CN109843925A

CN109843925A - Cd20抗体

Info

Publication number: CN109843925A
Application number: CN201780064749.4A
Authority: CN
Inventors: 珍妮特·亨利卡·威廉明娜·勒森; 彼得·博罗什; 约翰内斯·亨德里克·马尔科·詹森; 萨斯基亚·迈尔
Original assignee: UMC Utrecht Holding BV
Current assignee: UMC Utrecht Holding BV
Priority date: 2016-09-01
Filing date: 2017-09-01
Publication date: 2019-06-04
Also published as: EP3507303A1; US20230022731A1; AU2017320457A1; US20190263922A1; US11414495B2; CA3035427A1; WO2018044172A8; JP2019530661A; WO2018044172A1

Abstract

本发明涉及具有改进特征的CD20抗体。一些实施方案描述了包含小鼠IgG2，人IgG1、IgA1或IgA2的恒定区和可变结构域的抗体，可变结构域可以结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANpSEK”，并且当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，该抗体具有增加的PCD功能。

Description

CD20抗体

技术领域

本发明涉及抗体领域。具体地，本发明涉及结合CD20的抗体。本发明进一步涉及CD20抗体在医学和检测方法中的用途。本发明还涉及细胞、核酸分子以及用于产生抗体的方法。

背景技术

三种CD20mAb已经被批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤和白血病(NHL)的各种亚型。市场上第一种单克隆抗体利妥昔单抗(RTX)在与化疗方案组合给予时显著提高了患者的存活率(1-5)。奥法木单抗(OFA)基于其能够激活经典补体途径而被选中，致使膜破坏和补体依赖性细胞毒作用(CDC)。临床试验突出了其在例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的联合治疗和维持中的新兴潜力(6，7)。阿妥珠单抗(OBZ；GA101)是具有增强的FcγRIII结合和直接程序性细胞死亡(PCD)诱导能力的CD20mAb，已经被批准用于CLL的一线治疗(8)和RTX难治性滤泡性NHL的一线治疗(9)。

在体外，CD20mAb可诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用/吞噬作用(ADCC/ADCP)、CDC或PCD。根据它们的作用机制(MoA)，CD20mAb分为I型和II型。I型和II型mAb都能引发ADCC。包括RTX和OFA的I型mAb将CD20重新定位到脂筏中，并有效地激活补体系统(10)。II型mAb通过半胱天冬酶非依赖性途径诱导PCD(11)。仅描述的II型mAb是OBZ(12)、B1(13)和11B8(14)。感兴趣的是，显示RTX在淋巴瘤细胞系和原代CLL细胞中通过相同途径诱导PCD，但程度低于II型mAb(15)。最近，报道了在体外显示I型和II型特征的CD20mAb(16)。

在文献中，建议三个特征来管理I/II型分类：(a)表位，(b)结合动力学以及(c)VH链框架的肘部铰链角度确定区内的残基。

人CD20包括胞外小环(残基72-80)和胞外大环(残基140-186)。RTX的表位位于大环上，该环上具有代表核心结合区的¹⁷⁰ANPS¹⁷³(17)。诱变实验证实N171是RTX的重要残基(18)。对于RTX和另一组I型小鼠CD20mAb，确定A170和P172是重要(19，20)。尽管II型mAbOBZ和B1与RTX具有重叠的表位(¹⁷⁰ANPSEKNSP¹⁷⁸)，但残基176-178对结合贡献最大(18)。相反，I型mAb OFA和II型mAb11B8的表位由小环和大环上的残基组成(20)。由于OFA识别这种独特的表位并有效地激活补体，因此表明膜近端结合导致可用Fc片段的有益取向，从而允许更好的补体沉积。另外，由于强补体诱导剂OFA从CD20解离比具有中等CDC能力的RTX明显更慢(14)，因此，认为Ab动力学与CD20mAb的CDC活性相关。支持较慢的解离速率有助于更好的CDC诱导的进一步证据来自对CD20mAb维妥珠单抗的研究(21)。

除抗原结合特性外，提出了结构Ab特征。在将BLy-1(I型)人源化为OBZ(II型)期间，在VH链框架中引入L11V突变。OBZ中的反向突变导致PCD诱导的缺失(12)。RTX和OBZ的建模表明，与RTX(140°)相比，L11V突变导致更宽的OBZ Ab肘部铰链角(167°)(18)。

尽管已知各种CD20抗体，但对确定CD20mAb作用机制的性质仍然知之甚少。

本发明公开了新的CD20抗体。所有抗体均显示I型特征，而其中一些也显示出II型特征。发现表位和解离速率本身都不足以预测CD20抗体是否表现出I型、II型或I/II型活性。

本发明进一步提供了具有人IgA恒定区的CD20抗体。在IgG之后，IgA是血液中第二最突出的抗体，并且是粘膜中主要的Ab。IgA的单体形式主要存在于血清中，而聚合的IgA在粘膜部位产生。两个Ab亚类IgA1和IgA2在它们的铰链区中结构上不同，与IgA2相比，IgA1多了13个氨基酸。这可能能够改善远处抗原的覆盖，但同时使其更容易被蛋白酶降解(36)。此外，IgA1Ab的铰链区携带了几个O-连接的糖基化位点，这在IgA2抗体中是不存在的。IgA2以3种同种异型存在：IgA2(m1)与IgA1，相比具有2个额外的N-连接的糖基化位点，以及IgA2(m2)和IgA2(n)，具有3个额外的N-连接的糖基化位点。与IgG相反，由于不能结合C1q，IgA是经典补体途径的弱活化剂(37)。然而，已经表明IgA mAb通过凝集素途径激活补体系统，因为甘露聚糖结合凝集素(MBL)的糖识别结构域(CRD)可与IgA结合(38)。

IgA通过结合FcαRI(CD89)而接合免疫效应细胞，FcαRI(CD89)在髓系细胞：嗜中性粒细胞、单核细胞、不同的巨噬细胞群和嗜酸性粒细胞上表达(39)。示出了在体外产生的树突细胞上表达，但仍然存在争议。中性粒细胞表达高水平的FcαRI，而巨噬细胞具有较低的表达(42)。在靶向实体瘤靶标的IgA mAb的ADCC试验中，已经表明嗜中性粒细胞有效地根除肿瘤细胞(43-46)。相反，IgG1mAb不太能够与该效应细胞群结合。显示单核细胞/巨噬细胞介导的肿瘤细胞杀伤在IgA mAb和IgG mAb之间是相当的(43)。在活化FcγRIIIa之后，巨噬细胞也表达抑制性FcγRIIIa。已经显示FcγRIIb的存在降低了mAb活性(47)。对于IgA，尚未描述抑制性受体。

在过去几年中，对靶向肿瘤相关抗原的IgA mAb的知识显著增加。现在克服了几年前面临的几个瓶颈，并且目前我们能够生产和纯化足够量的单体IgA mAb，以用于体外和体内测试。小鼠缺乏IgA受体，因此现在人FcαR1转基因的产生允许体内测试(48)。Boross及同事最终在免疫活性肿瘤模型中显示了IgA mAb在治疗环境中的巨大潜力(44)。迄今为止研究的大多数IgA mAb靶向HER2或EGFR，在实体瘤上表达的抗原。只有一项研究已经观察到单体IgA-CD20mAb的潜力(49)。补体介导的肿瘤细胞杀伤被证明依赖于经典途径的弱间接激活和替代途径的更显著的直接激活。在FcαRI转基因小鼠中采用被动免疫策略，实现了利用单体IgA2-CD20mAb防止肿瘤发展的良好保护。然而，尚未进行IgA-CD20mAb的体内治疗性测试。此外，缺少IgA1和IgA2mAb的直接比较，特别是关于它们的补体激活特性。本发明描述了独特的IgA1-CD20mAb和IgA2-CD20mAb。

附图说明

图1.大多数新的CD20mAb具有独特的重链和轻链序列。

将编码(A)重链可变区和(B)轻链可变区的序列对齐，并通过使用％同一性(PID)计算平均距离与市售CD20mAb进行比较。右侧组是左侧树的快照。

图2.作为小鼠抗体，所有新的小鼠CD20 IgG mAb显示I型特征。

(A)PCD：将EL4-CD20细胞用1μg/mL CD20mAb在缺失或存在交联Ab的情况下孵育24小时。通过7-AAD⁺/Annexin-PE⁺染色测定PCD(平均值+SEM)。(B)ADCC：在1μg/mL CD20mAb以PBMC作为效应细胞(E：T＝100：1)的铬释放试验中，特异性裂解Daudi细胞(平均值+SEM)。(C)在15.5％人血清中，以10μg/mL和1μg/mL mAb测定新CD20mAb的CDC，并通过7-AAD染色检测((值_样品-平均值_培养基)+SEM)。灰色的mIgG2a-CD20mAb B1、mRTX和m7D8作为对照。粉红色为mIgG2cmAb及蓝色为mIgG2bmAb。

图3.新的mIgG2c-CD20mAb显示不同的CDC性质。

通过(A)Daudi细胞上的所有新mIgG2c-CD20mAb以及(B)Ramos细胞和Raji细胞上的m1、m2和m7D8诱导补体依赖性细胞毒性。mIgG2a-CD20mAb B1和m7D8作为对照。用指定的mAb浓度和15.5％人血清孵育细胞。通过7-AAD染色检测细胞毒性((值_样品-平均值_培养基)+SEM)。

图4.CD20上的结合位点不同于新的CD20mAb。

(A)使用环肽YNCEPANPSEKNSPSTQYCYS的表位作图导致确定m1(左)的表位，但是仅m2(右)的边缘。通过ELISA测定1μg/mL mAb与肽和突变体的结合，其中每种氨基酸被所有其他可获得的氨基酸置换(位置扫描；不包括半胱氨酸)。灰线和阴影区域代表WT结合±SEM。结果用Tukey-whiskers显示。(B)用CD20WT或CD20突变体进行粗略的表位作图(KDD＝T159K/N163D/N166D，AxP＝A170S/P172S)。用质粒转染HEK293F细胞，并通过FACS测定mAb(5μg/mL)与CD20的结合。比较I型CD20mAb(m7D8和mRTX)以及II型mAb(B1和m11B8)的结合。(C)确定对CD20mAb结合至关重要的残基。数据以最佳结合物的％表示。根据与最佳结合物相比的结合性着色(深灰色：0-20％＝结合损失；灰色：21-70％＝中度结合；浅灰色：71-100％完全结合)。

图5.具有独特动力学的新CD20mAb。

使用Ligand Tracer Green分析SKBR3-CD20细胞的实时结合和解离曲线。监测10nM FITC标记的CD20mAb的结合1小时，然后在(A)RPMI培养基(非竞争性)或(B)100nM未标记的CD20mAb(竞争性)存在下解离3小时。(C)通过1：1拟合模型确定非竞争和竞争条件下的解离速率常数的比较。

图6.嵌合可改变PCD活性。

在不存在(浅灰色条)或存在(深灰色条)交联Ab(对于IgG1，a-人IgG：20μg/mL；对于B1，a-小鼠IgG：50μg/mL)的情况下，具有或不具有L11V突变的IgG1-CD20-1和IgG1-CD20-2mAb(1μg/mL)对同型聚集(图片)和PCD的诱导。B1和OFA分别作为阳性和阴性对照。通过7-AAD和Annexin V-PE染色测定细胞死亡的诱导(平均值±SEM)。

图7.mIgG2c-CD20mAb体内疗效的差异。

在mAb或PBS处理前16小时，用5×10⁵CellTraceViolet标记的EL4-CD20细胞腹腔注射C57BL/6小鼠(4-6只小鼠/组)。24小时后通过用TruCount管测定腹膜灌洗液中剩余肿瘤细胞的量来评估抗肿瘤反应。(A)m1、m2和m7D8的mAb滴定(中位数±四分位范围)。(B)1μgmIgG2c mAb的抗肿瘤反应，表示为PBS％(中位数±四分位范围)。1μg m7D8(mIgG2a)作为阳性对照。如虚线所示的2个单独的实验。

图8.新的嵌合IgG1-CD20mAb结合表达CD20的Daudi细胞。

Daudi细胞用一系列稀释的mAb孵育后，通过FACS测定结合。RTX和OFA作为阳性对照，曲妥珠单抗作为同种型对照。

图9.新的嵌合IgG1-CD20mAb的体外效果分析。

(A)ADCC：在较宽的mAb浓度范围、PBMC作为效应细胞(E：T＝50：1)的铬释放试验中，Daudi细胞的特异性裂解(平均值±SEM)。(B)在15.5％人血清中测定新CD20mAb的CDC并通过7-AAD染色检测((值_样品-平均值_培养基)±SEM)。(C)PCD：在缺失或存在20μg/mL交联Ab的情况下，将EL4-CD20细胞用1μg/mL CD20mAb孵育24小时。通过7-AAD/AnnexinV-PE染色测定PCD(平均值+SEM)。B1(mIgG2a-CD20mAb)是PCD的阳性对照((值_样品-平均值_培养基)±SEM)。在所有试验中，RTX和OFA作为阳性对照，且TRA作为同种型对照。没有或具有L11V突变(10μg/ml)的IgG1-CD20-1对(D,E)Ramos细胞和(F,G)Daudi细胞的PCD诱导。通过(D,F)7-AAD/AnnexinVPE染色和(E,G)DiOC6/TO-PRO-3染色测定细胞死亡的诱导(平均值+SEM)。11B8和OFA分别作为阳性和阴性对照。结果代表3种单独的试验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，通过单因素方差分析，然后是Bonferroni posthoc分析。

图10.自体环境中CD19+活B细胞的消失。

通过将mAb在37℃下用来自健康供体的未处理的血液孵育1小时来测定CD20mAb的B细胞耗竭。(A)FACS图显示与PBS对照相比，用mAb(此处为IgG1-CD20-1)孵育后的活B细胞消失。(B)在更宽的浓度范围内测定的CD20mAb介导的B细胞耗竭(平均值±SEM)。RTX和OFA作为阳性对照，并且TRA作为同种型对照。

图11.IgG1-CD20mAb的体内效果。

在mAb(10μg)或PBS处理之前16小时，用5×10⁵CellTraceViolet标记的EL4-CD20细胞腹腔注射C57BL/6小鼠(6只小鼠/组)。24小时后通过用TruCount管(中位数±四分位范围)测定腹膜灌洗液中剩余肿瘤细胞的量来评估抗肿瘤反应。

图12：IgA-CD20mAb的产生。

(A)测试HEK293F细胞的转染以确定HC、LC和pAdvantage编码质粒之间的最佳比例。通过IgA特异性ELISA测量产生的IgA-CD20mAb的浓度。通过(A)抗人Kappa亲和层析纯化大规模产生的IgA-CD20mAb，然后进行(B)尺寸排阻层析以将全长抗体与松散的轻链和聚集体分离。显示代表性图表。

图13：IgA-CD20mAb与表达CD20的Ramos细胞的结合。

将Ramos细胞用一系列稀释的mAb孵育后，通过FACS测定结合。

图14：IgA-CD20mAb诱导程序性细胞死亡的可变程度。

在缺失和存在交联Ab(B1：50μg/mL；IgG1和IgA mAb：20μg/mL)的情况下，将EL4-CD20细胞用1μg/mL mAb孵育24小时。细胞死亡程度确定为AnnexinV⁺和AnnexinV⁺/7AAD⁺细胞的总和(值_样品-平均值_培养基+SEM)。取B1(mIgG2a-CD20mAb)和RTX作为阳性对照，以及OFA作为阴性对照。

图15：IgA-CD20mAb诱导的补体依赖性细胞毒性。将靶细胞用15.5％混合人血清孵育指定时间，并将CDC的程度确定为％7AAD⁺细胞。(A,B)IgA-CD20mAb的补体诱导的时间依赖性。补体介导的(A)Daudi和(B)Ramos细胞的裂解，其在10μg/mL mAb存在下孵育15、60、240和360分钟。(C)用10μg/mL mAb孵育15分钟后，Ramos细胞的补体介导的裂解程度通过用指定的抑制剂预处理补体源来抑制(热灭活血清；过量的依库丽单抗；EDTA+MgCl₂)。结果显示为(值_样品-平均值_培养基)+SEM。

图16：自体环境中的B细胞耗竭测定。

将全血白细胞用CD20mAb在37℃下孵育3小时。对FSC/SSC淋巴细胞门进行分析，从中排除CD3、CD14、CD56和CD11b阳性细胞。CD19用作B细胞标记物。(A)CD19⁺细胞(B细胞)上CD19表达的分析。(B)在淋巴细胞门中发现的CD19⁺事件的数量。(C)减去背景(无抗体)后在淋巴细胞门中发现的CD19^-细胞数量。

图17.抗CD20IgA介导CD20靶标的有效肿瘤细胞裂解。

通过使用(A)PBMC，E：T＝100：1或(B)PMN，E：T＝40：1作为效应细胞和指定的抗体浓度从EL4-CD20-Luc2细胞释放⁵¹Cr来测量ADCC。抗CD20IgA含有与利妥昔单抗相同的可变区。

图18.各种VH和VL链的氨基酸序列。

CDR序列在序列CDR1、CDR2和CDR3中从左到右加下划线。

使用以下标准确定VH中CDR的位置：

CDR-H1

起始-约26个残基(通常为CYS后4个)[Chothia/AbM限定]，或者Kabat限定在5个残基后开始。之前的残基通常为CYS-XXX-XXX-XXX。之后的残基通常为TRP。典型为TRP-VAL，但也可以是TRP-ILE、TRP-ALA。，长度为10-12个残基[AbM限定]，而Chothia限定排除了最后4个残基。

CDR-H2

起始-Kabat/AbM限定，通常CDR-H1的末端后15个残基。之前的典型残基为LEU-GLU-TRP-ILE-GLY，但也可以有多个变体。之后的残基为LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA。Kabat限定，长度为16-19个残基。

CDR-H3

起始-通常CDR-H2末端后33个残基(通常为CYS后2个)。之前的残基通常为CYS-XXX-XXX(典型的为CYS-ALA-ARG)，之后的残基通常为TRP-GLY-XXX-GLY。长度为3-25(！)个残基。

使用以下标准测定VL中CDR的位置：

CDR-L1

起始-约24个残基，之前的残基通常为Cys，之后的残基通常为Trp，典型的为TRP-TYR-GLN，也可以为TRP-LEU-GLN、TRP-PHE-GLN、TRP-TYR-LEU。长度为10-17个残基。

CDR-L2

起始-通常L1末端后16个残基。之前的残基通常为ILE-TYR，也可以为VAL-TYR、ILE-LYS、ILE-PHE。长度通常为7个残基。

CDR-L3

起始-通常于L2末端后33个残基。之前的残基通常为Cys，之后的残基通常为PHE-GLY-XXX-GLY。长度为7-11个残基。

图19.mIgG-CD20mAb与Daudi细胞的结合。

图20.

新CD20mAb(1μg/mL)未诱导EL4-CD20细胞的HA(放大20倍)。加入交联Ab(50μg/mL)作为阳性对照条件。B1作为阳性对照(II型)。

图21.

使用线性肽NSPSTQYGPANPSEK的表位作图导致识别有助于结合(A)m1但不结合(B)m2的aa。通过ELISA测定1μg/mL mAb与肽和相应突变体的结合，其中每个aa被所有其他可用氨基酸置换(位置扫描；不包括半胱氨酸)。灰线和阴影区域＝WT结合±SEM；结果用Tukey-whiskers显示。

图22.

(A，B)基于FACS的解离分析。Daudi细胞用10μg/mL Alexa647标记的CD20mAb染色。将细胞留在(A)RPMI培养基(非竞争性)或(B)存在10倍过量的未标记的mAb(100μg/mL；竞争性)。在指定的时间点，测定细胞结合mAb的水平。(C，D)使用Ligand Tracer技术分析SKBR3-CD20细胞的实时结合和解离曲线。监测10nM FITC标记的CD20mAb的结合4小时，然后在(C)RPMI培养基(非竞争性)或(D)100nM未标记的相同克隆的CD20mAb(竞争性的)存在下解离8小时。

图23.

总结现有和新的CD20mAb的分子决定因素的概述。描述了三种不同的分子决定因素以确定CD20mAb的MoA：1)表位(指出几种CD20抗体的位置)；2)动力学(CD20抗体的k_off从高(10^-5)到低(10^-6)排列)；和3)根据文献记载，肘角(市售的CD20mAb(OFA、RTX和OBZ)按宽角和窄角分组。Kabat 11位的氨基酸被描述为影响角度，并且基于此，我们根据残基对新的嵌合mAb进行排序)。

图24.合适的IgG1、IgA1和IgA2重链和轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3重链IgG1恒定区CH1-3和铰链

SEQ ID NO：4重链IgA1恒定区CH1-3和铰链

SEQ ID NO：5重链IgA2恒定区CH1-3和铰链

SEQ ID NO：6轻链恒定区

图25在1μg抗体下来自B细胞的CD20的内化。

图中UMAB…参考的数字是指抗体m…的可变结构域，其具有指定的各个数字和恒定区。

图26 B细胞CD20内化中抗体的滴定范围。

图27分析新的嵌合IgA-CD20mAb的体外效果。

(A)IgA1-CD20抗体的ADCC：在以PMN作为效应细胞(E：T＝40：1)的铬释放试验中Daudi细胞的特异性裂解。(B)IgA2-CD20抗体的ADCC：在用PMN作为作为效应细胞(E：T＝40：1)的铬释放试验中Daudi细胞的特异性裂解。

图28 IgA-CD20mAb的体内效果。

在mAb(10μg)或PBS处理前16小时，给C57BL/6小鼠(6只小鼠/组)腹腔注射5×10e5CellTraceViolet标记的EL4-CD20细胞。24小时后通过用TruCount管测定腹膜灌洗液中剩余肿瘤细胞的量来评估抗肿瘤反应(中位数±四分位范围)。

图29体内IgG处理后出现CD20表达缺失，但在IgA处理后不会发生。

在mAb(10μg)或PBS处理前16小时，给C57BL/6小鼠(6只小鼠/组)腹腔注射5×10e5CellTraceViolet标记的EL4-CD20细胞。随后，通过流式细胞术分析测定这些细胞上的CD20表达。

图30具有指定抗体的可变结构域和指定恒定区IgG1、IgA1或IgA2的抗体的CD19/CD24+事件。

发明内容

本发明提供了一种抗体，包含小鼠IgG2；以及人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，所述可变结构域可以结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANpSEK”，并且与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比，所述抗体具有增加的PCD功能。

本发明还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体，该抗体包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于重链可变区包含具有序列SNSYGSTYWYFDV的CDR3区。

本发明还提供了一种抗体，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，所述可变结构域可以结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANPsEK”，并且与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比，该抗体具有增加的ADCC功能。

还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体，该抗体包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于重链可变区包含具有序列YYYGSSYGAMDY的CDR3区。

进一步提供了一种抗体，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，所述可变结构域可以结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANpsEK”，并且与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比，该抗体具有增加的CDC功能。

还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体，该抗体包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于重链可变区包含具有序列TYYYGSSPYWSFDV的CDR3区。

还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体，所述抗体包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于重链可变区包含具有序列SRLFDSSYGWYFDV的CDR3区。

进一步提供了一种抗体，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，所述可变结构域可以结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANpSEK”，并且与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比，所述抗体具有增加的CDC功能和/或增加的ADCC功能。

还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体，所述抗体包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于所述重链可变区包含具有序列SAYYGSNVWFFDV的CDR3区。

进一步提供了如本文所述的抗体在用于治疗个体疾病中使用。

还提供了本文所述的抗体在用于治疗与过量B细胞、过度活化B细胞和/或功能异常B细胞相关的疾病中使用。

还提供了本文所述的抗体在用于治疗CD20阳性肿瘤如CD20阳性B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病或黑素瘤中使用。

还提供了用于治疗患有与过量B细胞、过度活化B细胞和/或功能异常B细胞相关的疾病的个体的方法，包括给予需要其的个体本文所述的抗体。

还提供了用于治疗患有CD20阳性肿瘤如CD20阳性B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病或黑素瘤的个体的方法，包括给予需要其的个体本文所述的抗体。

还提供了用于治疗患有B细胞恶性肿瘤的儿童和在干细胞移植后患有B细胞疾病的儿科白血病患者的方法。在儿科患者中，利妥昔单抗的长期副作用是：B细胞永久性耗竭以及原初B细胞不能转换为记忆B细胞，导致终生免疫球蛋白耗竭。IgG在体内持久存在可能是有问题的。当与包含相同可变结构域的IgG抗体相比时，本文所述的IgA抗体具有更强的ADCC功能。这在分析B细胞特异性标记物时很明显，该标记物在用CD20抗体孵育细胞后不会发生胞啃作用。与包含相同可变结构域的IgG抗体相比，本文所述的IgA抗体具有短的半衰期。与具有相同可变结构域的IgG抗体相比，本文所述的IgA抗体引起的副作用较少。简而言之，本发明的IgA抗体促进有效的命中率，但也被足够快地清除以较好的恢复B细胞组库。从治疗恢复后，特别是在用本发明的抗体治疗的干细胞移植后患有B细胞疾病的上述白血病患者以及用本发明的抗体的B细胞耗竭后的儿科患者中，这都特别有助于保存B细胞组库。

本发明进一步提供了一个可变结构域，包含SEQ ID NO:1和2的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明进一步提供了一个可变结构域，包含SEQ ID NO:7和8的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明进一步提供了一个可变结构域，包含SEQ ID NO:9和10的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明进一步提供了一个可变结构域，包含SEQ ID NO:11和12的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明进一步提供了一个可变结构域，包含SEQ ID NO:13和14的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。进一步提供了包含本文指定的可变结构域的抗体。

进一步提供了

-编码本文所述抗体的重链或轻链的核酸分子；

-编码本文所述抗体的重链或轻链的CDR3的核酸分子；

-编码如本文所述的抗体的重链或轻链的CDR1、CDR2和CDR3的核酸分子；以及

-编码本文所述抗体的重链或轻链可变区的核酸分子。

进一步提供了包含编码本文所述抗体的核酸的细胞。

进一步提供了用于生产本文所述抗体的装置和方法。

具体实施方式

本发明涉及结合CD20的抗体。已知CD20蛋白还有各种其他名称，例如跨膜4-结构域A1；MS4A1；膜跨4-结构域亚家族A成员1；白细胞表面抗原Leu-16；CD20抗原；Bp35；B淋巴细胞表面抗原B1；B淋巴细胞表面抗原B1；CD20受体；LEU-16；CVID5；MS4A2；B1；和S7。用于MS4A1的外部Id是HGNC：7315；Entrez基因：931；Ensembl：ENSG00000156738；OMIM：112210和UniProtKB：P11836。

一些名称可能已经用于或可能还没有用于指代CD20以外的其他蛋白。仅出于参考目的给出名称和序列标识符。本发明的抗体与在Ramos细胞上表达的CD20结合，但也与其他CD20分子结合，只要抗体结合的表位可用即可。因此，只要表位可用，剪接变体或突变体CD20分子(如果有的话)也将被本发明的抗体结合。抗体结合CD20的事实意味着抗体可以结合CD20但不暗示抗体实际上结合至CD20。它也不意味着抗体不与其他蛋白结合。这种交叉反应性目前对于本发明的抗体是未知的，然而，不明确排除可能存在这种交叉反应性。

抗体(Ab)，也称为免疫球蛋白(Ig)，是一种大的通常是Y形的蛋白。抗体与免疫系统的各种组分相互作用。一些相互作用由含有参与这些相互作用的位点的Fc区(位于“Y”的基部)介导。

抗体是属于免疫球蛋白超家族的蛋白。它们通常具有两条重链和两条轻链。存在几种不同类型的抗体重链，其限定了可以附着于抗原结合片段的五种不同类型的可结晶片段(Fc)。五种不同类型的Fc区域使得抗体分成五种同种型。特定抗体同种型的Fc区域能够与其特异性Fc受体(FcR)结合，从而使得抗原-抗体复合物根据其结合的FcR介导不同的作用。IgG抗体与其相应FcR结合的能力通过相互作用位点的存在/缺失以及存在于其Fc区内部位点处的聚糖(如果有的话)的结构来调节。抗体结合FcR的能力有助于针对它们遇到的每种不同类型的外来物质引导适当的免疫应答。

尽管所有抗体的一般结构相似，但蛋白尖端的区域变化极大，这使得存在数百万具有略微不同的尖端结构或抗原结合位点的抗体。该区域被称为高变区。抗体结合抗原的巨大多样性主要由高变区和含有高变区的可变结构域限定。

本发明的抗体通常是全长抗体。术语“全长抗体”定义为包含基本上完整的免疫球蛋白分子，然而其不一定具有完整免疫球蛋白的所有功能。为避免疑义，全长抗体具有两条重链和两条轻链。每条链含有恒定区(C)和可变区(V)。全长抗体的重链通常包含CH1、CH2、CH3、VH区和铰链区。全长抗体的轻链通常包含CL区和VL区。

抗体通过Fab部分中包含的可变区结构域与抗原结合。抗体可变结构域包含重链可变区和轻链可变区。根据本发明的全长抗体包括重链和轻链，其中可以存在提供所需特征的突变。全长抗体不应缺失任何区域的实质部分。然而，其中一个或几个氨基酸残基被取代、插入、缺失或其组合，而本质上不改变所得抗体的抗原结合特征的IgG分子包含在术语“全长”抗体内。例如，“全长”抗体可具有优选在非CDR区中的1至10个(包括10)氨基酸残基的取代、插入、缺失或其组合，其中缺失的氨基酸对于抗体的结合特异性不是必需的。

由本发明的抗体识别的表位和/或其中的次要贡献氨基酸尤其通过位置氨基酸扫描和细胞上表达的CD20蛋白的突变体筛选来确定，在所述位置氨基酸扫描中氨基酸被含有该表位的肽中的每个其他天然氨基酸置换。氨基酸对抗体与表位结合的贡献优选通过比较包含该表位的肽和相同肽(但在分析的氨基酸位置上具有丙氨酸)的结合来确定。当蛋白中的丙氨酸取代导致抗体的结合相对于未修饰的蛋白降低到0至70％时，氨基酸与抗体和蛋白的结合相关。这也称为结合的降低。相对于未修饰的蛋白质蛋白，降低至0至20％的结合被认为是结合的缺失，而相对于未修饰的蛋白降低至21至70％被认为是中度结合。如此鉴定的氨基酸被认为是抗体与蛋白结合的主要贡献者或中间因素。71至100％的结合被认为是完全结合。不认为所涉及的氨基酸对抗体与蛋白的结合有显著贡献。

本发明提供的抗体之一是这样的抗体(A)，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，该可变结构域可以结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANpSEK”，并且所述抗体与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比具有增加的PCD功能。当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，抗体优选进一步包含相当的或增加的CDC功能。优选地，当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，抗体的ADCC功能相当或降低。CD20上被抗体结合的表位是“EPANpSEK”。大写字母、小写字母和粗体表示氨基酸与抗体和肽结合的相关性。粗体字母表示该氨基酸是抗体结合的主要贡献者；小写字母表示该氨基酸对结合有中等贡献，而文本中大写字母表示氨基酸对抗体与肽的结合的贡献较小或不可检测。该抗体结合20％或更少的CD20蛋白，其中“EPANpSEK”中的一个或多个氨基酸N或S已被丙氨酸取代，其中将该结合与抗体和未修饰的CD20蛋白的结合进行比较。

还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体(A1)，其包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于重链可变区包含具有序列SNSYGSTYWYFDV的CDR3区。当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，抗体(A1)具有增加的PCD功能。当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，抗体优选进一步包含相当的或增加的CDC功能。优选地，当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，抗体的ADCC功能相当或降低。重链可变区优选包含CDR1、CDR2和CDR3区，分别具有序列SYNLH、AIYPGNGDTSYNQKFKG和SNSYGSTYWYFDV。优选地，重链可变区包含SEQ ID NO:1的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:1具有如下序列：

QAYLQ QSGAE LVRPG ASVKM SCKAS GYTFT SYNLH WVKQT PRQGL EWIGA IYPGNGDTSY NQKFK GKATL TVDKS SSTAY MQLSR LTSED SAVYF CARSN SYGST YWYFD VWGTG TTVTVSS。

抗体(A1)的轻链可变区优选包含SEQ ID NO:2的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:2具有如下序列：

QIVLS QSPAV LFASP GEKVT MTCRA RSSVS YMDWY QQKPR SSPKP WIYAT SNLASGVPAR FSGSG SGTSY SLTIS RVEAE DAATY YCQQW TSNPP TFGSG TKLEI KRADA APTVS IFPPSS。

抗体A1优选包含小鼠IgG2；人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA重链恒定区或其组合。优选地，其包含人IgG1、IgG2、IgA1或IgA2重链恒定区或其组合。优选其包含人IgG1恒定区。在优选的实施方案中，重链恒定区是人IgA1或人IgA2重链恒定区，优选人IgA2；更优选人IgA2m、优选IgA2m1或IgA2m2、优选IgA2m1重链恒定区。在另一个优选的实施方案中，抗体包含鼠IgG2区，优选IgG2c恒定区。

在一个优选的实施方案中，抗体A是A1抗体。

抗体A或A1优选包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:1的序列以及SEQ IDNO:3、4或5的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

抗体A或A1优选包含轻链，轻链包含SEQ ID NO:2的序列和SEQ ID NO:6的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明还提供了抗体(B)，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，所述可变结构域可以结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANPsEK”，并且所述抗体与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比具有增加的ADCC功能。CD20中被抗体结合的表位是“EPANPsEK”。大写字母、小写字母和粗体表示氨基酸与抗体和肽结合的相关性。文本中的粗体字母表示该氨基酸是抗体结合的主要贡献者；小写字母表示该氨基酸对结合有中等贡献，而大写字母表示氨基酸对抗体与肽的结合的贡献较小或不可检测。该抗体结合20％或更少的CD20蛋白，其中“EPANpSEK”中的氨基酸N已被丙氨酸取代，由此将该结合与抗体和未修饰的CD20蛋白的结合进行比较。

还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体(B1)，所述抗体包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于重链可变区包含具有序列YYYGSSYGAMDY的CDR3区。当与具有相同同种型恒定区的利妥昔单抗相比时，抗体B1具有增加的ADCC功能。重链可变区优选包含分别具有序列SYNMH、GIYPGGNGDTSYNQKFKG和YYYGSSYGAMDY的CDR1、CDR2和CDR3区。

优选地，重链可变区包含SEQ ID NO:7的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置以外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:7具有如下序列：

QAYLQ QSGAE LVRPG ASVKM SCKAS GYTFT SYNMH WVKQT PRQGL EWIGG IYPGNGDTSY NQKFK GKATL TVDKS SSTAY MQLSS LTSED SAVYF CARYY YGSSY GAMDY WGQGT SVTVSS。

抗体B1的轻链可变区优选包含SEQ ID NO:8的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:8具有如下序列：

QIVLS QSPAI LSASP GEKVT MTCRA SSSVS YMHWY QQKPG SSPKP WIYAT SNLASGVPAR FSGSG SGTSY SLTIS RVEAA DAATY YCHQW TFNPP TFGGG TKLEI KRADA APTVS IFPPSS。

抗体B1优选包含小鼠IgG2；人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA重链恒定区或其组合。优选地，抗体B1包含小鼠IgG2；人IgG1、IgG2、IgA1或IgA2重链恒定区或其组合。优选地，抗体B1包含人IgG1恒定区。在优选的实施方案中，重链恒定区是人IgA1或人IgA2重链恒定区，优选人IgA2；更优选人IgA2m，优选IgA2m1或IgA2m2，优选IgA2m1重链恒定区。在另一个优选的实施方案中，抗体包含鼠IgG2区，优选IgG2c恒定区。

在优选的实施方案中，抗体B是B1抗体。

抗体B或B1优选包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:3、4或5的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

抗体B或B1优选包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:8的序列和SEQ ID NO:6的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明还提供了一种抗体(C)，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，所述可变结构域可以结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANpsEK”，并且当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，所述抗体具有增加的CDC功能。优选地，其包含与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相似的ADCC功能。CD20中被抗体结合的表位是“EPANpsEK”。大写字母、小写字母和粗体表示氨基酸与抗体和肽结合的相关性。文本中的粗体字母表示该氨基酸是抗体结合的主要贡献者；小写字母表示该氨基酸对结合有中等贡献，而大写字母表示氨基酸对抗体与肽的结合的贡献较小或不可检测。该抗体结合20％或更少的CD20蛋白，其中“EPANpSEK”中的氨基酸N已被丙氨酸取代，由此将该结合与抗体和未修饰的CD20蛋白的结合进行比较。

还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体(C1)，其包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于重链可变区包含具有序列TYYYGSSPYWSFDV的CDR3区。当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，抗体具有增加的CDC功能。优选地，其包含与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相似的ADCC功能。重链可变区优选包含分别具有序列SYNMH、AIYPGNGDTSYNQKFKG和TYYYGSSPYWSFDV的CDR1、CDR2和CDR3区。

优选地，重链可变区包含SEQ ID NO:9的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:9具有如下序列：

QAYLQ QSGAE LVRPG ASVKM SCKAS GYTFA SYNMH WIKQT PRQGL EWIAA IYPGNGDTSY NQKFK GKATL TVDKS SSTAY MQLSS LTSED SAVYF CARTY YYGSS PYWSF DVWGT GTTVTVSS。

抗体C1的轻链可变区优选包含SEQ ID NO:10的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:10具有如下序列：

DIQMT QSPAS LSASV GETVT VTCGA SYNIY GALNW YQRKQ GKSPQ LLIYG ATNLADGMSS RFSGS GSGRQ YSLKI SSLHP DDVAT YYCQN VLSNP PTFGG GTKLE IKRAD AAPTV SIFPPSS。

抗体C1优选包含小鼠IgG2；人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA重链恒定区或其组合。优选地，抗体C1包含人IgG1、IgG2、IgA1或IgA2重链恒定区或其组合。优选地，抗体C1包含人IgG1恒定区。在优选的实施方案中，重链恒定区是人IgA1或人IgA2重链恒定区，优选人IgA2；更优选人IgA2m，优选IgA2m1或IgA2m2，优选IgA2m1重链恒定区。在另一个优选的实施方案中，抗体包含鼠IgG2区，优选IgG2b恒定区。

在一个优选的实施方案中，抗体C是C1抗体。

抗体C或C1优选包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:9的序列和SEQ ID NO:3、4或5的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

抗体C或C1优选包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:10的序列和SEQ ID NO:6的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体D1，其包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于所述重链可变区包含具有序列SRLFDSSYGWYFDV的CDR3区。当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，抗体具有增加的CDC和/或增加的ADCC功能。优选地，与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比，抗体包含改善的ADCC功能。重链可变区优选包含分别具有序列SYNMH、AIYPGNGDTSYNQKFKG和SRLFDSSYGWYFDV的CDR1、CDR2和CDR3区。

优选地，重链可变区包含SEQ ID NO:11的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:11具有如下序列：

QAYLQ QSGAE LVRPG ASVKM SCKAS GYTFP SYNMH WVKQT PRQGL EWIGA IYPGNGDTSY NQKFK GKASQ TVDKS SSTVY MQLSS LTSAD SAVYF CARSR LFDSS YGWYF DVWGT GTTVTVSS。

抗体D1的轻链可变区优选包含SEQ ID NO:12的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:12具有如下序列：

QIVLS QSPAI LSAYP GEKVT MTCRA RSSVS YIDWY QQKAG SSPKP WIYAT SNLASGVPAR FSGSG SGTSY SLTIS RVEAE DAATY YCQQW TSNPP TFGGG TKLEI KRADA APTVS IFPPSS。

抗体D1优选包含小鼠IgG2；人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA重链恒定区或其组合。优选地，其包含人IgG1、IgG2、IgA1或IgA2重链恒定区或其组合。优选其包含人IgG1恒定区。在优选的实施方案中，重链恒定区是人IgA1或人IgA2重链恒定区，优选人IgA2；更优选人IgA2m，优选IgA2m1或IgA2m2，优选IgA2m1重链恒定区。在另一个优选的实施方案中，抗体包含鼠IgG2区，优选IgG2c恒定区。

在优选的实施方案中，抗体D是D1抗体。

抗体D或D1优选包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:11的序列和SEQ IDNO:3、4或5的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

抗体D或D1优选包含具有SEQ ID NO:12的序列和SEQ ID NO:6的序列的轻链，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明还提供了一种抗体(E)，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，所述可变结构域可以结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANpSEK”，并且当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，该抗体具有增加的CDC和/或增加的ADCC功能。CD20中被抗体结合的表位是“EPANpSEK”。大写字母、小写字母和粗体表示氨基酸与抗体和肽结合的相关性。文本中的粗体字母表示该氨基酸是抗体结合的主要贡献者；小写字母表示该氨基酸对结合有中等贡献，而大写字母表示氨基酸对抗体与肽的结合的贡献较小或不可检测。该抗体结合20％或更少的CD20蛋白，其中“EPANpSEK”中的一个或多个氨基酸N或S已被丙氨酸取代，由此将该结合与抗体和未修饰的CD20蛋白的结合进行比较。

还提供了能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外区的抗体(E1)，其包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于重链可变区包含具有序列SAYYGSNVWFFDV的CDR3区。当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，抗体具有增加的CDC和/或增加的ADCC功能。重链可变区优选包含CDR1、CDR2和CDR3区，分别具有序列SYNLH、AIYPGNGDTSYNQKFKG和SAYYGSNVWFFDV。

优选地，重链可变区包含SEQ ID NO:13的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:13具有如下序列：

QAYLQ QSGAD LVRPG ASVKM SCKAS GFTFP SYNLH WVKQT PRQGL EWIGA IYPGNGDTSY NQKFK GKATL TVDKS SSTAY MQLSS LTSED SAVYF CARSA YYGSN VWFFD VWGTG TTVTVSS。

抗体E1的轻链可变区优选包含SEQ ID NO:14的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:14具有如下序列：

QIVLS QSPAI LSASP GEKVT MTCRA SSSVS YMDWY QQKPG SSPKP WIYAT SNLASGVPTR FSGSG SGTSY SLTIS RVEAE DAATY YCQQW ISNPP TFGAG TKLDL KRADA APTVS IFPPSS。

抗体E1优选包含小鼠IgG2；人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA重链恒定区或其组合。优选地，抗体E1包含人IgG1、IgG2、IgA1或IgA2重链恒定区或其组合。优选地，抗体E1包含人IgG1恒定区。在优选的实施方案中，重链恒定区是人IgA1或人IgA2重链恒定区，优选人IgA2；更优选人IgA2m，优选IgA2m1或IgA2m2，优选IgA2m1重链恒定区。在另一个优选的实施方案中，抗体包含鼠IgG2区，优选IgG2c恒定区。

在一个优选的实施方案中，抗体E是E1抗体。

抗体E或E1优选包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:13的序列和SEQ IDNO:3、4或5的序列，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

抗体E或E1优选包含具有SEQ ID NO:14的序列和SEQ ID NO:6的序列的轻链，在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

可以将抗体的功能与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗进行比较。这优选是相同的恒定区。一些氨基酸差异可以存在于恒定区中，这样的氨基酸差异可以例如通过体细胞超突变引入。通常允许0至5个氨基酸之间的差异，虽然更多也是可能的。为了比较功能，优选抗体和利妥昔单抗的恒定区相同。

本发明的抗体可具有重链可变区，该重链可变区在相对于由相应SEQ ID NO指示的序列的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。因此，CDR的序列如各自的SEQ ID NO所示。优选重链可变区在相应SEQ ID NO所示序列的一个或多个位置处具有0至4个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。优选重链可变区在相应SEQ ID NO所示序列的一个或多个位置处具有0至3个，更优选0至2个，更优选0至1个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。在优选的实施方案中，本发明抗体中的重链可变区相对于所示SEQ ID NO的序列具有0个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明的抗体可具有轻链可变区，该轻链可变区在相对于由相应SEQ ID NO指示的序列的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。因此，CDR的序列如各自的SEQ ID NO所示。优选轻链可变区在相应SEQ ID NO所示序列的一个或多个位置处具有0至4个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。优选轻链可变区在相应SEQ ID NO所示序列的一个或多个位置处具有0至3个，更优选0至2个，更优选0至1个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。在优选的实施方案中，本发明抗体中的轻链可变区相对于所示SEQ ID NO的序列具有0个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明的抗体的重链可在由相应SEQ ID NO指示的序列的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。因此，CDR的序列如各自的SEQ ID NO所示。优选地，重链在由相应的SEQID号指示的序列的一个或多个位置处具有0至10个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。重链可在由相应SEQ ID号指示的序列的一个或多个位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。优选地，重链在由相应SEQ ID号指示的序列的一个或多个位置处具有0至3个，更优选0至2个，更优选0至1个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。在优选的实施方案中，本发明抗体中的重链相对于所示SEQ ID号的序列具有0个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本发明的抗体的轻链在由相应SEQ ID号指示的序列的一个或多个位置处可以具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。因此，CDR的序列如各自的SEQ ID NO所示。优选地，所述轻链在由相应的SEQ ID号指示的序列的一个或多个位置处具有0至10个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。轻链可在由相应SEQ ID号指示的序列的一个或多个位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。优选地，所述轻链在由相应SEQ ID号指示的序列的一个或多个位置处具有0至3个，更优选0至2个，更优选0至1个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中所述一个或多个位置不是CDR1、CDR2和CDR3区中的位置。在优选的实施方案中，本发明的抗体中的轻链相对于所示SEQ ID号的序列具有0个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

如本文所述的抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1可以是包含一个可变结构域的双特异性抗体，所述可变结构域结合在Ramos细胞上表达的CD20的胞外区上的除所示表位之外的抗原。其他抗原优选CD19、CD64、CD32、CD16、CD3和CD47。在优选的实施方案中，抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1包含两个可变结构域，每个结构域与在Ramos细胞上表达的CD20的胞外区上的相同表位结合，其中所述表位如对于抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1的可变结构域所指出。抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1优选包含两个相同的可变结构域。抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1优选包含两个可变结构域，每个可变结构域结合相同的表位并包含相同的VH和相同的VL序列。

本发明还提供了CAR-T受体，其包含如本文所述的抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1的可变结构域。可变结构域包含相应抗体的重链可变区和轻链可变区，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。相应的重链和轻链可变区的序列如图18所示。

例如，CAR-T受体优选包含抗体A1的可变结构域。在一个优选的实施方案中，可变结构域包含SEQ ID NO:1和2的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

CAR-T受体优选包含抗体B1的可变结构域。在一个优选的实施方案中，可变结构域包含SEQ ID NO:7和8的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

CAR-T受体优选包含抗体C1的可变结构域。在一个优选的实施方案中，可变结构域包含SEQ ID NO:9和10的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

CAR-T受体优选包含抗体D1的可变结构域。在一个优选的实施方案中，可变结构域包含SEQ ID NO:11和12的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

CAR-T受体优选包含抗体E1的可变结构域。在一个优选的实施方案中，可变结构域包含SEQ ID NO:13和14的重链和轻链可变区的氨基酸序列，每个在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

还提供了用于过继细胞转移的包含本发明CAR-T细胞受体的T细胞。该用途优选用于治疗患有CD20阳性肿瘤如CD20阳性B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病或黑素瘤的个体，包括给予需要其的个体本文所述的抗体。该T细胞还可用于治疗患有B细胞恶性肿瘤的儿童和在干细胞移植后患有B细胞疾病的儿科白血病患者。

免疫原性可能是改变某一位置的氨基酸的一个原因。其他原因包括但不限于改善抗体的产生或同质性。本发明的抗体具有来源于鼠背景的可变重链区和可变轻链区。具有这种可变结构域的抗体可用于人。目前优选去免疫这些可变结构域。去免疫通常包括尽可能将鼠序列修饰成更接近人序列。通常这种修饰涉及从可变结构域去除一个或多个T细胞表位或一个或多个B细胞表位。在一个优选的实施方案中，本发明提供抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1，其中一个或多个(人)T细胞表位已经通过用不同氨基酸置换表位的至少一个氨基酸而被去除。通常，取代所谓的“锚定”氨基酸就足够了。合适的置换氨基酸可以从特定VH或VL的体细胞超突变株获得。优选用人抗体中该位置天然存在的氨基酸进行置换。在一个优选的实施方案中，本发明提供抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1，其中一个或多个(人)B细胞表位已经通过用不同氨基酸置换表位的至少一个氨基酸而被去除。通常仅置换表位的一个氨基酸就足够了。合适的置换氨基酸可以从特定VH或VL的体细胞超突变株获得。优选用人抗体中该位置天然存在的氨基酸进行置换。优选地，本发明的可变结构域相对于一个或多个外部残基被修饰。免疫系统很容易遇到这些残基，并且优选被人残基选择性置换以提供包含弱免疫原性表面或基本上非免疫原性表面的杂合分子。合适的置换氨基酸可以从特定VH或VL的体细胞超突变株获得。优选用人抗体中该位置天然存在的氨基酸进行置换。因此，本发明进一步提供了包含人源化重链可变区、人源化轻链可变区或其组合的抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1。

本发明进一步提供了用于治疗个体疾病的抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1。还提供了抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1，其用于治疗与过量B细胞、过度活化B细胞和/或功能异常B细胞相关的疾病。还提供了用于治疗CD20阳性肿瘤如CD20阳性B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和黑素瘤的抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1。

还提供了抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1在制备用于治疗与过量B细胞、过度活化B细胞和/或功能异常B细胞相关的疾病的药物中的用途。还提供了抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1在制备用于治疗CD20阳性肿瘤如CD20阳性B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和黑素瘤的药物中的用途。

还提供了用于治疗患有与过量B细胞、过度活化B细胞和/或功能异常B细胞相关的疾病的个体的方法，包括给予需要其的个体抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1。

进一步提供了用于治疗患有CD20阳性肿瘤如CD20阳性B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和黑素瘤的个体的方法，包括给予需要其的个体抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1。

本发明还提供了编码重链、轻链和/或其可变区的核酸分子。这种核酸分子通常是但不仅仅是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。本领域技术人员可使用替代核酸，例如肽核酸(PNA)。本发明提供的核酸分子的实例是

-编码本文所述抗体的重链或轻链的核酸分子；

-编码本文所述抗体的重链或轻链的CDR3的核酸分子；

-编码本文所述抗体的重链或轻链的CDR1、CDR2和CDR3的核酸分子；以及

-编码本文所述抗体的重链或轻链的可变区的核酸分子。

-编码包含具有序列SNSYGSTYWYFDV的CDR3区的重链可变区的核酸分子。

-编码包含CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变区的核酸分子，CDR1、CDR2和CDR3区分别具有序列SYNLH、AIYPGNGDTSYNQKFKG和SNSYGSTYWYFDV。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:1具有如下序列：

-编码轻链可变区的核酸分子，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:2具有如下序列：

-编码重链的核酸分子，所述重链包含SEQ ID NO:1的序列和SEQ ID NO:3、4或5的序列，这些序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

-编码轻链的核酸分子，所述轻链包括SEQ ID NO:2的序列和SEQ ID NO:6的序列，这些序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

-编码具有CDR3区的重链可变区的核酸分子，CDR3区具有序列YYYGSSYGAMDY。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含分别具有序列SYNMH、GIYPGNGDTSYNQKFKG和YYYGSSYGAMDY的CDR1、CDR2和CDR3区。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:7具有如下序列：

-编码轻链可变区的核酸分子，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的序列，该序列在构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置以外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:8具有如下序列：

-编码重链的核酸分子，所述重链包含SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:3、4或5的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

-编码轻链的核酸分子，所述轻链包含SEQ ID NO:8的序列和SEQ ID NO:6的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含具有序列TYYYGSSPYWSFDV的CDR3区。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含分别具有序列SYNMH、AIYPGNGDTSYNQKFKG和TYYYGSSPYWSFDV的CDR1、CDR2和CDR3区。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:9具有如下序列：

-编码轻链可变区的核酸分子，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置以外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:10具有如下序列：

-编码重链的核酸分子，所述重链包含SEQ ID NO:9的序列和SEQ ID NO:3、4或5的序列，这些序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

-编码轻链的核酸分子，所述轻链包含SEQ ID NO:10的序列和SEQ ID NO:6的序列，这些序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含具有序列SRLFDSSYGWYFDV的CDR3区。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含分别具有序列SYNMH、AIYPGNGDTSYNQKFKG和SRLFDSSYGWYFDV的CDR1、CDR2和CDR3区。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含SEQ ID NO:11的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置以外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:11具有如下序列：

-编码轻链可变区的核酸分子，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置以外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:12具有如下序列：

-编码重链的核酸分子，所述重链包含SEQ ID NO:11的序列和SEQ ID NO:3、4或5的序列，这些序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

-编码轻链的核酸分子，所述轻链具有SEQ ID NO:12的序列和SEQ ID NO:6的序列，这些序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含具有序列SAYYGSNVWFFDV的CDR3区。

-编码包含CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变区的核酸分子，所述CDR1、CDR2和CDR3区分别具有序列SYNLH、AIYPGNGDTSYNQKFKG和SAYYGSNVWFFDV。

-编码重链可变区的核酸分子，所述重链可变区包含SEQ ID NO:13的序列，该序列在构成CDR1，CDR2和CDR3区的氨基酸位置以外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:13具有如下序列：

QAYLQ QSGAD LVRPG ASVKM SCKAS GFTFP SYNLH WVKQT PRQGL EWIGAIYPGNGDTSY NQKFK GKATL TVDKS SSTAY MQLSS LTSED SAVYF CARSAYYGSN VWFFD VWGTG TTVTVSS。

-编码轻链可变区的核酸分子，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14的序列，该序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置以外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合，其中SEQ ID NO:14具有如下序列：

QIVLS QSPAI LSASP GEKVT MTCRASSSVS YMDWY QQKPG SSPKP WIYAT SNLASGVPTR FSGSG SGTSY SLTIS RVEAE DAATY YCQQW ISNPP TFGAG TKLDL KRADAAPTVS IFPPSS。

-编码重链的核酸分子，所述重链包含SEQ ID NO:13的序列和SEQ ID NO:3、4或5的序列，这些序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

-编码轻链的核酸分子，所述轻链具有SEQ ID NO:14的序列和SEQ ID NO:6的序列，这些序列在除了构成CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。

本文所述的核酸分子优选用于通过包含所述核酸分子的细胞产生本文所述的抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1。包含两个或多个所示序列的核酸分子包含这样的序列，其顺序和连接适于通过包含所述核酸分子的细胞产生本文所述的抗体A、B、C、D、E、A1、B1、C1、D1或E1。核酸分子优选进一步包含一种或多种用于表达所述抗体的序列。这些序列的非限制性实例是启动子、终止序列、增强子、内含子等。这样的序列不一定存在于核酸分子上，因为这样的序列可以通过核酸分子在例如细胞染色体或包含所述核酸分子的载体中的整合位点顺式提供。可以容易地(例如通过同源重组)确定和靶向细胞染色体中的合适整合位点。

进一步提供了包含一种或多种本文所述核酸分子的细胞。

进一步提供了用于使用本发明的核酸分子或包含本发明的核酸分子的细胞生产本文所述的抗体的装置和方法。

根据本发明的核酸例如包含在细胞中。当所述核酸在所述细胞中表达时，核酸分子的翻译产物可以整合到本发明的抗体中。因此，本发明还提供了包含根据本发明的核酸分子的细胞。本发明进一步提供了包含本发明的核酸分子并且能够产生本发明的抗体的细胞。进一步提供了用于生产本发明的抗体的方法，包括培养包含表达一种或多种编码本发明抗体的核酸分子的细胞，并从培养基、细胞或其组合中收获抗体。所述细胞优选是动物细胞，更优选哺乳动物细胞。所述细胞优选是通常用于生产用于人的抗体的细胞。这种细胞的非限制性实例是CHO、NSO和PER.C6细胞。细胞可以特别设计以适合某些目的，例如，用于产生抗体的大多数细胞系已经适应悬浮生长、高密度生长和其他性质。出于本发明的目的，合适的细胞是能够包含并优选产生根据本发明的抗体的任何细胞。

所要求保护的抗体的PCD功能优选在基于流式细胞术中膜联蛋白V阳性的方法中测量(如实施例3所述)。

所要求保护的抗体的ADCC功能优选地在基于流式细胞术中测量的来自健康志愿者的血液中B细胞耗竭的方法中，通过CD24阳性细胞的减少、骨髓标记物阴性或经典的铬释放测定来测量(如实施例1所述)。

所要求保护的抗体的CDC优选在基于流式细胞术中7AAD阳性的方法中测量(参见例如实施例1)。

实施例

实施例1控制这些抗体的功能特性的新抗CD20抗体和分子决定簇。

材料和方法

抗体

通过细胞免疫和脾细胞的标准融合产生CD20mAb以获得杂交瘤。通过FACS(大鼠抗mIgG2a-生物素(与mIgG2c交叉反应；BD)，山羊抗mIgG2b-Fcγ-RPE(Southernbiotech)，山羊抗mIgG3-PerCP(Jackson))确定同种型。在无血清培养基中生长后，通过使用HiTraprProteinA FF柱的亲和层析(GE Healthcare)纯化mAb。用0.1M乙酸钠pH2.5(SigmaAldrich)洗脱结合的蛋白，并用1M Tris-HCl pH8.8直接中和。通过将可变区(由Shinegene合成)克隆到Lonza表达载体(pEE14.4-kappaLC、pEE14.4-IgG1)中产生嵌合IgG1(IgG1)mAb。通过定点诱变引入L11V突变。所有IgG1mAb通过瞬时转染HEK293F细胞产生²²、并通过蛋白A亲和层析纯化。将所有mAb透析至PBS(Sigma-Aldrich)并使用下述公式测定浓度：280nm处的OD值/校正因子(mIgG1.36；chIgG1.35)。

如果需要，将RTX(chIgG1；Pharmacy UMC Utrecht)、OFA(人(h)IgG1；PharmacyUMC Utrecht)、小鼠(m)IgG2a-CD20-7D8(m7D8)和mIgG2a-CD20-11B8(m11B8)(由荷兰Genmab BV，Utrecht友情提供)、B1(mIgG2a，由英国南安普敦Mark Cragg友情提供)和mIgG2a-RTX(mRTX)(Invivogen)透析至PBS。按照制造商的说明，用FITC(ThermoScientific)或Alexa647(Molecular Probes)标记Ab。

细胞系

用人CD20逆转录病毒转导SKBR3细胞(ATCC)，产生SKBR3-CD20细胞。通过限制稀释建立稳定表达CD20的亚克隆。如前所述产生EL4-CD20细胞。²³将Daudi、Ramos、Raji(ATCC)和上述细胞在包含补充有10％胎牛血清(FCS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(LifeTechnologies)的RPMI-1640+HEPES+谷氨酰胺(Invitrogen)的培养基中培养(条件为37℃/5％CO₂)。将FreeStyle^TM HEK293F细胞(Invitrogen)在轨道振荡器上的FreeStyle^TM 293表达培养基(Invitrogen)中在37℃/5％CO₂下培养。

可变区共有氨基酸序列测定

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从冷冻的干燥细胞颗粒中分离和纯化RNA。使用纯化的RNA(2μg)作为模板，用RevertAid H Minus First Strand cDNA合成试剂盒(Fermentas)合成cDNA。接下来，在PCR反应中扩增可变轻链(VL)和可变重链(VH)区(参见补充材料和方法)。将凝胶纯化的PCR产物克隆到pCRII平端TOPO载体(Life Technologies)中，并转化进DH5αE.coli。使用QIAprep Spin miniprep试剂盒(Qiagen)从几个克隆体中分离质粒DNA。随后，通过含有插入物的几个质粒克隆体的DNA测序(Macrogen)测定来自每个mIgG-CD20mAb的VL和VH区的共有DNA序列。基于每种mAb的几个克隆的序列信息，确定共有V-区序列，随后推导氨基酸序列。

同型聚集和细胞活力测定

将培养基中的0.4x10⁵EL4-CD20细胞与1μg/mL Ab一起在96孔板中铺板，37℃/5％CO₂温育24小时。在交联条件下，30分钟后加入以下Ab：20μg/mL兔-F(ab')₂-抗-hIgG(Jackson)或50μg/mL兔-F(ab')₂-抗-mIgG(Jackson)。使用EVOS显微镜(20x放大倍数)半定量地评估同型聚集。按照制造商的说明，通过AnnexinV-PE和7-AAD(Pharmingen)染色测定细胞活力。

人PBMC ADCC

如前所述进行用⁵¹Cr标记的靶细胞的ADCC试验。^22,24简言之，将通过Ficoll分离(GE Healthcare)从健康个体(MiniDonorDienst UMC Utrecht)分离的PBMC与⁵¹Cr标记的Daudi细胞(效应物：靶标比＝100：1)和CD20mAb稀释合并。在37℃/5％CO₂下孵育4h后，收集上清液并在液体闪烁计数器(MicroBeta；Perkin Elmer)中计数。使用下述公式计算裂解：％裂解＝((样品计数-最小释放)/(最大释放-最小释放))x100。在培养基中或在补充有2.5％Triton X-100(Roche Diagnostics)的培养基中，具有PBMC的Daudi细胞分别用于测定最小和最大释放。

CDC试验

将10⁵个细胞(Daudi、Ramos、Raji)铺板在96孔板中，并在室温下用在培养基中稀释的Ab预孵育30分钟。加入人血清(来自8名健康供体的混合物)作为补体来源(终浓度15.5％)，并在37℃/5％CO₂下保持制备15分钟。通过用7-AAD(Pharming)染色评估补体介导的裂解程度。在FACS Canto II(BD)上测量细胞。

CD20肽库的设计与筛选

CD20肽库的设计在别处描述。²⁰简而言之，直接在聚丙烯板上合成具有不同大小的环、覆盖2个细胞外环的线性和环状肽。^25,26重建线性和不连续表位，包括对每个肽和完整氨基酸进行扫描(参见补充材料和方法)。

如前所述，在基于PepScan的ELISA中评估CD20mAb对肽的识别。²⁰简而言之，将1μg/mL mAb加入到具有共价连接的肽的板中并在4℃下孵育过夜。在充分洗涤后，用HRP连接的兔抗-mIgG(DakoCytomation)在25℃下检测结合的mAb 1小时。洗掉未结合的检测Ab。使用ABTS基底对板进行显影，并使用CCD照相机和图像处理系统对板进行定量显色。

突变体筛选

按照制造商的说明，使用293fectin(Invitrogen)用编码野生型或突变CD20的载体转染HEK293F细胞。转染后1天，收获细胞，在FACS缓冲液中洗涤并在冰上用5μg/mLCD20mAb染色30分钟。用山羊抗hIgG-APC或山羊抗mIgG-APC Ab(Jackson)检测mAb结合。在FACS Canto II(BD)上测量细胞。

配体示踪剂

通过使用LigndTracer Green Technology(Ridgeeview Instruments AB)进行mAb和CD20之间相互作用的动力学分析。将10⁶个SKBR3-CD20细胞接种在10cm培养皿(Greiner)的一侧作为靶细胞面积，并测量10nM FITC标记的CD20mAb的结合。对于非竞争性或竞争性解离，分别用RPMI培养基或相同克隆的100nM未标记mAb代替标记mAb溶液。使用TraceDrawer(Ridgeview Instruments AB)中的OneToOne拟合模型进行分析。

EL4-CD20淋巴瘤模型

C57BL/6小鼠购自Janvier(法国)或在我们的设施中饲养。用5×10⁵CellTraceViolet(10μM，Invitrogen)标记的EL4-CD20细胞腹腔注射(i.p.)4-6只小鼠/组。16h后，用mAb或PBS(100μL)腹腔注射处理小鼠。24小时后，用含有5mM EDTA的PBS进行腹腔灌洗，并使用TruCount管(BD)测定剩余肿瘤细胞的量。所有实验都得到UMC Utrecht的动物伦理委员会的批准。

补充材料和方法

VH和VL区的扩增

根据制造商的说明书，PCR反应含有25ng cDNA、1x AccuPrime mix(LifeTechnologies)，25pmol分别退火至编码信号肽的cDNA和抗体的恒定区的5’和3’引物(Biorigo)，以及AccuPrimeTM Pfx DNA聚合酶(Life Technologies)。扩增由以下组成：在95℃下初始化2分钟，然后在95℃下变性30秒、在55℃或60℃下退火30秒以及在68℃下延伸2.5分钟的34个循环，最终在34个循环之后，是在68℃下持续7分钟的扩张步骤(extensionstep)。将PCR管保持在4℃直至进一步处理。

结合测定

将10⁵个Daudi细胞铺板在96孔板中，并与mIgG CD20mAb(在PBS中)在冰上孵育45分钟。洗涤后，用山羊-F(ab’)₂-抗-mIgG(H+L)-APC(Southern Biotech)检测结合的CD20mAb，随后在FACS Canto II(BD)上测量。

用于表位作图实验的肽文库的详细描述

覆盖2个胞外CD20环的单结构域和双结构域肽被用于重建线性和不连续表位。对于每种肽，包括全部位置aa扫描(即每个位置被所有其他aa代替)。文库的第二部分由环肽组成，其通过使用Pepscan技术(www.pepscan.nl)引入基于半胱氨酸的环而形成。包括以下肽：(a)覆盖大环的所有重叠的线性34-mer肽，包括每个34-mer肽的完全丙氨酸扫描；(b)将来自大环的34个重叠肽和来自小环的1个肽在35×35的基质中相互组合，以便绘制分布在两个不同部分上的不连续表位；(c)覆盖完整CD20的所有重叠的线性15-mer肽；(d)YNCEPANPSEKNSPSTQYCYS的全位置aa扫描(不包括半胱氨酸)；(e)一个双环小环覆盖肽；(f)覆盖大环的不同大小的单环肽，以捕获依赖于特定环大小的构象表位；以及(g)覆盖CD20分子的完整胞外序列的所有重叠的单环15-mer肽。

基于FACS的解离

将10⁵个Daudi细胞与10μg/mL Alexa647标记的mAb在37℃下孵育1小时，然后制粒并重悬于100μg/mL未标记的mAb或RPMI完全培养基中。将细胞放置在37℃/5％CO₂下，并在指定时间点在FACS Canto II上测量以确定随时间推移细胞结合mAb的水平。每个时间点的剩余平均荧光强度(MFI)以初始MFI的百分比表示。

结果

新的CD20mAb显示I型特征

我们生成了一组新的CD20mAb并对其进行了详细的表征。在融合6只免疫小鼠的脾B细胞后，我们获得了17个产生mIgG2c-CD20mAb、mIgG2b-CD20mAb和mIgG3-CD20mAb的稳定杂交瘤克隆体(表1)。对于17个CD20mAb中的14个，我们获得了具有不同关联度的独特VH和VL链序列对(图1)。新的mIgG-CD20mAb与可用的I/II型CD20mAb的比较显示VH链的CDR3保守性最低(与RTX相比，新的mIgG-CD20mAb具有27％至63％的同一性)。为了进一步研究，我们纯化了11种CD20mAb。它们的结合与I型CD20mAb m7D8(衍生自与OFA相同组，具有相当的特性¹⁴，但表达为mIgG2amAb)和mRTX相当(图19)。

接下来，我们确定它们的MoA。在不存在交联Ab的情况下，通过新的CD20mAb既没有诱导PCD(图2A)也没有诱导同型聚集(图20)，二者都是由II型mAb强烈引发的。

作为I/II型mAb的共同特征，我们在ADCC试验中使用Daudi细胞作为靶细胞和PMBC作为效应物确定了特异性细胞裂解(图2B)。用所有mIgG2c-CD20mAb获得了相当程度的裂解。相反，mIgG2b mAb的效力较低。值得注意的是，CDC活性，仅由I型mAb引发的MoA，在CD20mAb中显著不同(图2C)。

新的mIgG2c-CD20mAb的CDC能力的变化

为了进一步比较，我们主要关注mIgG2c mAb，因为它们表现出更高水平的效应器功能。我们在更宽的浓度范围内分析Daudi细胞的CDC，Daudi细胞是由于高CD20和低补体调节蛋白(CRP)表达而对补体介导的裂解敏感的细胞系(图3A)。m1和m9、尤其是在0.1μg/mL至3μg/mL mAb时，示出了最高的CDC活性。m10表现出中等CDC活性，以及m2的CDC活性最弱。在用Ramos和Raji细胞的试验中也检测到m1比m2有更好的CDC诱导活性，Ramos和Raji细胞具有降低的CD20和增加的CRP表达(图3B)。

具有重叠但不同的表位的新CD20mAb

为了研究功能特性和表位之间可能的相关性，我们应用PepScan-技术对m1和m2(均为mIgG2c-CD20mAb，但CDC活性分别为最高和最低)进行详细的表位作图分析。我们通过使用线性(图21A)和环状(图4A，左)肽用覆盖较大胞外环的位置氨基酸扫描识别了m1的关键残基为¹⁶⁸EPANPSEK¹⁷⁵。相反，m2与线性(图21B)和环状(图4A，右)肽结合的信号相当低。然而，低于野生型(WT)结合信号的信号降低仅发生在¹⁶⁸EPANPSEK¹⁷⁵序列基序内。这表明两种mAb的表位均位于相同区域的较大环上，然而它们的结合特性是不同的。数据表明m1与线性表位结合，而m2可能与构象表位结合。

在基于肽扫描识别两种新CD20mAb的表位后，我们接下来感兴趣的是在正确折叠的CD20上定义完整mAb组的识别位点。因此，我们首先用两个CD20突变体进行了粗略的表位作图实验，两个突变体具有在CD20的小环(T159K/N163D/N166D)或较大(A170S/P172S)环中突变的氨基酸(图4B)。没有新的CD20mAb显示出对m7D8(T159K/N163D/N166D)结合区突变的结合受损。RTX表位区域(A170S/P172S)中的突变导致所有新的CD20mAb的结合以不同程度减少(0％至20％的WT结合：RTX、m1、m6、m7、m17；20％至30％的WT结合：m3、m4、m5、m10；50％至80％的WT结合：m2、m9、m11)。

为了确定在较大的胞外环内结合所需的关键氨基酸，我们使用跨越¹⁶⁸PANPSEKNSP¹⁷⁸序列的单一突变文库(图4C)。所有11个评估的具有独特序列对的CD20mAb显示出不同的结合模式。11个新CD20mAb中没有一个在N176或E174突变时显示结合缺失，发现两个残基分别影响II型mAb B1和m11B8的结合。m9的结合不受任何突变体的影响。所有其他新CD20mAb在N171突变后显示与CD20分子的结合受损，如mRTX所示。两个单突变体A170P和P172A使得识别A170S/P172S双突变体中的有贡献的氨基酸成为可能。A170P突变不影响mAb结合。相反，P172A突变体影响除了m2、m9和m11之外的所有新CD20mAb的结合。识别出残基S173对于mRTX、m1、m4和m10的结合是重要的。总之，大多数新CD20mAb的表位可以缩小到¹⁷⁰ANPSE¹⁷⁴，然而结合需要不同的氨基酸。

CD20mAb显示结合稳定性的变化

缓慢的Ab解离速率可能有利于形成Ab-C1q复合物，经典补体途径的第一个组分。基于FACS的解离分析暗示了m1和m2的独特解离行为(图22A、B)，表明m2的解离/结合速率更快。为了表征mAb的相互作用动力学和亲和力，我们使用LigandTracer技术记录Ab与细胞受体的实时结合和解离。我们在非竞争性(图5A，左)和竞争性(图5A，右)条件下对所有4mIgG2c-CD20mAb进行动力学分析，并检测它们结合行为的差异。所有的mAb在低至亚纳摩尔范围内具有相似的表观亲和力(表3)。所有mAb的结合速率常数相当。在解离阶段观察到动力学的主要差异。OFA、m9和m10的解离非常缓慢，而m1、m2和RTX具有更显著的双相释放模式，这意味着一部分mAb快速解离，而另一部分更稳定结合(通过InteractionMap分析确定；数据未显示)。此外，除了m9，在竞争条件下的解离比在非竞争条件下的解离快(图5C)，这表明解离的mAb在非竞争条件下重新结合到细胞上。这发生在例如其他受体紧密接近时或Ab结合通过多重结合而稳定时，例如在Ab-(CD20)₂或CD20-Ab-C1q复合物中。m2具有最大比例的快速释放Ab，并且解离受竞争影响最大。由于多次相互作用形成更稳定的复合物可以通过以下观察得到证实：当孵育时间延长时，竞争对标记的mAb的释放具有更强的影响(图22C、D)。

嵌合可影响功能性质

在B-Ly1向OBZ的人源化过程中，在VH链中Kabat位置11引入亮氨酸向缬氨酸的突变。在OBZ序列中插入V11L突变导致其PCD能力缺失并扩大其肘角。为了评估该残基是否通常改变CD20mAb的MoA，我们将反向突变(L11V)分别引入到m1(IgG1-CD20-1)和m2(IgG1-CD20-2)的嵌合形式中。结合、ADCC和CDC在饱和浓度下相当(数据未显示)。令人惊奇的是，在用EL4-CD20细胞进行的PCD测定中(图6)，IgG1-CD20-1诱导PCD，在插入V11L突变后特性丧失。相反，对于IgG1-CD20-2，亲本或突变形式都不诱导PCD。这表明MoA可以在嵌合时改变，并且肘角确定区在其中起关键作用。

新的CD20mAb表现出体内抗肿瘤应答的变化

由于mIgG2c-CD20mAb在体外是最有效的，我们决定在我们实验室之前建立的短的低肿瘤负荷模型中研究它们的体内活性。²⁷在该模型中，CDC被证明是肿瘤细胞根除的主要效应机制。由于m1和m2在体外显示出最大的差异，我们首先使用这两种mAb来确定有效的Ab浓度(图7A)。观察到明显的浓度依赖性抗肿瘤反应，并且在1μg mAb下，用m1而不是m2实现肿瘤细胞的完全清除。测试剩余的mIgG2c mAb在1μg时的功效，我们显示m9和m10的表现与m1相当(图7B)。

讨论

为了治疗B细胞恶性肿瘤，以CD20为靶的RTX(chIgG1)、OFA(hIgG1)和OBZ(用于增强ADCC的糖基改造hIgG1Fc区)已被FDA批准。它们在体外诱导由ADCC和CDC(I型；RTX和OFA)或ADCC和PCD(II型；OBZ)介导的肿瘤细胞杀伤。很可能某些具有例如较少有益的FcγR多态性或不同类型的B细胞恶性肿瘤的患者组可能受益于用高度补体活性或诱导mAb的凋亡的治疗。为了开发更有效的CD20治疗性mAb，进一步理解指示CD20mAb的MoA的基本特征是重要的。生成类型特异性CD20mAb仍然是一个挑战，不仅是由于CD20分子本身的先天免疫原性低，而且由于缺乏对Ab特性与功能相关的理解。我们使用有效的内部开发的免疫方法培养新的CD20mAb，并纯化了11个mAb用于进一步表征。研究功能性质揭示了所有新的CD20mAb在诱导CDC而不是PCD时表现出I型特征。在我们的小组中，mIgG2b是最常见的同种型，接着是mIgG2c和mIgG3。这表明Ab更加成熟，因为mIgG2c和mIgG2b Ab在C57BL/6小鼠中重链(5'cμ-cδ-cγ3-cγ1-cγ2b-cγ2c-cε-cα 3')的类别转换顺序中进一步发展。²⁸可变区的多样性表明我们提高了亲和力成熟的CD20mAb。

为了研究我们的新mAb的MoA的潜在性质，我们基于Kabat位置11处的突变确定了表位、结合动力学和结构性质。对于该表位，发现CD20的较大环的C-末端部分与B1和OBZ结合相关，这表明该表位对于Ab II型特征是重要的。^18,29然而，OBZ和B1的表位的相似位置很可能是不完全的解释，因为OBZ的亲本Ab B-Ly1³⁰在人源化之前不显示完整的II型特征。³¹另外，II型mAb 11B8的表位不重叠，而是由位于小的和大的胞外环上的氨基酸组成，类似于7D8和OFA。11个我们mAb中的10个与RTX结合在同一区域。我们的数据表明残基S173与确定表位类型有关。在残基S173突变后，m1(线性表位)的结合被消除。相反，m2结合(构象表位)受到的影响较小。这种变化的识别导致结合行为的改变，并且深度分析表明它对mAb产生二次相互作用的能力有影响。最近提出的GA101中逆转了mAb II型特征的V11L突变也不是一种普遍的解释。序列比较证实，我们自己的I型CD20mAb以及B1和11B8，都在该位置携带亮氨酸。有趣的是，衍生自m1的嵌合的mAb表现出PCD能力。随后在Kabat 11号位置引入缬氨酸消除了所有的PCD活性。这表明涉及肘部铰链角，然而我们不能推断哪些残基是重要的，因为m1和m2的VH构架的氨基酸序列是相同的。可能涉及带有B1的Kabat位置11，因为在肘部铰链角附近，缺乏与N171的结合被认为是第二个要求¹²。

关于结合动力学，关于CD20mAb解离速率对CDC的贡献的先前发现是矛盾的。用非补体活化试剂减轻RTX的解离速率增加了其CDC活性。¹⁴此外，veltuzumab，一种人源化IgG1mAb，除了1个残基外，其CDR与RTX相同，显示出比RTX更慢的解离速率和更高的CDC活性。³²然而，RTX突变体在较慢的解离速率下没有诱导CDC增强。³³我们的一组mIgG2c-CD20mAb，其引发CDC的能力不同，在LigandTracer实验中测定的良好CDC和缓慢解离之间未发现相关性。通常，功能特征不能与观察到的相互作用动力学或亲和力和/或表位的差异明显相关。最近，表明hIgG1mAb的优异CDC活性归因于抗原结合后的Fc-Fc相互作用，这导致六聚体的形成，其最终促进C1q结合。³⁴在弱补体激活的Ab中引入增强Fc-相互作用的突变导致增强的CDC活性。³⁵

然而，我们的结合动力学分析揭示了不同的解离模式，并表明我们的CD20mAb结合其他分子的能力不同，导致Ab结合的稳定化；而大多数OFA和m10迅速形成稳定的相互作用，对于m1、m2和RTX，观察到更不均匀的模式。m2的释放明显受到自我竞争的影响。这些数据指出mAb的多位点结合，这在各组中是不同的。增加孵育时间时，释放更快的mAb的部分减少。这些发现提出了I型mAb对复合物形成的时间依赖性和类型及其对脂筏形成的影响以及最终对CDC诱导的影响的问题。

在体外，新的mIgG2c-CD20mAb可以分为强(m1和m9)、中(m10)和弱(m2)补体诱导物。在体内，m1、m9和m10表现相当，而m2效果较差。这表明在体外CDC试验中检测到的差异在使用的模型中不明显的。这可能是模型依赖效应，并且在体内模型使用其他时不同。控制CD20mAb功能特性的特征如图23所示。

实施例2

材料和方法

抗体

利妥昔单抗(RTX、嵌合(ch)IgG1)、奥法木单抗(OFA、人(h)IgG1)和曲妥珠单抗(TRA、人源化IgG1)获自UMC Utrecht的药房。

第7章描述了新嵌合IgG1mAb IgG1-CD20-1和IgG1-CD20-2的产生。IgG1-CD20-7、IgG1-CD20-9和IgG1-CD20-10由U-Protein(Utrecht)制造，它们在HEK293T细胞中生成mAb。将所有mAb透析至1×PBS(Sigma-Aldrich)，并使用下述公式确定浓度：

细胞系

Daudi细胞(ATCC)在含有RPMI-1640+HEPES+谷氨酰胺(Invitrogen)的RPMI培养基中在37℃/5％CO₂下培养，该培养基补充有10％胎牛血清(FCS)和100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(1xP/S；Life Technologies)。如前所述产生EL4-CD20细胞(23)，并在RPMI培养基中培养。

结合试验

将10⁵个Daudi细胞在96孔板中铺板，并与IgG1-CD20mAb(在PBS中)在冰上孵育45分钟。洗涤后，用山羊-F(ab')₂-抗-hIgG-RPE(Southern Biotech)检测结合的CD20mAb，随后在FACS Canto II(BD)上进行测量。

人PBMC ADCC

如前所述，进行用⁵¹Cr-标记的靶细胞的ADCC试验(22)。通过Ficoll分离(GEHealthcare；Sigma-Aldrich)从健康个体分离PBMC(MiniDonorDienst UMC Utrecht)。⁵¹Cr-标记的Daudi细胞与PBMC(效应物：靶标比＝50：1)和CD20mAb稀释混合。在37℃/5％CO₂下培养4h后，收集上清液并在液体闪烁计数器(MicroBeta；Perkin Elmer)中计数。使用下述公式计算裂解： RPMI培养基或补充有2.5％Triton X-100的培养基(Roche Diagnostics)中的具有效应细胞的Daudi细胞分别用于测定最小和最大释放。

CDC试验

10⁵Daudi细胞在96孔板中铺板并在室温下用稀释在RPMI培养基中的mAb预孵育30分钟。加入人血清(来自8名健康供体的混合物)作为补体来源(终浓度15.5％)，并将配制品在37℃/5％CO₂下保持15分钟。通过用7-AAD(BD Pharmingen)染色死亡细胞来评估补体介导的裂解程度。在FACS Canto II(BD)上测量细胞。

细胞生存力试验

将RPMI培养基中的4×10⁴EL4-CD20细胞与1μg/mL Ab一起在96孔板中铺板，并在37℃/5％CO₂下培养24小时。在交联条件下，在孵育开始30分钟后加入20μg/mL兔-F(ab')₂-抗-hIgG(Jackson ImmunoResearch)。按照制造商的说明，通过AnnexinV-PE和7-AAD(BDPharmingen)染色测定细胞活力。

B细胞耗竭试验

将来自健康供体的血液收集在水蛭素采血管中并储存在冰上直至使用。将mAb在RPMI-1640+HEPES+谷氨酰胺(Invitrogen)中稀释并加入未处理的血液。在37℃/5％CO₂下将板孵育60分钟后，将样品保存在冰上以用于所有进一步的步骤。通过加入小鼠-抗-hCD45-PO(Life Technologies)和小鼠-抗-hCD19-APC(Biolegend)，对白细胞和CD19⁺细胞染色30分钟。随后用补充有5mM EDTA pH8(Sigma-Aldrich)、7-AAD(BD Pharmingen)和Cyto/cal Multifluor Plus Violet流式细胞仪校准珠(Thermo Scientific)的1x BDPharm裂解裂解缓冲液(BD)裂解红细胞，随后在FACS Canto II(BD)上进行测量。

EL4-CD20淋巴瘤模型

C57BL/6小鼠购自Janvier(Le Genest Saint Isle，法国)。6只小鼠/组腹膜内(i.p.)注射5×10⁵细胞示踪紫(10μM、Invitrogen)标记的EL4-CD20细胞。16小时后，用10μgmAb或PBS(100μL)腹膜内注射处理小鼠。24小时后，用含有5mM EDTA的1×PBS进行腹膜灌洗。使用TruCount管(BD)测定剩余肿瘤细胞的量。所有实验都得到UMC Utrecht的动物伦理委员会的批准。

结果

从先前表征的mIgG CD20mAb组中，我们选择5个有希望的嵌合候选物。其中4个是mIgG2c mAb(m1、m2、m9和m10；参见实施例1)，其在体外表现出不同的功能模式。在mIgG2bmAb中，m7显示最高的补体依赖性细胞毒性。将可变区克隆到人IgG1恒定区和人kappa轻链(LC)表达载体中后，我们在HEK293F或HEK293T细胞中生产mAb。随后，对纯化的chIgG1mAb进行初步体外表征。

首先，我们测试了所有嵌合的mAb CD20mAb的抗原结合能力。它们特异性结合CD20阳性Daudi细胞(图8)。它们的结合模式与市售CD20mAb RTX(chIgG1)和OFA(hIgG1)相当。

接下来，我们在两种不同的试验中评估了它们根除肿瘤细胞的潜力。首先，在经典的铬释放ADCC试验中，通过将⁵¹Cr标记的Daudi细胞与mAb和PBMC(效应物：靶标比＝50：1)孵育来测量肿瘤细胞杀伤能力(图9A)。与它们的小鼠形式(实施例1)相比，嵌合IgG1-CD20mAb在它们的ADCC能力方面可以看到更明显的差异。1μg/mL mAb的最大裂解百分比介于38％(IgG1-CD20-1)和49％(IgG1-CD20-10)之间。尽管商业mAb RTX和OFA的最大裂解稍高，但在较低浓度下，IgG1-CD20-2、IgG1-CD20-9和IgG1-CD20-10表现优于RTX。

通过激活补体系统杀死肿瘤细胞是通常由IgG1-CD20mAb诱导的第二种效应机制。chIgG1-CD20mAb显示浓度依赖性肿瘤细胞裂解(图9B)。与RTX相比，所有mAb诱导更高水平的CDC。IgG1-CD20-2仍然是效力最差的。IgG1-CD20-1和IgG1-CD20-10表现相似，而IgG1-CD20-7在较低浓度下甚至优于OFA。

描述的由CD20mAb诱导的最后一种作用机制是通过程序性细胞死亡(PCD)导致的肿瘤细胞死亡。这种特性被所谓的II型CD20mAb如阿妥珠单抗(OBZ)(12)和B1(mIgG2aCD20mAb)(13)强烈诱导。RTX显示通过相同的半胱天冬酶-非依赖性途径杀死肿瘤细胞的程度较低(15)。亲代小鼠CD20mAb都不诱导同型聚集(作为细胞死亡诱导的标志)，也不诱导7-AAD和AnnexinV阳性的增加。如实施例1所述，IgG1-CD20-1诱导EL4-CD20细胞的PCD。这里，比较了完整的IgG1-CD20mAb组，然而，对于其它4个CD20mAb，嵌合不改变这些特征(图9C)。

最后，我们在自体全血测定中评估B细胞耗竭的程度。由于我们没有观察到在与任何浓度的mAb一起孵育时7AAD⁺CD19⁺B细胞的增加，我们只关注活的CD19⁺B细胞的数量(图10A)。我们检测到活CD19⁺B细胞的mAb浓度依赖性下降(图10B)。RTX作为最弱的CDC诱导剂表现最差。在新的IgG1-CD20mAb之间没有观察到明显的差异。

最后，使用先前建立的EL4-CD20低肿瘤负荷模型，我们在10μg mAb的完全饱和浓度下测定了我们的嵌合IgG1-CD20mAb的效力。没有检测到主要的差异，但是所有mAb都表现出体内肿瘤细胞杀伤的有效诱导(图11)。

讨论

从小鼠序列开始，人源化之前的一个重要步骤是测试嵌合mAb的治疗潜力。我们生成了5种新的嵌合IgG1-CD20mAb，它们都在体外和体内诱导了肿瘤细胞杀伤。然而，它们的ADCC和CDC活性的差异并未转化为体内更好的抗肿瘤应答。

OBZ，一种有效的ADCC和PCD诱导剂，在NHL异种移植模型中显示出比RTX更有效地延长SCID小鼠的存活率(12)。然而，尚未评估ADCC或PCD对疗效的个体贡献。

已经在全血B细胞耗竭测定中广泛研究了CD20mAb的潜力。通常，使用4小时至24小时的孵育时间(12,50,51)。结果表明，与RTX相比，OBZ在健康的自体血液以及患者供体血液中表现出优越且更快的B细胞杀伤。然而，在那些试验中，所有效应机制都可能起作用。我们将mAb与未加工的血液一起孵育1小时。这种设置有利于评估补体介导的而不是效应细胞介导的肿瘤细胞杀伤。CDC被快速诱导，而NK细胞介导的肿瘤细胞根除需要较长的孵育时间。这可能解释了用RTX(最弱的补体激活剂)获得的不良结果。新CD20mAb在B细胞耗竭试验中的效力与获得的CDC结果相关。除了供体可变性，我们检测到淋巴细胞门内CD19表达的降低，表明CD20mAb处理对CD19的影响。先前已经表明，RTX治疗诱导CD19“剃须现象”(shaving)或细胞吞噬作用，中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞介导的机制(9-11)。由于这似乎是一种非常快速的效果，我们目前正在研究确定自体环境中CD20mAb的B细胞耗竭潜力的替代策略。在此，CD24作为次级B细胞标记物将被研究。我们的发现证明了小鼠IgG mAb所显示的功能特征对于嵌合体不是预测性的(表2)。抗体GA101(阿妥珠单抗)不具有显著的补体活性，参见Herter et al(2013)Mol Cancer Ther.12(10):2031-42.doi:10.1158/1535-7163.MCT-12-1182。

实施例3

IgG1-CD20单克隆抗体(mAb)如利妥昔单抗、奥法木单抗和阿妥珠单抗在临床上用于治疗诊断为不同种类的B细胞恶性肿瘤的患者。对于IgG1-CD20mAb，已知各种作用机制有助于根除肿瘤细胞(56-61)：(a)由Fcγ受体(FcγR)对主要的天然杀伤细胞和单核细胞/巨噬细胞的结合介导的抗体依赖性细胞毒性和吞噬作用(ADCC/ADCP)；(b)通过结合C1q激活经典补体途径，导致通过CDC的肿瘤细胞裂解；(c)在直接结合CD20分子时诱导PCD。另外，表明用mAb处理可诱导适应性细胞免疫应答。Abès及其同事的研究结果表明，Fc介导的反应在肿瘤再激发后对免疫活性小鼠进行长期保护(62)。细胞毒性T细胞的诱导可以由树突细胞引发，树突细胞在Ab调节的靶细胞吞噬作用后交叉呈递肿瘤衍生肽(63，64)。这种长期抗肿瘤免疫还没有在患者中显示出来，但是可以解释为什么对于一些患者可以用CD20mAb实现持久的肿瘤消退。

IgG1-CD20mAb诱导抗肿瘤应答所需的效应细胞的参与依赖于与FcγR的相互作用。然而，FcγRIIa和FcγRIIIa内的单核苷酸多态性(SNP)与更好或更差的治疗结果相关(65-68)。此外，由于未知原因，并非所有患者都对IgG1-CD20mAb治疗有反应。还报道了在利妥昔单抗治疗后复发或产生耐药的患者(69-73)。因此，需要替代的治疗选择来克服这些限制。一种可能性是使用不同的Ab同种型，即IgA。在IgG之后，IgA是血液中第二最突出的抗体，并且是粘膜中的主要抗体。IgA的单体形式主要存在于血清中，而聚合的IgA在粘膜部位产生。两个Ab亚类IgA1和IgA2在其铰链区结构上不同，IgA1比IgA2多13个氨基酸。这可以改善远距离抗原的覆盖范围，但同时使其更易于被蛋白酶降解(36)。此外，IgA1mAb的铰链区携带几个O-连接糖基化位点，这些位点在IgA2mAb中是不存在的。IgA2以3种同种异型存在；IgA2(m1)与IgA1相比具有2个额外的N-连接糖基化位点，以及IgA2(m2)和IgA2(n)，具有3个额外的N-连接糖基化位点。与IgG相反，IgA是经典补体途径的弱激活剂，因为它不能结合C1q(37)。然而，已经表明IgA mAb通过凝集素途径激活补体系统，因为结合甘露聚糖的凝集素(MBL)的糖识别结构域(CRD)可以结合IgA(38)。

IgA通过与FcαRI(CD89)结合而加入免疫效应细胞，FcαRI在髓系细胞如嗜中性粒细胞、单核细胞、不同的巨噬细胞群和嗜酸性粒细胞上表达(39)。显示了在体外产生的树突细胞上的表达(23，24)，但仍然存在争议。中性粒细胞表达高水平的FcαRI，而巨噬细胞具有较低的表达(42)。在用靶向实体瘤靶的IgA mAb的ADCC试验中，已经显示中性粒细胞可有效根除肿瘤细胞(43-46)。相反，IgG1mAb不太能够参与该效应细胞群。显示单核细胞/巨噬细胞介导的肿瘤细胞杀伤在IgA和IgG mAb之间是相当的(44)。在激活FcγRIIIa后，巨噬细胞也表达抑制性FcγRIIb。已经表明FcγRIIb的存在降低了mAb的活性(47)。对于IgA，还没有描述抑制性受体。

在过去几年中，对靶向肿瘤相关抗原的IgA mAb的知识显著增加。现在克服了几年前面临的几个瓶颈，目前我们能够生产和纯化足够量的单体IgA mAb用于体外和体内测试。小鼠缺乏IgA受体，因此，现在人FcαRI转基因的产生允许体内测试(48)。Boross及其同事最终在免疫功能正常的肿瘤模型中显示了IgA mAb在治疗环境中的巨大潜力(44)。迄今为止研究的大多数IgA mAb靶向Her2或EGFR，在实体瘤上表达的抗原。仅一项研究已经注意到单体IgA-CD20mAb的潜力(49)。证实补体介导的肿瘤细胞杀伤依赖于经典途径的弱间接激活和替代途径的更显著的直接激活。利用FcαRI转基因小鼠的被动免疫策略，实现了用单体IgA2-CD20mAb对肿瘤发展的良好保护。然而，尚未进行IgA-CD20mAb的治疗性体内测试。此外，缺乏IgA1和IgA2mAb的直接比较，特别是它们的补体激活特性。因此，本研究的目的是产生不同亚类的几种IgA-CD20mAb并对它们进行表征。这里，我们描述了独特IgA1-和IgA2-CD20mAb的初步体外表征。选择先前产生的mIgG2c-CD20mAb m1和m2(实施例1)作为IgA1和IgA2变体产生。它们的初步体外表征显示了有希望的潜力。

材料和方法

抗体

在实验中使用以下抗体作为阳性或阴性对照：利妥昔单抗(RTX；Pharmacy UMCUtrecht)，抗hCD20-hIgA2(IgA2-RTX；InvivoGen)，抗hCD20-hIgA1(IgA1-RTX；InvivoGen)；IgA1-Her2和IgA2(m1)-Her2(自体生产)，奥法木单抗(OFA；Pharmacy UMC Utrecht)，B1(mIgG2a-CD20mAb，由英国南安普敦大学Mark Cragg友情提供)和曲妥单抗(TRA；PharmacyUMC Utrecht)。

细胞系

伯基特淋巴瘤细胞系Ramos和Raji(ATCC)在含有RPMI-1640+HEPES+谷氨酰胺(Invitrogen)的RPMI培养基中在37℃/5％CO₂下培养，该培养基补充有10％FCS和1xP/S。如前所述产生EL4-CD20细胞(23)，并在RPMI培养基中培养。

IgA-CD20mAb的制备

可变重链和轻链(HC和LC)序列(由ShineGene合成)侧接HindIII和NotI限制性位点。将可变区克隆到Lonza载体pEE14.4-kappaLC、pEE14.4-IgA1和pEE14.4-IgA2(m1)中。

如先前所述使用HEK FreeStyle^TM 293F细胞(Invitrogen)系统产生瞬时抗体(22)。简而言之，用在Opti-MEM(Life Technologies)中稀释的LC、HC和pAdVAntage^TM载体(Promega)DNA以及293fectin^TM转染试剂(Life Technologies)转染HEK293F细胞。4小时后，加入1x P/S(Gibco)。转染后4天收获上清液，过滤并4℃储存直至纯化。

使用plus系统(GE Healthcare)进行所有柱纯化步骤。用结合缓冲液(1xPBS；Sigma-Aldrich)以1：1稀释含有抗体的上清液，并使用5mL HiTrap KappaSelect柱(GE-Healthcare)纯化IgA mAb。用0.1M甘氨酸(pH 2.5)从柱上洗脱结合的蛋白。收集组分，用1M Tris(pH8.8)直接中和，并基于在Nanodrop上测量的A280吸收测定的蛋白浓度合并。使用HiPrep 26/60Sephacryl S-300高分辨率柱(GE Healthcare)对含蛋白的组分进行尺寸排阻色谱(SEC)。收集、合并含有单体IgA mAb的组分，并使用VivaSpin浓缩柱(100,000MWCO；Sartorius)进行浓缩。使用下述公式通过Nanodrop测定IgA mAb的终浓度：

IgG和IgA ELISA

将96孔板(NUNC Maxisorp)用在1×PBS(Sigma-Aldrich)中稀释的山羊抗HuKappa(Southern Biotech)在4℃下涂覆过夜。用1％BSA/0.05％Tween-PBS封闭并用0.05％Tween-PBS洗涤后，加入样品并在室温下孵育90分钟。样品和标准品在1％BSA/0.05％Tween-PBS中稀释。纯化的huIgA(Bethyl Lab)用作IgA mAb的标准。将洗过的板与在0.05％Tween-PBS中稀释的山羊抗人IgA-HRP(SouthernBiotech)作为第二抗体在室温下孵育1小时。用ABTS(Roche)检测结合的抗体，随后用Multiscan RC(Thermolab系统)在405nm处测量。

CD20结合试验

将10⁵个Ramos细胞在96孔板中铺板，并用稀释在1×PBS中的mAb在冰上孵育45分钟。充分洗涤后，通过将细胞与山羊-F(ab’)₂-抗人IgA-RPE(Jackson ImmunoResearch)在冰上孵育45分钟，检测结合的Ab。用1％多聚甲醛固定细胞，然后在FACS Canto II(BD)上测量它们。

CDC试验

将10⁵Daudi或Ramos细胞用在RPMI培养基中稀释的mAb在室温下调理30分钟。接下来，加入从8个供体合并的15.5％正常人血清(NHS)，并将混合物在37℃下孵育不同的时间跨度(15、60、240和360分钟)。用于封闭实验的血清在加入细胞之前，通过热灭活(在56℃下30分钟)、与10mM EGTA+2mM MgCl₂预孵育、或以mAb：C5＝5：1的摩尔比加入依库珠单抗(抗C5mAb)在室温下处理15分钟。用1xPBS洗涤细胞，并在室温下用7-AAD(BD Pharmingen)染色死细胞15分钟。在FACS Canto II(BD)上测量样品，并将补体依赖性肿瘤细胞裂解确定为7-AAD阳性细胞的百分比。

细胞死亡诱导试验

将0.4×10⁵个EL4-CD20细胞与1μg/mL mAb在37℃下孵育24小时。用孵育具有CD20mAb细胞后30分钟加入交联Ab(20μg/mL兔F(ab')₂-抗hIgG；50μg/mL兔F(ab')₂-抗-mIgG和20μg/mL山羊F(ab')₂-抗人血清IgA；Jackson)。收集样品，用膜联蛋白V结合缓冲液洗涤，并与AnnexinV-APC和7-AAD(均为BD Pharmingen)的混合物在室温下孵育15分钟。在FACSCanto II上测量细胞，并将程序性细胞死亡的程度确定为％AnnexinV⁺/7-AAD⁺+％AnnexinV⁺细胞。

B细胞耗竭试验

通过Histopaque-ficoll密度梯度从肝素采血管中收集的健康供体血液中分离所有白细胞，随后使用红细胞裂解缓冲液(155mM氯化铵，0.1mM EDTA和10mM碳酸氢钾，pH7.4)裂解残留的红细胞。将分离的白细胞与抗体稀释液在96孔板中以0.2×10⁶白细胞/孔的浓度混合，并在37℃/5％CO₂下孵育3小时。离心后除去上清液，用冰冷的PBS/0.1％BSA(FACS缓冲液)洗涤细胞，并用含有小鼠抗人CD19-APC(Biolegend)、小鼠抗人CD11b-PE(BDPharmingen)、小鼠抗人CD14-V500(BDPharmingen)、小鼠抗人CD56-Alexafluor488(克隆B159，BD Pharmingen)和小鼠抗人CD3-PerCP(Biolegend)的抗体混合物在冰上染色30分钟。洗涤后，将细胞重悬于含有Cyto/Cal Multifluor Plus Violet流式细胞仪校准珠(Thermo Scientific)的FACS缓冲液中，以及使用BD FACS Canto^TM II进行流式细胞术。

人PMN ADCC

如前所述进行⁵¹Cr-标记的靶细胞的ADCC试验。简而言之，通过Ficoll/Histopaque分离(GE Healthcare；Sigma-Aldrich)从健康个体(MiniDonorDienst UMC Utrecht)分离PMN。⁵¹Cr-标记的Daudi细胞与PMN(效应物：靶标比＝40：1)和CD20mAb稀释合并。在37℃/5％CO₂下孵育4h后，收集上清液并在液体闪烁计数器(MicroBeta；Perkin Elmer)中计数。使用下述公式计算裂解：在RPMI培养基中或在补充有2.5％Triton X-100(Roche Diagnostics)的培养基中，具有效应细胞的Daudi细胞分别用于测定最小和最大释放。

结果

抗体生产和纯化

我们通过转染HEK293F细胞产生IgA1和IgA2mAb。首先，在小规模试验转染中确定重链、轻链和pAdvantage DNA之间的最佳比例。对于所有mAb，我们发现1:2:1的比率导致最高产量(图12A)。随后通过线性放大方法产生新的mAb。通过两步纯化方案分离全长mAb，包括1)抗-kappa纯化(图12B)和2)尺寸排阻层析(SEC)(图12C)。而对于两个亚类的kappa纯化峰看起来相同，在SEC期间可以观察到不同的模式。在全长Ab旁边，IgA1样品含有更高水平的松散kappa轻链(图12C左侧)。相反，IgA2样品含有更多的Ab结合物(更短的保留时间；图12C右侧)。SEC后获得的全长mAb的产率在两个亚类之间是相当的。通过SDS-PAGE评估纯化的IgA mAb的纯度和完整性(未显示数据)。

功能表征

首先，我们评估抗体与表达CD20的Ramos细胞结合的能力(图13)。所有IgA2-CD20mAb的结合能力在相同范围内。然而，IgA1mAb与IgA2mAb相比具有更好的结合能力。

接下来，测试新合成的抗体的功能。被称为II型CD20mAb的IgG-CD20mAb的子集在与其靶标结合后诱导PCD。我们将我们的IgA mAb进行细胞死亡诱导试验。EL4-CD20肿瘤细胞用mAb孵育24小时导致新IgA-CD20mAb的PCD略微增加(图14)。对于IgA1，这比IgA2mAb略微更显著。

随后，我们比较了IgG1-CD20和IgA-CD20mAb诱导CDC的能力。在用IgG1-CD20mAb15分钟后已经观察到补体介导的Daudi细胞裂解，但是用IgA-CD20mAb没有观察到(图15A)。在用补体活性血清孵育60分钟后观察到IgA-CD20-1mAb的轻微CDC诱导，其随着更长的孵育时间而增加。出乎意料的是，表达较少CD20但比Daudi细胞更高水平的CD46和CD59的Ramos细胞更易受CDC的影响(图15B)。此外，IgA1-CD20补体介导的裂解延迟，但在240分钟后达到与IgA2-CD20mAb相当的水平。为了证实IgA-CD20-1诱导的裂解是由补体激活介导的，我们在不同补体抑制剂存在下进行了CDC试验(图15C)。当使用热灭活血清和用艾珠单抗(抗C5单抗)预处理的血清时，IgA-CD20-1mAb诱导的裂解被消除。为了确定IgA mAb是否参与可替换途径，我们使用EGTA+MgCl₂来抑制经典和凝集素途径。不仅IgG1诱导的裂解降低至背景水平，而且由IgA-CD20-1mAb诱导的裂解也降低至背景水平。

在确定新的IgA-CD20mAb在铬释放试验中诱导PMN介导的肿瘤细胞裂解的能力后，随后我们分析了IgA-CD20mAb消耗人B细胞的潜力。用mAb孵育来自健康供体的白细胞导致CD19⁺事件的浓度依赖性下降(图16A)。这种效果在RTX和IgA-CD20mAb之间是相当的。对于所有IgA-CD20mAb，CD19⁺事件的数量(图16B)稳定下降，并且在0.05μg/mL和0.5μg/mL mAb之间达到平台期。相比之下，RTX孵育时CD19⁺事件的数量在0.05μg/mL时达到最小值，但在更高浓度时再次增加。对于两种同种型，CD19^-事件的数量达到0.05μg/mL至0.5μg/mL之间的最佳值(图16C)。

讨论

目前，市场上所有靶向CD20的mAb都是IgG1同种型。对治疗的不同反应强调了开发替代疗法的需要。近年来，研究者已经研究了靶向特别是实体瘤靶如Her2和EGFR的IgA mAb的抗癌潜力(43-46，74)。这里，我们描述了IgA1-CD20mAb和IgA2(m1)-CD20mAb的比较，它们具有两个先前选择的小鼠mAb的独特可变结构域序列。亲代小鼠mAb m1和m2的功能特征在其补体介导的肿瘤细胞裂解能力、结合动力学和表位识别方面显示出不同的行为(实施例1)。

我们研究了Fab-和Fc-介导的机制，导致如对IgG1mAb所述的肿瘤细胞的根除。一些IgG1-CD20mAb(例如，阿妥珠单抗和B1)在与CD20结合时引发肿瘤细胞杀伤(Fab介导的作用)。我们观察到具有IgG1-CD20-1而不是IgG1-CD20-2的PCD。相反，IgA-CD20-1和IgA-CD20-2都诱导PCD，虽然水平较低，但表明IgA mAb的这种作用机制不依赖于表位。为了加强这种假设，需要将其PCD能力与IgG1不同并且靶向不同表位的其它已知抗体(例如，RTX和阿妥珠单抗)作为IgA变体进行比较。

IgG1诱导的CDC是一种有效的Fc介导的裂解肿瘤细胞的机制。IgG1-CD20mAb通过结合C1q激活经典补体途径。然而，IgA mAb不可能激活这种途径，因为它们缺乏Clq识别位点(37)。在文献中描述了从人血清分离的IgA Ab结合MBL(38)。这导致C3沉积，表明凝集素途径的参与。然而，Pascal及其同事表明IgA2-CD20mAb通过直接激活替代途径和间接参与经典途径裂解CD20⁺肿瘤细胞系的亚群(39)。根据我们自己的数据，我们证实CDC参与IgAmAb对肿瘤细胞的杀伤。然而，我们的结果排除了替代途径的激活。为了进一步剖析不同补体途径的贡献，必须用特异性抑制剂进行另外的实验。例如，C1q缺失的血清可用于阻断经典途径，因子B缺失的血清用于抑制替代途径，以及MASP-1或MASP-2特异性抑制剂用于阻断凝集素途径(75，76)。我们首次比较了两个彼此相邻的亚类，并且我们发现IgA2mAb在诱导CDC方面比IgA1mAb更快。这种差异可能是IgA1(2N-连接的聚糖)和IgA2(m1)(4N-连接的聚糖)的重链的不同糖基化模式的结果，导致IgA2更好地激活凝集素途径。

性质如靶抗原表达水平、膜结合补体调节蛋白的表达、表位和结合动力学已暗示影响IgG1介导的CDC。迄今为止，我们只能建立IgA mAb的表位作用，因为来源于mIgG的具有更好CDC活性的IgA-CD20-1mAb也比IgA-CD20-2mAb更好地激活补体。其他属性是否也很重要，需要进一步阐明。

已经表明，由PMN介导的通过表达FcαRI的效应细胞的ADCC比由单核细胞/巨噬细胞介导的更快。为了确定这些免疫效应细胞在IgA-CD20介导的B细胞耗竭中的作用，我们在缺乏补体来源的自体环境中耗竭CD19⁺B细胞。对于IgA-CD20mAb，mAb介导的CD19⁺细胞耗竭通常优于RTX，其中IgA1-CD20mAb表现最佳。然而，两种同种型均诱导CD19表达的缺失。这与先前公开的发现一致：来自用RTX孵育的健康供体的B细胞缺失它们的CD19表达而不经历细胞死亡(52)。对CD20也描述了同样的抗原调节，在小于45分钟内降低了75-90％(55)。CD19的缺失既不涉及脱落也不涉及内化。相反，以Fc-依赖性方式，特别是由嗜中性粒细胞和单核细胞介导的“剃须现象”/胞啃作用被描述为作用机制。我们推测，与IgG1mAb相比，IgAmAb更强地参与PMN，最终导致由胞啃作用引起的肿瘤细胞死亡(53，54)。

应仔细确定RTX的治疗剂量，因为在我们的体外B细胞耗竭试验中，显示过高的浓度会降低Ab效力。相反，用IgA-CD20mAb未观察到这种效应。尽管如此，由于CD20mAb调节B细胞标志物的表达，因此B细胞追踪可能代表了一种更好的方法来适当确定mAb介导的B细胞耗竭。

实施例4

IgA CD20抗体的表征。

人体使用IgA主要是在粘膜屏障上防御病原体。它通过直接机制或通过中性粒细胞激活杀死病原体。极低量的IgA可通过Fcα受体(FcαR)有效地触发中性粒细胞。重要的是，中性粒细胞是比NK细胞更有效的杀伤细胞，并且具有优异的组织穿透能力。因此，IgA似乎是肿瘤免疫疗法的有吸引力的抗体类。然而，难以开发临床IgA抗体。直到最近，由于小鼠缺乏FcαR的表达，因此没有用于IgA免疫疗法的良好体内模型系统。我们的研究小组开发了一种在中性粒细胞上表达人FcαR(CD89)的转基因小鼠。用这种小鼠模型，我们已经证明治疗性IgA抗体在几种体内模型中，长期和短期地在不同位置上，以及在免疫活性小鼠6中可以有效地防御小鼠肿瘤生长。使用独特的局部开发的免疫方法，我们获得了一宽组新的CD20抗体(所有IgG)。这些抗体中的两种具有临床潜力，在体外杀死肿瘤细胞比所有目前可用的临床CD20抗体更有效。现在已将两种抗体转化为具有人IgA Fc片段(+/-70％huIgA)的嵌合抗体，并且目前正在探索它们的功效(图17)。

CD20内化

在参考文献77-79中已经描述了在淋巴瘤治疗中用于治疗的某些抗体(例如，利妥昔单抗和奥法木单抗)经历来自B细胞表面的Fcγ受体IIb(FcγRIIb)介导的内化，这对基于抗体的治疗具有重要意义。

在靶细胞自身上的FcγR表达对于该Ab-CD2复合物内化是关键的。反式的免疫效应细胞Fc-FcγR相互作用用于耗竭靶细胞，特别是当抗原以高水平表达时。尽管之前已经证实了激活FcγR对于异种移植模型中利妥昔单抗功效的重要性，但是现在已知在某些类型的B细胞恶性肿瘤上表达的抑制性FcR、FcγR11b也在Ab-CD20复合物的内化中起作用。FcγR11b含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序，其募集特异性磷酸酶并通过激活FcγR起对抗信号传导的作用。FcγRIIb介导的利妥昔单抗从B细胞表面的内化显示限制效应细胞的结合，在恶性肿瘤如慢性淋巴细胞白血病和套细胞淋巴瘤中可能特别重要的作用，其表达高水平的FcγRIIb并显示对CD20mAb治疗的降低应答。

利用抗体m1、m2、m7、m9、m10的IgA抗体未观察到这种效应。这些抗体没有这种负面影响。确实，当从健康志愿者的血液中分离出B细胞时，CD20IgG抗体显示CD20靶分子减少40％至60％，而IgA抗体在B细胞的细胞表面保持在80％的水平(参见图25和26)，这表明与IgG抗体相比，IgA抗体对治疗的副作用减弱。

用于CD20内化的方法

通过Ficoll(GE Healthcare)密度梯度从健康供体分离PBMC、并使用MACS人B细胞分离试剂盒II(Milteny Biotec)用于B细胞分离。将5×10e4分离的B细胞接种在锥形96孔板中，并与1μg/mL AlexaFluor 488(AL488)标记的(分子探针)Ab在37℃/5％CO₂下孵育3小时。洗掉未结合的抗体以及用25μg/mL山羊抗AL488(Life Technologies)淬灭AL488信号。剩余CD20％计算为((MFI_未淬灭-MFI_淬灭)/MFI_未淬灭)×100。

实施例5

材料和方法

ADCC试验

如前所述进行⁵¹Cr-标记的靶细胞的ADCC试验(22,24)。简而言之，通过Ficoll/Histopaque分离(GE Healthcare)从健康个体(Minidonordienst UMC Utrecht)分离的PBMC和PMN与⁵¹Cr-标记的Daudi细胞(效应物：靶标比率＝100：1)和CD20mAb稀释合并。在37℃/5％CO₂下孵育4h后，收集上清液并在液体闪烁计数器(MicroBeta；Perkin Elmer)中计数。使用下述公式计算裂解：％裂解＝((样品计数-最小释放)/(最大释放-最小释放))×100。在培养基中或在补充有5％Triton X-100(Roche Diagnostics)的培养基中，具有效应细胞的Daudi细胞分别用于测定最小和最大释放。

EL4-CD20淋巴瘤模型

C57BL/6小鼠购自Janvier(法国)或来自我们的设备中饲养。将5×10⁵CellTraceViolet(10μM，Invitrogen)标记的EL4-CD20细胞腹腔内(i.p.)注射4-6只小鼠/组。16小时后，用mAb或PBS(100μL)经腹腔内注射处理小鼠，24小时后用含5mM EDTA的PBS进行腹膜灌洗，并用TruCount管(BD)测定剩余肿瘤细胞的量。所有实验均得到UMCUtrecht的动物伦理委员会的批准。

EL4-CD20淋巴瘤细胞上CD20的饱和

在进行前述EL-4淋巴瘤模型后，用PBS洗涤收集的肿瘤细胞两次，并用二级IgA或IgG-PE标记的抗体染色。如果在用二级抗染色之前，在细胞中加入离体的抗体(10μg/mL)后没有增加的信号存在，则表明CD20被抗CD20抗体饱和。通过比较PBS处理的小鼠与抗体处理的小鼠的EL4细胞上的CD20表达，测定CD20的“剃须现象”。

结果

功能表征：

图13和图14描述了抗体结合表达CD20的Ramos细胞的能力和抗体对PCD的功能。IgG1-CD20mAb和IgA-CD20mAb诱导CDC的能力如图15所示(也参见实施例3)。图27描述了新IgA-CD20mAb在铬释放试验中诱导PMN介导的肿瘤细胞裂解的能力。IgA1抗体确实具有相似的ADCC潜力，但是IgA1-CD20 UMAB007是最有效的(图27A)。对于IgA2抗体，所有抗体显示相似的有效性，但是IgA2-CD20 UMAB010具有最高的杀伤潜能(图27B)。接下来，我们分析了IgA-CD20mAb耗竭人B细胞的能力。来自健康供体的白细胞用mAb孵育导致CD19⁺事件的浓度依赖性下降(图16A)。RTX和IgA-CD20mAb之间的这种作用是相当的。对于所有IgA-CD20mAb，CD19⁺事件的数量(图16B)稳定下降，并且在0.05μg/mL至0.5μg/mL mAb之间达到平台期。相反，RTX孵育时CD19⁺事件的数量在0.05μg/mL达到最小值，但在较高浓度下再次增加5。对于两种同种型，CD19^-事件的数量达到0.05μg/mL至0.5μg/mL之间的最佳值(图16C)。在EL4-CD20淋巴瘤模型中研究了这些抗体的选择的体内功效(图28)。IgA2-CD20 UMAB002和IgA1-CD20 UMAB007与利妥昔单抗一样有效，这显示了IgA抗体在体内的潜力。最后，结果显示用利妥昔单抗治疗后可见CD20表达缺失(图28-A)，但是在用IgA抗体治疗后表达没有降低(图28-B-C)。接着测定样品中EL4-CD20细胞的CD20表达。显示在IgG处理后CD20表达缺失，但在体内IgA处理后则没有缺失(图29)。在该特定试验中，Umab 002和007似乎比Umab 001表现更好。IgA2似乎是umab 001和umab 002更好的同种型，而IgA1与umab 007组合更好。其中点表示3位数字的IgA1-CD20UMAB…是具有所示恒定区和5种特定鼠抗体之一的可变结构域的抗体。UMAB参考的最后一个数字表示具有相同数字的m抗体的可变结构域。

表1：新CD20mIgG抗体组。

表2

表3：CD20mAb的亲和力值。通过将OneToOne结合模型拟合至具有1小时的结合时间和3小时的解离时间的结合曲线来获得值。亲和力(K_D)由解离速率常数(k_off)与结合速率常数(k_on)之间的比率获得。

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Claims

1.一种抗体，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，所述可变结构域能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANpSEK”，并且当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，所述抗体具有增加的PCD功能。

2.一种能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20的胞外部分的抗体，所述抗体包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于，所述重链可变区包含具有序列SNSYGSTYWYFDV的CDR3区。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，所述CDR1、CDR2和CDR3区分别具有序列SYNLH、AIYPGNGDTSYNQKFKG和SNSYGSTYWYFDV。

4.根据权利要求1至3所述的抗体，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1的序列：

SEQ ID NO:1

QAYLQ QSGAE LVRPG ASVKM SCKAS GYTFT SYNLH WVKQT PRQGL EWIGA IYPGN GDTSYNQKFK GKATL TVDKS SSTAY MQLSR LTSED SAVYF CARSN SYGST YWYFD VWGTG TTVTV SS；

所述序列在除了构成所述CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸的位置之外的一个或多个位置处具有0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或它们的组合。

5.根据权利要求1至4所述的抗体，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2的序列：

SEQ ID NO:2

QIVLS QSPAV LFASP GEKVT MTCRA RSSVS YMDWY QQKPR SSPKP WIYAT SNLAS GVPARFSGSG SGTSY SLTIS RVEAE DAATY YCQQW TSNPP TFGSG TKLEI KRADA APTVS IFPPS S；

6.一种抗体，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgA1或IgA2恒定区和可变结构域，所述可变结构域能够结合在Ramos细胞上表达的人CD20上的表位“EPANpSEK”，并且当与具有相同同种型的恒定区的利妥昔单抗相比时，所述抗体具有增加的CDC和/或增加的ADCC功能，优选包含具有重链可变区和轻链可变区的可变结构域，其特征在于所述重链可变区包含具有序列SAYYGSNVWFFDV的CDR3区。

7.根据权利要求1至6所述的抗体，包含小鼠IgG2；人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA重链恒定区或它们的组合。

8.根据权利要求7所述的抗体，包含人IgG1、IgG2、IgA1或IgA2重链恒定区或它们的组合。

9.根据权利要求1至8所述的抗体，包含重链和轻链，其中，所述重链包含SEQ ID NO:1的序列和SEQ ID NO:3、4或5的序列，所述序列在除了构成所述CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸的位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或它们的组合。

10.根据权利要求1至9所述的抗体，其中，所述轻链包含SEQ ID NO:2的序列和SEQ IDNO:6的序列，所述序列在除了构成所述CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸的位置之外的一个或多个位置处具有0至15个氨基酸插入、缺失、取代、添加或它们的组合。

11.根据权利要求1至10所述的抗体，用于治疗个体的疾病。

12.根据权利要求1至11所述的抗体，用于治疗与过量B细胞、过度活化B细胞和/或功能异常B细胞相关的疾病。

13.根据权利要求1至12所述的抗体，用于治疗CD20阳性肿瘤如CD20阳性B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；B细胞慢性淋巴细胞白血病和黑素瘤。

14.一种用于治疗患有与过量B细胞、过度活化B细胞和/或功能异常B细胞相关的疾病的个体的方法，包括给予需要其的个体权利要求1至10中任一项所述的抗体。

15.一种用于治疗患有CD20阳性肿瘤如CD20阳性B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；B细胞慢性淋巴细胞白血病或黑素瘤的个体的方法，包括给予需要其的个体权利要求1至10中任一项所述的抗体。