JP7023853B2 - 抗trem1抗体及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、すべての目的のために出典明示によって援用される2016年3月4日に出願された米国特許仮出願番号第62/304018号の利益を主張する。
本明細書において記載又は参照される技術及び手順は、全般的に十分に理解されており、例えば、Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.;Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel等編、(2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press、Inc.):PCR 2:A Practical Approach (M.J. MacPherson、B.D. Hames及びG.R. Taylor編(1995))、Harlow及びLane編. (1988) Antibodies、A Laboratory Manual、and Animal Cell Culture (R.I. Freshney編(1987));Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編、1984);Methods in Molecular Biology、Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E. Cellis編、1998)Academic Press; Animal Cell Culture(R.I. Freshney)編、1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及びP.E. Roberts、1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures (A. Doyle、J.B. Griffiths及びD.G. Newell編、1993-8) J. Wiley及びSons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及びC.C. Blackwell編);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller及びM.P. Calos編、1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction、(Mullis等編、1994);Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等編、1991);Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及びSons、1999);Immunobiology(C.A. Janeway及びP. Travers、1997);Antibodies (P. Finch、1997);Antibodies:A Practical Approach(D. Catty.編、IRL Press、1988-1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach (P. Shepherd及びC. Dean編、Oxford University Press、2000);Using Antibodies: A Laboratory Manual(E. Harlow及びD. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);The Antibodies (M. Zanetti及びJ. D. Capra編、Harwood Academic Publishers、1995);並びにCancer:Principles and Practice of Oncology(V.T. DeVita等編、J.B. Lippincott Company、1993)に記載される広く利用される方法論などの当業者によって従来の方法論を使用してよく用いられている。
本明細書において、用語「防止すること」は、個体における特定の疾患、障害又は状態の発生又は再発に関して予防を提供することを含む。個体は、特定の疾患、障害又は状態の素因があり得る、それに対して感受性があり得る、又はこのような疾患、障害又は状態が発達するリスクにあり得るが、疾患、障害又は状態を有するとまだ診断されていない。
本開示は、一又は複数のアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する抗TREM1抗体、このような抗体を作製及び使用する方法、このような抗体を含有する薬学的組成物、このような抗体をコードする核酸及びこのような抗体をコードする核酸を含有する宿主細胞に関する。
一態様では、本開示は、本開示のTREM1タンパク質と結合し、細胞において発現されたTREM1タンパク質との結合後に、一又は複数のTREM1活性を誘導し、及び/又は一又は複数のTREM1活性を増強する抗体を提供する。TREM1は、限定するものではないが、マクロファージ、樹状細胞、単球、皮膚のランゲルハンス細胞、クッパー細胞、破骨細胞、好中球及びミクログリアを含むミエロイド系統細胞で主に発現される、234個のアミノ酸の免疫グロブリン様受容体膜タンパク質である。いくつかの例では、TREM1は、DAP12と受容体シグナル伝達複合体を形成する。いくつかの例では、TREM1は、リン酸化し、DAP12(ITAMドメインアダプタータンパク質)を介してシグナル伝達し得る。TREM1シグナル伝達は、PI3K又はその他の細胞内シグナルの下流活性化をもたらし得る。ミエロイド細胞では、Toll様受容体(TLR)シグナルは、例えば、感染反応との関連でTREM1活性の活性化にとって重要である。TLR、例えば、マクロファージ及び樹状細胞において発現されたTLRはまた、病的炎症反応において重要な役割を果たす。
一態様では、本開示は、細胞において発現されたDAP12タンパク質の一又は複数のDAP12活性をさらに調節し得る抗TREM1抗体を提供する。いくつかのシグナル伝達経路では、DAP12中のアスパラギン酸残基は、アミノ酸残基217にリシンを含有するヒトTREM1の膜貫通ドメインと相互作用し、TREM2、TREM1及びその他の関連IgVファミリーメンバータンパク質からのシグナル伝達を伝達する。
MGGLEPCSRL LLLPLLLAVS GLRPVQAQAQ SDCSCSTVSP GVLAGIVMGD LVLTVLIALA
VYFLGRLVPR GRGAAEAATR KQRITETESP YQELQGQRSD VYSDLNTQRP YYK
本開示の特定の態様は、TREM1と特異的に結合する抗体に関する。いくつかの実施態様では、本開示の抗体は、成熟TREM1タンパク質と結合する。いくつかの実施態様では、本開示の抗体は、細胞上に発現された成熟TREM1タンパク質と結合する。いくつかの実施態様では、本開示の抗体は、ヒト樹状細胞、ヒトマクロファージ、ヒト単球、ヒト好中球、ヒト破骨細胞、ヒト皮膚のランゲルハンス細胞、ヒトクッパー細胞、ヒトミクログリア及びそれらの任意の組合せから選択される一又は複数のヒト細胞上に発現されたTREM1タンパク質と結合する。いくつかの実施態様では、本開示の抗体は、アゴニスト抗体である。いくつかの実施態様では、本開示の抗体は、不活性抗体である。いくつかの実施態様では、本開示の抗体は、アンタゴニスト抗体である。
本発明の抗TREM1抗体の一クラスとして、アゴニスト抗体がある。例えば、TREM1受容体は、シグナルを伝達するために細胞表面でのクラスター化を必要とすると考えられるので、アゴニスト抗体は、例えば、TREM1受容体を刺激する独特の特徴を有し得る。例として、アゴニスト抗TREM1抗体は、受容体活性化と適合する妥当なエピトープ特異性並びに細胞表面での受容体クラスター化を誘導又は保持する能力を有し得る。さらに、本開示のアゴニスト抗TREM1抗体は、一又は複数のTREM1リガンドの同時結合を遮断せずに、TREM1と結合する能力を示し得る。本明細書において開示の抗TREM1抗体は、一又は複数のTREM1リガンドとの相加的及び/又は相乗的機能的相互作用をさらに示し得る。したがって、いくつかの実施態様では、TREM1の最大活性は、本開示の一又は複数のTREM1リガンドと組み合わせて本開示の抗TREM1抗体に結合された場合に、飽和濃度のリガンド単独又は飽和濃度の抗体単独に曝露された場合のTREM1の最大活性よりも大きい(例えば、増強される)ことがある。さらに、抗体の存在下で、所与の濃度のTREM1リガンドでのTREM1の活性が、より大きい(例えば、増強される)ことがある。したがって、いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、TREM1タンパク質に結合された場合に、一又は複数のTREM1活性を増強する、一又は複数のTREM1リガンドとの相加作用を有する。いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、一又は複数のTREM1リガンドと協力して、一又は複数のTREM1活性を増強する。いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、一又は複数のTREM1リガンドの、一又は複数のTREM1活性を誘導する効力を、抗体の不在下での一又は複数のTREM1リガンドの、一又は複数のTREM1活性を誘導する効力と比較して増大する。いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、TREM1の細胞表面クラスター化の不在下で、一又は複数のTREM1活性を増強する。いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、TREM1の細胞表面クラスター化を誘導又は保持することによって、一又は複数のTREM1活性を増強する。いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、限定するものではないが、B細胞及びミクログリア細胞を含む一又は複数の免疫細胞上に発現された一又は複数のFc-γ受容体によってクラスター化される。いくつかの実施態様では、一又は複数のTREM1リガンドの、TREM1タンパク質との結合によって誘導された一又は複数のTREM1活性の増強は、限定するものではないが、樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、単球、ミクログリア、マクロファージ、好中球、NK細胞、破骨細胞、皮膚のランゲルハンス細胞及びクッパー細胞を含む初代細胞で、又は細胞株で測定され、一又は複数のTREM1リガンドの、TREM1タンパク質との結合によって誘導される一又は複数のTREM1活性の増強は、例えば、in vitro細胞アッセイを利用して測定される。
T細胞、Tヘルパー細胞又は細胞傷害性T細胞のうち一又は複数による腫瘍細胞死滅を活性化すること、(u)ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、好中球、T細胞、Tヘルパー細胞又は細胞傷害性T細胞のうち一又は複数の抗腫瘍細胞増殖活性を活性化すること、(v)ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、好中球、T細胞、Tヘルパー細胞又は細胞傷害性T細胞のうち一又は複数の抗腫瘍細胞転移活性を活性化すること、(w)一又は複数のITAMモチーフ含有受容体を活性化することであって、任意選択的に、一又は複数のITAMモチーフ含有受容体が、TREM1、TREM1、FcγR、DAP10及びDAP12から選択される、活性化すること、(x)一又は複数のパターン認識受容体(PRR)によるシグナル伝達を活性化することであって、任意選択的に、一又は複数のPRRが、病原体関連分子パターン(PAMP)を同定する受容体、損傷関連分子パターン(DAMP)を同定する受容体及びそれらの任意の組合せから選択される、活性化すること、(y)一又は複数の、モチーフD/Ex0-2YxxL/IX6-8YxxL/Iを含む受容体を活性化すること、(z)一又は複数のToll様受容体によるシグナル伝達を活性化すること、(aa)JAK-STATシグナル伝達経路を活性化すること、(bb)活性化B細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー(NFκB)を活性化すること、(cc)ITAMモチーフ含有受容体をリン酸化すること、(dd)一又は複数の炎症性受容体の発現を調節することであって、任意選択的に、一又は複数の炎症性受容体が、CD86を含み、一又は複数の炎症性受容体が、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、好中球、T細胞、Tヘルパー細胞又は細胞傷害性T細胞のうち一又は複数で発現される、発現を調節すること、(ee)一又は複数のTREM1依存性遺伝子の発現を増大すること、(gg)撹乱されたTREM1依存性遺伝子発現を正常化すること、(ff)一又は複数のITAM依存性遺伝子の発現を増大することであって、任意選択的に、一又は複数のITAM依存性遺伝子が、活性化T細胞の核内因子(NFAT)転写因子によって活性化される、発現を増大すること、(gg)免疫サプレッサー樹状細胞、免疫サプレッサーマクロファージ、ミエロイド由来サプレッサー細胞、腫瘍関連マクロファージ、免疫サプレッサー好中球及び制御性T細胞のうち一又は複数の分化を阻害すること、(hh)免疫サプレッサー樹状細胞、免疫サプレッサーマクロファージ、ミエロイド由来サプレッサー細胞、腫瘍関連マクロファージ、免疫サプレッサー好中球及び制御性T細胞のうち一又は複数の機能性を阻害すること、(ii)免疫サプレッサー樹状細胞、免疫サプレッサーマクロファージ、ミエロイド由来サプレッサー細胞、腫瘍関連マクロファージ、免疫サプレッサー好中球及び制御性T細胞のうち一又は複数の、腫瘍への浸潤を減少させること、(jj)腫瘍中の、末梢血又はその他のリンパ器官中の腫瘍促進性ミエロイド/顆粒球性免疫抑制細胞数を減少させること、(kk)ミエロイド由来サプレッサー細胞の腫瘍促進活性を阻害すること、(ll)腫瘍における、又は末梢血における腫瘍促進性サイトカインの発現を減少させることであって、任意選択的に、腫瘍促進性サイトカインが、TGFベータ又はIL-10である、発現を減少させること、(mm)腫瘍促進性FoxP3+制御性Tリンパ球の腫瘍浸潤を減少させること、(nn)腫瘍死滅能を有する腫瘍特異的Tリンパ球の活性化を増大すること、(oo)腫瘍量を減少させること、(pp)腫瘍成長速度を減少させること、(qq)抗腫瘍T細胞応答を調節する一又は複数の免疫療法の有効性を増大することであって、任意選択的に、一又は複数の免疫療法が、PD1/PDL1遮断、CTLA-4遮断及び癌ワクチンから選択される、免疫療法の有効性を増大すること、(rr)PLCγ/PKC/カルシウム動員を阻害すること、(uu)PI3K/Akt、Ras/MAPKシグナル伝達を阻害すること、(ss)樹状細胞、マクロファージ、単球及び/又はミクログリアによる食作用を増大すること、(tt)細胞表面でのTREM1クラスター化を誘導又は維持すること、(yy)記憶を増大すること、並びに(zz)認知欠損を低減することが挙げられる。
本開示の別のクラスの抗体は、不活性抗体を含む。本明細書において、「不活性」抗体とは、標的抗原と特異的に結合するが、抗原機能を調節しない(例えば、低減/阻害しない、又は活性化/誘導しない)抗体を指す。例えば、TREM1の場合には、不活性抗体は、リガンド結合及び/又はTREM1活性を調節しない。理論に拘泥するものではないが、細胞表面でTREM1をクラスター化する能力を有さない抗体は、受容体活性化と適合するエピトープ特異性を有する場合でさえ、不活性抗体であり得ると考えられる。
別のクラスの抗体として、アンタゴニスト抗体がある。いくつかの実施態様では、TREM1タンパク質と結合する抗体は、TREM1と結合し、TREM1と、一又は複数のTREM1リガンド間の相互作用を防止することによって、又はリガンドの存在下でTREM1の細胞外ドメインから細胞の細胞質へのシグナルの伝達を防止することの何れかによって、一又は複数のTREM1活性を阻害するアンタゴニスト抗体を含み得る。
いくつかの実施態様では、本明細書において記載されるIgG1変異体の一又は複数は、相補体活性化を排除するために、A330L突然変異(Lazar等、(2006) Proc Natl Acad Sci USA、103:4005-4010)又はL234F、L235E及び/又はP331S突然変異のうち一若しくは複数(Sazinsky等、(2008) Proc Natl Acad Sci USA、105:20167-20172)と組み合わされ得、これでは、アミノ酸位置は、EU又はKabat番号付け慣習に従う。いくつかの実施態様では、本明細書において記載されるIgG変異体は、ヒト血清における抗体半減期を増強するために、一又は複数の突然変異と組み合わされ得る(例えば、EU又はKabat番号付け慣習に従うM252Y、S254T、T256E突然変異)(Dall'Acqua等、(2006)J Biol Chem、281:23514-23524;及びStrohl等、(2009) Current Opinion in Biotechnology、20:685-691)。
上記の節に記載されるような一又は複数のTREM1活性を誘導又は遮断するために、本開示の抗TREM1抗体が試験され得る。
本開示の特定の態様は、ヒトTREM1(配列番号1)のアミノ酸残基21-205内の、又はTREM1相同体若しくは配列番号1のアミノ酸残基21-205に対応するオーソログ上のアミノ酸残基内の一又は複数のアミノ酸と結合する抗TREM1抗体を提供する。いくつかの実施態様では、抗TREM1抗体は、ヒトTREM1(配列番号1)のアミノ酸残基26-134内の、又はTREM1相同体若しくは配列番号1のアミノ酸残基26-134に対応するオーソログ上のアミノ酸残基内の一又は複数のアミノ酸と結合する。いくつかの実施態様では、抗TREM1抗体は、ヒトTREM1(配列番号1)のアミノ酸残基45-54内の、又はTREM1相同体若しくは配列番号1のアミノ酸残基45-54に対応するオーソログ上のアミノ酸残基内の一又は複数のアミノ酸と結合する。いくつかの実施態様では、抗TREM1抗体は、ヒトTREM1(配列番号1)のアミノ酸残基70-79内の、又はTREM1相同体若しくは配列番号1のアミノ酸残基70-79に対応するオーソログ上のアミノ酸残基内の一又は複数のアミノ酸と結合する。いくつかの実施態様では、抗TREM1抗体は、ヒトTREM1(配列番号1)のアミノ酸残基89-97内の、又はTREM1相同体若しくは配列番号1のアミノ酸残基89-97に対応するオーソログ上のアミノ酸残基内の一又は複数のアミノ酸と結合する。いくつかの実施態様では、抗TREM1抗体は、ヒトTREM1(配列番号1)のアミノ酸残基119-125内の、又はTREM1相同体若しくは配列番号1のアミノ酸残基119-125に対応するオーソログ上のアミノ酸残基内の一又は複数のアミノ酸と結合する。いくつかの実施態様では、抗TREM1抗体は、ヒトTREM1(配列番号1)のアミノ酸残基83-90内の、又はTREM1相同体若しくは配列番号1のアミノ酸残基83-90に対応するオーソログ上のアミノ酸残基内の一又は複数のアミノ酸と結合する。いくつかの実施態様では、抗TREM1抗体は、ヒトTREM1(配列番号1)のアミノ酸残基191-201内の、又はTREM1相同体若しくは配列番号1のアミノ酸残基191-201に対応するオーソログ上のアミノ酸残基内の一又は複数のアミノ酸と結合する。いくつかの実施態様では、抗TREM1抗体は、ヒトTREM1(配列番号1)のアミノ酸残基116-125内の、又はTREM1相同体若しくは配列番号1のアミノ酸残基116-125に対応するオーソログ上のアミノ酸残基内の一又は複数のアミノ酸と結合する。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、(a)表2-5に列挙される、又はT1-1-T1-80から選択される、若しくはT1-1-T1-25及びT1-33-T1-80から選択される抗体のうち何れか一つのHVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3から選択される、少なくとも一つの、二つ又は三つのHVR及びそれらの任意の組合せを含む軽鎖可変領域及び/又は(b)表2-5に列挙される、又はT1-1-T1-80から選択される抗体のうち何れか一つのHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3から選択される、少なくとも一つの、二つ又は三つのHVR及びそれらの任意の組合せを含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様では、HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3は、表2-5に示されるような、又はT1-1-T1-80から選択される抗体及びそれらの任意の組合せ、又はT1-1-T1-25及びT1-33-T1-80から選択される抗体及びそれらの任意の組合せに由来するEU又はKabat HVR、Chothia HVR又は接触HVR配列を含む。
ヒトTREM1及びマウスTREM1の抗TREM1抗体の解離定数(KD)は、15nM未満、14.5nM未満、14nM未満、13.5nM未満、13nM未満、12.9nM未満、12.8nM未満、12.7nM未満、12.6nM未満、12.5nM未満、12.4nM未満、12.3nM未満、12.2nM未満、12.1nM未満、12nM未満、11.5nM未満、11nM未満、10.9nM未満、10.8nM未満、10.7nM未満、10.6nM未満、10.5nM未満、10.4nM未満、10.3nM未満、10.2nM未満、10.1nM未満、10nM未満、9.5nM未満、9nM未満、8.5nM未満、8nM未満、7.5nM未満、7nM未満、6.9nM未満、6.8nM未満、6.7nM未満、6.6nM未満、6.5nM未満、6.4nM未満、6.3nM未満、6.2nM未満、6.1nM未満、6nM未満、5.5nM未満、5nM未満、4.5nM未満、4nM未満、3.5nM未満、3.4nM未満、3.3nM未満、3.2nM未満、3.1nM未満、3nM未満、2.9nM未満、2.8nM未満、2.7nM未満、2.6nM未満、2.5nM未満、2.4nM未満、2.3nM未満、2.2nM未満、2.1nM未満、2nM未満、1.9nM未満、1.8nM未満、1.7nM未満、1.6nM未満、1.5nM未満、1.4nM未満、1.3nM未満、1.2nM未満、1.1nM未満、1nM未満、0.95nM未満又は0.9nM未満であり得る。いくつかの実施態様では、解離定数は、約12.8nMから約1.2nM又は1.2nM未満の範囲である。いくつかの実施態様では、ヒトTREM1に対する抗TREM1抗体の解離定数は、約12.8nMから約2.9nM又は2.9nM未満の範囲である。いくつかの実施態様では、マウスTREM1に対する抗TREM1抗体の解離定数は、約10.4nMから約1.2nM又は1.2nM未満の範囲である。解離定数は、ELISA、表面プラズモン共鳴(SPR)、バイオレイヤーインターフェロメトリー(例えば、ForteBioによるOctet Systemを参照のこと)、等温滴定熱量測定法(ITC)、示差走査熱量測定(DSC)、円偏光二色性(CD)、ストップトフロー分析及び比色分析又は蛍光タンパク質融解分析などの任意の生化学的又は生物物理的技術を含む任意の分析技術によって決定され得る。
本開示の特定の態様は、本開示のTREM1タンパク質及び第2の抗原と結合する二重特異性抗体に関する。二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書において記載されている。いくつかの実施態様では、本開示の二重特異性抗体は、ヒトTREM1(配列番号1)の一又は複数のアミノ酸残基又は配列番号1のアミノ酸残基に対応するTREM1タンパク質上のアミノ酸残基と結合する。その他の実施態様では、本開示の二重特異性抗体はまた、ヒトDAP12(配列番号560)の一又は複数のアミノ酸残基又は配列番号560)のアミノ酸残基に対応するDAP12タンパク質上のアミノ酸残基と結合する。
本開示の特定の態様は、ヒトTREM1のうち一又は複数、ヒトTREM1の天然に存在する変異体及びヒトTREM1の疾患変異体と結合する抗体断片に関する。いくつかの実施態様では、抗体断片は、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv又はscFv断片である。いくつかの実施態様では、抗体断片は、a)血液脳関門を越える輸送を促進する抗原、(b)トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様成長因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマ単一ドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質形質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、アンジオペプチド及びANG1005から選択される、血液脳関門を越える輸送を促進する抗原、(c)アミロイドβ、オリゴマーアミロイドβ、アミロイドβプラーク、アミロイド前駆体タンパク質又はその断片、タウ、IAPP、αシヌクレイン、TDP-43、FUSタンパク質、C9orf72(第9染色体オープンリーディングフレーム72)、c9RANタンパク質、プリオンタンパク質、PrPSc、ハンチンチン、カルシトニン、スーパーオキシドジムスターゼ、アタキシン、アタキシン1、アタキシン2、アタキシン3、アタキシン7、アタキシン8、アタキシン10、レビー小体、心房性ナトリウム利尿因子、膵島アミロイドポリペプチド、インスリン、アポリポタンパク質AI、血清アミロイドA、メディン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β2ミクログロブリン、ゲルゾリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖AL、S-IBMタンパク質、リピート関連非ATG(RAN)翻訳産物、ジペプチドリピート(DPR)ペプチド、グリシン-アラニン(GA)リピートペプチド、グリシン-プロリン(GP)リピートペプチド、グリシン-アルギニン(GR)リピートペプチド、プロリン-アラニン(PA)リピートペプチド、ユビキチン及びプロリン-アルギニン(PR)リピートペプチドから選択される疾患を引き起こすタンパク質並びに(d)免疫細胞上で発現されるリガンド及び/又はタンパク質であって、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3及びホスファチジルセリンから選択されるリガンド及び/又はタンパク質並びに(e)一又は複数の腫瘍細胞上で発現されるタンパク質、脂質、多糖又は糖脂質並びにそれらの任意の組合せから選択される疾患を引き起こすタンパク質と特異的に結合する一又は複数の抗体と組み合わせて使用される。
本明細書において記載される抗体の何れかは、ヒト免疫グロブリンフレームワークとして使用されるフレームワークをさらに含む。例えば、いくつかの実施態様では、抗体(例えば、抗TREM1抗体)は、上記の実施態様の何れかにおけるようにHVRを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。ヒト免疫グロブリンフレームワークは、ヒト抗体の一部であり得、又は非ヒト抗体は、一又は複数の内因性フレームワークを、ヒトフレームワーク領域(複数可)と置き換えることによってヒト化され得る。ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域として、それだけには限らないが、「最良適合」法(例えば、Sims等J. Immunol. 151:2296(1993)を参照のこと)を使用して選択されたフレームワーク領域、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carter等Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:4285(1992);及びPresta等J.Immunol.、151:2623(1993)を参照のこと)、ヒト成熟(体細胞突然変異した)フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro及びFransson、Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)を参照のこと)及びスクリーニングFRライブラリーに由来するフレームワーク領域(例えば、Baca等、J. Biol. Chem. 272:10678-10684(1997)及びRosok等、J.Biol.Chem. 271:22611-22618(1996)を参照のこと)が挙げられる。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中に発現されたTREM1タンパク質との結合後にPI3K活性化を誘導し得る。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞表面で発現されたTREM1タンパク質との結合後に、脳における炎症促進性メディエーターを調節する(例えば、増大させる又は減少させる)。本開示の抗TREM1抗体は、細胞中に発現されたTREM1タンパク質との結合後に、サイトカイン(例えば、抗炎症性メディエーター)の発現を調節する、及び/又は炎症促進性メディエーターの発現を調節する。ひとたび、細胞がTREM1シグナル伝達の欠乏のために死滅すると、それらは、炎症促進反応を誘導する。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中に発現されたTREM1タンパク質との結合後に炎症促進性メディエーターの発現を調節し得る(例えば、増大させる又は減少させる)。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中に発現されるTREM1タンパク質との結合後に細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)リン酸化を誘導し得る。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中で発現されるTREM1タンパク質との結合後に、脾臓チロシンキナーゼ(Syk)リン酸化を誘導し得る。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中に発現されたTREM1タンパク質との結合後にTREM1自己リン酸化を誘導し得る。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、TREM1のDAP12との結合を誘導し得る。その他の実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中で発現されたTREM1タンパク質との結合後にDAP12リン酸化を誘導し得る。その他の実施態様では、TREM1媒介性DAP12リン酸化は、一又は複数のSRCファミリーチロシンキナーゼによって誘導される。Srcファミリーチロシンキナーゼの例として、限定するものではないが、Src、Syk、Yes、Fyn、Fgr、Lck、Hck、Blk、Lyn及びFrkが挙げられる。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中に発現されたTREM1タンパク質との結合後に、C-Cケモカイン受容体7(CCR7)の発現を調節し得る(例えば、増大させる又は減少させる)。発現の調節は、限定するものではないが、遺伝子発現の調節、転写発現の調節又はタンパク質発現の調節を含み得る。遺伝子、転写物(例えば、mRNA)及び/又はタンパク質発現を決定するために、当技術分野で公知の任意の方法が使用され得る。例えば、抗炎症性メディエーター遺伝子発現レベルを決定するためにノーザンブロット分析が使用され得、抗炎症性メディエーター転写のレベルを決定するためにRT-PCRが使用され得、抗炎症性メディエータータンパク質レベルを決定するためにウエスタンブロット分析が使用され得る。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中に発現されたTREM1タンパク質との結合後に、骨髄由来樹状細胞の、CD8+T細胞、CD4+T細胞及び/又は制御性T細胞を含む抗原特異的T細胞を抗原刺激する、又はその機能を調節する能力を増強及び/又は正常化し得る。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中で発現されたTREM1タンパク質との結合後に、破骨細胞産生を誘導し得る、及び/又は破骨細胞形成の速度を増大し得る。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中に発現されたTREM1タンパク質との結合後に、樹状細胞、マクロファージ、単球、破骨細胞、皮膚のランゲルハンス細胞、クッパー細胞及びミクログリア細胞(ミクログリア)の増殖、生存及び/又は機能を増大し得る。
いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体は、細胞中で発現されたTREM1タンパク質との結合の後に、アポトーシスニューロン、神経系の神経組織細片、神経系の非神経組織細片、細菌、その他の異物、疾患を引き起こすタンパク質、疾患を引き起こすペプチド、疾患を引き起こす核酸又は腫瘍細胞のうち一又は複数のクリアランス及び/又は食作用を誘導し得る。特定の実施態様では、疾患を引き起こすタンパク質として、限定するものではないが、アミロイドβ又はその断片、タウ、IAPP、αシヌクレイン、TDP-43、FUSタンパク質、プリオンタンパク質、PrPSc、ハンチンチン、カルシトニン、スーパーオキシドジムスターゼ、アタキシン、レビー小体、心房性ナトリウム利尿因子、膵島アミロイドポリペプチド、インスリン、アポリポタンパク質AI、血清アミロイドA、メディン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β2ミクログロブリン、ゲルゾリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖AL、S-IBMタンパク質及びグリシン-アラニン(GA)、グリシン-プロリン(GP)、グリシン-アルギニン(GR)、プロリン-アラニン(PA)又はプロリン-アルギニン(PR)から構成されるジペプチドリピート(DPRペプチド)を含むリピート関連非ATG(RAN)翻訳産物が挙げられる。特定の実施態様では、疾患を引き起こす核酸として、限定するものではないが、アンチセンスGGCCCC(G2C4)リピート増大RNAが挙げられる。
いくつかの実施態様では、本開示のアゴニスト抗TREM1抗体は、転写因子の活性化T細胞の核内因子(NFAT)ファミリーの一又は複数の転写因子などのTREM1依存性遺伝子の活性及び/又は発現を増大し得る。或いは、本開示のアンタゴニスト抗TREM1抗体は、転写因子のNFATファミリーの一又は複数の転写因子などのTREM1依存性遺伝子の活性及び/又は発現を阻害し得る。
本開示の抗TREM1抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化及びキメラ抗体、ヒト抗体、抗体断片(例えば、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv及びF(ab’)2)、二重特異性及び多特異性抗体、多価抗体、ライブラリー由来抗体、エフェクター機能が修飾された抗体、抗体部分を含有する融合タンパク質並びに抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体及び共有結合によって修飾された抗体を含む本開示のTREM1タンパク質のアミノ酸残基を有するエピトープなどの抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意のその他の修飾された立体配置を包含し得る。抗TREM1抗体は、ヒト、マウス、ラット又はその他の任意の起源のもの(キメラ又はヒト化抗体を含む)であり得る。
抗TREM1ポリクローナル抗体などのポリクローナル抗体は、一般に、関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下(sc)又は腹膜内(ip)注射によって動物において産生される。二機能性薬剤又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基によるコンジュゲーション)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2又はR1N=C=NR(式中、R及びR1は独立に、低級アルキル基である)を使用して、関連抗原(例えば、本開示の精製又は組換えTREM1タンパク質)を、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシンインヒビターとコンジュゲートすることは、有用であり得る。使用され得るアジュバントの例として、フロイントの完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコレート)が挙げられる。免疫化プロトコールは、過度の実験方法を用いなくても当業者によって選択され得る。
抗TREM1モノクローナル抗体などのモノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる、すなわち、個々の抗体から構成される集団は、微量で存在し得るあり得る天然に存在する突然変異及び/又は翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて、同一である。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないというような抗体の特徴を示す。
本開示の抗TREM1抗体又はその抗体断片は、ヒト化又はヒト抗体をさらに含み得る。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2又はその他の抗体の抗原結合部分配列など)である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRに由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中にも、移入されたCDR又はフレームワーク配列中にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つの、通常、二つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、CDR領域のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべて又は実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含む。Jones等、Nature 321: 522-525(1986);Riechmann等、Nature 332: 323-329(1988)及びPresta、Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596(1992)。
或いは、ヒト抗TREM1抗体は、作製され得る。例えば、免疫化の際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生可能であるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を製造することが現在可能である。キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域(JH)遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全阻害をもたらす。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原負荷の際にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovits等、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA、90:2551(1993);Jakobovits等、Nature、362:255-258(1993);Bruggermann等、Year in Immunol.、7:33 (1993);米国特許第5591669号及び国際公開第97/17852号を参照のこと。
最後に、ヒト抗TREM1抗体はまた、活性化B細胞によってin vitroで作製され得る(米国特許第5567610号及び同5229275号を参照のこと)。
特定の実施態様では、全抗TREM1抗体ではなく抗TREM1抗体断片を使用する利点がある。いくつかの実施態様では、より小さい断片の大きさが、迅速なクリアランス及びより良好な脳への浸透を可能にする。
二重特異性抗体(BsAb)は、同一又は別のタンパク質(例えば、一又は複数の、本開示のTREM1タンパク質)上のものを含む、少なくとも2種の異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。或いは、BsAbの一方の部分が、標的TREM1抗原と結合するようにアームとされ得、もう一方が、第2のタンパク質と結合するアームと組み合わされ得る。このような抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)に由来し得る。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行され得る(及び/又は異化され得る)。本開示の抗TREM1抗体又はその抗体断片は、3つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(IgMクラスとは別のもの)であり得(例えば、四価抗体)、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生され得る。多価抗体は、二量体化ドメイン及び3つ以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Fc領域又はヒンジ領域を含む。このシナリオでは、抗体は、Fc領域及びFc領域のアミノ末端の3つ以上の抗原結合部位を含む。本明細書において好ましい多価抗体は、3から約8、好ましくは、4つの抗原結合部位を含有する。多価抗体は、少なくとも一つのポリペプチド鎖(好ましくは、2つのポリペプチド鎖)を含有し、ポリペプチド鎖(単数又は複数)は、2以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖(単数又は複数)は、VD1-(X1)n--VD2-(X2)n-Fcを含み得、式中、VD1は、第1の可変ドメインであり、VD2は、第2の可変ドメインであり、Fcは、Fc領域の一つのポリペプチド鎖であり、X1及びX2は、アミノ酸又はポリペプチドを表し、nは、0又は1である。同様に、ポリペプチド鎖(単数又は複数)は、VH-CH1-可動性リンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を含み得る。本明細書において、多価抗体は、好ましくは、少なくとも2つ(好ましくは、4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書において多価抗体は、例えば、約2から約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書において考慮される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択的に、CLドメインをさらに含む。多価抗体は、TREM1抗原並びに、限定するものではないが、さらなる抗原Aベータペプチド、抗原又はアルファシヌライン(synuclain)タンパク質アンチジーン又はタウタンパク質アンチジーン又はTDP-43タンパク質アンチジーン又はプリオンタンパク質アンチジーン又はハンチンチンタンパク質アンチジーン又はRAN、グリシン-アラニン(GA)、グリシン-プロリン(GP)、グリシン-アルギニン(GR)、プロリン-アラニン(PA)又はプロリン-アルギニン(PR)から構成されるジペプチドリピート(DPRペプチド)を含む翻訳産物アンチジーン、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体、トランスフェリン受容体又は血液脳関門を越える抗体移入を促進する任意のその他の抗原を認識し得る。
抗体のエフェクター機能を修飾するため、及び/又は血清半減期を増大するために、本開示の抗TREM1抗体を修飾することもまた、望ましいものであり得る。例えば、定常領域上のFc受容体結合部位は、特定のFc受容体、例えば、FcγRI、FcγRII及び/又はFcγRIIIとの結合親和性を除去又は低減して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を低減するように修飾又は突然変異され得る。いくつかの実施態様では、エフェクター機能は、抗体のFc領域(例えば、IgGのCH2ドメイン中の)のN-グリコシル化を除去することによって損なわれる。いくつかの実施態様では、エフェクター機能は、PCT 国際公開第99/58572号及びArmour等、Molecular Immunology 40:585-593(2003);Reddy等、J. Immunology 164:1925-1933(2000)に記載されるように、ヒトIgGの233-236、297及び/又は327-331などの領域を修飾することによって損なわれる。その他の実施態様では、エフェクター機能を修飾して、ITIM含有FcgRIIb(CD32b)に向けた知見選択性を増大して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害及び抗体依存性細胞性食作用を含む体液性応答を活性化せずに隣接細胞上のTREM1抗体のクラスター化を増大するために、本開示の抗TREM1抗体を修飾することが望ましいものであり得る。
本開示の抗TREM1抗体又はその抗体断片のアミノ酸配列修飾も考慮される。例えば、抗体又は抗体断片の結合親和性及び/又はその他の生物学的特性を改善することが望ましいものであり得る。抗体又は抗体断片のアミノ酸配列変異体は、抗体又は抗体断片をコードする核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製される。このような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び/又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入及び/又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組合せは、所望の特徴(すなわち、本開示のTREM1タンパク質と結合する、又はそれと物理的相互作用する能力)を有する限り、最終構築物に到達するように行われる。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置を変化させることなどの抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile、
(2)中性親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;並びに
(6)芳香族:trp、tyr、phe.
本開示の抗TREM1抗体又はその抗体断片は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能であるさらなる非タンパク質性部分を含有するように、又は当技術分野で公知であり、容易に入手可能である異なる種類の薬物コンジュゲートを含有するようにさらに修飾され得る。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの限定されない例として、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1、3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダム共重合体の何れか)及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール及びそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造において利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐していても非分岐であってもよい。抗体と結合しているポリマーの数は変わり得、1を超えるポリマーが結合している場合には、それらは、同一分子である場合も異なる分子である場合もある。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、抗体誘導体が、既定される条件下で療法において使用されるか否かなどに関わらず、それだけには限らないが、改善されるべき抗体特定の特性又は機能を含む検討事項に基づいて決定され得る。このような技術及びその他の適した製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、Alfonso Gennaro編、Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000)に開示されている。
本開示の抗TREM1抗体は、例えば、ELISA、ウエスタンブロットなどといった公知の方法によって抗原結合活性について試験され得る。
本開示の抗TREM1抗体は、例えば、米国特許第4816567号に記載されるように、組換え法及び組成物を使用して産生され得る。いくつかの実施態様では、本開示の抗TREM1抗体の何れかをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗TREM1抗体のVLを含有するアミノ酸配列及び/又はVHを含有するアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードし得る。いくつかの実施態様では、このような核酸を含有する一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。いくつかの実施態様では、このような核酸を含有する宿主細胞も提供される。いくつかの実施態様では、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含有するアミノ酸配列及び抗体のVHを含有するアミノ酸配列をコードする核酸を含有するベクター又は(2)抗体のVLを含有するアミノ酸配列をコードする核酸を含有する第1のベクター及び抗体のVHを含有するアミノ酸配列をコードする核酸を含有する第2のベクターを含有する(例えば、それらを用いて形質導入されている)。いくつかの実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ球細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。本開示の宿主細胞としてまた、限定するものではないが、単離された細胞、in vitro培養細胞及びex vivo培養細胞が挙げられる。
抗TREM1抗体は、抗体を適当な薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることによって治療的投与のために種々の製剤中に組み込まれ得る、又は固体、半固体、液体又はガス状形態の調製物に製剤化され得る。このような製剤の例として、限定するものではないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射物、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェア及びエアゾールが挙げられる。薬学的組成物は、望まれる製剤に応じて、動物又はヒト投与のために薬学的組成物を製剤化するためによく使用されるビヒクルである、薬学的に許容される非毒性の担体又は希釈剤を含み得る。希釈剤は、組合せの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。このような希釈剤の例として、限定するものではないが、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、PBS、リンゲル溶液、デキストロース溶液及びハンクス溶液が挙げられる。本開示の薬学的組成物又は製剤は、その他の担体、アジュバント又は非毒性、非治療性、非免疫原性安定化剤、賦形剤等をさらに含み得る。組成物はまた、pH調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤及び界面活性剤などの生理学的状態に近づけるためのさらなる物質を含み得る。
本開示の抗TREM1抗体を含有する本開示の薬学的組成物は、抗TREM1抗体を用いる治療を必要とする個体、好ましくは、ヒトに、ボーラスとしての静脈内投与などの既知方法に従って、又は一定期間にわたる連続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、経口、局所又は吸入経路によって投与され得る。
本開示のさらなる態様は、個体に、治療有効量の本開示の抗TREM1抗体を投与して、個体における一又は複数のTREM1活性を調節する(例えば、誘導する又は阻害する)ことによって、TREM1を調節する(例えば、活性化する又は阻害する)ための、DAP12を調節する(例えば、活性化する又は阻害する)ための、PI3Kを調節する(例えば、活性化する又は阻害する)ための、一又は複数の炎症促進性及び抗炎症性メディエーター(例えば、IFN-a4、IFN-b、IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-8、IL-23、CRP、ケモカインタンパク質ファミリーのTGF-βメンバー、IL-20ファミリーメンバー、IL-33、LIF、IFN-γ、OSM、CNTF、TGF-β、GM-CSF、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-23、MCP-1、VEGF、CXCL10及びCRP)の発現を調節する(例えば、活性化する又は低下させる)ための、一又は複数のTREM1発現細胞の生存を調節する(例えば、活性化する又は低下させる)ための、又は、一又は複数のTREM1発現細胞の機能を調節する(例えば、活性化する又は低下させる)ための、又は一又は複数のTREM1発現細胞の増殖を調節する(例えば、活性化する又は低下させる)ための、又は一又は複数のTREM1発現細胞の遊走を調節する(例えば、活性化する又は低下させる)ための、又はそれを必要とする個体における一又は複数のTREM1発現細胞のその他の細胞との相互作用を調節する(例えば、活性化する又は低下させる)方法を提供する。
認知症は、正常な加齢から予測され得るものを越えた、これまでに未障害の人における全体的な認知能力の重篤な喪失として現れる非特異的症候群(すなわち、徴候及び症状のセット)である。認知症は、独特の全体的な脳傷害の結果として静的であり得る。或いは、認知症は、進行性であり得、身体における損傷又は疾患のために長期の低下をもたらす。認知症は、老人集団ではかなりより一般的であるが、65歳より前で生じることもある。認知症によって影響を受ける認知領域として、限定するものではないが、記憶、注意持続時間、言語及び問題解決が挙げられる。一般に、症状が、個体が認知症と診断される前の少なくとも6ヶ月間存在しなければならない。
前頭側頭型認知症(FTD)は、脳の前頭葉の進行性の増悪に起因する状態である。経時的に、変性は、側頭葉に進行し得る。有病率では唯一アルツハイマー病(AD)に次いで第2位であり、FTDは、初老期認知症の症例の20%を占める。FTDの臨床特徴として、記憶欠損、行動異常、人格変化及び言語障害が挙げられる(Cruts,M. & Van Broeckhoven,C.、Trends Genet. 24:186-194(2008);Neary,D.等、Neurology 51:1546-1554(1998);Ratnavalli,E.、Brayne,C.、Dawson,K. & Hodges,J. R.、Neurology 58:1615-1621(2002))。
アルツハイマー病(AD)は、認知症の最も一般的な形態である。疾患の治癒はなく、進行するにつれ悪化し、最終的には死につながる。ほとんどの場合、ADは、65歳を超えるヒトにおいて診断される。しかし、あまり蔓延していないが早期発症型アルツハイマーは、かなり早く生じることがある。
那須・ハコラ病(NHD)は、別に硬化性白質脳症を伴う多発嚢胞性脂肪膜性骨異型性(PLOSL)と呼ばれることもあり、稀にしか遺伝しない白質ジストロフィーであり、下肢及び上肢の多嚢胞性骨様病変のために、再発性骨折を伴う進行性の初老期認知症である。NHD疾患経過は、一般に、4つのステージ:潜在性、骨様、早期神経学的及び後期神経学的にわけられる。小児期(潜在性ステージ)の間の正常な発達後、NHDは、若年成人期の間に(通常の発症年齢20~30歳)手、手首、足首及び足の疼痛で現れ始める。次いで、患者は、肢の骨における多嚢胞性骨様及び骨粗鬆症性病変による再発性骨折に苦しみ始める(骨様ステージ)。20代又は30代の間に(早期神経学的ステージ)、患者は、前頭葉症候群に特有の明白な人格変化を示す(例えば、多幸感、集中の欠如、判断の喪失及び社会的抑制)。患者は、通常、進行性の記憶撹乱にも苦しむ。てんかん性発作も頻繁に観察される。最後に(後期神経学的ステージ)、患者は、重度の認知症に進行し、話すことも、動くこともできず、通常、50歳までに死亡する。
パーキンソン病は、特発性又は原発性パーキンソニズム、運動低下性硬直性症候群(HRS)又は振戦麻痺と呼ばれることもあり、運動系制御に影響を及ぼす神経変性性脳障害である。脳におけるドーパミン産生細胞の進行性の死滅が、パーキンソンの主要な症状につながる。ほとんどの場合、パーキンソン病は、50歳を超えるヒトで診断される。パーキンソン病は、ほとんどのヒトにおいて特発性(既知原因がない)である。しかし、遺伝因子も疾患において役割を果たしている。
本明細書において、筋萎縮性側索硬化症(ALS)又は運動ニューロン疾患又はルー・ゲーリック病は、同義的に使用され、迅速進行性脱力、筋肉萎縮及び線維束性収縮、筋肉筋痙縮、発話困難(構音障害)、嚥下困難(嚥下障害)及び呼吸困難(difficulty breathing)(呼吸困難(dyspnea))を特徴とする多様な病因論を有する衰弱性疾患を指す。
ハンチントン舞踏病(HD)は、ハンチンチン遺伝子(HTT)において常染色体優性突然変異によって引き起こされる遺伝性神経変性性疾患である。ハンチンチン遺伝子内のサイトカイン-アデニン-グアニン(CAG)トリプレットリピートの拡大は、この遺伝子によってコードされるハンチンチンタンパク質(Htt)の突然変異体形態の生成をもたらす。この突然変異体ハンチンチンタンパク質(mHtt)は、毒性であり、神経細胞死に寄与する。ハンチントン舞踏病の症状は、任意の年齢で現れ得るが、35歳から44歳の間に最もよく現れる。
タウオパチー病、又はタウオパチーは、脳内で微小管関連タンパク質タウの凝集によって引き起こされる神経変性性疾患のクラスである。アルツハイマー病(AD)は、最もよく知られたタウオパチー病であり、不溶性神経原線維変化(NFT)の形態でニューロン内にタウタンパク質の蓄積を含む。その他のタウオパチー病及び障害として、進行性核上性麻痺、拳闘家認知症(慢性外傷性脳傷害)、前頭側頭型認知症及び染色体17と連鎖しているパーキンソニズム、リチコ-ボーディッヒ病(グアムのパーキンソン認知症複合)、タングル優位型認知症、神経節膠腫及び神経節細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、鉛脳障害、結節性硬化症、ハラーホルデン・スパッツ病、リポフスチン沈着症、ピック病、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒病(AGD)、ハンチントン舞踏病、前頭側頭型認知症及び前頭側頭葉変性症が挙げられる。
多発性硬化症(MS)はまた、播種性硬化症又は散在性脳脊髄炎とも呼ばれ得る。MSは、脳の軸索の周囲の脂肪ミエリン鞘及び脊髄が損傷を受けている炎症性疾患であり、脱髄及び瘢痕並びに広範囲の徴候及び症状につながる。MSは、脳及び脊髄中の神経細胞の、互いに効率的に連絡する能力に影響を及ぼす。神経細胞は、活動電位と呼ばれる電気信号を、ミエリンと呼ばれる絶縁物質内に含有される軸索と呼ばれる長い線維の下に送ることによって連絡する。MSでは、身体自身の免疫系が、ミエリンを攻撃し、損傷を与える。ミエリンが失われると、軸索は、もはや効率的にシグナルを伝達できない。MS発生は、普通、若年成人において起こり、女性においてより一般的である。
本開示のなおさらなる態様は、癌を有するリスクを防止し、低減する、又はそれを治療する方法であって、個体に、治療有効量の、単離された本開示の抗TREM1抗体を投与することを含む方法を提供する。本開示の単離された抗体の何れも、これらの方法において使用され得る。いくつかの実施態様では、単離された抗体は、本開示のアゴニスト抗体である。その他の実施態様では、単離された抗体は、本開示のアンタゴニスト抗体である。
本開示はまた、本開示の単離された抗体(例えば、本明細書において記載される抗TREM1又は抗DAP12抗体)又はその機能的断片を含有するキットを提供する。本開示のキットは、本開示の精製抗体を含む一又は複数の容器を含み得る。いくつかの実施態様では、キットは、本開示の方法に従って使用するための説明書をさらに含む。いくつかの実施態様では、これらの説明書は、本開示の方法に従って、認知症、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、那須・ハコラ病、多発性硬化症及び癌から選択される疾患、障害又は傷害を有するリスクを防止、低減する、又はそれを有する個体を治療するための、本開示の単離された抗体(例えば、本明細書に記載された抗TREM1又は抗DAP12抗体)の投与の説明を含む。
本開示の単離された抗体はまた、診断的有用性を有する。したがって、本開示は、個体における又は個体に由来する組織サンプルにおけるTREM1の検出などの診断目的で、本開示の抗TREM1抗体又はその機能的断片を使用する方法を提供する。
導入
ヒトTREM1前駆タンパク質のアミノ酸配列は、以下の配列番号1に記載される。ヒトTREM1は、配列番号1のアミノ残基1-20に位置するシグナルペプチドを含有する。ヒトTREM1は、配列番号1のアミノ残基26-134に位置する細胞外免疫グロブリン様可変型(IgV)ドメイン;配列番号1のアミノ残基135-205に位置するさらなる細胞外配列;配列番号1のアミノ残基206-226に位置する膜貫通ドメイン;及び配列番号1のアミノ残基227-234に位置する細胞内ドメインを含有する。
MRKTRLWGLL WMLFVSELRA ATKLTEEKYE LKEGQTLDVK CDYTLEKFAS SQKAWQIIRD GEMPKTLACT ERPSKNSHPV QVGRIILEDY HDHGLLRVRM VNLQVEDSGL YQCVIYQPPK EPHMLFDRIR LVVTKGFSGT PGSNENSTQN VYKIPPTTTK ALCPLYTSPR TVTQAPPKST ADVSTPDSEI NLTNVTDIIR VPVFNIVILL AGGFLSKSLV FSVLFAVTLR SFVP
抗TREM1抗体産生
免疫化手順
ラピッドプライム方法:4匹の50日齢雌BALB/cマウスを以下の手順を使用して免疫化した。ヒトTREM1抗原を含有するがアジュバントを含有しない一連の皮下の水性注射液を19日間にわたり与えた。マウスをLab Productsの換気ラックシステム中に収容した。全ての4匹のマウスを19日目に安楽死させ、リンパ球をハイブリドーマ細胞株生成のために回収した。
リンパ球を単離し、標準的なRocheのプロトコールによりポリエチレングリコール(PEG1500)の存在下でマウスのSP2/0骨髄腫細胞と融合した。1ステップのクローニング方法(HAT選択)を使用して融合した細胞を培養した。この方法は、ハイブリドーマ選択及びクローニングを1つのステップに合わせるために、半固体のメチルセルロースベースのHAT選択的培地を使用する。半固体培地上で、単一細胞由来のハイブリドーマが増殖してモノクローナルコロニーを形成する。融合事象の10日後、得られたハイブリドーマクローンのうち948個を96ウェルの組織培養プレートに移し、対数中期の増殖が達成されるまで(5日)、HT含有培地中で増殖させた。
948個のハイブリドーマからの組織培養上清を、スクリーニング抗原上での間接ELISA(一次スクリーニング)によって試験し、ヤギ抗IgG/IgM(H&L)-HRP二次を使用してIgG及びIgM抗体の両方に対してプローブ付けを行い、TMB基質で展開した。このアッセイにおいてODが0.2を超えるクローンを次回の試験に進めた。陽性の培養物をスクリーニング抗原で再試験して分泌を確認し、さらに、無関係の抗原(ヒトトランスフェリン)で再試験して、非特異的な又は「粘着性の」mAbを消去し、偽陽性を除外した。全ての目的のクローンを抗体捕捉ELISAによってアイソタイプ分類し、それらがIgG又はIgMアイソタイプであるかどうかを決定した。
目的のハイブリドーマ細胞株を、96ウェルのプレートに移した後、24ウェルの培養プレート中での培養で32日間維持した。これは安定期間と称され、クローンが安定であり分泌を続けているかどうかを試験する。この安定期間の間、-80℃で貯蔵するための(生存可能な6ヶ月間)全ての目的のクローンの一時的に凍結した細胞株のバックアップを作製する。この期間中に、分泌及び特異性についてハイブリドーマを定期的に試験した。
上位のハイブリドーマ細胞株(クローン)をサブクローニングして、単クローン性を確認した。サブクローニングは、1ステップのクローニングシステムを使用して親クローンを再度プレーティングすることによって実行された。24個から90個の間のサブクローンを96ウェルの培養プレートに移した。サブクローンを間接ELISA及び抗体捕捉ELISAによってスクリーニングした。各親につき上位のサブクローンを培養での拡張に進めた。クローン性が50%未満の全ての親クローンに2回目のサブクローニングを実行した。
標準的な技術を使用して、生成した抗体の軽鎖可変及び重鎖可変ドメインをコードするアミノ酸配列を決定した。抗体のEU又はKabatの軽鎖HVR配列は、表2-5に記載される。抗体のEU又はKabatの軽鎖HVR配列は、表2に記載される。抗体のEU又はKabatの重鎖HVR配列は、表3に記載される。抗体のEU又はKabatの軽鎖フレームワーク(FR)配列は、表4に記載される。抗体のEU又はKabatの重鎖フレームワーク(FR)配列は、表5に記載される。
TREM1抗体の最初の特徴付けは、単球及び他の一次ヒト又はマウス免疫細胞上で発現されるTREM1と結合するそれらの能力を決定することを含んでいた。細胞を回収し、96ウェルのプレート中で105/mlでプレーティングし、洗浄し、10-50ug/mlのMab及びFcブロッキング試薬を含有する100ulのPBS中で、氷中で1時間インキュベートした。次いで細胞を2回洗浄し、5ug/mlのPEコンジュゲート二次抗体を含有する100ulのPBS中で、氷中で30分インキュベートした。細胞を冷PBS中で2回洗浄し、BD FACS Canto上で捕捉した。平均蛍光強度(MFI)値又は%陽性細胞のデータ分析及び計算を、FlowJo(TreeStar)ソフトウェアバージョン10.0.7を用いて実行した。
TREM1抗体を、ヒトTREM1全体にわたる15mer又は25merのペプチド(配列番号1)と結合するそれらの能力について試験した。
直鎖状の15merのペプチドを、ヒトTREM1(配列番号1)の配列に基づき14残基をオーバーラップさせて合成した。加えて、直鎖状の25merのペプチドを、ヒトTREM1の配列(配列番号1)又はマウスTREM1の配列(配列番号2)に基づき単一の残基をシフトさせて合成した。合成されたペプチドのそれぞれへのTREM1抗体の結合を、ELISAベースの方法で試験した。このアッセイにおいて、ペプチドアレイを、一次抗体溶液と共にインキュベートした(4℃で一晩)。洗浄後、ペプチドアレイを、抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート(SBA、カタログ番号2010-05)の1/1000希釈液と共に25℃で1時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質である2,2’-アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸塩(ABTS)及び2μl/mlの3%H2O2を添加した。1時間後、発色を測定した。発色を電荷結合素子(CCD)カメラ及び画像処理システムで定量した。
脾臓チロシンキナーゼ(Syk)は、数種の基質をリン酸化し、それによって細胞活性化及び炎症プロセスを引き起こすシグナル伝達複合体の形成を容易にするTREM1の下流で機能する細胞内シグナル伝達分子である。アゴニストTREM1抗体のSyk活性化を誘導する能力を、マウスマクロファージを培養し、細胞抽出物中でのSykタンパク質のリン酸化状況を測定することによって決定した。
脾臓チロシンキナーゼ(Syk)の活性化は、2以上のTREM1受容体を抗体で架橋し、それによって細胞活性化及び炎症プロセスを引き起こすシグナル伝達複合体の形成を容易にすることによって促進される。in vivoでの架橋は、高親和性Fc受容体(FcR)を発現する隣接する細胞、例えばB細胞及び他の白血球などによって媒介される(White AL Cancer Immunol Immunother (2013) 62:941-948; Wilson NS 2011, Cancer Cell 19, 101-113; Bartholomaeus P J Immunol 2014; 192:2091-2098)。
公開された報告によれば、Toll様受容体(TLR)リガンドに曝露された好中球は、それらの細胞表面にTREM1の内因性リガンドを出現させることが実証されている。例えば、ナイーブマウスからの好中球ではなく、盲腸結紮及び穿刺によって誘導された腹膜炎に罹っているマウスから採取された腹膜の好中球は、組換えマウスTREM1の可溶性断片と結合する。同様に、TLRリガンドで刺激されたヒト好中球は、ヒトTREM1を過剰発現するレポーター細胞を活性化する。近年、ヒトペプチドグリカン認識タンパク質-1(hPGLYRP1)は、グラム陽性菌の細胞壁の主要な構造要素であるペプチドグリカンで刺激されたヒト好中球からのTREM1リガンドであることが同定された。ヒトPGLYRP1は、細菌感染に対する先天性免疫応答に関与する分泌されたパターン認識受容体として機能する4つの保存されたペプチドグリカン結合タンパク質のファミリーに属する。PGLYRPファミリーのなかでも、PGLYRP1が、好中性顆粒で固有に発現される。ヒトTREM1とhPGLYRP1との相互作用を検証するために、ヒトTREM1を発現するCHO細胞(CHO-huTREM1)を、180nMの組換えHisタグ付きヒトPGLYRP1又はマウスPGLYRP1の何れかと共に氷上で30分インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、氷上で15分、PEで標識した抗HISタグ二次モノクローナル抗体で染色した。リガンド結合をフローサイトメトリーによって評価した。図6Aで示されるように、hPGLYRP1の存在下の二次抗体でのみ染色したCHO-huTREM1細胞から、マウスではなくヒトPGLYRP1が、ヒトTREM1と結合することが実証された。リガンドが高濃度にもかかわらず、蛍光強度のシフトが狭かったことから、リガンドと受容体との相互作用は低い親和性であったことが示唆される。この相互作用の結合活性を増加させるために、180nMのhPGLYRP1を、濃度を増加させた枯草菌由来のペプチドグリカン(PGN-BS)又は黄色ブドウ球菌由来のペプチドグリカン(PGN-SA)の何れかと混合することによって、可溶性TREM1リガンド複合体を形成した。図6Bで示されるように、hPGLYRP1及びPGN-SAではなくhPGLYRP1及びPGN-BSからなる可溶性複合体のみが、二次抗体で染色したCHO-huTREM1における蛍光強度のシフトを増加させた。重要なことに、図6Cは、PGN-BS又はPGN-SAのどちらも、CHO細胞上で発現されるヒトTREM1へのマウスPGLYRP1の結合を増大させなかったことを示す。したがって、組換えhPGLYRP1及びPGN-BSで構成される可溶性TREM1リガンド複合体は、ヒトTREM1との活発な結合を可能にする高次構造を形成する。
プレートと結合した全長抗TREM1抗体の、マウス又はヒトTREM1依存性遺伝子を活性化する能力を、NFAT(活性化T細胞核内因子)プロモーターの調節下でルシフェラーゼ又はGFPレポーター遺伝子を使用して評価した。マウス胸腺リンパ腫Tリンパ球由来の細胞株BW5147.G.1.4(ATCC(登録商標)TIB48(商標))を、ヒト又はマウスTREM1及びDAP12、並びにCignal Lenti NFAT-ルシフェラーゼウイルス(Qiagen)で感染させた。代替として、BW5147.G.1.4細胞株を、ヒトTREM1/CD3ゼータ鎖融合タンパク質、及びCignal Lenti NFAT-GFPウイルス(Qiagen)で感染させた。PMA(0.05ug/ml)及びイオノマイシン(0.25uM)を、NFATシグナル伝達の陽性コントロールとして、レポーター細胞に添加した。抗TREM1及びアイソタイプコントロール抗体をPBS中に溶解させ、組織培養プレート上に0.625-10ug/mlの濃度範囲でプレーティングし、4℃で一晩インキュベートして、抗体をプレートに吸着させた。プレートを洗浄した後、細胞を、プレートと結合した抗体上に播種し、37℃で一晩インキュベートした。GFP誘導をフローサイトメトリーによって分析した。レポーター細胞は、外因性の刺激の非存在下で、親のレポーター細胞(TREM1発現がない)と比較して持続的なTREM1依存性シグナル伝達を呈示しないことから、内因性リガンド又は自発的な受容体凝集がないことが示される。
可溶性全長抗TREM1抗体の、マウス又はヒトTREM1依存性遺伝子を活性化する能力を、NFAT(活性化T細胞核内因子)プロモーターの調節下でルシフェラーゼ又はGFPレポーター遺伝子を使用して評価した。マウス胸腺リンパ腫Tリンパ球由来の細胞株BW5147.G.1.4(ATCC(登録商標)TIB48(商標))を、ヒト又はマウスTREM1及びDAP12、並びにCignal Lenti NFAT-ルシフェラーゼウイルス(Qiagen)で感染させた。代替として、BW5147.G.1.4細胞株を、ヒトTREM1/CD3ゼータ鎖融合タンパク質、及びCignal Lenti NFAT-GFPウイルス(Qiagen)で感染させた。NFAT依存性のGFP誘導を試験するために、これらのレポーター細胞を、PMA(0.05ug/ml)及びイオノマイシン(0.25uM)で処理した。TREM1活性化を試験するために、レポーター細胞を、可溶性抗TREM1又はアイソタイプコントロール抗体と共に37℃で一晩インキュベートし、GFP誘導をフローサイトメトリーによって分析した。レポーター細胞は、外因性の刺激の非存在下で、親のレポーター細胞(TREM1発現がない)と比較して持続的なTREM1依存性シグナル伝達を呈示しないことから、内因性リガンド又は自発的な受容体凝集がないことが示される。
マウス又はヒトTREM1の天然リガンドの活性を増強又は阻害する可溶性全長抗TREM1抗体の能力を、遺伝子発現の活性化を測定するためのNFAT(活性化T細胞核内因子)プロモーターの調節下でルシフェラーゼ又はGFPレポーター遺伝子を使用して評価した。マウス胸腺リンパ腫Tリンパ球由来の細胞株BW5147.G.1.4(ATCC(登録商標)TIB48(商標))を、ヒト又はマウスTREM1及びDAP12、並びにCignal Lenti NFAT-ルシフェラーゼウイルス(Qiagen)で感染させた。代替として、BW5147.G.1.4細胞株を、ヒトTREM1/CD3ゼータ鎖融合タンパク質、及びCignal Lenti NFAT-GFPウイルス(Qiagen)で感染させた。細胞を、50nMの組換えヒトPGLYRP1及び10μg/mLのPGN-BSからなる可溶性TREM1リガンド複合体と共に、可溶性抗TREM1又はアイソタイプコントロール抗体と37℃で一晩インキュベートした。GFP発現をフローサイトメトリーによって分析した。
TREM1抗体のアゴニスト機能を、一次ヒト先天性免疫細胞(例えば、単球及び好中球)において評価した。
免疫細胞の表面上で発現されたある特定のITIM/ITAM受容体を標的化する抗体は、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、及び/又は小グリア細胞上の受容体の表面レベルを低減できると考えられる。
in vitroでの細胞生存
TREM1が遺伝学的に欠乏したナイーブマウスは、野生型マウスと比較して、骨髄区画内の細胞生存低減に関する内因性の素因がないことが解明されている。しかしながら、数々の研究によれば、炎症状態で、TREM1ノックアウトマウスは、影響を受けた組織への好中球浸潤の減少を示すことが実証されている。これらの観察は、TREM1は、好中球の移動能力又はそれらの炎症中の生存の何れかにおいて機能する可能性があることを示唆する。in vitroでの免疫細胞生存に影響を与えるTREM1リガンドの能力を評価するために、一次ヒト単球又は好中球を、ヒトPGLYRP1、PGN-BS、可溶性TREM1リガンド複合体、又はLPSの存在又は非存在下で、37℃20時間培養した。ルシフェラーゼベースのアッセイキット(CellTiter-Glo;Promega)を製造元の説明書に従って使用して、細胞の生存率を代謝活性のインジケーターであるATPの定量によって決定した。BioTek Synergy(商標)マイクロプレートリーダーでGEN5(商標)2.04ソフトウェアを使用して、発光を測定した。
抗TREM1抗体は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子によって測定した場合、ヒトTREM1を発現する細胞においてTREM1依存性遺伝子発現をモジュレートすることにおいて、溶液中又は抗体のクラスター化後(すなわちプレート結合によって)の何れかでアゴニスト又はアンタゴニスト活性を実証した(表1B)。TREM1抗体のサブセットは、プレートと結合した場合、アゴニスト活性を呈示する。TREM1抗体の別のサブセットは、溶液中の場合、アゴニスト活性を呈示する。TREM1抗体の第3のサブセットは、可溶性の非架橋抗体のアンタゴニスト作用を呈示する。
抗体単独又はLPSとの組合せの何れかの腹膜内(IP)投与の後における、C57Bl6マウスの腹膜腔(PEC)における炎症細胞(好中球、顆粒球、単球、及びマクロファージ)の補充をモジュレートするTREM1抗体の能力を評価した。簡単に言えば、まずマウスに、40mg/kgの抗TREM1抗体又はアイソタイプコントロール抗体であるmIgG1(クローンMOPC-21、Bioxcell)のIP注射を与えた。14時間後、マウスに、4mg/kgのLPS、又はコントロールとしてPBSのIP注射を与えた。LPS又はPBS注射の6時間後、細胞を、記載された通りにPECから回収し(例えば、Gawish Rら、2014 FASEB Jを参照のこと)、FACSによって分析した。FACS分析のために、PEC細胞を、抗CD11b-パシフィックブルー、抗CD11c PeCy7、抗MCH-II-APCCy7、抗Gr1-FITC、抗Ly6G-PE及び生死判定色素(Life Technologies、カタログ番号L34957)と共に氷上で1時間インキュベートし、次いで冷FACS緩衝液で2回洗浄した。次いで4%PFA固定サンプルを得た。BD FACS CANTO II血球計算器(Becton Dickinson)でデータを得て、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。
TREM1の細胞外部分は、可溶性の形態(sTREM1)に変えることができ、したがって血漿及び髄液(CSF)中で検出できると考えられる。また、アルツハイマー病又は前頭側頭認知症を有する個体において、CSF中のsTREM1の量は、健康なコントロール個体と比較して低いとも考えられている。
炎症性遺伝子
APPPS1マウスの脳の異なる領域で炎症性遺伝子の発現をモジュレートする抗TREM1抗体の能力を、抗TREM1抗体の頭蓋内(IC)投与後に評価した。APPPS1マウスは、何れもThy1プロモーターの調節下で、スウェーデン突然変異(K670N、M671L)を有するAPP及びL166P突然変異を含有するPSEN1の両方に関するヒト導入遺伝子を含有する。1グループ当たり5匹のマウスに、抗TREM1抗体又はアイソタイプコントロール抗体であるmIgG1(クローンMOPC-21、Bioxcell)の1mg/ml溶液2ulのIC注射を、記載された通りに与えた(Wilcock DMら、(2003) J Neurosci 23:3745;Wilcock DMら、(2004) Neurobiol Dis 15:11;Sudduthら、(2013) J. Neurosc、33、9684。具体的には、外科手術の日にマウスの体重を量り、イソフルランで麻酔し、定位装置(51733Dデジタルデュアルマニピュレーターマウス定位フレーム;Stoelting)に入れた。正中矢状の切開を行って頭蓋を露出させ、定位フレーム中に搭載した歯科用ドリルで前頭皮質及び海馬の上の以下の座標に4つの穿頭孔を開けた:前頭皮質、前後方向+1.7mm、横方向±2.0mm;海馬、前後方向-2.7mm;横方向2.5mm、全てブレグマから採取。注射しようとする溶液を含有する10mlのHamiltonシリンジ(Hamilton)に取り付けられた26ゲージの針をブレグマの3.0mm腹側に下げ、2分間にわたり2μlの注射を行った。切開部をクリーニングし、外科的ステープルで閉じた。注射から3日後、マウスを塩類溶液で灌流し、脳の右半球を前頭皮質、海馬、脳の残部に切り分け、急速冷凍した。トリゾールプラスRNA精製システム(Ambion、Invitrogen)を製造元の説明書に従って使用して、左の海馬からRNAを抽出した。BioSpecナノ分光光度計(島津)を使用してRNAを定量し、cDNA High Capacityキット(Applied Biosystems)を製造元の説明書に従って使用してcDNAを逆転写した。リアルタイムPCRを、目的の遺伝子のIL-1b、IL-6、TNFa、IL-12、YM-1、IL-1Ra、MRC1、IL-10、CD86、FCGR1B、及びTGFbのためのTaqMan(登録商標)遺伝子発現プローブを含有する384ウェルの微小流体工学カードカスタムTaqMan(登録商標)アッセイ(Applied Biosystems、Invitrogen)を使用して実行した。全ての遺伝子発現データを18S rRNA発現に正規化した。変化倍数を、ΔCT方法を使用して決定した。データは、平均±SEMとして提示される。統計的分析は、JMP統計的分析プログラム(SAS)を使用して実行される。p値が0.05より低い場合、統計的有意性を割り当てた。必要に応じて、一元配置ANOVA及び二元配置ANOVAを使用して、時間経過に沿った処理の差及び処理グループ内の差を検出した。
APPPS1マウスの脳の異なる領域におけるアミロイドベータ(Aベータ)ペプチドの量を低減する抗TREM1抗体の能力を、抗TREM1抗体の頭蓋内(IC)投与後に評価した。1グループ当たり5匹のマウスに、抗TREM1抗体又はアイソタイプコントロール抗体であるmIgG1(クローンMOPC-21、Bioxcell)の1mg/ml溶液2ulのIC注射を与えた。Aベータペプチドの定量、3日のポット注射(pot injection)のために、致死量のペントバルビタールを注射した後、25mlの規定食塩液でマウスの心臓内を灌流した。脳を迅速に取り出し、正中矢状の面で二等分した。左半分を、新たに調製された4%パラホルムアルデヒド中で浸漬固定した。右半分を前頭皮質及び海馬に切り分け、これを単離し、液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で貯蔵した。低温保護としての一連の10、20、及び30%スクロース溶液に左半分の脳を通過させ、スライド式マイクロトームを使用して25μmの凍結した水平断片を収集し、4℃でアジ化ナトリウムを含有するPBS中に浮遊させた状態で貯蔵した。推測の注射部位間に300μmの間隔を設けた断片をまず搭載し、クレシルバイオレットによって染色して、注射部位を識別した。全てのそれに続く組織学及び免疫組織化学のために、注射部位間に100μmの間隔を設けた6つの断片を選択し、分析した。Aベータのための浮遊性の免疫組織化学(ウサギポリクローナル抗体Aβ1-16;Invitrogen)を実行した。陽性染色によって占められた領域のパーセントを、ニコンのエレメントであるBRソフトウェアを使用して計算した。
抗TREM1抗体の、アルツハイマー病(AD)の発症を遅延させる、予防する、又は逆転させる能力を評価するために、5X FADマウスを使用する。5X FADマウスは、スウェーデン(K670N、M671L)、フロリダ(I716V)、及びロンドン(V717I)家族性アルツハイマー病(FAD)突然変異を有する突然変異ヒトAPP(695)を、2つのFAD突然変異、M146L及びL286Vを有するヒトPS1と共に過剰発現する。両方の導入遺伝子は、マウスThy1プロモーターによって、脳での過剰発現を駆動させADの主要な特徴を再現するように制御される。マウスは、14週齢から開始して、50mg/kgの抗TREM1抗体又はアイソタイプコントロール抗体であるmIgG1(クローンMOPC-21、Bioxcell)で週1回処理される。免疫組織化学を用いて、さらに組織抽出物のELISAによって、マウスをAベータ斑の負荷量について試験する。マウスをさらに、脳中の小グリア細胞の数及び認知障害の低減について、モーリスの水迷路、空間学習及び記憶課題、放射アーム水迷路、空間学習及び記憶課題、Y迷路(空間認知の尺度としての自発的交替行動を定量する)、オープンフィールドにおける嗜好性、評価学習に対するオペラント学習、並びにメモリー、及び恐怖条件付け(mousebiology.orgのウェブサイト;Wangら、(2015) Cell. pii: S0092-8674(15)00127-0)を使用して試験する。
抗TREM1抗体の、アルツハイマー病(AD)の発症を遅延させる、予防する、又は逆転させる能力を評価するために、Tg2576マウスが使用される。Tg2576マウスは、スウェーデン突然変異(KM670/671NL)を有するAPP(アイソフォーム695)の突然変異形態を過剰発現する。マウスは、98-99週齢から開始して、50mg/Kg抗TREM1抗体又はアイソタイプコントロール抗体であるmIgG1(クローンMOPC-21、Bioxcell)で週1回処理される。免疫組織化学を用いて、さらに組織抽出物のELISAによって、マウスをAベータ斑の負荷量について試験する。マウスをさらに、脳中の小グリア細胞の数及び認知障害の低減について、モーリスの水迷路、空間学習及び記憶課題、放射アーム水迷路、空間学習及び記憶課題、Y迷路(空間認知の尺度としての自発的交替行動を定量する)、オープンフィールドにおける嗜好性、評価学習に対するオペラント学習、並びにメモリー、及び恐怖条件付け(mousebiology.orgのウェブサイト;Wangら、(2015) Cell. pii: S0092-8674(15)00127-0)を使用して試験する。
3匹のC57Bl6又はBALB/cマウス(雌、8週齢)のグループの皮下を、100ulのPBSに懸濁した1×106個のMC38若しくはCT26結腸癌腫細胞、又はEMT-6マウス乳癌腫細胞で攻撃した。埋め込みの前に動物をイソフルランで麻酔する。腫瘍が700-1000mm3のサイズに達したら、腫瘍を体外培養して、腫瘍微小環境におけるTREM1発現をFACSによって分析した。比較として、腫瘍を有するマウスの脾臓又はナイーブマウスのコントロール脾臓も分析した。FACSによる発現分析のために、腫瘍及び脾臓を1mg/mlコラゲナーゼを含有するPBS中でインキュベートし、次いでセルストレーナー(cell strained)を介して加工し、単一の細胞懸濁液を得た。次いで細胞を、抗CD45-PerCp-Cy7、抗CD11b-PerCP-Cy5.5、抗CD3-PC、抗Gr1-FITC、抗NK1.1-PE、抗TREM1-APC抗体及び生死判定色素(Life Technologies、カタログ番号L34957)と共に氷上で30分インキュベートし、次いで冷冷FACS緩衝液で2回洗浄した。次いで4%PFA固定サンプルを得た。BD FACS CANTO II血球計算器(Becton Dickinson)でデータを得て、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。
TREM1野生型(WT、n=11)及びTREM1ノックアウト(KO、n=14)マウス(性別及び年齢を適合させた同腹子、10週齢(+/-2週間))のグループの皮下を、100ulのPBSに懸濁した1×106個のMC38結腸癌腫腫瘍細胞で攻撃した。埋め込みの前にマウスをイソフルランで麻酔した。5日目から開始して2週に1回カリパスを用いてモニターして、腫瘍増殖を測定した。実験の評価項目は、2000mm3の腫瘍体積又は60日である。経時的な腫瘍サイズ(体積、mm3として示される)が転帰尺度である。
8週齢(+/-2週齢)の10匹のBALB/cマウスのグループの皮下を、100ulのPBSに懸濁した5×106個のEMT-6腫瘍細胞で攻撃する。埋め込みの前に動物をイソフルランで麻酔する。2日目から開始して、マウスのグループに、40mg/kgの抗TREM1抗体を1日目、4日目、8日目、15日目、及び22日目にIP注射する。4日目から開始して2週に1回カリパスを用いてモニターして、腫瘍増殖を測定する。実験の評価項目は、2000mm3の腫瘍体積又は60日である。腫瘍増殖及び生存率%が転帰尺度である。腫瘍の取り込み及び増殖速度の低減、腫瘍浸潤性の免疫サプレッサーマクロファージの数の低減、及び腫瘍へのエフェクターT細胞流入の増加が、抗TREM1抗体を遮断する抗癌作用を示す。
8週齢(+/-2週齢)の10BALB/cマウスのグループの皮下を100ulのPBSに懸濁した5×106個のEMT-6腫瘍細胞で攻撃する。埋め込みの前に動物をイソフルランで麻酔する。2日目から開始して、マウスのグループに、1日目、4日目、8日目、15日目、及び22日目に40mg/kgの抗TREM1抗体を単独で、又は8日目及び11日目にチェックポイントタンパク質(例えば、抗PDL1mAbクローン10F.9G2及び/又は抗CTLA-4mAbクローン9H10)に対する抗体と組み合わせてIP注射する。処理グループは、抗TREM1;抗CTLA-4;抗TREM1+抗CTLA-4及びアイソタイプコントロールを包含する。4日目から開始して2週に1回カリパスを用いてモニターして、腫瘍増殖を測定する。実験の評価項目は、2000mm3の腫瘍体積又は60日である。腫瘍増殖及び生存率%が転帰尺度である。併用療法による腫瘍増殖の減少及び生存率パーセントの増加は、抗TREM1抗体が、抗チェックポイント抗体との相加的又は相乗的な治療作用を有することを示す。チェックポイント分子に対するアンタゴニスト抗体は、PDL1、PDL2、PD1、CTLA-4、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3、及びホスファチジルセリン(PS)に対する抗体を包含する。阻害サイトカインに対するアンタゴニスト抗体は、CCL2、CSF-1、及びIL-2に対する抗体を包含する。
8週齢(+/-2週齢)の15匹のC57Bl6/NTacマウスのグループの皮下を、実施例19に記載されたように腫瘍細胞で攻撃する。埋め込みの前に動物をイソフルランで麻酔する。2日目から開始して、3日目、6日目、及び9日目に、マウスに、200ugの抗TREM1抗体単独で、又は刺激チェックポイントタンパク質を活性化するアゴニスト抗体(例えば、OX40又はICOS mAb)と組み合わせて3日毎に4用量で腹腔内注射する。4日目から開始して2週に1回カリパスを用いてモニターして、腫瘍増殖を測定する。実験の評価項目は、2000mm3の腫瘍体積又は60日である。腫瘍増殖及び生存率パーセントが転帰尺度である。併用療法による腫瘍増殖の減少及び生存率パーセントの増加は、抗TREM1抗体が、刺激チェックポイント抗体と相加的又は相乗的な治療作用を有することを示す。刺激チェックポイント抗体は、CD28、ICOS、CD137、CD27、CD40、及びGITRに対するアゴニスト/刺激性の抗体を包含する。
8週齢(+/-2週齢)の15匹のC57Bl6/NTacマウスのグループの皮下を、実施例19に記載されたように腫瘍細胞で攻撃する。埋め込みの前に動物をイソフルランで麻酔する。2日目から開始して、マウスに、200ugの抗TREM1抗体単独で、又は刺激性サイトカイン(例えば、IL-12、IFN-a)と組み合わせて3日毎に4用量で腹腔内注射する。4日目から開始して2週に1回カリパスを用いてモニターして、腫瘍増殖を測定する。実験の評価項目は、2000mm3の腫瘍体積又は60日である。腫瘍増殖及び生存率パーセントが転帰尺度である。併用療法による腫瘍増殖の減少及び生存率パーセントの増加は、抗TREM1抗体が、免疫刺激性サイトカインとの相加的又は相乗的な治療作用を有することを示す。刺激性サイトカインは、IFN-a/b、IL-2、IL-12、IL-18、GM-CSF、及びG-CSFを包含する。
アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体の治療有用性を、炎症性疾患のモデル、例えばリウマチ様関節炎又は別の炎症性疾患の確立されたモデル(Mizoguchi (2012) Prog Mol Biol Transl Sci.、105:263-320;及びAsquithら、(2009) Eur J Immunol. 39:2040-4)で試験する。
成体の7-9週齢の雌C57BL/6マウス(Charles River Laboratoriesから入手)の尾の付け根の両側に、不完全フロイントアジュバント(Difco)中の100μgのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(アミノ酸MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(配列番号497);Seqlab)及び1mgのヒト型結核菌H37Ra(Difco)を含有する200μlの接種材料を注射する。免疫化後の0日目及び2日目に百日咳毒素(200ng;List Bio-logical Laboratories)を注射する。臨床徴候は、以下のようにスコア付けされる:0、臨床徴候なし;1、完全な尾の引きずり;2、完全な尾の引きずり及び異常な歩行;3、1本の後肢の対不全麻痺;4、完全な後脚対不全麻痺;及び5、前肢及び後肢の麻痺又は瀕死。14日目に疾患が発病したマウスのみ(1又はそれより高い臨床スコア)を実験に使用する。EAE罹患マウスに、アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体を、最初の臨床症状の日に、又は他のあらゆる望ましい時間に腹腔内又は静脈内注射する(PLoS Med (2007) 4(4): e124)。
アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体の治療有用性が、外傷性脳損傷の確立された動物モデルで試験する(Tanaka, Yら(2013) Neuroscience 231 49-60)。例えば、小グリア細胞及び星状細胞の活性化を誘導する外傷性脳損傷のモデルを使用する。8又は9週齢の雄C57BL/6J WTマウス又はプログラニュリンヘテロ接合型マウスを使用する(Charles River Laboratories又はJackson Laboratoriesから購入)。滅菌塩類溶液中に溶解したキシラジン塩酸塩(8mg/kg)及び抱水クロラール(300mg/kg)の腹膜内投与によってマウスを麻酔し、その後、定位装置(ナリシゲ、日本、東京)に入れた。頭皮を切開し、頭蓋を露出させる。頭蓋骨から骨膜を取り去り、歯科用ドリルを用いて右大脳半球上にドリルで穴を開け、針の先端で硬膜を除去する。外径0.5mmのステンレス鋼カニューレを使用して、右半球に縦の刺創を作る。カニューレを中線の1.3mm横方向、及びブレグマの1mm後方に配置し、先端が深さ2mmに達するまで脳に導入する。次いでカニューレを尾側に2mm(ブレグマ3mm)シフトさせ、次いでその最初の位置に対して吻側に2mm後ろにシフトさせる。最終的に、カニューレを脳から除去し、頭皮創傷を縫合した。
アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体の治療有用性を、毒素によって誘導された損傷後の神経炎症及びニューロン損失のモデルで試験する(Martens, LHら、(2012) The Journal of Clinical Investigation、122、3955)。3月齢のマウスを、2日にわたり1日当たり4回のMPTP(1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン)の腹膜内注射(4μg/g体重)(Sigma-Aldrich)又はPBSで処理する。標準的なプロトコールに従ってアゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体でマウスを処理し、次いで立体解析学的な計数を使用して分析して、黒質緻密部(SNpc)中のドーパミンニューロン及び小グリア細胞を記載された通りに定量する。
アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体は、マーカーCD83及びCD86を発現し、次いで抗原特異的なT細胞増殖を誘導する骨髄由来樹状細胞(BMDC)の能力を増加させることができると考えられる。TREM1抗体が、樹状細胞上で細胞表面マーカーCD83及びCD86の発現を誘導するかどうかを決定するために、12ウェルのプレート中にPBS中2又は5μg/mlで抗体を4℃で一晩プレーティングする。次の日ウェルをPBSで3回洗浄し、5日目に未成熟のヒトDCを回収し、細胞100万個/ウェルでプレーティングし、サイトカインの非存在下で、37C、5%CO2でインキュベートする。48時間後、CD86、CD83及びCD11c(BD Biosciences)のFACS分析をBD FACS Canto上で実行する。データ分析を、FlowJo(TreeStar)ソフトウェアバージョン10.0.7を用いて実行した。代替として、5日目に、U型の底のTCで処理されていない96ウェルのプレートで、サイトカイン非含有の培地中で、細胞100,000個/ウェルで未成熟のヒト樹状細胞をプレーティングする。20μg/mlのLPS除去した抗ヒト二次抗体(Jackson ImmunoResearch)と共に、又はそれなしで、抗体を5μg/mlで添加する。CD86、CD83、及びCD11c(BD Biosciences)のFACS分析を、前に記載した通りに抗体添加の48時間後に実行する。BMDCにより誘導されたオボアルブミン(OVA)特異的なT細胞応答は、CFSE希釈によって決定することができる。培養6日後にBMDCをMACSによって単離し、GM-CSF(10ng/mL)の存在下で4時間、OVA(2又は0.5mg/mL)及びCpG DNA(100又は25nM)と共に、丸底の96ウェルのプレートの1ウェル当たり細胞1×104個でプレーティングする。OT-IIトランスジェニックマウスの脾臓及びリンパ節からのCD4T細胞を、Dynal Mouse CD4 Negative Isolation Kit(Invitrogen)を使用することによって単離し、CFSE(最終濃度0.8mM)で染色する。DC培養の4時間後、1×105個のCFSE標識CD4 OT-II T細胞を各ウェルに添加し、72時間インキュベートする。培養後、細胞を抗CD4モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーを実行して、ゲーティングしたCD4 OT-II T細胞のCFSE希釈を検出する。分裂及び分割インデックスのパーセンテージを計算するためのデータ分析を、Flowjoソフトウェア(Treestar)(Eur. J. Immunol.2012.42: 176-185)によって実行する。
CD83及びCD86の発現を修飾する抗TREM1抗体の能力を評価するために、プレートと結合した抗体及び可溶性抗体の両方を、樹状細胞(DC)と共にインキュベートし、CD83、CD86、CCR7、及びリン酸化ERKの発現を測定した。T細胞増殖をモジュレートする抗TREM1抗体の能力を評価するために、T細胞及び抗TREM1抗体と共にDCをインキュベートし、T細胞増殖のレベルを測定する。12ウェルのプレート中で、抗体を、PBS中2又は5ug/mlで、4Cで一晩プレーティングする。次の日ウェルをPBSで3回洗浄する。5日目に、未成熟のヒトDCを回収し、細胞100万個/ウェルでプレーティングし、サイトカインの非存在下で、37C、5%CO2でインキュベートする。48時間後、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR、及びLIN(BD Biosciences)のFACS分析をBD FACS Canto上で実行する。データ分析を、FlowJo(TreeStar)ソフトウェアバージョン10.0.7を用いて実行する。CD11c+HLA-DR+LIN-細胞集団のCD83、CD86、及びCCR7のレベルを評価する。細胞内ERKのリン酸化のために、細胞を1%ホルムアルデヒドで固定し、cytofix/cytopermキット(BD)で透過性にし、PE-ERK抗体(BD)で染色した後、細胞内Erkのリン酸化をフローサイトメトリーで決定する。
TLR応答を修飾する抗TREM1抗体の能力を評価するために、骨髄由来のマクロファージ(BMDM)又は一次腹腔マクロファージのTLRシグナル伝達に対する応答を、TREM1の欠乏によって変更する(Turnbull、IRら、J Immunol 2006;177:3520-3524)。アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体は、マクロファージにおけるTLR応答を増加又は正常化できると考えられる。一次マクロファージを惹起するために、マウスを、1.5mlの2%チオグリコレート媒体で腹膜内注射により処理し、次いで腹膜の洗浄によって細胞を単離する。BMDMを生成するために、全ての骨髄を、10%ウシ血清、5%ウマ血清、及び6ng/ml組換えヒトCSF-1が補充されたDMEM(R&D Systems)中で培養する。細胞を5-6日培養し、接着細胞をPBS中の1mMのEDTAで取り外す。細胞を、市販の抗体:抗CD11b、抗CD40、抗GR1(BD Pharmingen)、及びF4/80(Caltag Laboratories)で染色する。BMDMを再度プレーティングし、37℃で4時間接着させ、次いでTLRアゴニスト、例えばLPS(ウマ流産菌(Salmonella abortus equi))、ザイモサン(サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae))、及びCpG1826DNA(例えば、Sigma-Aldrichから購入)などを添加する。刺激の24時間後に細胞培養上清を収集し、培養上清中のIFN-a4、IFN-b、IL-6、IL-12p70、及びTNFサイトカイン濃度のレベルを、マウスIFN-a4、IFN-b、IL-6、IL-12p70、TNF、及びIL-10 ELISAキット(eBioscience)並びにVeriKineマウスIFN-b ELISAキット(PBLインターフェロン源)を製造元のプロトコールに従って使用して決定する。代替として、ヒト又はマウスサイトカインのためのCytometricビーズアレイ(BD Biosciences)、又はメソスケールディスカバリーシステムを備えたV-PLEXヒト若しくはマウスサイトカインシステムを使用することができる。代替として、サイトカイン分泌を分析するために、示された遺伝子型を有するBM由来マクロファージを5日目に回収し、96ウェルのプレート上に105細胞/ウェルでプレーティングする。次いで細胞を示された濃度のLPS又はザイモサンで刺激する。24時間後、細胞培養上清を回収し、FACSにより、炎症性サイトカイン(IL-12、IL-10、IFN-γ、TNFa、IL-6、MCP-1)の存在について、Cytometricビーズアレイキット(BD、製造元の説明書に従う)を使用して分析する。細胞をFACSによっても分析して、生存率(DAPI)及び表面マーカー(CD11b、CD86)の発現を評価する。
骨髄由来のマクロファージ(BMDM)又は一次腹腔マクロファージ応答は、TREM1が欠失した場合、変更されたTLRシグナル伝達を有する(Turnbull、IRら、J Immunol 2006;177:3520-3524)。TREM1抗体が、炎症性サイトカイン産生における変化を誘導するかどうかを決定するために、マウス野生型(WT)及びTREM1 KOマウス(KO)又はTREM1ヘテロ接合型(HETS)を、抗体単独、又は非飽和レベルのTLR刺激因子と組み合わせた抗体と共に培養し、24-48時間の後にサイトカインのレベルを測定する。BMDMを生成するために、野生型(WT)からの全ての骨髄を、10%ウシ血清、5%ウマ血清、及び50ng/ml組換えマウスCSF-1が補充されたRPMI(R&D Systems)中で培養した。細胞を5日間培養し、接着細胞をPBS中の1mMのEDTAで取り外す。BMDMを、96ウェルのプレート上に細胞105個/ウェルでプレーティングし、37℃で4時間接着させる。次いで細胞を抗体単独に曝露し、TLRアゴニストであるLPS(ウマ流産菌)又はザイモサン(サッカロミセス・セレビジエ)で、単独で0.01-100ng/ml(LPS)又は0.01-100□g/ml(ザイモサン)の範囲の濃度で刺激するか、又はTREM1抗体と組み合わせてLPS又はザイモサンで刺激する。代替として、WT及びKOマウスから単離されたマクロファージを、TREM1抗体と共に、又はそれなしで、10ng/mlのサイトカインIL-4又は50ng/mlのIFN-□□の存在下で培養する。刺激の24又は48時間後に細胞培養上清を収集し、TNFa、IL-6、IL-10、及びMCP-1サイトカインのレベルを、Cytometric Bead Array Mouse Inflamation Kit(BD)を製造元のプロトコールに従って使用することによって測定した。
骨髄由来の骨髄前駆細胞は、アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体で処理し、アポトーシス細胞と共培養することによって、又は類似の刺激によって100ng/mlのLPS(Sigma)で刺激した後、抗炎症性サイトカインIL-10の減少を示す可能性があると考えられる。骨髄由来の骨髄前駆細胞の単離を、以下のように実行する。骨髄細胞を、6-8週齢の成体雌C57BL/6マウス(Charles River、Sulzfeld、Germany)及びTREM1欠失マウス(KOMPリポジトリ)の後肢の脛骨及び大腿骨の髄腔から単離する。赤血球の除去を、低張溶液での溶解によって実行する。75cm2の培養フラスコ(Greiner Bio-One)中で、細胞を、10%ウシ胎児血清(Pan Biotech)及び10ng/mlのGM-CSF(R&D Systems)を含有するDMEM培地(Invitrogen)中で培養する。24時間後、非接着細胞を収集し、新しい75cm2の培養フラスコ中に再度播種する。5日後に培地を換え、追加の10-11日間細胞を培養する。TREM1抗体の存在又は非存在下で細胞を培養し、24時間後に上清を収集し、細胞から放出されたIL-10のレベルを、IL-10 ELISAにより製造元の説明書に従って決定する(QuantikineMマウスIL-10、R&D Systems)(JEM (2005), 201; 647-657;及びPLoS Medicine (2004), 4 | Issue 4 | e124)。
アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体は、アポトーシスニューロン、神経組織細片、非神経組織細片、細菌、その他の異物、及び疾患を引き起こすタンパク質、任意選択的に、例えばAベータペプチド、アルファシヌクレインタンパク質、タウタンパク質、TDP-43タンパク質、プリオンタンパク質、ハンチンチンタンパク質、RAN、翻訳生成物のアンチジーンなど、例えば、骨髄系統、例えば単球、樹状細胞マクロファージ及びミクログリア細胞などからの細胞における、グリシン-アラニン(GA)、グリシン-プロリン(GP)、グリシン-アルギニン(GR)、プロリン-アラニン(PA)、又はプロリン-アルギニン(PR)で構成されるジペプチドリピート(DPRペプチド)などの貪食を誘導できると考えられる。二重特異性抗体は、TREM1抗原及び第2の抗原を認識する抗体であってもよく、このようなものとしては、限定するものではないが、Aベータペプチド、抗原若しくはアルファシヌクレインタンパク質アンチジーン、又はタウタンパク質アンチジーン、又はTDP-43タンパク質アンチジーン、又はプリオンタンパク質アンチジーン、又はハンチンチンタンパク質アンチジーン、又はRAN、翻訳生成物アンチジーン、例えばグリシン-アラニン(GA)、グリシン-プロリン(GP)、グリシン-アルギニン(GR)、プロリン-アラニン(PA)、又はプロリン-アルギニン(PR)で構成されるジペプチドリピート(DPRペプチド)などが挙げられる。単球は、成体C57BL/6マウスから収集される末梢血液から単離される。低張性溶解緩衝液により赤血球を枯渇させる。10%ウシ胎児血清(Pan Biotech)を含有するRPMI培地(Invitrogen)中で、培養皿上に細胞をプレーティングする。10%CO2、37℃で数時間細胞を培養する。トリプシン処理後、接着細胞を収集し、貪食実験に使用する。
抗TREM1及び/又はTREM1/二重特異性抗体は、ミクログリア細胞、マクロファージ、及び樹状細胞におけるCCR7及びCCL19及びCCL21への移動を誘導できると考えられる。ミクログリア細胞、マクロファージ又は樹状細胞の何れかを、アゴニスト抗TREM1及び/若しくはTREM1/DAP12二重特異性抗体、又はコントロール抗体と共に培養する。72時間後に細胞を収集し、CCR7特異的抗体で免疫標識し、フローサイトメトリーによって分析する。増加したCCR7発現のあらゆる機能的な帰結を決定するために、走化性アッセイを実行する。ミクログリア細胞、マクロファージ又は樹状細胞を、TREM1を介してアゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1/DAP12二重特異性抗体で刺激し、2つのチャンバーシステムに入れる。ケモカインリガンドCCL19及びCCL21に移動するミクログリア細胞の数を定量する(JEM (2005)、201、647-657)。走化性アッセイのために、ミクログリア細胞、マクロファージ又は樹状細胞を、アゴニスト抗TREM1又はTREM1/二重特異性抗体に曝露し、1μg/mlのLPSで処理する。ミクログリア細胞、マクロファージ又は樹状細胞を、下のチャンバー中に100ng/mlのCCL19又はCCL21(両方ともPeproTech)を含む450μlの培地を含有するトランスウェルシステム(3μm孔のフィルター;Millipore)の上のチャンバーに移す。1時間のインキュベーション期間後、下のチャンバーに移動したミクログリア細胞、マクロファージ又は樹状細胞の数を、3つの独立した領域で顕微鏡法により計数する(JEM (2005)、201、647-657)。
アゴニスト抗TREM1又はTREM1二重特異性抗体は、ミクログリア細胞、マクロファージ、及び樹状細胞においてF-アクチンを誘導できると考えられる。TREM1で形質導入されるか又はTREM1を発現する、ミクログリア細胞、マクロファージ又は樹状細胞及び他の目的の細胞を培養プレートに添加し、次いでアゴニスト抗TREM1及び/若しくはTREM1二重特異性抗体、又はコントロール抗体に曝露する。細胞を固定し、遮断し、次いで1時間後、Alexa Fluor546コンジュゲートファロイジン(Molecular Probes)で染色し、F-アクチンを蛍光色素で標識する。40×の対物レンズ(Leica)を備えた共焦点レーザー顕微鏡検査法によって画像を収集する。(JEM (2005)、201、647-657)。
アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体は、破骨細胞産生を誘導し、破骨細胞形成速度を増加させることができると考えられる。破骨細胞を作り出すRAW264.7細胞又は骨髄由来の単球/マクロファージ(BMM)前駆細胞を、10%FBS(Atlantic Biologics、Atlanta、GA、USA)及びペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(Mediatech)が補充された、RPMI-1640培地(Mediatech)、又は別の適切な培地中で維持する。FLAGエピトープがN末端に付加されたTREM1BのcDNAを、IRESのレトロウイルスベクターpMXpie上流に挿入し、続いてeGFPのcDNA配列を挿入する。Fugene6(Roche)を製造元のプロトコールに従って使用して、細胞をpMXpie-FLAG TREM1Bでトランスフェクトする。2μg/mlのピューロマイシン(Sigma)中で細胞を選択する。安定なピューロマイシン耐性クローンを、フローサイトメトリーを使用することによって抗FLAG M2モノクローナル抗体(Sigma)の結合についてスクリーニングし、次いでサブクローニングし、ピューロマイシン選択培地で維持する。
アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体の治療有用性を、前に記載した通りに、老化、発作、脊髄の損傷、網膜ジストロフィー、前頭側頭認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びアルツハイマー病のための動物モデルで試験する(例えば、Beattie, MSら、(2002) Neuron 36、375-386; Volosin, Mら、(2006) J. Neurosci. 26、7756-7766; Nykjaer, Aら、(2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15、49-57; Jansen, Pら、(2007) Nat. Neurosci. 10、1449-1457; Volosin, Mら、(2008) J. Neurosci. 28、9870-9879; Fahnestock, Mら、(2001) Mol. Cell Neurosci. 18、210-220; Nakamura, Kら、(2007) Cell Death. Differ. 14、1552-1554; Yune, Tら、(2007) Brain Res. 1183、32-42; Wei, Yら、(2007) Neurosci. Lett. 429、169-174; Provenzano, MJら、(2008) Laryngoscope 118、87-93; Nykjaer, Aら、(2004) Nature 427、843-848; Harrington, AWら、(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101、6226-6230; Teng, HKら、(2005) J. Neurosci. 25、5455-5463; Jansen, Pら、(2007) Nat. Neurosci. 10、1449-1457; Volosin, Mら、(2008) J. Neurosci. 28、9870-9879; Fan, YJら、(2008) Eur. J. Neurosci. 27、2380-2390; Al-Shawi, Rら、(2008) Eur. J. Neurosci.27、2103-2114; and Yano, Hら、(2009) J. Neurosci. 29、14790-14802)。
アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体の治療有用性を、前に記載した通りに、アテローム性動脈硬化症のモデルで試験する(例えば、Lance, Aら、 (2011) Diabetes, 60, 2285; and Kjolby, Mら、 (2012) Cell Metabolism 12, 213-223)。
アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体の治療有用性を、感染のモデルで試験する。例えば、正常マウス又はプログラニュリンヘテロ接合型マウスにおけるリステリア・モノサイトゲネス又は他の感染を、前に記載した通りに使用することができる(例えば、Yin, Fら、(2009) J. Exp. Med、207、117-128)。
細胞(J774、RAW264.7、BMM細胞、又は破骨細胞)を、PBS-EDTAを用いて組織培養皿から除去し、PBSで洗浄し、計数する。J774(40×106個)又はRAW264.7細胞(10×106個のBMM又は破骨細胞)を、1μg/106個の細胞で氷上で20分、又は他の条件下で、抗TREM1及び/若しくはTREM1二重特異性抗体、又はアイソタイプ適合コントロール抗体と共にインキュベートする。氷冷した放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液中で20分細胞を溶解させ、続いて16,000gで10分、4℃で遠心分離して、不溶性物質を除去する。得られた上清を、示された抗体(DAP12、ERK、又はAKT)及びプロテインA又はプロテインG-アガロース(Sigma)を用いた免疫沈降反応に供する。ビーズをRIPA緩衝液で徹底的に洗浄し、タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離する。次いでタンパク質をウェスタンブロッティングによってニトロセルロースメンブレンに移し、適切な抗体(DAP12、ERK、又はAKTのリン酸化された形態を特異的に認識する抗体)と共にインキュベートし、増強化学発光(ECL)システム(Pierce)を用いて記載された通りに可視化する(例えば、Pengら、(2010) Sci Signal.、3(122): ra38)。
BMM細胞をHEPES含有緩衝液[20mMのHEPES(pH7.3)、120mMのNaCl、1mMのCaCl、1mMのMgCl、5mMのKCl、グルコース(1mg/ml)、ウシ血清アルブミン(1mg/ml)]で2回洗浄し、続いて0.05%Pluronic F-127(Invitrogen)及び1μMのIndo-1AM(Invitrogen)中で37℃で20分インキュベートする。細胞をHEPES緩衝液で2回洗浄し、次いで抗TREM1及び/若しくはTREM1二重特異性抗体(16μg/ml)又はコントロール抗体(16μg/ml)で刺激し、分光光度計(PTL Photon Technology International)によってモニターする。製造元の説明書に従ってIndo-1蛍光発光をカルシウム(Ca2+)に変換する(例えば、Pengら、(2010) Sci Signal.、3(122): ra38)。
脛骨及び大腿の骨髄細胞を冷PBSでフラッシングすることによって、マウス骨髄前駆体を得る。PBSで1回洗浄した後、ACK溶解緩衝液(Lonza)を使用して赤血球を溶解させ、PBSで2回洗浄し、マクロファージを作製するための示された量の50ng/mlのM-CSF又は10ng/mlのGM-CSFを含む完全RPMI培地(10%FCS、Pen/Strep、Gln、neAA)中に細胞0.5×106個/mlで懸濁する。M2型マクロファージの場合、10ng/mlのIL-4を培養細胞に添加する。M1型マクロファージの場合、50ng/mlのIFN-γを添加する。一部の実験において、5日目に、LPS又はザイモサンを1μg/ml-0.01ng/mlの濃度で細胞培養物に添加する。組換えサイトカインをPeproTechから購入した。BM由来マクロファージの生存率を分析するために、示された遺伝子型の細胞を上述した通りに調製し、段階的な濃度のMCSF中で培養する。細胞は、96ウェルのプレート中に105個/200μlでプレーティングするか(ルシフェラーゼベースのアッセイを使用した生存率分析のため)、又は組織培養で処理されていないプレート中の6ウェルのプレート中に0.5×106個/1mlでプレーティングするか(トリパンブルー排除細胞計数のため)の何れかである。新鮮なM-CSFを含有する培地を3日目に添加する。示されたタイムポイントで、3mMのEDTAを用いてプレートから穏やかに細胞を取り外し、Burkerチャンバーを使用して計数する。一部の実験において、FACS分析のためにもCD11b抗体及びDAPIを使用して細胞を染色する。代替として、細胞を、ToxGlo試薬(Promega)と直接インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を決定する。一部の実験において、5日目にMCSFを培養培地からから引き出すか又は引き出さずに、細胞の生存率を36時間後にFACSによって分析する。成熟破骨細胞培養物を、24ウェルの培養皿中でRANKL及びM-CSFで識別する。4日後、完全培地を無血清培地で交換して、アポトーシスを誘導する。細胞を、一晩の血清飢餓状態で、RANKL、PBS、並びに抗TREM1及び/若しくはTREM1二重特異性抗体、又はアイソタイプ適合コントロール抗体で処理する。細胞を1%パラホルムアルデヒド中で固定し、TUNELベースのキット(Millipore社)を製造元の説明書に従って用いて染色した。Nikon TE2000-E顕微鏡で20×の倍率を用いてアポトーシスを起こした核を計数する。結果は、2つのウェルの6つの無作為に選択した視野における細胞総数に対するアポトーシス細胞のパーセンテージとして記載された通りに表される(例えば、Pengら、(2010) Sci Signal.、3(122): ra38)。類似のアッセイを一次ミクログリア細胞を用いて実行する。
細胞生存におけるTREM1の役割を評価するために、野生型(WT)、TREM1ノックアウト(KO)、並びにTREM1ヘテロ接合型(Het)マクロファージ及び樹状細胞を、TREM1抗体又はその断片の存在下で培養し、細胞の生存率を決定する。
マウス胚幹細胞由来のミクログリア細胞を、療法とも細胞内免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)モチーフが欠失した全長又は短縮型のTyrobpの何れかを過剰発現するようにレンチウイルスベクターによって遺伝子改変する。ミクログリア細胞はまた、TREM1についてヘテロ接合型のマウス胚幹細胞由来でもある。Tyrobp又はTREM1の変動に応答したゲノム規模での遺伝子発現の変化を評価するために、遺伝子発現データを、(1)ビヒクル、(2)全長Tyrobp、若しくは(3)ドミナントネガティブ短縮型Tyrobpを過剰発現する;又は(4)TREM1のノックダウン構築物、例えばSiRNAなどを過剰発現するマウスミクログリア細胞のマクロファージ又は樹状細胞、及びTREM1についてヘテロ接合型の細胞、加えてTREM1欠失マウス由来の細胞のRNAシーケンシングから得る。全長Tyrobp及び短縮型Tyrobの過剰発現に対しておよそ2,638個及び3,415個の差次的に発現された遺伝子がそれぞれ同定される(Zhangら、(2013) Cell 153、707-720)。無傷のTyrobpを過剰発現するミクログリア細胞から差次的に発現された遺伝子のおよそ99%が、コントロールビヒクルと比較して下方制御される。例えば、658個の遺伝子が、小胞/自食作用に関し、同様にRNA代謝及び細胞周期の有糸分裂に関与する遺伝子は、活性Tyrobpによって下方制御されるが、ドミナントネガティブ短縮型Tyrobpを発現する細胞において上方制御される。逆に言えば、小胞/自食作用経路及びミトコンドリアに関する一部の2,856個の遺伝子は、ドミナントネガティブ短縮型Tyrobpを発現するミクログリア細胞中で選択的に上方制御される。アゴニスト抗TREM1及び/又はTREM1二重特異性抗体を、正常なミクログリア細胞、及びドミナントネガティブ短縮型Tyrobpを発現する細胞(Zhangら、(2013) Cell 153、707-720)、TREM1がノックダウンされた構築物を発現する細胞、又はTREM1についてヘテロ接合型である細胞中で無傷のTyrobpを過剰発現するミクログリア細胞で観察された遺伝子発現プロファイルに類似した遺伝子発現プロファイルを惹起するそれらの能力についてスクリーニングする。遺伝子発現ネットワークを変化させることが可能な抗体を選択する。
8週齢(+/-2週齢)の10匹のC57Bl6/NTacマウスのグループの皮下を、100ulのPBSに懸濁した腫瘍細胞(例えば1×105から1×106個のMC38、ルイス肺、又はB16細胞)で攻撃する。埋め込みの前に動物をイソフルランで麻酔する。2日目から開始して、マウスのグループに、200ugのアンタゴニスト抗TREM1抗体のそれぞれ、例えば実施例38及び40に記載されたものを3日毎に4用量で腹腔内注射する。4日目から開始して2週に1回カリパスを用いてモニターして、腫瘍増殖を測定する。実験の評価項目は、2000mm3の腫瘍体積又は60日である。腫瘍増殖及び生存率パーセントが転帰尺度である。腫瘍の取り込み及び増殖速度の低減、腫瘍浸潤性の免疫サプレッサーマクロファージの数の低減、及び腫瘍へのエフェクターT細胞流入の増加が、抗TREM1抗体を遮断する抗癌作用を示す。
8週齢(+/-2週齢)の15匹のC57Bl6/NTacマウスのグループの皮下を、腫瘍細胞で攻撃する。埋め込みの前に動物をイソフルランで麻酔する。2日目から開始して、3日目、6日目、及び9日目に、マウスに、200ugの抗TREM1抗体を単独で、又はチェックポイントタンパク質に対する抗体(例えば抗PDL1mAbクローン10F.9G2及び/又は抗CTLA-4mAbクローンUC10-4F10-11)と組み合わせて3日毎に4用量でi.p.注射する。処理グループは、抗TREM1;抗CTLA-4;抗PDL1;抗TREM1+抗CTLA-4;抗TREM1+抗PDL1;及びアイソタイプコントロールを包含する。4日目から開始して2週に1回カリパスを用いてモニターして、腫瘍増殖を測定する。実験の評価項目は、2000mm3の腫瘍体積又は60日である。腫瘍増殖及び生存率%が転帰尺度である。併用療法による腫瘍増殖の減少及び生存率%の増加は、抗TREM1抗体が、抗チェックポイント抗体との相加的又は相乗的な治療作用を有することを示す。チェックポイント分子に対するアンタゴニスト抗体としては、PDL1、PDL2、PD1、CTLA-4、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3、及びホスファチジルセリン(PS)に対する抗体が挙げられる。阻害サイトカインに対するアンタゴニスト抗体は、CCL2、CSF-1、及びIL-2に対する抗体を包含する。
8週齢(+/-2週齢)の15匹のC57Bl6/NTacマウスのグループの皮下を、腫瘍細胞で攻撃する。埋め込みの前に動物をイソフルランで麻酔する。2日目から開始して、3日目、6日目、及び9日目に、マウスに、200ugの抗TREM1抗体単独で、又は刺激チェックポイントタンパク質を活性化するアゴニスト抗体(例えば、OX40又はICOS mAb)と組み合わせて3日毎に4用量で腹腔内注射する。4日目から開始して2週に1回カリパスを用いてモニターして、腫瘍増殖を測定する。実験の評価項目は、2000mm3の腫瘍体積又は60日である。腫瘍増殖及び生存率パーセントが転帰尺度である。併用療法による腫瘍増殖の減少及び生存率%の増加は、抗TREM1抗体が、刺激チェックポイント抗体と相加的又は相乗的な治療作用を有することを示す。刺激チェックポイント抗体としては、CD28、ICOS、CD137、CD27、CD40、及びGITRに対するアゴニスト/刺激性の抗体が挙げられる。
中大脳動脈(MCAO)の一時的な閉塞、すなわちヒト卒中に厳密に似ているモデルを使用して、マウスにおいて脳梗塞を誘導する。モノフィラメント(70SPRe、Doccol Corp、USA)を、右総頚動脈の切開部を介して内頸動脈に導入する。中大脳動脈を、様々な再灌流時間(6時間、12時間、24時間、2日、7日及び28日)で30分閉塞する。12時間及び7日に、偽動物を使用して外科手術の作用を調節する。偽動物は、中大脳動脈を閉塞させずに同じ外科手術を受ける。アゴニスト抗TREM1抗体又はコントロール抗体で処理されたMCAO動物を、梗塞の容量測定、急性炎症性反応(12時間の再灌流)、炎症促進性サイトカインTNFa、IL-1a、及びIL-1bの転写、ミクログリア細胞の活性(CD68、Iba1)、ケモカインCCL2(MCP1)、CCL3(MIP1a)及びケモカイン受容体CX3CR1の転写、並びにCD3陽性T細胞の浸潤について試験する(Sieberら、(2013) PLoS ONE 8(1): e52982. doi:10.1371/journal.pone.0052982) 。
抗TREM1抗体の、アルツハイマー病(AD)の発症を遅延させる、予防する、又は逆転させる能力を評価するために、5X FADマウスを使用する。5X FADマウスは、スウェーデン(K670N、M671L)、フロリダ(I716V)、及びロンドン(V717I)家族性アルツハイマー病(FAD)突然変異を有する突然変異ヒトAPP(695)を、2つのFAD突然変異、M146L及びL286Vを有するヒトPS1と共に過剰発現する。両方の導入遺伝子は、マウスThy1プロモーターによって、脳での過剰発現を駆動させADの主要な特徴を再現するように制御される。免疫組織化学を用いて、さらに組織抽出物のELISAによって、アゴニスト抗TREM1抗体又はコントロール抗体で処理されたマウスをAベータ斑の負荷量について試験する。学習及び記憶、並びに恐怖条件付けを評価するために、マウスをさらに、モーリスの水迷路、空間学習及び記憶課題、放射アーム水迷路、空間学習及び記憶課題、Y迷路(空間認知の尺度としての自発的交替行動を定量する)、オープンフィールドにおける嗜好性、オペラント学習を使用して、脳中のミクログリア細胞の数及び認知障害の低減について試験する(mousebiology.orgのウェブサイト;Wangら、(2015) Cell. pii: S0092-8674(15)00127-0)。
細菌による気道感染を遅延させる、予防する、又は処置するTREM1抗体の能力を評価するために、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)でのC57Bl6マウスの攻撃を含む前臨床マウスモデルを使用する。このモデルは、105CFUの肺炎連鎖球菌血清型3(ATCC6303)を記載された通りに鼻腔内(i.n.)投与することを含む(例えば、Sharif Oら、2014 PLoS Pathog. 2014年6月; 10(6): e1004167;及びSchabbauer Gら、2010 J Immunol 185: 468-476を参照のこと)。このモデルにおいて、WT C57Bl6マウスの~90%が感染後6日以内に感染で死亡する。1グループ当たりマウス10匹から15匹を肺炎連鎖球菌で刺激し、それに伴い0日目から開始して1日おきにアンタゴニスト抗TREM1抗体で処理する。肺炎連鎖球菌での攻撃の3時間前に抗TREM1抗体の第1の用量を投与する。マウスを15日間毎日モニターして、死亡事象をチェックする。細菌攻撃から生き残ったマウスの%を決定する。別の実験で、血液及び肺中の細菌負荷量の計数及びサイトカイン発現も決定する。感染の24又は48時間後、EDTA含有するチューブ中に血液を収集し、寒天プレート上にプレーティングして、血漿中の細菌のCFUを数える。ELISAによるサイトカイン分析のために血漿を-20℃で貯蔵する。肺を回収し、ホモジナイズし、寒天プレート上にプレーティングして、細菌のCFUを数えるか、又は溶解緩衝液中で30分インキュベートし、サイトカイン測定のために上清を分析する。別の実験で、細菌感染の40時間後に肺を収集し、10%ホルマリン中で固定し、H&E病理学分析のためにパラフィン中に埋め込む。
敗血症を遅延させる、予防する、又は処置するTREM1抗体の能力を評価するために、LPSでのC57Bl6マウスの全身攻撃を含む前臨床マウスモデルを使用する。このモデルは、37mg/mlのLPSを記載された通りに腹膜内(i.p.)投与することを含む(例えば、Gawish Rら、2014 FASEB Jを参照のこと)。このモデルにおいてWT C57Bl6マウスの>95%がLPS注射後40時間以内に感染で死亡する。マウスのコホートをLPSで攻撃し、それに伴いアンタゴニスト抗TREM1抗体で0日目から始めて毎日処理する。LPSでの攻撃の3時間前に抗TREM1抗体の第1の用量を投与する。昼間の間、マウスを~4時間毎にモニターして、死亡事象をチェックする。LPSでの攻撃から生き残ったマウスのパーセンテージを決定する。
大腸炎を遅延させる、予防する、又は処置する抗TREM1抗体の能力を評価するために、急性又は慢性大腸炎の前臨床マウスモデルを使用する。DSSによって誘導された大腸炎の場合、マウスに飲用水中3%のDSSを8日間にわたり適宜与える。TNBSによって誘導された大腸炎の場合、マウスを麻酔し、20%エタノール中3mg(vol/vol)のTNBSの直腸内注射又はコントロールとしてビヒクル単独で処理する。慢性大腸炎モデルの場合、2%DSSを5日間、それに続いて10日の回収期間を3サイクルで全てのマウスを処理する。全てのモデルにつき、体重の減少、便の堅さ、及び便潜血の存在を毎日モニターし、これを使用して、記載された通りに疾患活動性指標を計算する(例えば、Correale C、2013、Gastroenterology、2013年2月、pp.346-356.e3を参照のこと)。マウスのコホートを、アンタゴニスト抗TREM1抗体で0日目から始めて毎日処理し、DSS又はTNBS投与に供する。マウスを毎日モニターして、体重の減少、便の堅さ、及び便潜血の存在をチェックする。これらを毎日モニターして、記載された通りに疾患活動性指標を計算するのに使用した(例えば、S. Vetrano、Gastroenterology、135 (2008)、pp.173-184を参照のこと)。別の実験で、粘膜のダメージの内視鏡及び組織学的な画像を収集して、炎症細胞浸潤及び粘膜のダメージを評価する。クローン病、炎症性腸疾患、及び潰瘍性大腸炎などの他の自己免疫モデルにおけるTREM1抗体の利益を試験するために、類似の研究を実行してもよい(例えば、Lowら、(2013) Drug Des Devel Ther.;7: 1341-1357;及びSollidら、(2008) PLoS Med 5(9): e198を参照のこと)。
損傷後の結腸の創傷修復を増加させる抗TREM1抗体の能力を評価するために、結腸における生検損傷のマウスモデルを使用する。このモデルにおいて、外部操作されるシースを備えた内視鏡を中間から下行結腸に挿入し、肛門と直腸の接合部まで粘膜を調査する。次いで、単一の粘膜全体の全層領域及び粘膜下組織を、筋層の貫通を回避しながら直径3フレンチのフレキシブルな生検鉗子で除去する。各マウスにおいて、結腸の背面にそって3-5部位で生検損傷を与える(例えば、Seno H、2008、Proc Natl Acad Sci U S A. 2009年1月6日;106(1): 256-261を参照のこと)。生検損傷の2日後又は3日後に、マウスのコホートをアゴニスト抗TREM1抗体で処理する。マウスを15日間毎日モニターして、病変の表面領域を測定することによって体重の減少及び創傷治癒をチェックする。
AMDは、外部の網膜の変性疾患である。炎症、特に炎症性サイトカイン及びマクロファージはAMD疾患の進行に寄与すると考えられる。ドルーゼン、ブルック膜、脈絡膜及び網膜におけるAMD病変と近接したマクロファージの存在が報告されている。マクロファージは、組織因子(TF)及び血管内皮増殖因子(VEGF)を放出するが、これらは脈絡膜の血管新生を示す患者において新生血管形成の拡張の引き金になる。黄斑の脈絡膜中に存在するマクロファージのタイプは加齢に伴って変化し、より高齢の目ではより若い目と比較してM2マクロファージレベルの上昇を呈示する。しかしながら、進行中のAMD斑は、類似の年齢の正常な解剖された目と比較して、M2に対するM1の比率がより高い。(例えば、Cao Xら、(2011)、Pathol Int 61(9): pp528-35を参照のこと)。これは、古典的な目におけるM1マクロファージ活性化とAMD進行の後期発症との間に関連があることを示唆する。網膜のミクログリア細胞は、通常内部の網膜中にも存在する組織常在性のマクロファージである。ダメージの場合には、ミクログリア細胞は、活性化されて、炎症媒介物質として作用する可能性がある。AMD組織サンプルにおいて活性化されたミクログリア細胞が検出されており、AMDの病因を引き起こす炎症プロセスの1つの可能性のある寄与因子として提唱されている(Guptaら、(2003) Exp Eye Res.、76(4):463-71)。AMDを予防する、遅延させる、又は逆転させるアンタゴニストTREM1抗体の能力を、1つ又は複数のAMDモデルで試験する(例えば、Pennesiら、(2012) Mol Aspects Med.; 33(4): 487-509を参照のこと)。全体的な炎症性マクロファージ(M1及び/又は活性化されたミクログリア細胞の何れか)は、AMD疾患の進行と相関することが報告されており、それゆえにアンタゴニストTREM1抗体の治療標的の代表である。緑内障及び遺伝学的形態又は網膜変性、例えば網膜色素変性症などにおいても類似の治療的有用性を達成することができる。
脂肪生成及び肥満症におけるTREM1抗体の作用を試験するために、高脂肪食(HFD)のマウスモデルを使用する(例えば、Parkら、(2015) Diabetes. 64(1):117-27を参照のこと)。
非肝実質細胞におけるTREM1発現は、マラリア病原体のネズミマラリア原虫(Plasmodium berghei)による肝臓段階の感染に対する耐性と厳密に相関する(Goncalvesら、(2013) Proc Natl Acad Sci 26;110(48):19531-6)。理論に拘泥するものではないが、TREM1抗体は、ネズミマラリア原虫での肝臓段階の感染に対する耐性を増加させると考えられる。マラリア感染に対する耐性を増加させるTREM1抗体の能力を、Goncalvesら、(2013) Proc Natl Acad Sci 26;110(48):19531-6に記載されているようにして試験する。簡単に言えば、GFPを発現するネズミマラリア原虫ANKA種虫を、ハマダラカ(Anopheles stephensi)からの感染した唾液腺の切開によって得る。RPMI培地中の種虫懸濁液を、マウス1匹当たり104個の種虫を含有する100μLの接種材料でi.v.注射する。注射の40時間後に肝臓を収集するか、又は生存及び寄生虫血症を28日間にわたり追跡する。実験的な大脳マラリアのスコア付けのために、神経学的な症状を、注射後の5日目からモニターする。
骨は、カルシウムホメオスタシス及び構造的な必要性を維持するために絶えず再構築される動的な臓器である。破骨細胞は、骨の有機及び無機要素の両方の除去に関与する細胞である。破骨細胞は、マクロファージ系統の造血細胞祖先由来であり、NFκBリガンドの腫瘍壊死因子ファミリーのサイトカイン受容体活性化剤に応答して分化する。破骨細胞は、唯一の骨吸収細胞であり、これが、骨粗鬆症及び大理石骨病の病因の中心である(Novackら、(2008) Annual Rev Pathol.、3:457-84)。骨粗鬆症は、骨折のリスク増加を引き起こす可能性がある骨量及び密度の減少を特徴とする進行性の骨疾患である。これは、骨の転換が促進される場合、ほとんど閉経後の最初の数年で認められ、破骨細胞と骨芽細胞の両方の活性が増加する。しかしながら、再吸収及び合成プロセスにおける不均衡のために、正味の作用は骨量減少であり、これは、主として小柱である。したがって、骨粗鬆症における最も優勢な骨折部位は、手首、大腿頸部、及び椎体であり、これらにおいて小柱の構造が、全体の骨強度にとって重要である。骨粗鬆症を引き起こす破骨細胞分化の促進及び骨吸収能力の増加は、TREM1発現が欠失した動物モデルにおいて説明されている(Oteroら(2012) J. Immunol. 188、2612-2621)。破骨細胞機能の低減は、DAP12ITAMシグナル伝達アダプターが欠失した動物モデルで観察されるように、骨量の増加及び骨髄腔の消滅を伴う大理石骨病を引き起こし、結果として破骨細胞様細胞の分化の有意な欠陥が起こる(Kogaら、(2004) Nature 428: 758-763)。理論に拘泥するものではないが、本発明の開示の抗TREM1抗体の投与は、骨粗鬆症を予防する、骨粗鬆症のリスクを低減する、及び/又は骨粗鬆症を処理することができると考えられる。一部の実施態様において、アゴニスト抗TREM1抗体の投与は、大理石骨病を有する個体において1つ又は複数のTREM1活性を誘導することができる(例えば、DAP12リン酸化、Syk活性化、及び破骨細胞への分化の促進される)(Pengら(2010). Sci Signal. 2010 18;3 122; 及びHumphreyら、(2006) J Bone Miner Res.、21(2):237-45)。
TREM1は、ヒト癌において腫瘍浸潤骨髄細胞で発現され、TREM1活性のモジュレーションは、一部の腫瘍タイプでは他のものより多くの影響を有すると予測される。抗TREM1抗体が、疾患に影響を有する可能性が最も高い腫瘍タイプを同定するために、TCGAデータベース内の21種の腫瘍タイプにわたる8000個より多くの一次ヒト腫瘍サンプルを、RNAseqによって測定した場合、TREM1発現と患者生存との関連について照合した。発現と生存との関連を、Rにおけるコックス比例ハザードモデルにより、性別、年齢、及び腫瘍悪性度について補正して評価した。
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軽鎖可変領域配列
TI-1(ADI-19067)軽鎖可変領域(配列番号316)
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TI-2(ADI-19068)軽鎖可変領域(配列番号317)
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TI-3(ADI-19069)軽鎖可変領域(配列番号318)
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TI-4(ADI-19070)軽鎖可変領域(配列番号319)
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TI-5(ADI-19071)軽鎖可変領域(配列番号320)
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TI-6(ADI-19072)軽鎖可変領域(配列番号321)
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TI-7(ADI-19073)軽鎖可変領域(配列番号322)
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TI-8(ADI-19074)軽鎖可変領域(配列番号323)
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TI-9(ADI-19076)軽鎖可変領域(配列番号324)
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TI-10(ADI-19077)軽鎖可変領域(配列番号325)
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TI-11(ADI-19078)軽鎖可変領域(配列番号326)
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TI-12(ADI-19079)軽鎖可変領域(配列番号327)
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TI-13(ADI-19080)軽鎖可変領域(配列番号328)
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TI-14(ADI-19081)軽鎖可変領域(配列番号329)
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TI-15(ADI-19082)軽鎖可変領域(配列番号330)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAFISPPTFGGGTKVEIK
TI-16(ADI-19083)軽鎖可変領域(配列番号331)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADTLPITFGGGTKVEIK
TI-17(ADI-19084)軽鎖可変領域(配列番号332)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLATGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSDIHPRTFGGGTKVEIK
TI-18(ADI-19085)軽鎖可変領域(配列番号333)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQDSIYPITFGGGTKVEIK
TI-19(ADI-19086)軽鎖可変領域(配列番号334)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK
TI-20(ADI-19087)軽鎖可変領域(配列番号335)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYKSFSPFTFGGGTKVEIK
TI-21(ADI-19088)軽鎖可変領域(配列番号336)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSDLTFGGGTKVEIK
TI-22(ADI-19089)軽鎖可変領域(配列番号337)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYLIPPITFGGGTKVEIK
TI-23(ADI-19090)軽鎖可変領域(配列番号338)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQHQSFSPTFGGGTKVEIK
TI-24(ADI-19150)軽鎖可変領域(配列番号339)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQDSIYPITFGGGTKVEIK
TI-25(ADI-19092)軽鎖可変領域(配列番号340)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSVLPLTFGGGTKVEIK
TI-26(ADI-19097)軽鎖可変領域(配列番号341)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIFSTPLTFGGGTKVEIK
TI-27(ADI-19098)軽鎖可変領域(配列番号342)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFYDPITFGGGTKVEIK
TI-28(ADI-19101)軽鎖可変領域(配列番号343)
EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYLYFPLTFGGGTKVEIK
TI-29(ADI-19102)軽鎖可変領域(配列番号344)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGVNYPFTFGGGTKVEIK
TI-30(ADI-19103)軽鎖可変領域(配列番号345)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVISFPTFGGGTKVEIK
TI-31(ADI-19104)軽鎖可変領域(配列番号346)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDDFPPITFGGGTKVEIK
TI-32(ADI-19105)軽鎖可変領域(配列番号347)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLDLPFTFGGGTKVEIK
TI-33(ADI-19107)軽鎖可変領域(配列番号348)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQINDHPFTFGGGTKVEIK
TI-34(ADI-19108)軽鎖可変領域(配列番号349)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSINSWLAWYQQKPGKAPKLLISDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGPYPYTFGGGTKVEIK
TI-35(ADI-19109)軽鎖可変領域(配列番号350)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSHSTPLTFGGGTKVEIK
TI-36(ADI-19110)軽鎖可変領域(配列番号351)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLASQPPTFGGGTKVEIK
TI-37(ADI-19111)軽鎖可変領域(配列番号352)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYAYWPLTFGGGTKVEIK
TI-38(ADI-19112)軽鎖可変領域(配列番号353)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDFSLPYTFGGGTKVEIK
TI-39(ADI-19113)軽鎖可変領域(配列番号354)
DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLTHPTFGGGTKVEIK
TI-40(ADI-19114)軽鎖可変領域(配列番号355)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYDLLPYTFGGGTKVEIK
TI-41(ADI-19115)軽鎖可変領域(配列番号356)
DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAVIHPPYTFGGGTKVEIK
TI-42(ADI-19116)軽鎖可変領域(配列番号357)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNVHPPRTFGGGTKVEIK
TI-43(ADI-19117)軽鎖可変領域(配列番号358)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSRNAPWTFGGGTKVEIK
TI-44(ADI-19119)軽鎖可変領域(配列番号359)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARHGFTFGGGTKVEIK
TI-45(ADI-19123)軽鎖可変領域(配列番号360)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQAREVPFTFGGGTKVEIK
TI-46(ADI-19124)軽鎖可変領域(配列番号361)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARHVPPLTFGGGTKVEIK
TI-47(ADI-19120)軽鎖可変領域(配列番号362)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHDSAPYTFGGGTKVEIK
TI-48(ADI-19121)軽鎖可変領域(配列番号363)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGRQVPFTFGGGTKVEIK
TI-49(ADI-19122)軽鎖可変領域(配列番号364)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARGTPWTFGGGTKVEIK
TI-50(ADI-19125)軽鎖可変領域(配列番号365)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSRRAPPWTFGGGTKVEIK
TI-51(ADI-19126)軽鎖可変領域(配列番号366)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQFQSYPFTFGGGTKVEIK
TI-52(ADI-19127)軽鎖可変領域(配列番号367)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSSADSPFTFGGGTKVEIK
TI-53(ADI-19128)軽鎖可変領域(配列番号368)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQLPWTFGGGTKVEIK
TI-54(ADI-19129)軽鎖可変領域(配列番号369)
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDSSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQHDVWPITFGGGTKVEIK
TI-55(ADI-19130)軽鎖可変領域(配列番号370)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTRHTPTFGGGTKVEIK
TI-56(ADI-19131)軽鎖可変領域(配列番号371)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQDFARPPTFGGGTKVEIK
TI-57(ADI-19132)軽鎖可変領域(配列番号372)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRAVFPPTFGGGTKVEIK
TI-58(ADI-19133)軽鎖可変領域(配列番号373)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDATGITFGGGTKVEIK
TI-59(ADI-19135)軽鎖可変領域(配列番号374)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLASFPWTFGGGTKVEIK
TI-60(ADI-19136)軽鎖可変領域(配列番号375)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLAFTPWTFGGGTKVEIK
TI-61(ADI-19137)軽鎖可変領域(配列番号376)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDHSFITFGGGTKVEIK
TI-62(ADI-19138)軽鎖可変領域(配列番号377)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDVSDFTFGGGTKVEIK
TI-63(ADI-19139)軽鎖可変領域(配列番号378)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLYHAPPITFGGGTKVEIK
TI-64(ADI-19140)軽鎖可変領域(配列番号379)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDVAVYYCQQYDSLPFTFGGGTKVEIK
TI-65(ADI-19141)軽鎖可変領域(配列番号380)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQVYLFPWTFGGGTKVEIK
TI-66(ADI-19142)軽鎖可変領域(配列番号381)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFFLAPPTFGGGTKVEIK
TI-67(ADI-19143)軽鎖可変領域(配列番号382)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAVSLPWTFGGGTKVEIK
TI-68(ADI-19144)軽鎖可変領域(配列番号383)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFDNLPYTFGGGTKVEIK
TI-69(ADI-19145)軽鎖可変領域(配列番号384)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQATAHPPTFGGGTKVEIK
TI-70(ADI-19146)軽鎖可変領域(配列番号385)
DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAVSHPLTFGGGTKVEIK
TI-71(ADI-19147)軽鎖可変領域(配列番号386)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQATSLPLTFGGGTKVEIK
TI-72(ADI-19148)軽鎖可変領域(配列番号387)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQRLQAWTFGGGTKVEIK
TI-73(ADI-19149)軽鎖可変領域(配列番号388)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYRTYPTFGGGTKVEIK
TI-74(ADI-19151)軽鎖可変領域(配列番号389)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQHSLLSITFGGGTKVEIK
TI-75(ADI-19152)軽鎖可変領域(配列番号390)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHYNLWRTFGGGTKVEIK
TI-76(ADI-19153)軽鎖可変領域(配列番号391)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQHSTYSWTFGGGTKVEIK
TI-77(ADI-19154)軽鎖可変領域(配列番号392)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQHDVWPYTFGGGTKVEIK
TI-78(ADI-19155)軽鎖可変領域(配列番号393)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYFSTPPTFGGGTKVEIK
TI-79(ADI-19156)軽鎖可変領域(配列番号394)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYALTPYTFGGGTKVEIK
TI-80(ADI-19159)軽鎖可変領域(配列番号395)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDHDRPLTFGGGTKVEIK
重鎖可変領域配列
TI-1(ADI-19067)重鎖可変領域(配列番号396)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGSDHYYYGMDVWGQGTTVTVSS
TI-2(ADI-19068)重鎖可変領域(配列番号397)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGPRGASFNWFDPWGQGTLVTVSS
TI-3(ADI-19069)重鎖可変領域(配列番号398)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDVGSMYFDIWGQGTMVTVSS
TI-4(ADI-19070)重鎖可変領域(配列番号399)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHYYYGYAYFDLWGRGTLVTVSS
TI-5(ADI-19071)重鎖可変領域(配列番号400)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARESDGIDSYFDYWGQGTLVTVSS
TI-6(ADI-19072)重鎖可変領域(配列番号401)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARESGHSYVSSFDPWGQGTLVTVSS
TI-7(ADI-19073)重鎖可変領域(配列番号402)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLIYGDAFDYWGQGTLVTVSS
TI-8(ADI-19074)重鎖可変領域(配列番号403)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREVSMTAASLDVWGQGTMVTVSS
TI-9(ADI-19076)重鎖可変領域(配列番号404)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREAGYDISSAFDIWGQGTMVTVSS
TI-10(ADI-19077)重鎖可変領域(配列番号405)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGSGSWETLDVWGQGTMVTVSS
TI-11(ADI-19078)重鎖可変領域(配列番号406)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGEYGFDLWGRGTLVTVSS
TI-12(ADI-19079)重鎖可変領域(配列番号407)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGYPWEAFDYWGKGTTVTVSS
TI-13(ADI-19080)重鎖可変領域(配列番号408)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSNYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYRRTGSLDVWGQGTMVTVSS
TI-14(ADI-19081)重鎖可変領域(配列番号409)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRSSGDYLDVWGQGTMVTVSS
TI-15(ADI-19082)重鎖可変領域(配列番号410)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGGSYDAFQHWGQGTLVTVSS
TI-16(ADI-19083)重鎖可変領域(配列番号411)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGPRMSGWWADWGQGTLVTVSS
TI-17(ADI-19084)重鎖可変領域(配列番号412)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGAPGGRHNWFDPWGQGTLVTVSS
TI-18(ADI-19085)重鎖可変領域(配列番号413)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGDIGYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGPRMVTHLDVWGQGTMVTVSS
TI-19(ADI-19086)重鎖可変領域(配列番号414)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHHMDWVRQAPGKGLEWVGRTRNKANSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARGPLGYKLWGQGTLVTVSS
TI-20(ADI-19087)重鎖可変領域(配列番号415)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAPQLGLDVWGQGTMVTVSS
TI-21(ADI-19088)重鎖可変領域(配列番号416)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPLGYGDYKGMDVWGQGTTVTVSS
TI-22(ADI-19089)重鎖可変領域(配列番号417)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDAGRYYGSSSSWYFDLWGRGTLVTVSS
TI-23(ADI-19090)重鎖可変領域(配列番号418)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGITWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGPRLLSALDVWGQGTMVTVSS
TI-24(ADI-19150)重鎖可変領域(配列番号419)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGITWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGPRLLSALDVWGQGTMVTVSS
TI-25(ADI-19092)重鎖可変領域(配列番号420)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGGSRYSHFDYWGQGTLVTVSS
TI-26(ADI-19097)重鎖可変領域(配列番号421)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSAQETYYYGMDVWGQGTTVTVSS
TI-27(ADI-19098)重鎖可変領域(配列番号422)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDSSIAGRATLSFDYWGQGTLVTVSS
TI-28(ADI-19101)重鎖可変領域(配列番号423)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSNYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPSQYYYDSSAIEAFDIWGQGTMVTVSS
TI-29(ADI-19102)重鎖可変領域(配列番号424)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGGGTAQADGAYYYGMDVWGQGTTVTVSS
TI-30(ADI-19103)重鎖可変領域(配列番号425)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGRKAAAGIDEAEYFQHWGQGTLVTVSS
TI-31(ADI-19104)重鎖可変領域(配列番号426)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRRMWDPYGMDVWGQGTTVTVSS
TI-32(ADI-19105)重鎖可変領域(配列番号427)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDAPAVVGESPAFDIWGQGTMVTVSS
TI-33(ADI-19107)重鎖可変領域(配列番号428)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSTHRGSAYGMDVWGQGTTVTVSS
TI-34(ADI-19108)重鎖可変領域(配列番号429)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSNYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARRPDDRRGLFQHWGQGTLVTVSS
TI-35(ADI-19109)重鎖可変領域(配列番号430)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPDYYSSRGVFDIWGQGTMVTVSS
TI-36(ADI-19110)重鎖可変領域(配列番号431)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPDYYSSRGVFDIWGQGTMVTVSS
TI-37(ADI-19111)重鎖可変領域(配列番号432)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGDYLDPLFDYWGQGTLVTVSS
TI-38(ADI-19112)重鎖可変領域(配列番号433)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGLTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERGTYYYASGWANWGQGTLVTVSS
TI-39(ADI-19113)重鎖可変領域(配列番号434)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSNYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGGSSSTGLLYWGQGTLVTVSS
TI-40(ADI-19114)重鎖可変領域(配列番号435)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTRIDDSFDIWGQGTMVTVSS
TI-41(ADI-19115)重鎖可変領域(配列番号436)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSKHSTTSLDVWGQGTMVTVSS
TI-42(ADI-19116)重鎖可変領域(配列番号437)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARELMVTSGGWLYGMDVWGQGTTVTVSS
TI-43(ADI-19117)重鎖可変領域(配列番号438)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREAGNYYDIESAFDIWGQGTMVTVSS
TI-44(ADI-19119)重鎖可変領域(配列番号439)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGSGYDESMDVWGQGTTVTVSS
TI-45(ADI-19123)重鎖可変領域(配列番号440)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGSGYDESMDVWGQGTTVTVSS
TI-46(ADI-19124)重鎖可変領域(配列番号441)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGSGYDESMDVWGQGTTVTVSS
TI-47(ADI-19120)重鎖可変領域(配列番号442)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRGIAFDIWGQGTMVTVSS
TI-48(ADI-19121)重鎖可変領域(配列番号443)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGVINPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREAGQTSSALDVWGQGTMVTVSS
TI-49(ADI-19122)重鎖可変領域(配列番号444)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREAGSWLISTAFDIWGQGTMVTVSS
TI-50(ADI-19125)重鎖可変領域(配列番号445)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREAGTMSSAFDIWGQGTMVTVSS
TI-51(ADI-19126)重鎖可変領域(配列番号446)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGSIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGGYSSSWYGTGYDYWGQGTLVTVSS
TI-52(ADI-19127)重鎖可変領域(配列番号447)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGSIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDRGQYSSSWYGRMDVWGQGTTVTVSS
TI-53(ADI-19128)重鎖可変領域(配列番号448)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARESGYHVSTAFDIWGQGTMVTVSS
TI-54(ADI-19129)重鎖可変領域(配列番号449)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHWYALGSFDIWGQGTMVTVSS
TI-55(ADI-19130)重鎖可変領域(配列番号450)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGADYYAGFDYWGQGTLVTVSS
TI-56(ADI-19131)重鎖可変領域(配列番号451)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGPRLLGYFDLWGRGTLVTVSS
TI-57(ADI-19132)重鎖可変領域(配列番号452)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGITWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGPRYSKPYFDYWGQGTLVTVSS
TI-58(ADI-19133)重鎖可変領域(配列番号453)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARQEYGDGYFDLWGRGTLVTVSS
TI-59(ADI-19135)重鎖可変領域(配列番号454)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWAWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDLGGYEGAFDPWGQGTLVTVSS
TI-60(ADI-19136)重鎖可変領域(配列番号455)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWAWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDLGGYEGAFDPWGQGTLVTVSS
TI-61(ADI-19137)重鎖可変領域(配列番号456)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDDYLSSFDPWGQGTLVTVSS
TI-62(ADI-19138)重鎖可変領域(配列番号457)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGPSWIDVWGQGTMVTVSS
TI-63(ADI-19139)重鎖可変領域(配列番号458)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARELYAYSSPMFYGMDVWGRGTTVTVSS
TI-64(ADI-19140)重鎖可変領域(配列番号459)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARYYSPYGMDVWGQGTTVTVSS
TI-65(ADI-19141)重鎖可変領域(配列番号460)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSDYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDSGQYTGSLDVWGQGTMVTVSS
TI-66(ADI-19142)重鎖可変領域(配列番号461)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERHSSLGYAYWGQGTLVTVSS
TI-67(ADI-19143)重鎖可変領域(配列番号462)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGIHWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGRPSSSWGNWFDPWGQGTTVTVSS
TI-68(ADI-19144)重鎖可変領域(配列番号463)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTTYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGSPWDGRLFDIWGQGTMVTVSS
TI-69(ADI-19145)重鎖可変領域(配列番号464)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGAGMYDGSPLGMDVWGQGTTVTVSS
TI-70(ADI-19146)重鎖可変領域(配列番号465)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGIHWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAGTIYGRLDLWGRGTLVTVSS
TI-71(ADI-19147)重鎖可変領域(配列番号466)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGPRRTSHLDIWGQGTMVTVSS
TI-72(ADI-19148)重鎖可変領域(配列番号467)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGDIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGPRMTHSYFDLWGRGTLVTVSS
TI-73(ADI-19149)重鎖可変領域(配列番号468)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKAPRMYGYFDLWGRGTSVTVSS
TI-74(ADI-19151)重鎖可変領域(配列番号469)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGPRTRGYFDLWGRGTLVTVSS
TI-75(ADI-19152)重鎖可変領域(配列番号470)
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGDIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKAPRTRWTYFDYWGQGTLVTVSS
TI-76(ADI-19153)重鎖可変領域(配列番号471)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARARRGALAGMDVWGQGTTVTVSS
TI-77(ADI-19154)重鎖可変領域(配列番号472)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWAWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGPYPWSGWFDPWGQGTLVTVSS
TI-78(ADI-19155)重鎖可変領域(配列番号473)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDLGQYEGYFDLWGRGTLVTVSS
TI-79(ADI-19156)重鎖可変領域(配列番号474)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLGDGYRIWADYWGQGTLVTVSS
TI-80(ADI-19159)重鎖可変領域(配列番号475)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARELIVGATGGLTYYYGMDVWGQGTTVTVSS
例示的TREM1タンパク質配列:
マウスTREM1タンパク質(Uniprot受託番号Q9JKE2;配列番号2)
MRKAGLWGLLCVFFVSEVKAAIVLEEERYDLVEGQTLTVKCPFNIMKYANSQKAWQRLPDGKEPLTLVVTQRPFTRPSEVHMGKFTLKHDPSEAMLQVQMTDLQVTDSGLYRCVIYHPPNDPVVLFHPVRLVVTKGSSDVFTPVIIPITRLTERPILITTKYSPSDTTTTRSLPKPTAVVSSPGLGVTIINGTDADSVSTSSVTISVICGLLSKSLVFIILFIVTKRTFG
ラットTREM1タンパク質(Uniprot受託番号D4ABU7;配列番号3)
MRKAGLWGLLLVFFVSEVKAAIVPEEERYDLVEGQTLTVNCPFNIMKYARSRKAWQRLSAGKEPLTLVVTERSSTTSSEVRVGKYTLKDDPTEAMLFVQMTDLQVTDSGLYRCVIYHPPNDPVLLFHPVRLVVTKGSSGVSVPDIIPTTKPTEVPVLITTKHSTPTRSLPKSTAVVSSPDPGVTINNGTDPTSVSTYNVVVPVVCGLLIKTLIFFVLFVVTKRSFG
アカゲザルTREM1タンパク質(Uniprot受託番号F6TBB4;配列番号4)
MRKTRLWGLLWMLFVSELRATTELTEEKYEYKEGQTLEVKCDYALEKYANSRKAWQKMEGKMPKILAKTERPSENSHPVQVGRITLEDYPDHGLLQVQMTNLQVEDSGLYQCVIYQHPKESHVLFNPICLVVTKGSSGTPGSSENSTQNVYRTPSTTAKALGPRYTSPRTVTQAPPESTVVVSTPGPGPLPFFPSPCAERM
ウシTREM1タンパク質(Uniprot受託番号Q6QUN5;配列番号5)
MRKAGVWGLLWMLFIEEIQAAAEVFEEKCTLAEGQTLKVSCPTNTNIYSNSQKAWQRLKDNGEVQTLAITEGSSQVRVGKYFLEDIPSEGMLQIQMANLQVEDSGLYRCVILGPSDPIILFHPVRLVVTKNSLGTPASDEYPCQVSVQNPTPLPVTTKLRPRPRPRPKPVTQPIPTSADRLSSPGFTVTPTNVTHVNRAPGISIIIPAACGLLSKTLVFIGLFAVTHRSFAS
ウマTREM1タンパク質(Uniprot受託番号F6PSF7;配列番号6)
MRKAKLWGLLGMLFVSELQAAAGQAEEKKILTEGETLNYHCVYTRKHSQSQKAWQRVMDGGKAETLAFTEKTSKNSQELGGRYFLEDNTTQGAVHVRMTNVQMSDSGLYRCVIYPILSNPEVLESLRLVVTKGDTVSLGSSPSDSPSPDKNPPRDKAQTTTFPPATKAPVTQPPPKSTAGVSRPGLEVNPTHVTDVTRISVFSIVIPVACALVTKSLVLTVLFAVTQKSFGS
ブタTREM1タンパク質(Uniprot受託番号R4SEY7;配列番号7)
MRSARLGRLLWMLFITEIQAATELPEEKYILAEGETLNVNCPVTVGVYSNSRKAWQKLNRNGKFQTLAITERVSGQVSKVQVGKIFLTDEPSEGMLHVQMTNVQAEDSGLYRCVIYQPPKDPIILFYPVRLVVTNYSSGTPASAETPTQSCSPTTTLPPTTTTNRHRPRPRTVRTVTQFLTDFTTSLSSPGLKVTLTNVTDITRDTEISLILPAVCGLLSKSLVFIVLFVVTRMSFTP
イヌTREM1タンパク質(Uniprot受託番号E2RP37;配列番号8)
MRKARLWELLWLLFISELQATTEPDEIKYVLAEGGTLNMKCTTSTWKYTYSQKAWQKLMDREKPLTLIFTENVSGDTSQVQRGRYFLEDIPSEAILNVQMTNLQVEDSGLYQCVIYHPQKNPDILYPRVRLVVTKGITASDKSPTQNLAQISTHPPTTTKAQSTLLASPRTVTQLPPKSTADTSSPDFGVNITNVTNVTSYGFRFSVINIVILVLCGFLSKSLVFTVLIAVTQRSFGP
チンパンジーTREM1タンパク質(Uniprot受託番号H2QSZ3;配列番号561)
MRKTRLWGLLWMLFVSELRAATKLTEEKYELKEGQTLDVKCDYTLEKFASSQKAWQIIRDGEMPKTLACTERPSENSHPVQVGRIILEDYHDHGLLRVRMVNLQVEDSGLYQCVIYQPPKEPHILFDRIRLVVTKGFSGTPGSNENSTQNVYKIPPTTTKALHPLYTSPRTVTQAPPKSTADVSTPDSEINLTNVTDIIRVPVFNIVILLAGGFLSKSLVFSVLFAVTLRSFVP
Claims (20)
- TREM1タンパク質と結合する単離された抗体であって、単離された抗体の不在下での、一又は複数のTREM1リガンドの、TREM1タンパク質との結合によって誘導される一又は複数のTREM1活性と比較して、一又は複数のTREM1リガンドの、TREM1タンパク質との結合によって誘導される一又は複数のTREM1活性を増強し、
配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR-L2、配列番号101のアミノ酸配列を含むHVR-L3、配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号159のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び配列番号229のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、単離された抗体。 - TREM1タンパク質と結合する単離された抗体であって、単離された抗体の不在下での、一又は複数のTREM1リガンドの、TREM1タンパク質との結合によって誘導される一又は複数のTREM1活性と比較して、一又は複数のTREM1リガンドの、TREM1タンパク質との結合によって誘導される一又は複数のTREM1活性を増強し、
配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR-L2、配列番号102のアミノ酸配列を含むHVR-L3、配列番号136のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号168のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び配列番号230のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、単離された抗体。 - 一又は複数のTREM1リガンドと、TREM1タンパク質との結合について競合する、請求項1又は2に記載の単離された抗体。
- TREM1依存性遺伝子発現を誘導する、請求項1~3の何れか一項に記載の単離された抗体。
- TREM1の細胞表面クラスター化の不在下で、TREM1依存性遺伝子発現を誘導する、請求項1、3、又は4に記載の単離された抗体。
- リガンドの不在下で、TREM1依存性遺伝子発現を誘導する、請求項1、3、又は4に記載の単離された抗体。
- プレートに結合し、かつ可溶性である場合に、TREM1依存性遺伝子発現を誘導する、請求項1、及び3~6の何れか一項に記載の単離された抗体。
- 樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、単球、ミクログリア、マクロファージ、好中球、NK細胞、破骨細胞、皮膚のランゲルハンス細胞及びクッパー細胞からなる群から選択される初代細胞で、又は細胞株で、in vitroで、一又は複数のTREM1リガンドの、TREM1タンパク質との結合によって誘導される一又は複数のTREM1活性を増強する、請求項1~7の何れか一項に記載の単離された抗体。
- 配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR-L2、配列番号101のアミノ酸配列を含むHVR-L3、配列番号249のアミノ酸配列を含むVL FR1、配列番号261のアミノ酸配列を含むVL FR2、配列番号268のアミノ酸配列を含むVL FR3、及び配列番号276のアミノ酸配列を含むVL FR4を含む軽鎖可変領域、並びに
配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号159のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号229のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号285のアミノ酸配列を含むVH FR1、配列番号295のアミノ酸配列を含むVH FR2、配列番号299のアミノ酸配列を含むVH FR3、及び配列番号311のアミノ酸配列を含むVH FR4を含む重鎖可変領域、を含む、請求項1及び3~8の何れか一項に記載の単離された抗体。 - 配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR-L2、配列番号102のアミノ酸配列を含むHVR-L3、配列番号248のアミノ酸配列を含むVL FR1、配列番号260のアミノ酸配列を含むVL FR2、配列番号273のアミノ酸配列を含むVL FR3、及び配列番号276のアミノ酸配列を含むVL FR4を含む軽鎖可変領域、並びに
配列番号136のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号168のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号230のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号287のアミノ酸配列を含むVH FR1、配列番号291のアミノ酸配列を含むVH FR2、配列番号299のアミノ酸配列を含むVH FR3、及び配列番号314のアミノ酸配列を含むVH FR4を含む重鎖可変領域、を含む、請求項2~4及び8の何れか一項に記載の単離された抗体。 - 抗体が、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4アイソタイプである、請求項1~10の何れか一項に記載の単離された抗体。
- (a)単離された抗体が、ヒトIgG1アイソタイプを有し、N297A、D265A、D270A、L234A、L235A、G237A、C226S、C229S、E233P、L234V、L234F、L235E、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、L328E、P238D、S267E、L328F、E233D、G237D、H268D、P271G、A330R及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される残基位置で、Fc領域中に一又は複数のアミノ酸置換を含むか(残基の番号付けはEU又はKabat番号付けに従う)、又はグリシン236に対応する位置でFc領域中にアミノ酸欠失を含む、
(b)単離された抗体が、IgG1アイソタイプを有し、IgG2アイソタイプ重鎖定常ドメイン1(CH1)及びヒンジ領域を含み、任意選択的に、IgG2アイソタイプCH1及びヒンジ領域が、ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCP(配列番号476)のアミノ酸配列を含み、任意選択的に、抗体Fc領域が、S267Eアミノ酸置換、L328Fアミノ酸置換又は両方、及び/又はN297A又はN297Qアミノ酸置換を含むか(残基の番号付けはEU番号付けに従う)、
(c)単離された抗体が、IgG2アイソタイプを有し、P238S、V234A、G237A、H268A、H268Q、V309L、A330S、P331S、C214S、C232S、C233S、S267E、L328F、M252Y、S254T、T256E、H268E、N297A、N297Q、A330L及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される残基位置でFc領域中に一又は複数のアミノ酸置換を含むか(残基の番号付けはEU又はKabat番号付けに従う)、
(d)単離された抗体が、ヒトIgG4アイソタイプを有し、L235A、G237A、S228P、L236E、S267E、E318A、L328F、M252Y、S254T、T256E、E233P、F234V、L234A/F234A、S228P、S241P、L248E、T394D、N297A、N297Q、L235E及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される残基位置でFc領域中に一又は複数のアミノ酸置換を含むか(残基の番号付けはEU又はKabat番号付けに従う)、或いは
(e)単離された抗体が、ハイブリッドIgG2/4アイソタイプを有し、任意選択的に、ヒトIgG2のアミノ酸118-260及びヒトIgG4のアミノ酸261-447を含むアミノ酸配列を含む(残基の番号付けはEU又はKabat番号付けに従う)、
請求項11に記載の単離された抗体。 - 請求項1~12の何れか一項に記載の抗体をコードする核酸配列を含む、単離された核酸。
- 請求項13に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項13に記載の核酸又は請求項14に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
- TREM1と結合する抗体を産生する方法であって、抗体が産生されるように請求項15に記載の細胞を培養することを含む方法。
- 細胞によって産生された抗体を回収することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 治療有効量の、請求項1~12の何れか一項に記載の抗体を含む医薬。
- 阻害性チェックポイント分子と特異的に結合する抗体、阻害性サイトカインと特異的に結合する抗体、刺激性チェックポイントタンパク質と特異的に結合するアゴニスト抗体、刺激性サイトカイン、及び標準的又は治験的抗癌療法から選択される少なくとも一つの追加の治療剤を更に含む、請求項18に記載の医薬。
- (a)阻害性チェックポイント分子と特異的に結合する抗体が、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-L2抗体、抗PD-1抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗B-及びT-リンパ球アテニュエータ(BTLA)抗体、抗キラー阻害性受容体(KIR)抗体、抗GAL9抗体、抗TIM3抗体、抗A2AR抗体、抗LAG-3抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、
(b)阻害性サイトカインと特異的に結合する抗体が、抗CCL2抗体、抗CSF-1抗体、抗IL-2抗体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、
(c)刺激性チェックポイントタンパク質と特異的に結合するアゴニスト抗体が、アゴニスト抗CD40抗体、アゴニスト抗OX40抗体、アゴニスト抗ICOS抗体、アゴニスト抗CD28抗体、アゴニスト抗CD137/4-1BB抗体、アゴニスト抗CD27抗体、アゴニスト抗グルココルチコイドによって誘導されるTNFR関連タンパク質GITR抗体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、
(d)刺激性サイトカインが、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-8、CRP、ケモカインタンパク質ファミリーのTGF-βメンバー、IL20ファミリーメンバー、IL-33、LIF、OSM、CNTF、TGF-β、IL-11、IL-12、IL-17、IL-8、IL-23、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-18、GM-CSF、G-CSF及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、
(e)標準的及び治験的抗癌療法が、放射線療法、細胞傷害性化学療法、標的療法、ホルモン療法、イマチニブ(Gleevec(登録商標))、トラスツズマブ(Herceptin(登録商標))、ベバシズマブ(Avastin(登録商標))、オファツムマブ(Arzerra(登録商標))、リツキシマブ(Rituxan(登録商標)、MabThera(登録商標)、Zytux(登録商標))、寒冷療法、焼灼術、ラジオ波焼灼術、養子細胞移入(ACT)、キメラ抗原受容体T細胞移入(CAR-T)、ワクチン療法及びサイトカイン療法からなる群から選択される一又は複数の療法である、
請求項19に記載の医薬。
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