CN114395035A - 基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于广谱人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒及其应用。利用全新抗体增扩引物构建康复病人抗体噬菌体展示库和完备的多种突变抗原表达形式，通过体外独特设计的筛选策略，获得多株结合在RBD不同表位对VOC实现广谱中和的全人源抗体。对其中IMCAS‑123、IMCAS‑72、IMCAS‑364三个抗体开展配对检测，针对病毒表面抗原进行高灵敏、抗突变、具备区分高致病Delta与高传播性Omicron的快速检测。本发明首次基于免疫层析平台进行免疫学进行Omicron和Delta变异株分型的产品开发，具有灵敏度高、特异性好，检测快速的优点。

Description

基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒及其应用

技术领域

本申请属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒及其应用。

背景技术

新冠病毒进入人群传播后产生的多种突变让全球建立起来的疫苗免疫防线岌岌可危，自Omicron出现后变异株很可能具有感染小鼠等啮齿类动物的能力形成跨种传播成为学界关注的焦点，我们必须在Omicron致病力降低的表象中，警惕由于非人宿主免疫压力带来的新型突变，导致产生对人类既能免疫逃逸又致病力加强的大流行毒株。面对未来新冠突变压力，广谱治疗手段与抗突变的检测手段亟待同时开展。

抗体研发在应对新冠暴发后治疗与预防手段的紧急研发中起到了开路先锋作用，据统计目前已有4213个抗体序列被发表公开，然而在一片繁荣景象的背后，值得注意的是2988个抗体利用了康复病人外周血细胞测序产出的抗体，仅有几个被证明是新冠突变株具有广谱结合效果，Omicron暴发后，全部8个上市抗体仅存S309尚可以继续抵御，通过全世界多位学者根据抗体结合位置、结合特性、抗突变能力进行的归类中我们不难发现，S309所对应的潜在保守靶位至今鲜有抗体报道。这是由于广谱抗体的特性决定的，逻辑上讲广谱抗体的产生，需要有两个必要条件，即“保守位点的存在”与“抗体的有效调动”，从进化选择来说保守表位只有被病毒巧妙的隐藏不引起宿主针对性的免疫反应才有利于病毒长期的存在。针对保守位点免疫原性低的特点，科学家进一步通过不同抗原的免疫聚焦、续贯免疫的策略提升“抗体的有效调动”继而获得广谱抗体，例如S309抗体是从一位感染10年的SARS康复患者中体外利用SARS2靶蛋白获得的，但是这类志愿者不但存在极少，而且在Sarbecoviruses (SARS-CoV1, SARS-CoV2)层面实现广谱一定对SARS-CoV2新生突变产生的有效抵御尚缺相关性定论。更棘手的是，SARS2暴发事件不长，对于同一人先后感染不同受关注变体VOC（Variant of Concern）病毒株的机率与交替免疫不同VOC疫苗的可能性极小，这驱使我们必须另辟蹊径挖掘这种弱免疫原性的广谱抗体。

体外操作的抗体展示库技术的独特优势可在应对新冠突变株广谱抗体的难题上发挥重要作用，本质上来说，展示库是基于体外从抗原与抗体的结合的单一角度抽象体内发生的复杂免疫反应，展示库技术与单细胞分选技术相比可以在体外快速实现不同抗原的交替差减筛选实现广谱抗体富集，其次抗体展示库技术可以实现不同人中VH/VL的全新组合从数量级水平提升了新抗体可获得性。

目前，市场上针对新型冠状病毒变异株分型的产品主要为分子诊断产品，对奥密克戎（Omicron）突变株检测的方法主要有《CN 113943838 A 2019基于多重荧光定量ARMS-PCR技术的新冠病毒奥密克戎突变序列检测技术及其应用》和《CN 113981152 A检测SARS-CoV-2变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途》，仅针对Omicron。免疫学方法尚无用于新冠变异株分型的产品。

因此，亟需解决：1.快速区分Delta这类致病力强与Omicron这类传播力高的突变株，2.对新发突变具备有效包容性，需要多个广谱抗体组合实现3.对不同抗原灵敏度与特异性，可拓展到非呼吸道以外如快递表面、冷藏食品等多种适应场景。

发明内容

本发明利用全新抗体增扩引物构建康复病人抗体噬菌体展示库和完备的多种突变抗原表达形式，通过体外独特设计的筛选策略，获得多株结合在RBD不同表位对VOC实现广谱中和的全人源抗体。对其中IMCAS-123、IMCAS-72 、IMCAS-364三个表位不竞争的pM结合能力的抗体开展除药物开发以外的配对检测，针对病毒表面抗原进行高灵敏、抗突变、具备区分高致病Delta与高传播Omicron的快速检测。本发明首次基于免疫层析平台进行免疫学进行Omicron和Delta变异株分型的产品开发，具有灵敏度高、特异性好，检测快速的优点。

具体的，本申请的第一个目的是提供一种基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，该试剂盒包括检测新型冠状病毒的抗体或抗原结合片段，抗体或抗原结合片段为：

IMCAS-123：HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:44所示， HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示；所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:47所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 48所示，且LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO: 49所示；或者，

IMCAS-72：所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；或者，

IMCAS-364：所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 27所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 29所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 34所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 36所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 38所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示。

优选的，IMCAS-123：重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：46所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示；或者，

IMCAS-72：重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；或者，

IMCAS-364：重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示。

所述的抗体或其抗原结合片段，其为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体、单域抗体的形式。

优选的，其为单链抗体，优选的，IMCAS-123的scfv的氨基酸序列如SEQ ID NO：55所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示；

IMCAS-72 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：58所示；

IMCAS-364 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：59所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示。

所述的抗体或其抗原结合片段，特异性结合新型冠状病毒抗原S-RBD蛋白，所述S-RBD选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，相应的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5。

本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段在制备检测新型冠状病毒的药物中的应用，优选的，检测Delta、Omicron突变株。

进一步的，上述试剂盒还包括裂解液和采样拭子。所述裂解液为含有0.05%-2%NaCl、20mM-200mM Tris缓冲液、0.05%-2%的Triton X-100或Tween20的缓冲液。

所述试剂盒优选为免疫层析试剂盒。

其中，所述免疫层析试剂盒包括检测卡，检测卡包括：底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上；结合垫上喷涂有IMCAS-364抗体标记的示踪标志物划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为：C线、T1线、T2线，其中C线固定鼠抗人IgG抗体，T1线固定的抗体为IMCAS-123，T2线固定的抗体为IMCAS-72。优选的，底板为PVC板；优选的，示踪标志物可以为纳米颗粒，如胶体金、乳胶微球、或荧光微球。

进一步的，所述的检测卡还包括外壳，检测卡组装在由塑料制成的上壳和塑料制成的下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫，观察窗对应于检测线T线和质控线C线。

进一步的，IMCAS-123抗体的浓度为0.05-2mg/mL，优选的，为0.08-1 mg/mL ；IMCAS-72抗体的浓度为0.05-2mg/mL，优选的，为0.1-1mg/mL ；IMCAS-364的浓度为1μg-10μg /mL，优选的，为3-6μg /mL。

进一步的，免疫层析试剂盒的具体制备方法如下：(1)结合垫浸泡在10mM Tris缓冲液(pH8.0)中，缓冲液含1％BSA、0.9％NaCl、0.5％Triton X-100，室温浸泡1h，60℃烘干1小时，将浓度1μg-10μg /mL 的IMCAS-364抗体标记的示踪标志物均匀喷在结合垫上，置于干燥箱中，优选的，干燥箱为鼓风干燥箱，37℃烘干过夜；(2)T1线划线液配制：用划膜缓冲液将IMCAS-123抗体稀释至0.05-2mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4；（3）T2线划线液配制：用划膜缓冲液将IMCAS-72抗体稀释至0.05-2mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4；(4)C线划线液配制：用划膜缓冲液将鼠抗人IgG稀释至1.5～2.0mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4；(5)采用划膜仪，将C线抗体、T1线抗体、T2线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上，划液量：1μL/cm；划膜速度：50mm/s；(6)将划好的硝酸纤维素膜置于35-45℃环境烘干2-12h；(7)组装、成品。

所述免疫层析试剂盒还包括外壳，切割的试纸条组装在由塑料制成的上壳和塑料制成的下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫，观察窗对应于检测线T线和质控线C线。在此需要说明的是，上述塑料材质的壳体只是示例性公开的一个实施例，不局限于塑料材质。

划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为：C线、T1线、T2线，其中C线固定鼠抗人IgG抗体，T1线固定的抗体为IMCAS-123，T2线固定的抗体为IMCAS-72。

本申请另一个目的还提供了利用上述抗体或其抗原结合片段或试剂盒进行新型冠状病毒抗原分型检测的非疾病诊断的检测方法。

除此之外，本发明三种抗体组合还可以用于本领域已知的各种试剂盒中，用于新型冠状Delta型与Omicron分型的检测与区分。

本发明适用的样本包括人上呼吸道样本如鼻浅、鼻咽、口咽、唾液，及人非呼吸道样本，如快递表面、冷藏食品表面等。

与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：

本发明提供的抗体、试剂盒可以快速区分Delta这类致病力强与Omicron这类传播力高的突变株。

检测范围可拓展到非呼吸道以外如快递表面、冷藏食品等多种适应场景。

三个不相互竞争的抗体，IMCAS-123对Omicron 假病毒达到0.04ug/ml 中和能力，是目前已有报道中对Omicron逃逸株最好的中和抗体。

IMCAS-72结合在RBD的inner face（内侧面）覆盖了大部分受体结合区域，是一株对Delta突变株均实现0.004ug/ml以下中和能力的抗体。

IMCAS-364 是结合在RBD内侧面下方靶位抗体，其结合能力达到pM，同时与IMCAS-72 、IMCAS-123 均不竞争。

因此这三株抗体通过配伍可以达到Omicron和Delta变异株分型的目的。

本发明首次基于免疫层析平台进行Omicron和Delta变异株分型的产品开发，所述含有IMCAS-364、IMCAS-72 、IMCAS-123的试纸条、试剂盒具有灵敏度高、特异性好，检测快速的优点。

附图说明

图1为本申请三种抗体scfv蛋白和全抗过Superdex200pg分子筛图和SDS-PAGE图；

图2为三种抗体分别与SARS-CoV-RBD亲和力的检测图（biacore-8k）；

图3为本申请具体实施例示例性公开的免疫层析试剂盒的检测卡结构示意图；

图4A-图4C为实施例2提供的免疫层析试剂盒对新型冠状病毒不同抗原分型检测灵敏度评估，其中，4A为对应表1中的WT-RBD的试剂盒，4B为对应表1中Delta-RBD的试剂盒，4C中第一排为对应表1中Omicron BA.1-RBD的试剂盒、第二排为对应表1中Omicron BA.2-RBD的试剂盒、第三排为对应表1中的Omicron BA.1-RBD的试剂盒；

图5A-图5C为以市售抗体制备出免疫层析试剂盒对新型冠状病毒不同抗原分型检测灵敏度评估，其中，5A为对应表2中的WT-RBD的试剂盒，5B为对应表2中Delta-RBD的试剂盒，5C中第一排为对应表2中Omicron BA.1-RBD的试剂盒、第二排为对应表2中OmicronBA.2-RBD的试剂盒、第三排为对应表2中的Omicron BA.1-RBD的试剂盒。

具体实施方式

实施例1：抗体制备

一、康复病人外周血淋巴细胞RNA提取与人源单链抗体噬菌体展示文库的建立

在12名感染新型冠状病毒且痊愈出院的人员知情同意下，各采集3-10mL 的血液，分离PBMCs，转入1.5mlEP管中。加入700mltrizol并放置5分钟，在上述EP管中，加入0.14ml氯仿，盖上EP管盖子，剧烈震荡15秒，室温静置3分钟，12000g（4℃）离心15分钟。取上层水相置于新EP管中，加入 0.5ml异丙醇，在室温下静置10分钟，12000g（4℃）离心10分钟。弃上清，加入1ml 75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（4℃）离心5分钟，弃上清。让沉淀的RNA在室温在自然干燥。用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

通过HiScript-TS 5'/3' RACE Kit (Vazyme) 逆转录试剂盒，按说明书分别增扩VH、VL的DNA模板后，用2 × Taq Master Mix酶 (Vazyme)进行PCR，扩增抗体可变区序列，反应条件如下：95℃，2min；95℃，15s，58℃，15s，72℃，30s，35个循环，72℃，7min。1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将400-500bp的条带切胶回收。等摩尔比将12个人VH混合一起，同法混合VL片段后，将混合后VH与VL进行等摩尔比混合后用PCR搭桥引物连接抗体基因的重链轻链可变区，使用2 × Taq Master Mix酶 (Vazyme)进行PCR，反应条件如下：95℃，2min；95℃，15s，67℃，15s，72℃，30s，30个循环，72℃，7min增扩出完整的单链抗体scfv(VH-VL)，1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将750-800bp的条带切胶回收。将Overlapping后的产物与sfiI酶切后的pcomb3xss (addgene)质粒按照3：1的比例连接形成Phagemid，连接产物转化Top10感受态细胞，涂氨苄抗性平板（1：1000），37℃过夜培养后，将所有菌落收集大提质粒，得到5-10mg质粒文库。将20ug质粒使用电转仪(biorad)转化入TG1感受态细胞，1mlSOC37度1小时慢摇后，加入5ml氨苄抗性培养基，40分钟后加入5E7个辅助噬菌体，1小时后，转入125ml锥形瓶，加入氨苄西林和卡那霉素双抗LB，25ml，30度过夜，可增扩得到5E12pfu/ml 的噬菌体文库。

二、关键抗原制备

合成野生型新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域段（RBD）蛋白（氨基酸序列如SEQID NO：1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示）、Beta型新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域段（RBD）蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示）。通过EcoRI与XhoI两个酶切位点构建到pCAGGS质粒载体上。其中蛋白编码区5‘端前置信号肽核苷酸序列ATGTTTGTGTTTCTTGTGCTTCTTCCTCTTGTGTCATCACAATGC，同时蛋白编码区的3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子。用含10%FBS的DMEM培养293T细胞。用质粒转染293T。转染4-6小时后给细胞换液成无血清的DMEM继续培养3天，收集上清，并补加DMEM，再培养4天，收集上清。收集的上清经过5000rpm离心30min后，与含有20mM磷酸钠(pH 8.0)的缓冲液等体积混合，经过0.22 μm滤膜过滤后，与His-trapExcel预装柱结合（5mL，GE Healthcare）。以10mM咪唑洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS-PAGE确定，结果说明目标蛋白得到正常表达。

三、人源单链抗体噬菌体展示文库筛选

取纯化的野生型新型冠状病毒RBD蛋白，用PBS（Ph7.4）溶液按5ng/ul，每孔100ul包被96孔板，置于4℃冰箱中过夜包被。过夜包被后，弃去各孔内的包被液用0.05%的PBST溶液洗去未吸附的抗原，每孔加入65ul浓度为0.5%的BSA封闭半小时，随后加入40ul 10%吐温-20室 温下静置半小时30min后，弃去封闭液，0.05%的PBST洗板3次。取100ul纯化后的噬菌体溶入900ul 溶解buffer(0.5%的BSA0.05%的PBST)中混匀，用排枪向每孔中加入100ul，室温下孵育2h。弃去Elisa板中的噬菌体溶液，用0.05%的PBST洗板10次。用排枪向每孔内加入100ul洗脱液（pH=2.2,0.1M HCL），400rpm摇20min。将每10个孔内的洗脱液混合在一起，得到1000ul噬菌体。每管噬菌体加入200ul 终止液(1M Tris和0.5% BSA 1:1混合)，收集在2ml离心管内。取1管XLI-Blue感受态细胞（约100ul）接入5ml液体LB培养基中，摇至OD600介于0.6至0.8时停止。向5ml菌液中加入600ul噬菌体，转移至50ml无菌离心管中，37℃下220rpm摇菌半小时。向50ml管中加入1/1000的比例氨苄西林37℃下220rpm接菌，摇至OD值0.8左右。按1：1000的比例加入辅助噬菌体M13KO7（9×1012pfu/ml），37℃下220rpm摇菌半小时。随后转入到含有30ml 2YT培养基的锥形瓶，1：1000加入氨苄西林和卡那霉素。37℃下220rpm摇菌4小时，向锥形瓶中1:1000加入IPTG 30℃下过夜培养后的5E12pfu噬菌体筛选文库。重复上述步骤三次后，将野生型新型冠状病毒RBD蛋白变化为突变新型冠状病毒beta-RBD蛋白开展第四轮筛选。将第四轮洗脱的噬菌体，20ul接入摇至OD600介于0.6至0.8时的XLI-Blue感染20分钟后，涂布LB平板，37度过夜静置后，挑选384个单克隆进行菌落PCR，使用2 × Taq Master Mix酶 (Vazyme)进行PCR，反应条件如下：95℃，2min；95℃，15s，67℃，15s，72℃，30s，30个循环，72℃，7min增扩。1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将850-1000bp的阳性条带切胶回收。

四、候选抗体 SS320原核细胞小规模表达与鉴定

测序并进行序列比对，将所ScFv序列重复数大于2的噬菌体质粒，利用电转技术转化进入SS320细胞，加入无抗培养基在37℃摇菌1h，涂1‰氨苄抗性平板，挑单克隆菌落到100ul含有氨苄的培养基中，37℃培养箱中过夜培养。次日，接入到1.5ml的含有1‰氨苄和20ml 1M Mgcl2的SB培养基中,继续在400 rpm/min的37℃培养箱中培养8h后1：1000加入1M的IPTG 37℃过夜诱导。次日，将诱导完成的菌液收集，6500rpm，4℃，离心30min，收集上清后用0.22μm滤膜进行推滤。上清加入包被有野生型和Beta突变型、Omicron新型冠状病毒RBD蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示）的96孔板中进行ELISA实验，每孔按顺序加入100ul试表达溶液，每个样品加3个孔，室温下静置1h。100ul0.1%PBST溶液洗脱洗3次。按照1：2500的比例在0.1%的PBST中稀释一抗（兔抗HA），注意避光保存。用排枪向每孔中加入100ul一抗稀释液，室温下孵育1h。100ul 0.1%PBST溶液洗脱洗3次。二抗为羊抗兔IgG-HRP，孵育1h，100ul 0.1%PBST溶液洗脱洗3次。向每孔中加入50ul显色液TMB，37℃反应10-20min至显色适当时，立即加入50ul 2M浓HCl终止显色反应。

确认最优广谱结合能力的scfv为IMCAS-123，其scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：55所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示。

IMCAS-72 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：58所示；

IMCAS-364 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：59所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示。

五、抗体IgG全抗构建、表达和纯化

为了获得人源抗体进行后续评价，我们设计了全抗IgG1构建。策略如下：

重链H：CMV promoter-EcoRI-信号肽(SP)-重链可变区(VH)-重链恒定区(CH)-Xhol；

轻链κ：CMV promoter-EcoRI-信号肽(SP)-轻链可变区(VK)-轻链恒定区(CLκ)-Xhol；

分别将轻重链可变区序列与相应的含由重链CH和轻链CLκ的恒定区的表达载体pCAGGS，通过同源重组连接，克隆至表达载体pCAGGS中，得到含有特定抗体轻、重链编码基因的重组质粒；其中，使用酶切位点ScaI和KpnI将轻重链可变区连入含有恒定区的载体中。

用IMCAS-123/或IMCAS-72/或IMCAS-364的轻、重链编码基因的质粒按照重链：轻链1：1.5比例共转染密度3*10^6 293F细胞。用150mM NaCl稀释质粒1ml细胞加1ug质粒，用150mM NaCl稀释1mg/ml PEI 1ml 细胞加3ul，静置5min；上述二者混匀后静置20min，逐滴加入293F细胞。转染24h后按照1ml加0.035ml补料液，随后每48h加一次补料液。

转染5d后收上清，6500rpm离心30min去除细胞沉淀，与含有20mM磷酸钠(pH 7.4)等体积混合，经过0.22 um滤膜过滤后，与protein A预装柱结合（5mL, GE Healthcare）。以10mM甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS-PAGE确定，结果如图1所示。

获得抗体序列如下：

（1）IMCAS-123抗体，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：46所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示；

抗体IgG的重链全长包括SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ IDNO：52；轻链包括SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：56所示。

（2）IMCAS-72抗体，重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：13所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：23所示；

抗体IgG的重链包括SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链包括SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示。

（3）IMCAS-364抗体，重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：31所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：40所示；

抗体IgG的重链包括SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示；轻链包括SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：42所示。

利用等离子共振技术检测上述三种抗体与新型冠状病毒常见亚型的特异性结合活性，结果如图2所示：

抗体IMCAS-123和SARS-CoV-2 Prototype RBD蛋白的亲和力常数为0.18nM，抗体IMCAS-123和SARS-CoV-2 Alpha variant RBD蛋白的亲和力常数为0.15nM。抗体IMCAS-123和SARS-CoV-2 Beta variant RBD蛋白的亲和力常数为0.32nM；抗体IMCAS-123和SARS-CoV-2 Delta variant RBD蛋白的亲和力常数为0.48nM，抗体IMCAS-123和SARS-CoV-2Omicron variant RBD蛋白的亲和力常数为1.41nM，上述数据表明：抗体IMCAS-123与SARS-CoV-RBD有很强的亲和力。

抗体IMCAS-72和SARS-CoV-2 Prototype RBD蛋白的亲和力常数为0.39nM，抗体IMCAS-72和SARS-CoV-2 Alpha variant RBD蛋白的亲和力常数为6.37nM。抗体IMCAS-72和SARS-CoV-2 Beta variant RBD蛋白无明显亲和力；抗体IMCAS-72和SARS-CoV-2 Deltavariant RBD蛋白的亲和力常数为0.62nM，抗体IMCAS-72和SARS-CoV-2 Omicron variantRBD蛋白无明显结合力，上述数据表明：抗体IMCAS-72与SARS-CoV-RBD有很强的亲和力。

抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Prototype RBD蛋白的亲和力常数为1.04nM，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Alpha variant RBD蛋白的亲和力常数为1.06nM。抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Beta variant RBD蛋白的亲和力常数为1.07nM；抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Delta variant RBD蛋白的亲和力常数为1.18nM，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2Omicron variant RBD蛋白的亲和力常数为2.19nM，上述数据表明：抗体IMCAS-364与SARS-CoV-RBD有很强的亲和力。

实施例2：用于新型冠状病毒检测的免疫层析试剂盒

2.1试剂盒制备：一种免疫层析试剂盒包括检测卡、裂解液、采样拭子。

如图3所示，检测卡包括PVC底板5、样品垫4、结合垫3、硝酸纤维素膜2和吸水纸1，所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板、切割；互相交错搭接的尺寸为2mm，PVC底板5的尺寸为80-300mm，切割尺寸为3-4mm宽，加干燥剂于常温下在铝箔袋中密封保存，得到所述的检测卡；其中，样品垫4，尺寸为20*300mm；吸水纸1，尺寸为28*300mm；结合垫3为玻璃纤维材质；

结合垫处理液：10mM Tris(PH7.5-8.5)，含1-2%BSA,0.9%NaCl,0.1-0.5% TritonX-100

划线稀释液：10mM-50mM PH7.0-7.4 PB

胶体金保存液为：0.05-5％BSA、1-30％蔗糖、1-30%海藻糖、0.05%-0.2％Tween-20的pH8.0-8.5的20mM-50mM Tris-HCl缓冲液。

所述的检试剂盒还包括外壳，切割的检测卡组装在由塑料制成的上壳和塑料制成的下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫5，观察窗对应于检测线T线和质控线C线。

试剂盒的具体制备方法如下：(1)结合垫浸泡在10mM Tris缓冲液(pH8.0)中，缓冲液含1％BSA、0.9％NaCl、0.5％Triton X-100，室温浸泡1h，60℃烘干1小时，将浓度1μg-10μg /mL 的IMCAS-364抗体标记的示踪标志物均匀喷在结合垫上，置于干燥箱中，优选的，干燥箱为鼓风干燥箱，37℃烘干过夜；(2)T1线划线液配制：用划膜缓冲液将IMCAS-123抗体稀释至0.05-2mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4；（3）T2线划线液配制：用划膜缓冲液将IMCAS-72抗体稀释至0.05-2mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4；(4)C线划线液配制：用划膜缓冲液将鼠抗人IgG稀释至1.5～2.0mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4；(5)采用划膜仪，将C线抗体、T1线抗体、T2线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上，划液量：1μL/cm；划膜速度：50mm/s；(6)将划好的硝酸纤维素膜置于35-45℃环境烘干2-12h；(7)组装、成品。

裂解液为含有0.05%-2% NaCl、20mM-200mM Tris缓冲液、0.05%-2%的Triton X-100或Tween20的缓冲液。通过摸索、反复试验，获得曲拉通X-100和Tween20的上述配制浓度，使得病毒较好释放。

将检测卡、裂解液、采样拭子和说明书装盒即为新型冠状病毒抗原分型的免疫层析试剂盒成品。

试剂盒检测效果实验：分别用裂解液梯度稀释WT-RBD(野生型)、delta-RBD、Omicron BA.1-RBD、Omicron BA.2-RBD、Omicron BA.3-RBD，使用实施例2获得的试剂盒对新型冠状病毒不同抗原分型进行检测，对灵敏度进行评估。对照组选取市售的三株针对新型冠状病毒RBD的鼠抗制备成的试剂盒进行检测。其中，实验组抗体浓度分别：IMCAS-123为0.1mg/mL，IMCAS-72为0.2mg/mL，IMCAS-364为5μg/mL；对照组抗体浓度：T1线抗体1为0.1mg/mL，T2线抗体2为0.2mg/mL，金标抗体3为5μg/mL。结果如表1、图4A-图4C所示，其中图4A为对应表1中的WT-RBD的试剂盒，图4B为对应表1中Delta-RBD的试剂盒，图4C中第一排为对应表1中Omicron BA.1-RBD的试剂盒、第二排为对应表1中Omicron BA.2-RBD的试剂盒、第三排为对应表1中的Omicron BA.1-RBD的试剂盒。结果表明，IMCAS-123对野生型RBD、delta检测灵敏度达到0.002ug/ml以下，呈现 T2+ T1-的特点；IMCAS-72对Omicron BA.1BA.2 BA.3 均可识别，呈现 T1+ T2-的特点，检测灵敏度达到 0.016ug/ml。所述试剂盒能够检测出是否携带新型冠状病毒，并且能够将delta与Omicron进行区分，检测灵敏度很高。

对照组如表2、图5A-图5C所示，其中图5A为对应表2中的WT-RBD的试剂盒，图5B为对应表2中Delta-RBD的试剂盒，图5C中第一排为对应表2中Omicron BA.1-RBD的试剂盒、第二排为对应表2中Omicron BA.2-RBD的试剂盒、第三排为对应表2中的Omicron BA.1-RBD的试剂盒。结果表明，对照组T2检测Delta-RBD的最低检测限为63ng/mL,检测野生型-RBD的最低检测限为31ng/mL,检测野生型RBD和Delta均呈现T2强，T1弱或不出线现象；T1检测Omicron BA.1 RBD的最低检测限为31ng/mL,检测Omicron BA.2 RBD的最低检测限为125ng/mL,检测Omicron BA.3 RBD的最低检测限为31ng/mL,检测Omicron RBD呈现T1强，T2弱的现象，对RBD和Delta突变株不能区分。因此，该试剂盒对Omicron和Delta不能达到区分的目的，且对Delta和Omicron的检测灵敏度较差。

表1.本发明试剂盒检测结果

表2. 对照组检测结果

该试剂盒对delta型RBD与Omicron型RBD进行区分的原理推测如下：

若所述样本中含有新型冠状病毒Omicron突变株，Omicron突变株的抗原RBD将与所述胶体金垫标记的IMCAS-364抗体特异性结合形成复合物；该复合物不与T2线上包被的IMCAS-72反应，而被T1检测线上包被的IMCAS-123抗体捕获并出现红色条带；

若所述样本中含有新型冠状病毒Delta突变株，Delta突变株的抗原RBD将与所述胶体金垫标记的IMCAS-364抗体特异性结合形成复合物；该复合物能被T2检测线上包被的IMCAS-72抗体捕获并出现红色条带；从图2可以看出IMCAS-123抗体对Delta型RBD也具有一定的亲和力，当IMCAS-123抗体浓度满足对Delta型RBD的捕获要求时，该复合物也能被T1检测线上的IMCAS-123抗体捕获，从而在T1检测线处也出现红色条带；

若所述样本中不含有新型冠状病毒高传播Omicron株和高致病Delta株，则T1检测线、T2检测线不出现红色条带；

无论样本中是否含有新型冠状病毒，质控C线均出现红色条带。若C质控线未出现红色，则表明胶体金失效或者实验操作有误，实验结果无效，需重新检测。

不同浓度抗体对新型冠状病毒检测效果的影响实验：分别用裂解液梯度稀释WT-RBD、delta-RBD、Omicron BA.1-RBD、Omicron BA.2-RBD、Omicron BA.3-RBD，采用实施例2中的方法获取不同的试剂盒对新型冠状病毒不同抗原分型进行检测，检测结果如表3-表5所示。其中，表3所用抗体浓度分别：MCAS-123为0.05mg/mL，IMCAS-72为0.05mg/mL，IMCAS-364为1μg/mL；表4所用抗体浓度分别：MCAS-123为0.8mg/mL，IMCAS-72为0.8mg/mL，IMCAS-364为6μg/mL；表5所用抗体浓度分别：MCAS-123为2mg/mL，IMCAS-72为2mg/mL，IMCAS-364为10μg/mL。

表3不同浓度抗体对新型冠状病毒检测效果的影响（浓度一）

从表3中可以看出：T2线对野生型RBD的最低检测限为63ng/mL、对Delta型RBD的最低检测限为31ng/mL；T1线对Omicron型RBD的最低检测限为125ng/mL。因此，对野生型RBD和Delta型RBD，T2线均呈现强的检测结果，T1线的检测信号弱或不出线现象；对Omicron型RBD，T1线呈现强的检测结果，T2线不出线的现象。故该试纸盒可用于区分Omicron和Delta突变株。

表4不同浓度抗体对新型冠状病毒检测效果的影响（浓度二）

从表4中可以看出：T2线对野生型RBD和Delta型RBD的最低检测限均为4ng/mL，T1线对Omicron型RBD的最低检测限为31ng/mL。因此，对野生型RBD和Delta型RBD，T2线均呈现强的检测信号，T1线的检测信号弱或不出线现象；对测Omicron型RBD，T1线呈现强的检测信号，T2线不出线的现象。故该试纸盒可用于区分Omicron和Delta突变株。

表5不同浓度抗体对新型冠状病毒检测效果的影响（浓度三）

从表5中可以看出：T2线对野生型RBD的最低检测限为4ng/mL，对Delta型RBD的最低检测限为4ng/mL；T1线对Omicron型RBD的最低检测限为31ng/mL。因此，对野生型RBD和Delta 型RBD，T2线均呈现强的检测信号，T1线的检测效果弱或不出线现象；对Omicron型RBD呈现T1线强的检测信号，T2线不出线的现象。故该试纸盒可用于区分Omicron和Delta突变株。

综上所述，从不同抗体浓度组合情况可以看出，在一定范围内随着抗体浓度增加，试纸盒灵敏度增加，继续增加将影响试纸盒的灵敏度。

实施例3：不同样本的检测实验

将实施例2.1制备的免疫层析试剂盒用于对不同样本源新型冠状病毒分型进行检测，检测结果如表6所示。

表6不同形式试剂盒对不同样本源检测结果统计

表1-表6中符号所代表含义如下：

“+++”及“++++”： 强阳（T线颜色很深）；

“++”： 中阳（T线颜色深）；

“+”： 阳性（T线颜色较深，且明显可见）；

“+-”： 弱阳（T线颜色淡，但清晰可见）；

“+--”： 临界阳性（T线颜色很淡，需要仔细观察可见）；

“-”： 阴性（T线不可见）。

以上已以较佳实施例公布了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 江苏美克医学技术有限公司 中国科学院微生物研究所

<120> 基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒及其应用

<141> 2022-02-23

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 732

<212> DNA/RNA

<213> WT-RBD

<400> 1

atgtttgtgt ttcttgtgct tcttcctctt gtgtcatcac aatgcagagt gcaacctaca 60

gaatcaatcg tgagatttcc taacatcaca aacctttgcc ctttcggcga ggtgtttaac 120

gcaacaagat ttgcatcagt gtacgcatgg aacagaaagc gtatatcaaa ctgcgtggca 180

gattactcag tgctttacaa ctcagcatca ttcagtacgt ttaaatgcta cggagtgtca 240

cctacaaagc taaatgatct ttgctttaca aacgtgtacg cagattcatt tgtgatcaga 300

ggagatgaag tgagacaaat cgcacctgga caaacaggaa aaattgccga ttacaactac 360

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ggataccaac cttacagagt ggtggtgctt tcatttgaac ttcttcacgc acctgcaaca 660

gtgtgcggac ctaagaagag cacgaacctt gtgaagaata agtgcgtgaa ctttcaccac 720

caccaccacc ac 732

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> WT-RBD

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg

1 5 10 15

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

20 25 30

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

35 40 45

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

50 55 60

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

65 70 75 80

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

85 90 95

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

100 105 110

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

115 120 125

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

130 135 140

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

165 170 175

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

180 185 190

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

195 200 205

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

210 215 220

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His

225 230 235 240

His His His His

<210> 3

<211> 732

<212> DNA/RNA

<213> Beta-RBD

<400> 3

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gattactcag tgctttacaa ctcagcatca ttcagtacgt ttaaatgcta cggagtgtca 240

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<210> 4

<211> 244

<212> PRT

<213> Beta-RBD

<400> 4

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1 5 10 15

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20 25 30

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

35 40 45

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

50 55 60

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

65 70 75 80

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

85 90 95

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

100 105 110

Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

115 120 125

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

130 135 140

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

165 170 175

Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

180 185 190

Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

195 200 205

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210 215 220

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His

225 230 235 240

His His His His

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<211> 732

<212> DNA/RNA

<213> Omicron-RBD

<400> 5

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gcaacaagat ttgcatcagt gtacgcatgg aacagaaagc gtatatcaaa ctgcgtggca 180

gattactcag tgctttacaa cttagcacca ttctttacgt ttaaatgcta cggagtgtca 240

cctacaaagc taaatgatct ttgctttaca aacgtgtacg cagattcatt tgtgatcaga 300

ggagatgaag tgagacaaat cgcacctgga caaacaggaa aaattgccga ttacaactac 360

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aaggtaagtg gtaattataa ttatttgtat aggctctttc gtaagagcaa cttaaagcca 480

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gcaggattta actgctactt tcctcttcga tcatactcat ttagacctac aaacggagtg 600

ggacaccaac cttacagagt ggtggtgctt tcatttgaac ttcttcacgc acctgcaaca 660

gtgtgcggac ctaagaagag cacgaacctt gtgaagaata agtgcgtgaa ctttcaccac 720

caccaccacc ac 732

<210> 6

<211> 244

<212> PRT

<213> Omicron-RBD

<400> 6

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165 170 175

Cys Asn Gly Val Ala Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Tyr

180 185 190

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<211> 16

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<210> 14

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<400> 14

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1 5 10 15

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85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

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Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

145 150 155 160

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

165 170 175

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

180 185 190

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

195 200 205

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

210 215 220

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

340 345 350

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

355 360 365

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

370 375 380

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

385 390 395 400

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

405 410 415

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

420 425 430

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

435 440 445

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

450 455 460

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 15

<211> 1422

<212> DNA/RNA

<213> IMCAS-72

<400> 15

atggagacgg atacgctgct cctgtgggtt ttgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gaccaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtcc agcctggggg gtccctgaga 120

ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc agtagctatg gtatgcactg ggtccgccag 180

gctccaggca aggggctgga gtgggtggca gttatatcat atgatggaag tgataaatac 240

tacgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 300

tatctgcaaa tgaacagcct gagagctgag gacacggctg tgtattactg tgcgagagat 360

cgggatagat ttggggacca aggggggtgg ttcgacccct ggggccaggg aaccctggtc 420

accgtctcct cagccagcac caaaggcccg agcgtgtttc cgctggcgcc gagcagcaaa 480

agcaccagcg gcggcaccgc ggcgctgggc tgcctggtga aagattattt tccggaaccg 540

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ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840

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ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080

aaaactatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140

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cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1320

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 1422

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> IMCAS-72

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Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

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cagagcatta gcagctat 18

<210> 18

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<212> PRT

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Ala Ala Ser

1

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gctgcatcc 9

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Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr

1 5

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caacagagtt acagtacccc attcact 27

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<211> 108

<212> PRT

<213> IMCAS-72

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly

100 105

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<211> 236

<212> PRT

<213> IMCAS-72

<400> 23

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

100 105 110

Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser

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gacgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120

accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300

cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa cagagttaca gtaccccatt cactttcggc 360

cctgggacca aagtggatat caaacgaact gtggctgcac caagcgtgtt tatcttccct 420

cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tctgtctcct gaacaacttc 480

tatcccaggg aggccaaggt ccagtggaaa gtggacaacg ccctgcaaag cggcaatagc 540

caggagtccg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgtc cagcaccctg 600

accctcagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cttgcgaggt gacccatcag 660

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Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

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Ala Lys Gln Glu Gly Thr Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Gly

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Leu Asp Tyr

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<211> 128

<212> PRT

<213> IMCAS-364

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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

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Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

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<213> IMCAS-364

<400> 32

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val

20 25 30

Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Arg Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Glu Gly Thr Tyr Cys Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Cys Tyr Ser Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

130 135 140

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

145 150 155 160

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

165 170 175

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

180 185 190

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

195 200 205

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

210 215 220

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

225 230 235 240

Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Gly His Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

275 280 285

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

305 310 315 320

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

325 330 335

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

355 360 365

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

370 375 380

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

420 425 430

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

435 440 445

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

450 455 460

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

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Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

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tatcccaggg aggccaaggt ccagtggaaa gtggacaacg ccctgcaaag cggcaatagc 540

caggagtccg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgtc cagcaccctg 600

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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Ala Lys Asp His Leu Ile Thr Met Val Gln Pro Glu Tyr Phe His His

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100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp His Leu Ile Thr Met Val Gln Pro

115 120 125

Glu Tyr Phe His His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

145 150 155 160

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

165 170 175

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

180 185 190

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

195 200 205

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

210 215 220

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

225 230 235 240

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

260 265 270

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

275 280 285

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

290 295 300

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

305 310 315 320

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

325 330 335

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

340 345 350

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

355 360 365

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

370 375 380

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

385 390 395 400

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

405 410 415

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

420 425 430

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

435 440 445

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

450 455 460

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 52

<211> 1422

<212> DNA/RNA

<213> IMCAS-123

<400> 52

atggagacgg atacgctgct cctgtgggtt ttgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gaccaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggagg gtccctgaga 120

ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt agcagctatg ccatgagctg ggtccgccag 180

gctccaggga aggggctgga gtgggtctca gctattagtg gtagtggtgg tagcacatac 240

tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 300

tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaagat 360

caccttatta ctatggttca gcctgaatac ttccaccact ggggccaggg caccctggtc 420

accgtctcct cagccagcac caaaggcccg agcgtgtttc cgctggcgcc gagcagcaaa 480

agcaccagcg gcggcaccgc ggcgctgggc tgcctggtga aagattattt tccggaaccg 540

gtgaccgtga gctggaacag cggcgcgctg accagcggcg tgcatacctt tccggcggtg 600

ctgcagagca gcggcctgta tagcctgagc agcgtggtga ccgtgccgag cagcagcctg 660

ggcacccaga cctatatttg caacgtgaac cataaaccga gcaacaccaa agtggataaa 720

cgcgtggagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 780

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 900

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080

aaaactatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1200

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1320

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 1422

<210> 53

<211> 236

<212> PRT

<213> IMCAS-123

<400> 53

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Gly Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asp Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala

100 105 110

Asp Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 54

<211> 810

<212> DNA/RNA

<213> IMCAS-123 SCFV

<400> 54

gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtcggaga cagcgtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca gggaattagc agatggttag cctggtatca gcagagacca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcaggcaatt tggaaactgg ggtcccatcc 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcga cctgcaggct 240

gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctgacagtt tcccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaaag tggatatcaa aggtggttcc tctagatctt cccaggtgca gctggtggag 360

tctgggggag gcttggtaca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga 420

ttcaccttta gcagctatgc catgagctgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag 480

tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt agcacatact acgcagactc cgtgaagggc 540

cggttcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 600

agagccgagg acacggccgt atattactgt gcgaaagatc accttattac tatggttcag 660

cctgaatact tccaccactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 720

aagggcccat ccgtcactag tggccaggcc ggccagcacc atcaccatca ccatggcgca 780

tacccgtacg acgttccgga ctacgcttct 810

<210> 55

<211> 270

<212> PRT

<213> IMCAS-123 SCFV

<400> 55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Gly Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg

100 105 110

Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

115 120 125

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

130 135 140

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

145 150 155 160

Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

165 170 175

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

180 185 190

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

195 200 205

Tyr Cys Ala Lys Asp His Leu Ile Thr Met Val Gln Pro Glu Tyr Phe

210 215 220

His His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

225 230 235 240

Lys Gly Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His

245 250 255

His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser

260 265 270

<210> 56

<211> 708

<212> DNA/RNA

<213> IMCAS-123

<400> 56

atggagacgg atacgctgct cctgtgggtt ttgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacgacatcc agatgaccca gtctccatct tccgtgtctg catctgtcgg agacagcgtc 120

accatcactt gtcgggcgag tcagggaatt agcagatggt tagcctggta tcagcagaga 180

ccagggaaag cccctaaact cctgatctat gctgcaggca atttggaaac tggggtccca 240

tccaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cgacctgcag 300

gctgaagatt ttgcaactta ctattgtcaa caggctgaca gtttcccgct cactttcggc 360

ggagggacca aagtggatat caaacgaact gtggctgcac caagcgtgtt tatcttccct 420

cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tctgtctcct gaacaacttc 480

tatcccaggg aggccaaggt ccagtggaaa gtggacaacg ccctgcaaag cggcaatagc 540

caggagtccg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgtc cagcaccctg 600

accctcagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cttgcgaggt gacccatcag 660

ggcctgtcca gccccgtgac caagtccttc aacaggggcg aatgcagc 708

<210> 57

<211> 258

<212> PRT

<213> IMCAS-72 SCFV

<400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg

100 105 110

Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

115 120 125

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

130 135 140

Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

145 150 155 160

Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp

165 170 175

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

180 185 190

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

195 200 205

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Asp Arg Phe Gly Asp Gln Gly Gly Trp Phe

210 215 220

Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala

225 230 235 240

Ser Ala Pro Thr Leu Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His

245 250 255

His His

<210> 58

<211> 774

<212> DNA/RNA

<213> IMCAS-72 SCFV

<400> 58

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccattcac tttcggccct 300

gggaccaaag tggatatcaa aggtggttcc tctagatctt cccaggtgca gctggtggag 360

tctgggggag gcttggtcca gcctgggggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga 420

ttcaccttca gtagctatgg tatgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag 480

tgggtggcag ttatatcata tgatggaagt gataaatact acgcagactc cgtgaagggc 540

cgattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 600

agagctgagg acacggctgt gtattactgt gcgagagatc gggatagatt tggggaccaa 660

ggggggtggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agggagtgca 720

tccgccccaa cccttactag tggccaggcc ggccagcacc atcaccatca ccat 774

<210> 59

<211> 273

<212> PRT

<213> IMCAS-364 SCFV

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg

100 105 110

Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro

115 120 125

Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

130 135 140

Arg Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

145 150 155 160

Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp

165 170 175

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

180 185 190

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr

195 200 205

Tyr Cys Ala Lys Gln Glu Gly Thr Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr

210 215 220

Ser Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His

245 250 255

His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

260 265 270

Ser

<210> 60

<211> 819

<212> DNA/RNA

<213> IMCAS-364 SCFV

<400> 60

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta caccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaaag tggatatcaa aggtggttcc tctagatctt cccaggtgca gctgcaggag 360

tctgggggag gcgtggtcca gcctgggagg tccctgagac tctcctgtgc agcgtctgga 420

ttcaccttca gtagatatgg catgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag 480

tgggtggcag ttatttggta tgatggaagt aataaatact atgcagactc cgtgaagggc 540

cgattcacca tctccagaga caattccaag aacacgttgt atctgcaaat gaacagcctg 600

agagccgacg acacggctgt gtattactgt gcgaaacagg aggggacata ttgtagtggt 660

ggtagctgct acagtggcct tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 720

gcctccacca agggcccatc cgtcactagt ggccaggccg gccagcacca tcaccatcac 780

catggcgcat acccgtacga cgttccggac tacgcttct 819

Claims (23)

1.一种基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括与新型冠状病毒特异性结合的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区：所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述抗体或抗原结合片段为：IMCAS-123：HCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:43所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示， HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:45所示；所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 48所示，且LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 49所示；和

IMCAS-72：所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示；和IMCAS-364：所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO: 29所示；所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 34所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 36所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。

2.如权利要求1所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述IMCAS-123抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：46所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示；和所述IMCAS-72抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；和所述IMCAS-364抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示。

3.如权利要求1-2任一项所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述抗体为全长抗体、单链抗体scFv、双特异性抗体、多特异性抗体。

4.如权利要求3所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述IMCAS-123的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：55所示；IMCAS-72的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示；IMCAS-364的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：59所示。

5.如权利要求1-2任一项所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合新型冠状病毒抗原RBD蛋白。

6.如权利要求1-2任一项所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：裂解液和采样拭子。

7.如权利要求6所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述裂解液为含有0.05%-2% NaCl、20mM-200mM Tris缓冲液、0.05%-2%的Triton X-100或Tween20的缓冲液。

8.如权利要求1所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，其为免疫层析试剂盒。

9.如权利要求8所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述免疫层析试剂盒包括检测卡，检测卡包括：底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上；结合垫上喷涂有IMCAS-364抗体标记的示踪标志物，划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为：C线、T1线、T2线，其中C线固定鼠抗人IgG抗体，T1线固定的抗体为IMCAS-123，T2线固定的抗体为IMCAS-72。

10.如权利要求9所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述底板为PVC板。

11.如权利要求9所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒。

12.如权利要求11所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述示踪标志物为胶体金。

13.如权利要求9所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括外壳，检测卡组装在上壳和下壳扣合而成的外壳中，上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫，观察窗对应于T1线、T2线和C线。

14.如权利要求8-13任一项所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，IMCAS-123抗体的浓度为0.05-2mg/mL；IMCAS-72抗体的浓度为0.05-2mg/mL；IMCAS-364的浓度为1μg-10μg /mL。

15.如权利要求14所述的基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒，其特征在于，IMCAS-123抗体的浓度为0.08-1mg/mL ；IMCAS-72抗体的浓度为0.1-1mg/mL ；IMCAS-364的浓度为3-6μg /mL。

16.如权利要求8-13任一项所述基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒的制备方法，其特征在于，(1)结合垫浸泡在10mM Tris缓冲液(pH8.0)中，缓冲液含1％BSA、0.9％NaCl、0.5％Triton X-100，室温浸泡1h，60℃烘干1小时，将浓度1μg-10μg /mL 的IMCAS-364抗体标记的示踪标志物均匀喷在结合垫上，置于干燥箱中，37℃烘干过夜；(2)T1线划线液配制：用划膜缓冲液将IMCAS-123抗体稀释至0.05-2mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/LPBS溶液，pH7.0～7.4；（3）T2线划线液配制：用划膜缓冲液将IMCAS-72抗体稀释至0.05-2mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4；(4)C线划线液配制：用划膜缓冲液将鼠抗人IgG稀释至1.5～2.0mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4；(5)采用划膜仪，将C线抗体、T1线抗体、T2线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上，划液量：1μL/cm；划膜速度：50mm/s；(6)将划好的硝酸纤维素膜置于35-45℃环境烘干2-12h；(7)组装、成品。

17.如权利要求16所述基于人源抗体的新型冠状病毒分型检测试剂盒的制备方法，其特征在于，IMCAS-123抗体的浓度为0.08-1mg/mL ；IMCAS-72抗体的浓度为0.1-1mg/mL ；IMCAS-364的浓度为3-6μg /mL。

18.一种利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒进行新型冠状病毒抗原分型检测的非疾病诊断的检测方法。

19.如权利要求18所述的非疾病诊断的检测方法，其特征在于，检测样本为离体的上呼吸道样本，如鼻浅、鼻咽、口咽、唾液，或非呼吸道样本。

20.如权利要求19所述的非疾病诊断的检测方法，其特征在于，所述非呼吸道样本为快递表面、冷藏食品表面。

21.权利要求1-2任一项所述的试剂盒在制备检测新型冠状病毒抗原分型的产品中的应用。

22.如权利要求19-20任一项所述检测方法，其特征在于，所述新型冠状病毒抗原分型包括新型冠状病毒Delta与Omicron的分型检测。

23.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒抗原分型包括新型冠状病毒Delta与Omicron的分型检测。

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