KR20090094848A - Ｃｄ４４ 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD44에 결합하여 CD44를 억제하는 기능을 하는 인간 항체 및 이의 항원-결합 부분을 포함하는 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 인간 CD44 항체로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린, 및 이같은 면역글로불린을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 인간 CD44 항체의 제조 방법, 이러한 항체를 포함하는 조성물, 및 항체 및 조성물 또는 의약을 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.

CD44 항체, CD44 매개 장애, 면역글로불린

Description

ＣＤ４４ 항체 {CD44 ANTIBODIES}

관련 특허 및 특허 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 미국 특허 가출원 일련 번호 60/876109 (2006년 12월 21일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이는 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.

본 발명은 인간 CD44에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이같은 항체 및 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 분자, CD44 항체 및 항원-결합 부분의 제조 방법. 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물, 및 항체, 항원-결합 부분 및 조성물 또는 의약을 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.

신체 손상, 감염 또는 면역 응답에 의해 예를 들어 야기되는 염증 (체액의 국소적인 축적)은 세포외 매트릭스 내로의 염증 세포, 예컨대 단핵구 및 T-세포의 동원에 의해 개시된다 ([Naor, D. et al., (2003) Arthritis Res Ther, 5:105-115]). 이러한 세포 동원은 세포외 매트릭스 내로의 사이토카인, 예컨대 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 추가적인 침윤 및 증가를 전형적으로 초래한다 (동일 문헌). 이같은 세포 동원 및 침윤은, 다양한 또다른 세포성 프로세스, 예를 들어, 성장 조 절, 부착, 분화, 침범 및 생존과 함께, 부착 수용체 수퍼패밀리인 막횡단 당단백질 세포-부착 분자에 의해 매개된다. 세포 부착 수용체 패밀리의 구성원에는 광범위하게 분포된 클래스 I 막횡단 당단백질인 CD44가 포함된다. CD44는 부착, 이동, 활성화 및 생존이 포함되는 다양한 세포 거동에서 중추적인 역할을 한다 ([Ponta, H. et al., (2003) Molecular Cell Biology, 4:33-45]).

CD44는 분자량이 80 내지 90 kDa 사이이고, 차별적인 별법적인 스플라이싱에 의해 800개에 가까운 변이체 이소형(isoform)이 생성될 수 있다 ([Cichy, J. et al., (2003) Journal of Cell Biology, 161:5, 839-843]). 현재, 여러 다수의 이소형이 공지되어 있다. CD44는 백혈구, 섬유모세포, 상피 세포, 각질세포 및 일부 내피 세포가 포함되는 다수의 세포 유형에서 어디에나 있는 방식으로 발현되고, 이때 어떠한 변이체 엑손도 없는 표준 CD44 (CD44s) 형태가 가장 풍부하게 발현되는 이소형이다

CD44는 이의 1차 리간드인 히알루로난 또는 히알루론산 (HA) (친수성의 선형 세포외 다당류)와 함께 염증에서 중요한 역할을 한다 ([Naor D., (2003) Arthritis Res Ther, 5:105-115] 및 [Aruffo, A. (1990) Cell 61, 1301-1313]). 예를 들어, 생체내 연구에서, CD44-매개 HA-결합 활성을 유도하는 모노클로날(monoclonal) 항-CD44 항체 IRAWB14는 프로테오글리칸-유도 관절염이 있는 마우스에서 염증 증상의 악화를 초래하였다 ([Pure, E. et al., (2001) TRENDS in Molecular Medicine, 7:213-221]).

발명의 개요

본 발명은 CD44에 특이적으로 결합하고 CD44 길항제로 작용할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 및 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물 또는 의약을 제공한다. 본 발명의 또다른 양상은 인간 항체인, 임의의 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 인간 재조합 항체이다.

본 발명은 (i) 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 (ii) 이의 가변 도메인, 또는 (iii) 이의 항원-결합 부분, 또는 (iv) 이의 상보성 결정 영역(들) (CDR)을 포함하는, CD44에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명은 하기 a) 내지 g)에 기술된 기능적 성질들 중 하나 이상을 갖는, CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 추가로 제공한다:

a) 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정했을 때 1000 nM 이하의 K_D로 CD44에 결합함;

b) 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정했을 때 CD44에 대한 오프(off) 속도 (k_off)가 0.01 ^s-1 이하임;

c) FACS 또는 ELISA 결합 분석법에 의해 측정했을 때 500 nM 미만, 75 ㎍/㎖의 EC₅₀으로 CD44에 결합함;

d) ELISA 결합 분석법에 의해 측정했을 때 CD44와 HA 간의 상호작용을 500 nM 미만, 75 ㎍/㎖의 IC₅₀으로 억제함;

e) FACS에 의해 측정했을 때 약 100 nM 미만의 IC₅₀에서 염증 세포, 예컨대 CD3+ T 세포에서의 CD44 수용체의 생체내 표면 발현을 억제함;

f) 50 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 CD44 수용체의 표면 발현을 감소시킴;

g) 림프관 내피 히알루로난 수용체 1 단백질 (LYVE-1)에 비해 CD44에 대한 선택성이 100배 이상임.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 서열에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 임의의 본원에 기술된 핵산 분자를 포함하고, 이러한 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 임의로 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.

또다른 실시양태는 임의의 본원에 기술된 벡터를 포함하거나 임의의 본원에 기술된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또한 본 발명은 임의의 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 부분을 생산하거나 임의의 상기 항체 또는 상기 항원-결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 생산하는 단리된 세포주를 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 숙주 세포 또는 세포주를 적절한 조건 하에 배양하는 단계 및 상기 항체 또는 항원-결합 부분을 회수하는 단계를 포함하는, CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 임의의 본원에 기술된 핵산을 포함하고, 상기 핵산을 발현하 는 비-인간 트랜스제닉(transgenic) 동물 또는 트랜스제닉 식물을 제공한다.

본 발명은 본원에 기술된 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는, CD44에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 단리하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 (i) 상기 항-CD44 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 이의 가변 도메인, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 이의 CRD, 또는 이들을 코딩하는 핵산 분자; 및 (ii) 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 또다른 성분, 예컨대 치료제 또는 진단제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 임의의 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하고, 연결되거나 현탁된 제약상 허용가능한 담체를 임의로 포함하는 제약 조성물 또는 의약을 또한 제공한다. 본 발명의 조성물은 또다른 성분, 예컨대 치료제 또는 진단제를 추가로 포함할 수 있다.

진단 및 치료 방법이 본 발명에 의해 또한 제공된다.

본 발명은 포유동물에게 임의의 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 임의의 본원에 기술된 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 염증 세포 침윤 또는 동원의 치료를 필요로 하는 포유동물에서 염증 세포 침윤 또는 동원을 치료하는 방법을 또한 제공한다.

본 발명의 또다른 양상은 인간 항체인, 임의의 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 인간 재조합 항체이다.

도 1은 면역글로불린 (IgG)의 개략도이다.

도 2는 단리된 항-CD44 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 예상 아미노산 서열과 상응하는 경쇄 및 중쇄 유전자의 생식계통 아미노산 서열의 서열 정렬이다. 클론과 생식계통 서열 간의 동일한 잔기는 -로 표시되고, 결실/삽입은 #로 표시되며, 돌연변이가 열거되고, CDR에는 밑줄이 그어진다.

도 3은 항-CD44 1A9.A6.B9 항체가 HA가 CD44-Ig 융합 단백질에 결합하는 것을 차단하는 것을 도해하는 그래프이다.

도 4A-4C는 유동 세포측정법 분류 (FACS)에 의해 분석된, 세포에 대한 항-CD44 항체의 결합을 나타내는 그래프이다.

도 4A는 FACS에 의해 분석된, 인간 전혈 T-세포에 대한 항-CD44 1A9.A6.B9 및 14G9.B8.B4 항체의 결합을 도해하는 그래프이다.

도 4B는 FACS에 의해 분석된, 사이노몰구스 원숭이 전혈 T-세포에 대한 항-CD44 1A9.A6.B9 및 14G9.B8.B4 항체의 결합을 도해하는 그래프이다.

도 4C는 FACS에 의해 분석된, 인간 및 사이노몰구스 CD44가 형질도입된 300-19 세포에 대한 항-CD44 항체의 결합을 도해하는 그래프이다.

도 5는 ELISA 분석법에 의해 측정된, 인간 및 사이노몰구스 CD44-Ig 융합 단백질을 사용한 항-CD44 1A9.A6.B9 항체의 결합 연구를 도해하는 그래프이다.

도 6은 ELISA를 사용하여 정량된, 항-CD44 1A9.A6.B9 및 14G9.B8.B4 항체가 인간 전체 단핵구로부터의 지질다당류 (LPS) 및 HA에 의해 자극된 IL-1β 방출을 차단하는 것을 도해하는 그래프이다.

도 7은 FACS에 의해 측정된, 항-CD44 1A9.A6.B9 및 14G9.B8.B4 항체가 CD3+ 말초 T 세포 상에서의 CD44 수용체의 표면 발현을 감소시킨다는 것을 나타내는 그래프이다.

도 8A는 항-CD44 항체 1A9.A6.B9에 의한 인간 말초 백혈구 (림프구) 상에서의 CD44 수용체의 표면 발현의 감소를 나타내는 그래프이다.

도 8B는 항-CD44 항체 1A9.A6.B9에 의한 인간 말초 백혈구 (단핵구) 상에서의 CD44 수용체의 표면 발현의 감소를 나타내는 그래프이다.

도 8C는 항-CD44 항체 1A9.A6.B9에 의한 인간 말초 중성구 (PMN) 상에서의 CD44 수용체의 표면 발현의 감소를 나타내는 그래프이다.

도 9A 및 9B는 FACS를 사용하여 정량된, 사이노몰구스 원숭이에 투여된 항-CD44 1A9.A6.B6 항체의 단일 용량 생체내 연구를 도해하는 그래프를 나타낸다.

도 10A는 FACS를 사용하여 정량된, 인간 말초 T-세포를 사용한 항-CD44 항체 MEM 85와 직접적으로 경쟁하는 항-CD44 1A9.A6.B9의 결합을 도해하는 그래프이다.

도 10B는 FACS를 사용하여 정량된, 실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 CD44로 형질감염된 300-19 세포를 사용한 항-CD44 항체 MEM 85와 직접적으로 경쟁하는 항-CD44 1A9.A6.B9의 결합을 도해하는 도해하는 그래프이다.

도 11은 SE-HPLC에 의해 측정된, 5℃ (11a), 25℃ (11b) 및 40℃ (11c)에서 형성된 존재하는 응집물 (고분자량 종 (HMMS))을 도해하는 그래프이다.

도 12는 iCE에 의해 측정된, 5℃ (12a), 25℃ (12b) 및 40℃ (12c)에서 형성 된 전체 산성 종을 나타내는 그래프이다.

정의

본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐, "포함하다(comprise)"라는 단어, 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원과 관련되어 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 문맥적으로 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하고, 복수형 용어는 단수형을 포함한다. 일반적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학, 및 혼성화와 관련되어 본원에서 사용된 명명법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이다.

기본적인 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되고, 각각의 쌍에는 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50-70 kDa)가 있다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 아미노산 약 100개 내지 120개의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소타입(isotype)을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역이 아미노산 약 12개 이상의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 아미노산 약 3개 이상의 "D" 영역을 또한 포함한다. 일반적으로, [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]를 참조한다. 각각의 중쇄 /경쇄 쌍의 가변 영역 (V_H 및 V_L)이 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 무손상 IgG 항체에는, 예를 들어, 2개의 결합 부위가 있다. 이관능성 또는 이중특이적 항체를 제외하고는, 2개의 결합 부위는 동일하다.

중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 3개의 초가변 영역 (상보성 결정 영역 또는 CDR으로 또한 칭해짐)에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간에 서열 면에서 광범위하게 상이하고 각각의 특정 항체의 이의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균일하게 분포되지 않고, CDR에 집중되며, 이들은 더욱 고도로 보존된 FR에 의해 분리된다. 각각의 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 FR에 의해 정렬되어, 특이적 에피토프에 결합할 수 있도록 한다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 할당은 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 & 1991))], 또는 [Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]; [Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883]의 정의에 따른다. 본원에서 사용된, 번호로 지칭되는 항체는 동일한 번호의 하이브리도마에 의해 수득된 모노클로날 항체와 동일하다. 예를 들어, 모노클로날 항체 1A9.A6.B9는 하이브리도마 1A9.A6.B9, 또는 이의 서브클론으로부터 수득된 것과 동일한 항체이다. 본원에서 사용된 Fd 단편은 V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미하고, Fv 단편은 항체의 1개의 팔의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성되며, dAb 단편 ([Ward et al., (1989) Nature 341:544-546])은 V_H 도메인으로 구성된다.

일부 실시양태에서, 항체는 V_L 및 V_H 도메인이 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있게 하는 합성 링커를 통해 1가 분자를 형성하도록 V_L 및 V_H 도메인이 쌍을 이룬 단일 사슬 항체 (scFv)이다 ([Bird et al., (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]). 일부 실시양태에서, 항체는 디아바디(diabody), 즉 V_H 및 V_L 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만, 동일한 사슬 상의 두 도메인들 간에 쌍을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들이 또다른 사슬 상의 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록 강요하여 2개의 항원 결합 부위가 생성된 2가 항체이다 (예를 들어, [Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448], 및 [Poljak R. J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 항체로부터의 하나 이상의 CDR이 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 분자 내로 혼입되어, 분자가 CD44에 특이적으로 결합하는 면역부착소가 되도록 할 수 있다. 이같은 실시양태에서, CDR(들)은 더 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로 혼입될 수 있거나, 또다른 폴리펩티드 사슬에 공유결합에 의해 연결될 수 있거나, 또는 비-공유결합에 의해 혼입될 수 있다.

하나 이상의 결합 부위가 있는 항체 실시양태에서, 결합 부위는 서로 동일할 수 있거나, 또는 상이할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "유사체" 또는 "폴리펩티드 유사체"는 일부 기준 아미노산 서열과 실질적으로 동일하고 기준 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 기능 또는 활성이 있는 절편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 기준 서열에 대해 보존적 아미노산 치환 (또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체의 길이는 적어도 20 또는 25개의 아미노산일 수 있거나, 또는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개의 아미노산 또는 그 이상일 수 있으며, 종종 전장 폴리펩티드만큼 길 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태는 생식계통 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 치환이 있는 폴리펩티드 단편 또는 폴리펩티드 유사체 항체를 포함한다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 본 명세서의 교시내용에 따라 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다.

한 실시양태에서, CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 대한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키거나, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키거나, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화력을 변경시키거나, 또는 (4) 이같은 유사체의 또다른 물리화학적 또는 기능적 성질을 부여하거나 변형시키지만, CD44에 대한 특이적 결합을 여전히 유지시키는 치환이다. 유사체는 정상적으로 발생하는 펩티드 서열에 대한 다양한 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이 정상적으로 발생하는 서열에서, 예를 들어 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 부분에서 이루어질 수 있다. 폴리펩티드의 활성을 개선시킬 수 있는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들)에서 아미노산 치환이 또한 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 어버이 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다; 예를 들어, 교체 아미노산은 어버이 서열에서 발생하는 면역글로불린 결합 도메인을 구성하는 역평행 β-시트를 변경시키거나 어버이 서열을 특성화하는 또다른 유형의 2차 구조를 파괴하지 않아야 한다. 일반적으로, 글리신 및 프롤린은 역평행 β-시트에서 사용되지 않을 것이다. 당업계에 인지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예가 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 [Thornton et al., (1991) Nature 354:105]에 기술되어 있다.

본원에서 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린과 동의어이고, 당업계에 통상적으로 공지된 바와 같이 이해된다. 특히, 용어 항체는 임의의 특정한 항체 생산 방법에 의해 한정되지 않는다. 예를 들어, 용어 항체는 재조합 항체, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 특히 포함한다.

본원에서 사용된, 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항체 일부분" 또는 "일부분")이라는 용어는 항원 (예를 들어, CD44)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 1개의 팔의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) V_H 도메인으로 구성된 dAb 단편 ([Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 V_L 및 V_H가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 사용하여, 이들이 V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이뤄 1가 분자를 형성한 단일 단백질 사슬 (단일 사슬 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, [Bird et al., (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)로 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 이들을 연결시킬 수 있다. 이같은 단일쇄 항체 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되도록 의도된다. 또다른 형태의 단일 사슬 항체, 예컨대 디아바디가 또한 포함된다. 디아바디는 V_H 및 V_L 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만, 동일한 사슬 상의 두 도메인들 간에 쌍을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들이 또다른 사슬 상의 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록 강요하여 2개의 항원 결합 부위가 생성된 2가의 이중특이적 항체이다 (예를 들어, [Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak et al., (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).

또한, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 일부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유결합 또는 비-공유결합 회합에 의해 형성된 더 큰 면역부착 분자의 일부분일 수 있다. 이같은 면역부착 분자의 예로는 사량체성 scFv 분자를 제조하기 위해 스트렙타비딘 코어(core) 영역을 사용하는 것 ([Kipriyanov et al., (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101]) 및 2가의 비오틴화 scFv 분자를 제조하기 위해 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태크를 사용하는 것 ([Kipriyanov et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058])이 포함된다. 또다른 예로는 항체로부터의 하나 이상의 CDR이 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 분자 내로 혼입되어, 분자를 CD44와 같은 당해 항원에 특이적으로 결합하는 면역부착소로 만드는 경우가 포함된다. 이같은 실시양태에서, CDR(들)은 더 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로 혼입될 수 있거나, 또다른 폴리펩티드 사슬에 공유결합에 의해 연결될 수 있거나, 또는 비-공유결합에 의해 혼입될 수 있다. 통상적인 기술, 예컨대 각각 파파인 또는 펩신 소화를 사용하여 항체 일부분, 예컨대 Fab 및 F(ab')₂ 단편이 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 바와 같이, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 항체, 항체 일부분 및 면역부착 분자를 수득할 수 있다.

달리 명확하게 지시되지 않는 한, 용어 "CD44"는 인간 CD44를 지시한다. CD44는 다중구조성 세포외 매트릭스 수용체이고, 세포-세포 및 세포-매트릭스 활성을 조절하는 막횡단 당단백질의 전통적인 패밀리의 구성원이다. 인간 CD44의 클로닝 및 서열이, 예를 들어 [Arrofo, A. (1990) Cell, 16. (접속 번호 NM_001001391)에 보고되어 있고, 서열 1에 기재된다. 용어 CD44는 재조합 인간 CD44 및 재조합 키메라 형태의 CD44를 포함하도록 의도되고, 이는 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조할 수 있거나, 구입할 수 있다 (예를 들어, R&D Systems 카탈로그 번호 861-PC-100). 특히, CD44는 20개의 엑손을 포함하는 단일한 60 kb 유전자에 의해 코딩되는 80-90 kDa의 글리콜화 제I형 막횡단 단백질이다. 20개의 엑손 중 10개 (표준 엑손 1 내지 10)는 모든 CD44 양성 세포에서 발현되고, "표준 CD44" 또는 "CD44s"를 코딩한다. 나머지 10개의 엑손 (변이체 엑손 1v 내지 10v)는 별법적인 스플라이싱에 적용되고, CD44s의 세포외 도메인에 삽입된 펩티드성 서열을 코딩한다. "CD44의 세포외 도메인"은 3개의 디술피드 결합에 의해 안정화된 N-말단 구형 영역을 포함하고, 선형 구조에 의해 세포막으로부터 분리되며, 잔기 약 247개의 길이이고, 서열 3에 기재된다 ([Gadhoum Z. et al., (2004) Leukemia & Lymphoma 45(8):1501-1510]). 이러한 3개의 디술피드 결합 사다리는 CD44s의 세포외 도메인 내에 위치한, 히알루론산 (HA, 히알루로네이트, 히알루로난) 결합 도메인 "HA 결합 도메인"을 디스플레이하는 구형 영역을 포함하고, 잔기 약 100개의 길이인 "연결 모듈(module)" (CD44s의 세포외 도메인의 잔기 32-123; 서열 5에 기재됨)을 포함한다. "HA 결합 도메인"은 적어도 아미노산 잔기 Lys38, Arg41, Tyr42, Arg78, Tyr79, Asn100, Asn101, Arg150, Arg154 및 Arg162를 포함하는 것으로 추가로 특성화될 수 있다 ([Teriete P. et al., (2004) Molecular Cell, 13, 483-496]).

본원에서 사용된 용어 "키메라 항체"는 상이한 종들로부터의 항체들을 포함하는, 2개 이상의 상이한 항체로부터의 영역들을 포함하는 항체를 의미한다. 예를 들어, 키메라 항체의 CDR들 중 하나 이상이 인간 CD44 항체로부터 유래될 수 있다. 한 예에서, 인간 항체로부터의 CDR이 비-인간 항체, 예컨대 마우스 또는 래트로부터의 CDR과 조합될 수 있다. 또다른 예에서, 모든 CDR이 인간 CD44 항체로부터 유래될 수 있다. 또다른 예에서, 1가지를 초과하는 인간 CD44 항체로부터의 CDR이 키메라 항체에서 조합될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체가 제1 인간 CD44 항체의 경쇄로부터의 CDR1, 제2 인간 CD44 항체의 경쇄로부터의 CDR2 및 제3 인간 CD44 항체의 경쇄로부터의 CDR3를 포함할 수 있고, 중쇄로부터의 CDR은 하나 이상의 또다른 CD44 항체로부터 유래될 수 있다. 추가로, CDR들 중 하나 이상이 취해진 CD44 항체들 중 하나로부터 또는 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터 프레임워크 영역이 유래될 수 있다. 추가로, 용어 "키메라 항체"는 인간 및 비-인간 항체가 수반된 임의의 상기 언급된 조합을 포함하도록 의도된다.

항체와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "경쟁하다"는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 제2 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 결합에 대해 경쟁하고, 이때 제1 항체와 이의 동족 에피토프의 결합이 제2 항체의 부재 하의 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소된다는 것을 의미한다. 제2 항체의 이의 에피토프에 대한 결합이 제1 항체의 존재 하에 또한 검출가능하게 감소되는 별법적인 경우가 있을 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 즉, 제2 항체가 제1 항체가 이의 각자의 에피토프에 결합하는 것을 억제하지 않으면서 제1 항체가 제2 항체의 이의 에피토프에 대한 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 이의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출가능하게 억제하는 경우 (동일한 정도, 더 큰 정도, 또는 더 낮은 정도 여부와 상관없이), 이러한 항체들은 이들의 각자의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 양쪽 모두 본 발명에 포함된다. 이같은 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생하는 메커니즘 (예를 들어, 입체 장애, 형상 변화, 또는 공통 에피토프 또는 이의 일부분에 대한 결합)과 상관 없이, 본원에서 제공된 교시내용을 기초로, 당업자는 이같은 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 본원에 개시된 방법에 포함되고 이를 위해 유용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 사용된 용어 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R 기가 있는 또다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 치환의 보존적 성질을 수정하기 위해 서열 유사성 백분율이 상향 조정될 수 있다. 이와 같이 조정하는 수단은 당업자에게 주지되어 있다 ([Pearson, (1994) Methods Mol. Biol. 243:307-31]). 화학적 성질이 유사한 측쇄가 있는 아미노산들의 군의 예로는 하기의 것들이 포함된다: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 보존적 아미노산 치환 군은, 예를 들어, 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민일 수 있다.

또한 보존적 교체는 [Gonnet et al., (1992) Science 256:1443-45]에 개시된 PAM250 로그(log)-가능도 매트릭스에서 양성 값을 갖는 임의의 변화일 수 있다. "적당하게 보전적인" 교체는 PAM250 로그-가능도 매트릭스에서 음성이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.

"접촉"은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 표적 CD44 또는 이의 에피토프를 항체가 CD44의 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있는 방식으로 접합시키는 것을 지칭한다. 이같은 "접촉"은 "시험관 내에서", 예를 들어, 시험관, 페트리접시 등에서 달성될 수 있다. 시험관에서, 접촉은 항체 또는 이의 항원-결합 부분 및 CD44 또는 이의 에피토프만을 수반할 수 있거나, 또는 전체 세포를 수반할 수 있다. 또한 세포 배양 접시에서 세포가 유지 또는 성장되고, 이러한 환경에서 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 접촉될 수 있다. 이러한 정황에서, 더욱 복잡한 살아 있는 생물과 함께 생체 내에서 항체를 사용하는 것이 가능하기 전에 CD44-관련 장애에 영향을 미치는 특정 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 능력, 즉, 항체의 IC₅₀을 결정할 수 있다. 생물 외부의 세포에 대해, CD44를 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 접촉시키기 위한 여러 방법이 존재하고, 당업자에게 주지되어 있다.

본원에서 사용된 용어 "ELISA"는 효소-결합 면역흡착 분석법을 지칭한다. 이러한 분석법은 당업자에게 주지되어 있다. 이러한 분석법의 예를 [Vaughan, T.J. et al., (1996) Nat. Biotech. 14:309-314], 뿐만 아니라 본 출원의 실시예 5, 6, 7 및 11에서 확인할 수 있다.

용어 "에피토프"는 특이적으로 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 결합할 수 있거나 또는 다른 방식으로 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프성 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 집단물로 구성되고, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특성, 뿐만 아니라 특정한 전하 특성이 있다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형상성"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자 (예컨대 항체) 간의 상호작용의 모든 지점은 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형적으로 발생한다. 입체형상성 에피토프에서는, 상호작용 지점들이 단백질 상의 서로 떨어진 아미노산 잔기들에 걸쳐 발생한다. 일단 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어, 본 발명에 기술된 기술을 사용하여, 이러한 에피토프에 대한 항체가 생성될 수 있다. 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특성화가 원하는 에피토프에 관한 정보를 또한 명료하게 할 수 있다. 그후, 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에의 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 즉, 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 발견하기 위한 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다. 교차-경쟁을 기초로 항체들을 "비닝(binning)"하기 위한 고처리량 프로세스가 PCT 공보 번호 WO 03/48731에 기술되어 있다.

본원에서 사용된 용어 "발현 제어 서열"은 자신이 결찰된 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 실행시키는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 제어 서열에는 적합한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 강화시키는 서열 (즉, 코작(Kozak) 컨센서스(consensus) 서열); 단백질 안정성을 강화시키는 서열; 및 필요한 경우, 단백질 분비를 강화시키는 서열이 포함된다. 이같은 제어 서열의 성질은 숙주 생물에 따라 상이하다; 원핵생물에서, 이같은 제어 서열에는 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열이 포함되고, 진핵생물에서는, 일반적으로, 이같은 제어 서열에는 프로모터 및 전사 종결 서열이 포함된다. 용어 "제어 서열"은 최소한, 서열의 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 성분을 포함하도록 의도되고, 서열의 존재가 유리한 추가적인 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "생식계통"은 생식 세포를 통해 어버이로부터 자손으로 계대되는 항체 유전자 및 유전자 절편의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 생식계통 서열은 B 세포 성숙 과정 동안 재조합 및 과돌연변이 사건에 의해 변경된 성숙한 B 세포 내의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 구별된다. 본 발명의 생식계통 항체는 g-1A9.A6.B9, g-2D1.A3.D12 및 g-14G9.B8.B4로 지시된다.

본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 가변 도메인 및 불변 도메인 서열이 인간 서열인 임의의 항체를 의미한다. 이 용어는, 예를 들어, 가능한 면역원성의 감소, 친화력 증가, 바람직하지 않은 폴딩(folding)을 야기할 수 있는 시스테인 잔기의 제거 등을 위해 변경된 것들을 포함하여, 인간 유전자로부터 유래된 서열을 갖는 항체를 포함한다. 이 용어는 비-인간 세포에서 재조합적으로 생산된 항체를 또한 포함하고, 이는 인간 세포에서 전형적이지 않은 글리코실화를 부여할 수 있다. 하기 기술되는 바와 같은 다양한 방식으로 이러한 항체가 제조될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 비-인간 종의 항체 서열의 특징적인 아미노산 잔기가 인간 항체의 상응하는 위치에서 발견되는 잔기로 교체된 비-인간 기원의 항체를 지칭한다. 이러한 "인간화" 프로세스는 생성된 항체의 인간에서의 면역원성을 감소시키는 것으로 생각된다. 당업계에 주지된 기술을 사용하여 비-인간 기원의 항체가 인간화될 수 있는 것으로 이해된다 ([Winter et al., (1993) Immunol. Today 14:43-46]). CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인, 및/또는 프레임워크 도메인을 상응하는 인간 서열로 치환하는 재조합 DNA 기술에 의해 당해 항체가 조작될 수 있다 (PCT 공보 번호 WO 92/02190, 및 미국 특허 번호 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, 및 5,777,085). 본원에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 키메라 인간 항체 및 CDR-그래프트 항체를 이의 의미 내에 추가로 포함한다. 본 발명의 키메라 인간 항체는 비-인간 종의 항체의 V_H 및 V_L, 및 인간 항체의 C_H 및 C_L 도메인을 포함한다. 본 발명의 CDR-이식 항체는 인간 항체의 V_H 및 V_L의 CDR을 각각 인간 이외의 동물의 항체의 V_H 및 V_L의 것으로 교체하는 것으로부터 초래된다.

본원에서 사용된 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 "단리된 폴리뉴클레오티드"가 이의 기원에 의해 (1) "단리된 폴리뉴클레오티드"가 천연에서 이와 함께 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분과 회합되지 않거나, (2) 천연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (3) 더 큰 서열의 일부로서 천연에서 발생하지 않는, 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 조합을 의미한다.

용어 "단리된 단백질", "단리된 폴리펩티드" 또는 "단리된 항체"는 이의 기원 또는 유도 공급원에 의해, (1) 천연 상태에서 동반되는 천연적으로 회합되는 성분들과 회합되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 천연에서 발생하지 않는 단백질, 폴리펩티드 또는 항체이다. 따라서, 예를 들어, 화학적으로 합성되거나, 자신이 천연적으로 유래되는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 이의 천연적으로 회합되는 성분들로부터 "단리"될 것이다. 당업계에 주지된 단백질 정제 기술을 사용하여, 단리에 의해 천연적으로 회합되는 성분들이 단백질에 실질적으로 없게 될 수도 있다.

단리된 항체의 예로는 CD44를 사용하여 친화력 정제된 CD44 항체, 및 시험관내에서 세포주에 의해 합성된 CD44 항체가 포함된다.

"시험관내"는 예를 들어, 비제한적으로 시험관 또는 배양 배지와 같은 인공 환경에서 수행된 절차를 지칭한다.

"생체내"는 비제한적으로 포유동물, 예를 들어, 원숭이, 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 살아 있는 생물 내에서 수행된 절차를 지칭한다.

용어 "K_D"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 친화력 평형 상수를 지칭한다. K_D가 ≤ 1 mM, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 가장 바람직하게는 ≤ 10 nM인 경우에 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다. 예를 들어 실시예 5에 논의된 BIACORE™ 시스템을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 K_D 결합 친화력 상수를 측정할 수 있다.

용어 "k_off"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 예를 들어 실시예 5에 논의된 BIACORE™ 시스템을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 k_off 해리 속도 상수를 측정할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "천연 발생 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "변형된 뉴클레오티드"는, 예를 들어, 변형 또는 치환된 당 기가 있는 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 용어 "올리고뉴클레오티드 연결"은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포로아미데이트와 같은 올리고뉴클레오티드 연결을 포함하는 것을 지칭한다 ([LaPlanche et al., (1986) Nucl. Acids Res. 14:9081]; [Stec et al., (1984) J. Am. Chem. Soc. 106:6077]; [Stein et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16:3209]; [Zon et al., (1991) Anti-Cancer Drug Design 6:539]; [Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))]; 미국 특허 번호 5,151,510; [Uhlmann and Peyman, (1990) Chemical Reviews 90:543]). 원한다면, 올리고뉴클레오티드가 검출용 표지를 포함할 수 있다.

"작동가능하게 연결된" 서열은 당해 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 트랜스로(in trans) 또는 거리를 두고 작용하여 당해 유전자를 제어하는 발현 제어 서열 양쪽 모두를 포함한다.

핵산 서열의 정황에서의 용어 "서열 동일성 백분율"은 최대로 상응하도록 정렬되었을 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 의미한다. 서열 동일성 비교의 길이는 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 일반적으로는 적어도 약 18개의 뉴클레오티드, 더욱 일반적으로는 적어도 약 24개의 뉴클레오티드, 전형적으로는 적어도 약 28개의 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로는 적어도 약 32개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 36개, 48개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 신장물에 걸쳐질 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 다수의 상이한 알고리즘들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열들을 <Wisconsin Package Version 10.0> (Genetics Computer Group (GCG) (Madison, Wisconsin)) 내의 프로그램인 FASTA, Gap 또는 Bestfit을 사용하여 비교할 수 있다. FASTA2 및 FASTA3 프로그램을 예를 들어 포함하는 FASTA는 질의 서열과 검색 서열 간의 최상으로 중첩되는 영역들의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다 ([Pearson, (1990) Methods Enzymol. 183:63-98]; [Pearson, (2000) Methods Mol. Biol. 132:185-219]; [Pearson, (1996) Methods Enzymol. 266:227-258]; [Pearson, (1998) J. Mol. Biol. 276:71-84]). 달리 특정되지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리즘에 대한 디폴트 파라메터가 사용된다. 예를 들어, FASTA를 이의 디폴트 파라메터 (단어 크기 6 및 채점 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)와 함께 사용하여 또는 Gap을 GCG 버젼 6.1에서 제공된 이의 디폴트 파라메터와 함께 사용하여 핵산 서열들 간의 서열 동일성 백분율을 결정할 수 있다.

뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 달리 특정되지 않는 한 이의 상보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 이의 상보성 서열을 갖는 상보성 가닥을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

아미노산 서열의 정황에서의 용어 "서열 동일성 백분율"은 최대로 상응하도록 정렬되었을 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 의미한다. 서열 동일성 비교의 길이는 적어도 약 5개의 아미노산, 일반적으로는 적어도 약 20개의 아미노산, 더욱 일반적으로는 적어도 약 30개의 아미노산, 전형적으로는 적어도 약 50개의 아미노산, 더욱 전형적으로는 적어도 약 100개의 아미노산, 더욱 더 전형적으로는 약 150개, 200개 또는 그 이상의 아미노산의 신장물에 걸쳐질 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 다수의 상이한 알고리즘들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 아미노산 서열들을 <Wisconsin Package Version 10.0> (Genetics Computer Group (GCG) (Madison, Wisconsin)) 내의 프로그램인 FASTA, Gap 또는 Bestfit을 사용하여 비교할 수 있다.

폴리펩티드들에 대한 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 전형적으로 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형 (보존적 아미노산 치환 포함)에 할당된 유사성의 척도를 사용하여 서열들을 매칭시킨다. 예를 들어, GCG는 밀접하게 관련된 폴리펩티드들, 예컨대 상이한 종의 생물들로부터의 상동성 폴리펩티드들 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성, 또는 야생형 단백질과 이의 유사체 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 프로그램에 의해 특정된 디폴트 파라메터와 함께 사용될 수 있는 "Gap" 및 "Bestfit"과 같은 프로그램을 함유한다. 예를 들어, GCG 버젼 6.1 (University of Wisconsin, WI) 참조. 디폴트 파라메터 또는 권장 파라메터를 사용하여 FASTA를 사용하여 폴리펩티드 서열들을 또한 비교할 수 있다 (GCG 버젼 6.1 참조). FASTA (예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 질의 서열과 검색 서열 간의 최상으로 중첩되는 영역들의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다 ([Pearson, (1990) Methods Enzymol. 183:63-98]; [Pearson, (2000) Methods Mol. Biol. 132:185-219]). 본 발명의 서열을 상이한 생물들로부터의 다수의 서열들을 함유하는 데이터베이스에 비교하는 경우 또다른 바람직한 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp 또는 tblastn이고, 이때 프로그램에서 공급된 디폴트 파라메터가 사용된다. 예를 들어, [Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402] 참조.

상동성에 대해 비교되는 폴리펩티드 서열들의 길이는 일반적으로 적어도 약 16개의 아미노산 잔기, 일반적으로 적어도 약 20개의 잔기, 더욱 일반적으로는 적어도 약 24개의 잔기, 전형적으로는 적어도 약 28개의 잔기, 바람직하게는 약 35개를 초과하는 잔기일 것이다. 다수의 상이한 생물들로부터의 서열을 함유하는 데이터베이스를 검색하는 경우, 아미노산 서열들을 비교하는 것이 바람직하다.

본원에서 언급된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 염기 10개 이상인 중합체 형태의 뉴클레오티드로서, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 어느 한쪽 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 의미한다. 이 용어는 단일 또는 이중 가닥 형태를 포함한다.

용어 "폴리펩티드"는 단백질 서열의 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 결실이 있지만 나머지 아미노산 서열이 천연-발생 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단편은 적어도 5개, 6개, 8개 또는 10개의 아미노산의 길이이다.. 또다른 실시양태에서, 단편은 적어도 14개, 적어도 20개, 적어도 50개, 또는 적어도 70개, 80개, 90개, 100개, 150개 또는 200개의 아미노산의 길이다.

본원에서 사용된 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포를 의미할 뿐만 아니라, 이같은 세포의 후손을 또한 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이같은 후손은 실제로는 어버이 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다.

샘플의 적어도 약 60％ 내지 75％가 단일 종의 폴리펩티드를 나타내는 경우 단백질 또는 폴리펩티드는 "실질적으로 순수"하거나, "실질적으로 균질성"이거나, 또는 "실질적으로 정제"된 것이다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체성 또는 다량체성일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 전형적으로 단백질 샘플의 약 50％, 60％, 70％, 80％ 또는 90％ w/w, 더욱 일반적으로는 약 95％를 이룰 것이고, 바람직하게는 99％를 초과하여 순수할 수 있다. 당업계에 주지된 다수의 수단에 의해, 예컨대 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 이어서 당업계에 주지된 염료로 젤을 염색했을 때 단일 폴리펩티드 밴드가 시각화되는 것에 의해 단백질 순도 또는 균질성이 지시될 수 있다. 당업자가 이해할 바와 같이, HPLC 또는 정제 업계에 주지된 기타 수단을 사용함으로써 더 높은 분해능이 제공될 수 있다.

핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때의 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적인 서열 유사성"은 적합한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실과 함께 또다른 핵산 (또는 이의 상보성 가닥)과 최적으로 정렬되었을 때, 상기 논의된 바와 같이, 임의의 주지된 서열 동일성 알고리즘, 예컨대 FASTA, BLAST 또는 Gap에 의해 측정시, 뉴클레오티드 염기의 적어도 약 85％, 바람직하게는 적어도 약 90％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％에 뉴클레오티드 서열 동일성이 있다는 것을 의미한다.

폴리펩티드에 적용되는 경우, 용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적인 유사성"은 최적으로 정렬되었을 때, 예컨대 프로그램과 함께 공급된 디폴트 갭 가중치를 사용하여 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 2개의 아미노산 서열이 적어도 70％, 75％ 또는 80％ 서열 유사성, 바람직하게는 적어도 90％ 또는 95％ 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 서열 동일성을 공유한다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.

본원에서 사용된 용어 "표면 플라즈몬 공명"은 BIACORE™ 시스템 (Pharmacia Biosensor AB (Uppsala, Sweden & Piscataway, N.J.))을 예를 들어 사용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변경을 검출함으로써 생체특이적 상호작용을 실시간으로 분석하도록 하는 광학 현상을 지칭한다. 추가적인 설명을 위해, [Jonsson U. et al., (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26]; [Jonsson U. et al., (1991) Biotechniques 11:620-627]; [Jonsson B. et al., (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131]; 및 [Johnsson B. et al., (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참조한다.

"치료적 유효량"은 치료될 장애의 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬, 투여될 치료제의 양을 지칭한다. 류머티스성 관절염의 치료와 관련하여, 치료적 유효량은 하기의 효과들 중 하나 이상이 있는 양을 지칭한다: 관절의 구조적 손상을 감소시킴; 관절 영역 내의 체액 축적을 억제함 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 및 류머티스성 관절염과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킴 (또는, 바람직하게는 제거함).

"치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 이의 부수적인 증상을 경감시키거나 폐지하는 방법을 지칭한다. 다양한 자가면역 질환, 예컨대 류머티스성 관절염, 죽상동맥경화증, 육아종성 질환 및 다발성 경화증과 관련하여, 간단하게 이러한 용어는 자가면역 질환에 걸린 개체의 여명이 증가될 것임을 의미하거나, 또는 질환의 증상들 중 하나 이상이 감소될 것임을 의미한다.

특정 유전자와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "이용하다"는 항체 내의 특정 영역의 아미노산 서열이 B-세포 성숙 동안 이러한 서열로부터 궁극적으로 유래된다는 것을 의미한다. 예를 들어, "인간 V_H-3 패밀리 유전자를 이용하는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열"이라는 구절은 항체의 V_H 영역이 B-세포 성숙 동안 VH-3 패밀리의 유전자 절편으로부터 유래된 상황을 지칭한다. 인간 B-세포에서, 30가지를 초과하는 별개의 기능성 중쇄 가변 유전자들이 있고, 이들과 함께 항체가 생성된다. 따라서, 특정 중쇄 가변 유전자의 사용은 항원에의 결합 및 기능적 활성의 조합된 성질과 관련하여 항체-항원 상호작용의 바람직한 결합 모티프를 가리킨다. 명백할 바와 같이, 유전자 이용 분석은 항체 구조의 한정된 개관만을 제공한다. 인간 B-세포는 확률적으로 V-D-J 중쇄 또는 V-J 카파 경쇄 전사물을 생성하기 때문에, 다수의 2차 프로세스가 발생하고, 여기에는 체세포 과돌연변이, n-부가, 및 CDR3 확장이 비제한적으로 포함된다. 예를 들어, [Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)] 참조.

본원에서 사용된 20개의 통상적인 아미노산 및 이의 약자는 통상적인 용법을 따른다. [Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991))] 참조.

본원에서 사용된 용어 "벡터"는 자신이 연결된 또다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 추가적인 DNA 절편이 내부로 결찰될 수 있는 플라스미드, 즉, DNA의 원형 이중-가닥 조각이다. 한 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 이때 추가적인 DNA 절편은 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 한 실시양태에서, 벡터는 자신이 도입되는 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아성 복제 기원이 있는 박테리아 벡터, 및 에피솜성 포유류 벡터). 또다른 실시양태에서, 벡터 (예를 들어, 비-에피솜성 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 자신이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터는 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 본원에서 지칭된다.

본원에서 사용된 용어 "표지" 또는 "표지된"은 항체 내의 또다른 분자의 혼입을 지칭한다. 한 실시양태에서, 표지는 검출가능한 마커, 예를 들어, 방사성표지된 아미노산이 혼입되는 것 또는 마킹(marking)된 아비딘에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티가 폴리펩티드에 부착되는 것이다 (예를 들어, 광학 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 효소적 활성 또는 형광 마커를 함유하는 스트렙타비딘). 또다른 실시양태에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예를 들어, 약물 접합체 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 사용될 수 있다. 폴리펩티드용 표지의 예로는 방사성 동위원소 또는 방사성핵종, 형광 표지 (예를 들어, FITC, 로다민, 란탄계열 인광체), 효소성 표지, 화학발광 마커, 비오티닐 기, 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 정해진 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자성 작용제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트, 독소 예컨대 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 이의 유사체 또는 상동체가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해, 다양한 길이의 스페이서 팔에 의해 표지가 부착된다.

항체가 포유류 세포 배양에서 발현되는 경우 하나 이상의 카르복시펩티다제의 활성의 결과로, 항체가 재조합에 의해 생산되는 경우 본 발명의 항-CD44 항체의 중쇄의 C-말단 라이신이 절단될 수 있다 ([Lewis D. A., et al., Anal. Chem, 66(5):585-95 (1994)]; [Harris R. J., J. of Chromotography A, 705: 129-134 (1995)]). 공지된 또는 신규 유형의 생체내 (번역후) 변형으로부터 또는 자발적인 (비-효소성) 단백질 분해, 예컨대 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파라긴 잔기의 아스파르테이트 이성화 및 탈아미드화, 또는 숙신이미드 형성으로부터 초래되어, 재조합에 의해 생산된 항체에서 예상 구조로부터의 다수의 변형이 발견될 수 있다.

인간 항-CD44 항체 및 이의 특성화

본 발명은 인간 CD44에 결합하는 단리된 인간 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 본 발명의 다양한 양상은 이같은 항체 및 항원-결합 부분, 및 이의 제약 조성물, 뿐만 아니라 이같은 항체 및 항원-결합 부분의 제조를 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 시험관 내에서 또는 생체 내에서, 인간 CD44를 검출하거나 인간 CD44 활성을 억제하기 위해 본 발명의 항체 및 항원-결합 부분을 사용하는 방법이 본 발명에 또한 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따른 인간 항-CD44 항체는 비-인간 또는 비-인간-유래 모노클로날 항체 (Mab)에 고유한 면역원성 및 알레르기성 응답을 최소화하고, 따라서 투여된 항체의 효능 및 안정성을 증가시킨다. 완전히 인간형인 항체의 사용은 반복된 항체 투여를 필요로 할 수 있는 만성 및 재발성 인간 질환, 예컨대 류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염, 죽상동맥경화증, 육아종성 질환, 다발성 경화증, 천식, 크론병, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 판상형 건선 및 암의 치료에서 실질적인 장점을 제공한다.

인간을 포함하는 여러 종으로부터의 CD44 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다; 서열 1 및 2 (예를 들어, 접속 번호 NM_001001391 참조). 인간 CD44, 또는 이의 항원성 부분을 당업계에 주지된 방법에 따라 제조할 수 있거나, 또는 판매자 (예를 들어, R&D Systems 카탈로그 번호 861-PC-100)로부터 구입할 수 있다. 사이노몰구스 원숭이로부터의 CD44 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있지 않고, 본원에 개시된다; 서열 5, 7 (아미노산), 8 및 153 (핵산).

일부 실시양태에서, 인간 항-CD44 항체는 트랜스제닉 동물이 인간 항체를 생산하도록 게놈이 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 비-인간 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 설치류를 면역화시킴으로써 생산된다. 일부 실시양태에서, 항-CD44 항체 및 항원-결합 부분은 HA 결합 부위에 결합하는 항체 또는 항원-결합 부분을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명은 서열 17, 53, 89 및 125 중 어느 하나, 또는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 17, 53, 89 및 125 중 어느 하나와 상이한 서열로부터 독립적으로 선택된 V_H CDR1; 서열 19, 55, 91 및 127 중 어느 하나, 또는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 19, 55, 91 및 127 중 어느 하나와 상이한 서열로부터 독립적으로 선택된 V_H CDR2; 및 서열 21, 57, 93 및 129 중 어느 하나, 또는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 21, 57, 93 및 129 중 어느 하나와 상이한 서열로부터 독립적으로 선택된 V_H CDR3로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 예를 들어, 상기 언급된 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 각각의 열거된 서열과 각각 독립적으로 상이할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 23, 59, 95 및 131 중 어느 하나, 또는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 23, 59, 95 및 131 중 어느 하나와 상이한 서열로부터 독립적으로 선택된 V_L CDR1; 서열 25, 61, 97 및 133 중 어느 하나, 또는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 25, 61, 97 및 133 중 어느 하나와 상이한 서열로부터 독립적으로 선택된 V_L CDR2; 및 서열 27, 63, 99 및 137 중 어느 하나, 또는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 27, 63, 99 및 137 중 어느 하나와 상이한 서열로부터 독립적으로 선택된 V_L CDR3로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 예를 들어, 상기 언급된 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 각각의 열거된 서열과 각각 독립적으로 상이할 수 있다.

본 발명의 추가적인 양상에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 서열 17에 기재된 V_H CDR1, 서열 19에 기재된 V_H CDR2, 서열 21에 기재된 V_H CDR3, 서열 23에 기재된 V_L CDR1, 서열 25에 기재된 V_L CDR2 및 서열 27에 기재된 V_L CDR3을 포함한다.

본 발명의 추가적인 양상에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 서열 53에 기재된 V_H CDR1, 서열 55에 기재된 V_H CDR2, 서열 57에 기재된 V_H CDR3, 서열 59에 기재된 V_L CDR1, 서열 61에 기재된 V_L CDR2 및 서열 63에 기재된 V_L CDR3을 포함한다.

본 발명의 추가적인 양상에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 서열 89에 기재된 V_H CDR1, 서열 91에 기재된 V_H CDR2, 서열 93에 기재된 V_H CDR3, 서열 95에 기재된 V_L CDR1, 서열 97에 기재된 V_L CDR2 및 서열 99에 기재된 V_L CDR3을 포함한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 서열 125에 기재된 V_H CDR1, 서열 127에 기재된 V_H CDR2, 서열 129에 기재된 V_H CDR3, 서열 131에 기재된 V_L CDR1, 서열 133에 기재된 V_L CDR2 및 서열 135에 기재된 V_L CDR3을 포함한다.

추가적인 실시양태에서, 상기 언급된 V_H 및 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들 또한 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 상기 열거된 특정 서열과 각각 독립적으로 상이할 수 있다. 예를 들어, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 상기 열거된 각각의 특정 서열과 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 각각 독립적으로 상이할 수 있다.

본 발명은 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 및 10C8.2.3 중 어느 하나에서 발견되는 바와 같은 V_H 및 V_L CDR1, V_H 및 V_L CDR2, 및 V_H 및 V_L CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 추가로 제공한다.

추가적인 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 11, 47, 83 및 119 중 어느 하나이거나, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 11, 47, 83 및 119 중 어느 하나와 상이한 V_H 도메인을 포함한다. 예를 들어, V_H 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 11, 47, 83 및 119 중 어느 하나와 상이할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 임의의 이러한 보존적 아미노산 치환은 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 영역에서 일어날 수 있다.

본 발명의 추가적인 양상은 서열 11, 47, 83 및 119 중 어느 하나에 대해 아미노산 서열이 적어도 90％, 바람직하게는 95％, 더욱 바람직하게는 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 V_H 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다.

추가적인 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 15, 51, 87 및 123 중 어느 하나이거나, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 15, 51, 87 및 123 중 어느 하나와 상이한 V_L 도메인을 포함한다. 예를 들어, V_L 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 15, 51, 87 및 123 중 어느 하나와 상이할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 임의의 이러한 보존적 아미노산 치환은 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 영역에서 일어날 수 있다.

본 발명의 추가적인 양상은 서열 15, 51, 87 및 123 중 어느 하나에 대해 아미노산 서열이 적어도 90％, 바람직하게는 95％, 더욱 바람직하게는 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다.

본 발명의 또다른 양상에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 a) 서열 11에 기재된 V_H 도메인 및 서열 15에 기재된 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분; b) 서열 47에 기재된 V_H 도메인 및 서열 51에 기재된 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분; c) 서열 83에 기재된 V_H 도메인 및 서열 87에 기재된 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분; 및 d) 서열 119에 기재된 V_H 도메인 및 서열 123에 기재된 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가적인 실시양태에서, a) 내지 d) 군에서 상기 기술된 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 대해, V_H 및/또는 V_L 도메인은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 본원에서 열거된 특정 서열과 상이할 수 있다. 예를 들어, V_H 및/또는 V_L 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 보존적 아미노산 치환에 의해 열거된 서열과 상이할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 임의의 이러한 보존적 아미노산 치환은 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 영역에서 일어날 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명은 a) 서열 9에 대해 아미노산 서열이 적어도 90％, 바람직하게는 95％, 더욱 바람직하게는 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 중쇄, 및 서열 13에 대해 아미노산 서열이 적어도 90％, 바람직하게는 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분; b) 서열 45에 대해 아미노산 서열이 적어도 90％ 동일한 중쇄, 및 서열 49에 대해 적어도 95％, 바람직하게는 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분; c) 서열 81에 대해 적어도 95％, 바람직하게는 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 중쇄, 및 서열 85에 대해 95％, 바람직하게는 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분; 및 d) 서열 117에 대해 적어도 90％ 동일한 중쇄, 및 서열 121에 대해 바람직하게는 95％, 더욱 바람직하게는 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열 9에 기재된 중쇄, 및 서열 13에 기재된 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분; b) 서열 45에 기재된 중쇄, 및 서열 49에 기재된 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분; c) 서열 81에 기재된 중쇄, 및 서열 85에 기재된 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분; 및 d) 서열 117에 기재된 중쇄, 및 서열 121에 기재된 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CD44 항체의 중쇄의 C-말단 라이신이 절단된다 ([Lewis D. A., et al., Anal. Chem, 66(5):585-95 (1994)]; [Harris R. J., J. of Chromotography, 705: 129-134 (1995)]).

본 발명의 다양한 실시양태에서, 항-CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄(들)은 신호 서열을 임의로 포함할 수 있다.

본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 기술된 바와 같은 이의 CDR(들)에 하기 A) 내지 G)에서 기술된 바와 같은 여러 기능적 성질들 중 하나 이상이 있는, CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 추가로 제공한다.

A) 예를 들어, 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정했을 때 1000 nM 이하의 K_D로 CD44에 결합한다. 추가적인 실시양태에서, 항체 또는 일부분은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정했을 때 500 nM 미만, 바람직하게는 100 nM 미만, 50 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 900 pM 미만, 800 pM 미만, 700 pM 미만, 600 pM 미만, 500 pM 미만, 또는 100 pM 미만의 K_D로 CD44에 결합한다. 전형적으로, K_D 값에 대한 하한은 없다. 그러나, 실용적인 목적을 위해, 하한이 약 1 pM인 것으로 가정될 수 있다.

B) 또다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항체-결합 부분은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정했을 때 CD44에 대한 오프 속도 (k_off)가 0.01 ^s-1 이하이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체 또는 일부분은 CD44에 대한 k_off가 0.005 ^s-1 미만, 0.004 ^s-1 미만, 0.003 ^s-1 미만, 0.002 ^s-1 미만, 또는 0.001 ^s-1 미만이다. 전형적으로, k_off 값에 대한 하한은 없다. 그러나, 실용적인 목적을 위해, 하한이 약 1×10^{-7 s-1}인 것으로 가정될 수 있다.

C) 추가적인 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 FACS 또는 ELISA 결합 분석법에 의해 측정했을 때 500 nM 미만, 75 ㎍/㎖의 EC₅₀으로 CD44에 결합한다. 추가적인 실시양태에서, 항체 또는 일부분은 ELISA에 의해 측정했을 때 100 nM 미만, 50 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 또는 100 pM 미만의 EC₅₀으로 CD44에 결합한다. 바람직하게는, 항체 또는 일부분은 10 nM 미만, 1.5 ㎍/㎖의 EC₅₀으로 CD44에 결합한다. 전형적으로, EC₅₀ 값에 대한 하한은 없다. 그러나, 실용적인 목적을 위해, 하한이 약 1 pM인 것으로 가정될 수 있다.

D) 추가적인 또다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 ELISA 결합 분석법에 의해 측정했을 때 CD44와 HA 간의 상호작용을 500 nM 미만, 75 ㎍/㎖의 IC₅₀으로 억제한다. 추가적인 실시양태에서, 항체 또는 일부분은 ELISA 결합 분석법에 의해 측정했을 때 100 nM 미만, 50 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 또는 100 pM 미만의 IC₅₀으로 CD44에 결합한다.

E) 또다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 FACS에 의해 측정했을 때 약 100 nM 미만의 IC₅₀에서 단핵구에서의 생체내 표면 발현을 억제한다.

F) 또다른 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 FACS에 의해 측정했을 때 50 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 또는 100 pM 미만, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 또는 약 5 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 CD44 수용체의 표면 발현을 감소시킨다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 부분은 30 nM 미만, 4.5 ㎍/㎖의 IC₅₀으로 CD44 수용체의 표면 발현을 감소시킨다. 실용적인 목적을 위해, 하한이 약 1 pM인 것으로 가정될 수 있다.

G) 또다른 실시양태에서, 항-CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 림프관 내피 히알루로난 수용체 1 단백질 (LYVE-1)에 비해 CD44에 대한 선택성이 100배 이상이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3로 지정된 인간 항-CD44 모노클로날 항체 (mAb): 및 이들을 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 본 출원의 표 1 및 9-12는 전장 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산, 상응하는 전장 추정 아미노산 서열, 및 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열의 서열 식별인자 (서열 번호)을 나타낸다.

실시양태들에서, 항체들은 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3으로 지정된 IgG이다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분 또는 항체 도메인의 특정 아미노산 서열이 표 9, 10, 11 & 12, 및 도 2에서 기술된다.

변형 실시양태에서, CD44 항체의 V_L은 인간 유전자의 생식계통 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD44 항체의 V_L은 생식계통 아미노산 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 생식계통으로부터의 이러한 치환 중 하나 이상은 경쇄의 CDR 영역에 있다. 한 실시양태에서, 생식계통에 대한 아미노산 치환은 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3의 V_L 중 어느 하나 이상에서의 생식계통에 대한 치환과 동일한 위치들 중 하나 이상에 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD44 항체의 V_L은 항체 1A9.A6.B9의 V_L에서 발견되는 생식계통과 비교해서 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화는 동일한 위치들 중 하나 이상에 있지만, 기준 항체에서와 상이한 치환을 수반한다.

한 실시양태에서, 생식계통에 대한 아미노산 변화는 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 및 10C8.2.3의 임의의 V_L에서와 동일한 위치들 중 하나 이상에서 일어나지만, 변화는 기준 항체에서의 아미노산에 비해 이같은 위치(들)에서의 보존적 아미노산 치환을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체들 중 하나에서의 특정 위치가 생식계통에 비해 변화되고, 글루타메이트인 경우, 이러한 위치에서 아스파르테이트로 치환할 수 있다. 유사하게, 생식계통과 비교하여 아미노산 치환이 세린인 경우, 이러한 위치에서 세린을 트레오닌으로 보존적으로 치환할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 상기 논의되어 있다.

일부 실시양태에서, 인간 항-CD44 항체의 경쇄는 항체 1A9.A6.B9 (서열 15); 2D1.A3.D12 (서열 51); 14G9.B8.B4 (서열 87) 또는 10C8.2.3 (서열 123)의 V_L 아미노산 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개까지의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3개까지의 비-보존적 아미노산 치환이 있는 상기 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 상기 항체들 중 어느 하나의 CDR1의 시작점에서 CDR3의 종점까지의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 경쇄는 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 및 10C8.2.3의 경쇄의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3로부터 각각 독립적으로 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역, 또는 각각 4개 미만 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3개 이하의 비-보존적 아미노산 치환이 있는 CDR 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD44 항체의 경쇄는 모노클로날 항체 1A9.A6.B9 (서열 13); 2D1.A3.D12 (서열 49); 14G9.B8.B4 (서열 85) 또는 10C8.2.3 (서열 121)의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역으로부터 각각 독립적으로 선택된 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-CD44 항체의 경쇄는 1A9.A6.B9 (서열 15); 2D1.A3.D12 (서열 51); 14G9.B8.B4 (서열 87) 또는 10C8.2.3 (서열 123)으로부터 선택된 항체의 V_L 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역, 또는 각각 4개 미만 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3개 이하의 비-보존적 아미노산 치환이 있는 상기 CDR 영역을 포함한다.

본 발명의 항-CD44 항체는 인간 카파 또는 인간 람다 경쇄 또는 이로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 카파 경쇄를 포함하는 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인 (V_L)은 인간 V_κ1, V_κ2 또는 V_κ3 패밀리 유전자에 의해 부분적으로 코딩된다. 특정 실시양태에서, 경쇄는 인간, 또는 원숭이 아미노산 서열 또는 이의 조합물을 이용한다.

중쇄와 관련하여, 한 실시양태에서, 가변 도메인 (V_H)은 부분적으로 인간 유전자에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 항-CD44 항체의 V_H 서열은 생식계통 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입 (부가)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 중쇄의 가변 도메인은 생식계통 아미노산 서열로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 또는 17개의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이(들)은 생식계통 아미노산 서열과 비교하여 비-보존적 치환, 결실 또는 삽입이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 중쇄의 CDR 영역에 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화는 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 또는 10C8.2.3의 V_H 중 어느 하나 이상에서의 생식계통으로부터의 돌연변이와 동일한 위치들 중 하나 이상에서 이루어진다. 또다른 실시양태에서, 아미노산 변화는 동일한 위치들 중 하나 이상에 있지만, 기준 항체에서와 상이한 돌연변이를 수반한다.

일부 실시양태에서, 중쇄는 항체 1A9.A6.B9 (서열 11); 2D1.A3.D12 (서열 47); 14G9.B8.B4 (서열 83) 또는 10C8.2.3 (서열 119)의 V_H 아미노산 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 6개, 8개, 또는 10개까지의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3개까지의 비-보존적 아미노산 치환이 있는 상기 V_H 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 상기 항체들 중 어느 하나의 CDR1의 시작점에서 CDR3의 종점까지의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 중쇄는 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 또는 10C8.2.3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역, 또는 각각 8개 미만, 6개 미만, 4개 미만, 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3개 이하의 비-보존적 아미노산 치환이 있는 상기 CDR 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 CDR 영역은 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 또는 10C8.2.3의 CDR 영역들로부터 독립적으로 선택된다. 또다른 실시양태에서, 중쇄는 1A9.A6.B9 (서열 11); 2D1.A3.D12 (서열 47); 14G9.B8.B4 (서열 83) 또는 10C8.2.3 (서열 119)로부터 선택된 2개 이상의 V_H 영역으로부터 독립적으로 선택된 CDR 영역을 포함한다.

또다른 실시양태에서, 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR은 동일한 항체로부터의 것이다.

이루어질 수 있는 한가지 유형의 아미노산 치환은 화학적으로 활성일 수 있는 항체 내의 하나 이상의 시스테인을 또다른 잔기, 예컨대 비제한적으로 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 한 실시양태에서, 비-정규 시스테인이 치환된다. 치환은 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 항체의 불변 도메인에서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 정규 시스테인이다.

이루어질 수 있는 또다른 유형의 아미노산 치환은 항체 내의 임의의 잠재적인 단백질분해성 부위를 변화시키는 것이다. 이같은 부위는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 항체의 불변 도메인에서 발생할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질분해성 부위의 제거는 항체 제품 내의 임의의 비균질성의 위험을 감소시킬 수 있고, 따라서 이의 균질성을 증가시킬 수 있다. 또다른 유형의 아미노산 치환은 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 잔기들 중 하나 또는 양쪽 모두를 변화시킴으로써 제거하는 것이다.

본 발명의 실시양태들에서, 항-CD44 항체의 중쇄 및 경쇄는 신호 서열을 임의로 포함할 수 있다.

한 양상에서, 본 발명은 4개의 바람직한 억제성 인간 항-CD44 모노클로날 항체 및 이들을 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 표 1은 중쇄 및 경쇄의 전장 및 가변 도메인-포함 부분을 코딩하는 핵산, 및 상응하는 또는 추정 아미노산 서열의 서열 식별인자를 열거한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 모노클로날 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 또는 10C8.2.3의 중쇄 및 경쇄 변이체를 제공한다. 본 발명의 실시예 3에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 생식계통 CDR 영역에서의 것들과 매칭되도록 수많은 중쇄 및 경쇄 변이체 돌연변이가 이루어졌다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, g-1A9.A6.B9, g-2D1.A3.D12, g-14G9.B8.B4 및 g-10C8.2.3은 각각 1A9.A6.B9, 2D1.A3.D12, 14G9.B8.B4, 및 10C8.2.3의 생식계통화(germlining) 버젼이다. 생식계통화 버젼에 도달하도록 돌연변이된 특정 아미노산들은 생식계통화 대 비-생식계통화 항체의 서열들을 비교함으로써 당업자에게 명백하다. 예를 들어, 본 발명은 잔기 28의 트레오닌이 이소류신으로 변화되는, 항체 2D1.A3.D12의 중쇄에서의 하나의 아미노산 치환을 제공한다. 2번째 점 돌연변이는 항체 2D1.A3.D12의 경쇄 내에 있고, 잔기 38의 글루타민을 히스티딘으로 치환한다.

명백할 바와 같이, 유전자 이용 분석은 항체 구조의 한정된 개관만을 제공한다. 인간 B-세포는 확률적으로 V-D-J 중쇄 또는 V-J 카파 경쇄 전사물을 생성하기 때문에, 다수의 2차 프로세스가 발생하고, 여기에는 체세포 과돌연변이, n-부가, 및 CDR3 확장이 비제한적으로 포함된다. 예를 들어, [Mendez et al., (1997) Nature Genetics 15:146-156] 및 미국 특허 출원 공보 번호 2003-0070185 참조. 따라서, 본 발명의 항체 구조를 추가로 시험하기 위해, 항체의 예상 아미노산 서열이 클론으로부터 수득된 cDNA로부터 생성되었다. 또한, N-말단 아미노산 서열이 단백질 서열분석을 통해 수득되었다. 하기의 표 2는 항-CD44 하이브리도마에서 유래된 4개의 항체의 생식계통 유전자 절편 사용 및 이소타입을 도해한다.

별법적인 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD44에 특이적으로 결합하고 1) V_H D4-17 및 V_LL6; 2) V_H D3-10 및 V_LA27; 및 3) V_H D6-19 및 V_LA27로 이루어진 군으로부터 선택된 V_H 및 V_L 유전자 이용이 있는 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다.

또다른 실시양태는 Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 단일 사슬 V_H 단편, 단일 사슬 V_L 단편, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이중특이적 항체인 임의의 상기 기술된 항체 또는 항원-결합 부분을 제공한다.

추가적인 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 일부분 중 임의의 것 및 하나 이상의 추가적인 분자성 본체(entity)를 포함하는 유도체화 항체 또는 항원-결합 부분이 제공된다. 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 분자성 본체는 또다른 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체 또는 디아바디), 검출제, 표지, 세포독성제, 약제, 및/또는 항체 또는 항원-결합 부분과 또다른 분자 (예컨대 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드, 및/또는 항체 또는 항원-결합 부분에 연결 또는 융합 (융합 단백질)된 캐리어 단백질 (예를 들어, 혈액 단백질, 알부민 또는 트랜스페린)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분이 이와 함께 유도체화될 수 있는 유용한 검출제에는 형광 화합물, 특히 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 파이코에리트린, 란탄계열 인광체가 포함된다. 항체는 검출에 유용한 효소, 예를 들어, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 산화효소로 또한 표지될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 비오틴으로, 또는 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 정해진 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)로 또한 표지될 수 있다. 본 발명의 추가적인 실시양태에서, 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 화학기 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄수화물 기로 또한 유도체화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 CD44 항체 또는 항원-결합 부분이 고체 지지체 또는 입자에 부착된다. 이같은 입자는 생체내 또는 시험관내 진단 용도를 위해 사용될 수 있다.

항-CD44 항체의 클래스 및 서브클래스

CD44 항체의 클래스 (예를 들어, IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD) 및 서브클래스 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)를 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 서브클래스를 항체의 특정 클래스 및 서브클래스에 특이적인 항체를 사용하여 결정할 수 있다. 이같은 항체는 시판된다. ELISA, 또는 웨스턴 블롯, 뿐만 아니라 기타 기술에 의해 클래스 및 서브클래스를 결정할 수 있다. 별법적으로, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인 전체 또는 이의 일부를 서열분석하는 단계, 이들의 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 클래스 및 서브클래스의 공지된 아미노산 서열과 비교하는 단계, 및 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정하는 단계에 의해 클래스 및 서브클래스를 결정할 수 있다. 본 발명의 CD44 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있다. 예를 들어, CD44 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브클래스인 IgG일 수 있다.

본 발명의 한 양상은 CD44 항체의 클래스 또는 서브클래스를 또다른 클래스 또는 서브클래스로 전환시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, C_L 또는 C_H를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 V_L 또는 V_H를 코딩하는 핵산 분자가 당업계에 주지된 방법을 사용하여 단리된다. 그후, 이러한 핵산 분자가 원하는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스로부터의 C_L 또는 C_H를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 이는 상기 기술된 바와 같이 C_L 또는 C_H 사슬을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 원래는 IgM인 CD44 항체를 IgG로 클래스를 전환시킬 수 있다. 또한, 클래스 전환을 사용하여 한 IgG 서브클래스를 또다른 IgG 서브클래스로, 예를 들어, IgG1에서 IgG2로 변환시킬 수 있다. 원하는 이소타입을 포함하는 본 발명의 항체를 생산하는 또다른 방법은 CD44 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 및 CD44 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산을 단리하는 단계, V_H 영역을 코딩하는 서열을 단리하는 단계, V_H 서열을 원하는 이소타입의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열에 결찰시키는 단계, 경쇄 유전자 및 중쇄 구축물을 세포에서 발현시키는 단계, 및 원하는 이소타입의 CD44 항체를 수집하는 단계를 포함한다.

종 및 분자 선택성

본 발명의 또다른 양상에서, 항-CD44 항체는 종 선택성 및 분자 선택성 양쪽 모두를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 항-CD44 항체는 인간 및 영장류 CD44에 결합한다. 바람직하게는, 항-CD44는 인간, 및 사이노몰구스 원숭이 CD44에 결합한다. 본 명세서의 교시내용에 따라, 당업계에 주지된 방법을 사용하여 항-CD44 항체에 대한 종 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, 유동 세포측정법, ELISA, 면역침전 또는 RIA를 사용하여 종 선택성을 결정할 수 있다 (예를 들어, 실시예 5 참조).

또다른 실시양태에서, 항-CD44 항체는 림프관 내피 히알루로난 수용체 1 단백질 (LYVE-1)에 비해 적어도 100배만큼의 CD44에 대한 선택성이 있다 (실시예 11 참조). 본 명세서의 교시내용에 따라 당업계에 주지된 방법을 사용하여 CD44에 대한 항-CD44 항체의 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, 유동 세포측정법, ELISA, 면역침전 또는 RIA를 사용하여 선택성을 결정할 수 있다.

CD44에 대한 항-CD44 항체의 결합 친화력

한 실시양태에서, 항-CD44 항체는 포유류 CD44, 바람직하게는 인간 CD44에 높은 친화력으로 결합한다.

한 실시양태에서, 항-CD44 항체는 HA 결합 도메인 내에서 결합한다.

또다른 실시양태에서, 항-CD44 항체는 서열 3 (세포외 도메인 IgG 융합물) 또는 서열 154 (원숭이 세포외 IgG 융합물)에 기재된 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드에 높은 친화력으로 결합하고, 바람직하게는 HA 결합 도메인의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드에 높은 친화력으로 결합한다.

또다른 실시양태에서, 항-CD44 항체는 500 nM 이하의 K_D로 CD44, 더욱 바람직하게는 HA 결합 도메인에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 2×10^-8 M, 2×10^-9 M, 또는 5×10^-10 M 이하의 K_D로 CD44, 더욱 바람직하게는 CD44의 HA 결합 도메인에 결합한다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 항체는 2.5×10^-12 M 이하의 K_D로 HA 결합 도메인에서 CD44에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 또는 10C8.2.3와 실질적으로 동일한 K_D로 CD44에 결합한다.

일부 실시양태에서, 항-CD44 항체는 해리 속도 상수 (k_off)가 낮다. 일부 실시양태에서, 항-CD44 항체는 1.0×10^-3 s-1 이하의 k_off 또는 5.0×10^-4 s^-1 이하의 k_off로 CD44, 더욱 바람직하게는 CD44의 HA 결합 도메인에 결합한다. 또다른 실시양태에서, k_off는 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3로부터 선택된 항체를 포함하는, 본원에 기술된 항체와 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 항체는 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3로부터 선택된 항체로부터의 중쇄의 CDR 영역 또는 경쇄의 CDR 영역을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 k_off로 CD44에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 9, 45, 81 및 117에서 발견되는 V_H 영역의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 서열 13, 49, 85 또는 121에서 발견되는 V_L 영역의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 k_off로 CD44, 더욱 바람직하게는 CD44의 HA 결합 도메인에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 서열 15, 49, 85 또는 121에서 발견되는 V_L 영역의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인의 CDR 영역; 또는 서열 9, 45, 81 및 117에서 발견되는 V_H 영역의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인의 CDR 영역을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 k_off로 CD44, 더욱 바람직하게는 CD44의 HA 결합 도메인에 결합한다.

CD44에 대한 항-CD44 항체의 결합 친화력 및 해리 속도는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. ELISA, RIA, 유동 세포측정법 (FACS), 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 BIACORE™에 의해 결합 친화력이 측정될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명에 의해 해리 속도가 측정될 수 있다. 바람직하게는, 결합 친화력 및 해리 속도가 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다. 더욱 바람직하게는, 결합 친화력 및 해리 속도가 BIACORE™을 사용하여 측정된다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 한 항체의 K_D가 항-CD44 항체와 실질적으로 동일한지 여부를 결정할 수 있다. 실시예 5는 항-CD44 모노클로날 항체의 친화력 상수를 결정하기 위한 방법을 제공한다.

항-CD44 항체에 의해 인식되는 CD44 에피토프의 확인

본 발명은 CD44에 결합하고, (a) 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3으로부터 선택된 항체; (b) 서열 9, 45, 81 및 117에서 발견되는 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체; (c) 서열 13, 49, 85 또는 121에서 발견되는 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는 (d) (b)에서 정의된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 및 (c)에서 정의된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 양쪽 모두를 포함하는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하고/하거나 이와 동일한 에피토프에 결합하는 인간 항-CD44 모노클로날 항체를 제공한다. 2개의 항체가 CD44에 결합하는 것에 대해 서로 상호적으로 경쟁하는 경우, 이들은 교차-경쟁하는 것으로 언급된다.

당업계에 공지된 방법을 사용하여 항체가 항-CD44 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 결합에 대해 이와 교차-경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD44 항체를 포화 조건 하에 CD44에 결합하도록 한 후, CD44에 결합하는 테스트 항체의 능력을 측정한다. 테스트 항체가 항-CD44 항체와 동시에 CD44에 결합할 수 있다면, 테스트 항체는 항-CD44 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 테스트 항체가 동시에 CD44에 결합할 수 없으면, 테스트 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프, 또는 인간 항-CD44 항체에 의해 결합된 에피토프에 아주 근접하는 에피토프에 결합한다. ELISA, RIA, BIACORE™, 또는 유동 세포측정법 (FACS)을 사용하여 이러한 실험을 수행할 수 있다.

항-CD44 항체가 또다른 항-CD44 항체와 교차-경쟁하는지 여부를 테스트하기 위해, 상기 기술된 경쟁 방법을 2가지 방향으로 사용할 수 있고, 즉, 기준 항체가 테스트 항체를 차단하는지 및 이의 역을 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, ELISA를 사용하여 실험이 수행된다. K_D를 결정하는 방법은 하기에 추가로 논의된다.

항-CD44 항체에 의한 CD44 활성의 억제

또다른 실시양태에서, 본 발명은 CD44-매개 신호전달을 억제하는 항-CD44 항체를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 CD44를 통한 림프구 및 단핵구에 대한 공동-자극성 신호전달을 억제하는 항-CD44 항체를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 사이토카인 생산, 특히 TNF-α, IL-6 및 IL-1β와 같은 사이토카인을 차단하는 항-CD44 항체를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD44 수용체에 대한 HA의 결합을 억제하는 항-CD44 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, CD44 수용체는 인간의 수용체이다. 또다른 실시양태에서, 항-CD44 항체는 인간 항체이다. ELISA, RIA, 또는 기타 분석법에 의한 리간드 결합 분석법 및 세포-기반 분석법 예컨대 FACS 분석법 또는 CD44를 발현하는 세포에서 IC₅₀을 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 ELISA 분석법에 의해 측정했을 때 5 ㎍/㎖ 이하, 바람직하게는 1 ㎍/㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 ㎍/㎖ 이하, 더욱 더 바람직하게는 0.20 ㎍/㎖ 이하의 IC₅₀으로 HA와 CD44 간의 리간드 결합을 억제한다. 실시예 4는 모노클로날 항체에 의한 HA에 대한 CD44 결합의 억제를 결정하는 방법을 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 HA에 대한 CD44의 결합을 방지하는 항-CD44 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항-CD44 항체는 HA에 의해 유도된, (i) 백혈구 동원; (ii) 세포-매트릭스 상호작용 및 세포들, 예를 들어, 백혈구 및 내피 세포 간의 직접적인 상호작용; (iii) 백혈구 세포 기능의 조절; (iv) HA의 대사; 및/또는 (v) 매트릭스의 어셈블리, 조직화 및 리모델링에 대한 CD44의 기여를 억제한다. 지질다당류 (LPS) 및 HA에 의해 촉발되는 백혈구로부터의 염증성 사이토카인 방출을 결정함으로써 항-CD44 항체가 HA의 존재 하의 CD44의 활성화를 방지하거나, 억제하거나 감소시킬 수 있는지 여부를 결정할 수 있다. CD44 활성화 및/또는 CD44에 대한 HA 결합을 검출하기 위한 분석법이 실시예 4, 5, 6 및 7에 기술되어 있다. 한 실시양태에서, 사이토카인 분석법을 사용하여 CD44 활성화 수준을 결정할 것이다. 일부 실시양태에서, HA 경쟁 결합 분석법을 사용하여 측정된 IC₅₀은 5 ㎍/㎖ 이하, 바람직하게는 1 ㎍/㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 ㎍/㎖ 이하, 더욱 더 바람직하게는 0.20 ㎍/㎖ 이하이다.

항-CD44 항체에 의한 표면 세포 발현의 감소

본 발명의 또다른 양상에서, 항체는 항체와의 인큐베이션 후 세포 표면 CD44 발현의 하향조절을 야기한다. 한 실시양태에서, 인큐베이션은 단기간 (예를 들어, 4시간) 또는 장기간 (예를 들어, 24시간)일 수 있다. 특히, 본 발명은 순환 림프구, 바람직하게는 CD3+ T 림프구 상에서의 CD44 발현의 하향조절을 유도하는 항-CD44 항체를 제공한다. FACS를 사용하여 세포 표면 CD44 발현의 하향조절을 측정할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 바람직하게는 항체는 FACS에 의해 측정했을 때 세포 표면 CD44 발현의 6％ 감소, 바람직하게는 10％ 감소, 더욱 바람직하게는 20％ 하향조절, 또는 더욱 더 바람직하게는 세포 표면 CD44 발현의 50％ 이상의 감소를 야기할 수 있다. 실시예 8은 인간 및 사이노몰구스 원숭이의 2가지 종에서 백혈구 및 T-세포 상에서의 세포 표면 CD44 발현의 하향조절을 측정하는 FACS 분석법의 한가지 유형을 예시한다.

항체의 생산 방법

통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어, [Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술이 포함되는 다양한 기술에 의해 본 발명의 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 바람직하지만, 원칙적으로, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 또다른 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스성 또는 종양발생성 형질전환을 사용할 수 있다.

하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 뮤린(murine) 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립되어 있는 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항체를 상기 기술된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기초로 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA를 당해 뮤린 하이브리도마로부터 수득하여, 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 조작할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성시키기 위해, 뮤린 가변 영역을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (미국 특허 번호 4,816,567). 인간화 항체를 생성시키기 위해, 뮤린 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다 (미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; 및 6,180,370).

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 부분을 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조믹(transchromosomic) 마우스를 사용하여, CD44에 대해 지시된 이같은 인간 모노클로날 항체가 생성될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스크로모조믹 마우스에는 각각 HuMAb Mouse® 및 KM Mouse®로 본원에서 지칭되는 마우스가 포함되고, 이들은 본원에서 "인간 Ig 마우스"로 총괄적으로 지칭된다.

HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.)는 내인성 μ 및 κ 사슬 좌위를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌위(miniloci)를 함유한다 (예를 들어, [Lonberg, et al. (1994) Nature 368: 856-859] 참조). 따라서, 마우스가 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 응답하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진(transgene)에 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 진행되어, 고친화력 인간 IgGκ 모노클로날 항체가 생성된다 ([Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌]; [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]에서 리뷰됨; [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93], 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]). HuMAb Mouse®의 제조 및 사용, 및 이같은 마우스에 의해 수행되는 게놈 변형이 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656]; [Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724]; [Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830]; [Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591]; 및 [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기술되어 있다. 추가로, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; 미국 특허 번호 5,545,807; PCT 공보 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962; 및 WO 01/14424를 참조한다.

또다른 실시양태에서, 트랜스진 및 트랜스크로모좀(transchomosome) 상의 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 마우스를 사용하여 본 발명의 인간 항체가 상승될 수 있다. "KM 마우스™"으로 본원에서 지칭되는 이같은 마우스는 PCT 공보 번호 WO 02/43478에 상세하게 기술되어 있다.

또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 별법적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 입수가능하고, 본 발명의 항-CD44 항체를 상승시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Xenomouse™ (Abgenix, Inc.)으로 지칭되는 별법적인 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다; 예를 들어, 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584; 및 6,162,963에 이같은 마우스가 기술되어 있다.

또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 별법적인 트랜스크로모조믹 동물 시스템이 당업계에서 입수가능하고, 본 발명의 항-CD44 항체를 상승시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀 양쪽 모두를 보유하는 마우스가 사용될 수 있다; [Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 이같은 마우스가 기술되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 소가 당업계에 기술되어 있고 ([Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894]), 본 발명의 항-CD44 항체를 상승시키는데 사용될 수 있다.

면역화시 인간 항체 응답이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 내부로 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 본 발명의 인간 모노클로날 항체가 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,476,996; 및 5,698,767에 이같은 마우스가 기술되어 있다.

인간 Ig 마우스의 면역화

항체 및 항체-생산 세포주의 생산

동물을 CD44 항원으로 면역화시킨 후, 항체 및/또는 항체-생산 세포를 동물로부터 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 동물을 출혈 또는 희생시킴으로써 동물로부터 항-CD44 항체-함유 혈청이 수득된다. 동물로부터 수득된 그대로 혈청을 사용할 수 있거나, 혈청으로부터 면역글로불린 분획을 수득할 수 있거나, 또는 항-CD44 항체를 혈청으로부터 정제할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체-생산 불멸화 세포주가 면역화된 동물로부터 단리된 세포로부터 제조된다. 면역화 후, 동물을 희생시키고, 림프절 및/또는 지라 B 세포를 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 불멸화시킨다. 세포를 불멸화시키는 방법은 종양유전자로 형질감염시키는 것, 세포를 종양발생성 바이러스로 감염시키고 세포를 불멸화 세포를 선별하는 조건 하에 배양하는 것, 세포에 발암성 또는 돌연변이화 화합물을 적용하는 것, 세포를 불멸화 세포, 예를 들어, 골수종 세포와 융합시키는 것, 및 종양 억제인자 유전자를 불활성화시키는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, [Harlow and Lane, 상기 문헌] 참조. 골수종 세포와의 융합이 사용되는 경우, 골수종 세포는 바람직하게는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다 (비-분비성 세포주). CD44, 이의 일부분, 또는 CD44를 발현하는 세포를 사용하여 불멸화 세포를 스크리닝한다. 한 바람직한 실시양태에서, CD44 부분은 (i) CD44의 HA 결합 부위; (ii) 서열 1 및/또는 서열 2에 기재된 전장 또는 말단절단 아미노산 서열; 또는 (iii) 이들의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 효소-결합 면역분석법 (ELISA) 또는 방사선면역분석법을 사용하여 최초의 스크리닝을 수행한다. ELISA 스크리닝의 예가 PCT 공보 번호 WO 00/37504에서 제공된다.

하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 강건한 성장, 높은 항체 생산 및 원하는 항체 특성을 포함하는 원하는 특성에 대해 항-CD44 항체-생산 세포, 예를 들어, 하이브리도마가 선별되고, 클로닝되고, 추가로 스크리닝된다. 생체내에서 동계 동물에서, 면역계가 없는 동물, 예를 들어, 누드 마우스에서, 또는 시험관내 세포 배양에서 하이브리도마가 확장될 수 있다. 하이브리도마의 선별, 클로닝 및 확장 방법은 당업자에게 주지되어 있다.

한 실시양태에서, 면역화되는 동물은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 비-인간 동물이고, 지라 B 세포가 이러한 비-인간 동물과 동일한 종으로부터의 골수종 세포주에 융합된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 면역화되는 동물은 키린(Kirin) TC Mouse™ 마우스이고, 골수종 세포주는 비-분비성 마우스 골수종이다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 골수종 세포주는 Sp2/0-Ag14 (ATCC(American Type Culture Collection) CRL-1581)이고, 마우스 하이브리도마 세포주는 1376.3.2d1.A3.D12 (ATCC 번호 PTA-6928), 1376.3.1A9.A6.B9 (ATCC 번호 PTA-6929) 또는 1376.2.14G9.B8.B4 (ATCC 번호 PTA-6927)이다. 예를 들어, 실시예 1 참조.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본원에 기술된 비-인간 트랜스제닉 동물을 CD44, CD44의 일부분, 또는 CD44를 발현하는 세포 또는 조직으로 면역화시키는 단계; (b) 트랜스제닉 동물이 CD44에 대한 면역 응답을 개시하도록 하는 단계; (c) 트랜스제닉 동물로부터 항체-생산 세포를 단리하는 단계; (d) 항체-생산 세포를 불멸화시키는 단계; (e) 불멸화된 항체-생산 세포의 개별적인 모노클로날 집단을 생성시키는 단계; 및 (f) 불멸화된 항체-생산 세포를 스크리닝하여, CD44에 대해 지시된 항체를 생산하는 단계를 포함하는, CD44에 대해 지시된 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 세포주의 생산 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 단계 (f)는 불멸화된 항체-생산 세포를 스크리닝하여, CD44의 HA 결합 부위에 대해 지시되고, 임의로는 CD44의 HA 결합 부위 밖에서는 결합하지 않는 항체를 확인하는 것을 포함한다.

불멸화된 항체-생산 세포를 스크리닝하여, CD44의 HA 결합 부위에 대해 지시된 항체를 확인하는 단계는 세포에 의해 생산된 항체가 CD44의 HA 결합 부위의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합하는지를 테스트함으로써 달성될 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명은 인간 항-CD44 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 한 실시양태에서, 하이브리도마에 의해 생산된 인간 항-CD44 항체는 CD44의 길항제이다. 또다른 실시양태에서, 하이브리도마에 의해 생산된 인간 항-CD44 항체는 (i) CD44의 HA 결합 부위에 결합하거나; (ii) HA 결합 부위 밖에서는 결합하지 않거나; (iii) IM7 결합 부위에 결합하지 않거나; 또는 (iv) 이러한 성질들이 조합된다 ([Mikecz et al., (1999) Arthritis Rheumatism 42: 659, 668], [Zheng (1995) J. Cell Biol. 130: 485-495], [Peach et al., (1993) J. Cell Biol. 122: 257-264] 및 미국 특허 번호 6,001,356). 한 실시양태에서, 하이브리도마는 상기 기술된 바와 같은 마우스 하이브리도마이다. 또다른 실시양태에서, 하이브리도마가 기타 포유동물에서 생산된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항체-생산 세포가 단리되어, 숙주 세포, 예를 들어 골수종 세포에서 발현된다. 또다른 실시양태에서, 트랜스제닉 동물이 CD44로 면역화되고, 1차 세포 (예를 들어, 지라 또는 말초혈 세포)가 면역화된 트랜스제닉 동물로부터 단리되고, 원하는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 개별적인 세포들이 확인된다. 각각의 개별적인 세포로부터의 폴리아데닐화 mRNA가 단리되고, 가변 영역 서열에 어닐링(annealing)되는 센스(sense) 프라이머, 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 FR1 영역의 대부분 또는 전부를 인식하는 축퇴성 프라이머, 및 불변 또는 연결 영역 서열에 어닐링되는 안티-센스(anti-sense) 프라이머를 사용하여 역전사 중합효소 사슬 반응 (RT-PCR)이 수행된다. 그후, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 cDNA가 클로닝되고, 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 골수종 세포에서 각각의 면역글로불린 불변 영역, 예컨대 중쇄 및 κ 또는 λ 불변 도메인이 있는 키메라 항체로 발현된다 ([Babcook, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48] 참조). 그후, 항-CD44 항체가 본원에 기술된 바와 같이 확인 및 단리될 수 있다.

항체를 생산하는 재조합 방법

숙주 세포에서의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분을 제조할 수 있다. 예를 들어, 재조합에 의해 항체를 발현시키기 위해, 숙주 세포가 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염되어, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되고, 바람직하게는, 숙주 세포가 배양되는 배지 내로 분비되어, 이러한 배지로부터 항체가 회수될 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이러한 유전자들을 재조합 발현 벡터내로 혼입시키고, 벡터를 숙주 세포, 예컨대 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)], [Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)] 및 미국 특허 번호 4,816,397에 기술된 것들 내로 도입할 수 있다.

돌연변이 및 변형

본 발명의 CD44 항체를 발현시키기 위해, 임의의 상기 기술된 방법을 사용하여 V_H 및 V_L 영역을 코딩하는 DNA 단편을 먼저 수득할 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 다양한 변형, 예를 들어 돌연변이, 결실, 및/또는 부가를 DNA 내로 또한 도입할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발을 표준 방법, 예컨대 PCR-매개 돌연변이유발을 사용하여 수행할 수 있고, 이때 돌연변이된 뉴클레오티드가 PCR 프라이머 내로 혼입되어, PCR 생성물이 원하는 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이유발을 함유한다.

예를 들어, 이루어질 수 있는 한가지 유형의 치환은 화학적으로 활성일 수 있는 항체 내의 하나 이상의 시스테인을 또다른 잔기, 예컨대 비제한적으로 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 예를 들어, 비-정규 시스테인의 치환이 있을 수 있다. 치환은 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 항체의 불변 도메인에서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 정규 시스테인이다.

예를 들어, 항체의 결합 성질을 변경시키기 위해, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 항체가 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, CD44에 대한 항체의 K_D를 증가 또는 감소시키기 위해, k_off를 증가 또는 감소시키기 위해, 또는 항체의 결합 특이성을 변경시키기 위해, CDR 영역들 중 하나 이상에서 돌연변이가 이루어질 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발에서의 기술은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, [Sambrook et al., 상기 문헌] 및 [Ausubel et al., 상기 문헌] 참조.

CD44 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 도메인에서 돌연변이의 변형이 또한 이루어질 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 번호 WO 00/09560 참조. 항체의 면역원성을 변경시키기 위해, 또다른 분자에의 공유 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하기 위해, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)과 같은 성질을 변경시키기 위해, 프레임워크 영역 또는 불변 도메인에서의 돌연변이가 또한 이루어질 수 있다. 본 발명에 따라, 단일 항체에 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 중 어느 하나 이상에서 또는 불변 도메인에서 돌연변이가 있을 수 있다.

"생식계통화(germlining)"로 공지된 프로세스에서, V_H 및 V_L 서열 내의 특정 아미노산이 생식계통 V_H 및 V_L 서열에서 천연적으로 발견되는 것들과 매칭되도록 돌연변이될 수 있다. 특히, V_H 및 V_L 서열 내의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 항체가 투여될 때 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 생식계통 서열과 매칭되도록 돌연변이될 수 있다. 인간 V_H 및 V_L 유전자에 대한 생식계통 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, "Vbase" 인간 생식계통 서열 데이터베이스 참조; [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공보 번호 91-3242]; [Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24:827-836]을 또한 참조한다).

이루어질 수 있는 또다른 유형의 아미노산 치환은 항체 내의 잠재적인 단백질분해성 부위를 제거하는 것이다. 이같은 부위는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 항체의 불변 도메인에서 발생할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질분해성 부위의 제거는 항체 제품 내의 비균질성의 위험을 감소시킬 수 있고, 따라서 이의 균질성을 증가시킬 수 있다. 또다른 유형의 아미노산 치환은 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 잔기들 중 하나 또는 양쪽 모두를 변화시킴으로써 제거하는 것이다. 또다른 예에서, 본 발명의 CD44 항체의 중쇄의 C-말단 라이신이 절단될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, CD44 항체의 중쇄 및 경쇄는 신호 서열을 임의로 포함할 수 있다.

일단 본 발명의 V_H 및 V_L 절편을 코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자, 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해, 이러한 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작할 수 있다. 이러한 조작에서, V_L- 또는 V_H-코딩 DNA 단편이 또다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이러한 정황에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열들이 인-프레임(in-frame)으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미하도록 의도된다.

V_H-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 V_H 영역을 코딩하는 단리된 DNA가 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공보 번호 91-3242]), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 불변 영역이다. IgG1 불변 영역 서열은 여러 개체들 간에 발생하는 것으로 공지된 다양한 대립유전자 및 동종이형, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17) 중 임의의 것일 수 있다. 이러한 동종이형들은 IgG1 불변 영역에서의 천연 발생 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, V_H-코딩 DNA가 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변 영역은 임의의 중쇄 유전자로부터 유래될 수 있다.

V_L-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 C_L을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 V_L 영역을 코딩하는 단리된 DNA가 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공보 번호 91-3242]), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 여러 개체들 간에 발생하는 것으로 공지된 다양한 대립유전자, 예컨대 Inv(1), Inv(2), 및 Inv(3) 중 임의의 것일 수 있다. 람다 불변 영역은 3개의 람다 유전자 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.

scFv 유전자를 생성시키기 위해, V_H- 및 V_L-코딩 DNA 단편이 가요성 링커를 코딩하는 또다른 단편, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly₄-Ser)₃을 코딩하는 단편에 작동가능하게 연결되어, V_L 및 V_H 영역이 가요성 링커에 의해 연결되면서 V_H 및 V_L 서열이 연속적인 단일-사슬 단백질로서 발현될 수 있다 (예를 들어, [Bird et al., (1988) Science 242:423-426]; [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554] 참조). 단일 사슬 항체는 단일 V_H 및 V_L만이 사용된 경우 1가일 수 있거나, 2개의 V_H 및 V_L이 사용된 경우 2가일 수 있거나, 2개를 초과하는 V_H 및 V_L이 사용된 경우 다가일 수 있다. CD44 및 또다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 또다른 폴리펩티드에 연결된 본 발명의 CD44 항체의 일부분 또는 전체를 포함하는 융합 항체 또는 면역부착소가 제조될 수 있다. 또다른 실시양태에서, CD44 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 연결된다. 또다른 실시양태에서, CD44 항체의 V_H 도메인이 제1 폴리펩티드에 연결되는 한편, CD44 항체의 V_L 도메인이 제2 폴리펩티드에 연결되고, V_H 및 V_L 도메인이 서로 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 하는 방식으로 이러한 제2 폴리펩티드가 제1 폴리펩티드와 회합한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, V_H 및 V_L 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 V_H 도메인이 링커에 의해 V_L 도메인으로부터 분리된다. 그후, V_H-링커-V_L 항체가 당해 폴리펩티드에 연결된다. 또한, 2개 (또는 그 이상)의 단일-사슬 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 단일 폴리펩티드 사슬 상에 2가 또는 다가 항체를 생성시키기를 원하는 경우 또는 이중특이적 항체를 생성시키기를 원하는 경우 이러한 항체가 유용하다.

또다른 실시양태에서, CD44 항체 코딩 핵산 분자를 사용하여 기타 변형 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 교시 내용을 따라 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 "카파 바디(Kappa body)" ([Illl et al., (1997) Protein Eng. 10: 949-57]), "미니바디(Minibody)" ([Martin et al., (1994) EMBO J. 13: 5303-9]), "디아바디" ([Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]), 또는 "자누신(Janusin)" ([Traunecker et al., (1991) EMBO J. 10:3655-3659] 및 [Traunecker et al., (1992) Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52])이 제조될 수 있다.

하이브리도마들의 융합 또는 Fab' 단편들을 연결시키는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편이 생산될 수 있다. 예를 들어, [Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321], [Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148:1547-1553] 참조. 또한, "디아바디" 또는 "자누신"으로서 이중특이적 항체가 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 CD44의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 인간 CD44 항체로부터의 가변 도메인 또는 CDR 영역 중 하나 이상을 사용하여 상기 기술된 변형된 항체가 제조된다.

벡터 및 숙주 세포

본 발명의 항체 및 항원-결합 부분을 발현시키기 위해, 본원에 기술된 바와 같이 수득된, 부분적인 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입한다. 이러한 정황에서, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 수행하도록 항체 유전자가 벡터 내로 결찰되는 것을 의미하도록 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 발현 벡터에는, 예를 들어, 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 식물 바이러스 예컨대 컬리플라워 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC, EBV-유래 에피솜이 포함된다. 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 수행하도록 항체 유전자가 벡터 내로 결찰된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자가 별도의 벡터 내로 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 양쪽 유전자가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 블런트(blunt) 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내로 항체 유전자들이 삽입된다.

편리한 벡터는 상기 기술된 바와 같이, 임의의 V_H 또는 V_L 서열이 쉽게 삽입 및 발현될 수 있도록 조작된 적합한 제한 부위와 함께, 기능적으로 완전한 인간 C_H 또는 C_L 면역글로불린 서열을 코딩하는 벡터이다. 이같은 벡터에서, 스플라이싱이 삽입된 J 영역 내의 스플라이스 도너 부위와 인간 C 도메인에 선행하는 스플라이스 어셉터 부위 사이에서 일반적으로 발생하고, 인간 C_H 엑손 내에서 발생하는 스플라이스 영역에서 또한 발생한다. 폴리아데닐화 및 전사 종결이 코딩 영역의 하류의 천연 염색체 부위에서 발생한다. 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 또한 코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 면역글로불린 사슬의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 항체 사슬 유전자가 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 당업자는 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 디자인이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열에는 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)), 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서, 및 강력한 포유류 프로모터 예컨대 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터가 포함된다. 바이러스성 조절 요소 및 이의 서열의 추가적인 설명을 위해, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,168,062, 4,510,245 및 4,968,615 참조. 식물에서 항체를 발현시키기 위한 방법 (프로모터 및 벡터의 설명 포함), 뿐만 아니라 식물의 형질전환은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,517,529 참조. 박테리아 세포 또는 진균류 세포, 예를 들어, 효모 세포에서의 폴리펩티드 발현 방법 또한 당업계에 주지되어 있다.

항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 선별성 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선별성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선별성 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위한 것) 및 네오마이신 포스포트랜스페라제 유전자 (G418 선별용), 및 글루타메이트 신테타제 유전자가 포함된다.

CD44 항체를 코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 적절한 포유류, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 형질감염에 사용할 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 주지되어 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜 내로의 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 핵 내로의 DNA의 직접적인 미세주사를 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, 및 4,959,455 참조. 아그로박테리아-매개 형질전환, 바이오리스틱(biolistic) 형질전환, 직접적인 주입, 전기천공 및 바이러스성 형질전환을 예를 들어 포함하여, 식물 세포를 형질전환시키는 방법이 당업계에 주지되어 있다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환시키는 방법 또한 당업계에 주지되어 있다.

발현용 숙주로서 이용가능한 포유류 세포주가 당업계에 주지되어 있고, ATCC (American Type Culture Collection)으로부터 입수가능한 다수의 불멸화 세포주를 포함한다. 여기에는, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 및 다수의 기타 세포주가 포함된다. 어떠한 세포주에서 발현 수준이 높은지를 결정하는 것을 통해 특히 바람직한 세포주가 선택된다. 사용될 수 있는 또다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 또는 Sf21 세포이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 숙주 세포 내에서 항체가 발현되도록 하는데 충분한 시간, 더욱 바람직하게는 항체가 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로 분비되도록 하는데 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산된다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다. 식물 숙주 세포에는, 예를 들어, 니코티나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 개구리밥, 옥수수, 밀, 감자 등이 포함된다. 박테리아 숙주 세포에는 대장균 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종이 포함된다. 효모 숙주 세포에는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 포함된다

또한, 다수의 공지된 기술을 사용하여 생산 세포주로부터의 본 발명의 항체의 발현을 강화시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 (GS 시스템) 및 DHFR 유전자 발현 시스템은 특정 조건 하에서의 발현을 강화시키기 위한 일상적인 접근법이다. 통상적인 기술, 예컨대 한계 희석 클로닝 및 마이크로드랍(Microdrop) 기술을 사용하여 고발현 세포 클론을 확인할 수 있다. 유럽 특허 번호 EP 0 216 846, EP 0 256 055, EP 0 323 997 및 EP 0 338 841에 GS 시스템이 논의되어 있다.

상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현된 항체들은 글리코실화가 서로 상이할 것이다. 그러나, 본원에서 제공된 핵산 분자에 의해 코딩되거나, 본원에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 글리코실화와 관계 없이 본 발명의 일부이다.

파지 디스플레이 라이브러리

본 발명은 파지 상에 인간 항체의 라이브러리를 합성하는 단계, 라이브러리를 CD44 또는 이의 일부분으로 스크리닝하는 단계, CD44에 결합하는 파지를 단리하는 단계, 및 파지로부터 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 항-CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 파지 디스플레이 기술에서 사용하기 위한 항체의 라이브러리를 제조하는 한 방법은 인간 면역글로불린 좌위를 포함하는 비-인간 동물을 CD44 또는 이의 항원성 부분으로 면역화시켜, 면역 응답을 일으키는 단계, 면역화된 동물로부터 항체-생산 세포를 추출하는 단계, 추출된 세포로부터 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 RNA를 단리하는 단계, RNA를 역전사시켜 cDNA를 생산하는 단계, 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭시키는 단계, 및 항체가 파지 상에서 발현되도록 cDNA를 파지 디스플레이 벡터 내로 삽입하는 단계를 포함한다. 본 발명의 재조합 항-CD44 항체가 이러한 방식으로 수득될 수 있다.

조합형 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 본 발명의 재조합 항-CD44 인간 항체가 단리될 수 있다. 바람직하게는, 라이브러리는 B 세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 인간 V_L 및 V_H cDNA를 사용하여 생성된, scFv 파지 디스플레이 라이브러리이다. 이같은 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법은 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키기 위한 키트가 시판된다 (예를 들어, Pharmacia의 Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene의 SurfZAP™ 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612). 또다른 방법 및 시약들이 항체 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 스크리닝하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409; PCT 공보 번호 WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, 및 WO 92/09690; [Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1370-1372]; [Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85]; [Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281]; [McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554]; [Griffiths et al., (1993) EMBO J. 12:725-734]; [Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896]; [Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628]; [Gram et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580]; [Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377]; [Hoogenboom et al., (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137]; 및 [Barbas et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982] 참조).

원하는 특성이 있는 인간 항-CD44 항체를 단리 및 생산하기 위한 한 실시양태에서, 먼저 본원에 기술된 바와 같은 인간 항-CD44 항체를 사용하여, CD44에 대한 결합 활성이 유사한 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 PCT 공보 번호 WO 93/06213에 기술된 에피토프 각인 방법을 사용하여 선별한다. 바람직하게는, 이러한 방법에서 사용된 항체 라이브러리는 PCT 공보 번호 WO 92/01047, [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]; 및 [Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이 제조 및 스크리닝된 scFv 라이브러리이다. 바람직하게는, 인간 CCR2를 항원으로 사용하여 scFv 항체 라이브러리가 스크리닝된다.

일단 초기의 인간 V_L 및 V_H 도메인들이 선택되면, 여러 쌍의 초기에 선택된 V_L 및 V_H 절편들을 CD44 결합에 대해 스크리닝하여 바람직한 V_L/V_H 쌍 조합을 선택하는 "믹스 & 매치" 실험을 수행한다. 추가적으로, 항체의 품질을 더욱 개선시키기 위해, 바람직한 V_L/V_H 쌍(들)의 V_L 및 V_H 절편들을 천연 면역 응답 동안 항체의 친화력 성숙을 담당하는 생체내 체세포 돌연변이 프로세스와 유사한 프로세스에서 무작위로 돌연변이시킬 수 있고, 바람직하게는 V_L 및/또는 V_H의 CDR3 영역 내에서 돌연변이시킬 수 있다. 생성된 PCR 생성물이 무작위 돌연변이가 V_H 및/또는 V_L CDR3 영역 내로 도입된 V_H 및 V_L 절편을 코딩하도록 특정 위치에서 4가지 뉴클레오티드 염기의 무작위 혼합물로 "스파이킹(spiking)"된, 각각 V_H CDR3 또는 V_L CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 V_H 및 V_L 도메인을 증폭시킴으로써 이러한 시험관내 친화력 성숙이 달성될 수 있다. 이러한 무작위로 돌연변이된 V_H 및 V_L 절편들을 CD44에의 결합에 대해 다시 스크리닝할 수 있다.

재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터의 본 발명의 항-CD44 항체의 스크리닝 및 단리 후, 선택된 항체를 코딩하는 핵산을 디스플레이 패키지로부터 (예를 들어, 파지 게놈으로부터) 회수하여, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 또다른 발현 벡터 내로 서브클로닝할 수 있다. 원한다면, 하기 기술된 바와 같이, 이러한 핵산을 본 발명의 또다른 항체 형태를 생성시키기 위해 추가로 조작할 수 있다. 조합형 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리된 재조합 인간 항체를 발현시키기 위해, 상기 기술된 바와 같이, 항체를 코딩하는 DNA가 재조합 발현 벡터 내로 클로닝되어 포유류 숙주 세포 내로 도입된다.

면역제거 항체

본 발명의 또다른 양상에서, PCT 공보 번호 WO98/52976 및 WO00/34317에 예를 들어 기술된 기술을 사용하여 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 면역원성을 감소시키기 위해 이들을 면역제거(deimmunizing)시킬 수 있다.

유도체화 및 표지된 항체

본 발명의 항-CD44 항체 또는 항원-결합 부분이 유도체화되거나 또는 또다른 분자 (예를 들어, 또다른 펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 일반적으로, CD44 결합이 유도체화 또는 표지에 의해 불리하게 영향을 받지 않도록 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 유도체화된다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 부분은 본원에 기술된 인간 CD44 항체의 무손상 형태 및 변형 형태 양쪽 모두를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분이 하나 이상의 또다른 분자성 본체, 예컨대 또다른 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체 또는 디아바디), 검출제, 표지, 세포독성제, 약제, 항체 또는 항원-결합 부분과 또다른 분자 (예컨대 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드, 및/또는 항체 또는 항원-결합 부분에 연결 또는 융합 (융합 단백질)된 캐리어 단백질 (예를 들어 혈액 단백질, 알부민 또는 트랜스페린)에 기능적으로 연결될 수 있다 (화학적 커플링, 유전학적 융합, 비-공유결합 회합 등에 의해).

한 유형의 유도체화 항체는 2개 이상의 항체 (동일한 유형, 또는 예를 들어 이중 특이적 항체를 생성시키기 위한 상이한 유형)를 가교시킴으로써 생산된다. 적절한 가교제에는 적합한 스페이서에 의해 분리된 2개의 별개로 반응성인 기가 있는 이종이관능성 가교제 (예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르), 또는 동종이관능성 가교제 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트)가 포함된다. 이같은 링커들은 Pierce Chemical Company (Rockford, IL)로부터 시판된다.

또다른 유형의 유도체화 항체는 표지된 항체이다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분이 이와 함께 유도체화될 수 있는 유용한 검출제에는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 파이코에리트린, 란탄계열 인광체가 예를 들어 포함되는 형광 화합물이 포함된다. 항체는 검출에 유용한 효소, 예를 들어, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 산화효소로 또한 표지될 수 있다. 항체가 검출가능한 효소로 표지되는 경우, 식별될 수 있는 반응 생성물을 생산하기 위해 효소가 사용하는 추가적인 시약을 첨가함으로써 항체가 검출된다. 예를 들어, 양고추냉이 과산화효소 작용제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 유색 반응 생성물에 이른다. 또한 항체가 비오틴으로 표지되어, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접적인 측정을 통해 검출될 수 있다. 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 정해진 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)로 항체가 또한 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 팔에 의해 표지가 부착된다. CD44 항체는 화학기 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄수화물 기로 또한 유도체화될 수 있다. 이러한 기들은 항체의 생물학적 특성을 개선시키는데, 예를 들어, 혈청 반감기를 증가시키는데 유용하다.

제약 조성물 및 투여

본 발명은 비정상적인 세포 침윤을 치료하는데 효과적인 양의 본원에 기술된 바와 같은 CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 인간을 포함하는 포유동물에서의 비정상적인 세포 침윤의 치료를 위한 제약 조성물을 또한 제공한다. 바람직한 조성물은 하나 이상의 다양한 염증성 및 자가면역 질환, 예컨대 류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염, 죽상동맥경화증, 육아종성 질환, 다발성 경화증, 천식, 크론병, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 판상형 건선 및 암이 있는 환자에게 치료적 이점을 제공한다.

본 발명의 항체 및 항원-결합 부분은 PCT 공보 WO 2006/096488 및 이에 인용된 참조문헌에 예를 들어 기술된 바와 같은 대상에게의 투여에 적절한 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 전형적으로, 제약 조성물은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분, 및 단백질 안정성, 용해도 및 생체활성을 유지하도록 개조된 제약상 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에서 사용된 "제약상 허용가능한 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항-박테리아 및 항-진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등을 의미한다. 제약상 허용가능한 담체의 일부 예는 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 이들의 조합물이다. 다수의 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨이 조성물 내에 포함되는 것이 바람직할 것이다. 제약상 허용가능한 물질의 추가적인 예는 습윤화제 또는 미량의 보조 물질 예컨대 습윤화 또는 유화 작용제, 방부제, 아미노산이 포함되는 완충제, 및 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA, DTPA, DFM 및 이들의 혼합물이고, 이들은 항체의 보관 기간 또는 유효성을 강화시킨다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 IgG, 바람직하게는 IgG₁ 또는 IgG₂, 모노클로날 항체 및 제약상 허용가능한 킬레이팅제를 포함한다. 항체의 대표적인 몰 농도는 약 0.0006 mM 내지 약 1.35 mM 범위이고, 킬레이팅제의 몰 농도는 약 0.003 mM 내지 약 50 mM 범위이며, 항체 대 킬레이팅제의 몰비는 약 0.00001 내지 약 2000 범위이다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태, 예를 들어, 액체, 반-고체 및 고체 제형, 예컨대 액체 용액 (예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포솜 및 좌약일 수 있다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 용도에 좌우된다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사용 또는 주입용 용액, 예컨대 인간의 수동 면역화에 사용되는 것들과 유사한 조성물의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구 투여 (예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 주사용 제형은 방부제가 첨가된 또는 첨가되지 않은 단위 투여량 형태로, 예를 들어, 앰풀 또는 다중-용량 컨테이너 내에서 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁, 안정화 및/또는 분산 작용제와 같은 제형 작용제를 함유할 수 있다. 별법적으로, 활성 성분은 사용 전에 적절한 비히클, 예를 들어, 발열원이 없는 무균수로 재구성시키기 위한 분말 형태일 수 있다.

전형적으로 치료용 조성물은 제작 및 보관 조건 하에 안정적이고 무균성이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 분산액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적절한 또다른 규칙적인 구조로 제형될 수 있다. 필요한 양의 CD44 항체를 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적합한 용매 내에 혼입시킨 후, 여과 멸균시킴으로써 무균성 주사용 용액이 제조될 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분들을 함유하는 무균성 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액이 제조된다. 무균성 주사용 용액의 제조를 위한 무균성 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 앞서 무균성-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 산출되는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적합한 유동성이, 예를 들어, 코팅제 예컨대 레시틴을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사용 조성물의 장기 흡수가 초래될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분은 당업계에 종지된 다양한 방법으로 투여될 수 있지만, 다수의 치료 용도에 대해, 바람직한 투여 경로/방식은 피하 주입, 근육내 주입 또는 정맥내 주입이다. 당업자가 이해할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 변할 것이다.

특정 실시양태에서, 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템이 포함되는 제어 방출 제형과 같이, 급속한 방출에 대해 항체를 보호하는 담체와 함께 본 발명의 항체 조성물이 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이같은 제형의 제조를 위한 다수의 방법이 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.

추가적인 활성 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 억제성 CD44 항체가 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 공동-제형 및/또는 공동-투여된다. 이러한 작용제에는 또다른 표적에 결합하는 항체, 항-종양 작용제, 항-혈관형성 작용제, 신호 전달 억제제, 항-증식성 작용제, 화학요법제, 또는 CD44를 억제하는 펩티드 유사체가 비제한적으로 포함된다. 이같은 조합 요법은 억제성 CD44 항체, 뿐만 아니라 공동으로 투여되는 작용제의 더 낮은 투여량을 필요로 하여, 다양한 단독요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.

본 화합물은 사이클로스포린, 졸레드론산, 에팔리주맵, 알레파셉트, 에토돌락, 로르녹시캄, OM-89, 발데콕십, 토실리주맵, 아바타셉트, 멜록시캄, 이태너셉트, 남부메톤, 리멕솔론, 153Sm-EDTMP, 프로소르바, 이디다졸 살리실레이트, 오프렐베킨, 히알루론산, 나프록센, 피록시캄, 디아세레인, 루메리콕십, 로페콕십 타크롤리무스, 아세클로페낙, 악타리트, 테녹시캄, 로시글리타존, 데플라자코르트, 아달리무맵, 레플루노미드, 리세드로네이트 소듐, 미소프로스톨 및 디클로페낙, SK-1306X, 인플릭시맵, 아나킨라, 셀레콕십, 디클로페낙, 에토리콕십 및 펠비낙, 레우마콘, 골리무맵, 데노수맵, 오파투무맵, 10rT1 항체, 펠루비프로펜, 리코펠론, 템시롤리무스, 에쿨리주맵, 이구라티모드, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 이부프로펜, 트리암시놀론 아세토니드, 나부메톤, 옥사프로진, 옥시코돈 hcl, 펜타닐, 술린닥, 피리독신, 아세트아미노펜, 알렌드로네이트, 인도메타신, 글루코사민, 올로파타딘, 오메프라졸, 아자티오프린, 술파살라진, 히드록시클로로퀸, 시클로스포린 및 프레드니손을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항-염증제 또는 DMARDS에 더하여, 부분적으로 또는 완전하게, 공동-요법에서 또한 사용될 수 있다 (예비치료, 후속치료 또는 병행 치료). 또다른 적절한 항-염증제에는 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ON03144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-벤조일-1-인단카르복실산), TVX2706, U60257, UR2301 및 WY41770, CP- 481715, ABN-912, MLN-3897, HuMax-IL-15, RA-1, 파클리탁셀, Org-37663, Org 39141, AED-9056, AMG-108, 폰톨리주맵, 페그수네르셉트, 프랄나카산, 아필리모드, GW-274150, AT-001, 681323 (GSK) K-832, R-1503, 오크렐리주맵, DE-096, Cpn10, THC+CBD (GW Pharma), 856553 (GSK), ReN-1869, 면역글로불린, mm-093, 아멜루반트, SCIO-469, ABT-874, LenkoVAX, LY-2127399, TRU-015, KC-706, 아목사피넷 및 디피리다몰, TAK-715, PG 760564, VX-702, 프레드니솔론 및 디피리다몰, PMX-53, 벨리무맵, 프리나베렐, CF-101, tgAAV-TNFR:Fc, R-788, 프레드니솔론 및 SSRI, CP-690550 및 PMI-001과 같이 회사 코드명으로 지시되는 것을이 포함된다.

또다른 실시양태에서, 추가적인 치료제에는 생물학적 작용제가 포함된다. 추가적인 실시양태에서, 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 길항제, 인터루킨-1 알파 (IL-1 α) 길항제, CD28 길항제 및 CD20 길항제로부터 하나 이상의 생물학적 작용제가 선택된다. 추가적인 실시양태에서, 이태너셉트 (ENBREL™), 아달리무맵 (HUMIRA™), 인플릭시맵 (REMICADE™), 아나킨라 (KINERET™), 아바타셉트 (ORENCIA™), 리툭시맵 (RITUXAN™) 및 세르톨리주맵 페골 (CIMZIA™)로 이루어진 군으로부터 하나 이상의 생물학적 작용제가 선택된다.

류머티스성 관절염 치료법을 위해 화학식 I의 화합물 및 이의 염 및 용매화물과 조합되어 사용될 수 있는 추가적인 제약상 활성인 작용제들의 예로는 면역억제제 예컨대 암톨메틴 구아실, 미조르빈 및 리멕솔론; 항-TNF 알파 작용제 예컨대 이태너셉트, 인플리시맵, 디아세레인; 타이로신 키나제 억제제 예컨대 레플루노미드; 칼리크레인 길항제 예컨대 수브레움; 인터루킨 11 작동제 예컨대 오프렐베킨; 인터페론 베타 1 작동제; 히알루론산 작동제 예컨대 NRD-101 (Aventis); 인터루킨 1 수용체 길항제 예컨대 아나킨라; CD8 길항제 예컨대 아미프릴로스 히드로클로라이드; 베타 아밀로이드 전구체 단백질 길항제 예컨대 레우마콘; 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제 예컨대 시페마스탯 및 기타 질환 변형성 항-류머티즘 약물 (DMARD) 예컨대 메토트렉세이트, 술파살라진, 시클로스포린 A, 히드록시클로로퀸, 오라노핀, 오로티오글루코스, 골드 소듐 티오말레이트 및 페니실라민이 포함된다.

본 발명의 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 원하는 치료적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 항체 또는 항원-결합 부분의 치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 응답을 도출하는 항체 또는 항체 일부분의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 또한 치료적 유효량은 치료적으로 이로운 효과가 항체 또는 항원-결합 부분의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.

최적의 원하는 응답 (예를 들어, 치료적 또는 예방적 응답)을 제공하도록 투여량 처방계획이 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수회의 분할 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 요건에 의해 지시되는 대로 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 비경구 조성물을 제형하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 투여량 단위 형태는 치료될 포유류 대상에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분산된 단위를 지칭한다; 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 일으키도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 상세사항은 (a) CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 독특한 특성 및 달성하려는 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서의 민감성의 치료를 위해 이같은 항체를 조제하는 분야에 고유한 제한사항에 의해 지시되고, 이에 직접적으로 의존적이다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부분의 치료적 또는 예방적 유효량에 대한 예시적이고 비-제한적인 범위는 0.025 내지 50 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 0.1-25, 0.1 내지 10 또는 0.1 내지 3 ㎎/㎏이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부분은 pH가 약 5.0 내지 약 6.5 범위이고, 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖의 항체, 약 1 mM 내지 약 100 mM의 완충제 (예를 들어, 히스티딘, 아세테이트, 또는 숙시네이트), 약 0.01 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 약 100 mM 내지 약 400 mM의 트레할로스, 및 약 0.01 mM 내지 약 1.0 mM의 디소듐 EDTA 디히드레이트를 포함하는 무균성 수용액으로서 제형으로 투여된다. 본 발명의 조성물은 제약상 허용가능한 항산화제 및/또는 킬레이팅제를 임의로 포함할 수 있다. 적절한 항산화제에는 메티오닌, 소듐 티오술페이트, 카탈라제, 및 백금이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 조성물은 1 mM 내지 약 100 mM 범위이고, 특히 약 27 mM인 농도의 메티오닌을 함유할 수 있다. 투여량 값은 경감될 용태의 유형 및 중증도에 따라 변할 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 임의의 특정 대상에 대해, 개별적인 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 따라 특정 투여량 처방계획이 조정되어야 하고, 본원에 기재된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이고 청구된 조성물의 범주 또는 실행을 제한하도록 의도되지 않는 것으로 또한 이해되어야 한다.

본 발명의 또다른 양상은 본 발명의 CD44 항체 또는 항원-결합 부분 또는 이같은 항체 또는 항원-결합 부분을 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는, 항체 또는 조성물에 더하여, 진단제 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 진단 또는 치료 방법에서의 사용을 위한 사용 설명서를 또한 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 키트는 항체 또는 이를 포함하는 조성물, 및 하기에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 진단제를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 키트는 항체 또는 이를 포함하는 조성물, 및 하기에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 하나 이상의 치료제를 포함한다.

진단적 사용 방법

또다른 양상에서, 본 발명은은 생체내 및 시험관내 진단 방법을 제공한다. 항-CD44 항체를 사용하여, 시험관내에서 또는 생체내에서 생물학적 샘플 내의 CD44를 검출할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 항체를 대상 내로 주사하는 단계, 항체가 결합한 곳을 국소화함으로써 대상에서 CD44의 발현을 결정하는 단계, 대상에서의 발현을 정상적인 기준 대상 또는 표준물의 발현과 비교하는 단계, 및 세포의 존재 또는 위치를 진단하는 단계를 포함하는, CD44-발현 세포의 존재 또는 위치를 진단하는 것이 필요한 대상에서 이를 진단하는 방법을 제공한다. 항-CD44 항체는 염증에 대한 마커 및/또는 면역 세포 예컨대 단핵구 및 T 세포의 조직 내로의 침윤에 대한 마커로 또한 사용될 수 있다.

ELISA, RIA, 유동 세포측정법, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 면역침전이 비제한적으로 포함되는 통상적인 면역분석법에서 항-CD44 항체를 사용할 수 있다. 본 발명의 항-CD44 항체를 사용하여, 인간으로부터 CD44를 검출할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항-CD44 항체를 사용하여, 사이노몰구스 원숭이 또는 붉은털 원숭이로부터 CD44를 검출할 수 있다.

본 발명은 생물학적 샘플을 본 발명의 항-CD44 항체와 접촉시키는 단계 및 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내의 CD44를 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 항-CD44 항체가 검출가능한 표지로 직접적으로 표지된다. 또다른 실시양태에서, 항-CD44 항체 (제1 항체)는 표지되지 않고, 제2 항체 또는 항-CD44 항체에 결합할 수 있는 또다른 분자가 표지된다. 당업자에게 주지된 바와 같이, 특정 종 및 클래스의 제1 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체가 선택된다. 예를 들어, 항-CD44 항체가 인간 IgG이면, 제2 항체는 항-인간-IgG 항체일 수 있다. 항체에 결합할 수 있는 또다른 분자에는 단백질 A 및 단백질 G (예를 들어, Pierce Chemical Company로부터, 양쪽 모두 시판됨)가 비제한적으로 포함된다.

또다른 실시양태에서, 검출가능한 물질로 표지된 CD44 표준물 및 표지되지 않은 항-CD44 항체를 사용하는 경쟁 면역분석법에 의해 생물학적 샘플에서 CD44가 분석될 수 있다. 이러한 분석법에서, 생물학적 샘플, 표지된 CD44 표준물 및 항-CD44 항체가 조합되고, 표지되지 않은 항체에 결합된 표지된 CD44 표준물질의 양이 결정된다. 생물학적 샘플 내의 CD44의 양은 항-CD44 항체에 결합된 표지된 CD44 표준물질의 양에 반비례한다.

다수의 목적을 위해 본 출원에 개시된 면역분석법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 배양된 세포 내의 CD44를 검출하기 위해 항-CD44 항체가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 다양한 화합물로 처리된 세포의 표면 상의 CD44의 양을 결정하기 위해 항-CD44 항체가 사용된다. 이러한 방법을 사용하여, CD44 단백질 수준을 조정하는 화합물을 확인할 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 세포 샘플 하나를 일정 기간 동안 테스트 화합물로 처리하고, 또다른 샘플은 처리하지 않는다. 전체 CD44 발현을 측정하려는 경우, 세포를 용해시키고, 전체 CD44 발현을 상기 기술된 면역분석법들 중 하나를 사용하여 측정한다. 처리된 세포 대 처리되지 않은 세포에서의 전체 CD44 발현을 비교하여, 테스트 화합물의 효과를 결정한다.

전체 CD44 발현을 측정하기 위한 바람직한 면역분석법은 유동 세포측정법 또는 면역조직화학이다. 세포 표면 CD44 발현을 측정하려는 경우, 세포를 용해시키지 않고, CD44의 세포 표면 수준을 상기 기술된 면역분석법들 중 하나를 사용하여 측정한다. CD44의 세포 표면 수준을 결정하기 위한 바람직한 면역분석법은 세포 표면 단백질을 검출가능한 표지, 예컨대 비오틴 또는 ¹²⁵I로 표지하는 단계, CD44를 항-CD44 항체로 면역침전시키는 단계 및 이어서 표지된 CD44를 검출하는 단계를 포함한다.

CD44의 국소화, 예를 들어, 세포 표면 수준을 결정하기 위한 또다른 바람직한 면역분석법은 면역조직화학의 사용에 의한 방법이다. CD44의 세포 표면 수준을 검출하기 위한 바람직한 면역분석법은 적합한 형광단, 예컨대 플루오레세인 또는 파이코에리트린으로 표지된 항-CD44 항체의 결합, 및 유동 세포측정법을 사용하여 1차 항체를 검출하는 것을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항-CD44 항체는 표지되지 않고, 제2 항체 또는 항-CD44 항체에 결합할 수 있는 또다른 분자가 표지된다. ELISA, RIA, 유동 세포측정법, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 통합 막 단백질의 세포 표면 표지, 및 면역침전과 같은 방법이 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어, [Harlow and Lane, 상기 문헌] 참조). 또한, CD44의 활성화 또는 억제에 대해 다수의 화합물을 테스트하기 위한 고처리량 스크리닝을 위해 면역분석법의 규모를 증진시킬 수 있다.

본 발명의 항-CD44 항체는 조직 또는 조직으로부터 유래된 세포 내의 CD44의 수준을 결정하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직은 질환 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직은 조직 생검이다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 조직 또는 이의 생검이 환자로부터 절제된다. 그후, 조직 또는 생검을 면역분석법에서 사용하여, 상기 논의된 방법에 의해 전체 CD44 발현, CD44 세포 표면 수준 또는 CD44의 국소화를 예를 들어 결정한다. 이같은 방법은 조직이 높은 수준의 CD44를 발현하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있고, 이러한 높은 수준은 조직이 항-CD44 항체로의 치료에 대한 표적이라는 것을 가리킬 수 있다.

CD44를 발현하는 조직 또는 기관을 확인하기 위해 본 발명의 항체가 생체내에서 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD44 항체가 CD44-발현 세포를 확인하는데 사용된다. 본 발명의 인간 항-CD44 항체를 사용하는 것의 한가지 장점은, 비-인간 기원 항체 또는 인간화 또는 키메라 항체와 달리, 투여시 항체에 대한 실질적인 면역 응답을 도출하지 않으면서 생체 내에서 안전하게 사용될 수 있다는 것이다.

검출가능하게 표지된 항-CD44 항체 또는 이를 포함하는 조성물을 이같은 진단 테스트를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계 및 환자에게 영상화 분석을 수행하여 CD44-발현 조직의 위치를 결정하는 단계가 방법에 포함된다. 영상화 분석은 의료 분야에 주지되어 있고, x선 분석, 자기 공명 영상화 (MRI) 또는 전산화 단층촬영술 (CT)이 비제한적으로 포함된다. 생체내 영상화에 적절한 임의의 작용제, 예를 들어 x선 분석에 사용될 수 있는 조영제, 예컨대 바륨, 또는 MRI 또는 CT에 사용될 수 있는 자기 조영제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트로 항체가 표지될 수 있다. 기타 표지제에는 방사선동위원소, 예컨대 ⁹⁹Tc가 비제한적으로 포함된다. 또다른 실시양태에서, 항-CD44 항체는 표지되지 않고, 검출가능하고 항-CD44 항체에 결합할 수 있는 제2 항체 또는 기타 분자를 투여함으로써 항-CD44 항체가 영상화될 것이다. 실시양태에서, 당해 조직이 CD44를 발현하는지 여부를 결정하기 위해 환자로부터 생검이 수득된다.

한 실시양태에서, 검출가능하게 표지된 항-CD44는 형광단을 포함한다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명의 항-CD44 항체는 세포 상에서 CD44의 세포 표면 발현 감소를 검출하는데 또한 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 림프구 및 단핵구이다.

치료적 사용 방법

또다른 실시양태에서, 본 발명은 CD44 활성을 억제하는 것을 필요로 하는 환자에게 CD44 항체를 투여함으로써 이를 억제하는 방법을 제공한다. 임의의 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 치료적으로 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, CD44 항체는 키메라 또는 인간화 항체이다. 바람직한 실시양태에서, CD44는 인간 CD44이고, 환자는 인간 환자이다. 별법적으로, 환자는 CD44 항체가 교차-반응하는 CD44를 발현하는 포유동물, 예를 들어, 원숭이일 수 있다. 항체는 CD44를 발현하는 비-인간 포유동물, 예컨대 인간 질환의 동물 모델에게 투여될 수 있다. 이같은 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 유용할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 부적적하게 높은 수준의 CD44를 발현하는 환자에게 CD44 항체 또는 이의 항체 일부분이 투여될 수 있다. 항체가 1회 투여될 수 있지만, 더욱 바람직하게는 최적의 효능을 위해 여러번 투여된다. 항체는 1일 3회 내지 6개월마다 1회 또는 이보다 긴 간격으로 투여될 수 있다. 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 1주일마다 1회, 2주일마다 1회, 1개월마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 및 6개월마다 1회와 같은 스케쥴로 투여될 수 있다. 또한 미니펌프를 통해 지속적으로 항체가 투여될 수 있다. 점막, 구강, 비강, 흡입, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구 또는 종양내 경로를 통해 항체가 투여될 수 있다. 항체는 1회, 2회 이상, 또는 적어도 용태가 치료, 완화 또는 치유될 때까지의 기간 동안 투여될 수 있다. 일반적으로 용태가 존재하는 한 계속 항체가 투여될 것이다. 일반적으로 항체는 상기 기술된 바와 같이 제약 조성물의 일부로서 투여될 것이다. 일반적으로 항체의 투여량은 0.1 내지 100 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 50 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 1 내지 20 ㎎/㎏, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 항체의 혈청 농도를 측정할 수 있다.

본 발명은 비정상적인 세포 침윤을 치료하는데 효과적인, 치료적 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함하는 포유동물에서 비정상적인 세포 침윤을 치료하는 방법을 또한 제공한다.

유전자 요법

유전자 요법을 통해 본 발명의 항체 및 항체 일부분을 코딩하는 핵산 분자가 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 유전자 요법은 생체내 또는 생체외 요법일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 양쪽 모두를 코딩하는 핵산 분자가 환자에게 투여된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, B 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합되도록 핵산 분자가 투여되는데, 이는 이러한 세포가 항체의 생산에 전문화되었기 때문이다. 바람직한 실시양태에서, 전구체 B 세포가 생체외에서 형질감염 또는 감염되고, 이를 필요로 하는 환자에게 다시 이식된다. 또다른 실시양태에서, 전구체 B 세포 또는 기타 세포가 당해 세포 유형을 감염시키는 것으로 공지된 바이러스로 생체내에서 감염된다. 유전자 요법에 사용되는 전형적인 벡터에는 리포솜, 플라스미드, 및 바이러스 벡터가 포함된다. 대표적인 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스이다. 생체내 또는 생체외 감염 후, 치료된 환자로부터 샘플을 수득하고 당업계에 공지되었거나 본원에서 논의된 임의의 면역분석법을 사용함으로써 항체 발현 수준을 모니터링할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 유전자 요법 방법은 CD44 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 투여하는 단계, 및 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 유전자 요법 방법은 CD44 항체의 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 투여하는 단계, 및 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 더욱 바람직한 방법에서, 유전자 요법 방법은 본 발명의 CD44 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자 및 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 투여하는 단계, 및 핵산 분자들을 발현시키는 단계를 포함한다. 유전자 요법 방법은 또다른 치료제, 예컨대 조합 요법과 관련하여 본 출원에서 논의된 작용제들 중 임의의 것을 투여하는 단계를 또한 포함할 수 있다.

본 발명이 더욱 잘 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기의 예들이 기재된다. 이러한 예들은 단지 설명의 목적이고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

하기의 예 및 제제에서, "BSA"는 소 혈청 알부민을 의미하고, "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 의미하고, "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 의미하고, "MOPS"는 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산을 의미하며, "MES"는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산을 의미하고, "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 의미하고, "dPBS"는 둘베코(Dulbecco) 포스페이트 완충 염수를 의미하고; "HEMA"는 2-히드록시-에틸 메타크릴레이트를 의미하며, "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지를 의미하고, "FBS"는 소 태 아 혈청을 의미하고, "NEAA"는 비-필수 아미노산을 의미하며, "HEPES"는 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산을 의미하고, "DMF"는 디메틸 포름아미드를 의미한다.

실시예 1

항-CD44 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

본 발명에 따른 바람직한 항체를 하기와 같이 제조하고, 선별하고, 분석하였다:

면역화 및 하이브리도마 생성:

정제된 재조합 인간 CD44-Ig 융합 단백질 (서열 1), 인간 CD44를 발현하도록 형질감염된 뮤린 프리(pre)-B 세포주 300-19 ([Reth, M. G. et al, Nature 312 29: 418-42, 1984]; [Alt, F. et al., Cell 27: 381-390, 1981]), 및 인간 CD44를 천연적으로 발현하는 인간 단핵구성 백혈병 세포주 THP-1 (ATCC 카탈로그 번호 TIB-202)를 면역원으로 사용하였다.

인간 CD44에 대한 완전히 인간형인 모노클로날 항체를 인간 Ig 트랜스제닉 마우스 계통 HCo7 및 HCo12, 뿐만 아니라 인간 트랜스크로모조말/트랜스제닉 계통 KM (Mederex, Inc.)을 사용하여 제조하였다. 이러한 계통들은 모두 인간으로부터 단리된 항체와 구별할 수 없는 완전히 인간형인 항체를 발현한다. 이러한 마우스 계통에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자가 [Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820]에 기술된 바와 같이 동종접합적으로 파괴되었고, 내인성 마우스 중쇄 유전자가 PCT 공보 WO 01/09187의 실시예 1에 기술된 바와 같이 동종접합적으로 파 괴되었다. 각각의 이러한 마우스 계통들은 [Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기술된 바와 같은 인간 카파 경쇄 트랜스진인 KCo5를 보유한다. HCo7 계통은 미국 특허 번호 5,545,806; 5,625,825; 및 5,545,807에 기술된 바와 같은 HCo7 인간 중쇄 트랜스진을 보유한다. HCo12 계통은 PCT 공보 WO 01/09187의 실시예 2에 기술된 바와 같은 HCo12 인간 중쇄 트랜스진을 보유한다. KM 계통은 [Ishida et al., (2002), Cloning and Stem Cells, 4: 91-102]에 기술된 바와 같은 인간 미니-염색체를 보유한다.

CD44에 대한 완전히 인간형인 인간 모노클로날 항체를 생성시키기 위해, HCo7, HCo12 및 KM 계통의 HuMab 마우스를 THP-1 세포, 정제된 재조합 CD44-Fc 또는 인간 CD44를 발현하는 300-19 형질전환체로 면역화시켰다. [Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859]; [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] 및 PCT 공보 WO 98/24884에 HuMab 마우스에 대한 일반적인 면역화 계획이 기술되어 있다. 마우스들은 항원의 1차 주입시 6-16주령이었다. CD44-Fc 항원의 정제된 재조합 제제 (5-20 ㎍), THP-1 세포 또는 형질감염된 300-19 세포의 제제 (1×10⁷ 개의 세포)를 사용하여, 복강내 (IP), 피하 (Sc) 또는 발바닥 주사 (fp)를 통해 HuMab 마우스를 면역화시켰다.

트랜스제닉 마우스를 1-4주 간격으로 복강내로 및 피하로 Ribi 애쥬번트 내의 항원으로 면역화시켰다 (총 8회까지의 면역화). 안와 후방 출혈에 의해 수득한 혈액에서 면역 응답을 모니터링하였다. FACS (하기에 기술됨)에 의해 혈청을 스크 리닝하고, 항-CD44 인간 면역글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용하였다. 희생시켜 지라 및/또는 림프절을 제거하기 3일전 및 2일 전에 항원으로 마우스를 부스팅시킨 후, 희생시켰다. 전형적으로, 각각의 항원에 대해 10-20회의 융합을 수행하였다. 총 81마리의 HCo7, HCo12 및 KM 마우스를 면역화시켰다. 각각의 항원에 대해 수십마리의 마우스를 면역화시켰다.

항-CD44 항체를 생산하는 HuMab 마우스의 선별:

CD44에 결합한 항체를 생산하는 HuMab 마우스를 선별하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 전장 인간 CD44를 발현하는 세포주에는 결합하지만 CD44를 발현하지 않는 대조군 세포주에는 결합하지 않는 것에 대해 유동 세포측정법 (FACS)에 의해 스크리닝하였다: 간략하게, CD44-발현 300-19 세포를 1:20으로 희석된 면역화된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 세포들을 세정하고, 특이적 항체 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. FACS 유동 세포측정법 기구 (Becton Dickinson (San Jose, CA)) 상에서 유동 세포측정 분석을 수행하였다. 가장 높은 역가의 항-CD44 항체가 발달된 마우스를 융합에 사용하였다. 하기에 기술된 바와 같이 융합을 수행하였고, 하이브리도마 상등액을 FACS에 의해 항-CD44 활성에 대해 테스트하였다.

CD44에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성:

HuMab 마우스로부터 단리된 마우스 비장세포 및/또는 림프절 림프구를 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 전기융합 (E-융합, Cyto Pulse™ 기술, Cyto Pulse™ Sciences, Inc. (Glen Burnie, MD))을 사용하여 마우스 골수종 세포주 SP2/0 (ATCC, CRL-1581, 판매자, 도시, 주)에 표준 프로토콜 또는 제조사가 권장하는 프로토콜을 사용하여 융합시켰다. 간략하게, 면역화된 마우스로부터의 지라 및/또는 림프절 림프구의 단일 세포 현탁액을 50％ PEG (Sigma (St. Louis, MO)) 또는 E-융합을 각각 사용하여 1/3 내지 동일한 개수의 Sp2/0 비-분비형 마우스 골수종 세포에 융합시켰다. 세포를 약 1×10⁵개의 비장세포/웰 (PEG) 또는 2×10⁴개의 비장세포/웰 (E-융합)로 편평 바닥 미량역가 플레이트에 플레이팅하고, 10-14일 동안 10％ 소 태아 혈청, 10％ P388D1 (ATCC, CRL-TIB-63) 컨디셔닝 배지, DMEM 내의 3-5％ (IGEN) (Mediatech (Herndon, VA), 카탈로그 번호 CRL 10013, + 높은 글루코스, L-글루타민 및 피루브산나트륨), 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 ㎎/㎖ 젠타마이신 및 1× HAT (Sigma, 카탈로그 번호 CRL-P-7185)를 함유하는 선별 배지에서 인큐베이션하였다. 1-2주 후, 세포를 HAT가 HT로 교체된 배지에서 배양하였다. 세포를 플레이팅하고 나서 약 10-14일 후, 개별적인 웰로부터의 상등액을 인간 감마, 카파 항체를 함유하였는지 여부에 대해 1차로 스크리닝하였다. 그후, 인간 감마, 카파에 대해 양성으로 채점된 상등액을 FACS (상기 기술됨)에 의해 인간 항-CD44 모노클로날 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 24웰 플레이트로 옮기고, 다시 스크리닝하고, 인간 항-CD44 IgG 모노클로날 항체에 대해 양성으로 확인되면, 한계 희석에 의해 2회 이상 서브클로닝하였다. 그후, 안정적인 서브클론을 시험관내에서 배양하여, 추가적인 특성화를 위한 조직 배양 배지 내의 소량의 항체가 생성되었다.

이러한 하이브리도마들이 2005년 8월 10일에 ATCC (American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209))에 부다페스트 조약에 따라, 그리고 37 C.F.R. §§1.801-1.809 하의 기탁 조건에 따라 기탁되었다. 또한, mAb 10C8.2.3에 상응하는 cDNA를 함유하는 벡터가 동일한 조건에 따라 2006년 7월 15일에 ATCC에 ATTC 명칭 PTA-7658 및 7659 하에 기탁되었다. 기탁물에 대한 대중적인 접근에 대한 모든 제한사항은 본 출원에 대한 특허의 허여 시 취소불가능하게 제거될 것이고, 기탁기관이 살아 있는 샘플을 제공할 수 없는 경우 기탁물이 교체될 것이다.

하이브리도마들에게 하기의 접속 번호가 할당되었다:

실시예 2

안정적인 세포주 및 CD44-Ig 융합 단백질을 생성시키기 위한

인간 및 사이노몰구스 CD44 cDNA의 클로닝

인간 CD44 cDNA 클로닝:

인간 CD44 (서열 1)를 인간 지라 cDNA (Clontech Labs. Inc. (Mountain View, CA), 카탈로그 번호 639312)로부터 하기의 프라이머를 사용하여 클로닝하였다: 5'-atggacaagttttggtggcacgcagcctgg-3' (서열 155) 및 5'- ttacaccccaatcttcatgtccaca-3' (서열 156). PCR 생성물을 하기의 프라이머를 사용하여 다시 증폭시켜, XhoI 및 XbaI 제한 부위를 부가하였다: 5'-gactcgaggccaccatggacaagttttggtggc-3' (서열 157) 및 5'-gatctagatcactattacaccccaatcttcatgtcc-3' (서열 158). 이러한 2차 PCR 생성물을 pMIG 포유류 발현 벡터 내로 결찰시키고, 양쪽 가닥에서 CD44 서열을 확인하였다. [Hawley et al., (1994) Gene Thera. 1:136-138].

사이노몰구스 CD44 cDNA 클로닝:

사이노몰구스 CD44 유전자를 사이노몰구스 PBMC cDNA로부터 하기의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 5'-atggacaagttttggtgg-3' (서열 159) 및 5'- gttacaccccaatcttcatgtcca-3' (서열 160). PCR 생성물을 PCR2.1 TOPO 벡터 (Invitrogen, City (Carlsbad, CA), 카탈로그 번호 K4510-20) 내로 결찰시켰다. 19개의 클론을 서열분석하였고, 모든 상기 클론들의 컨센서스 서열에 의해 사이노몰구스 CD44 서열을 결정하였다. 2개의 클론 5-2 (서열 153) 및 5-8 (서열 8)의 핵산 서열이 제시된다. 사이노몰구스 CD44로 확인된 서열 (서열 8)을 포유류 발현 벡터 pMIG 내로 서브클로닝하였다. [Hawley et al., (1994)].

300-19 인간 및 사이노몰구스 CD44 300-19 과발현 세포주:

pMIG-인간 CD44 및 pMIG-사이노몰구스 CD44 양쪽 모두를 FUGENE 6 형질감염 시약 (Hoffman-La Roche Inc. (Nutley, NJ), 카탈로그 번호 11815091001)으로 293T/17 세포 (ATCC 번호 CRL-11263) 내로 형질감염시켜, 인간 CD44 및 사이노몰구스 CD44 레트로바이러스를 생성시켰다. 이어서, 양쪽 레트로바이러스를 300-19 세포 내로 형질도입하여 인간 CD44 및 사이노몰구스 CD44 발현 세포주를 생성시켰다.

인간 CD44-IgG1 융합 단백질의 클로닝:

인간 CD44의 세포외 도메인이 인간 IgG1융합 단백질 (서열 3)로서 발현되었다. CD44의 성숙형 세포외 도메인을 코딩하는 cDNA를 인간 백혈구 cDNA (Clontech Labs. Inc.)로부터 PCR 증폭시키고 (Klentaq PCR 키트, Clontech Labs Inc. (Mountain View, CA), 카탈로그 번호 639108), 포유류 발현 벡터인, CD5 리더 서열 및 인간 IgG1 태그를 함유하는 PCDMamp 내로 서브클로닝하였다. 하기의 PCR 프라이머들이 CD44 표준 형태의 공개된 서열에 대해 디자인되었다 ([G. R. Screaton, et al., (1992) PNAS 89:12160-12164]):

(CD44+C: AGTGAGACTAGTCAGATCGATTTGAATATAACCTGCCGCTTTG) (서열 161),

(CD44-D: ATCACTGAGATCTTCTGGAATTTGGGGTGTCCTTATAG) (서열 162).

완전한 CD44IgG1 cDNA가 서열분석되었고, 양쪽 가닥에서 확인되었다.

사이노몰구스 CD44-IgG1 단백질 클로닝:

사이노몰구스 CD44의 세포외 도메인이 인간 IgG1 Fc 융합 단백질 (서열 5)로서 발현되었다. 사이노몰구스 CD44의 성숙형 세포외 도메인을 코딩하는 cDNA를 pMIG-사이노몰구스 CD44 벡터로부터 PCR 증폭시키고, CD5 리더 서열, 인간 IgG1 태그, 뿐만 아니라 XhoI 및 HpaI 제한 부위를 함유하는 인-하우스(in-house) 포유류 발현 벡터 pLNp 내로 서브클로닝하였다. XhoI 및 EcoRV 제한 부위와 함께 인간 CD44 세포외 도메인과 정렬되도록 PCR 프라이머를 디자인하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다: 5'-atcggcgatccagatcgatttgaatataacc-3' (서열 163), 5'- ctgtgcctcgagccattctggaatttggggtgtcc-3' (서열 164). 완전한 사이노몰구스 CD44 세포외 IgG1 cDNA가 양쪽 가닥에서 서열 확인되었다.

모든 상기 클로닝에 대한 PCR 조건에서 표준 PCR 프로토콜에 따라 플래티늄 Taq 중합효소 (Invitrogen, 카탈로그 번호 11304-011)가 사용되었다: 95℃에서 3분; 25 × (55℃에서 30초, 78℃에서 1분); 72℃에서 7분.

인간 CD44 및 사이노몰구스 CD44의 세포외 도메인의 발현 및 정제:

프리스타일(Freestyle) 293 발현 시스템 (Invitrogen, 카탈로그 번호 K9000-01)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 인간 CD44IgG1 (서열 3) 및 사이노몰구스 CD44 IgG1 융합 단백질 (서열 5) 양쪽 모두가 발현되었다.

융합 단백질을 단백질 A 아가로스 비드 (Pierce (Rockford, IL), 카탈로그 번호 15918-014) 상에서 정제하였다. 배양 배지를 수확한 후, 프로테아제 억제제 정제 (Hoffman La-Roche 카탈로그 번호 1 697 498, 1개의 정제/50 ㎖ 배지), 트리스 완충제 (pH 8.0, 최종 농도 10 mM) 및 아지드화나트륨 (최종 농도 0.02％)를 첨가하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 단백질 A 비드의 50％ 슬러리 1 ㎖을 100 ㎖ 배지마다 첨가하였다. 배지/슬러리 혼합물을 2시간 이상 동안 4℃에서 회전시켰다. 1000×g에서 10분 동안의 회전으로 아가로스 펠렛이 생성되었다. 상등액을 조심스럽게 제거하고, 아가로스 펠렛을 2-3배 부피의 세정 완충제 (0.1M 트리스 HCl (pH 7.5), 0.1 M NaCl)에 재현탁시키고, 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 베드 부피 20배의 세정 완충제로 세정하고, 베드 부피 5배의 용출 완충제 (ImmunoPure IgG 용출 완충제, Pierce, 카탈로그 번호 21004)로 1/2 컬럼 부피의 1M 트리스 (pH 8)을 함유하는 튜브 내로 용출시켰다. Amicon 농축기 10,000 MW 컷오프(cutoff) (Millipore (Billerica, MA))를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 완충제를 PBS로 교환하였다.

실시예 3

본 발명에 따라 제조된 항-CD44 항체의 서열

본 발명에 따라 생산된 항체의 구조를 분석하기 위해, 본 발명가들은 항-CD44 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 단편을 코딩하는 핵산을 클로닝하였다. 클로닝 및 서열분석은 하기와 같이 수행되었다:

폴리(A)+ mRNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen (San Diego, CA))를 사용하여 시알화시키고, 올리고(dT) 프라이밍을 사용하여 Advantage RT-for-PCR 키트 (BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ))로 cDNA를 mRNA로부터 합성하였다. 클론 1A9.A6.B9, 2D1.A3.D12, 및 14G9.B8.B4에 대한 올리고(dT)가 프라이밍된 cDNA를 각각 표 4, 5 및 6에 열거된 축퇴성 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 하기와 같은 사이클링으로 High Fidelity Polymerase (Roche) 및 PTC-200 DNA Engine (MJ Research)을 사용하여 증폭을 달성하였다; 95℃에서 2분, 25 × (95℃에서 20초, 52℃에서 30초, 72℃에서 2분); 72℃에서 10분. PCR 앰플리콘을 pCR2.1 TOPO (Invitrogen (Carlsbad, CA) 카탈로그 번호 K4500-01) 내로 클로닝하고, TOP10 화학적 수용성 세포 (Invitrogen) 내로 표준 프로토콜을 사용하여 형질전환시켰다. Grills 16th BDTv3.1/dGTP 화학 (Applied Biosystems Inc) 및 3730xl DNA 분석기 (Applied Biosystems Inc. (Foster, CA))를 사용하여 클론들의 서열을 확인하였다. 모든 서열들을 'V BASE 서열 디렉토리' ([Tomlinson, et al, (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798]; [Hum, (1995) Mol. Genet., 3, 853-860]; [EMBO J., 14, 4628-638])에 대한 정렬에 의해 분석하였다.

유전자 이용:

표 7에는 본 발명에 따른 항체의 선별된 하이브리도마 클론에 의해 증명된 유전자 이용이 기재된다.

서열 및 돌연변이 분석:

당업자가 이해할 바와 같이, 유전자 이용 분석은 항체 구조의 한정된 개관만을 제공한다. KM 동물 내의 B-세포는 확률적으로 V-D-J 중쇄 및 V-J 카파 경쇄 전사물을 생성하기 때문에, 다수의 2차 프로세스가 발생하고, 여기에는 체세포 과돌연변이, 결실, N-부가, 및 CDR3 확장이 비제한적으로 포함된다. 예를 들어, [Mendez et al., (1997) Nature Genetics 15:146-156] 및 PCT 공보 WO 98/24893 참조. 따라서, 항체 구조를 추가로 시험하기 위해, 항체의 예상 아미노산 서열이 클론으로부터 수득된 cDNA로부터 생성되었다.

도 2는 단리된 항-CD44 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 예상 아미노산 서열과 상응하는 경쇄 및 중쇄 유전자의 생식계통 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.

표 9-12는 항체 1A9.A6.B9 (표 9), 2D1.A3.D12 (표 10), 14G9.B8.B4 (표 11), 및 10C8.2.3 (표 12)의 중쇄 및 카파 경쇄의 뉴클레오티드 및 예상 아미노산 서열을 제공하고, 이때 각각의 항체에 대한 가변 영역이 대문자로 표시된다.

본 발명가들에 의해 1개의 돌연변이 항체 2D1.A3.D12가 생성되었다. 항체 2D1.A3.D12에서의 중쇄는 위치 28의 트레오닌 잔기가 이소류신으로 변화되도록 돌연변이되었다. 위치 38에서 항체 2D1.A3.D12의 경쇄는 글루타민 잔기가 히스티딘으로 변화되도록 돌연변이되었다.

QuickChange 부위 지정 돌연변이유발 키트 (Stratagen)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 표 8에 열거된 프라이머들로 클론 2D1.A3.D12의 V_H (I28T) 및 V_κ (H38Q) 영역에서의 돌연변이유발을 수행하였다. 자동 서열분석에 의해 돌연변이가 확인되었고, 돌연변이된 삽입물이 발현 벡터 내로 서브클로닝되었다. 항-CD44 항체 2D1.A3.D12의 돌연변이유발이 하기와 같이 수행되었다:

항-CD44 항체의 가변 도메인이 하기와 같이 발현 벡터 내로 클로닝되었다:

가변 도메인을 pCR2.1-클로닝 cDNA로부터 표 13, 14, 및 15에 열거된 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 하기와 같은 사이클링으로 Pfx 플래티늄 중합효소 (Invitrogen) 및 PTC-200 DNA Engine (MJ Research)를 사용하여 증폭이 달성되었다: 94℃에서 2분, 20 × (94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 68℃에서 1분); 68℃에서 수분. 그후, 가변 도메인을 적합한 이소타입의 불변 도메인을 함유하는 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이러한 클론들의 서열을 Grills 16th BDTv3.1/dGTP 화학 (Applied Biosystems Inc) 및 3730xl DNA 분석기 (Applied Biosystems Inc)를 사용하여 확인하였다.

실시예 4

인간 항-CD44 항차가 CD44에 대한 히알루론산 (HA)의 결합을 차단한다

HA (Sigma, 카탈로그 번호 H5388)와 실시예 2에 기술된 바와 같은 인간 CD44 단백질 (서열 3) 간의 상호작용을 억제하는 능력에 대해 인간 항-CD44 항체를 평가하였다.

96웰 ELISA 분석 플레이트 (Immunolux HB Maxisorp 96-웰 플레이트, Nunc 카탈로그 번호 442404)에서 결합 분석법을 수행하였다. 제1일에, 50 mM 탄산수소나트륨 완충제 (pH 9.6)에 2.5 ㎎/㎖로 희석된 닭볏 HA 100 ㎕를 플레이트 상의 분석 웰에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 약 24시간 후에, HA로 코팅된 플레이트를 300 ㎕의 PBS 완충제 + 0.05％ 트윈-20 (Sigma, 카탈로그 번호 P1379)을 사용하여 4회 세정하였다. 그후, PBS 내의 3％ BSA 200 ㎕를 각각의 웰에 첨가함으로써 플레이트를 차단하고, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그후, 차단된 플레이트를 PBS + 0.05％ 트윈-20으로 세정하였다. 별도의 96웰 폴리프로필렌 플레이트 (Falco, 카탈로그 번호 351190)에서, 다양한 농도로 PBS + 1％ BSA에 희석된 항-CD44 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3을 50 ㎕ 부피의 최종 농도 0.6 ㎍/㎖의 인간 CD44-Ig 융합 단백질과 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 후, HA-코팅 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS + 0.05％ 트윈-20으로 세정하였다. (HA에 결합된 CD44-Ig를 검출하기 위하여) 1％ BSA에 1:500으로 희석된 항-인간 IgG-HRP (Amersham Biosciences (Piscataway, NJ), 카탈로그 번호 NA933)를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 인큐베이션하였다. 그후, 플레이트를 다시 세정하고, 50 ㎕의 TMB (TMB 마이크로웰 과산화효소 기질, KPL, 52-00-02)를 첨가하고, 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 그후, 반응물을 50 ㎕의 정지 용액으로 정지시키고, OD₄₅₀ 값을 플레이트 판독기 상에서 측정하였다. 도 3은 CD44 항체 1A9.A6.B9가 HA와 CD44-Ig 융합 단백질 간의 상호작용을 차단하는 것을 그래프로 도해한다. 표 16은 항-CD44 항체의 IC50을 나타낸다.

실시예 5

항-CD44 모노클로날 항체의 결합 상수의 결정

본 발명가들은 CD44에 대한 본 발명의 항체의 결합 친화력을 실연하기 위한 또다른 시험관내 분석법을 수행하였다.

결합 연구에서, 항-CD44 Ab가 평형 결합 분석에서 형질감염된 세포 상의 CD44에 결합하고, 결합 상수는 0.98 ㎍/㎖ (6.8 nM, 도 4A-C, 특히 도 4C 참조)라는 것이 실연되었다. 인간 CD44 단백질을 코딩하는 레트로바이러스 벡터가 형질도입된 300-19 세포를 PBS로 2회 세정하였다. 그후, 300-19 세포를 FACS 완충제 [PBS (Sigma, 카탈로그 번호 D-8537); 0.02％ 아지드(Azide) (Sigma, 카탈로그 번호 S-2000); 5 ㎍/㎖ 사이토칼라신 B1 (Sigma, 카탈로그 번호C-6762) 및 2％ 소 태아 혈청 (Gibco (도시, 주), 카탈로그 번호 16140-071)]에 1×10⁶ 개의 세포/㎖의 세포 밀도로 재현탁시켰다. 400 ㎕의 CD44 발현 300-19 세포 (2×10⁵ 개/400 ㎕)를 Nunc-Immuno 튜브 (VWR, 카탈로그 번호 443990) 내로 옮기고, 5 ㎕의 항-인간 IgG FITC (Jackson, 카탈로그 번호 109-095-098) 및 다양한 농도의 1A9.A6.B9를 첨가하고, 튜브를 진탕기 플레이트 (Thermolyne, 로토믹스(rotomix) 타입 48200) 상에서 실온에서 3시간 동안 계속 진탕하면서 인큐베이션하였다. 3시간 후, 세포를 FACS 완충제로 2회 세정하였다. 세포를 250 ㎕의 1 ％ 파라포름알데히드 (Electron Microscopy Science (Ft. Washington, PA), 카탈로그 번호 15710) 내로 재현탁시켰다. Becton Dickinson FACSCalibur를 사용하여 튜브를 판독하고, CellQuest Pro (Becton Dickinson)를 사용하여 데이터를 분석하였다. (도 4C 참조).

항-CD44 항체는 말초 CD3+ T 세포 상에 발현된 인간 CD44 및 사이노몰구스 CD44 단백질에 또한 결합하였다 (도 4A 및 4B 참조). 구체적으로, 정상적인 인간 지원자로부터 인간 말초 혈액을 헤파린이 있는 진공채혈관 (Becton Dickinson, 카탈로그 번호 366480) 내에 수집하였다. 수집된 인간 혈액 100 ㎕를 Nunc-Immuno 튜브 (VWR 카탈로그 번호 443990)에 첨가하였다. 0.2 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 최종 농도가 달성되도록 항-CD44 Ab를 각각의 튜브 내로 첨가하였다. 그후, 10 ㎕의 항-CD3-PerCP (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 347344) 및 10 ㎕의 항-CD14-APC (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 555399)를 각각의 튜브에 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 100 ㎕의 FACS 세정 완충제 (PBS-Sigma D8537; 0.02％ 아지드, Sigma 카탈로그 번호 S2002 및 2％ 소 태아 혈청, Gibco 카탈로그 번호 16140-071), 뿐만 아니라 50 ㎕/웰의 1:100배 희석된 2차 FITC 표지 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체 (Jackson 카탈로그 번호 109-095-098)를 첨가하였다. 25분 동안 4℃에서 암실에서 인큐베이션하였다. 25분 인큐베이션 후, 2 ㎖의 FACS 용해 용액 (BD Pharmingen, 물에서 1:10으로 희석됨)을 첨가하고, 와류시키고, 다시 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 10분 인큐베이션 후, 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 세포를 FACS 세정 완충제로 세정한 후, 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 그후, 세포를 250 ㎖의 1 ％ 파라포름알데히드 (Electron Microscope Science (Ft Washington, PA), 카탈로그 번호 15710)로 고정하고, Becton Dickson FACS Calibur를 사용하여 판독하고, CellQuest Pro (Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.

ELISA 결합 연구:

ELISA 결합 연구는 1A9.A6.B9가 96웰 플레이트 상에 코팅된 인간 및 사이노몰구스 CD44-Ig 융합 단백질에 결합한다는 것을 실연하였다 (도 5 참조). 분석법을 시작하기 위해, PBS 내 1 ㎍/㎖의 CD44-Ig 융합 단백질 50 ㎕를 96웰 분석 플레이트 (Immuno Maxisorp 플레이트, Nunc. 카탈로그 번호 442404)에 첨가하고, 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 플레이트를 PBS, 0.05％ 트윈-20으로 4회 세정하였다. 그후 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 200 ㎕/웰의 PBS 내의 3％ BSA로 차단하고, 다시 세정하였다. 항-CD44 항체 1A9.A6.A9를 PBS 및 1％ BSA로 다양한 농도로 희석하고, 플레이트에 첨가하여, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정하고, PBS 내의 1％ BSA에서 1:2000으로 희석된 항-인간 카파 경쇄-HRP 항체 (Amersham Bioscience, 카탈로그 번호 NA 933) 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세정하고, 50 ㎍/㎖의 TMB 마이크로웰 과산화효소 기질 (카탈로그 번호 KPL S2-00-02)을 첨가하고, 5 내지 10분 동안 인큐베이션하였다. 정지 용액으로 ELISA 반응을 정지시키고, OD450 값을 플레이트 판독기에 의해 측정하였다.

BIAcore 결합 연구:

표면 플라즈몬 공명을 사용하여, 표면 상에 인간 CD44-Fc 융합 단백질 (12 ㎍/㎖, 10 mM 아세테이트, pH 4.0)으로 코팅된 CM5 센서 칩 상에서 분자성 상호작용을 측정하였다. 5, 3, 2, 1, 0.5 및 0.25 ㎍/㎖ 농도의 항-CD44 Ab를 직접적인 방법에 의해 스크리닝하였다. 인간 IgG1 및 IgG2 표준물을 사용하여, 비-특이적 및 배경 결합을 점검하였다. 곡선의 회합 및 해리 단계의 초기 부분을 사용하여 친화력 및 속도 상수가 계산되었고, 표 17에서 보고된다.

실시예 6

항-CD44 모노클로날 항체가 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터의

염증성 사이토카인 생산을 차단한다

정제된 인간 PBMC로부터의 HA (Sigma, 카탈로그 번호 H5388)에 의해 자극된 IL-1β 방출을 차단하는 능력에 대해 항-CD44 항체를 또한 평가하였다 (도 6 참조). 인간 말초 혈액을 정상적인 인간 지원자로부터 헤파린이 있는 진공채혈관 (Becton Dickinson, 카탈로그 번호 366480) 내에 수집하였다. Sigma Accuspin 튜브 (Sigma, 카탈로그 번호 A7054)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 PBMC를 단리하였다. 정제된 세포를 RPMI 1640 (Gibco, 카탈로그 번호 11875-093)으로 2회 세정하고, 5×10⁶ 개로 RPMI에 재현탁시켜, 96웰 분석 플레이트 (Costar, 카탈로그 번호3596)에 100 ㎕ PBMC/웰로 첨가하였다. 그후, RPMI 내의 다양한 농도의 항-CD44 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3의 존재 하에 인간 PBMC를 HA (Sigma, 카탈로그 번호 H1751)로 자극하였다. 구체적으로, 100 ㎕의 HA 스톡 용액 (RPMI 내의 10 ㎍/㎖)을 PBMC 및 20 ㎕의 다양한 농도의 항-CD44 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3와 혼합하였다. 분석 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 습식 환경 하에 인큐베이션하였다 (Narco 6300 CO₂ 인큐베이터). 그후, 플레이트를 10분 동안 1200 rpm에서 원심분리하였다. 그후, 각각의 웰로부터 상등액을 제거하고, IL-1β ELISA에 의해 제조업자의 프로토콜에 따라 측정하였다 (IL-1β Quantikine ELISA 키트, R&D 카탈로그 번호DLB50). (표 18 참조).

실시예 7

항-CD44 모노클로날 항체가 인간 말초 T 세포로부터의 사이토카인 생산을 차단한다

항-CD44 모노클로날 항체가 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 자극된 인간 말초 T 세포로부터의 IL-2 및 IFN-γ 생산을 차단하였다. 인간 말초 혈액을 정상적인 인간 지원자로부터 헤파린이 있는 진공채혈관 (Becton Dickinson, 카탈로그 번호 366480) 내에 수집하였다. 그후, 혈액을 Falcon 폴리프로필렌 튜브 (Falcon 카탈로그 번호2059) 내의 PBS에 희석된 동일한 부피의 항-CD3 (UCTH1, R&D, 카탈로그 번호 MAB100) 및 항-CD28 항체 (R&D, 카탈로그 번호 AF-342-PB)와 혼합하였다. 항-CD3 및 항-CD28 항체의 최종 농도는 각각 약 1 ㎍/㎖ 및 10 ng/㎖였다. 96웰 폴리스트렌 플레이트 (Costar, 카탈로그 번호3596)에서, 10 ㎕의 다양한 농도의 항-CD44 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 및 14G9.B8.B4를 각각의 웰에 첨가한 후, 항-CD3 및 항-CD28 항체와 예비 혼합된 인간 전혈 200 ㎕와 혼합하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청을 제거하고, IFN-γ 및 IL-2 ELISA 분석법 (R&D, 각각 카탈로그 번호 DIF50 및 D2050)에 의해 테스트하였다. (하기 표 19 참조).

실시예 8

CD44의 표면 발현의 감소

유동 세포측정법 (FACS) 분석을 수행하여, 항-CD44 항체에 의한 CD44의 표면 발현의 감소를 검출하였다. 각각의 항-CD44 항체를 인간 전혈과 함께 약 12시간 동안 시험관내 조건 하에 인큐베이션하였고, 인간 말초 백혈구 상에서 감소된 CD44 표면 발현 수준을 검출하였다 (도 7 참조). 10 ㎕의 다양한 농도의 항-CD44 항체 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; 및 10C8.2.3을 96웰 편평 바닥 폴리스티렌 분석 플레이트 (Costar, 카탈로그 번호3596)에 첨가하였다. 인간 말초 혈액을 정상적인 인간 지원자로부터 헤파린이 있는 진공채혈관 (Becton Dickinson, 카탈로그 번호 366480) 내에 수집하였다. 그후, 100 ㎕/웰의 인간 혈액을 항-CD44 Ab와 혼합하고, 37℃에서 24시간 동안 습식 환경 하에 인큐베이션하였다 (Narco 6300 CO₂ 인큐베이터). 그후, 20 ㎕의 CD44 검출 항체인 G-44-26-PE (BD PharMingen (Franklin Lakes, NJ), 카탈로그 번호 555479), 10 ㎕의 항-CD3-perCP 항체 (BD PharMingen, 카탈로그 번호 347344) 및 10 ㎕의 항-CD14-APC 항체 (BD PharMingen, 카탈로그 번호 555399)를 웰에 첨가하고, 암실에서 얼음 상에서 30 내지 40분 동안 유지시켰다. 그후, 플레이트로부터 100 ㎕의 혈액을 제거하고, nunc-immuno 튜브 (VWR (West Chester, PA), 카탈로그 번호 443990)로 옮기고, 2 ㎖의 FACS 용해 용액 (BD Pharmingen 카탈로그 번호 349202)을 물 내의 1:10 희석물로 첨가하고, 와류시키고, 실온에서 10분 동안 방치하였다. 10분 후, 혈액을 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 세포를 FACS 세정 완충제 (PBS, 0.02％ 아지드, Sigma, 카탈로그 번호 S2002 및 2％ 소 태아 혈청 (Gibco, 카탈로그 번호 16140-071))로 세정하였다. 혈액을 다시 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, FACS 세정 완충제로 세정하였다. 그후, 세포를 250 ㎖의 1 ％ 파라포름알데히드 (Electron Microscopy Science, 카탈로그 번호 15710)로 고정하고, 튜브를 FACS Calibur를 사용하여 판독하고, Cellquest 소프트웨어를 사용하여 분석하였다 (표 20 및 21 참조). 도 8은 (a) 림프구, (b) 단핵구, 및 (c) PMN에 대한 10 ㎍/㎖ 농도의 1A9.A6.B9 항체에서의 FACS 결과를 나타낸다. 1A9.A6.B9 항체 결과는 회색으로, 기준선 발현은 흑색으로 표시된다.

실시예 9

항-CD44 항체 1A9.A6.B9의 단일 용량 생체내 연구가 사이노몰구스 원숭이에서

말초 CD3+ T 세포 상에서의 CD44 발현의 용량 의존적 감소를 유도한다

단일 정맥내 용량의 1A9.A6.B9 (25 mM 아세트산나트륨, 140 mM NaCl, 0.2 ㎎/㎖ 폴리소르베이트-80, pH 5.5 내의 10 ㎎/㎖)를 1, 10 및 100 ㎎/㎏ (용량 군 당 수컷 2마리 및 암컷 2마리)으로 Charles River Primates, BRF (Bio Research Facility, House Texas)에서 공급된 사이노몰구스 원숭이에게 투여함으로써 항-CD44 항체에 의해 유도된 림프구 (도 9A 참조) 및 단핵구 (도 9B 참조)로부터의 CD44 표면 발현의 감소를 시험하였다. 3색 (CD3+, CD14+, CD44+) 유동 세포측정법 분석을 위해 혈액 샘플 (약 2 ㎖)를 단식시킨 원숭이로부터 처리전 2회, 및 투약하고 나서 2시간 후, 24시간 후, 48시간 후, 168시간 후, 336시간 후 및 504시간 후에 대퇴부 정맥천자에 의해 수집하였다.

FACS 분석법에 의해 CD44 발현을 검출하기 위해, 100 ㎕의 말초 혈액을 20 ㎕의 CD14-FITC (클론 M5E2, BD-Pharm 카탈로그 번호 67509), 20 ㎕의 CD3-PerCP (BD-Pharm, 카탈로그 번호 13043) 및 10 ㎕의 CD44-PE (IM7, BD-Pharm 카탈로그 번호 8900)의 조합물, 또는 20 ㎕의 CD14-FITC (클론 M5E2, BD-Pharm 카탈로그 번호 67509), 20 ㎕의 CD3-PerCP (BD-Pharm, 카탈로그 번호 13043) 및 10 ㎕의 Rt IgG2b-PE (IM7, BD-Pharm 카탈로그 번호 60254)의 조합물과 혼합하였다. 중저속에서 1시간 동안의 와류를 사용하여 항체를 혼합하였다. 항체와 함께 혈액을 20분 내지 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였고, 1.5 ㎖의 1:10 FACS 용해 용액 (B.D. Pharmingen (San Diego, CA))을 각각의 튜브에 첨가하였다. 각각의 튜브를 중저속에서 1-3초 동안 와류기 상에서 혼합시켰다. 튜브를 실온에서 암실에서 약 12분 동안 인큐베이션하였다. 완전한 용해를 확실히 하기 위해, 각각의 튜브의 불투명도를 점검하였고, 흐리게 보이는 튜브에 추가적인 500 ㎕의 FACS 용해 용액을 첨가하였다. 추가적인 2 ㎖의 BD 염색 완충제 (BD PharMingen (San Diego, CA), 카탈로그 번호 55465C)를 첨가하였다; 튜브의 뚜껑을 다시 닫고, 튜브를 뒤집어서 혼합시켰다. 그후, 튜브를 진동 버킷 내에 놓고, 250×g에서 6-7분 동안 실온에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 염색 완충제로 세정하였다. 100 ㎕의 사이토픽스(cytofix) 완충제 (PBS + 4％ w/v 파라포름알데히드)를 세포에 첨가하였다. FACSCalibur 상에 적용하기 전에 샘플을 암실에서 4℃에서 유지시켰다. 100 ㎕의 사이토픽스 완충제 (PBS + 4％ W/V 파라포름알데히드)를 세포에 첨가하였다. 샘플을 4℃의 암실에서 사이토픽스 완충제에서 보관하였다. 100 ㎕의 PBS를 모든 튜브에 첨가한 후, 세포를 FACSCalibur 상에서 분석하였다. 게이팅(gating)된 림프구 상의 총 20,000개의 사건이 수집되었다.

실시예 10

에피토프 분류 연구

BIAcore™을 사용하여 경쟁 결합 분석을 수행하였다.

BIAcore 에피토프 지도작성 실험:

BIAcore™ 상에서 경쟁 분석법을 실행함으로써 CD44 항체 1A9.A6.B9, 2D1.A3.D12 및 14G9.B8.B4의 에피토프 지도작성을 수행하였다 (항체 농도에 대해 표 22, 에피토프 지도에 대해 표 23 참조). 바이오센서 생체특이적 상호작용 분석 기구 (BIAcore 2000) + 표면 플라즈몬 공명을 사용하여, CM5 센서 칩 상에서의 분자성 상호작용을 측정하였다. 센서 칩의 덱스트란 측면에 대한 분자의 상호작용에 의해 야기된, 2개의 매질 (유리 및 카르복시메틸화 덱스트란) 사이의 굴절 지수에서의 변화가 측정되었고, 제조업자의 애플리케이션 노트에 상술된 임의의 반사율 단위 (RU)에서의 변화로 보고되었다.

센서 칩 상의 유동 세포의 카르복시메틸화 덱스트란 표면이 7분 동안 0.2 M N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드에 의해 매개된 0.05 M N-히드록시숙신이미드로의 유도체화에 의해 활성화되었다. 10 mM 아세트산나트륨 (pH 3.5) 내의 30 ㎍/㎖ 농도의 CD44-Ig가 5 ㎕/분의 속도로 유동 세포 내로 수동으로 주입되었고, 원하는 양의 RU로 유동 세포 표면에 공유결합으로 고정되었다. 미반응 N-히드록시숙신이미드 에스테르의 비활성화가 1 M 에탄올아민 히드로클로라이드 (pH 8.5)로 수행되었다. 고정 후, 안정적인 기준선이 달성될 때까지 5 ㎕의 50 mM NaOH의 5회의 재생 주입으로 유동 세포에서 미반응 또는 불량 결합 물질을 제거하였다. 유동 세포 2는 약 62 RU를 나타냈고, 유동 세포 3은 약 153 RU를 나타냈다. 활성화된 백지 표면인 유동 세포 1에 대해, 고정 동안 항원 대신 35 ㎕의 10 mM 아세트산나트륨 완충제를 주입하였다. 유동 세포 4는 약 200 RU의 관련되지 않은 항원 대조군인 고정된 CTLA4-Ig를 함유하였다.

에피토프 지도작성 실험을 러닝(running)/희석 완충제 (HBS-EP)를 사용하여 수행하였다. 유속은 5 ㎕/분이었고, 기구 온도는 20℃였다. 각각의 쌍의 항체의 결합 후, 50 mM NaOH의 5 ㎕ 주입을 사용하여 유동 세포 표면이 기준선으로 재생되었다. 러닝 완충제 내의 정제된 항체를 30 ㎍/㎖으로 희석하고, 25 ㎕의 부피로 주입하였다.

유동 세포 표면을 제1 항체로 포화시키고, 즉각적으로 제2 항체를 주입하였다. 그후, 제2 항체의 결합을 고정된 CD44-Ig 표면에 대한 "결합", "결합하지 않음" 또는 "부분적으로 결합함"으로 평가하였다. 결합을 평가한 후, 표면을 재생시키고, 패널에 동일한 제1 항체를 다시 주입하고 나서, 다음 항체를 주입하였다. 패널 내의 모든 항체가 CD44-Ig에의 결합에 대해 평가될 때까지 이러한 주입 계획을 계속하였다. 또다른 항체를 제1 항체로 선택하고, 다른 항체를 CD44-Ig에 결합하는 제2 항체로서 평가하였다. 구체적으로, 항-CD44 항체 14G9.B8.B4가 제1 항체로 테스트된 경우, 14G9.B8.B4에 대한 오프-속도가 결합과 관련하여 빠르기 때문에 제2 항체와 공동 주입되었다.

모든 항체가 패널 내의 모든 항체에 대해 1차 주입물로서 테스트된 후, 유사한 결합 패턴을 하나의 에피토프 군으로 조합시키는 감소된 매트릭스가 제조되었다. 그후, 감소된 매트릭스에 따라 위상학적 지도를 작성할 수 있었다. 상이한 에피토프들 간의 간섭을 나타내는 항원 CD44-Ig의 위상학적 표면 지도의 관점에서 결합 매트릭스를 해석할 수 있었다. 이같은 지도는 기능적 관계만을 나타내고, 항원 표면의 실제 물리적 구조에 대한 어떠한 대응을 지녀야 하는 것은 아니다.

BIAcore 경쟁 결합 분석은 mAb 1A9.A6.B9 및 14G9.B8.B4가 인식하는 에피토프가 항체 515가 인식하는 에피토프와 중첩된다는 것을 나타냈다. 또한, BIAcore™ 연구는 mAb 1A9.A6.B9 및 14G9.B8.B4가 항체 IM7과 중첩되지 않았음을 나타냈다.

실시예 11

항-CD44 항체의 선택성

본 발명가들은 CD44 항체 대 림프관 내피 히알루로난 수용체 1 단백질 (LYVE-1) (R&D, 카탈로그 번호 2089-Ly)의 결합 친화력을 측정하였고, 항-CD44 항체에 CD44에 대해 LYVE-1에 비해 100배를 초과하는 선택성이 있다는 것을 발견하였다 (표 24 참조). 96웰 ELISA 플레이트 (Immuno Maxisorp 플레이트, Nunc 카탈로그 번호 442404)를 50 ng의 CD44-Ig 융합 단백질 또는 LYVE-1으로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그후, 플레이트를 PBS, 0.05％ 트윈-20으로 세정하고, PBS 내의 3％ BSA로 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 항-CD44 항체 또는 항-LYVE-1 항체 (R&D, 카탈로그 번호 AF 2089)를 PBS 내의 1％ BSA에 다양한 농도로 희석하고, 플레이트에 첨가하였다. ELISA 플레이트를 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정하고, PBS 내의 1％ BSA에 1:2000으로 희석된, 항-CD44 항체에 대한 항-인간 카파 경쇄-HRP 항체 (Bethyl, 카탈로그 번호 A80-115P.6) 또는 항-LYVE-1 항체에 대한 항-염소 IgG-HRP (Cappel/ICN, 카탈로그 번호 55363) 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세정하고, 50 ㎍/㎖의 TMB를 첨가하고, 5 내지 10분 동안 인큐베이션하였다. 정지 용액으로 ELISA 반응을 정지시키고, 플레이트 판독기로 OD450 값을 측정하였다.

실시예 12

MEM-85 및 1A9.A6.B9 항-CD44 항체의 결합 경쟁 연구

본 발명에 따른 인간 항-CD44 항체가 시판되는 항-CD44 항체 MEM-85 (Caltag Laboratories (Burlingame, CA), 카탈로그 번호 MHCD4404-4)와 CD44 분자 상의 동일한 부위 또는 상이한 부위에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 본 발명가들은 FACS 연구를 수행하였다.

레트로바이러스 벡터 상의 인간 CD44 분자가 형질도입된 CD3+ 인간 말초 T 세포 및 300-19 세포를 사용하여 FACS-기반 CD44 경쟁 결합 분석법을 수행하였다. 인간 말초 혈액을 정상적인 인간 지원자로부터 헤파린이 있는 진공채혈관 (Becton Dickinson, 카탈로그 번호 366480) 내에 수집하였다.

인간 말초 T 세포의 FACS 연구:

인간 말초 혈액을 정상적인 인간 지원자로부터 헤파린이 있는 진공채혈관 (Becton Dickinson, 카탈로그 번호 366480) 내에 수집하였다. 100 ㎕의 수집된 인간 혈액을 Nunc-Immuno 튜브 (VWR 카탈로그 번호 443990)에 첨가한 후, 10 ㎕의 항-CD44 Ab 1A9.A6.B9를 각각의 튜브 내로 0.2 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 최종 농도에 도달하도록 첨가하였다. 튜브를 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 5분 인큐베이션 후, 20 ㎕의 CD44 검출 Ab (MEM-85, 카탈로그 번호 MHCD4404-4) 및 항-CD3-PerCP (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 347344), 10 ㎕의 항-CD14-APC (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 555399), 및 10 ㎖의 항-CD4-APC (BD Pharmingen 카탈로그 번호 555349)를 각각의 튜브에 첨가하고, 얼음 상에서 30분 내지 40분 동안 암실에서 유지시켰다. 2 ㎖의 FACS 용해 용액 (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 349202, 물에서 1:10으로 희석됨)을 첨가하고, 와류시키고, 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 세정 완충제 (PBS Sigma 카탈로그 번호 D8537, 0.02％ 아지드, Sigma 카탈로그 번호 S2002 및 2％ 소 태아 혈청, Gibco 카탈로그 번호 16140-071)로 세정한 후, 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 그후, 세포를 250 ㎕의 1％ 파라포름알데히드 (Electron Microscope Science (Ft Washington, PA) 카탈로그 번호 15710)로 고정시켰다. Becton Dickson FACS Calibur를 사용하여 튜브를 판독하고, CellQuest Pro (Becton Dickinson)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

인간 CD44 분자가 형질도입된 300-19 세포의 FACS 연구:

10⁶개의 세포/㎖의 300-19 세포 100 ㎖를 Nunc-Immuno 튜브 (VWR 카탈로그 번호 443990)에 첨가하였다. 그후, 세포를 0 내지 10 ㎍/㎖의 최종 농도에 도달하도록 10 ㎕의 항-CD44 Ab와 혼합하고 (도 10A 참조), 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 20 ㎕의 CD44 검출 Ab MEM-85 (Caltag Laboratories (Burlingame, CA), 카탈로그 번호 MHCD4404-4)를 튜브에 첨가하고, 세포를 얼음 상에서 30분 내지 40분 동안 인큐베이션하였다. FACS 세정 완충제 (PBS Sigma D8537, 0.02％ 아지드, Sigma S2002 및 2％ 소 태아 혈청, Gibco 카탈로그 번호 16140-071)로 세정하였다. 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 세포를 250 ㎖의 1％ 파라포름알데히드 (Electron Microscope Science (Ft Washington), PA 카탈로그 번호 15710)로 고정시켰다. Becton Dickson FACS Calibur를 사용하여 튜브를 판독하고, CellQuest Pro (Becton Dickinson)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

FACS 경쟁 결합 분석은 mAb 1A9.A6.B9가 인식하는 에피토프가 CD44 분자 상의 LINK 도메인에 지도로 작성된, MEM-85 항체가 인식하는 에피토프와 중첩된다는 것을 나타냈다 ([Bajorath, J. et al., (1998) JBC, 273:338-343]). 도 10A-B 참조.

실시예 13

1A9.A6.B9의 2개의 동결건조된 제형 (HIS 동결건조 & CIT 동결건조)을 하기 표 25에 따라 제조하였다. 제형들은 20 ㎎/㎖ 1A9.A6.B9, 히스티딘 또는 시트레이트 완충제, 폴리소르베이트 80, EDTA, 및 트레할로스 디하이드레이트를 함유하였다. 하기 표 25에 제시된 바와 같이 액체 제형 (HIS 액체)을 또한 제조하였다 (1A9.A6.B9). 액체 제형의 조성은 10 ㎎/㎖ 1A9.A6.B9, 20 mM 히스티딘 완충제, 0.2 ㎎/㎖ 폴리소르베이트 80, 0.05 ㎎/㎖ EDTA, 84 ㎎/㎖ 트레할로스 디하이드레이트 및 0.1 ㎎/㎖ L-메티오닌이었다.

상기에서 제조된 각각의 제형을 2-8℃에서 유지시키고, 52주 동안 안전성 조건 (25℃ 및 40℃)을 가속화시켰다 (시트레이트 완충제를 함유하는 동결건조된 제형은 22주만 유지시켰다). 샘플을 제4주, 제8주, 제13주, 제22주 및 제52주에 분석하였다. 각각의 시점에, 입상물질의 존재, 색 변화, 및 투명도에 대해 샘플들을 시각적으로 분석하였다. pH를 또한 측정하였다. 응집물의 존재를 SE-HPLC에 의해 모니터링하였다. 테스트된 모든 제형은 시각적으로 계속 투명하였고, 무색이었으며, 입자가 없었고, pH에서의 어떠한 유의한 변화도 나타내지 않았다. 또한, 200 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0)인 이동상을 사용하여 일련의 2개의 컬럼 (GS SW3000XL 및 GS SW2000XL)을 사용하여 SE-HPLC에 의해 측정했을 때, 2-8℃ 및 25℃에서 52주 동안, 뿐만 아니라 40℃에서 22주 동안 보관된 후에, 97％를 초과하는 mAb 단량체 회수율 (< 3％ 응집물 형성)이 표 25의 모든 제형, 및 대조군으로 테스트된 액체 제형에 대해 수득되었다 (도 11 a, b & c). 유속은 0.7 ㎖/분으로 유지되었고, 러닝 시간은 40분이었다.

각각의 제형을 모세관 등전 포커싱을 영상화함으로써 분석하여, 52주의 냉동 보관 (2-8℃) 후에, 그리고 가속화된 온도 조건 (52주 동안 25℃, 뿐만 아니라 22주 동안 40℃) 하에 1A9.A6.B9 전하 변이체 (산성 종, 어버이 종 및 염기성 종)의 형성을 평가하였다. 모세관에서 이러한 전하를 띠는 종들의 분리가 수행되었고, UV 검출기 및 CCD 카메라를 사용하여 이러한 종들의 시각화 및 정량이 수행되었다. iCE 분석법의 결과 (산성 종)가 도 12 a, b & c에 도해된다. 결과는 52주 동안의 2-8℃ 및 25℃에서의 보관 후 모든 제형에서 산성 종 형성이 유사하였음을 실연한다. 40℃에서, 동결건조된 제형에서 대조군보다 더 낮은 산성 종 형성이 보고되었다.

각각의 제형을 SDS-PAGE에 의해 또한 분석하여, 52주의 냉동 보관 (2-8℃) 후에, 그리고 가속화된 안정성 조건 (52주 동안 25℃, 뿐만 아니라 22주 동안 40℃) 하에 mAb의 더 높은 크기의 변이체 및 더 낮은 크기의 변이체의 형성을 평가하였다. 이러한 방법은 경시적인 클립(clip) 형성 및 응집물 형성 수준을 포함하는 mAb 순도의 양호한 척도를 제공한다. SDS-PAGE 분석법의 결과가 표 26, 27 & 28에 설명된다.

52주의 냉동 보관 (2-8℃) 후에, 그리고 가속화된 안정성 조건 (52주 동안 25℃, 또는 22주 동안 40℃) 하에 중쇄의 메티오닌-256 위치에서의 메티오닌 산화의 형성을 평가하하기 위해 각각의 제형을 또한 분석하였다. 모노클로날 항체 제품을 Lys-C로 소화시키고, 메티오닌-함유 펩티드 단편 및 이의 각각의 산화된 형태를 모니터링하였다. 표 26, 27 & 28에 메티오닌 산화 분석법의 결과가 제시된다.

52주의 냉동 보관 (2-8℃) 후에, 그리고 가속화된 안정성 조건 (52주 동안 25℃, 뿐만 아니라 22주 동안 40℃) 하에 상대적인 생체활성을 평가하기 위해 각각의 제형을 또한 분석하였다. 생체활성 분석법의 결과가 표 26, 27 & 28에서 설명된다.

실시예 14

Biacore™ 분석에 의한 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD44에 대한 1A9.A6.B9의 결합 친화력

또다른 BIAcore™ 분석을 수행하여, 인간 및 사이노몰구스 CD44에 대한 1A9.A6.B9 항체의 결합 친화력을 실연하였다. 인간 CD44-Ig (55 RU, 86 RU) 및 사이노몰구스 CD44-Ig (99 RU, 116 RU)를 10 mM 아세트산나트륨 (pH 3.5) 내의 10 ㎍/㎖의 농도로 CM-5 칩에 고정시켰다. 다양한 농도의 1A9.A6.B9 (절반-로그 희석으로 100 ㎍/㎖ → 0.1 ㎍/㎖)를 칩 상에 5 ㎕/분의 유속으로 유동시켰다. 그후, 칩을 50 mM NaOH로 재생시키고, HBS-EP (BIAcore 22-0512-44)로 세정하였다. Biacore 2000 상에서 분석을 수행하였다. BIAEvaluation™ 소프트웨어 (n=2)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

모든 논문, 간행물, 특허, 특허 출원, 구두 발표, 교재, 보고서, 원고, 브로셔, 도서, 인터넷 포스팅, 저널 기사, 정기간행물, 제품 보고서 등이 비제한적으로 포함되는, 본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은 전체적으로 본 명세서에 거명에 의해 포함된다. 본원에서의 참조문헌의 논의는 단지 이의 저자의 주장을 요약하도록 의도되고, 어떠한 참조문헌도 종래 기술을 구성하는 것으로 인정되지 않으며, 본 출원인들은 인용된 참조문헌들의 정확성 및 적절성에 이의를 제기할 권리를 갖는다.

상기의 발명이 이해를 명확하게 하려는 목적으로 실례 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기술되었지만, 첨부된 청구항의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 특정 변화 및 변형이 이에 이루어질 수 있다는 것이 본 발명의 교시내용의 견지에서 당업자에게 이의 없이 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> PFIZER MEDAREX, INC. <120> CD44 ANTIBODIES <130> M3248.0001 <140> <141> <150> 60/876,109 <151> 2006-12-21 <160> 201 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 361 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Val Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly 20 25 30 Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu 35 40 45 Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala 50 55 60 Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile 85 90 95 Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser 100 105 110 Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp 115 120 125 Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr 130 135 140 Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp 165 170 175 Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly 180 185 190 Tyr Ile Phe Tyr Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp 195 200 205 Ser Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Arg Asp 210 215 220 Gln Asp Thr Phe His Pro Ser Gly Gly Ser His Thr Thr His Gly Ser 225 230 235 240 Glu Ser Asp Gly His Ser His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr 245 250 255 Thr Ser Gly Pro Ile Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile 260 265 270 Leu Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala 275 280 285 Val Asn Ser Arg Arg Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val Ile Asn 290 295 300 Ser Gly Asn Gly Ala Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu Asn Gly 305 310 315 320 Glu Ala Ser Lys Ser Gln Glu Met Val His Leu Val Asn Lys Glu Ser 325 330 335 Ser Glu Thr Pro Asp Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg Asn Leu 340 345 350 Gln Asn Val Asp Met Lys Ile Gly Val 355 360 <210> 2 <211> 1086 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcgtgccgct gagcctggcg 60 cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 120 cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 180 cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg 240 ttcatagaag ggcacgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac 300 aacacagggg tgtacatcct cacatccaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat 360 gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 420 ggaccaatta ccataactat tgttaaccgt gatggcaccc gctatgtcca gaaaggagaa 480 tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgatgatga cgtgagcagc 540 ggctcctcca gtgaaaggag cagcacttca ggaggttaca tcttttacac cttttctact 600 gtacacccca tcccagacga agacagtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 660 gctaccagag accaagacac attccacccc agtggggggt cccataccac tcatggatct 720 gaatcagatg gacactcaca tgggagtcaa gaaggtggag caaacacaac ctctggtcct 780 ataaggacac cccaaattcc agaatggctg atcatcttgg catccctctt ggccttggct 840 ttgattcttg cagtttgcat tgcagtcaac agtcgaagaa ggtgtgggca gaagaaaaag 900 ctagtgatca acagtggcaa tggagctgtg gaggacagaa agccaagtgg actcaacgga 960 gaggccagca agtctcagga aatggtgcat ttggtgaaca aggagtcgtc agaaactcca 1020 gaccagttta tgacagctga tgagacaagg aacctgcaga atgtggacat gaagattggg 1080 gtgtaa 1086 <210> 3 <211> 499 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val 1 5 10 15 Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu 20 25 30 Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys 35 40 45 Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly Phe Ile Glu Gly 50 55 60 His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn 65 70 75 80 Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr 85 90 95 Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp Cys Thr Ser Val 100 105 110 Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr Ile Thr Ile Val 115 120 125 Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu Tyr Arg Thr Asn 130 135 140 Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp Asp Val Ser Ser 145 150 155 160 Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr 165 170 175 Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp Ser Pro Trp Ile 180 185 190 Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Arg Asp Gln Asp Thr Phe 195 200 205 His Pro Ser Gly Gly Ser His Thr Thr His Gly Ser Glu Ser Asp Gly 210 215 220 His Ser His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr Thr Ser Gly Pro 225 230 235 240 Ile Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Arg 245 250 255 Leu Val Pro Arg Gly Phe Gly Thr Gly Asp Pro Glu Pro Lys Ser Ser 260 265 270 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly 275 280 285 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 290 295 300 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 325 330 335 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 340 345 350 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 370 375 380 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 385 390 395 400 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 405 410 415 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 420 425 430 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 435 440 445 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 450 455 460 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 465 470 475 480 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 485 490 495 Pro Gly Lys <210> 4 <211> 1578 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct 60 tcctgcctcg gaactagtca gatcgatttg aatataacct gccgctttgc aggtgtattc 120 cacgtggaga aaaatggtcg ctacagcatc tctcggacgg aggccgctga cctctgcaag 180 gctttcaata gcaccttgcc cacaatggcc cagatggaga aagctctgag catcggattt 240 gagacctgca ggtatgggtt catagaaggg catgtggtga ttccccggat ccaccccaac 300 tccatctgtg cagcaaacaa cacaggggtg tacatcctca catccaacac ctcccagtat 360 gacacatatt gcttcaatgc ttcagctcca cctgaagaag attgtacatc agtcacagac 420 ctgcccaatg cctttgatgg accaattacc ataactattg ttaaccgtga tggcacccgc 480 tatgtccaga aaggagaata cagaacgaat cctgaagaca tctaccccag caaccctact 540 gatgatgacg tgagcagcgg ctcctccagt gaaaggagca gcacttcagg aggttacatc 600 ttttacacct tttctactgt acaccccatc ccagacgaag acagtccctg gatcaccgac 660 agcacagaca gaatccctgc taccagagac caagacacat tccaccccag tggggggtcc 720 cataccactc atggatctga atcagatgga cactcacatg ggagtcaaga aggtggagca 780 aacacaacct ctggtcctat aaggacaccc caaattccag aagatcccgg cggcggcggc 840 ggccgcctgg ttcctcgtgg cttcggtacc ggagatccgg agcccaaatc ttctgacaaa 900 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaattcgagg gtgcaccgtc agtcttcctc 960 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga ctcctgaggt cacatgcgtg 1020 gtggtggacg taagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1080 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1140 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggat tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1200 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1260 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1320 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag 1380 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1440 tccttcttcc tttacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1500 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1560 ctgtctccgg gtaaatga 1578 <210> 5 <211> 248 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 5 Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val 1 5 10 15 Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu 20 25 30 Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys 35 40 45 Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly Phe Ile Glu Gly 50 55 60 His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn 65 70 75 80 Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr 85 90 95 Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp Cys Thr Ser Val 100 105 110 Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr Ile Thr Ile Val 115 120 125 Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu Tyr Arg Thr Asn 130 135 140 Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp Asp Val Ser Ser 145 150 155 160 Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr 165 170 175 Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp Ser Pro Trp Ile 180 185 190 Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Arg Asp Gln Asp Thr Phe 195 200 205 His Pro Ser Gly Gly Ser His Thr Thr His Gly Ser Glu Ser Asp Gly 210 215 220 His Ser His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr Thr Ser Gly Pro 225 230 235 240 Ile Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu 245 <210> 6 <211> 744 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 60 cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 120 cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg 180 ttcatagaag ggcacgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac 240 aacacagggg tgtacatcct cacatccaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat 300 gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 360 ggaccaatta ccataactat tgttaaccgt gatggcaccc gctatgtcca gaaaggagaa 420 tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgatgatga cgtgagcagc 480 ggctcctcca gtgaaaggag cagcacttca ggaggttaca tcttttacac cttttctact 540 gtacacccca tcccagacga agacagtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 600 gctaccagag accaagacac attccacccc agtggggggt cccataccac tcatggatct 660 gaatcagatg gacactcaca tgggagtcaa gaaggtggag caaacacaac ctctggtcct 720 ataaggacac cccaaattcc agaa 744 <210> 7 <211> 361 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 7 Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly 20 25 30 Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu 35 40 45 Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala 50 55 60 Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Val Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile Gln Pro Asn Ser Ile 85 90 95 Cys Ala Ala Asn His Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser 100 105 110 Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Lys Glu Asp 115 120 125 Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr 130 135 140 Ile Thr Ile Val Asn Pro Asp Gly Thr Arg Tyr Ile Lys Lys Gly Glu 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp 165 170 175 Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly 180 185 190 Tyr Ile Phe His Thr Phe Ser Thr Ala His Pro Ile Pro Asp Glu Asp 195 200 205 Gly Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Arg Asp 210 215 220 Gln Asp Ala Phe Tyr Pro Ser Gly Gly Ser His Thr Thr His Gly Ser 225 230 235 240 Glu Ser Ala Gly His Ser His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr 245 250 255 Thr Ser Gly Pro Val Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile 260 265 270 Leu Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala 275 280 285 Val Asn Ser Arg Arg Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val Ile Asn 290 295 300 Ser Gly Asn Gly Ala Val Asp Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu Asn Gly 305 310 315 320 Glu Ala Ser Lys Ser Gln Glu Met Val His Leu Val Asn Lys Glu Pro 325 330 335 Ser Glu Thr Pro Asp Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg Asn Leu 340 345 350 Gln Asn Val Asp Met Lys Ile Gly Val 355 360 <210> 8 <211> 1086 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 8 atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcttgcagct gagcctggcg 60 cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcgggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 120 cgctacagca tctctcggac ggaggctgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 180 cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcgtcggat ttgagacctg caggtacggg 240 ttcatagaag ggcacgtggt gattccccgg attcagccca actccatctg tgcagcaaac 300 cacacagggg tgtacatcct cacgtccaac acctcccagt atgacacata ctgcttcaat 360 gcttcagctc cacctaaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 420 ggaccaatta ccataactat tgttaacccc gatggcactc gctatatcaa gaaaggagaa 480 tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgacgatga cgtgagcagc 540 ggatcctcca gtgaaaggag cagcacttcg ggaggttaca tctttcacac cttttctact 600 gcacacccca tcccagacga agacggtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 660 gctaccagag accaagatgc attctacccc agtggggggt cccataccac tcatggatct 720 gaatcagctg gacactcaca tgggagtcaa gaaggtgggg caaacacaac ctctggtcct 780 gtaaggacac cccaaattcc agaatggctg atcatcttgg catccctctt ggccttggct 840 ttgattcttg cagtttgcat tgcagtcaac agtcgaagaa ggtgtgggca gaagaaaaag 900 ctagtgatca acagtggcaa tggagctgtg gatgatagaa agccaagtgg actcaatgga 960 gaggccagca agtctcagga aatggtgcat ttggtgaaca aggagccatc agaaactcca 1020 gaccagttta tgacagctga tgagacaagg aacctgcaga acgtggacat gaagattggg 1080 gtgtaa 1086 <210> 9 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 210 215 220 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 10 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 10 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaattctat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggagaagt 300 gactacaggg gctactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 420 gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag 660 cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa cagcacgttc 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa a 1341 <210> 11 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 12 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaattctat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggagaagt 300 gactacaggg gctactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 13 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 13 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 14 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 14 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttatc aactacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggcctctgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtcgcaact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 15 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 16 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttatc aactacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggcctctgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtcgcaact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 agctatggca tgcac 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 gttatatggt atgatggaag taataaattc tatgcagact ccgtgaaggg c 51 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 agaagtgact acaggggcta ctacggtatg gacgtc 36 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 agggccagtc agagtgttat caactactta gcc 33 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gatgcatcca acagggcctc t 21 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 cagcagcgtc gcaactggcc gctcact 27 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 30 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt 90 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 32 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg gagtgggtgg ca 42 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 tggtaccaac agaaacctgg ccaggctccc aggctcctca tctat 45 <210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 38 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 cgattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcgagg 96 <210> 39 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 40 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 ggcatcccag ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 60 agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgt 96 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tca 33 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa 30 <210> 45 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Ala Ile Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Trp Glu Asp Tyr Tyr Tyr His Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 46 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 46 caggtccaac ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata catcttcact agctatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatggggtgg atcaacgctg ccattggtag cacaaaatat 180 tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagacggg 300 tgggaggact actactacca cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356 <210> 47 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Ala Ile Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Trp Glu Asp Tyr Tyr Tyr His Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 48 caggtccaac ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata catcttcact agctatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatggggtgg atcaacgctg ccattggtag cacaaaatat 180 tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagacggg 300 tgggaggact actactacca cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 49 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 50 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 50 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagt agctggttag cctggtatca gcataaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaataatt tcccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 51 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 52 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 52 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagt agctggttag cctggtatca gcataaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaataatt tcccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa ac 322 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 54 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 agctatgcta tgcat 15 <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Trp Ile Asn Ala Ala Ile Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 56 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 tggatcaacg ctgccattgg tagcacaaaa tattcacaga agttccaggg c 51 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Asp Gly Trp Glu Asp Tyr Tyr Tyr His Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 gacgggtggg aggactacta ctaccacggt atggacgtc 39 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 cgggcgagtc agggtattag tagctggtta gcc 33 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 gctgcatcca gtttgcaaag t 21 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 caacaggcta ataatttccc gtggacg 27 <210> 65 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr 20 25 30 <210> 66 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 caggtccaac ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata catcttcact 90 <210> 67 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 68 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgt 69 <210> 69 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 70 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 tgggtgcgcc aggcccccgg acaaaggctt gagtggatgg gg 42 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 72 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 tggtatcagc ataaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctat 45 <210> 73 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 74 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 agagtcacca ttaccaggga cacatccgcg agcacagcct acatggagct gagcagcctg 60 agatctgaag acacggctgt gtattactgt gcgaga 96 <210> 75 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence peptide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 75 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 76 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 ggggtcccat caaggttcag cggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc 60 agcctgcagc ctgaagattt tgcaacttac tattgt 96 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 78 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tca 33 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa 30 <210> 81 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Tyr Ser Gly Ser Gly Ser Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 82 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 82 caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg atcaacactg gcaatggtaa cacaaaatat 180 tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gaggttttac 300 tctggttcgg ggagtccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa a 1341 <210> 83 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 83 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Tyr Ser Gly Ser Gly Ser Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 84 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 84 caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg atcaacactg gcaatggtaa cacaaaatat 180 tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gaggttttac 300 tctggttcgg ggagtccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 85 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 85 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 86 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 86 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 87 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 87 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 88 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 88 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaac 325 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Asn Tyr Ala Met His 1 5 <210> 90 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 aactatgcta tgcat 15 <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Trp Ile Asn Thr Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 92 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 tggatcaaca ctggcaatgg taacacaaaa tattcacaga agttccaggg c 51 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Phe Tyr Ser Gly Ser Gly Ser Pro 1 5 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 ttttactctg gttcggggag tccc 24 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 ggtgcatcca gcagggccac t 21 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 100 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 cagcagtatg gtagctcacc gctcact 27 <210> 101 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 102 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact 90 <210> 103 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 104 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69 <210> 105 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 106 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 tgggtgcgcc aggcccccgg acaaaggctt gagtggatgg ga 42 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 108 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc aggctcctca tctat 45 <210> 109 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 109 Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 110 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 agagtcacca ttaccaggga cacatccgcg agcacagcct acatggagct gagcagcctg 60 agatctgaag acacggctgt gtattactgt gcgagg 96 <210> 111 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 112 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 60 agactggagc ctgaagattt tgcagtgtat tactgt 96 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 114 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tca 33 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 115 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 116 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa 30 <210> 117 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 117 Glu Val Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Val Arg Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Ala Ile Ala Val Pro Gly Thr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 130 135 140 Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr 195 200 205 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 325 330 335 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 <210> 118 <211> 1362 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 118 gaggtgcagc tgatggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attactgtta gaagtagtta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagtcctc 300 gctatagcag tgcctggtac ctcctactac tactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc agcttccacc aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc 420 tgctccagga gcacctccga gagcacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 480 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 540 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 600 agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag 660 gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt cccccatgcc catcatgccc agcacctgag 720 ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 780 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 840 cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 900 gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 960 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1020 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1080 tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1140 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1200 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 1260 aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320 aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta aa 1362 <210> 119 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 119 Glu Val Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Val Arg Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Ala Ile Ala Val Pro Gly Thr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 120 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 120 gaggtgcagc tgatggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attactgtta gaagtagtta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagtcctc 300 gctatagcag tgcctggtac ctcctactac tactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc a 381 <210> 121 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 121 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 122 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 122 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacggct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 123 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 123 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 124 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 124 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacggct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaa 324 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 125 Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 126 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 agctatagca tgaac 15 <210> 127 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 127 Ser Ile Thr Val Arg Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 128 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 tccattactg ttagaagtag ttacatatac tacgcagact cagtgaaggg c 51 <210> 129 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Val Leu Ala Ile Ala Val Pro Gly Thr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 130 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 gtcctcgcta tagcagtgcc tggtacctcc tactactact acggtatgga cgtc 54 <210> 131 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 131 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 132 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36 <210> 133 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 133 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 ggtgcatcca gcagggccac t 21 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 135 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Thr 1 5 <210> 136 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 cagcagtatg gtagctcacg gctcact 27 <210> 137 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 137 Glu Val Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 138 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 gaggtgcagc tgatggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 139 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 139 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 140 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69 <210> 141 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 141 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 142 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggtct ca 42 <210> 143 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 143 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 144 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc aggctcctca tctat 45 <210> 145 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 145 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 146 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 cgattcacca tctccagaga caacgccaag aactcactgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcgaga 96 <210> 147 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 147 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 148 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 60 agactggagc ctgaagattt tgcagtgtat tactgt 96 <210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 149 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 150 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tca 33 <210> 151 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 151 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 152 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa 30 <210> 153 <211> 1086 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 153 atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcttgcagct gagcctggcg 60 cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcgggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 120 cgctacagca tctctcggac ggaggctgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 180 cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcgtcggat ttgagacctg caggtacggg 240 ttcatagaag ggcacgtggt gattccccgg attcagccca actccatctg tgcagcaaac 300 cacacagggg tgtacatcct cacgtccaac acctcccagt atgacacata ctgcttcaat 360 gcttcagctc cacctaaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 420 ggaccaatta ccataactat tgttaacccc gatggcactc gctatatcaa gaaaggagaa 480 tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgatgatga cgtgagcagc 540 ggatcctcca gtgaaaggag cagcacttca ggaggttaca tctttcacac cttttctact 600 gcacacccca tcccagacga agacggtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 660 gctaccagag accaagatgc attctacccc agtggggggt cccataccac tcatggatct 720 gaatcagctg gacactcaca tgggagtcaa gaaggtgggg caaacacaac ctctggtcct 780 gtaaggacac cccaaattcc agaatggctg atcatcttgg catccctctt ggccttggct 840 ttgattcttg cagtttgcat tgcagtcaac agtcgaagaa ggtgtgggca gaagaaaaag 900 ctagtgatca acagtggcaa tggagctgtg gatgatagaa agccaagtgg actcaatgga 960 gaggccagca agtctcagga aatggtgcat ttggtgaaca aggagccatc agaaactcca 1020 gaccagttta tgacagctga tgagacaagg aacctgcaga acgtggacat gaagattggg 1080 gtgtaa 1086 <210> 154 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly 1 5 10 15 Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Thr Ser Gln Ile Asp Leu Asn Ile 20 25 30 Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr 35 40 45 Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser 50 55 60 Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe 65 70 75 80 Glu Thr Cys Arg Tyr Gly Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg 85 90 95 Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile 100 105 110 Leu Thr Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser 115 120 125 Ala Pro Pro Glu Glu Asp Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala 130 135 140 Phe Asp Gly Pro Ile Thr Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg 145 150 155 160 Tyr Val Gln Lys Gly Glu Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro 165 170 175 Ser Asn Pro Thr Asp Asp Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg 180 185 190 Ser Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Thr Phe Ser Thr Val His 195 200 205 Pro Ile Pro Asp Glu Asp Ser Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg 210 215 220 Ile Pro Ala Thr Arg Asp Gln Asp Thr Phe His Pro Ser Gly Gly Ser 225 230 235 240 His Thr Thr His Gly Ser Glu Ser Asp Gly His Ser His Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Gly Ala Asn Thr Thr Ser Gly Pro Ile Arg Thr Pro Gln Ile 260 265 270 Pro Glu Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Phe 275 280 285 Gly Thr Gly Asp Pro Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 290 295 300 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 305 310 315 320 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 325 330 335 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 340 345 350 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 355 360 365 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 370 375 380 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 385 390 395 400 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 405 410 415 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 420 425 430 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 435 440 445 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 450 455 460 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 465 470 475 480 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 485 490 495 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 500 505 510 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 515 520 525 <210> 155 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 155 atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg 30 <210> 156 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 156 ttacacccca atcttcatgt ccaca 25 <210> 157 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 157 gactcgaggc caccatggac aagttttggt ggc 33 <210> 158 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 158 gatctagatc actattacac cccaatcttc atgtcc 36 <210> 159 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 159 atggacaagt tttggtgg 18 <210> 160 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 160 gttacacccc aatcttcatg tcca 24 <210> 161 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 161 agtgagacta gtcagatcga tttgaatata acctgccgct ttg 43 <210> 162 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 162 atcactgaga tcttctggaa tttggggtgt ccttatag 38 <210> 163 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 163 atcggcgatc cagatcgatt tgaatataac c 31 <210> 164 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 164 ctgtgcctcg agccattctg gaatttgggg tgtcc 35 <210> 165 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 165 attyrgtgat cagsactgaa casag 25 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 166 tacgtgccaa gcatcctcgc 20 <210> 167 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 167 atcaatgcct gkgtcagagc yytg 24 <210> 168 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 168 aggctggaac tgaggagcag gtg 23 <210> 169 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 169 ccctgagagc atcaymyarm aacc 24 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 170 tacgtgccaa gcatcctcgc 20 <210> 171 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 171 gsartcagwc ycwvycagga cacagc 26 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 172 aggctggaac tgaggagcag gtg 23 <210> 173 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 173 ccctgagagc atcaymyarm aacc 24 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 174 tacgtgccaa gcatcctcgc 20 <210> 175 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 175 atcaatgcct gkgtcagagc yytg 24 <210> 176 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 176 aggctggaac tgaggagcag gtg 23 <210> 177 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 177 aaggcttctg gatacacctt cactagctat gct 33 <210> 178 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 178 agcatagcta gtgaaggtgt atccagaagc ctt 33 <210> 179 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 179 ttagcctggt atcagcagaa accagggaaa gcc 33 <210> 180 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 180 ggctttccct ggtttctgct gataccaggc taa 33 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 181 caggtgcagc tggtggagtc tgg 23 <210> 182 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 182 tggaggctga ggagacggtg ac 22 <210> 183 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 183 gaaattgtgt tgacacagtc tccag 25 <210> 184 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 184 tatattcctt aattaagtta ttctactcac gtttgatctc caccttggtc cct 53 <210> 185 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 185 caggtccagc ttgtgcagtc tg 22 <210> 186 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 186 tggaggctga ggagacggtg ac 22 <210> 187 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 187 gacatccaga tgacccagtc tcc 23 <210> 188 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 188 tatattcctt aattaagtta ttctactcac gtttgatttc caccttggtc cct 53 <210> 189 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 189 caggtccagc ttgtgcagtc tg 22 <210> 190 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 190 tggaggctga ggagacggtg ac 22 <210> 191 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 191 gaaattgtgt tgacgcagtc tccag 25 <210> 192 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 192 tatattcctt aattaagtta ttctactcac gtttgatctc caccttggtc cct 53 <210> 193 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 193 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 194 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 195 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 196 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 197 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 198 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 199 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 200 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 201 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (25)

1. a) 서열 17에 기재된 V_H CDR1, 서열 19에 기재된 V_H CDR2, 및 서열 21에 기재된 V_H CDR3;

   b) 서열 53에 기재된 V_H CDR1, 서열 55에 기재된 V_H CDR2, 및 서열 57에 기재된 V_H CDR3;

   c) 서열 89에 기재된 V_H CDR1, 서열 91에 기재된 V_H CDR2, 및 서열 93에 기재된 V_H CDR3; 및

   d) 서열 125에 기재된 V_H CDR1, 서열 127에 기재된 V_H CDR2, 및 서열 129에 기재된 V_H CDR3

   으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 (V_H) 도메인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD44에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
2. 제1항에 있어서,

   a) 서열 23에 기재된 V_L CDR1, 서열 25에 기재된 V_L CDR2, 및 서열 27에 기재된 V_L CDR3;

   b) 서열 59에 기재된 V_L CDR1, 서열 61에 기재된 V_L CDR2, 및 서열 63에 기재된 V_L CDR3;

   c) 서열 95에 기재된 V_L CDR1, 서열 97에 기재된 V_L CDR2, 및 서열 99에 기재된 V_L CDR3; 및

   d) 서열 131에 기재된 V_L CDR1, 서열 133에 기재된 V_L CDR2, 및 서열 135에 기재된 V_L CDR3

   으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 (V_L) 도메인 아미노산 서열을 더 포함하는 단리된 인간 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
3. 제2항에 있어서, 서열 17에 기재된 V_H CDR1, 서열 19에 기재된 V_H CDR2, 서열 21에 기재된 V_H CDR3, 서열 23에 기재된 V_L CDR1, 서열 25에 기재된 V_L CDR2, 및 서열 27에 기재된 V_L CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
4. 제2항에 있어서, 서열 89에 기재된 V_H CDR1, 서열 91에 기재된 V_H CDR2, 서열 93에 기재된 V_H CDR3, 서열 95에 기재된 V_L CDR1, 서열 97에 기재된 V_L CDR2, 및 서열 99에 기재된 V_L CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
5. 제1항에 있어서, V_H 도메인 아미노산 서열이 서열 11, 47, 83 및 119로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 11, 47, 83 및 119 중 어느 하나와 상이한 것인 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
6. 제1항에 있어서, 서열 11, 47, 83 및 119 중 어느 하나에 대해 아미노산 서열이 95％ 이상 동일한 V_H 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
7. 제2항에 있어서, V_L 도메인 아미노산 서열이 서열 15, 51, 87 및 123으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 15, 51, 87 및 123 중 어느 하나와 상이한 것인 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
8. 제2항에 있어서, 서열 15, 51, 87 및 123 중 어느 하나에 대해 아미노산 서열이 95％ 이상 동일한 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
9. 제7항에 있어서, (V_H) 도메인 아미노산 서열 및 (V_L) 도메인 아미노산 서열이

   a) 서열 11에 기재된 V_H 도메인 및 서열 15에 기재된 V_L 도메인;

   b) 서열 47에 기재된 V_H 도메인 및 서열 51에 기재된 V_L 도메인;

   c) 서열 83에 기재된 V_H 도메인 및 서열 87에 기재된 V_L 도메인; 및

   d) 서열 119에 기재된 V_H 도메인 및 서열 123에 기재된 V_L 도메인

   으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
10. 제9항에 있어서, 서열 11에 기재된 V_H 도메인 및 서열 15에 기재된 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
11. 제9항에 있어서, 서열 83에 기재된 V_H 도메인 및 서열 87에 기재된 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
12. a) 서열 9에 기재된 중쇄, 및 서열 13에 기재된 경쇄;

    b) 서열 45에 기재된 중쇄, 및 서열 49에 기재된 경쇄;

    c) 서열 81에 기재된 중쇄, 및 서열 85에 기재된 경쇄; 및

    d) 서열 117에 기재된 중쇄, 및 서열 121에 기재된 경쇄

    로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, CD44에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 항체.
13. 제12항에 있어서, 서열 9에 기재된 중쇄 및 서열 13에 기재된 경쇄를 포함하는 단리된 인간 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
14. 제12항에 있어서, 서열 9에 기재된 중쇄 및 서열 13에 기재된 경쇄를 포함하는 단리된 인간 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
15. 제9항에 있어서, IgG인 항체.
16. 제15항에 있어서, IgG가 IgG₂인 항체.
17. 제1항에 따른 항체 또는 항원-결합 부분, 및 임의로는 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
18. CD44-매개 장애의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 경감시키는 것을 필요로 하는 대상에게 유효량의 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상에서 항-CD44 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로 CD44-매개 장애의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 경감시키는 방법.
19. 제18항에 있어서, CD44-매개 장애가 염증성 또는 자가면역 질환인 치료 방법.
20. 제18항에 있어서, 질환이 류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염, 죽상동맥경화증, 육아종성 질환, 다발성 경화증, 천식, 크론병, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 판상형 건선 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
21. 제1항에 따른 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분 및/또는 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
22. 제21항의 핵산 분자를 포함하며, 임의로는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 벡터.
23. 제22항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
24. 2D1.A3.D12 (ATCC 번호 PTA-6929) (LN 15920), 1A9.A6.B9 (ATCC 번호 PTA-6927) (LN 15922) 및 14G9.B8.B4 (ATCC 번호 PTA-6928) (LN 15921)로 이루어진 군으로부터 선택된, 제1항에 따른 인간 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma) 세포주.
25. 제24항에 있어서, 하이브리도마가 1A9.A6.B9 (ATCC 번호 PTA-6927) (LN 15922)인 하이브리도마 세포주.

Images