CN113416244A

CN113416244A - 全人源的新冠IgG3单链抗体及其应用

Info

Publication number: CN113416244A
Application number: CN202110545838.9A
Authority: CN
Inventors: 方涛; 程艳兵
Original assignee: Wuhan Feisha Genomics Medicine Co ltd
Current assignee: Wuhan Feisha Genomics Medicine Co ltd
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2021-09-21

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了全人源的新冠IgG3单链抗体及其应用。本发明提出的新冠特异性IgG3序列4条，所有的序列均包含VDJ区域，在5’端包括起始密码子ATG，在3’端包括终止密码子TGA，该抗体序列为全人源序列，可安全的应用于后续疫苗生产与抗体药物研发等应用中。

Description

全人源的新冠IgG3单链抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及全人源的新冠IgG3单链抗体及其应用。

背景技术

揭示人体对新冠侵染后的免疫过程，获取新冠病毒的B细胞受体对于新冠特异性药物的筛选、病毒疫苗的生产研发及其重要。B细胞受体(Bcell receptor，BCR)是B细胞抗原识别决定性表面分子，其本质是一种膜表面免疫球蛋白(membrane immunoglobulin,mIg)。BCR具有抗原结合特异性，每个个体的BCR多样性高达5×10^13，构成容量巨大的BCR库，赋予个体识别各种抗原、产生特异性抗体的巨大潜能。

BCR的结构包括重链和轻链。BCR的重链(heavy chain，H)由 65～100种可变区(VH)、2种多变区(DH)、6种结合区(JH)和恒定区(CH)四部分基因片段组成；轻链(lightchain，L)由可变区、结合区和恒定区三部分基因片段组成。发育过程中的B细胞在重组酶(RAG1、RAG2)作用下，形成了多样性高达1～2×10^11的BCR。同时，由其形成互补决定区(complementarities determining region， CDR)：CDR1、CDR2和CDR3区氨基酸序列的多样性，特别是编码 CDR3的基因，由于其位于轻链V、J或重链V、D、J片段的连接处，可以通过V(D)J的重排和(或)两个基因片段的连接间丢失或插入数个核苷酸，进一步增加BCR的多样性，而形成具有功能的BCR编码基因(B细胞克隆)。

BCR测序是通过高通量测序技术检测靶向扩增后的BCR重链和轻链，全面解析BCR基因重排碱基序列，以及各序列的丰度的测序技术。BCR测序常用于评价各种免疫相关疾病和遗传性突变引起的某个物种所有B细胞或特定B细胞激活介导的细胞免疫反应中BCR 基因重排碱基序列，以及各序列的丰度，用于研究不同B细胞克隆的转录情况和相互间关系，从而揭示更深层次的B细胞功能特异性，继而解释体液免疫应答耐受以及高频突变在B细胞应答识别抗原异常等相关生命现象。传统的BCR测序都是采用使用Illumina的测序仪进行2×300bp或2×150bp的双端测序方法来对BCR进行测序，该方法的测序准确率高，但对于部分长度超过600bp的BCR序列，该方法仅能获得两端的序列，会存在中间部分关键可变区序列缺失的问题。

PacBio公司正式推出Sequel II新一代测序系统后，依赖于 PacBio SMRT测序技术独有的CCS测序模式，能够通过滚环测序提升reads准确度，同时结合聚合酶试剂的优化，酶读长大幅提升，在获得高精准度HiFi reads的同时能够保证10kb以上的插入片段读长，将解决原有的Illumina等二代测序平台下无法完整覆盖整个片段区域的问题。通过进行HiFi测序，可以获得准确性达到99.5％以上的长读长序列。

目前，针对新冠病毒侵染人体后引起的BCR免疫反应，常规的方法是采用二代测序平台对抗体的可变区进行测序后筛选新冠相关抗体，但是受限于测序的读长，仅能够获得可变区的部分序列，无法进行准确的抗体类型识别与编码翻译识别，而基于三代测序平台PacBio的新冠病毒BCR全长扩增测序可轻松读取病毒侵染后的BCR 全长序列，突破了二代测序读长较短的局限性，提高了针对新冠病毒特异性BCR抗体的分辨能力，极大的提高了新冠特异性BCR抗体鉴定的分辨率与准确率。特别是在PacBio公司正式推出Sequel II新一代测序系统后，依赖于PacBio SMRT测序技术独有的HiFi测序模式，能够通过滚环测序提升reads准确度，目前采用HiFi技术进行BCR 抗体全长测序的准确率可以达到99.5％以上，通过进行HiFi测序，可以获得极高准确性的新冠BCR抗体全长序列，用于新冠相关BCR 抗体序列筛选、基于全长抗体序列的表达翻译与后续新冠中和反应评估等。

BCR一般包括与膜结合的免疫球蛋白分子和Ig-α/Ig-β信号转导组件，通过二硫键连接着免疫球蛋白分子和信号转导组件。BCR包括以下两部分：1.某一亚型(IgD、IgM、IgA、IgG或者IgE)的膜结合免疫球蛋白(mIg)。除了C端疏水的膜结合区和胞内区，这些膜结合免疫球蛋白和分泌型的免疫球蛋白单体是相同的，有两条重链 (IgHs)和两条轻链(IgLs)；2.信号转导组件：Ig-α/Ig-β的异二聚体 (CD79)，由二硫键连接。两个亚基都是跨膜蛋白，在胞内区都有免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。

免疫球蛋白IgG是人血清和细胞外液中含量最高的一类免疫球蛋白，约占血清总免疫球蛋白的75％～80％，是分子质量最小的一类免疫球蛋白，具有典型的免疫球蛋白单体结构。在人体中，IgG于出生后3个月开始合成，3～5岁接近成人水平。IgG由浆细胞合成，骨髓造血干细胞最初分化为前B细胞，进一步发育成未成熟的B细胞，此时可在细胞表面表达IgM，此后相继表达IgD并继续发育。只有能表达IgM且不能识别自身抗原的未成熟B细胞才能继续发育成熟成为具有免疫功能的B细胞，成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结。B细胞在遇到抗原刺激后会分化增殖为浆母细胞，根据产生抗体时是否需要T细胞，可将B细胞分为B1和B2两个亚群，其中 B2为T细胞依赖性细胞，这类细胞在受胸腺依赖性抗原刺激后发生免疫应答。IgG即由B2分化成的浆细胞产生，根据它们在血清中的含量，IgG有4个亚类，命名为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且各自都有着不同的免疫功能。

目前为止，未能通过筛选方式获得新冠特异性的IgG3BCR抗体全长。

发明内容

本发明目的在于提供一种全人源的新冠IgG3单链抗体，这类特异识别新冠的单链抗体本身或者其可变区序列，经过直接表达或经基因工程改造成其它的抗体形式后，可以作为抗新冠药物开发、疫苗生产、检测标志物开发等进行新冠相关应用中。

本发明提供一种全人源的新冠IgG3单链抗体，包括如SEQ ID No：5-SEQ ID No：8中至少一种所示的氨基酸序列。

本发明还提供，编码上述新冠IgG3单链抗体的基因序列，优选地，包括如SEQ IDNo：1-SEQ ID No：4中至少一种与上述氨基酸对应的核苷酸序列。

本发明还提供，包含上述新冠IgG3单链抗体中所述基因序列的文库。

本发明还提供，上述文库的制备方法，对不同新冠康复者共有而在正常人群中没有的BCR序列进行分析并筛选出新冠特异性的IgG3 BCR抗体序列。

进一步地，所述分析筛选过程为：对新冠康复者与正常人群进行 BCR全长测序，将测序的原始数据进行HiFi的一致性校正后，获得了质量值在Q20以上的BCR全长一致性序列，经过与BCR数据库中的抗体恒定区序列进行比对后，获得了每个样本测序数据中的不同类别的BCR抗体序列。

本发明还提供，包含上述新冠IgG3单链抗体中所述基因序列的表达载体。

本发明还提供，包含上述新冠IgG3单链抗体中所述基因序列的宿主细胞。

本发明还提供上述新冠IgG3单链抗体在制备新冠病毒治疗药物、药物载体及检测标记物中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果为：

1.本发明通过使用BCR全长扩增子测序的方法对新冠康复者与健康人群进行了BCR全长扩增建库测序，获得了质量值在Q20以上的BCR全长扩增子序列，获得的BCR序列包括完整的启动子至终止密码子的的区域，所获得的序列为全人源，无需进一步进行整合即可进行后续的表达验证。

2.本发明通过PacBio HiFi测序获得高质量的BCR序列，经与数据库进行比对后，根据人的BCR序列在恒定区的保守性，对获得的BCR全长序列进行转录方向校正与分类，构建新冠康复者与建库人群不同类别的BCR抗体全长数据库；传统的二代BCR测序技术仅进行部分可变区的测序，无法准确进行抗体的聚类筛选。

3.本发明针对获取的不同类型的BCR序列，基于不同类别抗体恒定区BCR序列的一致性，通过定位位于恒定区上的终止密码子位置，将获得的抗体直接翻译为蛋白质氨基酸序列，在蛋白质水平上对抗体进行比较；传统的二代BCR测序方法不涉及BCR序列的恒定区，无法进行准确的翻译，仅能在DNA序列的水平上进行比较。

4.本发明通过对新冠康复者与正常人群的不同类别的抗体蛋白质氨基酸序列进行比较，找到新冠康复者共有而在正常人群中没有的 BCR抗体，这些抗体为新冠特异性抗体；其抗体DNA序列为全人源的新冠特异性抗体全长序列，在经过直接表达或经基因工程改造成其它的抗体形式后，可以作为抗新冠药物开发、疫苗生产、检测标志物开发等进行新冠相关应用中；传统的新冠相关应用均是基于可变区的部分序列进行基因工程改造后再进行表达，由于其序列并非全人源，且必须经过改造，可能引入某些未知的安全问题。

5.本发明通过对获取的新冠特异性抗体序列设计特异性引物，该引物扩增区域包括启动子至终止密码子的全部区域，使用该引物在新冠康复者的cDNA作为模板进行PCR扩增后，将扩增产物转移至大肠杆菌表达载体中，通过构建单克隆后进行一代测序，基于扩增片段大小筛选获取的目标序列进行测序，在测序数据中找到了单一的新冠特异性的抗体DNA序列，获取的DNA序列为单一的纯的全人源特定抗体DNA序列，无需进行人工合成即可直接作为抗新冠药物开发、疫苗生产、检测标志物开发的原始DNA反应物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明新冠相关特异性抗体筛选与获取原理示意图。

图2是本发明特异性引物扩增富集新冠相关BCR序列电泳图示意图。

图3是本发明单克隆制备培养示意图。

图4是本发明单克隆扩增筛选电泳图。

图5是本发明单克隆一代测序峰图。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

如图1所示，本发明提供的全人源的新冠单链抗体获取流程如下：

1.通过进行新冠康复者与健康人群的BCR全长扩增子建库测序，获取质量值Q20以上的BCR全长序列，分别构建新冠康复者与健康人群的BCR抗体库；

2..在获得高质量的BCR抗体序列后，与抗体数据库进行比对，构建BCR抗体恒定区序列确定抗体类别，由于同类型的BCR抗体相似性非常高，且进行翻译时翻译的终止密码子位置也是一致，基于终止密码子位置将BCR抗体序列翻译为蛋白质氨基酸序列；

3.通过比较新冠康复者共有，而健康人群没有的BCR蛋白质氨基酸序列，找到新冠特异性相关的不同类别的BCR序列；

4.基于找到的新冠特异性序列设计特异引物，进行扩增特异性富集新冠相关的抗体序列；

5.将抗体序列转移至感受态细胞中，制备单克隆，挑选单克隆进行扩增后，选择特定片段大小的扩增产物进行一代测序，基于一代测序的结果筛选获得的全人源的新冠相关的BCR序列。

在本发明中，获得了新冠特异性IgG3序列4条，获得的新冠特异性IgG3序列如SEQID No：1-SEQ ID No：4所示，经翻译后的氨基酸序列如SEQ ID No：5-SEQ ID No：8所示。所有的序列均包含 VDJ区域，在5’端包括起始密码子ATG，在3’端包括终止密码子 TGA，该抗体序列为全人源序列，可安全的应用于后续疫苗生产与抗体药物研发等应用中。

根据本发明的新冠特异性IgG3中特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同的抗体轻重链基因的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造，而获得IgG3抗体或相关蛋白。

在本发明中，提出的包含上述新冠IgG3单链抗体中所述基因序列的文库，所述文库为：通过对新冠康复者与健康人群的BCR全长扩增子建库测序，获取质量值Q20以上的BCR全长序列，分别构建新冠康复者与健康人群的BCR抗体库；经与数据库进行比对后，根据人的BCR序列在恒定区的保守性，对获得的BCR全长序列进行转录方向校正与分类，构建新冠康复者与建库人群不同类别的BCR抗体全长数据库。

在本发明中，提出包含所述基因序列的表达载体，根据本领域的常识，载体可以为原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或昆虫细胞表达载体。

在本发明中，提出包含所述表达载体的宿主细胞，根据本领域的常识，所述的宿主细胞可以为原核表达细胞、真核表达细胞或昆虫细胞，所述原核表达细胞优选大肠杆菌。

实施例一：新冠康复者与正常人群BCR全长扩增测序

新冠康复者与正常人群的BCR全长扩增测序参照前期申请的专利方法(公开号CN111662970A)进行，主要流程如下：

1.全血样本Total RNA的提取

取新鲜全血样本1mL，使用TriZol LS进行全血样本Total RNA 提取，提取后使用Nanidrop 2000C测定RNA样本的浓度与纯度，使用Agilent 2100测定样本的完整性，达到合格标准的样本(总量>1μg，完整性RIN值>7)的样本进行后续实验。

2.总RNA中cDNA第一链的合成

实验操作流程如下：

1)OligodT逆转录引物与poly(A)结合，如表1所示。

表1：

轻弹混匀，瞬时离心，70℃孵育5min后立即置于冰上。

2)逆转录合成cDNA第一链，配制表2中的反应。

表2：

轻弹混匀，瞬时离心，42℃孵育75min。反应完成后立即置于冰上，加入1uL的BCRTemplate Switching Oligo，轻弹混匀，瞬时离心，42℃孵育15min。

3.BCR cDNA的全长扩增

BCR cDNA的全长扩增包括两轮半巢式扩增反应，第一轮扩增进行BCR序列的初步富集，第二轮扩增时采用内部的巢式引物，进一步提高扩增的特异性，使扩增条带单一。

1)BCR cDNA全长的第一轮PCR扩增

取一新的0.2mL PCR管，加入表3中的试剂。

表3：

充分混匀，瞬时离心，置于PCR仪上进行PCR反应：98℃2min；98℃20s、

65℃15s、72℃45s，18cycles；72℃5min。

2)BCR cDNA全长的第二轮PCR扩增

取一新的0.2mL PCR管，加入表4中的试剂。

表4：

10组混合引物均需要单独进行扩增，可以提高扩增反应的稳定性。

充分混匀，瞬时离心，置于PCR仪上进行PCR反应：98℃2min； 98℃20s、 65℃15s、72℃30s，20cycles；72℃5min。

反应结束后按照AMPure磁珠的使用说明对扩增产物进行磁珠纯化，最后使用10μL洗脱缓冲液洗脱，取1μL纯化产物，使用无核酸酶水稀释5倍后进行Qubit定量。

4.BCR全长扩增子片段混样

根据Qubit定量结果，将同一样本的不同扩增产物进行等量混样，要求混样后的总量在1μg以上，用于后续建库。

5.文库构建

1)末端修复

取1μg的全基因组扩增子样本，进行末端修复反应体系的配制，配制表5中的反应。

表5：

充分混匀，瞬时离心，20℃孵育30min。

反应完成后，按照AMPure磁珠的使用说明进行1X磁珠纯化，去除反应时加入的酶与Buffer，最后使用14μL洗脱缓冲液洗脱，获得片段末端加A的粘性末端。

2)连接带barcode的测序接头

通过末端修复与加A后，在加入具有与A末端匹配的带barcode 的测序接头，在连接酶的作用下即可实现接头的连接。反应体系如表6。

表6：

混匀，瞬时离心，20℃孵育60min，反应结束后65℃孵育10min，置于冰上。进行外切酶消化，反应体系如表7。

表7：

混匀，瞬时离心，37℃孵育60min，置于冰上。按照AMPure磁珠的使用说明进行磁珠纯化，最后使用20μL洗脱缓冲液洗脱，获得的适用于PacBio测序平台的哑铃型的环状文库。

3)文库质检与上机测序

取1μL文库进行Qubit定量，获得文库浓度；取1μL文库进行安捷伦2100的片段大小分析，将全长扩增文库在PacBioSequelII测序平台上进行混合测序，每个样本获得了约60G的测序数据。

实施例二：新冠康复者与正常人群BCR免疫组库分析，获得新冠特异性IgG3单链抗体

将测序的原始数据进行HiFi的一致性校正后，获得了质量值在 Q20以上的BCR全长一致性序列，经过与BCR数据库中的抗体恒定区序列进行比对后，获得了每个样本测序数据中的不同类别的BCR 抗体序列，同时基于恒定区的终止密码子位置，将DNA序列翻译为蛋白质多肽序列。通过比较新冠康复者共有的，而正常人群中没有的 BCR多肽序列，获得了新冠特异性相关的抗体全长。本次获得的新冠特异性IgG3序列4条，所有的序列均包含VDJ区域，在5’端包括起始密码子ATG，在3’端包括终止密码子TGA，该抗体序列为全人源序列，可安全的应用于后续疫苗生产与抗体药物研发等应用中。获得的新冠特异性IgG3序列如SEQID No：1-SEQ ID No：4所示，经翻译后的氨基酸序列如SEQ ID No：5-SEQ ID No：8所示。

实施例三：基于以新冠康复者样本设计特异性引物，进行单克隆 BCR抗体库的构建

基于抗体库筛选的IgG3抗体序列，在起始密码子的与终止密码子的外测设计特异性引物，通过PCR扩增特异性富集目标抗体序列。由于抗体存在多重重组的特性，获取的扩增产物是一类与引物匹配的抗体序列集合，无法直接进行一代测序与后续应用，需要将抗体序列进行克隆实验，获取单个抗体序列的单克隆，并挑选单克隆进行测序，验证所获得的单克隆序列为目标抗体。具体流程如下：

1.目标抗体IgG3抗体序列引物设计

基于测序筛选的目标序列抗体设计引物，该引物扩增的目标片段包括起始密码子与终止密码子区域，覆盖整个抗体表达区域的全长，包含实施例二公开抗体的所有序列，具体设计的引物序列如表8所示。

表8：IgG3抗体序列引物

其中，Primer_ID_01～02为R端通用引物，该引物在恒定区内，所有IgG3抗体序列均可与该引物进行匹配，使用时混合在一起作为 R端通用引物使用；Primer_ID_03～06为F端引物，该引物序列基于筛选的新冠相关特异性抗体设计，与R端引物组合在一起为一对引物，用于目标抗体序列的扩增。

2.扩增富集获取新冠相关特异性抗体

本步骤使用的扩增模板为新冠康复者样本的单链cDNA样本。取一新的0.2mL PCR管，加入如表9所示试剂。

表9：

充分混匀，瞬时离心，置于PCR仪上进行PCR反应：98℃2min； 98℃20s、65℃15s、72℃120s，35cycles；72℃5min。

反应结束后进行电泳检测，电泳结果示意图如图2所示。切胶获取片段大小在1.5～2k的目标特异性片段。

3.目标片段的单克隆制备

本步骤使用表10中的试剂。

表10：

LB固体培养基配制：取本品8克，溶解于250ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，至不烫手时加入250uL氨苄青霉素，混匀倒平板备用(每个平板15mL左右)。

LB液体培养基配制：取本品1克，溶解于40ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，分装至2mL无菌离心管中备用。

配制好培养基后进行载体连接反应，配制如表11中的反应体系。

表11：

轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体于离心管底，室温 25℃反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上。

将Fast-T1感受态细胞从-70℃拿出，迅速置于冰上融化，取20uL 感受态细胞加入目的载体连接反应产物，轻弹管壁混匀(避免用枪吸打)，冰上静置30min。

42℃水浴热激30s后，迅速置于冰上静置2min，切勿摇动离心管。

向离心管中加入200μLLB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm摇床中复苏5min。

复苏后颠倒混匀直接取200μL，涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，将平板正置于37℃培养箱10min，待菌液被完全吸收后，倒置平板，过夜培养，单克隆制备培养结果示意图如图3所示。

4.单克隆筛选与测序鉴定

在平板培养基上挑选单克隆菌落至10μL ddH2O中混匀作为模板；使用2×RapidTaq Master Mix(Vazyme#P222)进行扩增，反应体系如表12所示。

表12：

放置在PCR仪上进行如表13所示的扩增反应程序。

表13：

将扩增获得的扩增产物进行凝胶电泳检测，获得图4所示的电泳图，挑选扩增条带亮度高、扩增条带单一且片段大小在1.5～5k的扩增产物进行双端单克隆一代测序鉴定，测序峰图如图5所示，根据一代测序的序列与目标抗体序列进行一致性比对，选择序列完全一致的单克隆进一步进行扩增放大，即获得了高纯度的单一的新冠相关抗体特异性序列，该序列可以直接转移至假病毒体系中，进行后续的抗体效价验证，也可以直接转移至抗体表达体系中进行表达。

序列表

<110> 武汉菲沙基因组医学有限公司

<120> 全人源的新冠IgG3单链抗体及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> IgG3

<400> 1

atgcccaccc agtgcgagac gacggggacc gtgggcaggg gcttccaagc caacagggca 60

ggacacacca gaggctgact gaggcctcca ggacgaccgg gctgggagcg tgaggaacat 120

gacgggatgg ggcagagcca gccatggggt gatgccagga tgggcatgac cgacctgagc 180

tcaggaggca gcagagagag ggaggaggag aggccccagg tgaaccgagg ggcttgtcca 240

ggccggcagc atcaccggag cccaggggca gggtcagcag agctggccgt agggccctcc 300

tctcagccag gaccaaggac agcagcttcc accaagggcc catcggtctt ccccctggcg 360

ccctgctcca ggagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 420

ttcccagaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 480

ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 540

tccagcagct tgggcaccca gacctacacc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 600

aaggtggaca agagagttga gctcaaaacc ccacttggtg acacaactca cacatgccca 660

cggtgcccag agcccaaatc ttgtgacaca cctcccccgt gcccacggtg cccagagccc 720

aaatcttgtg acacacctcc cccatgccca cggtgcccag agcccaaatc ttgtgacaca 780

cctcccccgt gcccaaggtg cccagcacct gaactcctgg gaggaccgtc agtcttcctc 840

ttccccccaa aacccaagga tacccttatg atttcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 900

gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca agtggtacgt ggacggcgtg 960

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gttccgtgtg 1020

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1080

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggacag 1140

ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1200

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1260

agcagcgggc agccggagaa caactacaac accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1320

tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacatc 1380

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccgct tcacgcagaa gagcctctcc 1440

ctgtctccgg gtaaatga 1458

<210> 2

<211> 1458

<212> DNA

<213> IgG3

<400> 2

atgcccaccc agtgcgagac gacggggacc gtgggcaggg gcttccaagc caacagggca 60

ggacacacca gaggctgact gaggcctcca ggacgaccgg gctgggagcg tgaggaacat 120

gacgggatgg ggcagagcca gccatggggt gatgccagga tgggcatgac cgacctgagc 180

tcaggaggca gcagagagag ggaggaggag aggcccccag gtgaaccgag gggcttgtcc 240

aggccggcag catcaccgga gcccagggca gggtcagcag agctggccgt agggccctcc 300

tctcagccag gaccaaggac agcagcttcc accaagggcc catcggtctt ccccctggcg 360

ccctgctcca ggagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 420

ttcccagaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 480

ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 540

tccagcagct tgggcaccca gacctacacc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 600

aaggtggaca agagagttga gctcaaaacc ccacttggtg acacaactca cacatgccca 660

cggtgcccag agcccaaatc ttgtgacaca cctcccccgt gcccacggtg cccagagccc 720

aaatcttgtg acacacctcc cccatgccca cggtgcccag agcccaaatc ttgtgacaca 780

cctcccccgt gcccaaggtg cccagcacct gaactcctgg gaggaccgtc agtcttcctc 840

ttccccccaa aacccaagga tacccttatg atttcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 900

gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca agtggtacgt ggacggcgtg 960

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gttccgtgtg 1020

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1080

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggacag 1140

ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1200

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1260

agcagcgggc agccggagaa caactacaac accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1320

tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacatc 1380

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccgct tcacgcagaa gagcctctcc 1440

ctgtctccgg gtaaatga 1458

<210> 3

<211> 1335

<212> DNA

<213> IgG3

<400> 3

atgcggcaga gccggccgtg gggtgatgcc aggatgggca cggacccacc tgagctcgag 60

gaggcagcta gagcgaggga ggaggagagg ccccaggtga acggaggggc ttgtccaggc 120

cagcagcatc acctggagcc cagggcaggg tcagcagtgc tggccgtggg gccctcctct 180

cagccaggac caaggacagc agcttccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc 240

tgctccagga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 300

ccagaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 360

ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 420

agcagcttgg gcacccagac ctacacctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 480

gtggacaaga gagttgagct caaaacccca cttggtgaca caactcacac atgcccacgg 540

tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct cccccgtgcc cacggtgccc agagcccaaa 600

tcttgtgaca cacctccccc atgcccacgg tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct 660

cccccgtgcc caaggtgccc agcacctgaa ctcctgggag gaccgtcagt cttcctcttc 720

cccccaaaac ccaaggatac ccttatgatt tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780

gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaagt ggtacgtgga cggcgtggag 840

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgtt ccgtgtggtc 900

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggacagccc 1020

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140

agcgggcagc cggagaacaa ctacaacacc acgcctccca tgctggactc cgacggctcc 1200

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacatcttc 1260

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tctccgggta aatga 1335

<210> 4

<211> 1554

<212> DNA

<213> IgG3

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atggactgga cctggaacat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccactcgcag 60

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tgtaaggctt ctggttatag ttttaacacc tatactatca cctgggtgcg acaggcccct 180

ggacaaggcc ttgagtgggt gggctgggtc ggttacacaa actctgctgc acagaagttc 240

caagacagag tcaccatgac cagagataca tcgtcgaata cagcgtacct ggaactcagg 300

ggcctgagat ctgacgacac ggccgtttat tactgtgcga ggacgtactt cgatatcttg 360

acaacttact atcggtggtt agatatctgg ggccagggaa ccccggtcac cgtctcctca 420

gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctctggg 480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtca 540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660

tacacctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagctc 720

aaaaccccac ttggtgacac aactcacaca tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt 780

gacacacctc ccccgtgccc acggtgccca gagcccaaat cttgtgacac acctccccca 840

tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt gacacacctc ccccgtgccc aaggtgccca 900

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ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1140

caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1200

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ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca gcgggcagcc ggagaacaac 1380

tacaacacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1440

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<211> 484

<212> PRT

<213> IgG3_translation

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Met Pro Thr Gln Cys Glu Thr Thr Gly Thr Val Gly Arg Gly Phe Gln

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Ala Asn Arg Ala Gly His Thr Arg Gly Leu Arg Pro Pro Gly Arg Pro

20 25 30

Gly Trp Glu Arg Glu Glu His Asp Gly Met Gly Gln Ser Gln Pro Trp

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Gly Asp Ala Arg Met Gly Met Thr Asp Leu Ser Ser Gly Gly Ser Arg

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Glu Arg Glu Glu Glu Arg Pro Gln Val Asn Arg Gly Ala Cys Pro Gly

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Arg Gln His His Arg Ser Pro Gly Ala Gly Ser Ala Glu Leu Ala Val

85 90 95

Gly Pro Ser Ser Gln Pro Gly Pro Arg Thr Ala Ala Ser Thr Lys Gly

100 105 110

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

130 135 140

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

145 150 155 160

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

165 170 175

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val

180 185 190

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys

195 200 205

Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser

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Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

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His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

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Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro

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Ser Pro Gly Lys

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<211> 484

<212> PRT

<213> IgG3_translation

<400> 6

Met Pro Thr Gln Cys Glu Thr Thr Gly Thr Val Gly Arg Gly Phe Gln

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Ala Asn Arg Ala Gly His Thr Arg Gly Leu Arg Pro Pro Gly Arg Pro

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Gly Trp Glu Arg Glu Glu His Asp Gly Met Gly Gln Ser Gln Pro Trp

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Gly Asp Ala Arg Met Gly Met Thr Asp Leu Ser Ser Gly Gly Ser Arg

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Glu Arg Glu Glu Glu Arg Pro Pro Gly Glu Pro Arg Gly Leu Ser Arg

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Pro Ala Ala Ser Pro Glu Pro Arg Ala Gly Ser Ala Glu Leu Ala Val

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Gly Pro Ser Ser Gln Pro Gly Pro Arg Thr Ala Ala Ser Thr Lys Gly

100 105 110

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

130 135 140

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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

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225 230 235 240

Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser

245 250 255

Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

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His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

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Ser Pro Gly Lys

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<212> PRT

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Pro Glu Leu Glu Glu Ala Ala Arg Ala Arg Glu Glu Glu Arg Pro Gln

20 25 30

Val Asn Gly Gly Ala Cys Pro Gly Gln Gln His His Leu Glu Pro Arg

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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

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Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

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355 360 365

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Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser

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85 90 95

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Ile Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 18

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<400> 13

tgaggaacat gacgggatgg 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgggagcgt gaggaacat 19

Claims

1.一种全人源的新冠IgG3单链抗体，其特征在于，包括如SEQ ID No：5-SEQ ID No：8中至少一种所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的新冠IgG3单链抗体的基因序列。

3.根据权利要求2所述的新冠IgG3单链抗体，其特征在于，包括如SEQ ID No：1-SEQ IDNo：4中至少一种与所述氨基酸对应的核苷酸序列。

4.包含权利要求2所述新冠IgG3单链抗体中所述基因序列的文库。

5.权利要求4所述文库的制备方法，其特征在于，对不同新冠康复者共有而在正常人群中没有的BCR序列进行分析并筛选出新冠特异性的IgG3 BCR抗体序列。

6.根据权权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述分析筛选过程为：对新冠康复者与正常人群进行BCR全长测序，将测序的原始数据进行HiFi的一致性校正后，获得了质量值在Q20以上的BCR全长一致性序列，经过与BCR数据库中的抗体恒定区序列进行比对后，获得了每个样本测序数据中的不同类别的BCR抗体序列。

7.包含权利要求3所述新冠IgG3单链抗体中所述基因序列的表达载体。

8.包含权利要求3所述新冠IgG3单链抗体中所述基因序列的宿主细胞。

9.权利要求1所述的新冠IgG3单链抗体在制备新冠病毒治疗药物、药物载体及检测标记物中的应用。