JP2010512790A - Cd44抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、CD44に結合し、そしてCD44を阻害する機能を果たす、ヒト抗体及びその抗原結合部分を含む抗体に関する。本発明は、また、ヒトCD44抗体に由来する重鎖及び軽鎖免疫グロブリン、及びそのような免疫グロブリンをコードする核酸分子に関する。本発明は、また、ヒトCD44抗体を作製する方法、これらの抗体を含む組成物、及び治療のために抗体及び組成物又は薬剤を使用する方法に関する。
Description
関連特許及び特許出願への相互参照
本出願は、2006年12月21日に出願された米国仮出願第60/876109号の利益を請求する。本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2006年12月21日に出願された米国仮出願第60/876109号の利益を請求する。本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、ヒトCD44に結合する抗体及びその抗原結合部分に関する。本発明は、また、そのような抗体及び抗原結合部分をコードする核酸分子、CD44抗体及び抗原結合部分の作製方法、これらの抗体又はその抗原結合部分を含む組成物並びに抗体、抗原結合部分、及び組成物又は薬剤を治療のために使用する方法にも関する。
例えば、身体損傷、感染又は免疫応答によって引き起こされる体液の局所的蓄積である炎症は、単球及びT細胞などの炎症細胞の細胞外マトリックスへの動員によって開始される(非特許文献1)。この細胞動員は、典型的にはTNF−α、IL−6及びIL−1βなどのサイトカインの、細胞外マトリックへの更なる浸潤と増加をもたらす(同上)。このような細胞の動員と浸潤は、例えば、増殖の調節、接着、分化、侵入及び生存などの様々な他の細胞過程と共に、接着受容体のスーパーファミリーとしての膜貫通糖タンパク質細胞接着分子によって媒介される。細胞接着受容体ファミリーのメンバーには、広範に分布しているクラスI膜貫通糖タンパク質であるCD44が含まれる。CD44は、接着、移動、活性化及び生存を含み、様々な細胞挙動において重要な役割を果たしている(非特許文献2)。
CD44の分子量は80から90kDaの範囲であり、また差示的オルタナティブスプライシングにより、800に近い変異型アイソフォームを生成する可能性がある(非特許文献3)。現在、数十のアイソフォームが知られている。CD44は白血球、線維芽細胞、上皮細胞、角化細胞及び幾つかの内皮細胞を含む多くの細胞型に遍く発現しており、最も豊富に発現するアイソフォームである、いずれの変異型エキソンも欠く標準CD44(CD44s)型を有している。
CD44は、その一次リガンドである、親水性、線状、細胞外多糖類のヒアルロナン又はヒアルロン酸(HA)と一緒に、炎症において主要な役割を担っている(非特許文献1及び4)。例えば、インビボ研究では、CD44媒介HA結合活性を誘導するモノクローナル抗CD44抗体、IRAWB14は、プロテオグリカン誘発関節炎マウスにおいて炎症症状の憎悪を引き起こした(非特許文献5)。
Naor, D. et al., (2003) Arthritis Res Ther, 5:105-115
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Aruffo, A. (1990) Cell 61, 1301-1313
Pure, E. et al., (2001) TRENDS in Molecular Medicine, 7:213-221
本発明によれば、CD44を特異的に結合し、またCD44アンタゴニストとして作用し得る単離された抗体又はその抗原結合部分、及び該抗体又はその抗原結合部分を含む組成物又は薬剤が提供される。本発明の別の側面によれば、抗体又は抗原結合部分がヒト抗体である、本明細書に記載の任意の該抗体又はその抗原結合部分が提供される。更なる側面では、該抗体又は抗原結合部分はヒト組換抗体である。
本発明によれば、(i)重鎖及び/又は軽鎖、又は(ii)その可変ドメイン、又は(iii)その抗原結合部分、又は(iv)その相補性決定領域(CDR)を含むCD44を特異的に結合する抗体が提供される。
さらに、本発明によれば、抗体又はその抗原結合部分が、以下のa)からg)に記載される少なくとも1つの機能特性を有する、CD44抗体又はその抗原結合部分が提供される。
a)表面プラズモン共鳴によって測定して、1000nM以下のKDでCD44に結合する;
b)表面プラズモン共鳴によって測定して、0.01s-1より小さいか又は等しいCD44に対するオフレート(off rate)(Koff)を有する;
c)FACS又はELISA結合アッセイによって測定して、500nM、75μg/mlより小さいEC50でCD44に結合する;
d)ELISA結合アッセイによって測定して、500nM、75μg/mlより小さいIC50でCD44及びHA間の相互作用を抑制する;
e)FACSによって測定して、約100nMより小さいIC50で、D3+ T細胞などの炎症細胞におけるCD44受容体のインビボ表面発現を減少させる;
f)インビトロにおいて50nMより小さいIC50で、CD44受容体の表面発現を減少させる;
g)リンパ管内皮ヒアルロナン受容体1タンパク質(LYVE−1)を、少なくとも100倍を超えてCD44への選択性を有する。
a)表面プラズモン共鳴によって測定して、1000nM以下のKDでCD44に結合する;
b)表面プラズモン共鳴によって測定して、0.01s-1より小さいか又は等しいCD44に対するオフレート(off rate)(Koff)を有する;
c)FACS又はELISA結合アッセイによって測定して、500nM、75μg/mlより小さいEC50でCD44に結合する;
d)ELISA結合アッセイによって測定して、500nM、75μg/mlより小さいIC50でCD44及びHA間の相互作用を抑制する;
e)FACSによって測定して、約100nMより小さいIC50で、D3+ T細胞などの炎症細胞におけるCD44受容体のインビボ表面発現を減少させる;
f)インビトロにおいて50nMより小さいIC50で、CD44受容体の表面発現を減少させる;
g)リンパ管内皮ヒアルロナン受容体1タンパク質(LYVE−1)を、少なくとも100倍を超えてCD44への選択性を有する。
別の実施態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分のいずれかをコードする、ヌクレオチド配列を含む分離核酸分子を提供する。1つの特別の実施態様では、本発明は、本明細書に記載の配列番号のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を含む分離核酸分子を提供する。本発明は、更に本明細書に記載の核酸分子のいずれかを含むベクターを提供するが、その場合、ベクターは、場合により、核酸分子に機能可能に連結した発現調節配列を含む。
別の実施態様は、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む又は本明細書に記載の核酸分子のいずれかを含む宿主細胞を提供する。本発明は、また、本明細書に記載の抗体又は抗原結合部分のいずれかを産生する、又は該抗体又は該抗原結合部分のいずれかの重鎖又は軽鎖を産生する、単離された細胞系を提供する。
別の実施態様では、本発明は、適切な条件下に本明細書に記載の宿主細胞又は細胞系のいずれかを培養すること、そして抗体又はその抗原結合部分を回収することを含む、該CD44抗体又は該抗原結合部分を産生する方法を提供する。
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物が本明細書に記載の核酸を発現する、該核酸のいずれかを含む非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物をも提供する。
本発明は、更に、本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物からの抗体を単離する工程を含む、CD44に結合する抗体又はその抗原結合部分を単離する方法を提供する。
本発明は、(i)前記CD44抗体、又はそれらをコードする核酸分子の、重鎖及び/又は軽鎖、その可変ドメイン若しくはその抗原結合部分、又はそのCRD;及び(ii)薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、更に治療薬又は診断薬などの別の成分を含んでもよい。
本発明は、また、本明細書に記載の任意の抗体又はその抗原結合部分、そして場合により、結合した又は懸濁状態の薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物又は薬剤を提供する。本発明の組成物は、更に治療薬又は診断薬などの別の成分を含んでもよい。
診断及び治療方法も、また、本発明によって提供される。
本発明は、また、それが必要な哺乳動物において、本明細書に記載の任意の抗体又はその抗原結合部分、又は薬剤組成物のいずれかを該哺乳動物に投与する工程を含む、炎症性細胞浸潤又は動員の治療方法を提供する。
本発明の別の側面は、前記抗体又は抗原結合部分がヒト抗体である、本明細書に記載の任意の抗体又はその抗原結合部分を提供する。更なる側面では、該抗体又は抗原結合部分はヒト組換抗体である。
定義
本明細書及び特許請求の範囲を通して、用語「含む」(“comprise”)、又は「含む」(“comprises”)若しくは「含んでいる」(“comprising”)などの変形は、当然ながら記載された整数又は整数群の包含を含意するが、他のいかなる整数又は整数のグループを除外するものではない。
本明細書及び特許請求の範囲を通して、用語「含む」(“comprise”)、又は「含む」(“comprises”)若しくは「含んでいる」(“comprising”)などの変形は、当然ながら記載された整数又は整数群の包含を含意するが、他のいかなる整数又は整数のグループを除外するものではない。
本明細書に他に定義されていない限り、本発明との関連で使用される科学及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上他の必要がない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。一般的に、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して、本明細書で使用される命名法は、当該分野で一般に使用されているものである。
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体はポリペプチド鎖の2つの相同対から構成され、各対は1つの「軽い」(約25kDa)及び「重い」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与する約100から120又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖と分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンと分類され、そして抗体イソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEと定義する。軽鎖及び重鎖の中で、可変及び定常領域は、約12又はそれ以上のアミノ酸の「J」領域によって連結され、重鎖は、また、約3又はそれ以上のアミノ酸の「D」領域を含む。一般的には、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)を参照されたい。各重鎖/軽鎖対(VH及びVL)の可変領域は、それぞれ抗体結合部位を形成する。このように、例えば、インタクトIgG抗体は2つの結合部位を有する。二機能性及び二重特異性抗体を除いて、2つの結合部位は同じである。
重鎖及び軽鎖の可変領域は、3つの超可変領域によって連結された比較的保存性のフレームワーク領域(FR)の同じ一般構造を示し、また相補性決定領域又はCDRとも呼ばれる。用語「可変の」は、可変ドメインの特定の部分が抗体の間で配列が広範に異なり、そしてその特定の抗原に対する各々特定の抗体の結合及び特異性に使用されるという事実をいう。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均等に分布されず、より高保存FRによって分けられるCDRに集中する。各対の2つの鎖由来のCDRはFRによってアライン(aligned)され、特異的エピトープに結合することが可能である。N末端からC末端まで、軽鎖及び重鎖のいずれも、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3F及びR4ドメインを含む。各ドメインのアミノ酸の割り当ては、免疫学的関連タンパク質のKabat配列(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、 又は Chothia & Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989), Nature 342: 878-883の定義に従っている。本明細書で使用される、数によって言及される抗体は、同じ数のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体と同じである。例えば、モノクローナル抗体1A9.A6.B9は、ハイブリドーマ1A9.A6.B9から得られるものと同じ抗体であるか、又はそのサブクローンである。本明細書で使用されるFdフラグメントは、VH及びCH1ドメインから成る抗体フラグメントを意味する;Fvフラグメントは抗体の単アームのVH及びCH1ドメインから成り;そしてdAbフラグメント(Ward et al., (1989), Nature 341: 544-546)はVHドメインから成る。
幾つかの実施態様では、抗体は、VL及びVHドメインが単一タンパク質鎖としてそれらを作ることができる合成リンカーを介する、一価の分子を形成するように組み合わされた、単一鎖抗体(scFv)である(Bird et al., (1988), Science 242: 423-426, Huston et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)。幾つかの実施態様では、抗体は、二重特異性抗体、即ち、そこではVH及びVLドメインは単一ポリペプチド鎖上に発現するが、同じ鎖上で2ドメイン間で対形成するには短すぎるためにリンカーを用い、それにより別の鎖の相補ドメインと強制的にペアを組ませ、そして2つの抗原結合部位を作出する二価抗体である(例えば、Holliger P. et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, Poljak R. Et al., (1994), Structure 2: 1121-1123を参照)。1つの実施態様では、本発明の抗体の1つ又はそれ以上のCDRは、CD44に特異的に結合するイムノアドヘシンとなるように、共有結合か又は非共有結合で分子に組み込むこともできる。そのような実施態様では、CDRは大きなポリペプチド鎖の一部として組み込まれ、別のポリペプチド鎖と共有結合し、又は非共有結合的に組み込まれると考えられる。
1つ又はそれ以上の結合部位を有する抗体の実施態様では、結合部位はお互いに全く同一であっても、又は異なっていてもよい。
本明細書で使用される「アナログ」又は「ポリペプチドアナログ」の用語は、特定の参照アミノ酸配列と実質的な同一性を有し、また実質的に参照アミノ酸配列と同じ機能又は活性を有するセグメントを含むポリペプチドを指す。一般的に、ポリペプチドアナログは、参照配列に関して保存的アミノ酸置換(又は挿入又は欠失)を含む。アナログは少なくとも20又は25のアミノ酸長であり、又は少なくとも50、60、70、80、90、100、150又は200のアミノ酸長又はそれ以上の長さであり、そしてしばしば完全長ポリペプチドと同じ長さであってもよい。本発明の幾つかの実施態様は、生殖細胞系アミノ酸配列由来の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17の置換を有する、ポリペプチドフラグメント又はポリペプチドアナログ抗体を含む。抗体又は免疫グロブリン分子のフラグメント又はアナログは、当業者により本明細書の教示に従って容易に調製することができる。
1つの実施態様では、CD44抗体又はその抗原結合部分へのアミノ酸置換は、(1)タンパク質分解に対する感受性を低下させ、(2)酸化に対する感受性を低下させ、(3)タンパク質複合体を形成する結合親和性を変え、(4)そのようなアナログの他の物理化学的又は機能特性を付与し又は改変するものであるが、なおCD44への特異的結合を保持する。アナログ類は通常起こるペプチド配列への種々の置換を含むことができる。例えば、単一又は多重アミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、通常起こる配列において、例えば分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分で行われ得る。アミノ酸置換は、またポリペプチドの活性を改善し得る分子間接触を形成するドメインにおいても行われ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変えないものとなる;例えば、置換アミノ酸は、親配列に起こる免疫グロブリン結合ドメインを作製する逆平行βシートを変化させず、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊しないものとなる。一般に、グリシン及びプロリンは逆平行βシートに使用されない。業界で認識されているポリペプチド二次及び三次構造の例は、以下の文献に記載されている(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)、「タンパク質、構造及び分子原理(Proteins, Structures and Molecular Principles)」、C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)「タンパク質構造概論(Introduction to Protein Structure )」、Thornton et al., (1991) Nature 354:105)。
本明細書で使用される、「抗体」の用語は免疫グロブリンと同義語であり、また当然のことながら、業界で周知である。特に、抗体の用語は抗体を製造する如何なる特定の方法によっても限定されない。例えば、抗体の用語は、とりわけ、組換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体を含む。
本明細書に使用される、抗体の「抗原結合部分」(又は簡単に「抗体部分」又は「部分」)の用語は、抗原(例えば、CD44)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ又はそれ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって行なえることが示されている。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの例は、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価フラグメント;(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋で結合した2Fabフラグメントを含む二価フラグメント、F(ab′)2フラグメント:(iii)VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント;(iv)抗体の単一アームのVL及びVHドメインから成るFvフラグメント;(v)VHドメインから成るdAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544 546);そして(vi)単離された相補性決定領域(CDR)、を含む。更に、Fvフラグメント、VL及びVHの2ドメインは別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換法を用いて、VL及びVH領域が一価分子(単鎖Fv(scFv)として公知である)を形成するように組み合わせて、単一タンパク質鎖としてそれらを作製し得る合成リンカーにより連結され得る;例えば、以下の文献を参照されたい(Bird et al., (1988) Science 242: 423 426, Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 5883)。そのような単鎖抗体は、また、抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含されるものとする。二重特異性抗体などの他の型の単鎖抗体も包含される。二重特異性抗体は二価であり、VH及びVL領域が単一ポリペプチド鎖に発現する二重特異性抗体であるが、同一鎖の2ドメイン間で対にすることを可能にするには短すぎるためにリンカーを用い、それによりドメインを別の鎖の相補性領域とペアを組むように強制し、そして2つの抗原部位を作出する(例えば、以下の文献を参照されたい(Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 6448, Poljak R. J. et al., (1994) Structure 2: 1121-1123))。
なお更には、抗体又はその抗原結合部位は、1つ又はそれ以上のタンパク質又はペプチドを有する抗体又は抗体部分の共有結合性又は非共有結合性会合により形成される、大きな免疫接着分子の1部であってもよい。そのような免疫接着分子の例は、四量体のscFv分子(Kipriyanov et al., (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101)を作るストレプトアビジンコア領域の使用、並びにシステイン残基マーカーペプチド及び二価のビオチン化scFv分子(Kipriyanov et al., (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058)を作るC末端ポリヒスチジンタグの使用を含む。他の例は、1つの抗体由来の1つ又はそれ以上のCDRが、CD44などの関係する抗原に特異的に結合してイムノアドヘシンにするために、共有結合性か又は非共有結合性に分子に組み込まれる場合を含む。そのような実施態様では、CDRは大きなポリペプチド鎖の一部として組み込まれても、別のポリペプチド鎖に共有結合されても、又は非共有結合性に組み込まれてもよい。Fab及びF(ab′)2フラグメントなどの抗体部分は、全抗体のそれぞれパパイン又はペプシン消化などの従来技術を用いて、全抗体から調製し得る。その上、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、本明細書に記載の標準的な組換えDNA法を用いて得ることができる。
特に他の指示のない限り、「CD44」の用語はヒトCD44を指す。CD44は、多重構造の細胞外マトリックス受容体、並びに細胞−細胞及び細胞−マトリックス活性を調節する膜貫通糖タンパク質の古典的ファミリーの1メンバーである。ヒトCD44のクローニング及び配列は、例えば、Arrofo, A. (1990) Cell, 16. (Accession No. NM_001001391)に報告され、また配列番号1に示される。CD44の用語は、標準的な組換え発現法で調製することができ、又は市販購入可能な、組換えヒトCD44及びCD44の組換えキメラ型を含むものとする(例えば、 R&D Systems、カタログ番号861−PC−100)。特に、CD44は、20エキソンを含む単一60kb遺伝子によりコードされる、80〜90kDaのグリコール化I型膜貫通タンパク質である。20エキソンのうち10は(標準エキソン1sから10sまで)、CD44陽性細胞に発現し、そして「標準CD44」又は「CD44s」をコードする。他の10エキソン(変異エキソン1vから10vまで)はオルタナティブスプライシングにかけられ、そしてCD44の細胞外ドメインに挿入されるペプチド配列をコードする。「CD44の細胞外ドメイン」なる用語は、3ジスルフィド結合により安定化されるN末端球状領域を含み、また線形構造により細胞膜から隔てられ、そしてほぼ247の残基長であって、配列番号3に示される(Gadhoum Z. et al., (2004) Leukemia & Lymphoma 45(8): 1501-1510)。このトリ−ジスルフィド結合ラダーは、CD44の細胞外ドメイン内にあるヒアルロン酸(HA、ヒアルロン酸塩、ヒアルロナン)結合ドメイン「HA結合ドメイン」を示す球状領域を含み、またほぼ100残基長の「連結モジュール」を含む(CD44の細胞外ドメインの32〜123残基で、配列番号5に示される)。「HA結合領域」は更に、少なくともLys38、Arg41、Tyr42、Arg78、Tyr79、Asn100、Asn101、Arg150、Arg154及びArg162アミノ酸残基を含むことで特徴付けられる(Teriete P. et al., (2004) Molecular Cell, 13, 483-496)。
本明細書で使用される「キメラ抗体」の用語は、異なった種由来の抗体を含む、2つ又はそれ以上の異なる抗体由来の領域を含む抗体を意味する。例えば、キメラ抗体の1つ又はそれ以上のCDRは、ヒトCD44抗体から由来することもあり得る。1つの例では、ヒト抗体由来のCDRは、マウス又はラットなどの非ヒト抗体由来のCDRと組み合わせることが可能である。別の例では、全てのCDRはヒトCD44抗体から導くことができる。別の例では、1つ以上のヒトCD44抗体由来のCDRはキメラ抗体と組み合わせることが可能である。例えば、キメラ抗体は、第1ヒトCD44抗体の軽鎖由来のCDR1、第2ヒトCD44抗体の軽鎖由来のCDR2、及び第3ヒトCD44抗体の軽鎖由来のCDR3を含んでもよく、また重鎖由来のCDRは、1つ又はそれ以上の他のCD44抗体から導くこともできる。更に、フレームワーク領域は、1つ又はそれ以上のCDRが採られ又は1つ又はそれ以上の異なるヒト抗体由来のCD44抗体の1つから導くことができる。更に、「キメラ抗体」の用語は、組合せがヒト及び非ヒト抗体にかかわる上記の組合せのいずれをも含むものとする。
抗体について本明細書に使用される「競合する」の用語は、第1抗体、又はその抗原結合部分は、第2抗体、又はその抗原結合部分との結合を競合し、その場合、第1抗体のその同種エピトープとの結合は、第2抗体の不在下での第1抗体の結合に比べて、第2抗体の存在下で検出可能に減少する。第2抗体のそのエピトープへの結合も第1抗体の存在下で検出可能に減少する場合、その代わりとなるものはあり得るが、そうする必要はない。即ち、第1抗体は、第1抗体のそれぞれのエピトープへの結合を阻害するその第2抗体なしに、第2抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかしながら、各抗体が、同程度に、高度又は低度であるにせよ、その同種エピトープ又はリガンドと他の抗体の結合を検出可能に阻害する場合に、抗体はそれらの各エピトープの結合に対して互いに「交差競合する」という。競合及び交差競合抗体の両方が本発明では包含される。そのような競合及び交差競合が起こる(例えば、立体障害、立体配座変化、又は共通エピトープ若しくはその部分への結合)メカニズムに無関係に、当業者には当然ながら、本明細書に示される教示に基づいて、そのような競合及び/又は交差競合抗体も包含され、本明細書に開示の方法に有用であり得る。
本明細書で用いられるように、「保存的アミノ酸置換」の用語は、アミノ酸残基が類似の化学的特性(例えば、電荷又は疎水性)を有する側鎖R基をもつ別のアミノ酸残基により置換されるものの1つである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変えない。2つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存置換により相互に異なる場合には、百分率配列相同性は、置換の保存性を修正するように上方調整することができる。この調整をする手段は当業者でよく知られている。Pearson, (1994) Methods Mol. Biol. 243: 307-31。類似の化学的特性を有する側鎖を持つアミノ酸グループの例は、1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン;2)脂肪族ヒドロキシル側鎖:セリン及びトレオニン;3)アミド含有側鎖:アスパラギン及びグルタミン;4)芳香族側鎖;フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン;5)塩基性側鎖:リジン、アルギニン、及びヒスチジン;6)酸性側鎖:アスパラギン酸及びグルタミン酸;及び7)含硫側鎖:システイン及びメチオニン。保存的アミノ酸置換基は、例えば、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩、及びアスパラギン−グルタミンであってよい。
保存的置換は、また、Gonnet et al., (1992) Science 256: 1443-45に開示されている、PAM250対数尤度マトリックスにおいて正の値を有するいずれかの変化である。「適度に保存的な」置換は、PAM250対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有するいずれかの変化である。
「接触」とは、本発明の抗体又はその抗原結合部分及び標的CD44、又はそのエピトープを、抗体がCD44の生物活性に影響を与えるように合わせることを意味する。そのような「接触」は「インビトロ」、例えば、試験管内で、ペトリ皿内等で達成することができる。試験管内では、接触は、抗体又はその抗原結合部分及びCD44又はそのエピトープのみにかかわり、又はそれは全細胞にかかわり得る。細胞は、また、細胞培養皿中で維持され増殖もし、またその環境中で抗体又はその抗原結合部分と接触する。このような文脈において、特定の抗体又はその抗原結合部分のCD44関連疾患への影響力、即ち、抗体のIC50は、より複雑な生命体によるインビボでの抗体の使用前に測定することができる。生物体外の細胞では、抗体又はその抗原結合部分とCD44を接触させる複数の方法が存在し、そして当業者によく知られている。
本明細書で使用される「ELISA」の用語は、酵素免疫測定法を指す。この分析法は当業者によく知られている。この分析法の例は、Vaughan, T.J. et al., (1996) Nat. Biotech. 14: 309-314、並びに本出願の実施例5、6、7及び11に見出すことが可能である。
「エピトープ」なる用語は、免疫グロブリン若しくはT細胞受容体に特異的に結合し、又はその他に分子と相互作用することができるいずれかのタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、一般にアミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グルーピングから成り、そしてまた、一般に特異的3次元構造特性、並びに特異的電荷特性を有する。エピトープは、「線状」又は「立体配座的」であり得る。線状エピトープでは、タンパク質及び相互作用する分子(抗体など)との間の相互作用の全ての点が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に生じる。立体配座的エピトープでは、相互作用の点は互いに離れたタンパク質上のアミノ酸残基にわたって生じる。一方、抗原上の所望のエピトープがいったん決まると、そのエピトープに対する抗体は、例えば、本発明に記載の技術を用いて産生することができる。発見の過程において、抗体の産生と特徴付けは、所望のエピトープに関する情報を明らかにすることもできる。この情報から、次いで同じエピトープに結合する抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するアプローチは、互いに競合的に結合する抗体を見出すための交差競合検討を行なうことであり、即ち、抗体は抗原への結合を競合する。それらの交差競合に基づいて抗体を「結合」するためのハイスループット方法は、PCT国際公開第03/48731号に記載されている。
本明細書で使用される「発現制御配列」なる用語は、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングをなし遂げるのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な翻訳開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列;スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的RNAプロセシングシグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率化を高める配列(即ち、Kozakコンセンサス配列);タンパク質安定性を高める配列;及び所望により、タンパク質分泌を促進する配列を含む。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる;原核生物では、そのような制御配列は、一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含む;真核生物では、一般的にそのような制御配列はプロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」の用語は、最小限、その存在が発現及びプロセシングに必須である全成分を含むものとし、そしてまた、その存在が有益な、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列である、更なる成分を含むことができる。
本明細書に使用される、「生殖細胞系」なる用語は、親から子へ生殖細胞を経由して通過する抗体遺伝子及び遺伝子断片のヌクレオチド配列を指す。この生殖細胞系配列は、B細胞成熟の過程において組換え及び超変異事象により変化した成熟B細胞で抗体をコードするヌクレオチド配列と区別される。本発明の生殖細胞抗体は、g−1A9.A6.B9、g−2D1.A3.D12及びg−14G9.B8.B4と表わされる。
本明細書で使用される、「ヒト抗体」の用語は、可変及び定常ドメイン配列がヒト配列であるいずれかの抗体を意味する。この用語は、ヒト遺伝子由来の配列を有する抗体を包含し、例えば、可能な免疫原性を減少させ、親和性を増加させ、望ましくない折畳み等を引き起こすシステイン残基を除去するような、変化した抗体を含む。この用語は、また、ヒト細胞に特有ではないグリコシル化を与える可能性のある、非ヒト細胞において組換えで産生するそのような抗体を包含する。これらの抗体は、下記に示される様々な方法で製造することが可能である。
本明細書で使用される、「ヒト化抗体」の用語は、非ヒト起源の抗体を指し、この場合、ヒト以外の種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体の対応位置に見出される残基で置換される。この「ヒト化」方法は、得られる抗体の人間での免疫原性を低下させると考えられる。当然のことながら、非ヒト起源の抗体はこの分野でよく知られた方法を用いてヒト化することができる。Winter et al., (1993) Immunol. Today 14: 43-46。関係する抗体は、CH1、CH2、CH3、及びヒンジドメイン及び/又はフレームワークドメインを対応するヒト配列で置換する、組換えDNA技術により設計することができる(PCT国際公開第92/02190号、米国特許第5530101号、米国特許第5585089号、米国特許第5693761号、米国特許第5693792号、米国特許第5714350号及び米国特許第5777085号)。本明細書で使用される、「ヒト化抗体」の用語は、更にその意味の範囲内で、キメラヒト抗体及びCDRグラフト化抗体を含む。本発明のキメラヒト抗体は、ヒト以外の種の抗体のVH及びVL、及びヒト抗体のCH及びCLドメインを含む。本発明のCDR移植抗体は、ヒト以外の種の抗体の、それぞれVH及びVLによる、ヒト抗体のVH及びVLのCDRの置換をもたらす。
本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、cDNA若しくは合成起源のポリヌクレオチド、又はそれらの組合せを意味し、そしてその起源の故に、「単離されたポリヌクレオチド」は、(1)「単離されたポリヌクレオチド」がそれを有して天然に見出されるポリヌクレオチドの全体又は部分と関係せず、(2)それが天然では連結しないポリヌクレオチドに、機能可能に連結し、又は(3)大きな配列の一部として天然には存在しない。
「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」又は「単離された抗体」の用語は、その起源又は発生源又は由来により、(1)自然状態でそれを伴う天然関連成分に関係せず;(2)同じ種由来の他のタンパク質が認められず;(3)異なる種由来の細胞により発現し;又は(4)本来は起こらない、タンパク質、ポリペプチド又は抗体である。このように、例えば、化学的に合成され又は天然起源の細胞と異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、天然関連成分から「単離」されると思われる。タンパク質も、また、業界でよく知られたタンパク質精製法を用いて、単離により実質的に天然関連成分がないようにすることができる。
単離されたタンパク質の例は、CD44を用いて親和性精製されるCD44抗体、及びインビトロで細胞系によって合成されるCD44抗体を含む。
「インビトロ」は、例えば制限なく、試験管又は培養培地中などの人工環境中で行なわれる手順を指す。
「インビボ」は、制限なく、哺乳動物、例えばサル、ラット又はウサギなどの生物内で行なわれる操作を指す。
「KD」の用語は、特定の抗体−抗体相互作用の結合親和性平衡定数を指す。抗体は、KDが≦1mM、好ましくは≦100nM、及び最も好ましくは≦10nMの場合に、抗原を特異的に結合するといわれている。KD結合親和性定数は、例えば、実施例5で論じられるようにBIACORETMシステムを用いて、表面プラズモン共鳴により測定できる。
「koff」の用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。koff解離速度定数は、例えば、実施例5で論じられるようにBIACORETMシステムを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定できる。
本明細書で使用される「天然産のヌクレオチド」の用語は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「修飾ヌクレオチド」の用語は、例えば、修飾又は置換糖類を有するヌクレオチドを含む。本明細書でいう「オリゴヌクレオチド結合」の用語は、例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホロアニラダート、ホスホロアミダートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。 LaPlanche et al., (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9081; Stec et al., (1984) J. Am. Chem. Soc. 106: 6077; Stein et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16: 3209; Zon et al., (1991) Anti Cancer Drug Design 6: 539; Zon et al., 「オリゴヌクレオチド及び類似体:実用的方法(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach)」, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); 米国特許第5151510号; Uhlmann and Peyman, (1990), Chemical Reviews 90: 543。オリゴヌクレオチドは、所望により、検出用の標識を含むことができる。
「機能可能に連結した」配列は、対象とする遺伝子に隣接する発現制御配列、及び対象とする遺伝子に対してトランスに又はそれをコントロールする距離で作用する発現制御配列の両方を含む。
核酸配列との関連での「パーセント配列同一性」なる用語は、最大対応のためにアラインした場合に同じになる2配列中の残基を意味する。配列同一性比較の長さは、少なくとも約9ヌクレオチド、通常は少なくとも約18ヌクレオチド、より通常は少なくとも約24ヌクレオチド、一般的には少なくとも約28ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約32ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約36、48又はそれ以上のヌクレオチドのストレッチを超えてもよい。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに使用できる、業界でよく知られた異なるアルゴリズムは多数存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package Version 10.0、Genetics Computer Group(GCG), Madison、Wisconsinのプログラムである、FASTA、Gap又はBestfitを用いて比較することができる。例えばFASTA2及びFASTA3プログラムを含むFASTAは、クエリー及びサーチ配列間の最良重複の領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を与える(Pearson, (1990), Methods Enzymol. 183: 63-98; Pearson, (2000), Methods Mol. Biol. 132: 185-219; Pearson, (1996), Methods Enzymol. 266: 227-258; Pearson, (1998), J. Mol. Biol. 276: 71-84)。他の特定がない限り、特定のプログラム又はアルゴリズムに対する標準パラメータが使用される。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、標準パラメータ(スコアリングマトリクスに対して6のワードサイズ及びNOPAM因子)によるFASTAを使用して、又はGCG Version 6.1で与えられるその標準パラメータによるGapを用いて、測定することができる。
ヌクレオチド配列の基準は、他の特定がない限り、その相補体を包含する。それ故、特定の配列を有する核酸の言及は、当然のことながらその相補的配列を有するその相補ストランドを包含する。
アミノ酸配列との関連での「パーセント配列同一性」なる用語は、最大対応のためにアラインした場合に同じになる2配列中の残基を意味する。配列同一性比較の長さは、少なくとも約5アミノ酸、通常は少なくとも約20アミノ酸、より通常は少なくとも約30アミノ酸、一般的には少なくとも約50アミノ酸、より一般的には少なくとも約100アミノ酸、そしてなお更に一般的には約150、200又はそれ以上のアミノ酸のストレッチを超えてもよい。アミノ酸配列同一性を測定するのに使用できる、業界でよく知られた異なるアルゴリズムは多数存在する。例えば、アミノ酸配列は、Wisconsin Package Version 10.0、Genetics Computer Group(GCG)、Madison、Wisconsinのプログラムである、FASTA、Gap、又はBestfitを用いて比較することができる。
ポリペプチドの配列同一性は、一般的に配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失及び他の修飾に割り当てられる類似性の測定を用いて、配列をマッチさせる。例えば、GCGは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなど密接に関係するポリペプチド間、又は野生型タンパク質及びそのアナログ間の配列相同性又は配列同一性を決めるプログラムで規定された、標準パラメータを用いて使用できる「Gap」及び「Bestfit」などのプログラムを含む。例えば、GCG Version 6.1(Wisconsin大、WI)を参照されたい。ポリペプチド配列は、また標準又は推奨パラメータを用いるFASTAを使用して比較できるが、GCG Version 6.1を参照されたい。FASTA(例えば、FASTA2及びFASTA3)は、クエリー及びサーチ配列間の最良重複の領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を与える(Pearson, (1990), Methods Enzymol. 183: 63-98; Pearson, (2000), Methods Mol. Biol. 132: 185-219)。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合、もう1つの好適なアルゴリズムは、コンピュータプログラムのBLASTで、特にプログラムに付属の標準パラメータを用いる、blastp又はtblastnである。例えば、Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-402を参照されたい。
相同性で比較されるポリペプチド配列の長さは、一般には少なくとも約16アミノ酸残基、通常は少なくとも約20残基、より通常は少なくとも約24残基、一般的には少なくとも約28残基、そして好ましくは約35残基以上である。多数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
本明細書に記載の「ポリヌクレオチド」の用語は、少なくとも10塩基長のヌクレオチド、リボヌクレオチドか又はデオキシヌクレオチドの多量体型又はどちらかのタイプのヌクレオチドの修飾型を意味する。この用語は、一本鎖型及び二本鎖型 を含む。
「ポリペプチド」の用語は、天然又は人工タンパク質、タンパク質フラグメント及びタンパク質配列のポリペプチドアナログを包含する。ポリペプチドは単量体型又は多量体型であってもよい。
本明細書で使用される「ポリペプチドフラグメント」の用語は、アミノ末端及び/又はカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指すが、ここで、残りのアミノ酸配列は、天然型の配列の対応位置と同一である。幾つかの実施態様では、フラグメントは、少なくとも5、6、8、及び10アミノ酸長さである。他の実施態様では、フラグメントは、少なくとも14、少なくとも20、少なくとも50、又は少なくとも70、80、90、100、150又は200アミノ酸長さである。
本明細書で使用される、「組換え宿主細胞」(又は簡単に「宿主細胞」)の用語は、組換え発現ベクターが導入される細胞を意味する。当然のことながら、「組換え宿主細胞」及び「宿主細胞」は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫をも意味する。特定の修飾が変異か又は環境的影響に因り後続世代に生じることから、そのような子孫は実際には親細胞に一致しないこともあるが、なお本明細書に使用される「宿主細胞」なる用語の範囲内に含まれる。
タンパク質又はポリペプチドは、少なくとも約60から70%の試料が一種類のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋な」、「実質的に均一な」、又は「実質的に精製された」である。ポリペプチド又はタンパク質は単量体又は多量体である。実質的に純粋なポリペプチド又はタンパク質は、一般的にタンパク質試料の約50質量%、60質量%、70質量%、80質量%又は90質量%、より通常は約95質量%を含むことができ、そして好ましくは99質量%の純度を越えてもよい。タンパク質の純度及び均一性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動と、それに続く業界でよく知られた染色法によるゲル染色における単一ポリペプチドバンドの視覚化など、業界でよく知られた多くの手段により示すことができる。当業者には当然のことながら、精製のために業界によく知られたHPLC又は他の手段を用いることにより、より高い分解能がもたらされ得る。
核酸又はそのフラグメントに関して、「実質的類似性」又は「実質的配列類似性」なる用語は、別な核酸(又はその相補鎖)を用いて、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を含んで最適にアラインした場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約90%、そしてより好ましくは少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%にヌクレオチド配列同一性があることを意味し、これは上記のFASTA、BLAST又はGapなどの配列同一性のいずれかの周知アルゴリズムにより測定される。
ポリペプチドに適用される「実質的類似性」又は「実質的配列類似性」なる用語は、プログラムに付属した標準ギャップ重量を用いるGAP又はBESTFITプログラムによるなど最適にアラインした場合、2つのアミノ酸配列は、少なくとも70%、75%又は80%の配列類似性、好ましくは少なくとも90%又は95%の配列同一性、及び更に好ましくは少なくとも97%、98%、99%又は100%の配列同一性を共有することを意味する。特定の実施態様では、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。
本明細書で使用される、「表面プラズモン共鳴」の用語は、例えばBIACORETMシステム
(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden及びPiscataway, N.J.)を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイム生体特異性相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。更なる説明については、Jonsson U. et al., (1993), Ann. Biol. Clin. 51: 19 26; Jonsson U. et al., (1991), Biotechniques 11: 620 627; Jonsson B. et al., (1995), J. Mol. Recognit. 8: 125 131; and Johnsson B. et al., (1991), Anal. Biochem. 198: 268 277を参照されたい。
(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden及びPiscataway, N.J.)を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイム生体特異性相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。更なる説明については、Jonsson U. et al., (1993), Ann. Biol. Clin. 51: 19 26; Jonsson U. et al., (1991), Biotechniques 11: 620 627; Jonsson B. et al., (1995), J. Mol. Recognit. 8: 125 131; and Johnsson B. et al., (1991), Anal. Biochem. 198: 268 277を参照されたい。
「治療的有効量」は、治療している疾患の1つ又はそれ以上の症状をある程度軽減する、治療薬剤の投与される量を指す。関節リウマチの治療に関して、治療的有効量は、以下の効果の少なくとも1つを有する量を示す:関節の構造的損傷の低減;関節域の液体の蓄積の抑制(即ち、ある程度の遅延、好ましくは停止);そして関節リウマチに伴う1つ又はそれ以上の症状のある程度の軽減(又は、好ましくは、除去)。
「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、生物学的障害及び/又はその付随症状を軽減又は消失させる方法を意味する。関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、肉芽腫性疾患及び多発性硬化症などの様々な自己免疫疾患について、これらの用語は単純にいえば、自己免疫疾患に罹患した個体の推定寿命が増加すること、又は1つ又はそれ以上の疾患の症状が減少することを意味する。
本明細書で使用される、特定の遺伝子について「利用する」という用語は、抗体の特定部位のアミノ酸配列が、B細胞成熟時に最終的にその遺伝子から生成されたことを意味する。例えば、「ヒトVH−3ファミリー遺伝子を利用する重鎖可変アミノ酸配列」という語句は、抗体のVH領域がB細胞成熟時に遺伝子断片のVH−3ファミリーから生成された状況を指す。ヒトB細胞では、抗体を生成する30以上の異なる機能性重鎖可変遺伝子がある。特定の重鎖可変遺伝子の使用は、従って、抗原への結合と機能活性の組合せ特性に関し、抗体−抗原相互作用の好ましい結合モチーフを示す。当然のことながら、遺伝子利用解析は抗体構造の限られた一部の概観を与える。ヒトB細胞はV−D−J重鎖又はV−Jカッパ軽鎖転写物を確率的に生成することから、体細胞超変異、n−付加、及びCDR3拡張を含み、制限なく多くの二次過程が起こる。例えば、Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997)を参照されたい。
本明細書で使用される、20の通常のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。「免疫学−合成(Immnology - A Synthesis)」(2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991))を参照されたい。
本明細書で使用される、「ベクター」なる語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる、核酸分子を意味する。幾つかの実施態様では、ベクターは1つのプラスミド、即ち追加のDNA断片がそれに連結する環状二重鎖DNA切片である。1つの実施態様では、ベクターはウイルスベクターであり、ここで、追加のDNA断片は、ウイルスゲノムに連結され得る。1つの実施態様では、ベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製できる(例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター)。他の実施態様では、ベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター)を、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組込むことができ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。その上、特定のベクターは、それらが機能可能に連結され得る遺伝子の発現に導くことができる。そのようなベクターは「組換え発現ベクター」(又は簡単に、「発現ベクター」とも言われる。
本明細書で使用される「標識」又は「標識化」の用語は、抗体への別の分子の組込みを指す。1つの実施態様では、標識は検出可能なマーカー、例えば放射性標識アミノ酸の組み込み、及び印をつけたアビジン(例えば、光学的又は比色法により検出し得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプトアビジン)により検出し得る、ビオチン部分のポリペプチドへの結合である。別の実施態様では、標識又はマーカーは治療可能な、例えば薬物複合体又は毒素である。ポリペプチド又は糖タンパク質を標識化する種々の方法は業界でよく知られており、使用可能である。ポリペプチドに対する標識の例は、以下のもの:ラジオアイソトープ又は放射性核種、蛍光標識(例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光体)、酵素標識、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)、ガドリニウムキレートなどの磁性剤、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセン(anthracin)ジオン、ミトキサントロン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン並びにそのアナログ又はホモログを含むが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施態様では、標識は、潜在的立体障害を少なくするために種々の長さのスペーサーアームで付けられる。
本発明の抗CD44抗体の重鎖のC末端リジンは、抗体が哺乳類細胞培養で発現する際、1つ又はそれ以上のカルボキシペプチダーゼの活性の結果として抗体が組換え産生する場合には切断し得る(Lewis D. A., et al., Anal. Chem, 66(5): 585-95 (1994), Harris R. J., J. of Chromotography A, 705: 129-134 (1995))。予想構造との多くの違いは、公知か又は新しいタイプのインビボ(翻訳後)修飾、又はメチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸塩異性化及びアスパラギン残基の脱アミド、又はスクシンイミド形成などの、自然(非酵素的)タンパク質分解に由来する組換え産生抗体中に見出すことができる。
ヒト抗CD44抗体及びその特徴付け
本発明は、ヒトCD44に結合する単離されたヒト抗体、又はその抗原結合部分を提供する。本発明の種々の態様は、そのような抗体及び抗原結合部位、及びその薬剤組成物、並びにそのような抗体及び抗原結合部位を作製するための核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞に関する。インビトロか又はインビボで、ヒトCD44を検出し、又はヒトCD44活性を阻害するための本発明の抗体及び抗原結合部位を使用する方法も、本発明に包含される。本発明の好ましい実施態様のヒト抗CD44抗体は、非ヒト又は非ヒト誘導体化モノクローナル抗体(Mab)に固有の免疫原性又はアレルギー反応を最小化し、それ故に投与した抗体の有効性及び安全性を増加させる。完全ヒト抗体の使用は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、肉芽腫性疾患、多発性硬化症、喘息、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬及びがんなどの、反復抗体投与を要すると考えられる慢性及び再発ヒト疾患の治療において、実質的な利点を提供する。
本発明は、ヒトCD44に結合する単離されたヒト抗体、又はその抗原結合部分を提供する。本発明の種々の態様は、そのような抗体及び抗原結合部位、及びその薬剤組成物、並びにそのような抗体及び抗原結合部位を作製するための核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞に関する。インビトロか又はインビボで、ヒトCD44を検出し、又はヒトCD44活性を阻害するための本発明の抗体及び抗原結合部位を使用する方法も、本発明に包含される。本発明の好ましい実施態様のヒト抗CD44抗体は、非ヒト又は非ヒト誘導体化モノクローナル抗体(Mab)に固有の免疫原性又はアレルギー反応を最小化し、それ故に投与した抗体の有効性及び安全性を増加させる。完全ヒト抗体の使用は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、肉芽腫性疾患、多発性硬化症、喘息、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬及びがんなどの、反復抗体投与を要すると考えられる慢性及び再発ヒト疾患の治療において、実質的な利点を提供する。
ヒトを含む幾つかの種由来のCD44アミノ酸及びヌクレオチド配列は、配列番号1及び2が公知である(例えば、Accession番号NM_001001391を参照)。ヒトCD44、又はその免疫原性部分は当業者によく知られた方法によって製造することができ、又は小売業者から購入することができる(例えば、R&Dシステムカタログ番号861−PC−100)。カニクイザル由来のCD44のアミノ酸及びヌクレオチド配列は業界で周知ではなく、そして本明細書に、配列番号5、7(アミノ酸)、8及び153(核酸)として開示されている。
幾つかの実施態様では、ヒト抗CD44抗体は、非ヒトトランスジェニック動物、例えばそのゲノムはトランスジェニック動物がヒト抗体を産生するようにヒト免疫グロブリン遺伝子を含む、げっ歯類を免疫することにより産生させる。幾つかの実施態様では、抗CD44抗体及び抗原結合部分は、HA結合部位に結合する抗体又は抗原結合部位を含むが、これに限定されるものではない。
更なる実施態様では、本発明はその抗体又は抗原結合部位を提供し、ここで、該抗体又は抗原結合部位は、以下のもの:配列番号17、53,89及び125のいずれか1つ、又は少なくとも1つの保存的アミノ酸置換によって配列番号17、53,89及び125のいずれか1つと異なる配列から、独立に選択されるVHCDR1;配列番号19、55,91及び127のいずれか1つ、又は少なくとも1つの保存的アミノ酸置換によって配列番号19、55,91及び127のいずれか1つと異なる配列から、独立に選択されるVHCDR2;そして配列番号21、57、93及び129のいずれか1つ、又は少なくとも1つの保存的アミノ酸置換によって配列番号21、57,93及び129のいずれか1つと異なる配列から、独立に選択されるVHCDR3、から選択される少なくとも1つのCDRを含む。例えば、上記のVHCDR1、CDR2、及びCDR3配列は、1、2、3、4又は5の保存的アミノ酸置換により、それぞれの列挙された配列番号と独立に異なってもよい。
別の実施態様では、本発明は、抗体又はその抗原結合部分を提供することができ、ここで、該抗体又はその抗原結合部分は、配列番号23、59,95及び131のいずれか1つ、又は少なくとも1つの保存的アミノ酸置換によって配列番号23、59,95及び131のいずれか1つと異なる配列から、独立に選択されるVLCDR1;配列番号25、61,97及び133のいずれか1つ、又は少なくとも1つの保存的アミノ酸置換によって配列番号25、61,97及び133のいずれか1つと異なる配列から、独立に選択されるVLCDR2;そして配列番号27、63,99及び137のいずれか1つ、又は少なくとも1つの保存的アミノ酸置換によって配列番号27、63,99及び135のいずれか1つと異なる配列から、独立に選択されるVLCDR3、から選択される少なくとも1つのCDRを含む。例えば、上記のVLCDR1、CDR2、及びCDR3配列は、1、2、3、4又は5の保存的アミノ酸置換により、それぞれの列挙された配列番号と独立に異なってもよい。
本発明のなお更なる実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は:配列番号17に示されるVHCDR1、配列番号19に示されるVHCDR2、配列番号21に示されるVHCDR3、配列番号23に示されるVLCDR1、配列番号25に示されるVLCDR2、及び配列番号27に示されるVLCDR3を含む。
本発明のなお更なる実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は:配列番号53に示されるVHCDR1、配列番号55に示されるVHCDR2、そして配列番号57に示されるVHCDR3、配列番号59に示されるVLCDR1、配列番号61に示されるVLCDR2、及び配列番号63に示されるVLCDR3を含む。
本発明のなお更なる実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は:配列番号89に示されるVHCDR1、配列番号91に示されるVHCDR2、そして配列番号93に示されるVHCDR3、配列番号95に示されるVLCDR1、配列番号97に示されるVLCDR2、及び配列番号99に示されるVLCDR3を含む。
本発明のなお更なる実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は:配列番号125に示されるVHCDR1、配列番号127に示されるVHCDR2、そして配列番号129に示されるVHCDR3、配列番号131に示されるVLCDR1、配列番号133に示されるVLCDR2、及び配列番号135に示されるVLCDR3を含む。
更なる実施態様では、上記のVH及びVLCDR1、CDR2、及びCDR3は、少なく
とも1つの保存的アミノ酸配列置換により、上に列挙した特異的配列番号と各々独立に異なってもよい。例えば、CDR1、CDR2、及びCDR3配列は、1、2、3、4、又は5の保存的アミノ酸置換により、列挙したそれぞれ特異的な配列番号と各々独立に異なってもよい。
とも1つの保存的アミノ酸配列置換により、上に列挙した特異的配列番号と各々独立に異なってもよい。例えば、CDR1、CDR2、及びCDR3配列は、1、2、3、4、又は5の保存的アミノ酸置換により、列挙したそれぞれ特異的な配列番号と各々独立に異なってもよい。
本発明は、更に抗体又はその抗原結合部分を提供し、ここで、該抗体又は抗原結合部分は、1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4及び10C8.2.3抗体のいずれか1つに見出されるVH及びVLCDR1、VH及びVLCDR2、及びVH及びVLCDR3を含む。
更なる実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号11、47、83及び119のいずれかであり、又は少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有することにより配列番号11、47、83及び119のうちのいずれか1つと異なるVHドメインを含む。例えば、VHドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10の保存的アミノ酸置換により、配列番号11、47、83及び119のいずれかと異なることができる。更なる実施態様において、これらの保存的アミノ酸置換のいずれかは、CDR1、CDR2、及び/又はCDR3領域で起こり得る。
本発明の更なる態様は、アミノ酸配列において配列番号11、47、83及び119のうちのいずれか1つに、少なくとも90%、好ましくは95%、そしてより好ましくは96%、97%、98%、99%又は100%同一である、VHドメインを含む抗体又はその抗原結合部分である。
本発明の更なる態様では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号15、51、87及び123のいずれか、又は少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有することにより配列番号15、51、87及び123のうちのいずれかと異なるVLドメインを含む。例えば、VLドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10の保存的アミノ酸置換により、配列番号15、51、87及び123のいずれかと異なることができる。更なる実施態様において、これらの保存的アミノ酸置換のいずれかは、CDR1、CDR2、及び/又はCDR3領域で起こり得る。
本発明の更なる態様は、アミノ酸配列において配列番号15、51、87及び123のうちのいずれか1つに、少なくとも90%、好ましくは95%、そしてより好ましくは96%、97%、98%、99%又は100%同一である、VLドメインを含む抗体又はその抗原結合部分である。
本発明の別の態様では、抗体又はその抗原結合部分は、a)配列番号11に示されるVHドメイン、及び配列番号15に示されるVLドメインを含む抗体又はその抗原結合部分;b)配列番号47に示されるVHドメイン、及び配列番号51に示されるVLドメイン域を含む抗体又はその抗原結合部分;c)配列番号83に示されるVHドメイン、及び配列番号87に示されるVLドメインを含む抗体又はその抗原結合部分;及びd)配列番号119に示されるVHドメイン及び配列番号123に示されるVLドメインを含む抗体又はその抗原結合部分:から成る群から選択される。
更なる実施態様では、a)からd)までの群において上記した抗体又はその抗原結合部分のうちのいずれかに対して、VH及び/又はVLドメインは、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換により、本明細書に列挙した特異的配列番号と異なることができる。例えば、VH及び/又はVLドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10の保存的アミノ酸置換により、列挙した配列番号と異なることができる。更なる実施態様において、これらの保存的アミノ酸置換のいずれかは、CDR1、CDR2、及び/又はCDR3領域で起こり得る。
更に別の実施態様では、本発明は、a)アミノ酸配列において配列番号9に、少なくとも90%、好ましくは95%、そしてより好ましくは96%、97%、98%、99%又は100%同一である重鎖、及びアミノ酸配列において配列番号13に、少なくとも90%、好ましくは95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分;b)アミノ酸配列において配列番号45に、少なくとも90%同一である重鎖、及び配列番号49に、少なくとも95%、好ましくは96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分;c)配列番号81に、少なくとも95%、より好ましくは96%、97%、98%、99%又は100%同一である重鎖、及び配列番号85に、95%、好ましくは96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分;及びd)配列番号117に、少なくとも90%同一である重鎖、及び配列番号121に、好ましくは95%、そしてより好ましくは96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分:から成る群から選択される抗体又はその抗原結合部分である。
別の実施態様では、本発明は、a)配列番号9に示される重鎖、及び配列番号13に示される軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分;b)配列番号45に示される重鎖、及び配列番号49に示される軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分;c)配列番号81に示される重鎖、及び配列番号85に示される軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分;及びd)配列番号117に示される重鎖、及び配列番号121に示される軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分:から成る群から選択される抗体又はその抗原結合部分である。
幾つかの実施態様では、本発明の抗CD44抗体の重鎖のC末端リジンは切断される(Lewis D. A., et al., Anal. Chem, 66(5): 585-95 (1994), Harris R. J., J. of Chromatography A, 705: 129-134 (1995))。
本発明の種々の実施態様では、抗CD44抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び/又は軽鎖は、場合によりシグナル配列を含んでもよい。
本発明は、更にCD44抗体又はその抗原結合部分を提供し、ここで、記載の抗体又はその抗原結合部分、又はそのCDRは、下記のA)からG)に記載したような幾つかの機能特性の内の少なくとも1つを有する。
A)例えば、1つの実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴で測定して、1000nM以下のKDでCD44に結合する。更なる実施態様では、抗体又は部分は、表面プラズモン共鳴で測定して、500nMより小さい、又は好ましくは100nMより小さい、50nMより小さい、20nMより小さい、10nMより小さい、5nMより小さい、4nMより小さい、3nMより小さい、2nMより小さい、1nMより小さい、900pMより小さい、800pMより小さい、700pMより小さい、600pMより小さい、500pMより小さい、100pMより小さいKDでCD44に結合する。通常は、KD値に下限はない。しかしながら、実用的には、下限は約1pMと推定し得る。
B)別の態様では、抗体又はその抗体結合部分は、表面プラズモン共鳴で測定して、0.01s-1より小さいか等しいCD44に対するオフレート(Koff)を有する。例えば、特別の実施態様では、抗体又は部分は、CD44に対して0.005s-1より小さい、0.004s-1より小さい、0.003s-1より小さい、0.002s-1より小さい、又は0.001s-1より小さい、Koffを有する。通常は、Koff値に下限はない。しかしながら、実用的には、下限は1×10-7s-1と推定し得る。
C)更なる実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、FACS又はELISA結合アッセイにより測定して、500nM、75μg/mlより小さいEC50でCD44に結合する。更なる実施態様では、抗体又は部分は、ELISA結合アッセイにより測定して、100nMより小さい、50nMより小さい、20nMより小さい、10nMより小さい、1nMより小さい、500pMより小さい、又は100pMより小さいEC50でCD44に結合する。好ましくは、 抗体又は部分は、10nM、1.5μg/mlより小さいEC50でCD44に結合する。通常は、EC50に下限はない。しかしながら、実用的には、下限は約1pMと推定し得る。
D)更に別の実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、ELISA結合アッセイにより測定して、500nM、75μg/mlより小さいIC50でCD44及びHA間の相互作用を阻害する。更なる実施態様では、抗体又は部分は、ELISA結合アッセイにより測定して、100nMより小さい、50nMより小さい、20nMより小さい、10nMより小さい、5nMより小さい、4nMより小さい、3nMより小さい、2nMより小さい、1nMより小さい、500pMより小さい、又は100pMより小さいIC50でCD44に結合する。
E)更に別の実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、FACSにより測定して、インビボの表面発現及び単球を、約100nMより小さいIC50で減少させる。
F)別の実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、FACSにより測定して、50nMより小さい、20nMより小さい、10nMより小さい、1nMより小さい、500pMより小さい、又は100pMより小さい、約20nMより小さい、約10nMより小さい、又は約5nMより小さい、IC50で減少させる。好ましくは、抗体又はその抗体結合部分は、CD44受容体の表面発現を、30nM、4.5μg/mlより小さいIC50で、インビトロでのCD44受容体の表面発現を減少させる。通常は、EC50に下限はない。しかしながら、実用的には、下限は約1pMと推定できる。
G)別の実施態様では、抗CD44抗体又はその抗原結合部分は、リンパ管内皮ヒアルロナン(hyaluronan)受容体1タンパク質(LYVE1)で、少なくとも100倍のCD44に対する選択性を有する。
A)例えば、1つの実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴で測定して、1000nM以下のKDでCD44に結合する。更なる実施態様では、抗体又は部分は、表面プラズモン共鳴で測定して、500nMより小さい、又は好ましくは100nMより小さい、50nMより小さい、20nMより小さい、10nMより小さい、5nMより小さい、4nMより小さい、3nMより小さい、2nMより小さい、1nMより小さい、900pMより小さい、800pMより小さい、700pMより小さい、600pMより小さい、500pMより小さい、100pMより小さいKDでCD44に結合する。通常は、KD値に下限はない。しかしながら、実用的には、下限は約1pMと推定し得る。
B)別の態様では、抗体又はその抗体結合部分は、表面プラズモン共鳴で測定して、0.01s-1より小さいか等しいCD44に対するオフレート(Koff)を有する。例えば、特別の実施態様では、抗体又は部分は、CD44に対して0.005s-1より小さい、0.004s-1より小さい、0.003s-1より小さい、0.002s-1より小さい、又は0.001s-1より小さい、Koffを有する。通常は、Koff値に下限はない。しかしながら、実用的には、下限は1×10-7s-1と推定し得る。
C)更なる実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、FACS又はELISA結合アッセイにより測定して、500nM、75μg/mlより小さいEC50でCD44に結合する。更なる実施態様では、抗体又は部分は、ELISA結合アッセイにより測定して、100nMより小さい、50nMより小さい、20nMより小さい、10nMより小さい、1nMより小さい、500pMより小さい、又は100pMより小さいEC50でCD44に結合する。好ましくは、 抗体又は部分は、10nM、1.5μg/mlより小さいEC50でCD44に結合する。通常は、EC50に下限はない。しかしながら、実用的には、下限は約1pMと推定し得る。
D)更に別の実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、ELISA結合アッセイにより測定して、500nM、75μg/mlより小さいIC50でCD44及びHA間の相互作用を阻害する。更なる実施態様では、抗体又は部分は、ELISA結合アッセイにより測定して、100nMより小さい、50nMより小さい、20nMより小さい、10nMより小さい、5nMより小さい、4nMより小さい、3nMより小さい、2nMより小さい、1nMより小さい、500pMより小さい、又は100pMより小さいIC50でCD44に結合する。
E)更に別の実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、FACSにより測定して、インビボの表面発現及び単球を、約100nMより小さいIC50で減少させる。
F)別の実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、FACSにより測定して、50nMより小さい、20nMより小さい、10nMより小さい、1nMより小さい、500pMより小さい、又は100pMより小さい、約20nMより小さい、約10nMより小さい、又は約5nMより小さい、IC50で減少させる。好ましくは、抗体又はその抗体結合部分は、CD44受容体の表面発現を、30nM、4.5μg/mlより小さいIC50で、インビトロでのCD44受容体の表面発現を減少させる。通常は、EC50に下限はない。しかしながら、実用的には、下限は約1pMと推定できる。
G)別の実施態様では、抗CD44抗体又はその抗原結合部分は、リンパ管内皮ヒアルロナン(hyaluronan)受容体1タンパク質(LYVE1)で、少なくとも100倍のCD44に対する選択性を有する。
1つの実施態様では、本発明は1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3;で表わされるヒト抗CD44モノクローナル抗体(mAb);及びそれらを産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。本出願の表1及び9〜12は、完全長重鎖及び軽鎖、対応の完全長推定アミノ酸配列、並びにヌクレオチド及び重鎖及び軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列をコードする核酸の配列同定部(配列番号)を示す。
複数の実施態様では、抗体は、1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3で表わされるIgGである。本発明の抗体若しくはその抗原結合部分又は抗体ドメインの特異的アミノ酸配列は、表9、10、11及び12、及び図2に記載されている。
実施態様改変では、CD44抗体のVLは、ヒト遺伝子の生殖細胞系アミノ酸配列に対して1つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様では、抗CD44抗体のVLは、生殖細胞系アミノ酸配列に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のアミノ酸置換を含む。1つの実施態様では、生殖細胞系由来の1つ又はそれ以上のそれらの置換は、軽鎖中のCDR領域である。1つの実施態様では、生殖細胞系に関連したアミノ酸置換は、生殖細胞系に対して、抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3のいずれか1つ又はそれ以上のVLにおける置換と同じの、1つか又はそれ以上の位置においてである。例えば、本発明の抗CD44抗体のVLは、抗体1A9.A6.B9のVLに見出される生殖細胞系と比較して、1つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化は1つ又はそれ以上の同じ位置でなされるが、しかし基準抗体におけるものとは異なる置換を含む。
1つの実施態様では、生殖細胞系に関連したアミノ酸変化は、抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3のVLのいずれかと同じ1つ又はそれ以上の位置で起こるが、この変化は、基準抗体のアミノ酸に対して、そのような位置での保存的アミノ酸置換を表わす可能性がある。例えば、これらの抗体の1つの特定の位置が生殖細胞系に関連して変化して、グルタミン酸塩である場合、その位置でアスパラギン酸塩を置換することもできる。同様に、生殖細胞系と比べてアミノ酸置換がセリンの場合、その位置でトレオニンをセリンと置き換えることができる。保存的アミノ酸置換は上記で論じられている。
幾つかの実施態様では、ヒト抗CD44抗体の軽鎖は、抗体1A9.A6.B9(配列番号15);2D1.A3.D12(配列番号51);14G9.B8.B4(配列番号87)又は10C8.2.3(配列番号123)のVLアミノ酸配列、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10の保存的アミノ酸置換まで、及び/又は、3非保存的アミノ酸置換までの全てを有する該アミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様では、軽鎖は、前述した抗体のいずれか1つのCDR1の始めからCDR3の終わりまでのアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、軽鎖は、抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3の軽鎖の、それぞれ軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3から独立に選択されるCDR1、CDR2、及びCDR3領域、又はそれぞれ4より小さい若しくは3より小さい保存的アミノ酸置換、及び/又は総数で3又はそれより少ない非保存的アミノ酸置換を有するCDR領域を含むことができる。幾つかの実施態様では、抗CD44抗体の軽鎖は、軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、その各々は、モノクローナル抗体1A9.A6.B9(配列番号13);2D1.A3.D12(配列番号49);14G9.B8.B4(配列番号85)又は10C8.2.3(配列番号121)の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3領域から独立に選択される。特別の実施態様では、抗CD44抗体の軽鎖は、1A9.A6.B9(配列番号15);2D1.A3.D12(配列番号51);14G9.B8.B4(配列番号87)又は10C8.2.3(配列番号123)から選択されるVL領域のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3領域、又はそれぞれ4より小さい若しくは3より小さい保存的アミノ酸置換、及び/又は総数で3又はそれより少ない非保存的アミノ酸置換を有する該CDR領域を含む。
本発明の抗CD44抗体は、ヒトカッパ若しくはヒトラムダ軽鎖又はそれらに由来するアミノ酸配列を含むことができる。カッパ軽鎖を含む幾つかの実施態様では、軽鎖可変領域(VL)は、一部ヒトVΚ1、VK2又はVK3ファミリー遺伝子によってコードされる。特別の実施態様では、軽鎖は、ヒト、又はサルアミノ酸配列若しくはその組合せを利用する。
重鎖に関して、1つの実施態様では、可変領域(VH)が一部ヒト遺伝子によりコードされる。幾つかの実施態様では、抗CD44抗体のVH配列は、生殖細胞系アミノ酸配列に関連した1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入(付加)を含む。幾つかの実施態様では、重鎖の可変領域は、生殖細胞系アミノ酸配列由来の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17の突然変異を含む。幾つかの実施態様では、突然変異は生殖細胞系アミノ酸配列に比べて、非保存的置換、欠失又は挿入である。幾つかの実施態様では、突然変異は重鎖のCDR領域にある。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化は、抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4又は10C8.2.3のVHのいずれか1つ又はそれ以上の生殖細胞系の突然変異と同じ、1つ又はそれ以上の位置で行なわれる。他の実施態様では、アミノ酸変化は1つ又はそれ以上の同じ位置であるが、しかし基準抗体におけるものとは異なる突然変異を含む。
幾つかの実施態様では、重鎖は、抗体1A9.A6.B9(配列番号11);2D1.A3.D12(配列番号47);14G9.B8.B4(配列番号83)又は10C8.2.3(配列番号119)のVHアミノ酸配列、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10の保存的アミノ酸置換まで、及び/又は、3非保存的アミノ酸置換までの全てを有する該VHアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様では、重鎖は、前述の抗体のいずれか1つのCDR1の始めからCDR3の終わりまでのアミノ酸配列を含む。
1つの実施態様では、重鎖は、抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4又は10C8.2.3の重鎖CDR1、CDR2及びCDR3領域、又は各々8より小さい、6より小さい、4より小さい、又は3より小さい保存的アミノ酸置換、及び/又は総数で3又はそれより少ない非保存的アミノ酸置換を有する該CDR領域を含む。幾つかの実施態様では、重鎖CDR領域は、抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4又は10C8.2.3の重鎖CDR領域から独立に選択される。別の実施態様では、重鎖は、1A9.A6.B9(配列番号11);2D1.A3.D12(配列番号47);14G9.B8.B4(配列番号83)又は10C8.2.3(配列番号119)から選択される、2つ又はそれ以上のVH領域から独立に選択されるCDR領域を含む。
別の実施態様では、抗体は軽鎖及び重鎖を含む。更なる実施態様では、軽鎖CDR及び重鎖CDRは、同じ抗体に由来する。
行われるアミノ酸置換の1つのタイプは、抗体中の化学的に反応性の高い1つ又はそれ以上のシステインを、限定しないが、アラニン又はセリンなどの別の残基に変えることである。1つの実施態様では、非カノニカルシステインの置換がある。置換はCDRに又は可変ドメインのフレームワーク領域に又は抗体の定常ドメインでなされる。幾つかの実施態様では、システインがカノニカルである。
行われるアミノ酸置換の別のタイプは、抗体中の任意の潜在的タンパク質分解部位を変えることである。そのような部位は、CDRに又は可変ドメインのフレームワーク領域に又は抗体の定常ドメインに生じ得る。システイン残基の置換及びタンパク質分解部位の除去は、抗体産物のいずれかの異種性のリスクを低減し、その結果同種性を増加させる可能性がある。アミノ酸置換の別のタイプは、残基の1つ又は両方を変えることにより潜在的な脱アミド部位を形成する、アスパラギン−グリシン対を除去することである。
本発明の実施態様では、抗CD44抗体の重鎖と軽鎖は、場合によりシグナル配列を含むことができる。
1つの態様では、本発明は4つの好ましい阻害性ヒト抗CD44モノクローナル抗体、及びそれらを産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。表1に、重鎖及び軽鎖の完全長及び可変領域含有部分をコードする核酸の配列同定部(配列番号)、及び対応又は推定アミノ酸配列をリストアップする。
幾つかの実施態様では、本発明は、モノクローナル抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4又は10C8.2.3の、重鎖及び軽鎖バリアントを提供する。本発明の実施例3で詳述されるように、多くの重鎖及び軽鎖バリアント変異が、生殖細胞系CDR領域のそれと一致させるために作製された。例えば、本発明の1つの実施態様では、g−1A9.A6.B9、g−2D1.A3.D12、g−14G9.B8.B4、及びg−10C8.2.3は、それぞれ1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4、及び10C8.2.3の生殖細胞系列化バージョンである。変異して生殖細胞系列化バージョンに達した特異的アミノ酸は、生殖細胞系列化対非生殖細胞系列化抗体の配列を比較することにより当業者に明らかである。例えば、本発明は、残基28でのトレオニンがイソロイシンに変換される、抗体2D1.A3.D12の重鎖における1つのアミノ酸置換を提供する。第2点突然変異は、抗体2D1.A3.D12の軽鎖においてであり、そして残基38でグルタミンはヒスチジンで置換される。
当然のことながら、遺伝子利用解析は、抗体構造の限られた概観を提供するだけである。ヒトB細胞は確率的にV−D−J重鎖又はV−Jカッパ軽鎖転写物を生成することから、限定されないが、体細胞超変異、n−付加、及びCDR3拡張を含む多くの二次過程が起こる。例えば、Mendez et al., (1997) Nature Genetics 15: 146-156及び米国特許出願第2003−0070185号を参照されたい。従って、本発明の抗体構造を更に検討するために、抗体の予想アミノ酸配列が、クローンより得られたcDNAから生成された。加えて、N末端アミノ酸配列が、タンパク質配列決定を介して得られた。下表2は、4つの抗CD44ハイブリドーマ由来抗体の生殖細胞系遺伝子断片及びイソタイプを説明する。
代わりの実施態様では、本発明は、ヒトCD44に特異的に結合し、また1)VHD4−17及びVLL6;2)VHD3−10及びVLA27;及び3)VHD6−19及びVLA27から成る群から選択される、VH及びVL遺伝子を利用する抗体又はその抗原結合部分に関する。
別の実施態様は、Fabフラグメント、F(ab′)2フラグメント、Fvフラグメント、単鎖Fvフラグメント、単鎖VHフラグメント、単鎖VLフラグメント、ヒト化抗体、キメラ抗体又は二重特異性抗体である、上記の抗体又は抗原結合部分のいずれかを提供する。
更なる実施態様では、本明細書に記載の抗体又はその部分のいずれか、及び少なくとも1つの更なる分子実体を含む誘導化された抗体又は抗原結合部分が供給される。例えば、少なくとも1つの更なる分子的実体は、別の抗体(例えば、二重特異性抗体又は二重特異抗体)、検出試薬、標識、細胞毒性薬、薬剤、及び/又は抗体又は抗原結合部分と別の分子(ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ)及び/又は抗体又は抗原結合部分に結合若しくは融合(融合タンパク質)した担体タンパク質(例えば、血液タンパク質アルブミン又はトランスフェリン)との結合を媒介し得るタンパク質又はペプチドであってもよい。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分が誘導化される有用な検出試薬は、蛍光化合物;特に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5−ジメチルアミン−1−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体を含む。抗体は、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの、検出に有用な酵素で標識することができる。更なる実施態様では、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ビオチンで、又は二次レポーター(例えば、ロイシンジッパ対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)により認識される所定のポリペプチドエピトープで標識することもできる。本発明の尚更なる実施態様では、抗体又はその抗原結合部分のいずれも、ポリエチレングリコール(PEG)、メチル又はエチル基、又はカルボキシル基などの化学基で誘導化することもできる。
幾つかの実施態様では、本明細書に開示されるCD44抗体又は抗原結合部分は、固体支持体又は粒子に結合される。そのような粒子はインビボ又はインビトロで診断用に使用される。
抗CD44抗体のクラス及びサブクラス
CD44抗体のクラス(例えば、IgG、IgM、IgE、IgA、又はIgD)及びサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)は、業界でよく知られたいずれの方法によっても決定することができる。一般的に、抗体のクラス及びサブクラスは、抗体の特定のクラス及びサブクラスに特異的な抗体を用いて決定することができる。そのような抗体は市販されている。クラス及びサブクラスは、ELISA、又はウェスタンブロット法並びに他の技術で決定することができる。あるいは、クラス及びサブクラスは、抗体類の重鎖及び/又は軽鎖の定常ドメインの全部又は一部を配列解析し、それらのアミノ酸配列を様々なクラス及びサブクラスの免疫グロブリンの公知のアミノ酸配列と比較し、そして抗体のクラス及びサブクラスを調べることにより決定し得る。本発明のCD44抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、又はIgD分子であり得る。例えば、CD44抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4であるIgGであり得る。
CD44抗体のクラス(例えば、IgG、IgM、IgE、IgA、又はIgD)及びサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)は、業界でよく知られたいずれの方法によっても決定することができる。一般的に、抗体のクラス及びサブクラスは、抗体の特定のクラス及びサブクラスに特異的な抗体を用いて決定することができる。そのような抗体は市販されている。クラス及びサブクラスは、ELISA、又はウェスタンブロット法並びに他の技術で決定することができる。あるいは、クラス及びサブクラスは、抗体類の重鎖及び/又は軽鎖の定常ドメインの全部又は一部を配列解析し、それらのアミノ酸配列を様々なクラス及びサブクラスの免疫グロブリンの公知のアミノ酸配列と比較し、そして抗体のクラス及びサブクラスを調べることにより決定し得る。本発明のCD44抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、又はIgD分子であり得る。例えば、CD44抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4であるIgGであり得る。
本発明の1つの側面は、CD44抗体のクラス又はサブクラスを別のクラス又はサブクラスに変換する方法を提供する。幾つかの実施態様では、CL又はCHをコードする配列を含まないVL又はVHをコードする核酸が、業界でよく知られた方法を用いて単離される。次いで、核酸分子は、所望の免疫グロブリンクラス又はサブクラスからCL又はCHをコードする核酸配列に機能可能に連結される。これは、上記のCL又はCH鎖を含むベクター又は核酸分子を用いて達成することができる。例えば、元々IgMであったCD44抗体は、IgGのクラスにスイッチされ得る。更に、クラススイッチは、1つのIgGサブクラスを別なものに、例えば、IgG1からIgG2へ変換するのに使用可能である。所望のイソタイプを含む本発明の抗体を生産する方法は、CD44抗体の重鎖をコードする核酸及びCD44抗体の軽鎖をコードする核酸を単離し、VH領域をコードする配列を単離し、VH配列を所望のイソタイプの重鎖定常ドメインをコードする配列にライゲートし、細胞内に軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子構成体を発現させ、そして所望のイソタイプを有するCD44抗体を採取する工程を含む。
種及び分子選択性
本発明の別の側面では、抗CD44抗体は、種及び分子選択性の両方を示す。幾つかの実施態様では、抗CD44抗体はヒト及び霊長類のCD44に結合する。好適には抗CD44は、ヒト及びカニクイザルのCD44に結合する。明細書の教示に従って、業界でよく知られた方法を用いて抗CD44抗体に対する種特異性を決定することができる。例えば、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法又はRIAを用いて、種特異性を明らかにすることができる(例えば、実施例5を参照されたい)。
本発明の別の側面では、抗CD44抗体は、種及び分子選択性の両方を示す。幾つかの実施態様では、抗CD44抗体はヒト及び霊長類のCD44に結合する。好適には抗CD44は、ヒト及びカニクイザルのCD44に結合する。明細書の教示に従って、業界でよく知られた方法を用いて抗CD44抗体に対する種特異性を決定することができる。例えば、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法又はRIAを用いて、種特異性を明らかにすることができる(例えば、実施例5を参照されたい)。
別の実施態様では、抗CD44抗体は、リンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1タンパク質(LYVE−1)の少なくとも100倍を超えてCD44選択性を有する(実施例11を参照されたい)。明細書の教示に従って、業界でよく知られた方法を用いて、CD44に対する抗CD44抗体の選択性を決定することができる。例えば、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法又はRIAを用いて、選択性を明らかにすることができる。
CD44に対する抗CD44抗体の結合親和性
1つの実施態様では、抗CD44抗体は、哺乳類CD44、好ましくはヒトに対して高親和性で結合する。
1つの実施態様では、抗CD44抗体は、哺乳類CD44、好ましくはヒトに対して高親和性で結合する。
1つの実施態様では、抗CD44抗体は、HA結合ドメイン内で結合する。
別の実施態様では、抗CD44抗体は、配列番号3(細胞外ドメインIgG融合)に又は配列番号154(サル細胞外IgG融合)に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドに高親和性で結合し、そして好適にはHA結合ドメインのアミノ酸配列から成るポリペプチドに高親和性で結合する。
別の実施態様では、抗CD44抗体はCD44に、又はより好ましくはHA結合ドメインに、500nM以下のKDで結合する。尚他の実施態様では、抗CD44抗体はCD44に、又はより好ましくはCD44のHA結合ドメインに、2×10-8M、2×10-9M、又は5×10-10M以下のKDで結合する。更により好ましい実施態様では、CD44にHA結合ドメイン中で、2.5×10-12M以下のKDで結合する。幾つかの実施態様では、抗体はCD44に、抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;又は10C8.2.3と実質的に同じKDで結合する。
幾つかの実施態様では、抗CD44抗体は、低い解離速度定数(koff)を有する。幾つかの実施態様では、抗CD44抗体は、CD44に、又はより好ましくはCD44のHA結合ドメインに、1.0×10-3s−1より低いkoff又は5.0×10-4s−1より低いkoffで結合する。尚他の実施態様では、koffは、1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3から選択される抗体を含み、本明細書に記載の抗体と実質的に同じである。幾つかの実施態様では、抗体は、1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3から選択される抗体由来の、重鎖のCDR領域、又は軽鎖のCDR領域を含む抗体と実質的に同じkoffでCD44に結合する。幾つかの実施態様では、抗体は、CD44に、又はより好ましくはCD44のHA結合ドメインに、配列番号9、45、81及び117に見出されるVH領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、又は配列番号13、49、85又は121に見出されるVL領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と、実質的に同じkoffで結合する。尚別の実施態様では、抗体は、CD44に、又はより好ましくはCD44のHA結合ドメインに、配列番号15、49、85又は121に見出されるVL領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインのCDR領域、又は配列番号9、45、81及び117に見出されるVH領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインのCDR領域を含む抗体と、実質的に同じkoffで結合する。
CD44に対する抗CD44抗体の結合親和性及び解離速度は、業界でよく知られた方法により決定することができる。結合親和性は、ELISA、RIA、フローサイトメトリー(FACS)、BIACORETMなどの表面プラズモン共鳴により測定することができる。解離速度は、表面プラズモン共鳴により測定できる。好ましくは、結合親和性及び解離速度は、表面プラズモン共鳴により測定される。より好ましくは、結合親和性及び解離速度は、BIACORETMを用いて測定される。抗体が実質的に抗CD44抗体と同じKDを有するかについて、業界でよく知られた方法を用いて測定することができる。実施例5は、抗CD44モノクローナル抗体の親和定数を測定する方法を提供する。
抗CD44抗体で認識されるCD44エピトープの同定
本発明は、CD44に結合し、そして:(a)1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3から選択される抗体;(b)配列番号9、45、81及び117に見出される可変ドメインのアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む抗体;(c)配列番号13、49、85又は121に見出される可変ドメインのアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体;又は(d)(b)に記載の重鎖可変ドメイン及び(c)に記載の軽鎖可変ドメインの両方を含む抗体、と同じエピトープと競合又は交差競合及び/又は結合する、ヒト抗CD44モノクローナル抗体を提供する。
本発明は、CD44に結合し、そして:(a)1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3から選択される抗体;(b)配列番号9、45、81及び117に見出される可変ドメインのアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む抗体;(c)配列番号13、49、85又は121に見出される可変ドメインのアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体;又は(d)(b)に記載の重鎖可変ドメイン及び(c)に記載の軽鎖可変ドメインの両方を含む抗体、と同じエピトープと競合又は交差競合及び/又は結合する、ヒト抗CD44モノクローナル抗体を提供する。
抗体が、同じエピトープに結合するか、抗CD44抗体との結合と交差競合するかについて、業界でよく知られた方法を用いて明らかにすることができる。1つの実施態様では、本発明の抗CD44抗体を飽和状態下にCD44に結合することができ、その結果、試験抗体のCD44への結合能を測定することができる。試験抗体が抗CD44抗体と同時にCD44に結合できるならば、その結果、試験抗体は抗CD44抗体と異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が同時にCD44に結合できなければ、その結果、試験抗体は同じエピトープ、重複エピトープ、又はヒト抗CD44抗体により結合したエピトープに直近のエピトープに結合する。この実験は、ELISA、RIA、BIACORETM、又はフローサイトメトリー(FACS)を用いて実施することができる。
抗CD44抗体が別の抗CD44抗体と交差競合するかどうかを試験するために、2つの指示書に記載の競合法を使用することができる。即ち、基準抗体が試験抗体をブロックするか、またその逆を決定する。1つの実施態様では、実験はELISAを用いて実施される。更に以下でKDの決定法を論じる。
抗CD44抗体によるCD44活性の阻害
別の実施態様では、本発明は、CD44媒介シグナル伝達を阻害する抗CD44抗体を提供する。他の実施態様では、本発明は、CD44を介してリンパ球及び単球に対する共刺激シグナル伝達を阻害する抗CD44抗体を提供する。尚別の実施態様では、本発明は、サイトカイン産生、そして特にTNF−α、IL−6及びIL−1βなどのサイトカイン産生をブロックする抗CD44抗体を提供する。更なる実施態様では、本発明は、CD44受容体へのHAの結合を阻害する抗CD44抗体を提供する。1つの実施態様では、CD44受容体はヒトのものである。尚別の実施態様では、抗CD44抗体はヒト抗体である。IC50は、ELISA、RIA、又は他の方法によるリガンド結合アッセイ、及びFACS分析又はCD44を発現する細胞などの細胞に基づく分析で測定することができる。1つの実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、ELISA分析で測定して、わずか5μg/ml、好ましくはわずか1μg/ml、より好ましくは0.5μg/ml以上、尚一層好ましくはわずか0.20μg/mlのIC50で、HAとCD44間のリガンド結合を阻害する。実施例4は、HAに結合するCD44のモノクローナル抗体により阻害を測定する方法を提供する。
別の実施態様では、本発明は、CD44媒介シグナル伝達を阻害する抗CD44抗体を提供する。他の実施態様では、本発明は、CD44を介してリンパ球及び単球に対する共刺激シグナル伝達を阻害する抗CD44抗体を提供する。尚別の実施態様では、本発明は、サイトカイン産生、そして特にTNF−α、IL−6及びIL−1βなどのサイトカイン産生をブロックする抗CD44抗体を提供する。更なる実施態様では、本発明は、CD44受容体へのHAの結合を阻害する抗CD44抗体を提供する。1つの実施態様では、CD44受容体はヒトのものである。尚別の実施態様では、抗CD44抗体はヒト抗体である。IC50は、ELISA、RIA、又は他の方法によるリガンド結合アッセイ、及びFACS分析又はCD44を発現する細胞などの細胞に基づく分析で測定することができる。1つの実施態様では、抗体又はその抗原結合部分は、ELISA分析で測定して、わずか5μg/ml、好ましくはわずか1μg/ml、より好ましくは0.5μg/ml以上、尚一層好ましくはわずか0.20μg/mlのIC50で、HAとCD44間のリガンド結合を阻害する。実施例4は、HAに結合するCD44のモノクローナル抗体により阻害を測定する方法を提供する。
別の実施態様では、本発明は、HAに対するCD44の結合を阻害する抗CD44抗体を提供する。1つの実施態様では、抗CD44抗体は、HAで誘導された:(i)白血球動員;(ii)細胞−マトリックス相互作用、及び例えば、白血球及び内皮細胞などの細胞間直接相互作用;(iii)白血球細胞機能の調節;(iv)HAの代謝;及び/又は(v)マトリックスの集合、有機化(organization)及びリモデリングに対するCD44の寄与を阻害する。抗CD44抗体がHAの存在下にCD44の活性化を防止し、阻害し、又は低減するかについては、リポ多糖類(LPS)及びHAにより誘発された白血球からの炎症性サイトカイン放出を測定することにより決定できる。CD44活性化及び/又はCD44に対するHA結合の検出法は、実施例4、5、6及び7に記載されている。1つの実施態様では、サイトカイン分析を用いて、CD44活性化のレベルを測定できる。幾つかの実施態様では、HA競合結合アッセイを用いて測定したIC50は、5μg/ml以下、好ましくは1μg/ml以下、より好ましくは0.5μg/ml以下、尚一層好ましくは0.20μg/ml以下である。
抗CD44抗体による表面細胞発現の減少
本発明の別の態様では、抗体は、抗体とインキュベーション後細胞表面CD44発現のダウンレギュレーションを引き起こす。1つの実施態様では、インキュベーションは、短時間(例えば、4時間)又は長時間(例えば、24時間)が可能である。特に、本発明は、循環リンパ球、そして好ましくは、CD3+Tリンパ球上にCD44発現のダウンレギュレーションを誘導する抗CD44抗体を提供する。細胞表面CD44発現のダウンレギュレーションは、FACSを用いて測定することができる。本発明の格別な実施態様では、抗体は、FACSで測定して、細胞表面CD44発現の好適には6%減少、好適には10%減少、又はより好適には20%ダウンレギュレーション、又は更に好適には細胞表面CD44発現の少なくとも50%減少をもたらす。実施例8は、2種:ヒト及びカニクイザルの白血球及びT細胞の細胞表面CD44発現のダウンレギュレーションを測定する、FACS分析の1タイプを例証する。
本発明の別の態様では、抗体は、抗体とインキュベーション後細胞表面CD44発現のダウンレギュレーションを引き起こす。1つの実施態様では、インキュベーションは、短時間(例えば、4時間)又は長時間(例えば、24時間)が可能である。特に、本発明は、循環リンパ球、そして好ましくは、CD3+Tリンパ球上にCD44発現のダウンレギュレーションを誘導する抗CD44抗体を提供する。細胞表面CD44発現のダウンレギュレーションは、FACSを用いて測定することができる。本発明の格別な実施態様では、抗体は、FACSで測定して、細胞表面CD44発現の好適には6%減少、好適には10%減少、又はより好適には20%ダウンレギュレーション、又は更に好適には細胞表面CD44発現の少なくとも50%減少をもたらす。実施例8は、2種:ヒト及びカニクイザルの白血球及びT細胞の細胞表面CD44発現のダウンレギュレーションを測定する、FACS分析の1タイプを例証する。
抗体の生産方法
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含み、様々な技術で生産することができる。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原理的には、モノクローナル抗体を生産する他の技術、例えば、Bリンパ球のウイルス又は発がん性形質転換も使用可能である。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含み、様々な技術で生産することができる。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原理的には、モノクローナル抗体を生産する他の技術、例えば、Bリンパ球のウイルス又は発がん性形質転換も使用可能である。
ハイブリドーマを作製する好ましい動物系はマウス系である。マウスでのハイブリドーマ生産は非常に良く確立された手順である。融合用に免疫された脾臓細胞の分離のための免疫感作プロトコールと技術は、業界で公知である。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)及び融合手順もまた公知である。
本発明のキメラ又はヒト化抗体は、上記のように作製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて作製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、関心あるマウスハイブリドーマから得られ、そして標準的な分子生物学的技術を用いて非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように操作される。例えば、キメラ抗体を作出するためには、業界で公知の方法(米国特許第4816567号)を用いて、マウスの可変領域をヒト定常領域に結合することができる。ヒト化抗体を作出するためには、マウスCDR領域を業界に公知の方法(米国特許第5225539号、米国特許第5530101号、米国特許第5585089号、米国特許第5693762号及び米国特許第6180370号)を用いて、ヒトのフレームワークに挿入することができる。
好ましい実施態様では、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。CD44に対するそのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系の一部を持つトランスジェニック又は染色体導入マウス(transchromosomic mice)を用いて生成することができる。これらのトランスジェニック又は染色体導入マウスは、それぞれHuMAbマウス(登録商標)及びKMマウス(登録商標)として本明細書に記載のマウスを含み、また「ヒトIgマウス」と総称して本明細書に記載されている。
HuMAbマウス(登録商標)(Medarex、Inc.社)は、未再配列ヒト重鎖(μ及びν)及びκ軽鎖免疫グロブリン配列を、内因性μ及びκ鎖遺伝子座を不活化する標的変異と一緒にコードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む(例えば、 Lonberg, et al. (1994), Nature 368: 856-859を参照されたい)。その結果、マウスは、マウスのIgM又はκの発現低下を示し、そして免疫付与に応じて、導入されたヒト重鎖と軽鎖のトランス遺伝子は、高親和性ヒトIgGκモノクローナルを生成するように、クラススイッチ及び体細胞変異を受ける(Lonberg, N. et al. (1994), 同上; reviewed in Lonberg, N.
(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546)。HuMAbマウス(登録商標)の調製及び使用、及びそのようなマウスにより担持されたゲノム修飾は、更に、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993), International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724; Choi et al. (1993), Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993), EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994), J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. et al. (1994), International Immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されている。更に、米国特許第5545806号、米国特許第5569825号、米国特許第5625126号、 米国特許第5633425号、米国特許第5789650号、米国特許第5877367号、米国特許第5661016号、米国特許第5814318号、米国特許第5874299号、及び米国特許第5770429号、米国特許第5545807号、PCT国際公開第92/03918号、同国際公開第93/12227号、同国際公開第94/25585号、同国際公開第97/13852号、同国際公開第98/24884号及び同国際公開第99/45962号、及び国際公開第01/14424号を参照されたい。
(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546)。HuMAbマウス(登録商標)の調製及び使用、及びそのようなマウスにより担持されたゲノム修飾は、更に、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993), International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724; Choi et al. (1993), Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993), EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994), J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. et al. (1994), International Immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されている。更に、米国特許第5545806号、米国特許第5569825号、米国特許第5625126号、 米国特許第5633425号、米国特許第5789650号、米国特許第5877367号、米国特許第5661016号、米国特許第5814318号、米国特許第5874299号、及び米国特許第5770429号、米国特許第5545807号、PCT国際公開第92/03918号、同国際公開第93/12227号、同国際公開第94/25585号、同国際公開第97/13852号、同国際公開第98/24884号及び同国際公開第99/45962号、及び国際公開第01/14424号を参照されたい。
別の実施態様では、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子及びヒト軽鎖トランス染色体を持つマウスなどの、トランス遺伝子及びトランス染色体にヒト免疫グロブリン配列を持つマウスを用いて産生させることができる。「KMマウスTM」として本明細書に記載のそのようなマウスは、PCT国際公開第02/43478号に詳細に記載されている。
なお更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系は業界で入手可能であり、そして本発明の抗CD44抗体を産生させるのに使用可能である。例えば、XenomouseTM(Abgenix、Inc.)として記載されている代替トランスジェニック系が使用でき;そのようなマウスは、例えば、米国特許第5939598号、米国特許第6075181号、 米国特許第6114598号、 米国特許第6150584号、及び米国特許第6162963号に記載されている。
その上、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスクロモソミック動物系は業界で入手可能であり、そして本発明の抗CD44抗体を産生させるのに使用可能である。例えば、「TCマウス」として記載されているヒト重鎖染色体導入及びヒト軽鎖染色体導入の両方を持つマウスが使用でき;そのようなマウスは、例えば、Tomizuka et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727に記載されている。更に、ヒト重鎖及び軽鎖染色体導入を持つ雌ウシは、当該技術で記載されており(Kuroiwa et al. (2002), Nature Biotechnology 20: 889-894) 、そして本発明の抗CD44抗体を産生させるのに使用可能である。
本発明のヒトモノクローナル抗体も、ヒト抗体応答が免疫付与の際に発生し得るようにヒト免疫細胞を再構成している、SCIDマウスを用いて調製することができる。そのようなマウスは、例えば、米国特許第5476996号及び米国特許第号5698767号に記載されている。
ヒトIgマウスの免疫感作
動物のCD44抗原による免疫後、抗体及び/又は抗体産生細胞が動物から得られ得る。幾つかの実施態様では、抗CD44抗体含有血清が、動物の出血又は犠牲により動物から得られる。血清は動物から得られたまま使用してもよく、またその血清から免疫グロブリン画分を得たり、又は抗CD44抗体を精製することができる。
動物のCD44抗原による免疫後、抗体及び/又は抗体産生細胞が動物から得られ得る。幾つかの実施態様では、抗CD44抗体含有血清が、動物の出血又は犠牲により動物から得られる。血清は動物から得られたまま使用してもよく、またその血清から免疫グロブリン画分を得たり、又は抗CD44抗体を精製することができる。
幾つかの実施態様では、抗体産生不死化細胞系は、免疫動物から単離した細胞から作製することができる。免疫後、動物を犠牲にし、そしてリンパ節及び/又は脾臓B細胞を業界で公知の任意の手段で不死化する。細胞の不死化方法には、腫瘍遺伝子によるそれらのトランスフェクション、腫瘍ウイルスへのそれらの感染、不死化細胞を選択する条件下でのそれらの培養、発がん性又は変異原性化合物へのそれらの曝露、不死化細胞、例えば骨髄腫細胞とそれらの融合、及び腫瘍抑制遺伝子の不活性化が含まれるが、これらに限定されない。例えば、上記のHarlow and Laneを参照されたい。骨髄腫細胞との融合を使用する場合、骨髄腫細胞は、好ましくは免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない(非分泌細胞系)。不死化細胞は、CD44、その一部分、又はCD44を発現する細胞を用いてスクリーニングされる。1つの好ましい実施態様では、CD44部分は:(i)CD44のHA結合部位を含み;(ii)配列番号1及び/又は配列番号2で示した完全又は切り詰められたアミノ酸配列;(iii)又はその組み合わせを含む。1つの実施態様では、初期スクリーニングが、酵素結合免疫測定法(ELISA)又はラジオイムノアッセイを用いて行なわれる。ELISAスクリーニングの1例は、PCT国際公開00/37504号に与えられている。
抗CD44抗体産生細胞、例えばハイブリドーマは、選択され、クローニングされ、そして更にロバスト成長、抗体高生産を含む望ましい特性及び更に下記で論じる望ましい抗体特性を得るためにスクリーニングされる。ハイブリドーマは、インビボの同系動物、免疫系を欠く動物において、例えばヌードマウスにおいて、又はインビトロの細胞培養において、増殖させることができる。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、そして増殖させる方法は当業者によく知られている。
1つの実施態様では、免疫動物はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり、そして脾臓B細胞は非ヒト動物と同じ種由来の骨髄腫細胞系に融合される。より好ましい実施態様では、免疫動物はKirin TCマウスTMのマウスであり、また骨髄腫細胞系は非分泌マウス骨髄腫である。更になお好ましい実施態様では、骨髄腫細胞系は、Sp2/0−Ag14(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)CRL−1581)であり、そしてマウスハイブリドーマ細胞系は、1376.3.2d1.A3.D12.(ATCC No.PTA−6928)、1376.3.1A9.A6.B9(ATCC No.PTA−6929)又は1376.2.14G9.B8.B4.(ATCC No.PTA−6927)である。例えば、実施例1を参照されたい。
従って、1つの実施態様では、本発明は、(a)本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物をCD44、CD44の一部分又はCD44を発現する細胞若しくは組織で免疫すること;(b)トランスジェニック動物にCD44に対する免疫応答の組み込みを可能にすること;(c)トランスジェニック動物から抗体産生細胞を単離すること;(d)抗体産生細胞を不死化すること;(e)不死化抗体産生細胞の個々のモノクローナル集団を作出すること;及び(f)CD44に対する抗体を同定する不死化抗体産生細胞をスクリーニングすること:を含む、CD44に対するヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を産生する細胞系を生産する方法を提供する。1つの実施態様では、工程(f)は、CD44のHA結合部位に向けられた、そして場合により、CD44のHA結合部位の外で結合しない、抗体を同定する不死化抗体産生細胞をスクリーニングすることを含む。
CD44のHA結合部位に向けられた抗体を同定する、不死化抗体産生細胞をスクリーニングすることは、細胞により産生する抗体がCD44のHA結合部位のアミノ酸配列を含むペプチドに結合するか否かを試験することによって達成することができる。
別の側面では、本発明は、ヒト抗CD44抗体を産生するハイブリドーマを提供する。1つの実施態様では、ハイブリドーマにより産生するヒト抗CD44抗体は、CD44のアンタゴニストである。尚別の実施態様では、ハイブリドーマにより産生されるヒト抗CD44抗体は、(i)CD44のHA結合部位に結合し;(ii)HA結合部位の外では結合せず;(iii)IM7結合部位には結合しないか;又は(iv)その組み合わせに結合しない。Mikecz et al., (1999), Arthritis Rheumatism 42: 659, 668, Zheng (1995), J. Cell Biol. 130: 485-495, Peach et al., (1993), J. Cell Biol. 122: 257-264及び米国特許第6001356号。1つの実施態様では、ハイブリドーマは上記のようにマウスのハイブリドーマである。他の実施態様では、ハイブリドーマは他の動物で産生される。
本発明の1つの実施態様では、抗体産生細胞は、単離され、宿主細胞、例えば骨髄腫細胞中で発現される。尚別の実施態様では、トランスジェニック動物はCD44で免疫され、初代細胞(例えば、脾臓又は末梢血液細胞)は免疫トランスジェニック動物から単離され、そして所望の抗原に特異的な抗体を産生する個々の細胞が同定される。各個別の細胞由来のポリアデニル化mRNAが単離され、そして逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)が、可変領域配列にアニールするセンスプライマー、例えばヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のFR1領域の大部分又は全部を認識する縮重プライマー、及び定常及び連結領域配列にアニールするアンチセンスプライマーを用いて行なわれる。次いで、重鎖及び軽鎖可変ドメインのcDNAがクローニングされ、重鎖及びκ又はλ定常ドメインなどのそれぞれの免疫グロブリン定常領域を持つキメラ抗体として、いずれかの好適な宿主細胞、例えば骨髄腫細胞で発現させる。Babcook, J.S. et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48を参照されたい。次いで、抗CD44抗体は、本明細書に記載のように同定され単離される。
抗体を生産する組換え法
本発明の抗体、又は抗体結合部分は、宿主細胞での免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現により作製することができる。例えば、抗体を組換え技術で発現させるために、軽鎖及び重鎖が宿主細胞に発現するように、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするDNAフラグメントを持つ、1つ又はそれ以上の組換え発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、そして好ましくは宿主細胞を培養した培地においてそれを分泌させ、その培地から抗体を回収することができる。標準的な組換えDNA法は、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を得るために、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込むために、そしてベクターを、Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)「分子クローニング;実験室マニュアル、第二版(Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition)」、Ausubel, F. M. et al. (eds.) , Greene Publishing Associates, (1989),「分子生物学における最近のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」及び米国特許第4816397号に記載のものなどの宿主細胞に導入するために使用される。
本発明の抗体、又は抗体結合部分は、宿主細胞での免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現により作製することができる。例えば、抗体を組換え技術で発現させるために、軽鎖及び重鎖が宿主細胞に発現するように、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするDNAフラグメントを持つ、1つ又はそれ以上の組換え発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、そして好ましくは宿主細胞を培養した培地においてそれを分泌させ、その培地から抗体を回収することができる。標準的な組換えDNA法は、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を得るために、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込むために、そしてベクターを、Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)「分子クローニング;実験室マニュアル、第二版(Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition)」、Ausubel, F. M. et al. (eds.) , Greene Publishing Associates, (1989),「分子生物学における最近のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」及び米国特許第4816397号に記載のものなどの宿主細胞に導入するために使用される。
変異及び修飾
本発明のCD44抗体を発現させるため、先ずVH及びVL領域をコードするDNAフラグメントを、上記のいずれかの方法を用いて得ることができる。また、種々の修飾、例えば突然変異、欠失及び/又は付加を、当業者によく知られた標準的な方法を用いてDNA配列に導入することができる。例えば、突然変異誘発は、PCR介在性突然変異誘発などの標準的な方法を用いて行なわれ、この場合、変異ヌクレオチドは、PCR産物が所望の突然変異又は部位特異的突然変異誘発を含むように、PCRプライマーに組み込まれる。
本発明のCD44抗体を発現させるため、先ずVH及びVL領域をコードするDNAフラグメントを、上記のいずれかの方法を用いて得ることができる。また、種々の修飾、例えば突然変異、欠失及び/又は付加を、当業者によく知られた標準的な方法を用いてDNA配列に導入することができる。例えば、突然変異誘発は、PCR介在性突然変異誘発などの標準的な方法を用いて行なわれ、この場合、変異ヌクレオチドは、PCR産物が所望の突然変異又は部位特異的突然変異誘発を含むように、PCRプライマーに組み込まれる。
行なわれる可能性のある置換の1つのタイプは、例えば限定されないが、アラニン又はセリンなどの別の残基に対して化学的に反応性の高い、抗体内の1つ又はそれ以上のシステインを変えることである。例えば、非カノニカルシステインの置換があり得る。この置換は、可変ドメインのCDR若しくはフレームワーク領域内、又は抗体の定常ドメイン内でさせることができる。幾つかの実施態様では、システインはカノニカルである。
抗体は、例えば重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメインにおいて、例えば抗体の結合特性を変えるために修飾することもできる。例えば、突然変異は、CD44に対する抗体のKDを増加させ又は減少させるために、koffを増加させ若しくは減少させるために、又は抗体の結合特性を変えるために、1つ又はそれ以上のCDR領域において行なわせることができる。部位特異的突然変異誘発の技術は、業界でよく知られている。例えば、上記のSambrook et al. 及び Ausubel et al.,を参照されたい。
突然変異の修飾は、CD44の半減期を増加させるために、フレームワーク領域又は定常ドメインにて行なうことができる。例えば、PCT国際公開第00/09560号を参照されたい。フレームワーク領域又は定常ドメインの突然変異も、抗体の変異原性を変えるため、別の分子に対する共有結合又は非共有結合の部位を与えるため、又は相補体結合(complement fixation)、FcR結合及び抗体依存性媒介細胞傷害(ADCC)などの特性を変えるために行うことができる。本発明によれば、単一抗体は、可変ドメイン又は定常ドメインのCDR又はフレームワーク領域のいずれか1つに突然変異を有してもよい。
「生殖細胞系化(germlining)」として知られる方法において、VH及びVL配列における特定のアミノ酸は、生殖細胞系のVH及びVL配列に元々見出されるものにマッチさせるように突然変異させ得る。特に、VH及びVL配列におけるフレームワーク領域のアミノ酸配列は、抗体を投与する場合に、免疫原性のリスクを下げるために、生殖細胞系配列を一致させるように突然変異させ得る。ヒトVH及びVL遺伝子の生殖細胞系DNA配列は業界で公知である。例えば、「Vbase」ヒト生殖細胞系配列データベースを参照されたい。また、Kabat, E. A., et al. (1991), Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242「免疫学関連のタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」; Tomlinson et al., (1992), J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cox et al., (1994), Eur. J. Immunol. 24: 827-836を参照されたい。
実施できる別なタイプのアミノ酸置換は、抗体の潜在的タンパク質分解部位を除去することである。そのような部位は、可変ドメインのCDR若しくはフレームワーク領域又は抗体の定常ドメインである。システイン残基の置換及びタンパク質分解部位の除去は抗体産物において異種性のリスクを低下でき、その結果、その同種性を増加させる。別なタイプのアミノ酸置換は、潜在的な脱アミド化部位を形成するアスパラギン−グリシン対を、残基の1つ又は両方を変えることにより除去することである。別の実施態様では、本発明のCD44抗体の重鎖のC末端リジンが切断し得る。本発明の種々の実施態様では、CD44抗体の重鎖及び軽鎖は、場合によりシグナル配列を含んでもよい。
本発明のVH及びVLセグメントをコードするDNAフラグメントが得られると、これらのDNAフラグメントは更に標準的な組換えDNA法により操作され、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子に、Fabフラグメント遺伝子に、又はscFv遺伝子に変換することができる。これらの操作において、VL−又はVHコード化DNAフラグメントは、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーなど別のタンパク質をコードする別のDNAフラグメントに機能可能に連結される。この関連で使用される「機能可能に連結した」の用語は、2つのDNAフラグメントが、2つのDNAフラグメントによりコードされるアミノ酸配列が、フレームに残るように連結されることを意味するものとする。
VH領域をコードする単離されたDNAは、VHコード化DNAを重鎖定常領域(CH1、CH2及びCH3)をコードする別のDNA分子に操作可能に連結することにより、完全長重鎖遺伝子に変換し得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、業界で公知であり(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991), Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、「免疫学関連のタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」を参照されたい)、そしてこれらの領域を包含するDNAフラグメントは標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD定常領域であるが、最も好ましくはIgG1又はIgG2定常領域である。IgG1定常領域配列は、Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)、及びGm(17)など、異なる個体間に生じることが知られる種々のアレル又はアロタイプのいずれかであり得る。これらのアロタイプは、IgG1定常領域において天然アミノ酸置換を呈する。Fabフラグメント重鎖遺伝子では、VHコード化DNAは、重鎖CH1定常領域だけをコードする別のDNA分子に機能可能に連結することができる。CH1重鎖定常領域は、いずれの重鎖遺伝子に由来してもよい。
VL領域をコードする単離されたDNAは、VLコード化DNAを軽鎖定常領域、CLをコードする別のDNA分子に機能可能に連結して、完全長軽鎖遺伝子(並びにFab軽鎖遺伝子)に変換し得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、業界で公知であり(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991), Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242「免疫学関連のタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」を参照されたい)、そしてこの領域を包含するDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得る。カッパ定常領域は、Inv(1)、Inv(2)、及びInv(3)などの異なる個体に生じることが知られる種々のアレルのいずれかであり得る。ラムダ定常領域は3つのラムダ遺伝子のうちいずれの由来であってもよい。
scFv遺伝子を作出するために、VH−及びVL−コード化DNAフラグメントは、フレキシブルリンカーをコードする、例えばVH及びVL配列が、フレキシブルリンカーで連結されるVL及びVH領域で、連続した単鎖タンパク質として発現し得るようにアミノ酸配列(Gly4−Ser)3をコードする、別のフラグメントに機能可能に連結される(例えば、Bird et al., (1988), Science 242: 423 426, Huston et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, McCafferty et al., (1990), Nature 348: 552-554を参照されたい)。単鎖抗体は、単一VH及びVLのみが使用される場合は一価であり、2つのVH及びVLが使用される場合は二価であり、又は2つ以上のVH及びVLが使用される場合は多価であり得る。CD44及び別の分子に特異的に結合する二重特異性抗体及び多価抗体が生成され得る。
別の実施態様では、別のポリペプチドに連結される本発明のCD44抗体の全部又は一部を含む融合抗体、又はイムノアドヘシンを作製することができる。別の実施態様では、CD44抗体の可変ドメインだけがポリペプチドに連結される。別の実施態様では、CD44抗体のVHドメインは第1ポリペプチドに連結されるが、一方でCD44抗体のVLドメインは、VH及びVLドメインが抗原結合部位を形成するために互いに相互作用できるような様式で、第1ポリペプチドと結合する第2ポリペプチドに連結される。別の好ましい実施態様では、VHドメインは、VH及びVLドメインが互いに相互作用できるように、リンカーによりVLドメインから単離される。VH−リンカー−VL抗体は、次いで関係するポリペプチドに連結される。加えて、2つ(又はそれ以上の)単鎖抗体が互いに連結された融合抗体が作出できる。これは、単一ポリペプチド鎖に二価又は多価の抗体を作出したい場合、又は二重特異性抗体を作出したい場合に有用である。
他の実施態様では、他の修飾抗体が核酸分子をコードするCD44抗体を用いて作製し得る。例えば、「カッパ抗体」(Ill et al., (1997), Protein Eng. 10: 949-57)、「ミニ抗体」(Martin et al., (1994), EMBO J. 13: 5303-9)、「二重特異性抗体」(Holliger P. et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 6448)、又は「ジヤヌシン」(Traunecker et al., (1991), EMBO J. 10: 3655-3659及び Traunecker et al., (1992) Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52)は、明細書の教示に従って標準的な分子生物学的技術を用いて作製することができる。
本発明の二重特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマの融合又はFab’フラグメントの結合を含む様々な方法によって生産することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, (1990), Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321及びKostelny et al., (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553を参照されたい。加えて、二重特異性抗体は、「二重特異性抗体」又は「ジヤヌシン」として形成することができる。幾つかの実施態様では、二重特異性抗体はCD44の2つの異なるエピトープに結合する。幾つかの実施態様では、上記の修飾抗体は、本明細書において与えられるヒトCD44から、1つ又はそれ以上の可変ドメイン又はCDR領域を用いて調製される。
ベクター及び宿主細胞
本発明の抗体及び抗原結合部分を発現させるために、本明細書に記載のように得られる部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするDNAが、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に機能可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。これに関連して、「機能可能に連結」の用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するそれらの意図した機能の役割を果たすように、ベクターにライゲートされることを意味するものとする。発現ベクター及び発現調節配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択される。発現ベクターとしては、例えばプラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、YAC、EBV由来エピソームを含む。抗体遺伝子は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するそれらの意図した機能の役割を果たすように、ベクターにライゲートされる。発現ベクター及び発現調節配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができる。好ましい実施態様では、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は標準方法により発現ベクターに挿入される(例えば、抗体遺伝子フラグメント及びベクターでの相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合の平滑末端ライゲーション)。
本発明の抗体及び抗原結合部分を発現させるために、本明細書に記載のように得られる部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするDNAが、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に機能可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。これに関連して、「機能可能に連結」の用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するそれらの意図した機能の役割を果たすように、ベクターにライゲートされることを意味するものとする。発現ベクター及び発現調節配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択される。発現ベクターとしては、例えばプラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、YAC、EBV由来エピソームを含む。抗体遺伝子は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するそれらの意図した機能の役割を果たすように、ベクターにライゲートされる。発現ベクター及び発現調節配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができる。好ましい実施態様では、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は標準方法により発現ベクターに挿入される(例えば、抗体遺伝子フラグメント及びベクターでの相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合の平滑末端ライゲーション)。
好都合なベクターは、VH又はVL配列のいずれかが上記のように容易に挿入されて発現できるように操作された適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトCH又はCL免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、挿入J領域のスプライスドナー部位とヒトC領域に先立つスプライスアクセプター部位間で、スプライシングが通常生じ、そしてまた、ヒトCHエキソン内に起こるスプライス領域でも生じる。ポリアデニル化及び転写終結は、コーディング領域の自然の染色体部位下流で起こる。組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進する、シグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームで免疫グロブリン鎖のアミノ末端に連結されるように、ベクターにクローニングされる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種のシグナルペプチド(即ち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であってもよい。
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞の抗体鎖遺伝子の発現を調節する調節配列を有する。当業者には当然のことながら、調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存する可能性がある。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列としては、レトロウイルスLTR、サイトメガロウイルス(CMV)(CMVプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)(SV40プロモーター又はエンハンサーなど)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、ポリオーマ及び自然免疫グロブリンなどの強力哺乳類プロモーター並びにアクチンプロモーターなどの、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメントを含む。ウイルス調節エレメント、及びその配列の更なる記載については、例えば米国特許第5168062号、米国特許第4510245号及び米国特許第4968615号を参照されたい。プロモーター及びベクターの記述を含み、植物における抗体発現方法、並びに植物の形質転換は、業界で公知である。例えば、米国特許第6517529号を参照されたい。細菌細胞又は真菌細胞、例えば、酵母細胞におけるポリペプチドの発現方法も、業界では周知である。
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞(例えば、複製の起源)におけるベクターの複製及び選択マーカー遺伝子を調節する配列などの更なる配列を有してもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする(例えば、米国特許第4399216号、米国特許第4634665号及び米国特許第5179017号を参照)。例えば、一般的に選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞で、G418、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅によりdhfr宿主細胞で用いる)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(G418選択用)、及びグルタミン酸シンターゼ遺伝子を含む。
CD44抗体をコードする核酸分子及びこれらの核酸分子を含むベクターは、適切な哺乳類、植物、細菌又は酵母宿主細胞のトランスフェクションに使用することができる。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する、いずれの公知の方法によっても行うことができる。異種ポリヌクレオチドの哺乳類細胞への導入方法は業界でよく知られており、またデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、及び核へのDNAの直接マイクロインジェクションを含む。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターにより哺乳類細胞に導入してもよい。細胞の形質転換方法は業界でよく知られている。例えば、米国特許第4399216号、米国特許第4912040号、米国特許第4740461号及び米国特許第4959455号を参照されたい。植物細胞の形質転換方法は業界でよく知られており、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、直接注入、エレクトロポレーション及びウイルス形質転換を含む。細菌及び酵母細胞の形質転換方法も業界でよく知られている。
発現用宿主として利用できる哺乳類細胞は業界で周知であり、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手できる多くの不死化細胞系を含む。これらには、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO細胞、SP2細胞、HEK−293T細胞、NIH−3T3細胞、HeLa細胞、子ハムスター腎臓(BHK)細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞がん細胞(例えば、Hep G2)、A549細胞、及び多数の他の細胞系が含まれる。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するかを決定することにより選択される。使用される他の細胞としては、Sf9又はSf21細胞などの昆虫細胞系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入する場合、宿主細胞に抗体を発現するのに十分な一定期間宿主細胞を培養することにより、又はより好ましくは宿主細胞が増殖する培地への抗体の分泌により、抗体が生産される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収できる。植物宿主細胞は、例えばタバコ、Arabidopsis属、アオウキクサ、トウモロコシ、小麦、ジャガイモなどを含む。細菌宿主細胞は、大腸菌及びストレプトミセス属を含む。酵母宿主細胞は、シゾサッカロミセス・ポンべ、サッカロミセス・セレビジエ及びピチア・パストリスを含む。
更に、生産細胞系からの本発明の抗体の発現は、多くの公知技術を用いて促進される。例えば、グルタミンシンターゼ(GS系)及びDHFR遺伝子発現系は、特定の条件下に発現を促進する一般的なアプローチである。高発現細胞クローンは、限定希釈クローニング及びMicrodrop法などの従来技術を用いて同定することができる。GS系は、欧州特許第0216846号、欧州特許第0256055号、欧州特許第0323997号及び欧州特許第0338841号で論じられている。
異なる細胞系に又はトランスジェニック動物に発現する抗体は、互いに異なるグリコシル化を有するようである。しかしながら、本明細書で与えられる核酸分子によってコードされ、又は本明細書で与えられるアミノ酸を含む、抗体は、全て抗体のグリコシル化とは無関係に本発明の一部である。
ファージ・ディスプレイ・ライブラリー
本発明は、ファージ上のヒト抗体のライブラリーを合成し、CD44又はその一部でライブラリーをスクリーニングし、CD44に結合するファージを単離し、そしてファージから抗体を取得する工程を含む、抗CD44抗体又はその抗原結合部分を生産する方法を提供する。例証として、ファージディスプレイ法で使用するための、抗体ライブラリーを作成する1つの方法は、免疫応答を誘導するために、CD44又はその抗原部分を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を免疫し、免疫動物から抗体産生細胞を抽出し、抽出細胞から本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードするRNAを単離し、cDNAを産生するRNAを逆転写し、プライマーを用いてcDNAを増幅し、そして抗体がファージに発現するようにファージ・ディスプレイ・ベクターにcDNAを挿入する工程を含む。本発明の組換え抗CD44抗体は、このような方法で得ることができる。
本発明は、ファージ上のヒト抗体のライブラリーを合成し、CD44又はその一部でライブラリーをスクリーニングし、CD44に結合するファージを単離し、そしてファージから抗体を取得する工程を含む、抗CD44抗体又はその抗原結合部分を生産する方法を提供する。例証として、ファージディスプレイ法で使用するための、抗体ライブラリーを作成する1つの方法は、免疫応答を誘導するために、CD44又はその抗原部分を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を免疫し、免疫動物から抗体産生細胞を抽出し、抽出細胞から本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードするRNAを単離し、cDNAを産生するRNAを逆転写し、プライマーを用いてcDNAを増幅し、そして抗体がファージに発現するようにファージ・ディスプレイ・ベクターにcDNAを挿入する工程を含む。本発明の組換え抗CD44抗体は、このような方法で得ることができる。
本発明の組換え抗CD44抗体は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより単離できる。好ましくは、このライブラリーは、scFvファージ・ディスプレイ・ライブラリーであり、B細胞より単離されたmRNAから調製したヒトVL及びVHcDNAを用いて生成される。そのようなライブラリーを作成しスクリーニングする方法は、業界で公知である。ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを生成させるキットは、市販されている(例えば、Pharmacia組換えファージ抗体システム、カタログ番号27−9400−01;及びStratagene SurfZAP(登録商標)ファージ・ディスプレイ・キット、カタログ番号240612)。また、抗体ディスプレイライブラリーを生成させスクリーニングするのに使用することができる他の方法及び試薬もある(例えば、米国特許第5223409号、PCT国際公開第92/18619号、同国際公開第91/17271号、同国際公開第92/20791号、同国際公開第92/15679号、同国際公開第93/01288号、同国際公開第92/01047号、及び同国際公開第92/09690号; Fuchs et al., (1991), Bio/Technology 9: 1370 1372; Hay et al., (1992), Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81 85; Huse et al., (1989), Science 246: 1275 1281; McCafferty et al., (1990), Nature 348: 552 554; Griffiths et al., (1993), EMBO J. 12:725 734; Hawkins et al., (1992), J. Mol. Biol. 226: 889 896; Clackson et al., (1991), Nature 352: 624 628; Gram et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576 3580; Garrad et al., (1991), Bio/Technology 9: 1373 1377; Hoogenboom et al., (1991), Nuc. Acid Res. 19: 4133 4137; and Barbas et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978 7982を参照されたい)。
所望の特性を有するヒト抗CD44抗体を単離させ生産する1つの実施態様では、最初に本明細書に記載のヒト抗CD44抗体を、PCT国際公開第93/06213号に記載のエピトープインプリンティング法を用いて、CD44に対して類似の結合活性を有するヒト重鎖及び軽鎖配列を選択するために使用する。本方法で使用される抗体ライブラリーは、好ましくはPCT国際公開第92/01047号、McCafferty et al., Nature 348: 552 554 (1990); and Griffiths et al., EMBO J. 12: 725 734 (1993)に記載のように調製され、スクリーニングされたscFvライブラリーである。このscFv抗体ライブラリーは、抗原としてヒトCCR2を用いて好適にスクリーニングされる。
一旦、最初のヒトVL及びVHドメインが選択されれば、「ミックス及びマッチ」実験が行なわれ、ここでは最初に選択されたVL及びVHセグメントの異なる対が、好ましいVL/VH対組合せを選択するCD44結合についてスクリーニングされる。加えて、抗体の質を更に改善するために、好ましいVL/VH対のVL及びVHセグメントが、ランダムに、好ましくはVH及び/又はVLのCDR3領域内で、自然免疫応答の間の抗体の親和性成熟に関与するインビボ体細胞突然変異プロセスに類似の方法で変異される。このインビトロ親和性成熟は、それぞれVHCDR3又はVLのCDR3に相補性のPCRプライマーを用いて、VH及びVLドメインを増幅することにより達成し得るが、このプライマーは、得られるPCR産物がランダム変異をVH及び/又はVLのCDR3領域へ導入するVH及びVLセグメントをコードするように、特定の位置で4つのヌクレオチド塩基のランダム混合物で「スパイク」されている。これらのランダム変異VH及びVLセグメントが、CD44への結合のためにスクリーニングされる。
組換え免疫グロブリン・ディスプレイ・ライブラリーからの本発明の抗CD44抗体のスクリーニング及び単離の後、選択された抗体をコードする核酸は、ディスプレイパッケージから(例えば、ファージゲノムから)回収され、そして標準的な組換えDNA法により他の発現ベクターへサブクローニングされる。所望により、核酸は、下記のように、本発明の他の抗体型を作出するために更に操作できる。組合せライブラリーのスクリーニングにより単離された組換えヒト抗体を発現させるために、抗体をコードするDNAは、上記のように、組換え発現ベクター中にクローニングされ、そして哺乳類宿主細胞へ導入される。
脱免疫化抗体
本発明の別の態様では、抗体又はその抗原結合部分は、例えば、PCT国際公開第98/52976号及び同国際公開第00/34317号に記載の方法を用いて、それらの免疫原性を低減するために、脱免疫化することができる。
本発明の別の態様では、抗体又はその抗原結合部分は、例えば、PCT国際公開第98/52976号及び同国際公開第00/34317号に記載の方法を用いて、それらの免疫原性を低減するために、脱免疫化することができる。
誘導化及び標識抗体
本発明の抗CD44抗体又は抗原結合部分は、別の分子(例えば、別のペプチド又はタンパク質)に誘導化し又は連結し得る。一般的に、CD44結合が誘導化又は標識化により悪影響を受けないように、抗体又はその抗原結合部分は誘導化される。従って、本発明の抗体又は抗原結合部分は、本明細書に記載のヒトCD44抗体のインタクトの及び修飾型の両方を含むものとする。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分は、別の分子(例えば、二重特異性抗体又は二重特異抗体)、検出試薬、標識、細胞毒性剤、薬剤、抗体又は抗原結合部分と、別の分子(ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど)との結合を媒介できるタンパク質又はペプチド及び/又は輸送タンパク質(例えば、血液タンパク質、アルブミン又はトランスフェリン)などの、1つ又はそれ以上の他の分子的実体に機能的に連結(化学的結合、遺伝子融合、非共有結合などにより)し得る。
本発明の抗CD44抗体又は抗原結合部分は、別の分子(例えば、別のペプチド又はタンパク質)に誘導化し又は連結し得る。一般的に、CD44結合が誘導化又は標識化により悪影響を受けないように、抗体又はその抗原結合部分は誘導化される。従って、本発明の抗体又は抗原結合部分は、本明細書に記載のヒトCD44抗体のインタクトの及び修飾型の両方を含むものとする。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分は、別の分子(例えば、二重特異性抗体又は二重特異抗体)、検出試薬、標識、細胞毒性剤、薬剤、抗体又は抗原結合部分と、別の分子(ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど)との結合を媒介できるタンパク質又はペプチド及び/又は輸送タンパク質(例えば、血液タンパク質、アルブミン又はトランスフェリン)などの、1つ又はそれ以上の他の分子的実体に機能的に連結(化学的結合、遺伝子融合、非共有結合などにより)し得る。
誘導化抗体の1つのタイプは、2つ又はそれ以上の抗体(同じタイプ又は異なるタイプ、例えば、二重特異性抗体を作出するため)を架橋結合することにより生産される。好適な架橋剤は、適切なスペーサーで隔てられた2つの際立って反応性の高い基(例えば、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)を有する、ヘテロ二官能性又はホモ二官能性(例えば、ジスクシンイミジルスベラート)のものを含む。そのようなリンカーは、Pierce Chemical Company, Rockford, ILから市販されている。
誘導化抗体の別のタイプは標識抗体である。本発明の抗体又は抗原結合部分が誘導化され得る有用な検出試薬は、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5−ジメチルアミン−1−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体を含む、蛍光化合物を含む。抗体は、また、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなど検出に有用な酵素で標識し得る。抗体を検出酵素で標識する場合、抗体は、酵素が使用して識別できる反応生成物を生産する追加の試薬を加えることにより検出される。例えば、試薬のセイヨウワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加は、検出可能な着色反応生成物を生成させる。抗体は、またビオチンで標識可能であり、そしてアビジン又はストレプトアビジン結合の間接測定を介して検出される。抗体は、また、二次レポーター(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)で認識される所定のポリペプチドエピトープで標識可能である。幾つかの実施態様では、標識は、潜在的な立体障害を小さくするために、種々の長さのスペーサーアームによって結合される。CD44抗体は、また、ポリエチレングリコール(PEG)、メチル基若しくはエチル基、又はカルボキシル基などの化学基により誘導化し得る。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善する、例えば血清半減期を増加させるのに有用である。
薬剤組成物及び投与
本発明は、また、異常細胞浸潤の治療に有効な本明細書に記載のCD44抗体又はその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体の有効量を含む、ヒトを含む哺乳類における異常細胞浸潤の治療のための薬剤組成物を提供する。好ましい組成物は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、肉芽種性疾患、多発性硬化症、喘息、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬及びがんなどの、1つ又はそれ以上の様々な炎症性及び自己免疫疾患を有する患者に、治療上の利益を提供する。
本発明は、また、異常細胞浸潤の治療に有効な本明細書に記載のCD44抗体又はその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体の有効量を含む、ヒトを含む哺乳類における異常細胞浸潤の治療のための薬剤組成物を提供する。好ましい組成物は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、肉芽種性疾患、多発性硬化症、喘息、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬及びがんなどの、1つ又はそれ以上の様々な炎症性及び自己免疫疾患を有する患者に、治療上の利益を提供する。
本発明の抗体又は抗原結合部分は、例えばPCT国際公開第2006/096488号及びその引用文献に記載の、対象(subject)への投与に適する薬剤組成物に組み込むことができる。通常は、薬剤組成物は、本発明の抗体又は抗原結合部分、並びにタンパク質安定性、溶解性及び生物活性を維持するのに適する、薬学的に許容される担体を含む。本明細書に使用される、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶剤、分散媒体、被覆剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、及び生理的適合性のその他のものを意味する。薬学的に許容される担体の幾つかの例は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、並びにその組合せである。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを含むのが好ましい。薬学的に許容される物質の更なる例は、湿潤剤、又は湿潤剤又は乳化剤などの微量の補助物質、保存剤、アミノ酸を含む緩衝剤、及びキレート剤、例えばEDTA、DTPA、DFM及びその混合物であり、それらは抗体の貯蔵期限又は有効性を増強する。1つの実施態様では、薬剤組成物は、IgG、好ましくはIgG1又はIgG2、モノクローナル抗体及び薬学的に許容されるキレート剤を含む。抗体の代表的なモル濃度は、約0.0006ミリモルから約1.35ミリモルまでの範囲であり、キレート剤のモル濃度は、約0.003ミリモルから約50ミリモルまでの範囲であり、そしてキレート剤に対する抗体のモル比は、約0.00001から約2000までの範囲である。
本発明の組成物は、様々な形態、例えば液剤(例えば、注射用及び注入用液剤)、分散剤又は懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム及び坐剤などの、液体、半固体及び固体の投与形態であってもよい。好ましい形態は意図した投与方法及び治療適応によって決まる。典型的な好ましい組成物は、ヒトの受動免疫に使用されるものと類似の組成物のような、注射用及び注入用液剤の形態である。好ましい投与方法は非経口(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。好ましい実施態様において、抗体は静脈内注入又は静脈内注射によって投与される。別の好ましい実施態様では、筋肉内又は皮下注射によって投与される。注射用製剤は単位投与形態、例えば保存剤の添加有り又は無しで、アンプル又は反復投与容器中に存在し得る。組成物は、懸濁剤、液剤、又は油性又は水性ビヒクル中の乳剤のような形態をとり、また懸濁化剤、安定剤及び/又は分散剤などの製剤化物質を含んでもよい。あるいは、活性成分は、使用前に、例えば、滅菌パイロジェンフリー水のような適切な賦形剤で構成される、粉末形態であってよい。
治療用組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で、無菌でかつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高い薬物濃度に適した他の規定の構造として製剤化することができる。無菌の注射用液剤は、適切な溶媒中上に列挙した1つの又は組み合わせた成分と共に、必要量のCD44抗体を組込み、必要ならば続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散剤は、基本分散媒及び上に列挙したものの内の必要な他の成分を含有する無菌のビヒクルに、活性化合物を組込むことにより調製される。無菌の注射用液剤の調製用の無菌の散剤の場合では、好ましい調製方法は、活性成分プラス任意の所望の追加成分の粉末を、あらかじめ滅菌濾過したそれらの溶液から与える、減圧乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には所要の粒径の維持により、また界面活性剤の使用により維持し得る。注射用組成物の持続した吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸及びゼラチンを入れることにより、もたらすことができる。
本発明の抗体又は抗原結合部分は、業界で公知の様々な方法によって投与することができるが、多くの治療適用にとって、好ましい投与経路/投与方法は、皮下、筋肉内、又は静脈内注入である。当業者には当然のことながら、投与経路/投与方法は、所望する結果によって変わる可能性がある。
特定の実施態様では、本発明の抗体組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセルデリバリーシステムを含む制御放出製剤などの、抗体を急速な放出から保護する担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性高分子が使用できる。そのような製剤の多数の調製方法は、一般的に当業者に公知である。例えば、J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978の「持続及び制御放出ドラッグデリバリーシステム(Sustained and Controlled Release Drug Delivery System)」を参照されたい。
追加の活性化合物も、また、組成物に組込むことができる。特定の実施態様では、本発明の阻害性CD44抗体が、1つ又はそれ以上の追加の治療薬と共に共製剤化(co−formulated)及び/又は共投与(co−administered)される。これらの薬剤は、他の標的に結合する抗体、抗がん剤、抗血管新生薬、情報伝達阻害剤、抗増殖剤、化学療法剤、又はCD44を阻害するペプチドアナログを含むが、これらに限定されない。そのような併用療法は、阻害性CD44抗体並びに共投与薬剤をより低い用量でしか必要とせず、このようにして、種々の単剤療法に伴う毒性又は合併症の可能性を回避し得る。
本化合物は、限定されないが、シクロスポリン、ゾレドロン酸、エファリズマブ、アレファセプト、エトドラク、ロルノキシカム、OM−89、バルデコキシブ、トシリズマブ、アバタセプト、メロキシカム、エタネルセプト、ナンブメトン(nambumetone)、リメキソロン、153Sm−EDTMP、プロソルバ、イミダゾールサリチラート、オプレルベキン、ヒアルロン酸、ナプロキセン、ピロキシカム、ジアセレイン、ルメリコキシブ、ロフェコキシブタクロリムス、アセクロフェナク、アクタリット、テノキシカム、ロシグリタゾン、デフラザコート、アダリムマブ、レフルノミド、リセドロン酸ナトリウム、ミソプロストール及びジクロフェナク、SK−1306X、インフリキシマブ、アナキンラ、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトリコキシブ及びフェルビナク、ロイマコン(reumacon)、ゴリムマブ、デノスマブ、オファツムマブ、10rT1抗体、ペルビプロフェン、リコフェロン、テムシロリムス、エクリズマブ、イグラチモド、酢酸メチルプレドニゾロン、イブプロフェン、トリアムシノロンアセトニド、ナブメトン、オキサプロジン、オキシコドンhcl、フェンタニル、スリンダク、ピリドキシン、アセトアミノフェン、アレンドロネート、インドメタシン、グルコサミン、オロパタジン、オメプラゾール、アザチオプリン、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン及びプレドニゾンを含む、他の抗炎症剤又はDMARDSに加えて、共療法(co-therapy)(前治療、後治療又は同時治療)において、部分的に又は完全に使用され得る。他の抗炎症剤としては、480156S、AA861、AD1590、AFP802、AFP860、AI77B、AP504、AU8001、BPPC、BW540C、CHINOIN127、CN100、EB382、EL508、F1044、FK−506、GV3658、ITF182、KCNTEI6090、KME4、LA2851、MR714、MR897、MY309、ON03144、PR823、PV102、PV108、R830、RS2131、SCR152、SH440、SIR133、SPAS510、SQ27239、ST281、SY6001、TA60、TAI−901(4−ベンゾイル−1−インダンカルボン酸)、TVX2706、U60257UR23010及びWY41770、CP−481715、ABN−912、MLN−3897、HuMax−IL−15、RA−1、パクリタキセル、Org−37663、Org−39141、AED−9056、AMG−108、フォントリズマブ、ペグスネルセプト、プラルナカサン、アピリモド、GW−274150、AT−001、681323(GSK)K−832、R−1503、オクレリズマブ、DE−096、Cpn10、THC+CBD(GWpharma)、856553(GSK)、ReN−1869、免疫グロブリン、mm−093、アメルバント、SCIO−469、ABT−874、LenkoVAX、LY−2127399、TRU−015、KC−706、アモキサピネット及びジピリダモール、TAK−715、PG760564、VX−702、プレドニゾロン及びジピリダモール、PMX−53、べリムマブ、プリナベレル、CF−101、tgAAV−TNFR:Fc、R−788、プレドニゾロン及びSSRI、CP−690550及びPMI−001などの、会社コード番号で表わされる薬剤が挙げられる。
別の実施態様では、更なる治療薬として生物剤が含まれる。更なる実施態様では、1つ又はそれ以上の生物剤は、腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−α)アンタゴニスト、インターロイキン−1アルファ(IL−1α)アンタゴニスト、CD28アンタゴニスト及びCD20アンタゴニストから選択される。なお更なる実施態様では、エタネルセプト(ENBRELTM)、アダリムマブ(HUMIRATM)、インフリキシマブ(REMICADETM)、アナキンラ(KINERETTM)、アバタセプト(ORENCIATM)、リツキシマブ(RITUXANTM)及びセルトリズマブペゴール(certolizumab pegol)(CIMZIATM)から成る群から選択される。
関節リウマチ治療に、式(I)の化合物及びそれらの塩及び溶媒和物との併用で使用され得る他の薬学的に活性な薬剤の例としては:アムトルメチングアシル、ミゾリビン及びリメキソロンなどの免疫抑制剤;エタネルセプト、インフリキシマブ、ジアセレインなどの抗TNFアルファ剤;レフルノミドなどのチロシンキナーゼ阻害剤;スブレウム(subreum)などのカリクレインアンタゴニスト;オプレルベキンなどのインターロイキン11アゴニスト;インターフェロンベータ1アゴニスト;NRD−101(Aventis)などのヒアルロン酸アゴニスト;アナキンラなどのインターロイキン1受容体アンタゴニスト;アミプリロース塩酸塩などのCD8アンタゴニスト;ロイマコン(reumacon)などのベータアミロイド前駆タンパク質アンタゴニスト;シペマスタットなどのマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びメトトレキサート、スルファサラジン、シクロスポリンA、ヒドロキシクロロキン、アウラノフィン、アウロチオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム及ペニシラミンなど他の疾患修飾抗リウマチ薬(DMARD)が挙げられる。
本発明の組成物は、本発明の抗体又は抗原結合部分の「治療的有効量」又は「予防的有効量」を含むこともできる。「治療的有効量」は、所望の治療結果を達成するための、用量での及び必要な期間の有効量を示す。抗体又は抗原結合部分の治療的有効量は、病状、年齢、性別、及び個体の体重、及び個体の所望の反応を誘導する抗体又は抗原結合部分の能力などの因子により変動し得る。治療的有効量は、また、抗体又は抗原結合部分のいずれの毒性又は有害作用も、治療的に有益な効果を上回らないような量である。「予防的有効量」は、所望の予防結果を達成するための、用量での及び必要な期間の有効量を示す。一般的には、予防用量は、疾患に先立って又はその初期に対象に使用されることから、予防的有効量は、治療的有効量よりも小さくてもよい。
用法・用量は、最適所望反応(例えば、治療又は予防反応)を与えるために調整し得る。例えば、単回ボーラス投与が可能であり、時間をかけた数回分割用量投与が可能であり、そして治療状況の緊急性により適応があれば、用量は比例的に減少又は増加できる。投与の容易性及び用量の均一性のために、投与単位形態の非経口組成物を製剤化することは特に有益である。本明細書で使用される投与単位形態は、治療しようとする哺乳類の対象に対して単位投与として適した、物理的に不連続な単位を指す;各単位は、所望の薬剤担体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投与単位形態の規格は、(a)CD44抗体又はその抗原結合部分の類を見ない特徴及び達成すべき格別な治療又は予防効果、及びb)個体の感受性の治療にそのような抗体を調合する技術に固有の限界、により決定され、そしてそれらに直接依存している。
本発明の抗体又は抗体部分の治療的又は予防的有効量に対する、典型的で且つ非限定的な範囲は、0.025から50mg/kg、より好ましくは0.1から50mg/kg、より好ましくは0.1〜25、0.1から10、又は0.1から3mg/kgである。1つの実施態様では、本発明の抗体又は抗体部分は、約5.0から約6.5の範囲のpHを有し、そして約1mg/mlから約200mg/mlの抗体、例えば、約1ミリモルから約100ミリモルのヒスチジン、酢酸塩又はコハク酸塩緩衝液、約0.01mg/mlから約10mg/mlのポリソルベート80、約100ミリモルから約400ミリモルのトレハロース、そして約0.01ミリモルから約1.0ミリモルのEDTA二ナトリウム・水和物である。本発明の組成物は、場合により薬学的に許容される抗酸化剤及び/又はキレート剤を含んでもよい。好適な抗酸化剤は、メチオニン、チオ硫酸ナトリウム、カタラーゼ、及び白金を含むが、これに限定されない。例えば、組成物は、メチオニンを1mMから約100mMまで、特に約27mMの濃度で含んでもよい。用量は軽減すべき状態のタイプ及び重症度に応じて変動する可能性があることに留意すべきである。更に当然のことながら、いずれの特定の対象に対しても、特定の用法・用量は、個体の必要性、及び組成物を投与する人又は投与を管理監督する人の専門的判断に従って、時間をかけて調整すべきであり、そして本明細書に記載の用量範囲は典型的なものであり、特許請求された組成物の範囲又は実施を制限することを意図するものではない。
本発明の別の側面は、本発明のCD44抗体又は抗原結合部分を含むキット、又はそのような抗体又は抗原結合部分を含む組成物を提供する。キットは、抗体又は組成物に加えて、診断又は治療薬剤を含む。キットは、また、診断又は治療方法で用いる説明書も含む。好ましい実施態様では、キットは、抗体又はそれを含む組成物及び下記の方法に用いることができる診断用薬を含む。別の好ましい実施態様では、キットは、抗体又はそれを含む組成物及び下記の方法に用いることができる1つ又はそれ以上の治療薬を含む。
診断用使用法
別の側面では、本発明は、インビボ及びインビトロ診断法を提供する。抗CD44抗体は、インビボ又はインビトロでの生体試料におけるCD44を検出するために使用することができる。1つの実施態様では、本発明は、診断が必要な対象におけるCD44発現細胞の存在又は位置を診断する方法を提供し、その方法は対象に抗体を注射する工程を含み、抗体が結合する場所を特定することで、対象のCD44の発現を明らかにし、対象における発現を正常な参照対象又は基準と比較し、そして細胞の存在と位置を診断する。抗CD44抗体は、また組織中の単球及びT細胞などの炎症及び/又は免疫細胞の浸潤のマーカーとして使用してもよい。
別の側面では、本発明は、インビボ及びインビトロ診断法を提供する。抗CD44抗体は、インビボ又はインビトロでの生体試料におけるCD44を検出するために使用することができる。1つの実施態様では、本発明は、診断が必要な対象におけるCD44発現細胞の存在又は位置を診断する方法を提供し、その方法は対象に抗体を注射する工程を含み、抗体が結合する場所を特定することで、対象のCD44の発現を明らかにし、対象における発現を正常な参照対象又は基準と比較し、そして細胞の存在と位置を診断する。抗CD44抗体は、また組織中の単球及びT細胞などの炎症及び/又は免疫細胞の浸潤のマーカーとして使用してもよい。
抗CD44抗体は、制限なく、ELISA、RIA、フローサイトメトリー、組織の組織化学、ウェスタンブロット法又は免疫沈降を含む、従来の免疫測定に使用できる。本発明の抗CD44抗体は、ヒト由来のCD44を検出するのに使用できる。別の実施態様では、抗CD44抗体は、カニクイザル又はアカゲザル由来のCD44を検出するのに使用することができる。
本発明は、本発明の抗CD44抗体と生体試料との接触及び結合抗体の検出を含む、生体試料中のCD44を検出する方法を提供する。1つの実施態様では、抗CD44抗体は、検出可能な標識で直接標識される。別の実施態様では、抗CD44抗体(一次抗体)は標識されず、抗CD44抗体に結合できる二次抗体又は他の分子が標識される。当業者によく知られているように、特定の種及び二次抗体のクラスを特異的に結合できる二次抗体が選ばれる。例えば、抗CD44抗体がヒトIgGの場合は、二次抗体が抗ヒトIgGであってよい。抗体に結合できる他の分子は、これらに限定されないが、プロテインA及びプロテインGを含み、両方とも例えば、Pierce Chemical Companyから市販されている。
他の実施態様では、CD44は生体試料であり、検出物質で標識したCD44標準及び非標識抗CD44抗体を用いて、競合免疫アッセイにより分析し得る。本分析では、生体試料、標識CD44標準及び抗CD44抗体を組み合わせて、非標識抗体に結合した標識CD44標準の量を測定する。生体試料中のCD44の量は、抗CD44抗体に結合した標識CD44標準の量に反比例する。
多くの目的のための適用において、開示されている免疫測定法を使用することができる。例えば、抗CD44抗体は、培養細胞においてCD44を検出するのに使用することができる。1つの実施態様では、抗CD44抗体は、種々の化合物で処理した、細胞表面のCD44の量を測定するのに使用することができる。本方法は、CD44タンパク質レベルを調節する化合物を同定するのに使用することができる。本方法によれば、細胞の1つの試料は、別の試料が未処理で残っている間に、経時的に試験物質で処理される。全CD44発現を測定しようとする場合には、細胞を溶解し、全CD44発現は上記の免疫分析の1つを使用して測定される。処理対非処理細胞中の全CD44発現は、試験化合物の効果を測定するために比較される。
全CD44発現を測定する好ましい免疫測定法は、フローサイトメトリー又は免疫組織化学である。細胞表面のCD44発現を測定する場合、細胞は溶解されず、CD44の細胞表面レベルが上記免疫測定法の1つを用いて測定される。CD44の細胞表面レベルを測定する好ましい免疫測定法は、ビオチン又は125Iなどの検出レベルの細胞表面タンパク質を標識し、抗CD44抗体でCD44を免疫沈降させ、次いで標識CD44を検出する工程を含む。
CD44の局在性、例えば細胞表面レベルを測定する別の好ましい免疫測定法は、免疫組織化学を用いることによる。CD44の細胞表面レベルを検出する好ましい免疫測定法は、フルオレセイン又はフィコエリトリンなどの適切な蛍光プローブにより標識した抗CD44抗体の結合、及びフローサイトメトリーを用いる一次抗体の検出を含む。別の実施態様では、抗CD44抗体は非標識であり、また抗CD44抗体に結合できる二次抗体又は他の分子は標識される。ELISA、RIA、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法、組織化学、内在性膜タンパク質の細胞表面標識及び免疫沈降は、業界でよく知られている(例えば、上記のHarlow and Laneを参照されたい)。加えて、免疫測定法は、CD44の活性化か又は阻害かを多数の化合物で試験するために、ハイ・スループット・スクリーニングでスケールアップすることができる。
本発明の抗CD44抗体は、組織又は組織由来の細胞中のCD44レベルを測定するのに使用することができる。幾つかの実施態様では、組織は病変組織である。幾つかの実施態様では、組織は組織生検である。その方法の幾つかの実施態様では、組織又はその生検は患者から切除される。次いで組織又は生検は免疫測定法で使用され、例えば全CD44発現、CD44の細胞表面レベル又はCD44の局在性を、上記の方法により決定する。そのような方法は、組織が高レベルのCD44を発現するかどうかを明らかにするために使用でき、組織が抗CD44抗体による治療の標的であることを示すことができる。
本発明の抗体は、また、インビボでCD44を発現する組織及び器官を同定するのに使用することができる。幾つかの実施態様では、CD44発現細胞を同定するのに抗CD44抗体が使用される。本発明のヒト抗CD44抗体を用いる1つのメリットは、それらが、非ヒト起源の抗体又はヒト化若しくはキメラ抗体と違って、投与時に抗体への実質的免疫応答を引き出すことなく、インビボで安全に使用することができることである。
この方法は、検出可能な標識抗CD44抗体又はそれらを含む組成物を、そのような診断試験を必要とする患者に投与し、そしてCD44発現組織の位置を決める画像解析に患者をかける工程を含む。画像解析は、医療業界でよく知られており、そして限定されないが、X−線解析、磁気共鳴イメージング(MRI)又はコンピュータートモグラフィー(CT)を含む。抗体は、インビボイメージングに適するいずれかの薬剤、例えばX−線解析に使用することができるバリウムなどの造影剤、又はMRI又はCTに使用することができるガドリニウムキレートなどの磁気造影剤で標識することができる。他の標識剤は、限定しないが、99Tcなどのラジオアイソトープを含む。別の実施態様では、抗CD44抗体は非標識であり、そして検出可能な、抗CD44抗体を結合できる他の分子の二次抗体を投与することによりイメージングされる。
1つの実施態様では、検出可能な標識抗CD44抗体は蛍光プローブを含む。
なお更なる実施態様では、本発明の抗CD44抗体は、また、細胞のCD44の細胞表面発現の減少を明らかにするために使用してもよい。好ましい実施態様では、細胞はリンパ球及び単球である。
治療的使用法
別の実施態様では、本発明は、CD44抗体を、それを必要とする患者に投与することによるCD44活性を阻害する方法を提供する。本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分のいずれも、治療的に使用可能である。1つの実施態様では、CD44抗体はキメラ又はヒト化抗体である。好ましい実施態様では、CD44はヒト由来であり、また患者は人間の患者である。あるいは、患者は哺乳類、例えばCD44抗体が交差反応するCD44を発現するサルであってもよい。抗体は、ヒトの疾患の動物モデルとしてCD44を発現する、非ヒト哺乳類に投与してもよい。そのような動物モデルは、本発明の抗体の治療効果を評価するのに有用と考えられる。
別の実施態様では、本発明は、CD44抗体を、それを必要とする患者に投与することによるCD44活性を阻害する方法を提供する。本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分のいずれも、治療的に使用可能である。1つの実施態様では、CD44抗体はキメラ又はヒト化抗体である。好ましい実施態様では、CD44はヒト由来であり、また患者は人間の患者である。あるいは、患者は哺乳類、例えばCD44抗体が交差反応するCD44を発現するサルであってもよい。抗体は、ヒトの疾患の動物モデルとしてCD44を発現する、非ヒト哺乳類に投与してもよい。そのような動物モデルは、本発明の抗体の治療効果を評価するのに有用と考えられる。
別の実施態様では、CD44抗体又はその抗体部分は、不適切に高レベルのCD44を発現する患者に投与することができる。抗体は単回投与でもよいが、最適薬効には、好ましくは反復投与される。抗体は、毎日3回から6か月以上に1回の投与でよい。投与は、1日3回、1日2回、2日毎に1回、3日毎に1回、週1回、2週毎に1回、月1回、2か月毎に1回、3か月毎に1回及び6か月毎に1回、のようにスケジュールに従って行うことができる。抗体は、またミニポンプにより連続的に投与可能である。抗体は、粘膜、口腔、鼻腔内、吸入、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、又は腫瘍内経路を経由して投与できる。抗体は、1回、少なくとも2回、又は少なくとも状態が治療され、軽減し又は治癒される期間投与してもよい。抗体は、一般的に、状態が存在している間中投与される。抗体は、一般的に、上に記載の薬剤組成物の一部として投与される。抗体の用量は、一般的に、0.1から100mg/kg、より好ましくは0.5から50mg/kg、そして更に好ましくは1から10mg/kgの範囲である。抗体の血清中濃度は、業界で公知のいずれの方法で測定してもよい。
本発明は、ヒトを含む哺乳類における異常細胞浸潤の治療方法を提供し、また、本明細書に記載の、異常細胞浸潤の治療に有効なCD44抗体又はその抗原結合部分の治療的有効量を、該哺乳類に投与することを含む。
遺伝子療法
本発明の抗体及び抗体部分をコードする核酸分子は、それを必要とする患者に対して遺伝子治療を介して投与することができる。本療法は、インビボか又はエキソビボで行われる。好ましい実施態様では、重鎖及び軽鎖の両方をコードする核酸分子が患者に投与される。より好ましい実施態様では、核酸分子は、B細胞が抗体を産生するように特異化されることから、その染色体に安定的に組込まれるように投与される。好ましい実施態様では、前駆B細胞は、エキソビボでトランフェクト又は感染され、そしてそれを必要とする患者に再移植される。別の実施態様では、前駆B細胞又は他の細胞は、関係する細胞型に感染することが知られているウイルスを用いてインビボで感染される。遺伝子療法に使用される典型的なベクターは、リポソーム、プラスミド、及びウイルスベクターを含む。例としてのウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスである。インビボか又はエキソビボでの感染後、抗体発現レベルは、治療した患者から採取し、そして業界公知の又は本明細書で議論したいずれかの免疫測定法を用いることにより、モニタリングすることができる。
本発明の抗体及び抗体部分をコードする核酸分子は、それを必要とする患者に対して遺伝子治療を介して投与することができる。本療法は、インビボか又はエキソビボで行われる。好ましい実施態様では、重鎖及び軽鎖の両方をコードする核酸分子が患者に投与される。より好ましい実施態様では、核酸分子は、B細胞が抗体を産生するように特異化されることから、その染色体に安定的に組込まれるように投与される。好ましい実施態様では、前駆B細胞は、エキソビボでトランフェクト又は感染され、そしてそれを必要とする患者に再移植される。別の実施態様では、前駆B細胞又は他の細胞は、関係する細胞型に感染することが知られているウイルスを用いてインビボで感染される。遺伝子療法に使用される典型的なベクターは、リポソーム、プラスミド、及びウイルスベクターを含む。例としてのウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスである。インビボか又はエキソビボでの感染後、抗体発現レベルは、治療した患者から採取し、そして業界公知の又は本明細書で議論したいずれかの免疫測定法を用いることにより、モニタリングすることができる。
好ましい実施態様では、遺伝子治療法は、CD44抗体の重鎖又はその抗原結合部分をコードする分離核酸分子を投与し、また核酸分子を発現させる工程を含む。別の実施態様では、遺伝子治療法は、CD44抗体の軽鎖又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与し、また核酸分子を発現する工程を含む。より好ましい方法では、遺伝子療法は、重鎖又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、及び本発明のCD44抗体の軽鎖又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与し、並びに核酸分子を発現する工程を含む。遺伝子療法は、また、併用療法と関連して本出願で論じられたいずれかの薬剤などの、別の治療薬を投与する工程を含む。
本発明が更によく理解できるように、以下の実施例を説明する。これらの実施例は、説明目的のためだけのものであり、如何なる形であれ本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
以下の実施例及び薬剤において、「BSA」はウシ血清アルブミンを意味し;「EDTA」はエチレンジアミン四酢酸を意味し;「DNSO」はジメチルスルホキシドを意味し;「MOPS」は3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸を意味し;「MES」は2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸を意味し;「PBS」はリン酸緩衝生理食塩水を意味し;「dPBS」はダルべッコのリン酸緩衝生理食塩水を意味し;「HEMA」は2−ヒドロキシ−エチルメタクリレートを意味し;「DMEM」はダルべッコ改変イーグル培地を意味し;「FBS」は胎児ウシ血清を意味し;「NEAA」は非必須アミノ酸を意味し;「HEPES」はN−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−2−エタンスルホン酸を意味し;「DMF」はジメチルホルムアミドを意味する。
〔実施例1〕
抗CD44抗体を産生するハイブリドーマの生成
本発明に従う好ましい抗体は、以下のように作製され、選択され、そしてアッセイされた:
抗CD44抗体を産生するハイブリドーマの生成
本発明に従う好ましい抗体は、以下のように作製され、選択され、そしてアッセイされた:
免疫化及びハイブリドーマ生成:
精製組換えヒトCD44−Ig融合タンパク質(配列番号1)、ヒトCD44を発現するようにトランスフェクトされたマウスプレB細胞系300−19(Reth, M. G. et al, Nature 312 29: 418-42, 1984; Alt, F. et al., Cell 27: 381-390, 1981)、及びヒトCD44を自然発現するヒト単球性白血病細胞系、THP−1(ATCC、カタログ番号TIB−212)が、免疫原として用いられた。
精製組換えヒトCD44−Ig融合タンパク質(配列番号1)、ヒトCD44を発現するようにトランスフェクトされたマウスプレB細胞系300−19(Reth, M. G. et al, Nature 312 29: 418-42, 1984; Alt, F. et al., Cell 27: 381-390, 1981)、及びヒトCD44を自然発現するヒト単球性白血病細胞系、THP−1(ATCC、カタログ番号TIB−212)が、免疫原として用いられた。
ヒトCD44に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、ヒトIgトランスジェニックマウス株HCo7及びHCo12、並びにヒトトランス染色体/トランスジェニック株、KM(Mederex, Inc.社)を用いて調製した。これらの株は、全てヒトから単離された抗体と区別できない完全ヒト抗体を発現する。これらのマウス株では、内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子は、Chen et al. (1993), EMBO J. 12: 811-820に記載のようにホモ接合的に破壊されており、また内因性マウス重鎖遺伝子は、PCT国際公開第01/09187号の実施例1に記載のように、ホモ接合的に破壊されている。これらのマウス株のそれぞれは、Fishwild et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851に記載のヒトカッパ軽鎖トランス遺伝子、KCo5を有している。KCo7株は、米国特許第5545806号、米国特許第5625825号、米国特許第5545807号に記載のKCo7ヒト重鎖トランス遺伝子を有している。KCo12株は、PCT国際公開第01/09187号の実施例2に記載のように、KCo12ヒト重鎖トランス遺伝子を有している。KM株は、Ishida et al., (2002), Cloning and Stem Cells, 4: 91-102に記載のヒトミニ染色体を有している。
CD44に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、Hco7、HCo12及びKM株のHuMabマウスを、THP−1細胞、精製組換えCD44−Fc又はヒトCD44を発現する300−19トランスフェクタントで免疫した。HuMabマウスに対する一般的免疫化スキームは、Lonberg, N. et al (1994), Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851 及びPCT国際公開第98/24884号に記載されている。マウスは抗原の最初の融合時に6〜16週齡であった。CD44−Fc抗原(5〜20μg)の精製組換え試料、THP−1細胞の試料、又はトランスフェクト300−19細胞(1×107細胞)を用いて、HuMabマウスを腹腔内(IP)、皮下(Sc)又は経足蹠(fp)の注射で免疫した。
トランスジェニックマウスを、Ribiアジュバントにおける抗原で、1〜4週間隔で腹腔内及び皮下に免疫した。免疫応答を眼窩後方出血により採血してモニターした。血清をFACSでスクリーニングし(下記のように)、そして抗CD44ヒト免疫グロブリンの十分なタイターを有するマウスを融合に使用した。静脈内に抗原で追加免疫した2、3日後にマウスを犠牲にし、脾臓及び/又はリンパ節を取り出した。典型的には、各抗原に対して10〜20の融合を行なった。総数で81のHCo7、HCo12及びKMマウスが免疫された。数十のマウスが各抗原に対して免疫された。
抗CD44抗体を産生するHuMabマウスの選択:
CD44に結合した抗体を産生するHuMabマウスを選択するために、完全長ヒトCD44を発現する細胞系に結合し、そしてCD44を発現しない対照細胞系には結合しない免疫マウスの血清を、フローサイトメトリー(FACS)によりスクリーニングした:簡潔に云えば、CD44発現300−19細胞を1:20で希釈した免疫マウスの血清でインキュベートした。細胞を洗浄し、そして特異的抗体結合をFITC標識ヒトIgG Abで検出した。フローサイトメトリー分析を、FACSフローサイトメトリー装置(Becton Dickinson, San Jose, CA)で行なった。抗CD44抗体の最大タイターを示したマウスが融合に使用された。融合は下記のように行なわれ、そしてハイブリドーマ上清の抗CD活性を、FACSにより試験した。
CD44に結合した抗体を産生するHuMabマウスを選択するために、完全長ヒトCD44を発現する細胞系に結合し、そしてCD44を発現しない対照細胞系には結合しない免疫マウスの血清を、フローサイトメトリー(FACS)によりスクリーニングした:簡潔に云えば、CD44発現300−19細胞を1:20で希釈した免疫マウスの血清でインキュベートした。細胞を洗浄し、そして特異的抗体結合をFITC標識ヒトIgG Abで検出した。フローサイトメトリー分析を、FACSフローサイトメトリー装置(Becton Dickinson, San Jose, CA)で行なった。抗CD44抗体の最大タイターを示したマウスが融合に使用された。融合は下記のように行なわれ、そしてハイブリドーマ上清の抗CD活性を、FACSにより試験した。
CD44に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成:
HuMabマウスから単離されたマウス脾細胞及び/又はリンパ節リンパ球を、ポリエチレングリコール(PEG)又は電気融合(E融合、Cyto Pulse(登録商標) technology、Cyto Pulse(登録商標) Sciences、Inc., Glen Burnie, MD)を用いて、マウス骨髄腫細胞系、SP2/0(ATCC、CRL−1581、Vendor, City, State)に、標準又はメーカー推奨プロトコールを使用して融合した。簡潔に云えば、免疫マウス由来の脾臓及び/又はリンパ節リンパ球の単細胞懸濁液を、1/3及び等しい数のSP2/0非分泌マウス骨髄腫細胞間で、それぞれ50%PEG(Sigma, St.Louis, MO)又はE融合を用いて融合した。細胞をおよそ1×105脾細胞/ウェル(PEG)又は2×104脾細胞/ウェル(E融合)で、平底マイクロプレートにおいて平板培養し、そして10%ウシ胎仔血清を含有する選択培地、10%P388D1(ATCC、CRL−TIB−63)馴化培地、高グルコース、L−グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを有するDMEM(Mediatech, Herndon, VA、カタログ番号CRL 10013)中3〜5%(IGEN)、5mMのHEPES、0.055mMの2−メルカプトエタノール、50mg/mlのゲンタマイシン及び1×HAT(Sigma、カタログ番号CRL−P−7185)で、10〜14日間インキュベートした。1〜2週間後、HATがHTで置換された培地中で、細胞を培養した。細胞平板培養のおよそ10〜14日後、個々のウェルからの上清を、先ずそれらがヒトガンマ、カッパ抗体を含んでいるかについてスクリーニングした。ヒトガンマ、カッパ抗体の陽性を示す上清を、次いでFACS(上記)によりヒト抗CD44モノクローナル抗体IgGをスクリーニングした。ハイブリドーマを分泌する抗体を24ウェルプレートに移し、再度スクリーニングし、そしてヒト抗CD44モノクローナル抗体IgGの陽性が確認された場合、限界希釈法により少なくとも2回サブクローニングした。次いで安定なサブクローンを、更なる特性化用に組織培養培地中に少量の抗体を生成させるために、インビトロで培養した。
HuMabマウスから単離されたマウス脾細胞及び/又はリンパ節リンパ球を、ポリエチレングリコール(PEG)又は電気融合(E融合、Cyto Pulse(登録商標) technology、Cyto Pulse(登録商標) Sciences、Inc., Glen Burnie, MD)を用いて、マウス骨髄腫細胞系、SP2/0(ATCC、CRL−1581、Vendor, City, State)に、標準又はメーカー推奨プロトコールを使用して融合した。簡潔に云えば、免疫マウス由来の脾臓及び/又はリンパ節リンパ球の単細胞懸濁液を、1/3及び等しい数のSP2/0非分泌マウス骨髄腫細胞間で、それぞれ50%PEG(Sigma, St.Louis, MO)又はE融合を用いて融合した。細胞をおよそ1×105脾細胞/ウェル(PEG)又は2×104脾細胞/ウェル(E融合)で、平底マイクロプレートにおいて平板培養し、そして10%ウシ胎仔血清を含有する選択培地、10%P388D1(ATCC、CRL−TIB−63)馴化培地、高グルコース、L−グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを有するDMEM(Mediatech, Herndon, VA、カタログ番号CRL 10013)中3〜5%(IGEN)、5mMのHEPES、0.055mMの2−メルカプトエタノール、50mg/mlのゲンタマイシン及び1×HAT(Sigma、カタログ番号CRL−P−7185)で、10〜14日間インキュベートした。1〜2週間後、HATがHTで置換された培地中で、細胞を培養した。細胞平板培養のおよそ10〜14日後、個々のウェルからの上清を、先ずそれらがヒトガンマ、カッパ抗体を含んでいるかについてスクリーニングした。ヒトガンマ、カッパ抗体の陽性を示す上清を、次いでFACS(上記)によりヒト抗CD44モノクローナル抗体IgGをスクリーニングした。ハイブリドーマを分泌する抗体を24ウェルプレートに移し、再度スクリーニングし、そしてヒト抗CD44モノクローナル抗体IgGの陽性が確認された場合、限界希釈法により少なくとも2回サブクローニングした。次いで安定なサブクローンを、更なる特性化用に組織培養培地中に少量の抗体を生成させるために、インビトロで培養した。
ハイブリドーマを、2005年8月にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、10801 University Blvd., Manassas、VA20110−2209、とのブダペスト条約に基づいて、及び37C.F.R.§§1.801〜1.809下の寄託条件に基づいて寄託した。加えて、mAb10C8.2.3に対応するcDNAを含むベクターを、ATTC指定PTA−7658及び7659の下で同じ条件に基づいて、2006年6月15日にATCCに寄託した。寄託物へのパブリック・アクセスの全ての制限は、本出願に関する特許の付与時点で確定的に解除され、そして生存試料が受託者により分配できない場合、寄託は置き換えられる。
〔実施例2〕
安定な細胞系及びCD44−Ig融合タンパク質を生成させるヒト及びカニクイザルのCD44cDNAのクローニング
ヒトCD44cDNAクローニング:
ヒトCD44(配列番号1)を、ヒト脾臓cDNA(Clontech Labs.Inc., Mountain View, CA、カタログ番号639312)から以下のプライマー:5'-atggacaagttttggtggcacgcagcctgg-3' (配列番号155)及び5'-ttacaccccaatcttcatgtccaca-3' (配列番号156)によりクローニングした。PCR産物を、Xhol及びXbal制限部位を付加するために、以下のプライマー: 5'-gactcgaggccaccatggacaagttttggtggc-3' (配列番号157)及び5'- gatctagatcactattacaccccaatcttcatgtcc-3' (配列番号158)を用いて再増幅した。この2番目のPCR産物を、pMIG哺乳類発現ベクター内にライゲートし、そしてCD44配列は、両スタンドで検証した。Hawley et al., (1994), Gene Thera. 1: 136-138。
安定な細胞系及びCD44−Ig融合タンパク質を生成させるヒト及びカニクイザルのCD44cDNAのクローニング
ヒトCD44cDNAクローニング:
ヒトCD44(配列番号1)を、ヒト脾臓cDNA(Clontech Labs.Inc., Mountain View, CA、カタログ番号639312)から以下のプライマー:5'-atggacaagttttggtggcacgcagcctgg-3' (配列番号155)及び5'-ttacaccccaatcttcatgtccaca-3' (配列番号156)によりクローニングした。PCR産物を、Xhol及びXbal制限部位を付加するために、以下のプライマー: 5'-gactcgaggccaccatggacaagttttggtggc-3' (配列番号157)及び5'- gatctagatcactattacaccccaatcttcatgtcc-3' (配列番号158)を用いて再増幅した。この2番目のPCR産物を、pMIG哺乳類発現ベクター内にライゲートし、そしてCD44配列は、両スタンドで検証した。Hawley et al., (1994), Gene Thera. 1: 136-138。
カイニクイザルCD44cDNAクローニング:
カイニクイザルCD44遺伝子を、以下のプライマー:5'-atggacaagttttggtgg-3' (配列番号159)及び5'-gttacaccccaatcttcatgtcca-3' (配列番号160)により、cynoPBMCcDNAからPCR増幅した。PCR産物を、PCR2.1TOPOベクター(Invitrogen, City, Carlsbad, CA、カタログ番号K4510−20)にライゲートした。19クローンを配列決定し、またcynoCD44配列は、クローンの全てのコンセンサス配列により決定した。2つのクローン、5−2(配列番号153)及び5−8(配列番号8)の核酸配列を示す。配列を検証したカニクイザルCD44(配列番号8)を、哺乳類発現ベクターpMIG内にサブクローニングした。Hawley et al., (1994)。
カイニクイザルCD44遺伝子を、以下のプライマー:5'-atggacaagttttggtgg-3' (配列番号159)及び5'-gttacaccccaatcttcatgtcca-3' (配列番号160)により、cynoPBMCcDNAからPCR増幅した。PCR産物を、PCR2.1TOPOベクター(Invitrogen, City, Carlsbad, CA、カタログ番号K4510−20)にライゲートした。19クローンを配列決定し、またcynoCD44配列は、クローンの全てのコンセンサス配列により決定した。2つのクローン、5−2(配列番号153)及び5−8(配列番号8)の核酸配列を示す。配列を検証したカニクイザルCD44(配列番号8)を、哺乳類発現ベクターpMIG内にサブクローニングした。Hawley et al., (1994)。
300−19ヒト及びカニクイザルCD44 300−19過剰発現細胞系:
pMIG−ヒトCD44及びpMIG−cynoCD44の両方を、FUGENE 6トランスフェクション試薬(Hoffman-La Roche Inc.、Nutley、カタログ番号11815091001)で、293T/17細胞(ATCC No.CRL−11263)内にトランスフェクトし、ヒトCD44及びcynoCD44レトロウイルスを生成させた。両レトロウイルスを、その後300−19細胞へ形質導入してヒトCD44及びcynoCD44発現細胞系を生成させた。
pMIG−ヒトCD44及びpMIG−cynoCD44の両方を、FUGENE 6トランスフェクション試薬(Hoffman-La Roche Inc.、Nutley、カタログ番号11815091001)で、293T/17細胞(ATCC No.CRL−11263)内にトランスフェクトし、ヒトCD44及びcynoCD44レトロウイルスを生成させた。両レトロウイルスを、その後300−19細胞へ形質導入してヒトCD44及びcynoCD44発現細胞系を生成させた。
ヒトCD44−IgG1融合タンパク質のクローニング:
ヒトCD44の細胞外ドメインを、ヒトIgG1融合タンパク質(配列番号3)として発現させた。CD44の成熟細胞外ドメインをコードするcDNAを、ヒト白血球cDNA(Clontech Labs. Inc.)からPCR増幅し(Klentaq PCRキット、Clontech Labs Inc., Mountain View, CA、カタログ番号639108)、これをCD5リーダー配列及びヒトIgG1タグを含む哺乳類発現ベクター−PCDMamp内にサブクローニングした。以下のPCRプライマーを、CD44標準型(G.R. Screaton, et al., (1992), PNAS 89: 12160-12164,) (CD44+C: AGTGAGACTAGTCAGATCGATTTGAATATAACCTGCCGCTTTG) (配列番号161), (CD44−D: ATCACTGAGATCTTCTGGAATTTGGGGTGTCCTTATAG) (配列番号162)の公開されている配列にデザインした。完全CD44IgG1cDNAを、配列決定し、そして両鎖で検証した。
ヒトCD44の細胞外ドメインを、ヒトIgG1融合タンパク質(配列番号3)として発現させた。CD44の成熟細胞外ドメインをコードするcDNAを、ヒト白血球cDNA(Clontech Labs. Inc.)からPCR増幅し(Klentaq PCRキット、Clontech Labs Inc., Mountain View, CA、カタログ番号639108)、これをCD5リーダー配列及びヒトIgG1タグを含む哺乳類発現ベクター−PCDMamp内にサブクローニングした。以下のPCRプライマーを、CD44標準型(G.R. Screaton, et al., (1992), PNAS 89: 12160-12164,) (CD44+C: AGTGAGACTAGTCAGATCGATTTGAATATAACCTGCCGCTTTG) (配列番号161), (CD44−D: ATCACTGAGATCTTCTGGAATTTGGGGTGTCCTTATAG) (配列番号162)の公開されている配列にデザインした。完全CD44IgG1cDNAを、配列決定し、そして両鎖で検証した。
カニクイザルCD44−IgG1タンパク質クローニング:
カニクイザルCD44の細胞外ドメインを、ヒトIgG1Fc融合タンパク質(配列番号5)として発現させた。cynoCD44の成熟細胞外ドメインをコードするcDNAを、pMIG−cynoCD44ベクターからPCR増幅し、そしてCD5リーダー配列、ヒトIgG1タグ、およびXholおよびHpal制限部位を含む自社内の哺乳類発現ベクターpLNpへサブクローニングした。PCRプライマーを、Xhol及びEcoRV制限部位を有するCD44細胞外ドメインとアラインするためにデザインした。プライマー配列は以下のとおりである:5'-atcggcgatccagatcgatttgaatataacc-3' (配列番号163)、 5'-ctgtgcctcgagccattctggaatttggggtgtcc-3' (配列番号164)。完全cynoCD44細胞外IgG1cDNAを、配列決定し、両鎖において検証した。
カニクイザルCD44の細胞外ドメインを、ヒトIgG1Fc融合タンパク質(配列番号5)として発現させた。cynoCD44の成熟細胞外ドメインをコードするcDNAを、pMIG−cynoCD44ベクターからPCR増幅し、そしてCD5リーダー配列、ヒトIgG1タグ、およびXholおよびHpal制限部位を含む自社内の哺乳類発現ベクターpLNpへサブクローニングした。PCRプライマーを、Xhol及びEcoRV制限部位を有するCD44細胞外ドメインとアラインするためにデザインした。プライマー配列は以下のとおりである:5'-atcggcgatccagatcgatttgaatataacc-3' (配列番号163)、 5'-ctgtgcctcgagccattctggaatttggggtgtcc-3' (配列番号164)。完全cynoCD44細胞外IgG1cDNAを、配列決定し、両鎖において検証した。
上のクローニング全てにわたるPCR条件として、白金Taqポリメラーゼ(Invitrogen、カタログ番号11304−011)を使用し、標準的PCRプロトコール:95℃で3分;25×(55℃で30秒、78℃で1分);72℃で7分、を使用した。
ヒトCD44及びcynoCD44発現の細胞外ドメイン及び精製:
ヒトCD44IgG1(配列番号3)及びcynoCD44IgG1(配列番号5)を、製造業者プロトコールに従って、フリースタイル293発現システム(Invitrogen、カタログ番号K9000−01)を用いて発現させた。
ヒトCD44IgG1(配列番号3)及びcynoCD44IgG1(配列番号5)を、製造業者プロトコールに従って、フリースタイル293発現システム(Invitrogen、カタログ番号K9000−01)を用いて発現させた。
融合タンパク質は、プロテインAアガロースビーズ(Pierce, Rockford, IL、カタログ番号15918−014)で精製した。培養培地を採取後、プロテアーゼ阻害錠(Hoffman-La Roche Inc., Nutley、カタログ番号1697498、1錠/50ml媒体)、トリス緩衝液(pH8.0、最終濃度:10mM)及びナトリウムアジド(最終濃度:0.02%)を加え、そして0.22μmのフィルターで濾過した。プロテインAビーズの50%スラリー(1ml)を各媒体(100ml)に加えた。媒体/スラリー混合物を4℃で少なくとも2時間回転させた。1000×gで10分間の高速回転によりペレットアガロースを得た。上清を注意深く除去し、そのアガロースペレットを洗浄緩衝液(0.1MトリスHCl、pH:7.5、0.1MのNaCl)(2〜3容)に再懸濁して、カラムにかけた。カラムを20通液量の洗浄緩衝液で洗浄し、5通液量の溶離緩衝液(ImmunoPure IgG 溶離緩衝液、Pierce、カタログ番号21004)で、1Mトリス、pH:8の1/2カラム容積を収容するチューブに溶離した。緩衝液を、メーカープロトコールに従い、Amicon濃縮器10000MWカットオフ(Millipore, Billerica, MA)を用いてPBS内に交換した。
〔実施例3〕
本発明に従って調製した抗CD44抗体の配列決定
本発明に従って生産した抗体の構造を解析するために、CD44モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ由来の重鎖及び軽鎖をコードする核酸をクローニングした。クローニング及び配列決定は以下のように達成された:
本発明に従って調製した抗CD44抗体の配列決定
本発明に従って生産した抗体の構造を解析するために、CD44モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ由来の重鎖及び軽鎖をコードする核酸をクローニングした。クローニング及び配列決定は以下のように達成された:
ポリ(A)+mRNAを、RNeasyミニキット(Qiagen, San Diego, CA)を用いてシレート化し(silated)、cDNAを、オリゴ(dT)プライミングを使用し、Advantage RT−for−PCRキット(BD Biosciences, Frnaklin Lakes, NJ)を用いて、mRNAから合成した。クローン1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、及び14G9.B8.B4に対するオリゴ(dT)プライム化(primed)cDNAは、それぞれ表4、5及び6に記載の縮重プライマーを用いて増幅した。増幅は、繰り返して高性能ポリメラーゼ(Roche)及びPTC−200DNA Engine(MJ Reseach)を用いて以下のように達成した:2′@95℃;25×(20″@95℃、30″@52℃、2′@72℃);10′@72℃。PCRアンプリコンを、pCR2.1TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA、カタログ番号K4500−01)内にクローニングし、そしてTOP10化学的コンピテント細胞(Invitrogen)内に標準プロトコールを使用して形質転換した。クローンを、Grills 16th BDTv3.1/dGTP chemistry(Applied Biosystems Inc.)及び3730×I DNAアナライザー(Applied Biosystems,Inc., Foster, CA)を用いて検証して証明決定した。全配列は、「V BASE配列ダイレクトリー」に対するアラインメントにより解析した (Tomlinson, et al, (1992), J. Mol. Biol., 227, 776−798; Hum, (1995) Mol. Genet., 3, 853−860; EMBO J., 14, 4628−4638)。
配列及び突然変異解析:
当業者には当然のことながら、遺伝子利用解析は抗体構造の限定された概観のみを提供する。KM動物のB細胞はV−D−J重鎖及びV−Jカッパ軽鎖転写物を確率的に生成することから、限定されないが、体細胞超変異、欠失、N−付加、及びCD3拡張を含み、多くの二次過程が生じる。例えば、Mendez et al., (1997), Nature Genetics 15: 146-156 及びPCT国際公開第98/24893号を参照されたい。従って、更に抗体構造を調べるために、本発明者らは、クローンから得られたcDNAからの抗体の予想アミノ酸配列を生成した。
当業者には当然のことながら、遺伝子利用解析は抗体構造の限定された概観のみを提供する。KM動物のB細胞はV−D−J重鎖及びV−Jカッパ軽鎖転写物を確率的に生成することから、限定されないが、体細胞超変異、欠失、N−付加、及びCD3拡張を含み、多くの二次過程が生じる。例えば、Mendez et al., (1997), Nature Genetics 15: 146-156 及びPCT国際公開第98/24893号を参照されたい。従って、更に抗体構造を調べるために、本発明者らは、クローンから得られたcDNAからの抗体の予想アミノ酸配列を生成した。
図2は、対応軽鎖及び重鎖遺伝子の生殖細胞系アミノ酸配列を有する、単離されたCD44モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の、予想アミノ酸配列のアラインメントを示す。
表9〜12は、大文字で表示した各抗体の可変領域を有する抗体1A9.A6.B9(表9)、2D1.A3.D12(表10)、14G9.B8.B4(表11)、及び10C8.2.3(表12)の、重鎖及びカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド及び予想アミノ酸配列を提供する。
本発明者らは、1つの突然変異抗体2D1.A3.D12を生成させた。抗体2D1.A3.D12の重鎖は突然変異し、28位のトレオニン残基をイソロイシンに変化させた。38位の抗体2D1.A3.D12の軽鎖は突然変異して、グルタミン残基をヒスチジンに変化させた。
クローン2D1.A3.D12のVH(128T)及びVΚ(H38Q)領域における突然変異を、Stratagenの高速交換部位特異的突然変異誘発キットを用いて、表8に示すプライマーで製造業者説明書に従って行なった。突然変異は自動配列決定法により確認され、そして突然変異誘発挿入物を、発現ベクターへサブクローニングした。抗CD44抗体2D1.A3.D12の突然変異誘発は、以下のように行なわれた:
抗CD44抗体の可変ドメインは、以下の通り発現ベクターにクローニングした:
可変ドメインは、表13、14、及び15に示すプライマーを用いてpCR2.1クローン化cDNAから増幅した。増幅は、Pfx白金ポリメラーゼ(Invitrogen)及びPTC−200 DNA Engine(MJ Research)を、以下のようにサイクルして達成した:94℃で2分;20×(94℃で30秒、55℃で45秒、68℃で1分);68℃で数分。これらのクローンを、Grills 16th BDTv3.1/dGTP chemistry(Applied Biosystems Inc.)及び3730×l DNAアナライザー(Applied Biosystems Inc.)を用いて検証して配列決定した。
可変ドメインは、表13、14、及び15に示すプライマーを用いてpCR2.1クローン化cDNAから増幅した。増幅は、Pfx白金ポリメラーゼ(Invitrogen)及びPTC−200 DNA Engine(MJ Research)を、以下のようにサイクルして達成した:94℃で2分;20×(94℃で30秒、55℃で45秒、68℃で1分);68℃で数分。これらのクローンを、Grills 16th BDTv3.1/dGTP chemistry(Applied Biosystems Inc.)及び3730×l DNAアナライザー(Applied Biosystems Inc.)を用いて検証して配列決定した。
〔実施例4〕
ヒト抗CD44抗体はヒアルロン酸(HA)のCD44への結合をブロックする
ヒト抗CD44抗体について、HA(Sigma、カタログ番号H5388)と実施例2に記載のヒトCD44タンパク質(配列番号3)との相互作用の阻害能を評価した。
ヒト抗CD44抗体はヒアルロン酸(HA)のCD44への結合をブロックする
ヒト抗CD44抗体について、HA(Sigma、カタログ番号H5388)と実施例2に記載のヒトCD44タンパク質(配列番号3)との相互作用の阻害能を評価した。
結合アッセイを、96ウェルELISA分析プレート(Immunolux HB Maxisorp 96ウェルプレート、Nunc、カタログ番号442404)で行なった。1日目に、2.5mg/mlでpH9.6の50mMのNabicarb緩衝液で希釈した鶏冠HA(100μl)をプレートのアッセイウェルに加え、4℃で一夜インキュベートした。ほぼ24時間後、HA被覆プレートを、0.05%のTween−20(Sigma、カタログ番号P1379)を含むPBS緩衝液(300μl)を用いて4回洗浄した。次いでプレートを、各ウェルにPBS中3%BSA(200μl)を加えることによりブロックし、37℃で2時間インキュベートした。次いでブロックプレートは、0.05%のTween−20を含むPBSで洗浄した。別々の96ウェルのポリプロピレンプレート(Falco、カタログ番号351190)内で、抗CD44抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3を、1%BSA含有PBSで種々の濃度に希釈し、そして50μl容積中0.6μg/mlの最終濃度で、ヒトCD44−Ig融合タンパク質を混合した。混合物を室温で60分間インキュベートし、次いで、HA被覆プレートに移して室温で1時間インキュベートした。プレートは、0.05%Tween−20を含むPBSで洗浄した。1%BSAで1:500に希釈した(HAに結合したCD44−Igを検出するため)抗ヒトIgG−HRP(American Biosciences, Piscataway, NJ, State、カタログ番号NA933)を各ウェルに加えて、室温でインキュベートした。次いでプレートを再度洗浄し、TMB(TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質、KPL、52−00−02)(50μl)を加えて、更に約10分間インキュベートした。次いで反応を停止液(50μl)で停止させ、そしてOD450値をプレートリーダーで測定した。図3は、HAとCD44−Ig融合タンパク質間の相互作用をブロックする、CD44抗体1A9.A6.B9のグラフ表示を示す。表16は、抗CD44抗体のIC50値を示す。
〔実施例5〕
抗CD44モノクローナル抗体の結合定数の測定
CD44に対する本発明の抗体の結合親和性を示す、別のインビトロ試験を行った。
抗CD44モノクローナル抗体の結合定数の測定
CD44に対する本発明の抗体の結合親和性を示す、別のインビトロ試験を行った。
結合試験は、抗体CD44Abが平衡結合解析においてトランスフェクト細胞のCD44に結合し、0.98μg/mL(6.8nM、図4A−C、特に図4Cを参照)の結合定数を有することを示した。ヒトCD44タンパク質をコードするレトロウイルスベクターで形質導入された300−19細胞をPBSで2回洗浄した。次いで、300−19細胞を、1×106細胞/mlの細胞密度で、FACS緩衝液[PBS(Sigma、カタログ番号D−8537);0.02%のアジド(Sigma、カタログ番号S−2000);5μg/mlのサイトカラシンB(Sigma、カタログ番号C−6762)及び2%のウシ胎仔血清(Gibco, City, State、カタログ番号16140−071)]に再懸濁した。CD44発現300−19細胞(2×105/400μl)(400μl)をNunc−Immunoチューブ、(VWR、カタログ番号443990)に移し、抗ヒトIgG FITC(Jackson、カタログ番号109−095−098)(5μl)及び1A9.A6.B9を種々の濃度で加え、そして振盪プレート(Thermolyne、rotomix型48200)上、室温で連続振盪により3時間、チューブをインキュベートした。3時間後、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、1%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science, Ft.Washington, PA、カタログ番号15710)(250μl)に再懸濁した。Becton DickinsonのFACS Caliburを用いてチューブの読み取りを行ない、そのデータをCellQuest Pro(Becton Dickinson)を用いて解析した(図4Cを参照)。
抗CD44抗体は、また、末梢CD3+T細胞に発現するヒトCD44及びcynoCD44タンパク質に結合する(図4A及び4Bを参照)。具体的には、ヘパリン(Becton
Dickinson、カタログ番号366480)入りのvacutainerチューブで、健常人ボランティアからヒト末梢血を採取した。採取ヒト血液(100μl)をNunc−Immunoチューブ(VWR、カタログ番号443990)に加えた。抗CD44Abを各チューブに加えて、0.2μg/ml〜20μg/mlの最終濃度を得た。その後、抗CD3−PerCP(BD Pharmingen、カタログ番号347344)(10μl)及び抗CD14−APC(BD Pharmingen、カタログ番号555399)(10μl)を各チューブに加えた。氷上で30分間インキュベートして、1200rpmで10分間遠心分離し、そして上清を除いた。FACS洗浄緩衝液(PBS−Sigma、D8537;0.02%アジド、Sigma、カタログ番号S2002及び2%ウシ胎仔血清、Gibco、カタログ番号16140−071)(100μl)、並びに二次FITC標識ヤギ抗ヒトIgGFC特異抗体(Jackson、カタログ番号109−095−098)(50μl/ウェル)を1:100倍希釈で加えた。暗所にて4℃で25分間インキュベートした。25分のインキュベーション後、FACS溶解溶液(BD Pharmingen、水に1:10で希釈)(2ml)を加え、ボルテックスして、室温で10分間再度インキュベートした。10分のインキュベーション後、1200rpmで10分間遠心分離して上清を除き、細胞をFACS洗浄緩衝液で洗浄し、続いて遠心分離して上清を除去した。次いで細胞を、1%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science、Ft.Washington, PA、カタログ番号15710)(250ml)で固定し、そしてBecton DickinsonのFACS Caliburを用いて読み取り、更にそのデータをCellQuest Pro(Becton Dickinson)を用いて解析した。
Dickinson、カタログ番号366480)入りのvacutainerチューブで、健常人ボランティアからヒト末梢血を採取した。採取ヒト血液(100μl)をNunc−Immunoチューブ(VWR、カタログ番号443990)に加えた。抗CD44Abを各チューブに加えて、0.2μg/ml〜20μg/mlの最終濃度を得た。その後、抗CD3−PerCP(BD Pharmingen、カタログ番号347344)(10μl)及び抗CD14−APC(BD Pharmingen、カタログ番号555399)(10μl)を各チューブに加えた。氷上で30分間インキュベートして、1200rpmで10分間遠心分離し、そして上清を除いた。FACS洗浄緩衝液(PBS−Sigma、D8537;0.02%アジド、Sigma、カタログ番号S2002及び2%ウシ胎仔血清、Gibco、カタログ番号16140−071)(100μl)、並びに二次FITC標識ヤギ抗ヒトIgGFC特異抗体(Jackson、カタログ番号109−095−098)(50μl/ウェル)を1:100倍希釈で加えた。暗所にて4℃で25分間インキュベートした。25分のインキュベーション後、FACS溶解溶液(BD Pharmingen、水に1:10で希釈)(2ml)を加え、ボルテックスして、室温で10分間再度インキュベートした。10分のインキュベーション後、1200rpmで10分間遠心分離して上清を除き、細胞をFACS洗浄緩衝液で洗浄し、続いて遠心分離して上清を除去した。次いで細胞を、1%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science、Ft.Washington, PA、カタログ番号15710)(250ml)で固定し、そしてBecton DickinsonのFACS Caliburを用いて読み取り、更にそのデータをCellQuest Pro(Becton Dickinson)を用いて解析した。
ELISA結合試験:
ELISA結合試験は、1A9.A6.B9が、96ウェルプレート上に被覆したヒト及びcynoCD44−Ig融合タンパク質に結合することを示した(図5を参照)。分析の始めに、PBS中1μg/mlのCD44−Ig融合タンパク質(50μl)を、96ウェルプレート(Immuno Maxisorpプレート、Nunc、カタログ番号442404)に加え、4℃で一夜インキュベートした。次の日、プレートを、0.05%Tween20を含むPBSで4回洗浄した。次いで、プレートをPBS中の3%BSA(ウェル当り200μl)により、37℃で2時間ブロックし、再度洗浄した。抗CD44抗体1A9.A6.B9を、PBS及び1%BSAにより種々の濃度で希釈し、そしてプレートに加えて室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてPBS中1%BSAで1:2000に希釈した抗ヒトカッパ軽鎖HRP抗体(Amersham Bioscience、カタログ番号NA933)(50μl)を、各ウェルに加えて更に1時間室温でインキュベートした。再度プレートを洗浄し、そして50μg/mlのTMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質(カタログ番号KPL S2−00−02)を加えて5〜10分間インキュベートした。ELISA反応を停止溶液で停止させ、OD450値をプレートリーダーで測定した。
ELISA結合試験は、1A9.A6.B9が、96ウェルプレート上に被覆したヒト及びcynoCD44−Ig融合タンパク質に結合することを示した(図5を参照)。分析の始めに、PBS中1μg/mlのCD44−Ig融合タンパク質(50μl)を、96ウェルプレート(Immuno Maxisorpプレート、Nunc、カタログ番号442404)に加え、4℃で一夜インキュベートした。次の日、プレートを、0.05%Tween20を含むPBSで4回洗浄した。次いで、プレートをPBS中の3%BSA(ウェル当り200μl)により、37℃で2時間ブロックし、再度洗浄した。抗CD44抗体1A9.A6.B9を、PBS及び1%BSAにより種々の濃度で希釈し、そしてプレートに加えて室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてPBS中1%BSAで1:2000に希釈した抗ヒトカッパ軽鎖HRP抗体(Amersham Bioscience、カタログ番号NA933)(50μl)を、各ウェルに加えて更に1時間室温でインキュベートした。再度プレートを洗浄し、そして50μg/mlのTMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質(カタログ番号KPL S2−00−02)を加えて5〜10分間インキュベートした。ELISA反応を停止溶液で停止させ、OD450値をプレートリーダーで測定した。
BIAcore結合試験:
表面プラズモン共鳴を使用して、表面にCD44−Fc融合タンパク質(12μg/ml、10mM酢酸塩、pH4.0)をコーティングしたCM5センサーチップでヒト分子間相互作用を測定した。5、3、2、1、0.5及び0.25μg/mlの濃度で抗CD44 Abを直接法によりスクリーニングした。ヒトIgG1及びIgG2標準を用いて、非特異的及びバックグラウンド結合をチェックした。曲線の会合相と解離相の初期部を用いて親和性及び速度定数を計算し、表17に報告する。
表面プラズモン共鳴を使用して、表面にCD44−Fc融合タンパク質(12μg/ml、10mM酢酸塩、pH4.0)をコーティングしたCM5センサーチップでヒト分子間相互作用を測定した。5、3、2、1、0.5及び0.25μg/mlの濃度で抗CD44 Abを直接法によりスクリーニングした。ヒトIgG1及びIgG2標準を用いて、非特異的及びバックグラウンド結合をチェックした。曲線の会合相と解離相の初期部を用いて親和性及び速度定数を計算し、表17に報告する。
〔実施例6〕
抗CD44モノクローナル抗体は、ヒト末梢血単球(PBMC)からの炎症性サイトカイン産生をブロックする
また、抗CD44抗体について、精製ヒトPBMC由来のHA(Sigma、カタログ番号H5388)によって刺激したIL−1β放出の遮断能を評価した(図6参照)。ヒト末梢血を、ヘパリン入りvacutainerチューブ(Becton Dickinson、カタログ番号366480)で健常人ボランティアから採取した。PBMCを、製造業者説明書に従いSigma Accuspinチューブ(Sigma、カタログ番号A7054)を用いて分離した。精製細胞をRPMI 1640(Gibco、カタログ番号11875−093)により2回洗浄し、そしてRPMI中5×106で再懸濁し、PBMC(100μl/ウェル)を、96ウェルアッセイプレート(Costar、カタログ番号3596)に加えた。次いでヒトPBMCを、RPMI中種々の濃度の抗CD44抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3の存在下、HA(Sigma、カタログ番号H1751)により刺激した。具体的には、HA保存溶液(RPMI中10μg/ml)(100μl)をPBMCと抗CD44抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3と種々の濃度で混合した。アッセイプレートを加湿雰囲気下(Narco6300 CO2インキュベータ)、37℃で24時間インキュベートした。次いでプレートを、1200rpmで10分間遠心分離した。次いで上清を各ウェルから除去し、そして製造業者プロトコール(IL−1β Quantikine ELISAキット、R&D、カタログ番号DLB50)に従い、IL−1β ELISAにより測定した(表18参照)。
抗CD44モノクローナル抗体は、ヒト末梢血単球(PBMC)からの炎症性サイトカイン産生をブロックする
また、抗CD44抗体について、精製ヒトPBMC由来のHA(Sigma、カタログ番号H5388)によって刺激したIL−1β放出の遮断能を評価した(図6参照)。ヒト末梢血を、ヘパリン入りvacutainerチューブ(Becton Dickinson、カタログ番号366480)で健常人ボランティアから採取した。PBMCを、製造業者説明書に従いSigma Accuspinチューブ(Sigma、カタログ番号A7054)を用いて分離した。精製細胞をRPMI 1640(Gibco、カタログ番号11875−093)により2回洗浄し、そしてRPMI中5×106で再懸濁し、PBMC(100μl/ウェル)を、96ウェルアッセイプレート(Costar、カタログ番号3596)に加えた。次いでヒトPBMCを、RPMI中種々の濃度の抗CD44抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3の存在下、HA(Sigma、カタログ番号H1751)により刺激した。具体的には、HA保存溶液(RPMI中10μg/ml)(100μl)をPBMCと抗CD44抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3と種々の濃度で混合した。アッセイプレートを加湿雰囲気下(Narco6300 CO2インキュベータ)、37℃で24時間インキュベートした。次いでプレートを、1200rpmで10分間遠心分離した。次いで上清を各ウェルから除去し、そして製造業者プロトコール(IL−1β Quantikine ELISAキット、R&D、カタログ番号DLB50)に従い、IL−1β ELISAにより測定した(表18参照)。
〔実施例7〕
抗CD44モノクローナル抗体は、ヒト末梢T細胞からの炎症性サイトカイン産生をブロックする
抗CD44モノクローナル抗体は、抗CD3及び抗CD28抗体により刺激したヒト末梢T細胞からのIL−2及びIFN−γ産生をブロックした。ヒト末梢血を、ヘパリン入りvacutainerチューブ(Becton Dickinson、カタログ番号366480)で健常人ボランティアから採取した。次いで、Falconポリプロピレンチューブ(Falcon、カタログ番号2059)内でPBSで希釈した等量の抗CD3(UCTH1、R&D、カタログ番号MAB100)及び抗CD28抗体(R&D、カタログ番号AF−342−PB)を混合した。抗CD3及び抗CD28抗体の最終濃度は、それぞれ1μg/ml及び10ng/mlであった。96ウェルのポリスチレンプレート(Costar、カタログ番号3596)に、抗CD44抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;及び14G9.B8.B4(10μl)を各ウェルに種々の濃度で加え、次いで、抗CD3及び抗CD28抗体と予混合したヒト全血(200μl)と混合して、37℃で24時間インキュベートした。血清を除去し、IFN−γ及びIL−2 ELISA法(それぞれ、R&D、カタログ番号DIF50及びD2050)で分析した(下表19参照)。
抗CD44モノクローナル抗体は、ヒト末梢T細胞からの炎症性サイトカイン産生をブロックする
抗CD44モノクローナル抗体は、抗CD3及び抗CD28抗体により刺激したヒト末梢T細胞からのIL−2及びIFN−γ産生をブロックした。ヒト末梢血を、ヘパリン入りvacutainerチューブ(Becton Dickinson、カタログ番号366480)で健常人ボランティアから採取した。次いで、Falconポリプロピレンチューブ(Falcon、カタログ番号2059)内でPBSで希釈した等量の抗CD3(UCTH1、R&D、カタログ番号MAB100)及び抗CD28抗体(R&D、カタログ番号AF−342−PB)を混合した。抗CD3及び抗CD28抗体の最終濃度は、それぞれ1μg/ml及び10ng/mlであった。96ウェルのポリスチレンプレート(Costar、カタログ番号3596)に、抗CD44抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;及び14G9.B8.B4(10μl)を各ウェルに種々の濃度で加え、次いで、抗CD3及び抗CD28抗体と予混合したヒト全血(200μl)と混合して、37℃で24時間インキュベートした。血清を除去し、IFN−γ及びIL−2 ELISA法(それぞれ、R&D、カタログ番号DIF50及びD2050)で分析した(下表19参照)。
〔実施例8〕
CD44の表面発現の低下
抗CD44抗体によるCD44の表面発現の低下を検出するために、フローサイトメトリー(FACS)解析を行なった。インビトロの条件下、ヒト全血により各抗CD44抗体をおよそ12時間インキュベートし、そしてヒト末梢白血球でのCD44表面発現低下を検出した(図7参照)。抗CD44抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3抗体(10μl)を種々の濃度で、96ウェル平底ポリスチレン・アッセイ・プレート(Costar、カタログ番号3596)に加えた。ヒト末梢血を、ヘパリン入りvacutainerチューブ(Becton Dickinson、カタログ番号366480)で健常人ボランティアから採取した。次いで、ヒト血液(100μl/ウェル)を、抗CD44Abと混合し、そして加湿雰囲気下(Narco6300 CO2インキュベータ)、37℃で24時間インキュベートした。次いで、CD44検出抗体、G−44−26−PE(BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ、カタログ番号555479)(20μl)、抗CD3−perCP抗体(BD PharMingen、カタログ番号347344)(10μl)及び抗CD14−APC(BD PharMingen、カタログ番号555399)(10μl)をウェルに加え、そして暗所で30〜40分間氷上に保持した。次いで100μlの血液をプレートから除去し、nunc−immunoチューブ(VWR、West Chester, PA、カタログ番号443990)に移し、そしてFACS溶解溶液(BD Pharmingen、カタログ番号349202)(2ml)を1:10の水希釈で加え、ボルテックスして室温で10分間脇に置いた。10分後、血液を1200rpmで10分間遠心分離し、細胞をFACS洗浄緩衝液(PBS、0.02%のアジド、Sigma、カタログ番号S2002及び2%のウシ胎仔血清、Gibco、カタログ番号16140−071)で洗浄した。次いで細胞を、1%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science、カタログ番号15710)(250ml)で固定し、そしてチューブをFACS caliburを用いて読み取り、更にそのデータをCellQuestソフトウェアを用いて解析した(表20及び21参照)。図8は、(a)リンパ球、(b)単球、及び(c)PMNについての10μg/mlの1A9.A6.B9抗体濃度でのFACSの結果を示す。1A9.A6.B9抗体の結果は灰色で、そしてベースライン発現は黒色で示す。
CD44の表面発現の低下
抗CD44抗体によるCD44の表面発現の低下を検出するために、フローサイトメトリー(FACS)解析を行なった。インビトロの条件下、ヒト全血により各抗CD44抗体をおよそ12時間インキュベートし、そしてヒト末梢白血球でのCD44表面発現低下を検出した(図7参照)。抗CD44抗体1A9.A6.B9;2D1.A3.D12;14G9.B8.B4;及び10C8.2.3抗体(10μl)を種々の濃度で、96ウェル平底ポリスチレン・アッセイ・プレート(Costar、カタログ番号3596)に加えた。ヒト末梢血を、ヘパリン入りvacutainerチューブ(Becton Dickinson、カタログ番号366480)で健常人ボランティアから採取した。次いで、ヒト血液(100μl/ウェル)を、抗CD44Abと混合し、そして加湿雰囲気下(Narco6300 CO2インキュベータ)、37℃で24時間インキュベートした。次いで、CD44検出抗体、G−44−26−PE(BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ、カタログ番号555479)(20μl)、抗CD3−perCP抗体(BD PharMingen、カタログ番号347344)(10μl)及び抗CD14−APC(BD PharMingen、カタログ番号555399)(10μl)をウェルに加え、そして暗所で30〜40分間氷上に保持した。次いで100μlの血液をプレートから除去し、nunc−immunoチューブ(VWR、West Chester, PA、カタログ番号443990)に移し、そしてFACS溶解溶液(BD Pharmingen、カタログ番号349202)(2ml)を1:10の水希釈で加え、ボルテックスして室温で10分間脇に置いた。10分後、血液を1200rpmで10分間遠心分離し、細胞をFACS洗浄緩衝液(PBS、0.02%のアジド、Sigma、カタログ番号S2002及び2%のウシ胎仔血清、Gibco、カタログ番号16140−071)で洗浄した。次いで細胞を、1%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science、カタログ番号15710)(250ml)で固定し、そしてチューブをFACS caliburを用いて読み取り、更にそのデータをCellQuestソフトウェアを用いて解析した(表20及び21参照)。図8は、(a)リンパ球、(b)単球、及び(c)PMNについての10μg/mlの1A9.A6.B9抗体濃度でのFACSの結果を示す。1A9.A6.B9抗体の結果は灰色で、そしてベースライン発現は黒色で示す。
〔実施例9〕
抗CD44抗体1A9.A6.B9の単回投与インビボ試験は、カニクイザルの末梢CD3+T細胞上のCD44発現の用量依存的な低下を誘導する
抗CD44抗体によって誘導されるリンパ球(図9A参照)及び単球(図9B参照)からのCD44表面発現の減少を、Charles River Primates,BRF(Bio Research Facility、House Texas)から供給されたカニクイザルに対し、1、10及び100mg/kg(各用量群につき2匹の雄と2匹の雌)での1A9.A6.B9の単回静脈内投与(25nMの酢酸ナトリウム中10mg/ml、140mMのNaCl、0.2mg/mlのポリソルベート−80、pH5.5)により調べた。血液試料(約2ml)を2回の前処置の絶食サルから静脈穿刺により採取し、そして3色(CD3+、CD14+、CD44+)フローサイトメトリー解析を投与後2、24、48、168、336及び504時間に行なった。
抗CD44抗体1A9.A6.B9の単回投与インビボ試験は、カニクイザルの末梢CD3+T細胞上のCD44発現の用量依存的な低下を誘導する
抗CD44抗体によって誘導されるリンパ球(図9A参照)及び単球(図9B参照)からのCD44表面発現の減少を、Charles River Primates,BRF(Bio Research Facility、House Texas)から供給されたカニクイザルに対し、1、10及び100mg/kg(各用量群につき2匹の雄と2匹の雌)での1A9.A6.B9の単回静脈内投与(25nMの酢酸ナトリウム中10mg/ml、140mMのNaCl、0.2mg/mlのポリソルベート−80、pH5.5)により調べた。血液試料(約2ml)を2回の前処置の絶食サルから静脈穿刺により採取し、そして3色(CD3+、CD14+、CD44+)フローサイトメトリー解析を投与後2、24、48、168、336及び504時間に行なった。
FACS分析によるCD44発現を検出するために、末梢血(100μl)を、CD14−FITC(クローンM5E2、BD−Pharm、カタログ番号67509)(20μl)、CD3−PerCP(BD−Pharm、カタログ番号13043)(20μl)及びCD44−PE(IM7、BD−Pharm、カタログ番号8900)(10μl)の組み合わせか、又はCD14−FITC(クローンM5E2、BD−Pharm、カタログ番号67509)(20μl)、CD3−PerCP(BD−Pharm、カタログ番号13043)(20μl)及びRt IgG2b−PE(IM7、BD−Pharm、カタログ番号60254)(10μl)の組み合わせと混合した。抗体を、低中程度の速度で1秒間ボルテックスを用いて血液と混合した。抗体を有する血液を4℃で20から30分間インキュベートし、1:10FACS溶解溶液(B.D.Pharmingen, San Diego, CA)(1.5ml)を各チューブに加えた。各チューブは、低度/中程度の速度で1〜3秒間ボルテックスで混合した。チューブを、暗所でおよそ12分間室温でインキュベートした。完全溶解を確実にするために、各チューブの不透明性をチェックし、そして追加のFACSリーゼ(lyse)(500μl)を濁って見えたチューブに加えた。追加のBD染色緩衝液(BD、PharMingen, San Diego, CA、カタログ番号55465C)(2ml)を加えた;チューブを再キャッピングして、チューブの転倒によって混合した。次いでチューブをスイング型ローターに入れ、室温で6〜7分間250×gで遠心した。細胞ペレットを染色緩衝液で洗浄した。cytofix緩衝液(4%w/vのパラアルデヒドを含むPBS)(100μl)を細胞に加えた。試料は、それらがFACSCaliburで得られるまで、4℃で暗所に保持した。cytofix緩衝液(4%w/vのパラアルデヒドを含むPBS)(100μl)を細胞に加えた。試料をcytofix緩衝液中暗所に4℃で保管した。PBS(100μl)を、細胞をFACSCaliburで解析する前に全チューブに加えた。ゲーテッドリンパ球上の全20000事象を採集した。
〔実施例10〕
エピトープ分類試験
競合結合解析をBIAcoreTMを用いて行なった。
エピトープ分類試験
競合結合解析をBIAcoreTMを用いて行なった。
BIAcoreエピトープマッピング実験:
抗CD44抗体、1A9.A6.B9、2D1.A3.D12及び14G9.B8.B4のエピトープマッピングを、BIAcoreTMでのランニング競合アッセイにより行った(抗体濃度は表22を、そしてエピトープマップは表23を参照)。表面プラズモン共鳴によるバイオセンサー生体特異性相互作用解析装置(BIAcore2000)を用いて、CM5センサーチップでの分子間相互作用を測定した。センサーチップのデキストラン側に対する分子の相互作用により生じる2媒体、ガラスとカルボキシメチル化デキストラン間の屈折率の変化を測定し、製造業者のアプリケーション・ノートとして詳述されている任意の反射率単位(RU)の変化として報告した。
抗CD44抗体、1A9.A6.B9、2D1.A3.D12及び14G9.B8.B4のエピトープマッピングを、BIAcoreTMでのランニング競合アッセイにより行った(抗体濃度は表22を、そしてエピトープマップは表23を参照)。表面プラズモン共鳴によるバイオセンサー生体特異性相互作用解析装置(BIAcore2000)を用いて、CM5センサーチップでの分子間相互作用を測定した。センサーチップのデキストラン側に対する分子の相互作用により生じる2媒体、ガラスとカルボキシメチル化デキストラン間の屈折率の変化を測定し、製造業者のアプリケーション・ノートとして詳述されている任意の反射率単位(RU)の変化として報告した。
センサーチップ上のフローセルのカルボキシメチル化デキストラン表面は、0.2MのN−エチル−N’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの7分間の介在による、0.05MのN−ヒドロキシスクシンイミドを用いる誘導体化により活性化された。10mMの酢酸ナトリウム中、pH3.5において30μg/mlの濃度でのCD44−Igを、手動により5μl/分の速度でフローセルに注入し、そしてRUの所望量でフローセル表面に共有結合により固定化した。未反応N−ヒドロキシスクシンイミドエステルの非活性化を、1Mのエタノールアミン塩酸塩を用いてpH8.5で行なった。固定化に続き、フローセルから全ての未反応の又は結合不十分の物質を、安定なベースラインが得られるまで、50mMのNaOH(5μl)の5回の再生注入により取り除いた。フローセル2ではおよそ62RUが測定され、フローセル3ではおよそ153RUが測定された。フローセル1、活性化ブランク表面には、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液(35μl)を、抗原の代わりに固定化中に注入した。フローセル4はおよそ200RUの固定化CTLA4−Igを、無関連抗原コントロールとして含有した。
ランニング/希釈緩衝液(HBS−EP)を用いて、エピトープマッピング実験を行なった。流速は5μl/分、機器温度は20℃であった。抗体の各対の結合後、次いでフローセル表面を50mMのNaOH(5μl)の注入を用いてベースラインまで再生した。ランニング緩衝液中の精製抗体(25μl)を30μg/mlに希釈して注入した。
フローセル表面を一次抗体で飽和させ、直ちに二次抗体の注入を続けた。次いで二次抗体の結合を、固定化CD44−Ig表面への「結合」「非結合」「部分結合」のように評価した。結合評価を行った後、表面を再生し、そして同じ一次抗体を再注入し、パネルの次の抗体に続けた。この注入スキームは、パネル中の全抗体のCD44−Igへの結合が評価されるまで続けられる。別の抗体が一次として選択され、そして他の抗体がCD44−Igに結合する二次抗体として評価される。具体的に、抗CD44抗体14G9.B8.B4を一次抗体として評価する場合、それは、結合に関して14G9.B8.B4のオフレートが速いので、それを二次抗体と共注入した。
パネルの全抗体に対する一次注入として全抗体を試験した後、1つのエピトープ群への類似結合パターンを組み合わせる縮小マトリックスが作製される。次いでトポロジーマップを縮小マトリックスに従って引くことができる。結合マトリックスは、異なるエピトープ間で干渉を示すCD44−Ig抗原のトポロジー表面マップから解釈できる。そのようなマップは機能的関連性のみを示し、そして必ずしも抗原表面の実際の物理的構造に何らかの対応を持つものではない。
BIAcore競合結合解析により、mAbの1A9.A6.B9及び14G9.B8.B4によって認識されるエピトープが、抗体515によって認識されるエピトープと重複することが示された。更に、BIAcoreTM研究の結果、 mAbの1A9.A6.B9及び14G9.B8.B4は、抗体IM7と重複しないことが示された。
〔実施例11〕
抗CD44抗体の選択性
リンパ管内皮ヒアルロナン受容体1タンパク質(LYVE−1)(R&D、カタログ番号2089−Ly)に対するCD44抗体の結合親和性を測定し、抗CD44抗体がLYVE−1よりも、CD44に対して100倍大きい選択性を有することを見出した(表24参照)。96ウェルELISAプレート(Immuno Maxisorpプレート、Nunc、カタログ番号442404)をCD44−Ig融合タンパク質(50ng)又はLYVE−1でコーティングし、そして4℃で一夜インキュベートした。次いでプレートをPBS、0.05%Tween−20で洗浄し、室温で2時間PBS中3%BSAによりブロックした。抗CD44抗体又は抗LYVE−1抗体(R&D、カタログ番号AF2089を、PBS中1%BSA中で種々の濃度に希釈し、プレートに加えた。ELISAプレートを室温で1.5時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗CD44抗体に対する抗ヒトカッパ軽鎖−HRP抗体(Bethyl、カタログ番号A80−115P.6)か又は抗LYVE−1抗体(Cappel/ICN、カタログ番号55363)に対する抗ヤギIgG−HRPのいずれか(50μl)を、PBS中1%BSAで1:2000希釈して各ウェルに加え、更に1時間室温でインキュベートした。プレートを再度洗浄し、そして50μg/mlのTMBを加え、5〜10分間インキュベートした。ELISA反応を停止溶液で停止させ、OD450値プレートリーダーにより測定した。
抗CD44抗体の選択性
リンパ管内皮ヒアルロナン受容体1タンパク質(LYVE−1)(R&D、カタログ番号2089−Ly)に対するCD44抗体の結合親和性を測定し、抗CD44抗体がLYVE−1よりも、CD44に対して100倍大きい選択性を有することを見出した(表24参照)。96ウェルELISAプレート(Immuno Maxisorpプレート、Nunc、カタログ番号442404)をCD44−Ig融合タンパク質(50ng)又はLYVE−1でコーティングし、そして4℃で一夜インキュベートした。次いでプレートをPBS、0.05%Tween−20で洗浄し、室温で2時間PBS中3%BSAによりブロックした。抗CD44抗体又は抗LYVE−1抗体(R&D、カタログ番号AF2089を、PBS中1%BSA中で種々の濃度に希釈し、プレートに加えた。ELISAプレートを室温で1.5時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗CD44抗体に対する抗ヒトカッパ軽鎖−HRP抗体(Bethyl、カタログ番号A80−115P.6)か又は抗LYVE−1抗体(Cappel/ICN、カタログ番号55363)に対する抗ヤギIgG−HRPのいずれか(50μl)を、PBS中1%BSAで1:2000希釈して各ウェルに加え、更に1時間室温でインキュベートした。プレートを再度洗浄し、そして50μg/mlのTMBを加え、5〜10分間インキュベートした。ELISA反応を停止溶液で停止させ、OD450値プレートリーダーにより測定した。
〔実施例12〕
MEM−85及び1A9.A6.B9抗CD44抗体の結合競合研究
本発明のヒト抗CD44抗体が、市販の抗CD44抗体MEM−85(Caltag Laboratories, Burlingame, CA、カタログ番号MHCD−4404−4)のように、CD44分子の同じか又は異なる部位に結合するかを明らかにするFACS研究を行った。
MEM−85及び1A9.A6.B9抗CD44抗体の結合競合研究
本発明のヒト抗CD44抗体が、市販の抗CD44抗体MEM−85(Caltag Laboratories, Burlingame, CA、カタログ番号MHCD−4404−4)のように、CD44分子の同じか又は異なる部位に結合するかを明らかにするFACS研究を行った。
レトロウイルスベクター上ヒトCD44で形質導入したCD3+ヒト末梢T細胞及び300−19細胞のいずれかを使用して、FACSに基づくCD44競合結合アッセイを実施した。ヒト末梢血を、ヘパリン(Becton Dickinson、カタログ番号366480)入りのvacutainerチューブで、健常人ボランティアから採取した。
ヒト末梢T細胞のFACS研究:
ヒト末梢血を、健常人ボランティアから、ヘパリン入りのvacutainerチューブ(Becton Dickinson、カタログ番号366480)に採取した。採取したヒト末梢血(100μl)をNunc−Immunoチューブ(VWR、カタログ番号443990)に加え、次いで、抗CD44 Ab 1A9.A6.B9(10μl)を各チューブに加えて、0.2μg/mlから20μg/mlの濃度を得た。チューブを5分間氷上でインキュベートした。5分のインキュベーション後、CD44検出Ab(MEM−85、カタログ番号MHCD−4404−4)及び抗CD3-PerCP(BD−Pharmingen、カタログ番号347344)(20μl)、抗CD14−APC(BD Pharmingen、カタログ番号555349)(10μl)、及び抗CD4−APC(BD Pharmingen、カタログ番号555349)(10ml)を、各チューブに加えて、暗所にて30から40分間氷上で保持した。FACS溶解溶液(BD Pharmingen、カタログ番号349202、1:10水希釈)(2ml)を加え、ボルテックスして室温で10分間インキュべートした。細胞をFACS洗浄緩衝液、(PBS、Sigma、カタログ番号D8537、0.02%のアジド、Sigma、カタログ番号S2002及び2%のウシ胎仔血清、Gibco、カタログ番号16140−071)で洗浄し、遠心分離後上清を除去した。次いで細胞を、1%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science, Ft Washington, PA、カタログ番号15710)(250μl)で固定した。チューブをBecton Dickson のFACS Caliburを用いて読み取り、更にそのデータをCellQuest Pro(Becton Dickinson)を用いて解析した。
ヒト末梢血を、健常人ボランティアから、ヘパリン入りのvacutainerチューブ(Becton Dickinson、カタログ番号366480)に採取した。採取したヒト末梢血(100μl)をNunc−Immunoチューブ(VWR、カタログ番号443990)に加え、次いで、抗CD44 Ab 1A9.A6.B9(10μl)を各チューブに加えて、0.2μg/mlから20μg/mlの濃度を得た。チューブを5分間氷上でインキュベートした。5分のインキュベーション後、CD44検出Ab(MEM−85、カタログ番号MHCD−4404−4)及び抗CD3-PerCP(BD−Pharmingen、カタログ番号347344)(20μl)、抗CD14−APC(BD Pharmingen、カタログ番号555349)(10μl)、及び抗CD4−APC(BD Pharmingen、カタログ番号555349)(10ml)を、各チューブに加えて、暗所にて30から40分間氷上で保持した。FACS溶解溶液(BD Pharmingen、カタログ番号349202、1:10水希釈)(2ml)を加え、ボルテックスして室温で10分間インキュべートした。細胞をFACS洗浄緩衝液、(PBS、Sigma、カタログ番号D8537、0.02%のアジド、Sigma、カタログ番号S2002及び2%のウシ胎仔血清、Gibco、カタログ番号16140−071)で洗浄し、遠心分離後上清を除去した。次いで細胞を、1%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science, Ft Washington, PA、カタログ番号15710)(250μl)で固定した。チューブをBecton Dickson のFACS Caliburを用いて読み取り、更にそのデータをCellQuest Pro(Becton Dickinson)を用いて解析した。
ヒトCD44分子で形質導入した300−19細胞のFACS研究:
106細胞/mlの300−19細胞(100ml)を、Nunc−Immuno(VWR、カタログ番号443990)に加えた。次いで細胞を抗CD44 Ab(10μl)と混合して、0から10μg/mlの最終濃度を達成し(図10A参照)、氷上で5分間インキュベートした。インキュベーション後、抗CD44抗体検出Ab MEM−85(Caltag Laboratories, Burlingame, CA、カタログ番号MHCD−4404−4)(20μl)を各チューブに加えて、その細胞を30〜40分間氷上でインキュベートした。FACS洗浄緩衝液(PBS、Sigma、D8537、0.02%のアジド、Sigma、S2002及び2%のウシ胎仔血清、Gibco、カタログ番号16140−071)で洗浄した。12000rpmで10分間遠心分離して、上清を除去した。細胞を、1%パラホルムアルデヒド(Electron Microscope Science, Ft Washington, PA、カタログ番号15710)(250μl)で固定した。チューブをBecton DicksonのFACS Caliburを用いて読み取り、更にそのデータをCellQuest Pro(Becton Dickinson)を用いて解析した。
106細胞/mlの300−19細胞(100ml)を、Nunc−Immuno(VWR、カタログ番号443990)に加えた。次いで細胞を抗CD44 Ab(10μl)と混合して、0から10μg/mlの最終濃度を達成し(図10A参照)、氷上で5分間インキュベートした。インキュベーション後、抗CD44抗体検出Ab MEM−85(Caltag Laboratories, Burlingame, CA、カタログ番号MHCD−4404−4)(20μl)を各チューブに加えて、その細胞を30〜40分間氷上でインキュベートした。FACS洗浄緩衝液(PBS、Sigma、D8537、0.02%のアジド、Sigma、S2002及び2%のウシ胎仔血清、Gibco、カタログ番号16140−071)で洗浄した。12000rpmで10分間遠心分離して、上清を除去した。細胞を、1%パラホルムアルデヒド(Electron Microscope Science, Ft Washington, PA、カタログ番号15710)(250μl)で固定した。チューブをBecton DicksonのFACS Caliburを用いて読み取り、更にそのデータをCellQuest Pro(Becton Dickinson)を用いて解析した。
FACS競合結合解析の結果、mAb 1A9.A6.B9によって認識されたエピトープは、CD44分子上のLINKドメインにマッピングしているMEM−85抗体によって認識されたエピトープと重複することを示した。Bajorath, J. et al., (1998) JBC, 273:338-343 (図10A−B参照)。
〔実施例13〕
1A9.A6.B9(HIS lyo & CIT Lyo)の2凍結乾燥(凍乾)製剤を、下記の表25のように作製した。製剤は、20mg/mL 1A9.A6.B9、ヒスチジン又はクエン酸緩衝液、ポリソルベート80、EDTA、及びトレハロース・二水和物を含有した。液体製剤(HIS液)についても、下記の表25に示すように調製した(1A9.A6.B9)。液体製剤の組成は:10mg/mLの1A9.A6.B9、20mMのヒスチジン緩衝液、0.2mg/mLのポリソルベート80、0.05mg/mLのEDTA、84mg/mLのトレハロース・二水和物及び0.1mg/mLのL−メチオニンであった。
1A9.A6.B9(HIS lyo & CIT Lyo)の2凍結乾燥(凍乾)製剤を、下記の表25のように作製した。製剤は、20mg/mL 1A9.A6.B9、ヒスチジン又はクエン酸緩衝液、ポリソルベート80、EDTA、及びトレハロース・二水和物を含有した。液体製剤(HIS液)についても、下記の表25に示すように調製した(1A9.A6.B9)。液体製剤の組成は:10mg/mLの1A9.A6.B9、20mMのヒスチジン緩衝液、0.2mg/mLのポリソルベート80、0.05mg/mLのEDTA、84mg/mLのトレハロース・二水和物及び0.1mg/mLのL−メチオニンであった。
上で調製した各製剤を2〜8℃、及び加速安定性条件下(25及び40℃)で52週間保存した(クエン酸緩衝液を含有する凍結乾燥製剤は22週だけ保存した)。試料を、4、8、13、22及び52週時に分析した。各時点で、肉眼で微粒子の存在、色の変化、及び透明度を分析した。pH測定も行った。凝集体の存在は、SE−HPLCでモニタリングした。試験した製剤は全て肉眼的に透明で、無色でかつ粒子はないままであり、またpHの大きな変化は示さなかった。加えて、200mMのリン酸緩衝液でpH7.0の移動相を使用し、直列の2カラム(GS SW3000XL及びGS SW2000XL)を用いたSE−HPLCによって測定して、表25の製剤の全て、並びに2〜8℃及び25℃で52週間、及び40℃で22週間(図11a、b及びc)保存した後、コントロールとして試験した液体製剤で、97%以上もの良好なmAbモノマー回収率(<3%凝集体形成)が得られた。HPLCの流速は、40分の分析時間で0.7mL/分に維持した。
各製剤はイメージングキャピラリー等電点電気泳動法(iCE)によって解析し、52週の冷蔵貯蔵(2〜8℃)後及び加速温度条件(25℃で52週間並びに40℃で22週)下の、1A9.A6.B9電荷変化体(酸性、親及び塩基性種)の形成を評価した。これらの電荷種の分離は、キャピラリー内で行ない、これらの種の可視化及び定量化はUV検出器及びCCDカメラを用いて行なった。iCEアッセイの結果(酸性種)を、図12a、b及びcに示す。結果は、全ての製剤が2〜8℃及び25℃で52週間の貯蔵後類似の酸性種形成を有することを示す。40℃では、凍結乾燥製剤が、コントロールより低い酸性種形成を示すことを報告した。
各製剤は、また、SE−HPLCによって分析し、52週の冷蔵貯蔵(2〜8℃)後及び加速温度条件(25℃で52週間並びに40℃で22週)下に、mAbの高い及び低いサイズ変化体の形成を評価した。本方法は、経時的なクリップ形成及び凝集体形成のレベルを含む、mAb純度の優れた測定法を提供する。SDS−PAGE分析の結果を表26、27及び28に示す。
また、各製剤を、52週の冷蔵貯蔵(2〜8℃)後及び加速温度条件(25℃で52週間並びに40℃で22週)下に、重鎖のメチオニン−位置256でのメチオニン酸化の形成を評価するために分析した。モノクローナル抗体製品を、Lys−Cで消化し、メチオニン含有ペプチドフラグメント及びその各酸化体をモニタリングした。表26、27及び28は、メチオニンの酸化アッセイの結果を示す。
また、各製剤を、52週の冷蔵貯蔵(2〜8℃)後及び加速温度条件(25℃で52週間並びに40℃で22週)下の相対的生物活性を評価するために分析した。生物活性分析の結果を、表26、27及び28に示す。
〔実施例14〕
BiacoreTM解析による、ヒト及びカニクイザルCD44に対する1A9.A6.B9の結合親和性
別のBiacoreTM解析を行って、ヒト及びカニクイザルCD44に対する1A9.A6.B9抗体の結合親和性を証明した。ヒトCD44−Ig(55RU、86RU)及びcynoCD44−Ig(99RU、116RU)を、pH3.5の10mMの酢酸ナトリウム中、10μg/mlの濃度でCM−5チップに固定化した。変動濃度の1A9.A6.B9(半対数希釈で100μg/mlから0.1μg/ml)を、5μl/分の流速でチップ上に流した。次いでチップを50mMのNaOHで再生し、そしてHBS−EP(BIAcore 22−0512−44)で洗浄した。分析は、Biacore 2000で行なった。データをBIAEvaluationTMソフトウェアを用いて解析した(n=2)。
BiacoreTM解析による、ヒト及びカニクイザルCD44に対する1A9.A6.B9の結合親和性
別のBiacoreTM解析を行って、ヒト及びカニクイザルCD44に対する1A9.A6.B9抗体の結合親和性を証明した。ヒトCD44−Ig(55RU、86RU)及びcynoCD44−Ig(99RU、116RU)を、pH3.5の10mMの酢酸ナトリウム中、10μg/mlの濃度でCM−5チップに固定化した。変動濃度の1A9.A6.B9(半対数希釈で100μg/mlから0.1μg/ml)を、5μl/分の流速でチップ上に流した。次いでチップを50mMのNaOHで再生し、そしてHBS−EP(BIAcore 22−0512−44)で洗浄した。分析は、Biacore 2000で行なった。データをBIAEvaluationTMソフトウェアを用いて解析した(n=2)。
限定されないが、全ての論文、刊行物、特許、特許出願、プレゼンテーション、テキスト、レポート、原稿、パンフレット、書籍、インターネット・ポジティング、学術論文、定期刊行物、製品ファクトシート等を含む、本明細書に引用されている全ての参考文献は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書の参考文献の議論・考察は、それらの著者らによってなされる主張を単に要約することを意図しており、またどの参考文献が先行技術を構成するものと自白するものではなく、そして引用した参考文献の正確さと適切さにチャレンジする出願人の権利を留保するものである。
前述の発明を、理解を明瞭にする目的で図面と実施例により若干詳細に説明してきたが、本発明の教示の観点から当業者には当然のことながら、添付した特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなしに、一定の変更及び修正をそれに加えることは可能である。
Claims (25)
- a)配列番号17に示されるVHCDR1、配列番号19に示されるVHCDR2、そして配列番号21に示されるVHCDR3;
b)配列番号53に示されるVHCDR1、配列番号55に示されるVHCDR2、そして配列番号57に示されるVHCDR3;
c)配列番号89に示されるVHCDR1、配列番号91に示されるVHCDR2、そして配列番号93に示されるVHCDR3;及び
d)配列番号125に示されるVHCDR1、配列番号127に示されるVHCDR2、そして配列番号129に示されるVHCDR3;
から成る群から選択される、CDR1、CDR2、及びCDR3領域を含む重鎖可変(VH)ドメインアミノ酸配列を含む、ヒトCD44に特異的に結合する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分。 - a)配列番号23に示されるVLCDR1、配列番号25に示されるVLCDR2、そして配列番号27に示されるVLCDR3;
b)配列番号59に示されるVLCDR1、配列番号61に示されるVLCDR2、そして配列番号63に示されるVLCDR3;
c)配列番号95に示されるVLCDR1、配列番号97に示されるVLCDR2、そして配列番号99に示されるVLCDR3;及び
d)配列番号131に示されるVLCDR1、配列番号133に示されるVLCDR2、そして配列番号135に示されるVLCDR3;
から成る群から選択される、CDR1、CDR2、及びCDR3領域を含む軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列を更に含む、請求項1に記載の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分。 - 配列番号17に示されるVHCDR1、配列番号19に示されるVHCDR2、配列番号21に示されるVHCDR3、配列番号23に示されるVLCDR1、配列番号25に示されるVLCDR2、及び配列番号27に示されるVLCDR3を含む、請求項2に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
- 配列番号89に示されるVHCDR1、配列番号91に示されるVHCDR2、配列番号93に示されるVHCDR3、配列番号95に示されるVLCDR1、配列番号97に示されるVLCDR2、及び配列番号99に示されるVLCDR3を含む、請求項2に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
- VHドメインアミノ酸配列が、配列番号11、47、83及び119から成る群から選択され、又は保存的アミノ酸置換を有することにより配列番号11、47、83及び119のうちのいずれか1つと異なる、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- アミノ酸配列において、配列番号11、47、83及び119のうちのいずれか1つに少なくとも95%同一であるVHドメインを含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- VLドメインアミノ酸配列が、配列番号15、51、87及び123から成る群から選択され、又は保存的アミノ酸置換を有することにより配列番号15、51、87及び123のうちのいずれか1つと異なる、請求項2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- アミノ酸配列において、配列番号15、51、87及び123のうちのいずれか1つに少なくとも95%同一であるVLドメインを含む、請求項2に記載の抗体又はその抗原結
合部分。 - (VH)ドメインアミノ酸配列及び(VL)ドメインアミノ酸配列が、
a)配列番号11に示されるVHドメイン及び配列番号15に示されるVLドメイン;
b)配列番号47に示されるVHドメイン及び配列番号51に示されるVLドメイン;
c)配列番号83に示されるVHドメイン及び配列番号87に示されるVLドメイン;及び
d)配列番号119に示されるVHドメイン及び配列番号123に示されるVLドメイン;
から成る群から選択される、請求項7に記載の抗体又はその抗原結合部分。 - 配列番号11に示されるVHドメイン及び配列番号15に示されるVLドメインを含む、請求項9に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- 配列番号83に示されるVHドメイン及び配列番号87に示されるVLドメインを含む、請求項9に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- a)配列番号9に示される重鎖、及び配列番号13に示される軽鎖;
b)配列番号45に示される重鎖、及び配列番号49に示される軽鎖;
c)配列番号81に示される重鎖、及び配列番号85に示される軽鎖;及び
d)配列番号117に示される重鎖、及び配列番号121に示される軽鎖;
から成る群から選択される重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を含む、CD44に特異的に結合する単離されたヒト抗体。 - 配列番号9に示される重鎖及び配列番号13に示される軽鎖を含む、請求項12に記載の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分。
- 配列番号9に示される重鎖及び配列番号13に示される軽鎖を含む、請求項12に記載の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分。
- IgGである、請求項9に記載の抗体。
- IgGがIgG2である、請求項15に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分、及び場合により薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物。
- 請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分の有効量を対象に投与する工程を含む、抗CD44抗体又はその抗原結合部分を用いて、それを必要とする対象のCD44媒介疾患の症状を治療、予防又は軽減する方法。
- CD44媒介疾患が炎症性又は自己免疫疾病である、請求項17に記載の治療方法。
- 疾患が関節リウマチ、若年性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、肉芽腫性疾患、多発性硬化症、喘息、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬及びがんから成る群から選択される、請求項18に記載の治療方法。
- 請求項1に記載の抗体の重鎖又はその抗原結合部分及び/又は軽鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- ベクターが場合により核酸分子に機能可能に連結した発現制御配列を含む、請求項21に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項22に記載のベクターを含む宿主細胞。
- ハイブリドーマが、2D1.A3.D12.(ATCC No.PTA−6929)(LN15920)、1A9.A6.B9(ATCC No.PTA−6927)(LN15922)及び14G9.B8.B4.(ATCC No.PTA−6928)(LN15921)から成る群から選択される、請求項1に記載のヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
- ハイブリドーマが、1A9.A6.B9(ATCC No.PTA−6927)(LN15922)である、請求項24に記載のハイブリドーマ細胞系。
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