CN112010982A - 一种抗gpc3/cd3双特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种抗GPC3/CD3双特异性抗体及其应用，属于抗体药物领域，本发明的抗体具有GPC3和CD3抗原结合域，在VH和VL、CH1和CL之间均引入工程二硫键后发生突变，所得双抗在表达上基本不存在错配，单体量得到很大提高，热稳定性显著增强，并且双抗在血液中的半衰期延长，提高了双抗对肿瘤细胞的杀伤力。

Description

一种抗GPC3/CD3双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体药物领域，具体涉及一种抗GPC3/CD3双特异性抗体及其应用。
背景技术
双特异性抗体(BsAb)，可同时识别和结合两种不同的抗原或抗原表位，阻断两种不同的信号通路或介导效应细胞杀伤靶细胞以发挥其生物功能。根据不同结构可将双特异性抗体结构主要有两大类：基于人IgG-Fc片段设计的双特异性抗体(IgG-like双特异性抗体)与不含Fc片段的双特异性抗体(non-IgG-like双特异性抗体)。四价双特异性抗体是理论上一个抗体分子有四个抗原结合功能区，比如含四个Fab或同时含两个Fab两个ScFv结构域。
双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。重新定向T细胞杀伤癌细胞的策略已被证明能够有效的治疗或辅助治疗癌症，如已经被FDA批准上市的CD19/CD3的双功能抗体Blinatumomab，用于治疗复发或难治性前体B细胞急性淋巴细胞白血病等。目前已有数十个靶向T细胞表面CD3分子来富集T细胞杀伤肿瘤细胞(实体瘤、血液瘤)的双功能抗体正在将进行临床实验。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)分子是一种特异性表达于肝细胞肝癌、头颈部鳞状细胞癌、食管鳞状细胞、癌肺鳞状细胞癌等癌细胞表达的膜蛋白，目前已有几个抗GPC3单克隆抗体，如hGC33(Chugai制药，专利号CN101186650A)和YP7(美国国立卫生研究院国家癌症研究所，专利号CN104520331)，被报道能诱发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)抑制肝癌裸鼠移植的生长。
将靶向GPC3的单克隆抗体与靶向T细胞表面CD3构建双功能抗体是治疗GPC3阳性肿瘤的重要方向。目前双功能抗体形式多样，但仍存在错配，表达量或回收率低，稳定性差，以及血液半衰期短等问题。比如CN107556387A提供了一种链式抗-GPC3/CD3双特异性抗体，虽然能特异地识别并结合GPC3抗原和GPC3过表达的肿瘤细胞，介导T细胞发挥杀伤作用，但是该结构同blinatumomab抗体BITE结构类似，已被证明只有几个小时很短的血液半衰期。Chugai制药提供了一种IgG型的抗-GPC3/CD3二价双特性抗体(US20140112914A1)，具有较强的细胞杀伤作用，但此结构含有的两个结合抗原的Fab域是具有共同轻链(VL-CL)，一般情况下共同轻链的双特异性抗体前期筛选过程复杂，很难一次性获得高亲和力抗体。因此，急需开发出错配率低、稳定性高的双抗来治疗GPC3阳性肿瘤。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种抗GPC3/CD3双特异性抗体，本发明的目的之二在于提供一种药物组合物；本发明的目的之三在于提供一种药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种抗GPC3/CD3双特异性抗体，所述双特异性抗体是由两条相同的多肽链以共价键结合形成的四价同源二聚体，每条多肽链包含人免疫球蛋白抗体IgG1的Fc片段、结合GPC3抗原的Fab片段和结合CD3抗原的单链片段scFv，其中，Fc片段的分子结构形式为CH2-CH3，Fab片段的分子结构形式为VH-CH1和VL-CL，Fab片段和Fc片段通过CH1与CH2之间的铰链区连接；单链片段scFv通过Linker1与CL的N端连接，所述VH和VL、CH1和CL之间均引入工程二硫键后发生突变。
作为优选技术方案之一，所述VH和VL上的突变位点为VH44和VL100。
作为优选技术方案之一，所述CH1和CL上的突变位点为CH1126和CL121、CH1126和CL124、CH1127和CL121、CH1141和CL116、CH1168和CL164、CH1170和CL164或CH1173和CL160中一对或多对。
作为优选技术方案之一，所述VH-CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述VL-CL氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为优选技术方案之一，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
作为优选技术方案之一，所述CH2-CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为优选技术方案之一，所述单链片段scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
作为优选技术方案之一，所述Linker1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
2、一种药物组合物，所述组合物包含上述的双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
3、一种抗GPC3/CD3双特异性抗体或上述药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗肿瘤。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的抗GPC3/CD3双特异性抗体，在VH和VL、CH1和CL之间均引入工程二硫键后发生突变，所得双抗在表达上基本不存在错配，单体量得到很大提高，且表达量保持原有的水平，仅纯化一次获得的目的蛋白纯度就能达到96％以上。
(2)本发明提供的抗GPC3/CD3双特异性抗体，与普通双特性抗体相比，其热稳定性显著提高，与亲本的单克隆抗体接近。
(3)本发明提供的抗GPC3/CD3双特异性抗体保留了Fc域，故半衰期较长，双特异性抗体的Fc与FcRn的亲和力比亲本单克隆抗体的Fc与新生儿受体(FcRn)的亲和力增加一个数量级。
(4)本发明提供的抗GPC3/CD3双特异性抗体与靶细胞具有较强亲和力，对GPC3阳性细胞株SK-GPC3、HepG2、Huh-7及CD3阳性细胞株(人PBMCs)具有较强的结合，但与GPC3阴性细胞株SK-Hep-1无结合。
(5)本发明提供的抗GPC3/CD3双特异性抗体对GPC3阳性细胞具有较强杀伤作用，且对HepG2具有最强的杀伤作用。
附图说明
图1为双抗结构图，a为h8B-BsAb-WT结构，b为h8B-BsAb结构，虚线代表抗体天然二硫键对，
Figure BDA0002659064240000031
代表引入的二硫键对；
图2为蛋白纯化结果图，a为Western blot检测结果，b为SDS-PAGE检测结果；
图3为双抗稳定性检测结果图，a为震荡168h后双抗降解情况，b为震荡168h后双抗浊度分析结果，c为双抗热稳定性，d为双抗常温下稳定性；
图4为双抗对靶细胞的结合亲和力结果图，a为双抗与GPC3亲和力，b为双抗与CD3亲和力；
图5为双抗与FcRn受体亲和力结果图，a为双抗在PH 6.0条件下与FcRn受体的相互作用结果，b为PH 7.4条件下与FcRn受体的相互作用；
图6为双抗对癌细胞杀伤作用及人T细胞激活能力结果图，a为双抗对各种癌细胞的细胞毒性，b为双抗诱导CD4+和CD8+T细胞得分化和增殖，c为双抗诱导细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的表达。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。通过实施例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。
实施例1
抗GPC3/CD3双抗分子的构建
抗GPC3/CD3双特异性抗体是由两条相同的多肽链以共价键结合形成的四价同源二聚体，每条多肽链包含人免疫球蛋白抗体IgG1的Fc片段、结合GPC3抗原的Fab片段和结合CD3抗原的单链片段scFv，其中，Fc片段的分子结构形式为CH2-CH3，Fab片段的分子结构形式为VH-CH1和VL-CL，Fab片段和Fc片段通过CH1与CH2之间的铰链区连接；单链片段scFv通过Linker1与CL的N端连接，根据DSDBASE数据库二硫键形成标准，空间构象中
Figure BDA0002659064240000041
Figure BDA0002659064240000042
故在Fab片段的VH-VL、CH1-CL之间进行工程二硫键引入突变，VH和VL上的突变位点为VH44-VL100，CH1和CL上的突变位点为CH1126-CL121、CH1126-CL124、CH1127-CL121、CH1141-CL116、CH1168-CL164、CH1170-CL164或CH1173-CL160中一对或多对。
构建VH和VL、CH1和CL之间均未引入工程二硫键后发生突变的抗GPC3/CD3双抗分子，h8B-BsAb-WT(图1中a)，抗体分子序列为：
VH-CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述VL-CL氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；CH2-CH3的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；单链片段scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；Linker1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
构建CH1126-CL121和VH44-VL100之间均引入工程二硫键后发生突变的抗GPC3/CD3双抗分子，h8B-BsAb(图1中b)，抗体分子序列为：
VH-CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述VL-CL氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；CH2-CH3的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；单链片段scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；Linker1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。以下实施例2-5均以h8B-BsAb-WT为对照组，h8B-BsAb为实验组
实施例2
双抗的表达与纯化
将双抗的重链和轻链的DNA片段分别克隆到pCDNA3.4载体中，提取重组质粒共转染Expi293F细胞。细胞培养7天后，离心收集细胞上清液，将细胞上清液用0.45um滤网过滤后，上样至protein A柱，用含有100mM甘氨酸，pH 3.0的洗脱液洗脱蛋白，回收目标样品并用pH 9.0的Tris-HCl中和，超滤离心置换于PBS缓冲液中保存，用HPLC检测蛋白纯度。取纯化后的蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测以及Western blot检测。目的蛋白大小为200kDa。结果如图2中a、b和表1所示，a为Western blot检测结果，b为SDS-PAGE检测结果，Western blot结果显示抗体h8B-BsAb中CH1126-CL121和VH44-VL100间引入二硫键后能形成更多目的单体，SDS-PAGE结果显示两种抗体配对正确，HPLC纯化结果显示，h8B-BsAb-WT抗体的单体量仅为40％，而h8B-BsAb单体量为76％，尽管两种抗体单体量不同，但两者表达量相似，两种双特异性抗体的纯度均＞96％。
表1双抗蛋白表达量
Figure BDA0002659064240000051
实施例3
测定双抗稳定性
调整双抗溶液的浓度为1mg/ml，将双抗溶液置于恒温混匀仪上，25℃、1400rpm震荡168h，涡旋期间用微孔板分光光度计测定不同时间595nm处的OD值。结果如图3中a、b所示，SDS-PAGE结果显示，震荡168h后h8B-BsAb-WT出现明显的降解，而h8B-BsAb未出现降解，此外，h8B-BsAb-WT的浊度明显高于h8B-BsAb。
通过MicrolCalTM VP-DSC系统进行抗体热稳定性分析测定。用PBS缓冲液将抗体稀释至0.5mg/ml，真空脱气5min；将缓冲液分别加入参比池与样品池中，反复吹打排出气泡，并吸去多余液体；将样品及缓冲液经真空泵脱气5min后进行测定，测定条件为：升温速率1℃/min，温度范围25-95℃。数据通过系统自带的MicrolCal Origin 7.0软件进行处理。结果如图3中c所示，h8B-BsAb的蛋白变性中点温度(Tm)提高了2℃，与亲本单克隆抗体接近。
将抗体置于4℃ PBS缓冲液中观察双特性抗体的稳定性，30天后，HPLC检测。结果如图3中d所示，h8B-BsAb-WT出现了明显的降解片段(6.57％)，相比之下，h8B-BsAb几乎没有降解。
实施例4
4.1测定双抗对靶细胞的结合亲和力
用GPC3阴性细胞SK-Hep-1构建的细胞表面高表达GPC3的SK-GPC3癌细胞作为靶细胞，用含有0.5％BSA的PBS洗涤3次，300g离心5min，弃上清。0.5％BSA的PBS重悬细胞，细胞浓度为5×105个/ml，100ul/孔加入96孔板，将纯化的h8B-BsAb-WT和h8B-BsAb梯度稀释(32pM-250nM)，100ul/孔加入96孔板，与SK-GPC3细胞均匀混合，4℃孵育1h。用含2％FBS的PBS溶液洗涤细胞两次以除去未结合的待检抗体，加入Mouse anti-Human IgG荧光二抗，4℃孵育30min；用含2％FBS的PBS溶液洗涤细胞两次，以除去未结合的二抗。最后将细胞重悬在200ul含2％FBS的PBS溶液中，通过流式细胞仪检测双抗对该细胞的结合亲和力，所得数据通过GraphPad Prism8软件拟合分析。同样地，以细胞表面表达CD3的人外周血淋巴细胞(PBMCs)作为靶细胞，通过流式细胞仪测定h8B-BsAb-WT和h8B-BsAb对该细胞的结合亲和力，方法如前所述。结果如图4中a、b和表2所示，两种双特异性抗体均保持了对GPC3和CD3的亲和力，且h8B-BsAb抗体与CD3的亲和力(72.02nM)略高于h8B-BsAb-WT(122.5nM)。
表2双抗与GPC3和CD3的亲和力结果
Figure BDA0002659064240000061
4.2测定双抗与FcRn受体亲和力
用生物膜干涉技术(BLI)测定双特异性抗体Fc与FcRn受体的亲和力，评价抗体在血液中的半衰期。将h8B-BsAb-WT和h8B-BsAb浓度调至5ug/ml，用Anti-HIgG Fc的生物感应器固化后，在不同FcRn蛋白浓度中结合后，在pH为6.0的PBS溶液中解离。实验中抗体与抗原之间的解离平衡常数(KD)、结合速率常数(Kon)及解离速率常数(Koff)由DataAnalysis7.0(
Figure BDA0002659064240000062
System)和GraphPad Prism8处理分析。结果如图5中a、b和表3所示，a为双抗在PH 6.0条件下与FcRn受体亲和力结果，b为双抗在PH 7.4条件下与FcRn受体亲和力。在pH为6.0的条件下，h8B-BsAb与FcRn的结合能力强于h8B-BsAb-WT，这可能是h8B-BsAb的轻链多一个ScFv分子后，使其与FcRn结合速度略降低，解离速度变慢，但在pH为7.4时h8B-BsAb能全部解离，符合该受体的理论解离和结合方式。综合结果可预测在血液中双抗与FcRn受体的亲和力没有因为结构位阻降低，反而有提高，体内半衰期可能增加。
表3双抗与FcRn受体在PH 6.0时的亲和力结果值
Figure BDA0002659064240000071
解离平衡常数(KD)、结合速率常数(Kon)及解离速率常数(Koff)
实施例5
双抗对癌细胞杀伤作用及人T细胞激活能力测定
以人PBMCs为效应细胞(E)；对数生长期的癌细胞HepG2、Huh-7及SK-Hep-1作为靶细胞(T)；以E∶T为10∶1的比例分别接种于96细胞板中，加入梯度稀释的h8B-BsAb，37℃孵育48h，用Cell Counting Kit-8试剂盒检测细胞毒性。结果如图6中a所示，h8B-BsAb对HcpG2的杀伤作用最强，而对阴性细胞SK-Hep-1细胞无明显杀伤作用。
用RosetteSepTM Human T Cell Enrichment Cocktail(Stemcell，美国)从人PBMCs中分离人T细胞作为效应细胞(E)，HepG2为靶细胞(T)，以E∶T为5∶1的比例接种于96细胞板，加入梯度稀释的h8B-BsAb，37℃孵育48h，收集培养基上清，用ELISA试剂盒检测IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平。48h后取出细胞4℃孵育荧光抗体：APC-anti-humanCD3抗体、APC-Cy7anti-Human-CD4抗体、FITC-anti-human-CD8抗体、PE-anti-human-CD69抗体、PE-anti-human-CD25抗体，30min后用含2％FBS的PBS溶液洗涤两遍，流式细胞仪检测并分析T细胞是否被激活。结果如图6中b、c所示，b为双抗诱导CD4+和CD8+T细胞得分化和增殖，c为双抗诱导细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的表达，h8B-BsAb抗体体外上调CD4+和CD8+T细胞表面的CD69和CD25分子的表达，证明T细胞已激活；细胞因子检测的结果也显示h8B-BsAb诱导的癌细胞杀伤实验伴随较强的细胞因子释放包括IL-2、TNF-α、IFN-γ。故h8B-BsAb通过激活T细胞特异性杀伤GPC3阳性肝癌细胞，具有潜在的抗肿瘤活性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆金迈博生物科技有限公司
重庆市畜牧科学院
<120> 一种抗GPC3/CD3双特异性抗体及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Asn Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Cys Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val
210
<210> 2
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagt gcctggagtg ggtctcattg attagtagta atagtagtta catatactac 180
gcggactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactggat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acagctgtgt attactgtct aactgggggt 300
tttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca 360
tcggtctgcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 420
tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480
accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540
agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 600
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagtt 636
<210> 3
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Asn
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Thr His Trp Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacatcgtga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacaataatg gaaacaccta cttgcattgg 120
tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180
tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggcgtt tattactgca tgcaacatac acactggcca 300
acgttcggct gcgggaccaa ggtggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catgcgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 5
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 6
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacctgaag ccgctggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240
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cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gccca 45
<210> 9
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Met Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 10
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180
gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240
atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300
gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360
gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420
ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480
agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540
aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600
agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660
acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720
gagatcaaa 729
<210> 11
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Asn Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val
210
<210> 12
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcattg attagtagta atagtagtta catatactac 180
gcggactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactggat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acagctgtgt attactgtct aactgggggt 300
tttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca 360
tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 420
tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480
accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540
agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 600
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagtt 636
<210> 13
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Asn
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Thr His Trp Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 14
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gacatcgtga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacaataatg gaaacaccta cttgcattgg 120
tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180
tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggcgtt tattactgca tgcaacatac acactggcca 300
acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
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agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggtggtggtg gttct 45

Claims (10)

1.一种抗GPC3/CD3双特异性抗体，所述双特异性抗体是由两条相同的多肽链以共价键结合形成的四价同源二聚体，每条多肽链包含人免疫球蛋白抗体IgG1的Fc片段、结合GPC3抗原的Fab片段和结合CD3抗原的单链片段scFv，其中，Fc片段的分子结构形式为CH2-CH3，Fab片段的分子结构形式为VH-CH1和VL-CL，Fab片段和Fc片段通过CH1与CH2之间的铰链区连接；单链片段scFv通过Linker1与CL的N端连接，其特征在于，所述VH和VL、CH1和CL之间均引入工程二硫键后发生突变。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述VH和VL上的突变位点为VH44和VL100。
3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述CH1和CL上的突变位点为CH1126和CL121、CH1126和CL124、CH1127和CL121、CH1141和CL116、CH1168和CL164、CH1170和CL164或CH1173和CL160中一对或多对。
4.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述VH-CH1的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述VL-CL氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
6.如权利要求1-5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述CH2-CH3的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
7.如权利要求1-5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链片段scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
8.如权利要求7所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Linker1的氨基酸序列如SEQID NO.15所示。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-8任一所述的双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.如权利要求1-8任一所述的双特异性抗体或9所述的组合物在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物用于治疗肿瘤。
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