CN110170053A - 组合物、其在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用及药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组合物，包括PD‑1免疫抑制剂和食用药用植物多糖。本发明还涉及一种所述的组合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。本发明进一步涉及一种药物组合物。

Description

组合物、其在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用及药物组合物

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，特别是涉及一种组合物、其在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用及药物组合物。

背景技术

肺癌是对人健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌占所有肺癌的85％以上。非小细胞肺癌患者的生存改善较低，大部分非小细胞肺癌患者会发生局部晚期或转移性疾病，导致预后不良，5年总生存率低于20％。近年来，免疫检查点抑制剂在非小细胞肺癌中的临床应用取得了突破性进展，为临床大量患者的长期应答提供了令人振奋的希望。诸如针对免疫检查点PD-1及其配体的免疫抑制剂直接刺激免疫系统在非小细胞肺癌中已有报道，并大量进入临床试验。尽管效果喜人，但仅少数患者对这些免疫疗法产生应答(有效率仅15-25％)，因此亟需增强免疫疗法的应答率。

多糖是自然界广泛分布的一种生物大分子。近年来，多糖对肠道免疫的生物学作用引起了研究人员的广泛关注。从自然界中提取的多糖被证明具有显著的抗炎、抗癌、抗肿瘤和抗氧化活性。此外，从肠道免疫角度研究多糖的免疫调节机制也被广泛接受。石斛是我国传统的食用药用植物，在日常生活中作为饮料、粥、汤的原料已有数百年的历史。有人认为，石斛有助于改善身体健康状况，预防肝功能障碍、高血糖、免疫紊乱等慢性疾病。据报道，石斛多糖具有多种药理活性，其中，石斛多糖的免疫调节作用引起了人们的广泛关注。石斛多糖可刺激小鼠巨噬细胞和脾细胞分泌多种细胞因子，调节免疫功能。

因此，如何提高检查点抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应答率，扩大免疫治疗在肺癌中的应用是我们亟待解决的问题。

发明内容

基于此，有必要提供一种组合物，包括PD-1免疫抑制剂和食用药用植物多糖。

本发明提供一种组合物，包括PD-1免疫抑制剂和食用药用植物多糖。

在其中一个实施例中，所述PD-1免疫抑制剂包括小分子化合物、核酸、肽、蛋白质、抗体、肽体、单链可变片段(ScFv)或其功能片段或变异体。

在其中一个实施例中，所述PD-1免疫抑制剂为PD-1抗体。

在其中一个实施例中，所述PD-1抗体为单克隆抗体。

在其中一个实施例中，所述PD-1抗体包括人类抗体、小鼠抗体、嵌合抗体、人类化抗体、嵌合人类化抗体中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述PD-1抗体包括纳武单抗、派姆单抗、赛诺菲(REGN2810)、PDR001、MEDIO680中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述食用药用植物多糖为组成含有葡萄糖单糖、半乳糖单糖和甘露糖单糖的杂多糖，所述食用药用植物多糖的分子量为10KD至1000KD。

在其中一个实施例中，所述食用药用植物多糖包括石斛多糖、茯苓多糖、灵芝多糖中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述食用药用植物多糖为石斛多糖。

在其中一个实施例中，所述PD-1免疫抑制剂与所述多糖的质量比为1∶10至1∶16。

本发明还提供一种所述的组合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述肿瘤包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌。

在其中一个实施例中，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

本发明进一步提高一种药物组合物，如所述的组合物，以及一种或多种可药用的赋形剂。

本发明提供的PD-1抗体和石斛多糖组合物，PD-1抗体和石斛多糖具有协同作用，联合使用可促进免疫T细胞CD4+和CD8+向肿瘤微环境浸润，增强对肿瘤的抑制作用，提高检查点抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应答率，尤其是对于非小细胞肺癌具有优异的抑制效果。比单独使用PD-1免疫抑制剂具有更好的抗肿瘤作用。

附图说明

图1为本发明实施例各治疗组小鼠肿瘤体积随给药时间变化的曲线图；

图2为本发明实施例各治疗组小鼠肿瘤照片；

图3为本发明实施例各治疗组小鼠肿瘤重量的数据统计图；

图4为本发明实施例各治疗组小鼠体重随给药时间变化的曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

具体的，本发明术语“PD-1免疫抑制剂”是指降低、抑制、阻断、消除或干扰PD-1的活性或表达的部分(例如化合物、核酸、多肽、抗体)(例如程序性细胞死亡蛋白1，PD-1(CD279)，GI:145559515)，包括变异体、同种型、人类PD-1的物种同源物(例如小鼠)和与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。PD-1抑制剂包括小分子和大分子，例如化合物、核酸、多肽、抗体、肽体、单链可变片段(ScFv)或其变异体。因此，如本文所用的PD-1抑制剂是指拮抗PD-1活性或表达的任何部分。

术语“多肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用，并且是指包括至少2个或更多个氨基酸的任何分子。

术语“纳武单抗”、“派姆单抗”、“赛诺菲(REGN2810)”、“PDR001”、“SHR-1210”、“MEDIO680”根据其在本领域中理解的一般含义使用。

本发明所述的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，优选为单克隆抗体，并且包括异种、同种异体或同基因形式和其修饰型式(例如人类化或嵌合的)。“抗体”为能够结合特异性分子抗原的多肽的免疫球蛋白类别范畴内的B细胞的多肽产物，所述多肽由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)且每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。可以与本发明所述的抗体结合的特定分子抗原包括PD-1和其表位。

术语“单克隆抗体”是指含有一种能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点的一群抗体分子。单克隆抗体通常对与其免疫反应的特定抗原显示单一结合亲和性。本发明所述的单克隆抗体还包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与衍生物特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体，以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要其展现出所需的生物活性。

当关于抗体或其功能片段(例如“人类化抗体”)使用时，术语“人类”是指具有对应与人类生殖系统免疫球蛋白序列的人类可变区或其部分的抗体或其功能片段。

“人类抗体”是指具有对应于人类产生的抗体的氨基酸序列的抗体和/或使用本发明公开的制备人类抗体的任何技术制备的抗体。可以使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库来产生人类抗体、通过抗原施用至转基因动物来制备人类抗体、还可以通过人类B细胞融合瘤技术产生人类抗体。

“人类化抗体”是具有可变区或可变区和恒定区的非人类细胞制得的抗体，其已经被改变以更紧密类似于由人类细胞制得的抗体。例如，通过改变非人类抗体氨基酸序列以并入人类生殖系统免疫球蛋白序列中发现的氨基酸。本发明的人类化抗体可包括不由人类生殖系统免疫球蛋白序列中发现的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性突变诱发或通过体内体细胞突变引入的突变)。人类化抗体还可以包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的生殖系的CDR序列已经移植到人类框架序列上的抗体。

当关于抗体使用时，术语“功能片段”是指抗体的一部分，包括重链或轻链多肽，其保留作为衍生所述片段的抗体的一些或全部结合活性。例如，单链Fv(ScFv)。术语“可变域”或“可变区”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端并且长度在重链中为约120至130个氨基酸且在轻链中为约100至110个氨基酸，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。

本发明所述的“存在量”是指相对于患者的体重的量度的量，例如，患者的体重为45kg，PD-1免疫抑制剂存在量为10mg/kg，即PD-1免疫抑制剂的施用剂量为450mg。

本发明提供了可增强肿瘤免疫治疗应答率的组合物，包括PD-1免疫抑制剂和食用药用植物多糖。PD-1免疫抑制剂和食用药用植物多糖具有协同作用，联合使用可促进免疫T细胞CD4+和CD8+向肿瘤微环境浸润，增强对肿瘤的抑制作用，提高检查点抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应答率，尤其是对于非小细胞肺癌具有优异的抑制效果。比单独使用PD-1免疫抑制剂具有更好的抗肿瘤作用。

本发明所述的PD-1免疫抑制剂包括能够降低、抑制、阻断、消除或干扰PD-1的活性或表达的任何分子。优选的，所述PD-1免疫抑制剂可以是小分子化合物、核酸、肽、蛋白质、抗体、肽体、单链可变片段(ScFv)或其功能片段或变异体。

在一实施例中，所述PD-1免疫抑制剂为PD-1抗体。所述PD-1抗体可以是单克隆或多克隆抗体，优选的，所述PD-1抗体为单克隆抗体。

所述PD-1抗体包括所有已知类型的抗体和其功能片段，包括但不限于人类抗体、小鼠抗体、嵌合抗体、人类化抗体、嵌合人类化抗体中的一种或多种。

在一实施例中，所述PD-1抗体可以为纳武单抗、派姆单抗、赛诺菲(REGN2810)、PDR001、SHR-1210、MEDIO680中的一种或多种。

纳武单抗(OPDIVO销售)是针对具有免疫增强活性的PD-1的完全人类单克隆抗体。不受任何特定理论的束缚，纳武单抗通过其同源配体结合到PD-1并阻断其活化，导致T细胞的活化和针对肿瘤细胞或病原体的细胞介导的免疫反应。

派立珠单抗(MK-3475，KEYTRUDA销售)是针对人类细胞表面受体PD-1的人类化单克隆IgG4抗体，具有潜在的免疫增强活性。不受任何特定理论的束缚，派立珠单抗与PD-1结合，PD-1是在活化的T细胞表面上表达的抑制性信号传导受体，并且通过其同源配体阻断PD-1的结合和活化。结合和活性的阻断导致T细胞介导的针对肿瘤细胞的免疫反应的激活。

匹立珠单抗(CT-011)是一种针对人类PD-1的人类化单克隆抗体，具有免疫调节和抗肿瘤活性。不受任何特定理论的束缚，匹立珠单抗阻断受体PD-1与其配体之间的相互作用，导致淋巴细胞(主要是效应/记忆T细胞)中凋亡过程的减弱，以及NK细胞的抗肿瘤活性的增强。

赛诺菲REGN2810是针对PD-1的人类单克隆抗体，具有潜在的免疫检查点抑制和抗肿瘤活性。不受任何特定理论的束缚，REGN2810与PD-1结合，抑制与其同源配体的结合，并阻止其下游信号传导路径的活化。这可以通过细胞毒性T细胞的活化来恢复免疫功能。

PDR001是针对PD-1的完全人类化单克隆抗体，具有免疫检查点抑制和抗肿瘤活性。不受任何特定理论的束缚，PDR 001与活化的T细胞上表达的PD-1结合并阻断与其同源配体的相互作用。配体结合的抑制阻止了PD-1介导的信号传导，并导致T细胞活化和诱导针对肿瘤细胞的T细胞介导的免疫反应。

MEDI0680(AMP-514)是一种针对PD-1的单克隆抗体，具有潜在的免疫调节和抗肿瘤活性。不受任何特定理论的束缚，MEDI0680似乎抑制PD-1和其下游信号传导路径的活化。这种抑制可以通过活化T细胞和针对过表达PD-1的肿瘤细胞的细胞介导的免疫反应来恢复免疫功能。

所述食用药用植物多糖为组成含有葡萄糖单糖、半乳糖单糖和甘露糖单糖的杂多糖，分子量为10KD至1000KD。所述食用药用植物多糖包括但不限于石斛多糖、茯苓多糖、灵芝多糖中的一种或多种。优选的，所述食用药用植物多糖为石斛多糖。

在一优选实施例中，所述组合物包括PD-1抗体和石斛多糖。PD-1抗体和石斛多糖具有协同作用，联合使用可促进免疫T细胞CD4+和CD8+向肿瘤微环境浸润，增强对肿瘤的抑制作用，提高检查点抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应答率，尤其是对于非小细胞肺癌具有优异的抑制效果。比单独使用PD-1免疫抑制剂具有更好的抗肿瘤作用。

在一实施例中，所述组合物中所述PD-1免疫抑制剂与所述多糖的质量比为1∶10至1∶16。在该配比范围内，所述组合物具有更优异的抑制肿瘤的效果。

本发明所述的组合物可以作为药物组合物提供，所述药物组合物适用于通过本发明所述的任何途径施用至患者，包括但不限于：口服、经粘膜(例如经鼻、经肺、舌下、经阴道、经颊或经直肠)、皮下、静脉、肌肉、动脉、经皮施用至患者。

所述药物组合物的剂型可包括：片剂、囊片、胶囊、扁囊剂、口含锭、栓剂、粉末、凝胶、适合于肠胃外施用至患者的液体剂型和无菌固体(例如结晶或非晶固体)。

本发明所述的药物组合物还包括一种或多种赋形剂，可根据剂型和向患者预期施用的途径进行选择。

本发明所述的药物组合物进一步可包括其他试剂，例如稳定剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂、稀释剂、载体等。

所述药物组合物可以作为肿瘤免疫治疗药物，适用的肿瘤可包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌，尤其对于非小细胞肺癌具有优异的抑制作用。

所述药物组合物中PD-1免疫抑制剂和食用药用植物多糖可以作为相对于有需要的患者的体重的量度的量存在。在一实施例中，所述PD-1免疫抑制剂的存在量可以为10mg/kg至12.5mg/kg，所述多糖的存在量可以为100mg/kg至200mg/kg。在一优选实施例中，所述PD-1免疫抑制剂为PD-1抗体，所述PD-1抗体的存在量为12.5mg/kg，所述石斛多糖的存在量为200mg/kg。

实施例1动物实验：石斛多糖联合PD-1抗体抗肿瘤效果测试

分别设置PD-1抗体单一疗法组、石斛多糖单一疗法组、以及PD-1抗体与石斛多糖组合疗法组，以PBS溶液治疗组作为对照用于分析功效。

小鼠：C57BL/6J鼠，雌性，体重20g,6-8周龄。所有小鼠均自由取食和饮水，在室温(23±2)℃条件下饲养。

肿瘤细胞：小鼠肺癌细胞株LLC在常规培养基中培养，传代。

荷瘤小鼠模型建立：在细胞对数期收集细胞，配成浓度为2×106/100μL的细胞悬液，C57BL/6J小鼠右前肢皮下注射，约9天后待肿瘤长至体积约～60mm3，接瘤成功。肿瘤体积＝(l×w2/2)，其中l为肿瘤的长度，w为肿瘤的宽度。

测试品：PD-1抗体PMP1-14(批号)购自Bio X cell，石斛多糖由澳门科技大学姜志宏教授组提供。

给药溶液：用无菌PBS将PD-1抗体配制成浓度为0.125mg/ml，在10ml/kg剂量体积中产生12.5mg/kg剂量的PD-1抗体给药溶液；用无菌PBS将石斛多糖配制成浓度为20mg/ml，在10ml/kg剂量体积中产生200mg/kg剂量的石斛多糖给药溶液。

按不同给药方式将小鼠分为四组，每组5只，根据表1中所示的方案对四组C57BL/6J小鼠给药。所用剂量如上文所述。PD-1抗体给药溶液经腹腔静脉注射施用，每3天给药1次；石斛多糖给药溶液经灌胃施用，每1天给药1次。

每3天测量一次肿瘤，并称量体重。当体重下降超过20％或者肿瘤体积达到了最大允许值2000mm³，则将小鼠处死并称量瘤体重量。

数据处理：

数据用平均值±SEM表示，利用Graph Prim5.0软件进行处理，采用单因素方差分析(ANOVA)或t检验比较各组间的数据差异，P<0.05为差异有统计学意义。

实验结果：

各治疗组小鼠肿瘤体积随给药时间的变化如图1所示，从图1可以看出，PD-1抗体单一疗法组、石斛多糖单一疗法组、PD-1抗体与石斛多糖组合疗法组均比PBS溶液对照组肿瘤生长要缓慢，且PD-1抗体与石斛多糖组合疗法组肿瘤生长的最慢。

肿瘤大小如图2所示，从图2中可以更直观的看出各治疗组小鼠肿瘤的实际情况，PD-1抗体单一疗法组、石斛多糖单一疗法组、PD-1抗体与石斛多糖组合疗法组小鼠肿瘤体积均比PBS溶液对照组小鼠肿瘤体积要小很多，其中，PD-1抗体与石斛多糖组合疗法组的小鼠肿瘤体积最小。

图3为各治疗组小鼠肿瘤重量的数据统计图，从图3可以看出，各组小小鼠肿瘤重量有显著的差异，PD-1抗体与石斛多糖组合疗法组的小鼠肿瘤重量最小。

图4为各治疗组小鼠体重随给药时间的变化。

从图1-图4可以看出，PD-1抗体与石斛多糖联合治疗明显比PD-1抗体或单独使用石斛多糖具有更大的肿瘤抑制作用，并且治疗前后未有明显的体重变化。

实施例2HE染色及免疫组化：石斛多糖联合PD-1抗体对肿瘤中CD4+和CD8+细胞浸润

实验仪器及试剂：抗体CD4(货号：ab203034)购自Abcam；抗体CD8(货号：ab203035)购自Abcam；Dako PT Link抗原修复仪；Nikon Eclipse E600(40×)全自动图像分析系统

制作组织切片：标本固定、脱水、石蜡包埋和制片：将实施例1中各组小鼠的肿瘤制成标本，然后分别固定在10％福尔马林中，室温下固定至少24h，再经过脱水，石蜡包埋，制作成5μm的切片，包括：PD-1抗体单一疗法组肿瘤组织切片、石斛多糖单一疗法组肿瘤组织切片、PD-1抗体与石斛多糖组合疗法组肿瘤组织切片、PBS溶液对照组肿瘤组织切片。

HE染色：苏木精-伊红染色法对上述制作的各组切片进行染色，观察小鼠肿瘤组织形态学的变化。

分别采用CD4抗体和CD8抗体对肿瘤组织进行免疫组化，具体包括：

将上述制作的各组切片使用Novocastra抗原表位修复液(pH＝6.0)在Dako PTLink抗原修复仪中97℃预处理30min。然后将切片置于室温下，用PBS洗涤。滴加3％H₂O₂，室温避光15min，去除内源性过氧化物酶。滴加封闭液(EnVision FLEX,Peroxidase-BlockingReagent)阻断特异性蛋白后，加一抗：抗体CD4(货号：ab203034)或抗体CD8(货号：ab203035)，4℃过夜。取出标本，加入荧光二抗(EnVision FLEX,HRP)，孵育45min。加DAB显色，苏木精复染，脱水，封片。采用Nikon Eclipse E600(40×)全自动图像分析系统分析。

实验结果：

HE染色和免疫组化的结果如图所示，从图中可以看出，PD-1抗体与石斛多糖组合疗法组肿瘤组织切片中染色部分最多，该组肿瘤组织中CD4+和CD8+细胞浸润率最高，表明PD-1抗体与石斛多糖联合治疗可增强CD4+和CD8+T细胞在肿瘤中的浸润。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种组合物，其特征在于，包括PD-1免疫抑制剂和食用药用植物多糖。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述PD-1免疫抑制剂包括小分子化合物、核酸、肽、蛋白质、抗体、肽体、单链可变片段(ScFv)或其功能片段或变异体。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述PD-1免疫抑制剂为PD-1抗体。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述PD-1抗体为单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述PD-1抗体包括人类抗体、小鼠抗体、嵌合抗体、人类化抗体、嵌合人类化抗体中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述PD-1抗体包括纳武单抗、派姆单抗、赛诺菲(REGN2810)、PDR001、MEDIO680中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述食用药用植物多糖为组成含有葡萄糖单糖、半乳糖单糖和甘露糖单糖的杂多糖，所述食用药用植物多糖的分子量为10KD至1000KD。

8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述食用药用植物多糖包括石斛多糖、茯苓多糖、灵芝多糖中的一种或多种。

9.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述食用药用植物多糖为石斛多糖。

10.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述PD-1免疫抑制剂与所述多糖的质量比为1∶10至1∶16。

11.一种根据权利要求1-10任一项所述的组合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌。

13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

14.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-10任一项所述的组合物，以及一种或多种可药用的赋形剂。