CN114195890B

CN114195890B - 一种k27泛素链特异性抗体及其用途

Info

Publication number: CN114195890B
Application number: CN202111454256.6A
Authority: CN
Inventors: 赵博; 李贞�; 叶琳; 金博; 王亚楠
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-12-01
Also published as: CN114195890A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种K27泛素链特异性抗体及其用途，所述的抗体包括重链可变区，所述的重链可变区具有如下技术特征中的一个或多个：1‑1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR‑H1；1‑2)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR‑H2；1‑3)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR‑H3。本发明的K27泛素链特异性抗体可特异性识别和结合K27泛素链，与其他类型的泛素链均无交叉反应，可用于直接定性或定量检测K27泛素链、修饰蛋白底物的K27泛素链，也可富集包含K27泛素链修饰的底物蛋白，此外还可用于制备和/或筛选用于调控固有免疫的药物和/或DNA损伤应答的药物。

Description

一种K27泛素链特异性抗体及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种K27泛素链特异性抗体及其用途。

背景技术

蛋白质泛素化是一种重要的翻译后修饰(Hershko A,Ciechanover A.Theubiquitin system.Annu Rev Biochem,1998,67:425-479.)，主要参与体内蛋白质的降解，但还具有其他非降解的功能(Swatek K N,Komander D.Ubiquitin modifications.CellRes,2016,26(4):399-422.；Yau R,Rape M.The increasing complexity of theubiquitin code.Nat Cell Biol,2016,18(6):579-586.)。泛素(ubiquitin，Ub)是一种含有76个氨基酸残基的小分子量蛋白，其中有8个位点(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)可以与另外一个泛素分子的C末端连接，形成泛素链。泛素链的结构(包括连接位点和长度等)很大程度决定其在体内的生物学功能(Tracz M,Bialek W.Beyond K48 and K63:non-canonical protein ubiquitination.Cell Mol Biol Lett,2021,26(1):1)。

相比与其他连接泛素链，通过K48和K63连接形成的泛素链是体内丰度较高、研究较多的两种泛素链，其中K48泛素链主要介导蛋白质靶向蛋白酶体降解，K63泛素链则具有非降解的功能，包括信号转导、DNA损伤修复和固有免疫应答等。其余6种位点连接类型的泛素链在体内丰度较低，称为非经典泛素链。目前对这些非经典泛素链的生物学功能也有一些研究，如K27连接泛素链参与固有免疫、DNA损伤应答和线粒体自噬，另外也可能参与癌症的进程以及其他的生物学过程。

对于非经典泛素链的研究较少的主要原因是缺乏检测泛素链连接类型的特异性工具。目前，鉴定泛素链连接类型的方法和工具主要有3种：质谱、泛素突变体以及泛素连接特异性亲和工具(李贞,赵博.解密泛素链的亲和工具.生物化学与生物物理进展,2019,46(09):845-857.)。泛素连接特异性抗体是一种可以直接鉴定泛素链连接类型的有效工具，目前已开发K48、K63、K11、M1以及K11/K48泛素连接特异性抗体(Matsumoto M L,Dong K C,Yu C,et al.Engineering and structural characterization of a linearpolyubiquitin-specific antibody.J Mol Biol,2012,418(3-4):134-144.；Matsumoto ML,Wickliffe K E,Dong K C,et al.K11-linked polyubiquitination in cell cyclecontrol revealed by a K11 linkage-specific antibody.Mol Cell,2010,39(3):477-484.；Newton K,Matsumoto M L,Wertz I E,et al.Ubiquitin chain editing revealedby polyubiquitin linkage-specific antibodies.Cell,2008,134(4):668-678.；WangH,Matsuzawa A,Brown S A,et al.Analysis of nondegradative proteinubiquitylation with a monoclonal antibody specific for lysine-63-linkedpolyubiquitin.Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(51):20197-20202.；Yau R G,Doerner K,Castellanos E R,et al.Assembly and Function of HeterotypicUbiquitin Chains in Cell-Cycle and Protein Quality Control.Cell,2017,171(4):918-933.e920.)，促进泛素链信号的功能研究，特别是可以同时识别两种连接的双特异性抗体，可以鉴定更加复杂的异型泛素链，有助于复杂泛素网络的研究。

通过K27连接形成的泛素链在体内丰度小于10％(总的泛素修饰)，并且尚未发现K27泛素链特异性的E2(Ubiquitin conjugating enzymes，泛素结合酶)、E3(Ubiquitinligases，泛素连接酶)、UBD(Ubiquitin binding domains，泛素结合域)和DUB(Deubiquitinases，去泛素化酶)，因此难以通过酶催化合成K27泛素链。利用化学合成的抗原K27-diUb和抗原K27-3Ub(Xu P,Duong D M,Seyfried N T,et al.Quantitativeproteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains inproteasomal degradation.Cell,2009,137(1):133-145.)，结构解析发现K27连接包埋于分子内部，并且diUb呈现对称形式，具有较大的灵活性(Pan M,Gao S,Zheng Y,etal.Quasi-Racemic X-ray Structures of K27-Linked Ubiquitin Chains Prepared byTotal Chemical Synthesis.J Am Chem Soc,2016,138(23):7429-7435.；Pan M,Zheng Q,Ding S,et al.Chemical Protein Synthesis Enabled Mechanistic Studies on theMolecular Recognition of K27-linked Ubiquitin Chains.Angew Chem Int Ed Engl,2019,58(9):2627-2631.)，这些独特的结构特征暗示筛选K27泛素链特异性抗体可能具有一定的难度以及K27泛素链很可能具有独特的功能。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种K27泛素链特异性抗体及其用途。

由于目前还没有全人源的K27泛素链特异性抗体以及对K27泛素链的功能研究仍较少，因此本发明利用从全人源天然噬菌体展示的scFv抗体库中筛选获得可特异性结合抗原K27-3Ub的噬菌体克隆，对结合抗原K27-3Ub最明显克隆的抗体进行制备和鉴定。首先鉴定结合抗原K27-3Ub最明显克隆的抗体基因序列，然后将该抗体(scFv.zl1901)基因构建到原核表达载体pET-22b中，周质表达后通过Ni-NTA亲和层析纯化获得抗体蛋白scFv.zl1901。通过ELISA和Western blot分析抗体蛋白scFv.zl1901与K27泛素链的结合，并且通过Western blot分析抗体蛋白scFv.zl1901的泛素连接特异性。为进一步表征该抗体，将抗体scFv.zl1901转换成全长抗体IgG(IgG.zl1901)，真核表达并纯化后，通过Biacore检测全长抗体IgG.zl1901与抗原K27-3Ub的亲和力。

本发明目的之一在于提供，一种K27泛素链特异性抗体，所述的抗体包括重链可变区，所述的重链可变区具有如下技术特征中的一个或多个；

1-1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；

1-2)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；

1-3)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3。

根据本申请的技术方案，所述的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3。

根据本申请的技术方案，所述的重链可变区的氨基酸序列包括：

A1)如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；或

A2)与SEQ ID No.9所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有A1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。

根据本申请的技术方案，所述的抗体还包括轻链可变区，所述的轻链可变区具有如下技术特征中的一个或多个：

2-1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L3；

2-2)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；

2-3)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

根据本申请的技术方案，所述的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

根据本申请的技术方案，所述的轻链可变区的氨基酸序列包括：

B1)如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；或

B2)与SEQ ID No.10所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有B1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。

根据本申请的技术方案，所述抗体为全人源单克隆抗体。

根据本申请的技术方案，所述抗体还包括免疫球蛋白恒定区。

根据本申请的技术方案，所述抗体包括如SEQ ID No.14所示的重链。

根据本申请的技术方案，所述抗体包括如SEQ ID No.16所示的轻链。

根据本申请的技术方案，所述抗体还包括缀合物。

本发明目的之二在于提供，与如所述的抗体相关的生物材料，所述生物材料包括如下中的一种或多种：

a)编码如所述的抗体的核苷酸；

b)含有a)所述的核苷酸的重组表达载体；

c)含有a)所述的核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的生物工程菌。

根据本申请的技术方案，a)中，所述的核苷酸包括如SEQ ID NO.7和/或如SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列。

根据本申请的技术方案，a)中，所述的核苷酸序列包括如SEQ ID No.13所示和/或如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。

本发明目的之三在于提供，一种试剂盒或亲和试剂，包括如所述的抗体和/或如所述的生物材料。

根据本申请的技术方案，所述试剂盒为ELISA、Western blot、免疫荧光、免疫共沉淀、免疫组化、流式细胞术或活体免疫成像试剂盒。

本发明目的之四在于提供，如上文所述的抗体或如上文所述的生物材料或如上文所述的试剂盒或亲和试剂在如下至少一项中的用途：

检测K27泛素链；

检测被泛素化修饰的底物上连接的是否为K27泛素链；

富集包含K27泛素链修饰的蛋白底物；

制备和/或筛选用于调控固有免疫的药物；

制备和/或筛选用于DNA损伤应答的药物。

本发明目的之五在于提供，一种药物组合物，包括如上文所述的抗体和/或如上文所述的生物材料，以及药学上可接受的载体。

具体地，所述调控固有免疫的药物包括抗RNA病毒感染的药物，如单纯性疱疹病毒、流感病毒和脑心肌炎病毒。

具体地，所述DNA损伤应答的药物包括肿瘤药物。

如上所述，本发明的具有以下有益效果：

本发明的K27泛素链特异性抗体与其他类型的泛素链，如M1泛素链、K11泛素链、K29泛素链、K48泛素链和K63泛素链无交叉反应，但与抗原K27-3Ub的亲和力常数K_D为3.66nM，表明本发明的K27泛素链特异性抗体与K27泛素链具有较强的结合，因此，本申请的K27泛素链特异性抗体可用于直接检测和鉴定游离的K27泛素链、修饰蛋白底物的K27泛素链，也可富集包含K27泛素链修饰的底物蛋白，此外本申请的抗体还可用于制备和/或筛选用于调控固有免疫的药物和/或DNA损伤应答的药物。

附图说明

图1显示为本发明的实施例1中抗体scFv.zl1901的重链可变区和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列图。

图2显示为本发明的实施例2中重组表达载体pET-22b-scFv.zl1901-Flag-His₆的构建图；其中图2A显示为PCR扩增抗体scFv.zl1901后的琼脂糖凝胶电泳图，图2B显示为使用NcoI和KpnI酶切载体pET-22b-Flag-His6后的琼脂糖凝胶电泳图。

图3显示为本发明的实施例2中抗体scFv.zl1901经原核表达后的纯化和融合表达的鉴定图；其中图3A显示为抗体scFv.zl1901经原核表达和纯化后的上清液、流穿液、洗脱液的SDS-PAGE分析图；图3B显示为抗体scFv.zl1901与Flag标签融合表达的Western blot检测结果图。

图3中3A图中的附图标记为：

泳道1上清液；

泳道2上清液；

泳道3流穿液；

泳道4使用100mM咪唑洗脱获得的洗脱液；

泳道5使用150mM咪唑洗脱获得的洗脱液；

泳道6使用250mM咪唑洗脱获得的洗脱液；

泳道7使用500mM咪唑洗脱获得的洗脱液。

图4显示为本发明的实施例2中的抗体scFv.zl1901与抗原K27-3Ub、Ub和BSA的ELISA检测结果图。

图5显示为本发明的实施例2中的抗体scFv.zl1901、anti-Ub分别与MonoUb、抗原K27-3Ub的Western blot检测结果图；其中图5A显示为anti-Ub与MonoUb、抗原K27-3Ub的Western blot检测结果图，图5B显示为抗体scFv.zl1901与MonoUb、抗原K27-3Ub的Westernblot检测结果图。

图6显示本发明的实施例2中的抗体scFv.zl1901与MonoUb、M1-diUb、K11-diUb、K27-3Ub、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb的SDS-PAGE分析图。

图7显示本发明的实施例2中的抗体scFv.zl1901、anti-Ub分别与MonoUb、M1-diUb、K11-diUb、K27-3Ub、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb的Western blot检测结果图；其中图7A显示为抗体scFv.zl1901与MonoUb、M1-diUb、K11-diUb、K27-3Ub、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb的Western blot检测结果图，图7B显示为anti-Ub与MonoUb、M1-diUb、K11-diUb、K27-3Ub、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb的Western blot检测结果图。

图8显示本发明的实施例3中的全长抗体IgG.zl1901的还原和非还原SDS-PAGE图；其中图8A显示为全长抗体IgG.zl1901的还原SDS-PAGE图，图8B显示为全长抗体IgG.zl1901的非还原SDS-PAGE图。

图9显示为本发明的实施例3中的SPR检测全长抗体IgG.zl1901与抗原K27-3Ub的亲和力曲线图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

泛素分子本身有8个氨基酸位点可以参与泛素链形成，包含7个赖氨酸位点(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)以及N末端的甲硫氨酸位点(M1)，泛素分子之间可以通过这些位点彼此交联，形成多种不同类型的泛素链。不同链接类型的泛素链会赋予其所链接的底物蛋白以不同的命运，被称为泛素密码。底物蛋白上只连接一个泛素分子的泛素化修饰方式称为单泛素化修饰(Monoubiquitin，简称MonoUb)；泛素分子之间使用同一位点的赖氨酸或甲硫氨酸进行链接形成泛素链，称为同型链，包括K6泛素链、K11泛素链、K27泛素链、K29泛素链、K33泛素链、K48泛素链、K63泛素链以及M1泛素链。M1-diUb是由两个泛素通过肽键首尾相连产生，又称为M1连接二泛素，其他如K11-diUb、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb与M1连接二泛素机理相同。

本发明主要目的是对通过噬菌体展示技术筛选获得的可与抗原K27-3Ub(一种K27泛素链)特异性结合的噬菌体克隆，经过序列鉴定后进行制备和鉴定。将阳性抗体(scFv.zl1901)基因构建到原核表达载体pET-22b，周质表达后使用Ni-NTA亲和层析纯化后获得抗体蛋白scFv.zl1901，随后通过ELISA以及Western blot检测其与抗原K27-3Ub的结合和泛素连接特异性。为了更好地检测抗体scFv.zl1901的亲和力，将其转换成全长IgG形式，真核表达后，使用Biacore检测与抗原K27-3Ub的亲和力常数。结果显示，scFv.zl1901成功通过周质表达制备，可以特异性结合抗原K27-3Ub，与通过其他连接的泛素二聚体(M1、K11、K29、K48和K63-linked diUb)几乎没有结合，并且与抗原K27-3Ub的亲和力常数K_D为3.66nM。这些结果表明，筛选得到的scFv.zl1901抗体可以特异性结合K27泛素链，并且结合力较强。为K27泛素链提供一个有效的鉴定检测工具，进一步有利于促进复杂的泛素信号的研究。

本发明的第一方面，提供一种K27泛素链特异性抗体，所述的抗体包括重链可变区，所述的重链可变区具有如下技术特征中的一个或多个；

1-1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；

1-2)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；

1-3)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3。

在本发明某些实施方式中，所述的抗体还包括轻链可变区，所述的轻链可变区具有如下技术特征中的一个或多个：

2-1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L3；

2-2)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；

2-3)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

本发明的所述的抗体能特异性识别和结合抗原蛋白K27-3Ub。

本发明中的“抗体”包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体多特异性抗体(如，双特异性抗体)或抗体片段。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一可变区和第一、第二、第三恒定区组成；每条轻链由一可变区和一恒定区组成。

本发明中的CDR(互补决定区，complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区中，单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区通常均具有3个超变区(hypervariable region，HVR)，这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补，所以超变区也被称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，即重链可变区通常包括三个互补决定区，即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区通常包括三个互补决定区，即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。

在本发明某些实施方式中，所述的重链可变区的互补决定区(CDR)包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3。

在本发明某些实施方式中，所述的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

在本发明某些实施方式中，所述的抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3，所述的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

在本发明某些实施方式中，重链可变区和轻链可变区中还可以包括框架区，所述框架区可以位于互补决定区之间，也可以位于互补决定区的两端。在本发明某些具体实施方式中，所述框架区的序列为人源单抗可变区，或为鼠源单抗可变区的框架区序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的框架区序列，该框架区序列与人源单抗可变区序列的框架区序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

在本发明某些实施方式中，所述的抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，所述的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。

本发明的K27泛素链特异性抗体为抗原结合片段和/或单克隆抗体。

本申请中的“抗原结合片段”一词，指由含有一个或多个CDR的抗体部分或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的例子包括，但不限于，如单链抗体分子(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2等。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以含有来自某特定人抗体的一个或多个CDR，移接至来自一个或多个不同人抗体的框架区。抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。抗体的“Fab'”片段是指一对Fab片段，它们通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在羧基末端附近共价连接。“F(ab')2”指的是Fab的二聚体。“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。

本申请中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的各种抗体是相同的，除了通常以极少量存在的可能的天然存在的突变体。单克隆抗体具有高度特异性，即针对抗原上的单个表位。此外，不同于包含针对不同决定区(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定区。除了它们的特异性外，单克隆抗体的一个优点是，它们现在可以在合成时不受其他抗体的污染。修饰词“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的性质，不应解释为需要任何特定的方法来产生抗体。

本申请中使用的术语“全人源”当用于抗体或抗原结合片段时，是指所述抗体或抗原结合片段具有某氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于由人或人免疫细胞生产的、或从例如利用人源抗体库的转基因非人动物等非人来源衍生的抗体的氨基酸序列，或者其他编码人源抗体的序列。在某些实施方式中，全人源抗体不包含来源于非人抗体的氨基酸残基(特别是抗原结合残基)。

在本发明某些实施方式中，所述抗体还包括恒定区，所述的恒定区可以为天然序列恒定区(例如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。例如本申请中的恒定区为IgG，具体为IgG1。全长重链的核苷酸序列包括SEQ ID No.13所示序列，全长重链的氨基酸序列包括SEQ ID No.14所示序列；全长轻链的核苷酸序列包括SEQ ID No.15所示序列，全长轻链的氨基酸序列包括SEQ ID No.16所示序列。

本发明的另一方面提供，与上文所述的抗体相关的生物材料，所述的生物材料包括如下中的一种或多种：

a)编码如所述的抗体的核苷酸；

b)含有a)所述的核苷酸的重组表达载体；

本发明的“重组表达载体”是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。

本发明中“宿主生物工程菌”是指导入外源核苷酸和/或载体的细菌或细胞。

本发明的另一方面，还提供所述的抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养所述的抗体的生物工程菌，从而表达出所述抗体，纯化分离出所述的抗体。

本发明目的另一方面，还提供一种试剂盒或亲和试剂，包括如所述的抗体和/或如所述的生物材料。

所述的试剂盒还可以包括抗体的标记物，可选用的标记物的种类包括但不限于荧光标记物、放射性标记物、酶标标记物、化学发光性标记物等中的一种或多种的组合。根据试剂盒的检测原理，所述试剂盒通常还可包含检测所需的一种或多种试剂。此外，所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。

在本发明某些实施方式中，所述的试剂盒为ELISA、Western blot、免疫荧光、免疫共沉淀、免疫组化、流式细胞术或活体免疫成像试剂盒。

在本发明某些实施方式中，所述的亲和试剂可富集包含K27泛素链修饰的蛋白底物。

本发明目的另一方面，还提供如上文所述的抗体或如上文所述的生物材料或如上文所述的试剂盒或亲或试剂在如下至少一项中的用途：

检测K27泛素链；

检测被泛素化修饰的底物上连接的是否为K27泛素链；

富集包含K27泛素链修饰的蛋白底物；

制备和/或筛选用于调控固有免疫的药物；

制备和/或筛选用于DNA损伤应答的药物。

本发明的检测包括定量或定性检测。

本发明中检测K27泛素链，方法为：使生物样品与上文所述的抗体接触，并检测生物样品和上文所述的抗体之间是否结合。生物样品包括例如细胞或组织(例如，活检材料，包括癌性或潜在癌性结肠、结直肠、小肠、子宫内膜、胰腺、乳腺、肺、前列腺或卵巢组织)。

在本发明某些实施方式中，检测被泛素化修饰的底物上连接的是否为K27泛素链，是指对被泛素化修饰的底物中的泛素链连接类型，如K27。

在本发明某些实施方式中，所述的调控固有免疫的药物包括抗RNA病毒感染的药物，如单纯性疱疹病毒、流感病毒和脑心肌炎病毒。

在本发明某些实施方式中，所述的DNA损伤应答的药物包括肿瘤药物。DNA损伤是指在DNA复制过程中发生的核苷酸序列永久性的改变，从而导致了遗传特征的改变，常见的损失类型包括碱基突变、DNA链交联、DNA链断裂、插入或缺失、DNA重组。识别并修复DNA的损伤这项工作由DNA损伤应答机制完成。本申请的肿瘤的实例包括但不限于癌、淋巴瘤(例如，霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。

本发明目的另一方面，还提供一种药物组合物，包括如上文所述的抗体和/或如上文所述的生物材料，以及药学上可接受的载体。

本申请的下述实施例中：

E.coli XL1-Blue和E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买于Invitrogen公司；HEK293F细胞购买于ATCC；原核表达载体pET-22b-Flag-His6原来购买于Invitrogen公司；真核表达载体pCMV3购买于北京义翘神州科技股份有限公司。

构建原核表达载体特异性引物的合成、全长抗体IgG.zl1901的重链和轻链的基因以及测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

2×Taq PCR mix购自Toyobo公司；限制性内切酶NcoI、KpnI和BamHⅠ以及T4 DNAligase购于Thermo Scientific公司。

质粒小规模提取以及DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；ELISA检测试剂盒购自江苏凯基生物科技有限公司。

Ni-NTA柱料购自Bio-Lab公司；Protein A亲和填料购自GE公司；预包被链霉亲和素的96孔板购自Thermo Scientific公司。

anti-HA和anti-ubiquitin兔单抗购自Abcam公司；anti-Flag鼠单抗购自Sigma公司；二抗peroxidase goat anti-mouse IgG(H+L)和Alexa.Fluor790-goat anti-rabbitIgG(H+L)购于Jackscon ImmunoReaserch；ECL发光液购自Thermo Scientific公司。

化学合成抗原K27-3Ub以及biotin-Ub由清华大学刘磊课题组提供；重组蛋白M1-diUb、K11-diUb、K29-diUb、K48-diUb、K63-diUb均购于Boston Biochem公司。

M293T1-培养基、SMS-293-SUPI加料液(293细胞)以及TF1转染试购买于北京义翘神州科技股份有限公司；Western一抗二抗去除液(弱碱性)(货号：P0025B)购买于上海碧云天生物技术有限公司。

培养基：

LB(5g/L yeast extract，10g/L Tryptone，10g/LNaCl)

2YT(10g/L yeast extract，16g/L Tryptone，5g/LNaCl)

缓冲液：

1、Lysis buffer(50mM Tris Base，500mM NaCl，5mM Imidazole，pH 7.5)。

2、Wash buffer(50mM Tris Base，500mM NaCl，20mM Imidazole，pH 7.5)。

3、Elution buffer(50mM Tris Base，500mM NaCl，250mM Imidazole，pH 7.5)。

4、透析缓冲液(25mM Tris Base，150mM NaCl，5mM DTT，pH 7.5)。

5、TBS(20mM Tris Base，150mM NaCl，pH 7.5)。

实施例1K27泛素链特异性抗体基因序列鉴定

本申请的K27泛素链特异性抗体是从全人源单链抗体库中采用生物淘选法获得，对淘选得到的抗体进行测序和鉴定，包括如下：

以现有技术中经化学合成的K27连接泛素链蛋白(标记为抗原K27-3Ub)为靶抗原，采用生物淘选法对噬菌体展示全人源单链抗体(scFv)库进行淘选，经过4轮“结合、洗涤、洗脱、扩增”程序，通过逐渐减低每轮筛选使用的抗原浓度提高筛选的严格性。并通过间接ELISA方法进一步筛选阳性克隆，获得特异性结合抗原K27-3Ub的噬菌体克隆，得到与抗原K27-3Ub结合最明显的噬菌体克隆，并标记为zl1901。

将标记为zl1901的噬菌体克隆感染XL1-Blue细胞后，涂布于含有amp/0.2％glucose的LB平板，在37℃培养过夜，次日挑取2～3个新鲜克隆至LB/amp培养基中，37℃振荡培养过夜。

然后使用质粒小规模提取试剂盒提取含有scFv.zl1901抗体的质粒(具体操作可见试剂盒说明书)，送至苏州金唯智公司测序。获得序列后，通过序列分析软件DNAStar并结合NCBI的IgBLAST工具分析和鉴定该scFv抗体序列的重链和轻链可变区。

与抗原K27-3Ub结合最明显的抗体标记为scFv.zl1901，scFv.zl1901抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列如图1所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，其中，重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，其中，轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L3、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

实施例2抗体scFv.zl1901的原核表达、结合和特异性分析

本实施例中，进行原核表达抗体scFv.zl1901并制备得到抗体蛋白scFv.zl1901，并对抗体蛋白scFv.zl1901的结合和特异性进行分析，包括如下：

2.1原核表达载体pET-22b-scFv.zl1901-Flag-His6的构建

以实施例1得到的含有scFv.zl1901抗体序列的质粒为模板，通过PCR扩增获得抗体scFv.zl1901的基因片段。PCR扩增程序为：94℃预热2min，94℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环，68℃延伸10min。PCR扩增的特异性引物，如下：

zl1901-F:ATTACATGCCATGGATGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG(SEQ ID NO:11)

zl1901-R:ATCCACGGGGTACCTTTAATCTCCAGTCGTGTC(SEQ ID NO:12)

其中，下划线表示酶切位点，CATGG代表NcoI酶的酶切位点，GGTACC代表KpnI酶的酶切位点。

将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。

采用Thermo Scientific公司的酶切试剂盒，利用限制性内切酶NcoI和KpnI分别酶切抗体scFv.zl1901的基因片段和载体pET-22b-Flag-His6，通过OMEGA公司的DNA凝胶试剂盒纯化回收。

图2显示为本实施例2中pET-22b-scFv.zl1901-Flag-His6的构建图；其中图2A显示为PCR扩增scFv.zl1901后的琼脂糖凝胶电泳图，图2B显示为使用NcoI和KpnI酶切载体pET-22b-Flag-His6的琼脂糖凝胶电泳图。

从图2A可知，PCR扩增产物大小约为750bp，符合单链抗体(scFv)基因大小，表明已经成功扩增出抗体scFv.zl1901的基因片段。

从图2B可知，经双酶切后载体pET-22b-Flag-His6的大小约为4kb，与未经酶切的载体pET-22b-Flag-His6大小一致，表明已经成功酶切载体。

经酶切后的抗体scFv.zl1901基因片段和酶切后的载体pET-22b-Flag-His6通过T4 DNA连接酶连接，得到酶连接产物。

将酶连接产物通过电转化至E.coli XL1-Blue感受态细胞。电转化步骤如下：将无菌干净的1mm电击杯置于冰上预冷，XL1-Blue感受态细胞置于冰上解冻，酶连接产物冰上预冷。然后将预冷的1μL酶连接产物与40μL已经融化的XL1-Blue感受态细胞轻轻混匀，置于冰上1～2min，转移至电击杯中(防止出现气泡)。使用吸水纸擦干电击杯表面的水，电击杯放置在电转仪的反应槽中，启动电击程序，程序为：电压脉冲为25μF，电压为1.8kV，电阻为200Ω，时间约为4.0～5.0ms。然后取出电击杯，迅速加入1mL SOC复苏液，转移至15mL EP管，230rpm，37℃，复苏1h，得到复苏菌液。

将复苏菌液涂布于LB/kan(kan：50μg/mL)平板，37℃培养过夜，挑取3-5个新鲜的单克隆，培养并提取质粒。将质粒送至苏州金唯智测序公司测序验证，经测序正确后得到重组表达载体pET-22b-scFv.zl1901-Flag-His6。

2.2抗体scFv.zl1901的原核表达及纯化

2.2.1抗体cFv.zl1901的原核表达

将步骤2.1成功构建的重组表达载体pET-22b-scFv.zl1901-Flag-His6通过化学转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞。将1μL重组表达载体pET-22b-scFv.zl1901-Flag-His6(约50ng)与40μL BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀，冰上静置30min，42℃热激90s，冰上静置2min，加入1mLSOC复苏液，于230rpm和37℃复苏1h，涂布LB/amp平板，37℃过夜培养。挑取单克隆培养至对数期后，转移至1L的2YT/amp(amp：100μg/mL)培养基，于37℃和240rpm，培养至OD₆₀₀为0.5～0.6，加入0.1～1mM IPTG，20℃，240rpm，诱导过夜，得到细胞培养物。

2.2.2蛋白纯化

将步骤2.2.1得到的细胞培养物于4℃和7000g离心10min，收集细胞沉淀。加入10mL洗涤缓冲液TBS(pH 8.0)洗涤细胞沉淀，接着于4℃和7000g离心10min，以去除洗涤缓冲液。然后用5％体积的预冷高渗缓冲液(20％蔗糖溶液)重悬，冰浴30min后于4℃和7000g离心10min，收集细胞。使用5％体积的预冷低渗缓冲液(5mM MgCl₂溶液)重悬细胞。冰浴30min，使周质表达的蛋白释放至缓冲液中，然后于4℃和30000g离心40min，收集上清液。

上清液加入1mL Ni-NTA bead，4℃充分结合2h。装柱后静置30min，加入10mLLysis buffer平衡柱子，然后加入15mL Wash buffer洗涤3～5次，使用1mL不同浓度梯度(100mM、150mM、250mM和50mM)的咪唑进行洗脱，得到洗脱液。将洗脱液放入透析袋中，4℃透析过夜，即得到纯化的抗体蛋白scFv.zl1901。

分别取20～40μL上清液、20～40μL流穿液、20～40μL洗脱液加入5×SDS上样缓冲液，95℃煮沸5min，SDS-PAGE分离，经过考马斯亮蓝染色后脱色，分析上清液、流穿液和洗脱液中蛋白的表达和纯度。通过BCA法测定蛋白的浓度，并将蛋白小量分装保存。

图3显示为本实施例2中抗体scFv.zl1901经原核表达后的纯化和融合表达的鉴定图；其中图3A显示为抗体scFv.zl1901经原核表达和纯化后的上清液、流穿液、洗脱液的SDS-PAGE分析图；图3B显示为抗体scFv.zl1901与Flag标签融合表达的Western blot检测结果图。图3A中，泳道1和2为上清液；泳道3为流穿液；泳道4～7分别为使用100、150、250、500mM咪唑洗脱获得的洗脱液。

从图3A和图3B可知，表明抗体scFv.zl1901能通过周质表达获得，使用500mM咪唑洗脱获得的抗体蛋白scFv.zl1901的纯度较高，纯度可达90％以上，并且成功融合表达Flag标签。

2.3结合和特异性分析

(1)ELISA检测抗体蛋白scFv.zl1901与抗原K27-3Ub的结合

采用ELISA实验，测定步骤2.2.2得到的抗体蛋白scFv.zl1901与抗原K27-3Ub的结合。

在预包被链霉亲和素的96孔板中包被5～10μg/mLbiotin-K27-3Ub，对照组分别包被biotin-Ub和3％BSA-TBS，37℃孵育2h。弃除包被液，使用200μL/孔的TBS洗涤3次，每次间隔3min。加入200μL/孔的3％BSA-TBS封闭液，37℃封闭1h。

随后，均加入10μg/mL抗体蛋白scFv.zl1901溶液，37℃温育1h。弃除抗体蛋白scFv.zl1901溶液，加入TBS-T洗涤3次，每次间隔2～3min。使用1％BSA-TBS-T稀释液稀释anti-Flag抗体(1:1000)，100μL/孔，37℃温育1h。弃除anti-Flag抗体溶液，加入200μL/孔的TBS-T洗涤3次，每次间隔2～3min。

使用1％BSA-TBS-T稀释二抗HRP-conjugated goat anti-mouse IgG(1:5000)，然后按照100μL/孔的量加入二抗溶液，37℃温育1h。弃除抗体溶液，加入200μL/孔的TBS-T洗涤3次，每次间隔2～3min。每孔加入100μL TMB显色液，室温反应20～30min。加入终止液，酶标仪测定OD₄₅₀。

图4为本实施例中的抗体scFv.zl1901与抗原K27-3Ub、Ub和BSA的ELISA检测图。

从图4可知，抗体scFv.zl1901能特异性结合抗原K27-3Ub，但与Ub几乎不结合。

(2)Western blot检测抗体蛋白scFv.zl1901与抗原K27-3Ub的结合

由于scFv.zl1901的C末端融合Flag标签，所以使用抗体蛋白scFv.zl1901为一抗，HRP-anti-Flag作为二抗，检测抗体蛋白scFv.zl1901与抗原K27-3Ub的结合活性。

2×系列稀释K27-3Ub抗原，SDS-PAGE分离后，使用终浓度为1～10μg/mL的抗体蛋白scFv.zl1901为一抗，4℃孵育过夜。使用1μg/mL的HRP-anti-Flag作为二抗，室温孵育1h。然后加入ECL发光液，覆盖NC膜，曝光分析目的条带。加入5mL TNE-T漂洗NC膜，后加入5～10mL抗体剥离液(碧云天的Western一抗二抗去除液，货号：P0025B)，低速摇床剥离30min，TNE-T清洗3～5次，每次间隔5min。5％脱脂牛奶封闭1h，使用anti-ubiquitin(标记为anti-Ub)兔单抗为一抗，荧光anti-rabbit-IgG为二抗进行Western blot分析。

图5为本实施例2中的抗体scFv.zl1901、anti-Ub分别与MonoUb、抗原K27-3Ub的Western blot检测结果图；其中图5A显示为anti-Ub与MonoUb、抗原K27-3Ub的Westernblot检测结果图，图5B显示为抗体scFv.zl1901与MonoUb、抗原K27-3Ub的Western blot检测结果图。图5中A图和B图中，抗原K27-3Ub从左到右每个泳道的总质量分别为1μg、0.5μg、0.25μg、0.125μg和0.0625μg，MonoUb从左到右每个泳道的总质量分别为5μg和1μg。

从图5可知，抗体scFv.zl1901与纳克级别(如0.0625μg)的抗原K27-3Ub仍有显著的结合，与高浓度的MonoUb(5μg/10μL)几乎不结合，进一步证明抗体scFv.zl1901可以特异性结合抗原K27-3Ub。

(3)Western blot检测抗体蛋白scFv.zl1901的泛素连接特异性

Mono-Ub、M1-diUb、K11-diUb、K27-3Ub、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb各取1μg，加入5×SDS上样缓冲液，35～40℃加热20min，SDS-PAGE分离后，分别使用抗体scFv.zl1901和抗体anti-Ub进行Western blot检测，后续实验步骤与步骤2.3中的(2)Western blot检测抗体scFv.zl1901与抗原K27-3Ub相同。

图6为本实施例2中的抗体scFv.zl1901与MonoUb、M1-diUb、K11-diUb、K27-3Ub、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb的SDS-PAGE分析图。

图7为本实施例2中的抗体scFv.zl1901、anti-Ub分别与MonoUb、M1-diUb、K11-diUb、K27-3Ub、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb的Western blot检测结果图；其中图A显示为抗体scFv.zl1901与MonoUb、M1-diUb、K11-diUb、K27-3Ub、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb的Western blot检测结果图，图B显示为anti-Ub与MonoUb、M1-diUb、K11-diUb、K27-3Ub、K29-diUb、K48-diUb和K63-diUb的Western blot检测结果图。

从图6、7A和7B可知，抗体scFv.zl1901可以特异性结合抗原K27-3Ub，与通过M1、K11、K29、K48和K63连接diUb几乎不结合，表明抗体scFv.zl1901仅识别K27-3Ub中的K27连接，而并非其他类型的泛素连接。

实施例3真核表达制备抗体蛋白IgG.zl1901及亲和力测定

本实施例中，采用真核表达制备得到抗体蛋白IgG.zl1901，并进行抗体蛋白IgG.zl1901的亲和力检测，包括如下：

3.1抗体IgG.zl1901的真核表达

委托苏州金维智生物科技有限公司合成scFv.zl1901中的重链可变区和轻链可变区，然后分别与人的IgG1重链和轻链的恒定区拼接后得到的全长重链和全长轻链，全长重链的核苷酸序列包括SEQ ID No.13所示序列，全长重链的氨基酸序列包括SEQ ID No.14所示序列；全长轻链的核苷酸序列包括SEQ ID No.15所示序列，全长轻链的氨基酸序列包括SEQ ID No.16所示序列，并在全长重链和全长轻链的N端，添加可以使抗体分泌表达的信号肽序列，分别为：

全长重链信号肽基因序列和氨基酸序列分别为：

ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAG T(SEQ IDNo.17)；

MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID No.18)

全长轻链信号肽基因序列和氨基酸序列分别为：

ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATAG T(SEQ IDNo.19)；

MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID No.20)

然后全长重链和全长轻链都使用KpnI和BamHⅠ这两种限制性内切酶消化，并使用这两种酶消化真核表达载体pCMV3，通过酶连接的方法将全长重链和全长轻链分别构建到载体pCMV3(具体方法参照说明书)。最后将构建的质粒送至苏州金唯智生物科技有限公司测序鉴定，最后得到测序正确的重链表达质粒和轻链表达质粒。

使用HEK293无血清CD培养基传代，培养HEK293F细胞至密度为70～80％，然后将重链表达质粒和轻链表达质粒按照摩尔比1:1(各为0.5～1μg)与转染试剂TF1混合后加入HEK293F悬浮细胞细胞中，共同瞬时转染细胞，在37℃，180rpm的摇床中培养。在转染后第一、三、五天分别添加HEK293无血清加料液。

培养一周后离心收集细胞上清液(4℃，4000rpm，20min)，使用0.45μm滤膜滤去不溶物后，使用Protein A亲和层析纯化抗体蛋白(具体步骤参照填料说明书)，得到抗体蛋白IgG.zl1901。

然后使用BCA蛋白质定量试剂盒测定纯化后的抗体蛋白IgG.zl1901的浓度，大约为1μg/mL。

将收获的抗体蛋白IgG.zl1901分装冻存于-80℃。使用还原和非还原的SDS-PAGE分析抗体蛋白IgG.zl1901的表达和纯化情况。

图8为本实施例3中的全长抗体蛋白IgG.zl1901的还原和非还原SDS-PAGE图；其中图A显示为全长抗体蛋白IgG.zl1901的还原SDS-PAGE图，图B显示为全长抗体蛋白IgG.zl1901的非还原SDS-PAGE图。

从图8A可知，在还原条件下，得到的重链条带(H chain)的大小为48.34kDa，得到的轻链条带(L chain)的大小为26.69kDa，分别与抗体全长重链和全长轻链的分子量相符合。

从图8B可知，抗体蛋白IgG.zl1901显示分子量大小约为194kDa(比理论分子量稍偏高)，表明全长抗体蛋白IgG.zl1901在HEK293F细胞成功表达，并且纯度达到95％以上。

3.2SPR检测抗体蛋白IgG.zl1901的亲和力

采用捕获法，使用BIACORE ProteinA芯片检测抗体蛋白IgG.zl1901与抗原K27-3Ub之间的相互作用，结合的动力学常数K_a、解离速率常数K_d和亲和力常数K_D。其中，抗体蛋白IgG.zl1901的分子量约为146.2kDa；抗原K27-3Ub的分子量约为25.8kDa；仪器为Biacore8K分子相互作用仪。

使用1000×HBS-EP缓冲液稀释抗体蛋白IgG.zl1901至终浓度为1μg/mL；使用2×HBS-EP缓冲液稀释抗原K27-3Ub至终浓度分别为：104.5nM、52.25nM、26.13nM、13.27nM、6.53nM、3.26nM、1.63nM、0.816nM、0.408nM。

实验程序设置为：抗体捕获60s，流速10μL/min；分析物进样120s，流速30μL/min；解离120s。

使用10mM Glycine溶液(pH 1.5)作为再生试剂，再生时间30s，流速30μL/min。原始数据用Biacore Insight Evaluation软件进行拟合分析，采用多循环动力学拟合方式，拟合模型(Fit model)设置为1:1，选取1.6nM(1.63)、3.3nM(3.26)、6.5nM(6.53)、13nM(13.27)、26nM(26.13)、52nM(52.25)的浓度点，拟合得到Ka(结合常数)、Kd(解离速率常数)和K_D(亲和力常数)。

图9为本实施例中的抗体蛋白IgG.zl1901与抗原K27-3Ub的亲和力曲线图和动力学参数。

从图9可知，抗体蛋白IgG.zl1901与抗原K27-3Ub结合的结合常数K_a为6.39×10^-5(Ms)^-1，解离常数K_d为2.34×10^-3s^-1，亲和力常数K_D为3.66nM，表明抗体蛋白IgG.zl1901与抗原K27-3Ub具有较强的结合。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种K27泛素链特异性抗体及其用途

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Leu Arg Ala Glu Leu Leu His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Gln Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggcctc 300

agggcggagc tactgcacta ctactacggc atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 8

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatattgtgc tgacgcagac tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccagtacac ttttggccag 300

gggacacgac tggagattaa a 321

<210> 9

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Arg Ala Glu Leu Leu His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Gln Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attacatgcc atggatgagg tgcagctggt ggagtctg 38

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atccacgggg tacctttaat ctccagtcgt gtc 33

<210> 13

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggcctc 300

agggcggagc tactgcacta ctactacggc atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 780

tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc 840

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 900

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 960

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1020

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1080

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1140

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1200

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1260

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 1365

<210> 14

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Arg Ala Glu Leu Leu His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 15

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gatattgtgc tgacgcagac tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccagtacac ttttggccag 300

gggacacgac tggagattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210> 16

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Gln Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 17

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagt 57

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Leu Ser

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagt 57

<210> 20

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

Claims

1.一种K27泛素链特异性抗体，所述的抗体包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述的重链可变区的CDR为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQID No.3所示的CDR-H3；所述的轻链可变区的CDR为氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的重链可变区的氨基酸序列包括：

A1)如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；或

A2)与SEQ ID No.9所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有

A1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的轻链可变区的氨基酸序列包括：

B1)如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；或

B2)与SEQ ID No.10所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有

B1)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体包括如下技术特征中的一项或多项：

所述的抗体还包括恒定区；

所述的抗体包括如SEQ ID No.14所示的重链；

所述的抗体包括如SEQ ID No.16所示的轻链；

所述的抗体为全人源单克隆抗体；

所述的抗体还包括缀合物。

5.与如权利要求1-4任一项所述的抗体相关的生物材料，其特征在于，所述的生物材料为如下中的一种或多种：

a)编码如权利要求1-4任一项所述的抗体的多核苷酸；

b)含有a)所述的多核苷酸的重组表达载体；

c)含有a)所述的多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的生物工程菌。

6.一种试剂盒或亲和试剂，其特征在于，包括如权利要求1-4任一项所述的抗体和/或如权利要求5所述的生物材料。

7.如权利要求1-4任一项所述的抗体或如权利要求5所述的生物材料或如权利要求6所述的试剂盒或亲和试剂在制备如下至少一项试剂中的用途：

检测K27泛素链；

检测被泛素化修饰的底物上连接的是否为K27泛素链；

富集包含K27泛素链修饰的蛋白底物。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-4任一项所述的抗体和/或如权利要求5所述的生物材料，以及药学上可接受的载体。