轻链，所述轻链包含氨基酸序列DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLNSDGRTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO：6)；或它们仅包括保守序列修饰的变体。

可以使用合成和/或重组核酸产生人源化免疫球蛋白，以制备编码所需人源化链的基因(例如cDNA)。例如，可以使用PCR诱变方法构建编码人源化可变区的核酸(例如，DNA)序列，以改变编码人或人源化链的DNA序列，例如来自先前人源化可变区的DNA模板(参见例如Kamman，M.等，Nucl.Acids Res.，17：5404(1989))；Sato，K.等，Cancer Research，53：851-856(1993)；Daugherty，B.L.等，Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；和Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101：297-302(1991))。使用这些或其他合适的方法，也可以容易地制备变体。在一个实施方案中，可以诱变克隆的可变区，并且可以选择编码具有所需特异性的变体的序列(例如，来自噬菌体文库；参见例如Krebber等，美国专利号5,514,548；Hoogenboom等，WO 93/06213)。

人源化免疫球蛋白的抗原结合区(非人部分)可以源自对人CD6具有结合特异性的非人源免疫球蛋白(称为供体免疫球蛋白)。例如，合适的抗原结合区可以源自对CD6具有结合特异性的鼠单克隆抗体。其他来源包括从非人源获得的CD6特异性抗体，例如啮齿动物(例如小鼠，大鼠)、兔、猪山羊或非人灵长类动物(例如猴)。另外，可以制备其他多克隆或单克隆抗体，例如结合与1D9抗体相同或相似的表位的抗体(例如，Kohler等，Nature，256：495-497(1975)；Harlow等，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor，N.Y.)；Current Protocols in Molecular Biology，Vo1.2(Supplement 27，Summer′94)，Ausubel等，Eds.(John Wiley&Sons：New York，N.Y.)，第11章(1991年))。

例如，可以在合适的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔或绵羊)中产生针对合适的免疫原的抗体。携带CD6的细胞、含有CD6的膜级分以及CD6的免疫原性片段是合适的免疫原的示例。产生抗体的细胞(例如淋巴细胞)可以从例如免疫动物的淋巴结或脾中分离。然后可将细胞与合适的永生化细胞(例如骨髓瘤细胞系)融合，从而形成杂交瘤。可以使用选择性培养技术分离融合细胞。可以通过合适的化验方法(例如ELISA)选择产生具有所需特异性的抗体的细胞。也可以从抗体库(例如，包含非人Fab分子的噬菌体库)获得对CD6具有结合特异性的非人源的免疫球蛋白。

试剂盒

本发明的另一方面提供了试剂盒，其包含特异性结合到CD6的人源化抗体或其片段、以及用于保存抗体的包装。合适的包装包括：例如瓶子、小瓶或注射器。包装可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳可有效治疗障碍的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉输液袋或具有可由皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂可以是本文所述的抗CD6抗体。标签或包装说明书可指示该组合物可用于治疗选择的障碍，例如癌症。在一个实施方案中，标签或包装说明书可指示包含抗CD6抗体的组合物可用于治疗T细胞介导的疾病或障碍。

试剂可以以固体(例如冻干)或液体形式提供。针对每种单独的缓冲液、细胞类型和/或试剂，本发明的试剂盒可任选地包含不同的容器(例如，小瓶、安瓿瓶、试管、烧瓶或瓶)。每种组分通常适合等分在其各自容器中或以浓缩形式提供。还可以提供适合于进行所公开方法的某些步骤的其他容器。试剂盒的各个容器优选保持密闭以进行商业销售。例如，试剂盒可包括用于试剂盒的各种组分的载体。载体可以是例如袋子、盒子、管子或架子形式的容器或支撑物，并且任选地是分隔的。在运输和储存期间，载体可以界定用于安全目的的封闭容器。

特异性结合到CD6的抗体或其片段可以是本文所述的任何抗体。例如，在一些实施方案中，抗体选自由Fab2、Fab4和Fab6组成的群组中的抗体，或它们仅包括保守序列修饰的变体。

在一些实施方案中，试剂盒还包括说明书，该说明书使用该试剂盒通过向受试者施用治疗有效量的特异性结合到CD6的人源化抗体或其片段来实施治疗受试者中T细胞介导的疾病或障碍的方法。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括用于实施治疗多发性硬化的方法的说明书。虽然说明书通常是书面或印刷材料，但它们不限于此。本公开内容考虑了能够存储这些说明书并将它们传送给最终用户的任何介质。介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)，光学介质(例如CD ROM)等。如这里所使用的，术语“说明书”可以包括提供说明书的网址。

已经包括的实例更清楚地描述了本发明的特定实施例及其相关的成本和操作优点。然而，在本发明的范围内存在各种各样的其他实施例，其不应限于本文提供的特定示例。

实施例

实施例1：CD6作为治疗多发性硬化模型的靶标

CD6目前被认为是多发性硬化症(MS)的风险基因，多发性硬化症是一种自身免疫性疾病，其中髓鞘反应性T细胞在发病机理中起重要作用。然而，部分由于缺乏动物模型，CD6在调节T细胞方面的作用基于体外研究是矛盾的，并且其作为MS治疗的新靶标的潜力仍不清楚。在此，报道了CD6敲除小鼠和CD6人源化小鼠的产生。其证明了：(a)CD6敲除小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(MS的动物模型)中免受中枢神经系统损伤，(b)CD6是T细胞活化的负调控因子，但是T细胞增殖和存活的正调控因子。因此，缺失CD6导致EAE中T细胞应答减少；(c)T细胞上的CD6也是通过血脑屏障(BBB)进入中枢神经系统(CNS)的T细胞浸润所必需的，以及(d)疾病发作后全身给药抗人CD6抗体逆转了CD6人源化小鼠中的EAE进展。这些数据表明靶向CD6应该在治疗MS方面是有效的。

方法

CD6敲除(KO)小鼠的开发：CD6 KO小鼠是遵照常规KO小鼠生成方案开发的。在该小鼠中，在同源重组后，包括CD6基因的外显子5-7的多个外显子被新霉素带(neomycincassette)取代，导致CD6蛋白缺失。将得到的CD6 KO小鼠与DBA-1小鼠回交12代。如所预期的，流式细胞法显示来自CD6敲除小鼠的淋巴细胞缺乏CD6蛋白，并且与WT DBA-1小鼠相比，这些小鼠具有相同数量的CD4⁺和CD8⁺T细胞(图1)。

EAE的诱导和疾病严重程度评估：通过主动免疫诱导EAE，并通过根据先前公开的方案分配临床评分来评估疾病严重性。Li等，Mol Immunol 46：2885-2891(2009)。简言之，在尾巴基部和两只大腿处，用200μg小鼠MOG_79-96肽(Genscript，NJ定制合成)来免疫8-10周龄的雌性小鼠，该MOG_79-96肽在已经补充了M.tuberculosis菌株H37RA至4mg/ml的完全弗氏佐剂(Complete Freund′s Adjuvant，CFA，)(Sigma，MO)中乳化。在免疫后和第二天，腹膜内注射0.2腹膜百日咳毒素(List Biological Laboratories，CA)。每日评估临床严重程度，评分系统为0至5分(0，无迹象；1，弛缓尾部；2，受损的翻正反射和/或步态；3，部分后肢麻痹；4，全后肢麻痹；5，垂死或死亡)。在同一天内对每只小鼠进行两次评估，并将来自两次评估的平均评分记录为当天的评分。

脊髓的组织学和组织化学染色：在处死时，取出脊髓并在PBS缓冲液中的10％(体积/体积)福尔马林中固定24小时，然后包埋在石蜡中。在切片机上切割5μm，切片并用苏木精和曙红(H&E)染色以评估CNS炎性浸润物和坚牢蓝(Luxol Fast Blue，LFB)，以根据标准方案评估脱髓鞘区域。

Th1和Th17回忆测定：在处死时，收集脾细胞。在裂解红细胞后，将0.4x10⁶个脾细胞在没有任何肽、有10μg/ml非相关肽(IRBP_1-20)、或有10μg/ml MOG_79-96肽的情况下在96孔板的每个孔中的100μl每个完全RPMI培养基中培育。72小时后，按照标准方案通过ELISA分别测量培养上清液中的IFN-γ上和IL-17水平。

体外Th1和Th17极化测定：通过使用磁珠的负选择(EasySep^TM小鼠CD4⁺T细胞分离试剂盒，STEMCELL Technologies，Canada)，从性别和年龄匹配的WT或CD6 KO小鼠分离CD4⁺T细胞，然后按照先前公布的方案在Th1或Th17极化条件下培养。Harrington，L.等，NatureImmunology 6(11)：1123-1132(2005)。简言之，用板连接的5μg/mL抗CD28(BioLegend)活化CD4⁺T细胞(每孔2x10⁴个细胞)，然后在37℃下培养5天。对于Th1极化，在20ng/mL重组小鼠IL-2、25ng/mL重组小鼠IL-12(PeproTech)和10proTec中和抗IL-4抗体(BioLegend)存在下培养活化的细胞。对于Th17分化，在20ng/mL重组小鼠IL-6、5ng/mL重组小鼠TGF-β(PeproTech)和10μg/ml中和抗IL-4和抗IFN-γ抗体(BioLegend)的存在下培养活化的T细胞。在第1、2和3天，以每个样品5μL膜联蛋白V对细胞染色，然后根据制造商提供的方案(Annexin V Apoptosis Detection Kit，BD Biosciences)进行流式细胞法分析。对于BrdU掺入试验，在所述存在(10μM)下培养细胞，并且在不同时间点，通过使用BrdU ELISA试剂盒(Roche)测量BrdU掺入来评估细胞的增殖。最后，通过IFN-γ和IL-17的细胞内染色来定量分化的Th1和Th17细胞(第5天)。Harrington，L.等，Nature Immunology 6(11)：1123-1132(2005)。

T细胞活化标记物调节分析：纯化的WT或CD6 KO CD4⁺T细胞通过1μg/ml的抗小鼠CD3和抗小鼠CD28(Biolegend，San Diego，CA)活化；5小时后，用2μg/ml PE抗小鼠CD69和APC-抗小鼠CD25 mAb(BioLegend，San Diego，CA)染色后，通过流式细胞法测量活化的CD4⁺T细胞上的活化标记物CD25和CD69的表达水平。

小鼠原代BMEC分离：按照先前公布的方案分离小鼠BMEC。Ruck，T.等，J Vis Exp(93)：e52204(2014)。简而言之，分离小鼠脑，并在解剖显微镜下移除脑干、小脑、丘脑和脑膜。将剩余的组织切碎并用DMEM中的5mg/mL胶原酶CLS2(Worthington Biochemical)在37℃下消化1小时，然后用20％(体积/体积)BSA-DMEM洗涤，并在1000x g下于4℃离心20分钟。将沉淀再次混悬于1mg/mL胶原酶/分散酶(Worthington Biochemical)，并在37℃下再温育1小时。最后洗涤后，将所得细胞在内皮细胞培养基(PeproTech)中培养。在用抗CD34 mAb(BioLegend)对细胞染色后，通过流式细胞法分析测定分离的BMEC纯度。

Transwell T细胞迁移测定：将分离的WT BMEC培养在24孔transwell板中的3μm孔径培养插件(Falcon)室上部上培养。细胞形成单层后，来自匹配的WT和CD6 KO小鼠的0.6x10⁶尼龙毛浓缩的脾T细胞[由1μg/ml的抗小鼠CD3和抗小鼠CD28mAb(BioLegend)活化]被添加到室下部中具有20ng/mL的小鼠CCL2[趋化因子(CC基序)配体2](PeproTech)的插件中(以促进T细胞迁移)，并在37℃下培养。18小时后，在台盼蓝(Trypan blue)染色后，通过流式细胞法，使用血细胞计数器计算培养插件中留在BMEC单层顶部上的T细胞数和底室中迁移细胞数。通过使用以下公式计算保留在上部培养插件中的细胞百分比和迁移到下部室中的细胞百分比：％＝上部插件中的细胞(或下部室中的细胞)/(上部插件中的细胞+下部室中的细胞)x100％。

CD6人源化小鼠的开发：通过首先产生人CD6(hCD6)转基因(Tg)小鼠来开发CD6人源化小鼠，其中，hCD6cDNA表达由人CD2启动子(Zhumabekov等，Journal of immunologicalmethods 185：133-140(1995))驱动，遵循Case WesternReserve大学转基因核心设施的常规方案。通过流式细胞法鉴定hCD6高表达Tg小鼠，并与mCD6 KO小鼠一起繁殖以产生CD6人源化小鼠(DBA-1背景)。使用各自的抗mCD6和抗hCD6 mAb通过流式细胞法对CD6人源化小鼠进行分型以确保T细胞上hCD6的存在和mCD6的缺失(图7A，B)。

EAE诱导和治疗研究：如上所述，通过用MOG_79-96肽主动免疫，在CD6人源化小鼠中诱导EAE。免疫后七天，当小鼠出现EAE的轻微临床症状时，将它们随机分成两组。一组腹膜内注射以稀释的腹水形式的0.4mg小鼠抗人CD6 IgG(UMCD6)(Singer，N.等，Immunology 88(4)：537-543(1996))(每只小鼠0.4mg)，另一组接受相同量的纯化小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)作为对照。然后监测小鼠并记录临床评分持续另一周。在实验结束时，对小鼠实施安乐死，并分析外周血淋巴细胞的CD4⁺、CD8⁺或CD6⁺T细胞的百分比，脾细胞用于进行抗原特异性Th1和Th17回忆测定，通过与上述相同的组织学和组织化学测定方法分析脊髓。

统计学分析：所有实验重复至少两次。为了确定各组之间是否存在统计学差异，采用方差分析(ANOVA test)分析临床评分，同时采用t检验(Student t test)比较其他结果。P值＜0.05则被认为显著。

结果和讨论

为了研究CD6在MS中的作用，用MOG_79-96肽皮下免疫诱导野生型(WT)小鼠和CD6敲除(KO)小鼠(图1)(均基于DBA/1背景)中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。Abdul-Majid等人，J.Neuroimmunol，111：23-33(2000)。这些实验证明，CD6 KO小鼠与WT小鼠相比受到保护，WT小鼠在免疫后出现严重的EAE(图2A)。与显著降低EAE严重程度相一致，CD6 KO小鼠的T细胞浸润减少且脊髓中脱髓鞘减少(图2D，2E)。回忆测定显示，CD6 KO小鼠与WT小鼠相比，MOG_79-96特异性Thl和Thl7应答减少(图2B，2C)。这些结果表明，EAE的发展需要CD6，可能通过调节致病性T细胞应答和/或进入中枢神经系统(CNS)的T细胞浸润。

为阐明CD6缺失在降低致病性Thl/Thl7应答和改善EAE的疾病严重程度方面的机制，从幼小的WT和CD6 KO小鼠中分离CD4⁺T细胞，在Thl或Thl7极化条件下培养，通过流式细胞法分析细胞内IFNγ(Thl)或IL-17(Thl7)。在这些实验中，细胞与WT CD4⁺T细胞相比，CD6KO CD4⁺T细胞已经损害了Thl和Thl 7的发展(图3)。

使用抗CD6 mAb来研究CD6在T细胞活化中的作用的先前研究产生了相互矛盾的结果。一些数据表明CD6提供共刺激信号而增强T细胞活化，一些数据表明CD6抑制T细胞活化。Bott，C.等人，Int Immunol 5(7)：783-792(1993)；Singer，N.等人，Immunololgy 88(4)：537-543(1996)。为了阐明CD6在T细胞活化中的作用，用抗CD3和抗CD28mAb活化WT和CD6 KOT细胞5小时，然后测定T细胞活化标记物CD25和CD69的上调。结果表明，与WT T细胞相比，CD6 KO T细胞对CD25(图4A)和CD69(图4B)均有增强的上调作用，表明CD6是T细胞活化的负调控因子。

CD6是T细胞活化的负调控因子的发现似乎与显示CD6 KO小鼠的Thl/Thl7应答减少的上述EAE研究结果相矛盾。为了解决这一矛盾，在Thl或Thl7极化条件下再次活化WT和CD6 KO CD4⁺T细胞，通过膜联蛋白V染色比较5、24、48和72小时时T细胞凋亡情况。在Thl和Thl 7两种极化条件下活化后，CD6 KO T细胞的凋亡(Annexin V⁺)明显多于WT T细胞(图5A、5B)。

除了活化和存活，活化的T细胞的增殖也控制着T细胞应答的结果。因此，在Thl或Thl7极化条件下，在活化后的5、24、48和72小时通过BrdU掺入检验法测定活化的WT和CD6KO T细胞的增殖。在没有CD6的情况下，在Thl和Thl7极化条件下的活化的T细胞的增殖均显著地减少(图5C，5D)。

在EAE中，活化的病原性Thl和/或Thl7细胞需要通过BBB迁移到中枢神经系统(CNS)以引发局部炎症，而BMEC是BBB的重要组成部分。为了确定CD6是否对活化的T细胞通过BBB的迁移有影响，首先按照既定方案(Ruck，T.等，J Vis Exp(93)：e52204(2014))从幼小的WT小鼠中分离出BMEC(图6A，B)，然后这些细胞在transwell培养板中的培养插件上生长为单层。将用抗CD3/抗CD28 mAb活化的、羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记的WT或CD6 KO T细胞加入到BMEC单层的顶部上；将CCL2[趋化因子(C-C基序)配体2]加入到transwell的底部以诱导T细胞迁移。培养18小时后，WT T细胞比CD6 KO T细胞更好地通过BMEC单层迁移(图6C)，表明T细胞上的CD6对于活化的T细胞有效地通过BBB迁移以引发EAE中的炎症来说是必要的。

为了测试现有小鼠抗人CD6 mAb用于治疗MS患者的未来人源化和临床开发的潜力，产生人CD6转基因小鼠(hCD6 Tg)，其中，人CD6 cDNA表达由人CD2启动子/位点控制区驱动，以再现人CD6对T细胞的相对限制。de Boer等，Eur J Immunol33：314-325(2013)。在验证在所得Tg小鼠中的淋巴细胞上的人CD6蛋白的表达后，将人CD6Tg小鼠回交到DBA-1背景上，然后将人CD6 Tg小鼠与小鼠CD6 KO小鼠一起繁殖，产生不表达小鼠CD6(图7A)而在体内表达人CD6(图7B)的CD6人源化小鼠。

为了证明人CD6可以在体内取代小鼠CD6功能以及这些新开发的人源化小鼠可用于测试具有治疗人类疾病潜力的CD6靶向试剂并用于评估小鼠抗人CD6 mAb在治疗MS方面的潜力，在人源化CD6小鼠(DBA-1背景)中诱导EAE。按照上述方案，用CFA中的MOG_79-96肽和百日咳毒素一起免疫人源化小鼠，然后通过每天监测临床评分来评估EAE的发展。一旦小鼠临床上显示出EAE的轻微症状，一半的小鼠随机用小鼠抗人CD6IgG(UMCD6)(0.4mg/小鼠)随机治疗，另一半通过腹膜内注射用相同量的小鼠IgG治疗，然后每天继续监测小鼠。还如所述进行免疫学和组织病理学测定。这些实验表明，与WTDBA-1小鼠一样，人源化CD6小鼠发展了严重的EAE(图7C)，表明人CD6的转基因表达可以取代小鼠CD6的功能，并支持了使用CD6人源化小鼠可以预测CD6相关试剂在人MS中的作用的假设。与用对照小鼠IgG治疗的人源化CD6小鼠中发展的严重EAE相比，治疗的小鼠中的EAE进展停止，并且这些小鼠在治疗后7天几乎没有显示EAE的临床症状(图7C)。与对照相比，回忆测定显示活性治疗组中MOG特异性Th1(图7D)和Th17应答(图7E)显着减少。此外，组织病理学测定显示治疗的小鼠中脊髓炎症显着减少(图7F)和脱髓鞘减少(图7G)。

因为CD6存在于所有T细胞上，所以抗CD6 mAb改善EAE严重性的一种可能机制是T细胞的消耗。为了验证这一点，通过用抗CD4、抗CD8和多克隆抗hCD6 IgG(R&D)染色外周白细胞来评估UMCD6治疗的小鼠和对照IgG治疗的小鼠中的CD4⁺和CD8⁺T细胞百分比。这些实验发现CD4⁺、CD8⁺和CD6⁺T细胞群在治疗组和对照组之间没有显着变化(图8)，表明UMCD6 mAb减弱CD6人源化小鼠中EAE疾病严重性既不通过T细胞耗竭也不通过调节T细胞上的CD6。

这些数据首次提供体内证据，证明CD6的缺失保护小鼠免于CNS中与减少的致病性Th1/Th17应答相关的EAE和到CNS中的T细胞浸润的减少。另外，显示小鼠抗人CD6 mAb(UMCD6)在不消耗T细胞的情况下非常有效地治疗EAE。

CD6是T细胞活化的负调控因子，同时也是T细胞增殖和生存的正调控因子。CD6对T细胞活化、增殖和凋亡的累积作用共同导致，与WT T细胞相比，CD6 KO T细胞分化为更少的IFN-γ产生的Thl细胞或更少IL-17产生的Thl7细胞。对MOG肽的体外回忆应答的观察显示，与WT脾细胞相比，CD6 KO脾细胞中IFNγ和IL-17的分泌减少，这支持在记忆应答中CD6的缺失减少了促炎细胞因子的产生。

即使某些CD6多态性与MS的易感性相关(International Multiple SclerosisGenetics C，PLoS One 6(4)：e18813(2011)；Heap，G.等，Hum Mol Genet 19(1)：122-134(2010))，CD6在MS中的致病作用尚不清楚。令人惊讶的是，在体外试验中，来自携带CD6风险等位基因的患者的活化T细胞与携带非风险等位基因的供体的T细胞相比增殖受损。Kofler，D.等，Journal ofImmunology 187(6)：3286-3291(2010)。通过在EAE中研究WT和CD6 KO小鼠，发明人发现CD6的缺失保护小鼠免受EAE中的CNS损伤，这表明CD6是EAE发展所必需的，并且可能是MS发展必须的。发明人的体外T细胞活化、增殖和存活研究提供了对EAE中观察到的CD6 KO小鼠中减少的MOG特异性Th1和Th17应答的潜在机制的见解。似乎在CD6KO小鼠中的EAE诱导后，虽然MOG特异性T细胞最初被更强烈地活化，但它们分化为IFNγ分泌的Th1细胞和IL-17分泌的Th17细胞的效率较低，并且在WT小鼠中它们比T细胞死亡得更快，导致MOG特异性Th1/Th17应答减少，并最终减弱EAE。

发明人的H&E研究还表明，在EAE诱导后，CD6 KO小鼠的CNS中的细胞浸润显着减少。为了区分CD6表达是否也影响T细胞浸润到CNS的能力，本发明人进行了体外T细胞迁移测定，比较了CD6 KO T细胞和WT T细胞通过单层BMEC迁移的能力。数据显示，CD6也是T细胞以最佳效率浸润通过BMEC单层所必需的。这意味着CD6对于T细胞通过BBB迁移到CNS中是重要的，这种迁移已知是EAE和MS发展和/或进展中的关键步骤。

CD6是治疗包括MS在内的自身免疫性疾病的良好靶标的推测已存在数十年(Pinto，M&Carmo，A.，BioDrug 27(3)：191-202(2013))，但是，30多年前进行的使用T细胞耗竭小鼠抗人CD6 IgM治疗MS患者的第一次也是唯一的临床研究尚无定论。Hafler，D.等人，Neurology36(6)：777-784(1986)。CD6缺乏导致体外减少的Th1和Th17极化的数据以及体内EAE中CD6 KO小鼠免于CNS损伤的数据强烈反应，对于治疗EAE有用的CD6靶向试剂值得作为MS的潜在方法重新评估。由于所有可用的抗人CD6 mAb均在小鼠中开发，并且先前的研究表明CD6与其配体结合而没有物种限制(Bowen，M.等，Eur J Immunol 27(6)：1469-1478(1997))，发明人开发了CD6人源化小鼠，其中，人CD6取代T细胞上的小鼠CD6。这些动物可用于筛选小鼠抗人CD6 mAb以用于未来开发而不会混淆小鼠中的免疫原性问题。CD6 KO小鼠对EAE诱导有抗性并且CD6 KO小鼠(CD6人源化小鼠)中人CD6的恢复与免疫后的严重EAE相关的发明人结果提供了明确证据，表明在小鼠中人和小鼠CD6可互换地发挥作用，如先前预测的。Bowen，M.等，Eur J Immunol 27(6)：1469-1478(1997)。因此，这些CD6人源化小鼠对于鉴定有效的人CD6靶向试剂(包括在人MS的EAE模型中以及可能在人自身免疫疾病的其他模型中的人CD6靶向mAb)是非常宝贵的。

虽然目前在美国和欧洲没有与CD6相关的临床试验，但在古巴开发的抗人CD6mAb，即，Itolizumab，可有效减少银屑病患者的致病性T细胞应答并且最近被批准用于治疗印度的牛皮癣。Menon，R&David，B，Clin Cosmet Investig Dermatol 8：215-222(2015)。据报道，Itolizumab联合甲氨蝶呤降低了类风湿性关节炎患者的T细胞数量和促炎细胞因子水平，但临床结果仍有待确定。Aira，L等，mAbs 8(1)：187-195(2016)。令人惊讶的是，Itolizumab与CD6的结构域1结合(Alonso，R等，Hybridoma(Larchmt)27(4)：291-301(2008))，并且它不阻断CD6与其目前已知的配体CD166(与CD6的结构域3结合)之间的相互作用。Chappell，P等，Structure 23(8)：1426-1436(2015)。有趣的是，发明人用于治疗CD6人源化小鼠中的EAE的抗人CD6 mAb(UMCD6)也结合CD6的结构域1并且不阻断CD6-CD166相互作用。Singer，N.等，Immunol Lett 58(1)：9-14(1997)。因此，使用抗CD6mAb的体外和体内研究均表明CD6-CD166相互作用可能对疾病中的CD6功能不是至关重要的，至少在银屑病或MS中不是。相反，与CD6的结构域1相互作用的新配体可能是比CD166更重要的CD6搭档。

最近报告使用了CD6^-/-小鼠来评估CD6在T细胞发育和活化中的作用。Orta-Mascaró，M.等，J Exp Med 213(8)：1387-1397(2016)。该研究发现，在CD6^-/-TCR转基因小鼠中，单阳性胸腺细胞和成熟T细胞亚群的细微畸变。CD6^-/-小鼠中胶原诱导的关节炎的严重程度增强，与EAE模型中的当前结果明显不同。值得注意的是，CIA研究是在C57BL/6小鼠中进行的，C57BL/6小鼠是一种品系，其中CIA的发生率和严重程度与DBA-1品系(发明人用于EAE研究的品系)相比显着降低。需要进一步的研究来揭示不同的自身免疫模型和遗传上不同的小鼠品系之间在CD6在自身免疫疾病发展中的作用之间的明显差异的原因，以及这些差异是否被CD6在各种各样的人类自身免疫疾病中的作用方面的异质性平衡。尽管如此，CIA和当前数据的结果都突显了CD6在控制T细胞驱动的自身免疫方面可能发挥关键作用的新兴以识。

总之，使用WT和CD6 KO小鼠，发明人证明了EAE的发展需要CD6。CD6是T细胞活化的负调控因子，但是是T细胞增殖和生存的正调节因子。因此，CD6的缺失导致EAE中T细胞应答的减少。此外，T细胞上的CD6也是通过BBB进入中枢神经系统的T细胞浸润必须的。通过开发CD6人源化小鼠，发明人表明人CD6在小鼠中起作用，并确定：UMCD6，即小鼠抗人CD6 mAb，是EAE的有效抑制剂。这些结果鼓励探索抗CD6抗体的人源化变体，例如UMCD6，成为治疗MS和其他疾病的新疗法的潜力。

实施例2：抗体人源化

该实施例描述了致力于使抗CD6小鼠单克隆抗体人源化而不牺牲结合亲和力的工作。使用两种方法进行人源化：一种是基于噬菌体展示库(phage display library)的“框架组件(framework assembly)”方法；另一种是具有框架回复突变的基于结构的CDR(互补决定区)移植。

进行以下实验以制备人源化抗CD5小鼠单克隆抗体。1.噬菌体展示库的生成；2.从噬菌体展示库中选择人源化抗体和FASEBA筛选；3.通过具有框架回复突变的CDR移植(基于结构的方法)进行抗体人源化；4.人源化抗体的产生和表征。

方法

人源化噬菌体展示库的生成：组合人源化噬菌体展示库是根据GenScript的专有技术′通过框架组装的抗体人源化′设计的；美国专利号9,090,994，其公开内容通过引用并入本文。简而言之，选择具有与小鼠抗体高度序列同一性的人抗体的框架(GenScript测序号353920)，随机组合并组装。然后将小鼠抗体的CDR移植到组装的组合人框架中。库的构建是按照GenScript的标准操作程序(SOP)进行的。

从噬菌体展示库中分离人源化抗体结合物：将人源化的Fab噬菌体展示库针对rhCD6-Fc进行淘选。在96深孔板中扩增单输出噬菌体克隆，并通过ELISA针对rhCD6-Fc测定扩增的噬菌体克隆。使用HRP/抗-M13单克隆抗体检测结合的噬菌体克隆。具有大于2.1的ELISA信噪比的噬菌体克隆被认为能够结合rhCD6-Fc。在发现良好百分比例的噬菌体克隆结合rhCD6-Fc的两轮之后，淘选结束。按照GenScript的SOP进行淘选和噬菌体ELISA。

通过CDR移植进行人源化：受体框架的选择：使用NCBIIg-Blast针对种系和重排的Ig可变区序列的数据库搜索亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域序列。具有在蛋白质数据库(PDB)中可获取的结构并且显示与亲本抗体可变区序列的最高序列同一性的可变结构域被用于产生亲本抗体的同源性模型。识别出了与亲本抗体可变区序列具有最高同一性的人序列。人受体的CDR被亲本抗体的CDR取代。

通过FACS进行FASEBA筛选、亲和力排序和细胞结合验证

FASEBA筛选、亲和力排序：扩增编码输出噬菌体的Fab片段的DNA并插入pFASEBA载体中以筛选前导抗体。接种各个FASEBA库克隆并诱导其在96深孔板中表达。进行ELISA筛选以分离特异性识别rhCD6-Fc的Fab，并且通过BIAcore T200选择表达培养基用于亲和力排序。

使用胺偶联法(amine coupling method)将BSA固定在传感器芯片上。注射并通过SASA用BSA捕获(捕获阶段)分泌到培养基中的所选Fab-SASA克隆。平衡后，注射抗原rhCD6-Fc 240秒(结合期)，然后注射运行缓冲液720秒(解离期)。在注射另外三个Fab-SASA克隆之前再生表面。重复该过程直至分析了所有抗体。在每个循环期间从Fab-SASA流动细胞的响应中减去参考流动细胞的响应。在结合开始时比对Fab-SASA克隆的结合曲线，并使用BIAcore T200评估软件在抗原注射停止后20秒进行标准化，以显示更可视化的抗体的比较。通过将实验数据局部拟合为1∶1结合模型获得Fab-SASA克隆的解离速率。通过解离速率常数对抗体进行排序。进行单循环动力学测量以验证亲和力排序结果。注射并通过SASA用BSA捕获(捕获阶段)分泌到培养基中的所选Fab-SASA克隆。平衡后，注射一系列浓度的抗原rhCD6-Fc(1、3、9、27和81nM)500秒(结合期)，然后注射运行缓冲液3000秒(解离期)。在另一次注射Fab-SASA克隆之前再生表面。在每个抗原注射循环期间，从Fab-SASA流动细胞的响应中双重减去参考流动细胞和只有缓冲液的注射的响应。使用BIAcore T200评估软件将结合数据拟合为1∶1结合模型。

使用胺偶联方法将BSA固定在传感器芯片上。注射并通过SASA用BSA捕获(捕获阶段)分泌到培养基中的所选Fab-SASA克隆。平衡后，注射抗原rhCD6-Fc 240秒(结合期)，然后注射运行缓冲液720秒(解离期)。在注射另外三个Fab-SASA克隆之前再生表面。重复该过程直至分析所有抗体。在每个循环期间从Fab-SASA流动池的那些中减去参考流动池的响应。Fab-SASA克隆的结合曲线在结合开始时比对，并使用BIAcore T200评估软件在抗原注射停止后20秒进行标准化，以显示更可视化的抗体比较。通过将实验数据局部拟合为1∶1结合模型获得Fab-SASA克隆的解离速率。通过解离速率常数对抗体进行排序进行单循环动力学测量以验证亲和力排序结果。注射并通过SASA用BSA捕获(捕获阶段)分泌到培养基中的所选Fab-SASA克隆注射到BSA并通过SASA。平衡后，注射一系列浓度的抗原rhCD6-Fc(1、3、9、27和81nM)500秒(结合期)，然后注射运行缓冲液3000秒(解离期)。在另一次注射Fab-SASA克隆之前再生表面。在每个抗原注射循环期间，从Fab-SASA流动细胞的响应中双重减去参考流动细胞和仅缓冲液注射的响应。使用BIAcore T200评估软件将结合数据拟合为1∶1结合模型。

通过FACS的细胞结合验证：对于Fabon Jurkat细胞的细胞结合验证，使用培养上清液进行流式细胞法分析。使Jurkat细胞生长至70-80％聚集并通过离心收获。每孔约4x10⁵个细胞用PBS洗涤两次。将蛋白质阳性克隆的200μl单个培养上清液加入细胞中并在室温下温育1小时。用PBS洗涤后，将抗体加入细胞中以检测结合的Fab。温育30分钟后，用PBS洗涤细胞两次然后将其重悬于PBS中。通过FACS Calibur(BD Bioscience，San Jose，CA)和Flowjo软件分析细胞的Fab结合。

选择的抗体的表达和纯化

抗体的表达：对于每次转染，将125μl轻链表达质粒和125μl重链表达质粒各自与750μl聚乙烯亚胺(PEI)储备溶液(1mg/m1)和10ml预热的Freestyle 293培养基预混合，然后将混合物在室温下温育10分钟以使复合物形成。将混合物加入到240ml的Freestyle 293培养基中的混悬的HEK293-6E细胞培养物(细胞密度为约2.0x10⁶个细胞/m1)中。将混合物转移到1L摇瓶中，并在轨道振荡器上以37℃和5％CO₂温育，在110rpm下持续摇动。在转染后24小时，将预热的TN1加入到细胞培养物中，终浓度为0.5％(w/v)。通过以1500x g以培离心10分钟，在转染后5-6天收获所述条件的培养基以除去细胞。将上清液用于随后的抗体纯化。

人源化抗体的鉴定

抗原-抗体相互作用的亲和力分析：使用BIAcore T200 SPR系统(GE Healthcare)在25℃下在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％(v/v)吐温20，pH7.4))中测定与抗原rhCD6-Fc结合的抗体的亲和力。为了测量rhCD6-Fc的三种人源化抗体亲和力，将rhCD6-Fc(以2μg/ml稀释在10mM乙酸钠中，pH 5.0)通过胺偶联以100RU的密度固定在S系列CM5芯片上。通过流动细胞以30μl/min的流速注射IgG抗体，浓度范围为0.11-27nM(三倍连续稀释)。结合时间为700秒，然后解离3600秒。在每个循环结束时，用10mMpH2.0的甘氨酸-HCl(100μl/min，12s，3次)再生传感器表面。在每个抗原注射循环期间，从rhCD6-Fc流动细胞中双重减去参考流动细胞和仅缓冲液注射的响应。通过使用BiacoreT200评估软件将结合数据拟合为1∶1结合模型来获得解离速率常数(kd)和结合速率常数(ka)的数据。表观平衡解离常数(KD)由kd对ka的比率计算。

通过FACS的人源化IgG的结合IC₅₀测量：使用纯化的抗体进行流式细胞法分析。使Jurkat细胞生长至70-80％聚集并通过离心收获。每孔约4x10⁵个细胞用PBS洗涤两次。将200μl培养上清液加入细胞中并在室温下温育1小时。用PBS洗涤后，向细胞中加入抗体以检测结合的人源化IgG。温育30分钟后，用PBS洗涤细胞两次然后将其重新悬浮于PBS中。通过使用FACS Calibur(BD Bioscience，San Jose，CA)和Flowjo软件分析细胞的IgG结合。通过GraphPad Prism分析IC₅₀。

通过圆二色光谱(CD)测量热稳定性：使用Jasco J-815 CD光谱仪(Jasco Inc.)记录在升高的温度下IgG的远紫外CD光谱。通过在202和208nm处的椭圆率的变化记录温度诱导的IgG变性。通过拟合双态变性模型获得转变中点(Tm)处的温度，其中在实验数据的平衡中仅存在天然和变性状态。使用Prism 4(GraphPad Software，Inc。)进行数据分析。

结果

从噬菌体展示库中分离人源化抗体结合物。进行两轮淘选以富集人源化结合物。第一轮的正性率(抗原特异性人源化克隆的数量超过随机挑选的克隆的数量)为约2％。在第二轮淘选后，富集结合物并且正性率达到约40％。将第二轮输出噬菌体的Fab DNA插入pFASEBA载体中进行FASEBA筛选。

表1：淘选和噬菌体ELISA实验的细节。

通过具有框架回复突变的互补决定区(CDR)移植的基于结构的人源化。使用Discovery Studio v5.0(Accelrys)进行亲本抗体可变片段的同源建模。亲本抗体可变区序列针对蛋白质数据库(PDB)抗体数据库进行BLAST搜索，用于识别抗体可变区片段的最佳模板，尤其是用于构建结构域界面。使用定制的Build Homology Models协议构建同源模型。指定并连接二硫桥。使用DOPE方法优化循环。基于亲本抗体可变区的同源模型，鉴定了所有CDR残基的邻近区域(即之内)中以及在抗体的疏水核心或V_H/V_L界面中的所有框架残基。为该项目设计了一个CDR移植和七个回复突变构建体(CDR显示为下划线的氨基酸，回复突变残基以粗体显示，表2)。表2按出现的顺序分别公开了SEQ ID NOS11、2、12、13、1、2、3、2、14、2、15、2、16、2、17和2。

表2：人源化抗体变体的序列

通过FACS进行FASEBA筛选、解离速率排序和细胞结合验证

从噬菌体展示库进行FASEBA筛选、亲和力排序和FACS验证。将编码第二轮输出噬菌体的Fab片段的DNA扩增并插入pFASEBA载体中，通过ELISA筛选前导抗体。通过FASEBAELISA筛选来选择600个克隆。将四十五个克隆送去进行DNA测序，并筛选用于针对rhCD6-Fc的结合试验和随后通过BIAcore T 200的解离速率分析。选择来自噬菌体展示库的5个克隆和来自CDR移植的Fab2进行单循环动力学分析，因为其低的解离速率使用BIAcore T200评估软件进行(图9)。并且根据单循环动力学分析，仅具有8点回复突变的Fab2(参考回复突变2的序列)与WT Fab(亲本嵌合抗体)相当(图10)。

根据亲和力排序结果，选出解离速率最慢的前10个克隆和CDR移植的Fab2克隆，用于通过FACS的细胞结合验证。WTFab(亲本嵌合抗体)作为阳性对照。图11表明11个克隆的结合与WTFab(亲本嵌合抗体)的结合相当(图11)。

根据Fab2序列和同源模型，构建了五个回复突变克隆。将编码五个Fab片段的DNA序列插入pFASEBA载体中，用于筛选前导抗体。针对rhCD6-Fc筛选与Fab2一起的五个克隆，用以进行结合试验和随后用BIAcore T200进行解离速率分析。由于解离速率较低，使用BIAcore T200评价软件，选择三个克隆进行IgG生成和表征(表3)。所选克隆(Fab2、Fab4和Fab6)的核苷酸和氨基酸序列分别如图16、17和18所示，而V_L区的序列如图19所示。

表3：所选Fab克隆的动力学数据

样品ID	K<sub>d</sub>(l/s)
		WT Fab(亲本嵌合抗体)	＜5E-06
WT Fab R(亲本嵌合抗体)	＜5E-06
		Fab4	1.9E-05
Fab2	2.1E-05
		Fab6	3.1E-05
Fab5 R	5.3E-04
		Fab5	5.6E-04
Fab7	8.9E-04
		Fab8	无表达

与Jurkat细胞结合的回复突变克隆的FACS验证。选择五个回复突变Fab克隆和Fab2一起用于通过FACS的细胞结合验证(图12)。根据图8，除了表达不佳的Fab8之外，所有的回复突变克隆都具有相当的在Jurkat细胞上的结合。

表达和纯化

通过SDS-PAGE分析纯化的人源化IgG2、人源化IgG4和人源化IgG6。纯化的蛋白质无论在还原还是在非还原条件下的分子量为170kDa且纯度＞90％(图13)。从每250ml培养物中获得约2.0mg人源化IgG2、2.3mg人源化IgG4和2.6mg人源化IgG6。

表征

抗原-抗体相互作用的亲和力分析。每种抗体的结合数据用Biacore T200评估软件处理并拟合为1∶1结合模型。所有实验数据都可以完美地拟合到模型中(图14)。从表4中可以看出，所有人源化抗体具有与亲本嵌合抗体相当的抗原结合亲和力。

表4：rhCD6-Fc嵌合体/人源化抗体相互作用的动力学数据

还进行了FACS结合试验来验证Jurkat细胞/人源化抗体相互作用。结合平均荧光强度(MFI)&IC₅₀列于表5中。三种人源化抗体显示与亲本抗体几乎相等的Jurkat细胞结合活性。

表5：人源化抗体与Jurkat细胞的结合MFI和IC₅₀

通过圆二色光谱(CD)测量热稳定性。对于所有抗体，202和208nm处的椭圆率变化可以完美地拟合为双态变性模型(图15)。通过监测在202和208nm处的椭圆率变化获得的转变中点(Tm)处的温度及其平均值显示在表6中。人源化抗体的Tm值略高于亲本嵌合抗体的Tm值，表明人源化提高了其热稳定性。

表6：亲本嵌合抗体和人源化抗体的转变中点(T_m)的温度。

结论

在该示例中，抗CD6小鼠单克隆抗体通过GenScript被人源化。从基于结构的CDR移植和框架回复突变获得三种人源化抗体。人源化抗体具有与亲本抗体相当的亲和力和更好的热稳定性，证明人源化小鼠抗体的结果是成功的。

本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可获取材料的完整公开内容通过引用结合到本文中。仅为了清楚理解，给出了前面的详细描述和实施例。从这些描述中理解不能得出不必要的限制。本发明不限于所示和所述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变化均包括在由权利要求限定的本发明内。

序列表

<110> 克利夫兰临床基金会

<120> 用于治疗T细胞介导疾病的新型抗CD6抗体

<130> CCF-024421 WO ORD

<140>

<141>

<150> 62/350,218

<151> 2016-06-15

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Leu Ile Trp Gly Gly Gly Phe Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Arg Glu Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 2

<211> 112

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<213> 人工序列

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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

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<213> 人工序列

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Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Leu Ile Trp Gly Gly Gly Phe Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

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Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

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Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

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<213> 人工序列

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<221> 源

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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

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20 25 30

Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Trp Gly Gly Gly Phe Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

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Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Ser

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<213> 人工序列

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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

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Ser

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Ser

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tataacagcg cgctgaaaag ccgtctgacc atcagcaaag ataacagcaa aaatcaggtg 300

agcctgaaac tgagcagcgt taccgcggcc gataccgccg tgtattattg tgctcgtgaa 360

ggtgtcgcat actggggtca aggcacgctg gttaccgtta gttccgctag caccaagggc 420

ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480

ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540

ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600

agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660

aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720

actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780

ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840

gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080

ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200

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Lys

465

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 源

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gccgccacca tgggctggag ctggatcctg ctgttcctcc tgagcgtgac agcaggagtg 60

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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Lys

465

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<211> 1398

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<213> 人工序列

<220>

<221> 源

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gccgccacca tgggctggag ctggatcctg ctgttcctcc tgagcgtgac agcaggagtg 60

cacagccaag tccaactgca agaaagtggt ccgggcctgg tgaaaccgag tgaaaccctg 120

tctctgacgt gtaccgtgag tggctttagc ctgagccgtt atagcgttca ttggattcgc 180

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agcctgaaac tgagcagcgt taccgcggcc gataccgccg tgtattattg cgctcgtgaa 360

ggcgtcgctt actggggcca aggcaccctg gttaccgtct cctccgctag caccaagggc 420

ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480

ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540

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aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720

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gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960

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gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080

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Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

145 150 155 160

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

210 215 220

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

225 230 235 240

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

Lys

465

<210> 24

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 24

gccgccacca tgggctggag ctggatcctg ctgttcctcc tgagcgtgac agcaggagtg 60

cacagcgatg tcgtgatgac gcaatccccg ctgtcgctgc cggtgacgct gggccaaccg 120

gcaagcattt cgtgtaaaag ctcgcaaagc ctgctgaaca gcgatggtcg tacctatctg 180

aattggtttc agcagcgtcc gggtcagagc ccgcgtcgtc tgatttatct ggtgagcaaa 240

ctggatagcg gtgttccgga tcgttttagc ggcagcggta gcggcaccga ttttaccctg 300

aaaatcagcc gcgtggaagc ggaagatgtg ggcgtttatt attgctggca gggcacccat 360

tttccgttca ccttcggtcc gggcaccaaa gttgacatta aacgaacggt ggctgcacca 420

tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480

tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540

ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 600

agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 660

tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 720

tgttag 726

<210> 25

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 25

Ala Ala Thr Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val

1 5 10 15

Thr Ala Gly Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser

20 25 30

Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser

35 40 45

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln

50 55 60

Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys

65 70 75 80

Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

85 90 95

Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly

115 120 125

Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

130 135 140

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val

145 150 155 160

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

165 170 175

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

180 185 190

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

195 200 205

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr

210 215 220

His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu

225 230 235 240

Cys

Claims

1.一种通过给受试者施用治疗有效量的特异性结合到CD6的抗体或其片段来治疗所述受试者中T细胞介导的疾病或障碍的方法。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述疾病是自身免疫疾病。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述T细胞介导的疾病是多发性硬化。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试者是人。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述抗体是人源化抗体。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述人源化抗体选自由Fab2、Fab4和Fab6组成的群组，或选自它们仅包括保守序列修饰的变体。

8.如权利要求6所述的方法，其中，所述人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：1的重链、含有SEQ ID NO：2的轻链、或它们仅包含保守序列修饰的变体。

9.如权利要求6所述的方法，其中，所述人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：3的重链、含有SEQ ID NO：4的轻链、或它们仅包括保守序列修饰的变体。

10.如权利要求6所述的方法，其中，所述人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：5的重链、含有SEQ ID NO：6的轻链、或它们仅包含保守序列修饰的变体。

11.一种对CD6具有结合特异性的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体选自由Fab2、Fab4和Fab6组成的群组、或它们仅包括保守序列修饰的变体。

12.如权利要求11所述的人源化抗体，其中，所述人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：1的重链、含有SEQ ID NO：2的轻链、或它们仅包括保守序列修饰的变体。

13.如权利要求11所述的人源化抗体，其中，所述人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：3的重链、含有SEQ ID NO：4的轻链、或它们仅包括保守序列修饰的变体。

14.如权利要求11所述的人源化抗体，其中，所述人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：5的重链、含有SEQ ID NO：6的轻链、或它们仅包括保守序列修饰的变体。

15.一种试剂盒，其包括特异性结合到CD6的人源化抗体或其片段、以及用于保存所述抗体的包装。

16.如权利要求15所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书用于：使用所述试剂盒通过给受试者施用治疗有效量的特异性结合到CD6的所述人源化抗体或其片段来实施治疗所述受试者中T细胞介导的疾病或障碍的方法。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其中，所述疾病是自身免疫疾病。

18.如权利要求16所述的试剂盒，其中，所述T细胞介导的疾病是多发性硬化。

19.如权利要求16所述的试剂盒，其中，所述抗体选自由Fab2，Fab4和Fab6组成的群组、或它们仅包括保守序列修饰的变体。

20.如权利要求16所述的试剂盒，其中，所述人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：1的重链、含有SEQ ID NO：2的轻链、或它们仅包含保守序列修饰的变体。

21.如权利要求16所述的试剂盒，其中，所述人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：3的重链、含有SEQ ID NO：4的轻链、或它们仅包含保守序列修饰的变体。

22.如权利要求16所述的试剂盒，其中，所述人源化抗体包括：含有SEQ ID NO：5的重链、含有SEQ ID NO：6的轻链、或它们仅包含保守序列修饰的变体。