CN114605531B

CN114605531B - 荧光微球标记的抗体及其应用

Info

Publication number: CN114605531B
Application number: CN202210366306.3A
Authority: CN
Inventors: 詹先发; 柳静
Original assignee: Beijing Key Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Key Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-04-08
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2042-04-08
Also published as: CN114605531A

Abstract

本发明涉及一种荧光微球标记的抗体及其应用。本发明提供了一种针对甲胎蛋白AFP的单克隆抗体及其荧光微球的试纸条或试剂盒，所述试纸条具有最低达到1ng/mL的检测下限，并且特异性也较好，可以实现用于AFP蛋白的检测，具有较好的应用前景。

Description

荧光微球标记的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的涉及生物检测领域，涉及一种荧光微球标记的抗体及其应用。

背景技术

荧光微球是指将荧光物质通过物理吸附法、自组装法、化学键合法、共聚法、包埋法等方法吸附或包埋到粒子内而形成的直径在纳米至微米级(0.01～10μm)范围内，受激发光源激发能发出荧光的固相球体。它是一种新型的功能性微球，具有比表面积大、吸附性强、凝集作用大和表面反应能力强等特性，并且具有稳定的形态结构和高效的发光效率，在许多领域尤其是生物医学领域有着重要的应用。

荧光微球作为一类特殊的功能微球，以其稳定的形态结构、窄的粒径分布、好的单分散性和高效的发光效率，吸引了国内外研究者广泛的关注，且在许多领域尤其是生物医学领域有很重要的应用。首先，荧光微球的载体多为有机或无机聚合物材料，可以根据载体及荧光物质的不同，将荧光微球分为三大类:①无机/有机荧光微球，其具体又可分为两种：1)以无机材料为载体，荧光物质为有机化合物，比如以硅胶为无机载体，结合异硫氰酸荧光素制造的荧光微球；2)以有机材料为载体，荧光物质为无机化合物。比如：以带有活性基团的聚合物微球为载体，与带有活性基团(如氨基酸、羧酸等)的无机荧光纳米晶体(半导体微晶或金属氧化物掺杂微晶)相结合。②无机/无机荧光微球，如以硅胶为载体，结合带有活性基团的无机荧光纳米晶体形成的荧光微球。③有机/有机荧光微球，如以带可自由基聚合官能团的荧光物质与带活性官能团(如-OH，-COOH)的丙烯酸类单体进行水相悬浮聚合，并用交联剂交联得到高光量子、高稳定性且生物相容的聚合物荧光微球。

荧光微球在生物样品检测中作为不同检测对象的固定化载体，通过物理吸附或共价结合方式使之与抗体或抗原结合，并通过凝集试验法可以检测体液中对应的抗原或抗体。这种方法因其简便、灵敏而在早期就得到了较为广泛的应用，而且不同荧光微球对应不同的捕获抗体，可以识别不同的抗原，从而能够实现多种待测抗原的定性及定量检测。研究表明将0.3μm的微球连接抗鼠免疫球蛋白后，可以用来检测p-glycoprotein，并且通过3D共焦荧光成像结果证明了量子点编码的微球在免疫标记中有巨大的应用空间。还有以聚苯乙烯羧基荧光微球为固相载体，将人免疫球蛋白(IgG)和猪血红蛋白(Hb)分别与微球偶联，检测抗体IgG和抗原Hb与荧光微球的偶联效率。另外的研究时通过合成了水溶性的CdTeQDs，通过反向微乳液法将其嵌入到纳米SiO₂中形成CdTe/SiO₂复合荧光微球，并在该微球表面连接上生物素标记的小鼠IgG，通过蛋白之间的相互作用可以与聚苯乙烯微球表面的荧光素FITC标记的抗生素蛋白进行识别，成功地应用到指示MG63骨肉瘤细胞的主要抗体，表明CdTe/SiO₂复合纳米微粒作为荧光探针应用到生物检测和荧光成像上是可行的。

甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，它属于白蛋白家族，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成。甲胎蛋白在胎儿血液循环中具有较高的浓度，出生后则下降，至生后2～3月甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中较难检出，故在成人血清中含量极低。甲胎蛋白具有很多重要的生理功能，包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、T淋巴细胞诱导凋亡等。甲胎蛋白与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中均可表现出较高浓度，可作为多种肿瘤的阳性检测指标。目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。目前针对甲胎蛋白检测的方法已经有很多，但是针对甲胎蛋白的荧光微球检测方法还没有多少，特别是针对甲胎蛋白的单克隆抗体研究也不够多，在技术上需要进一步的提高。

发明内容

本发明克服现有技术缺陷，提供一种针对甲胎蛋白AFP的单克隆抗体及其荧光微球的试纸条或试剂盒。

本发明一方面，提供一种特异性针对AFP的单克隆抗体6F3，其中所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示

EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSRYFAHWIKQRPGQGLEWIGPDADPEENLVLSHNARGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGNAQCFISWGLGTTLAVSS

轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示

DIVITQRPALMAASPGEKVTITCRIDVYHIIMGQWWYQQKSGISPKPWIYLDNEEGDGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCHAAICLIEHFGAGTKLELK。

在一些实施方案中，用于本发明的单克隆抗体包含重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO:1至少80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，用于本发明的第一种单克隆抗体包含轻链可变区序列，其具有与SEQ ID NO:2至少80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％相同的序列。

根据本发明的具体实施方式，所述抗体标记有荧光微球。

更进一步的，所述荧光微球的标记方法为，以5mL标记体系标记优化后的60μg/mg抗体/微球的免疫微球，具体方法：烧杯(用前铬酸浸泡3d，再用蒸馏水洗涤并浸泡1d，pH5.0的PB缓冲液润洗30min)中加入定量的PB缓冲液(pH 5.0)，加入荧光微球3mg，快速搅拌下加入相应标记量的抗体(稀释10倍并缓慢加入)，再缓慢加入10mg/mL EDC 19.2μL，保证最终体系体积为5mL。室温缓慢搅拌反应2h，再加入500μL 10％BSA封闭30min。8000r/min，4℃离心10min，弃上清，并以PB清洗，相同条件离心，重悬于500μL免疫微球复溶液中，4℃保存备用。

更进一步的，本发明还提供一种试纸条的制备方法，以XYZ3050点喷系统分别将免疫微球复溶液重悬后的荧光微球喷涂到结合垫上，喷涂量4μL/cm，得到结合垫，30℃真空干燥2h，干燥保存备用。用XYZ3050点喷系统分别在NC膜的适当位置喷涂AFP全抗原、羊抗鼠二抗形成检测线(T线)和质控线(C线)，30℃真空干燥1h，制成AFP NC膜，干燥环境保存。取结合垫和NC膜，于干燥环境中，依次按聚酯膜、样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫的顺序将各部分粘贴于试纸条PVC底板上，用切条机切成4mm宽的试纸条，组装卡壳，干燥保存。

在本发明的中，检测对象优选是人的样本；所述生物学样本为选自来自受试者的全血、血浆、血清、血细胞、腹水、淋巴液、唾液、痰液、汗液、尿液、粘液、间质液、组织活检和细胞中的一种或多种，优选全血、血清或血浆。

有益效果

本发明提供了一种针对甲胎蛋白AFP的单克隆抗体及其荧光微球的试纸条或试剂盒，所述试纸条具有最低达到1ng/mL的检测下限，并且特异性也较好，可以实现用于AFP蛋白的检测，具有较好的应用前景。

附图说明

图1间接ELISA法检测杂交瘤细胞的相对A450结果图

图2微球偶联前后在纯水中zeta电位结果图

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

实施例1甲胎蛋白AFP单克隆抗体的制备

以购买的甲胎蛋白AFP作为免疫原(货号:M101336T，WOLCAVIBIOTECH)。将100μgAFP蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化，经腹腔注射免疫BALB/c小鼠。以后每隔2周进行1次免疫，采用100μgAFP蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合、乳化后经腹腔注射免疫，共免疫4次。

提前制备正常BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞，进行细胞融合:末次免疫后3d取脾，同时眼部取血，离心分离血清备用。将小鼠脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0细胞按10：1比例混合于50mL离心管中，置于37℃水浴中，于1min内缓慢滴入1mL预热的PEG1500，静置5min，用无血清RPMI1640液终止作用，离心收集细胞。将细胞首先悬于含HAT的选择培养基中，接种于96孔培养板中，100μL/孔，接种密度为每孔2个细胞，10d后改用HT培养液，3周后改用普通RPMI1640培养液(含200mL/L胎牛血清)培养。

融合后13d，待融合细胞生长到培养孔的1/2时，取上清用间接ELISA法进行筛选。包被用抗原为AFP蛋白50ng/孔，融合细胞上清加100μL/孔，以Sp2/0细胞培养上清液作为阴性对照，阳性对照为商品化的甲胎蛋白单克隆抗体Anti-AFP(A4)(货号bsm-1622M，上海经科化学科技有限公司)，，二抗为1∶4000HRP山羊抗小鼠IgG，100μL/孔，经TMB底物显色后，酶标仪测定A450值。凡A450值大于阴性对照(Sp2/0细胞培养上清)2倍以上者，初步判定为阳性克隆，如图1所示，共有5株阳性克隆，分别是10号的2A4，16号的2D5，17号的6F3，19号的6G2，7H1。将5个阳性孔用有限稀释法进行4次亚克隆，建立稳定分泌AFP mAb的杂交瘤细胞株，至所有杂交瘤细胞上清液均呈阳性为建株标准，获得稳定的效果最好的2D5，6F3，7H1杂交瘤细胞株扩大培养后液氮冻存。

小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，12d后，经腹腔接种杂交瘤细胞(10⁷个/0.5mL)。待小鼠出现腹部肿胀、消瘦、呼吸急促、活动减少等体征时，开始收集腹水，2000r/min离心10min，通过辛酸-饱和硫氨沉淀和Protein-A亲和层析柱纯化腹水，获得纯化后的单克隆抗体2D5，6F3，7H1。纯化后的抗体分装保存于-70℃备用。

实施例2 6F3单克隆抗体的效价测定

将AFP蛋白进行ELISA包被，采用碳酸盐缓冲液将AFP稀释至1μg/mL，按每孔100μL加至96孔板，37℃包被4h。用PBST洗板1次，用含3％BSA的PBS于37℃封闭2h。以不同稀释比例的6F3单克隆抗体作为一抗(起始浓度为1mg/mL，从1∶10稀释比开始梯度稀释至1∶10000000)，每孔100μL，37℃孵育1h；用PBST清洗5次，加入100μL标有辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗鼠(Goatanti-Mouse，GAM)抗体作为二抗，37℃孵育30min；用PBST清洗5次，每孔加入100μLTMB显色液，37℃孵育15min；最后加入50μL终止液(2mol/L硫酸)，用酶标仪读取A450nm值。抗体的效价为判定为阳性时的抗体最大稀释比。实验样品孔以P/N值[(样品A450nm值-空白对照A450nm值)/(阴性对照A450nm值-空白对照A450nm值)]≥2时判定为阳性，阴性对照为无关抗体检测孔。结果如表1所示。

表1间接ELISA法测定6F3抗体效价

6F3抗体稀释倍数	6F3抗体效价(P/N)
		1∶100000	7.93±0.22
1∶1000000	4.27±0.13
		1∶10000000	1.80±0.06

从表1的结果可以看出，6F3抗体的效价达到了1∶1000000，表明6F3抗体的活性较好，可以用于后续实验。

实施例2 6F3单克隆抗体的特异性鉴定

将AFP蛋白、CEA蛋白、BSA蛋白煮沸变性后进行SDS-PAGE分离得到相应的抗原条带，然后电转到PVDF膜上，5％BSA封闭，4摄氏度过夜。使用TBST缓冲液在摇床上清洗3次，每次3min。再加入含有单克隆抗体的缓冲液，室温反应1h。使用TBST溶液清洗反应膜3次，每次3min。再加入1:500辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白，室温反应1h。取出反应膜用TBST溶液漂洗反应膜3次，每次3min，成像系统中成像后拍照鉴定，结果显示，6F3单克隆抗体只与AFP蛋白结合并显示条带，不与CEA蛋白、BSA蛋白结合，无条带。这表明本发明的6F3单克隆抗体具有较好的特异性。

实施例3 6F3单克隆抗体亲和力鉴定、亚型鉴定及序列分析

采用AffinitySensors公司生产的生物传感器IAsysPlus对单克隆抗体的亲和常数进行测定。羧甲基葡聚糖(carboxymethyldextran，CMD)预处理样品池，在样品池中加入不同浓度的AFP蛋白，5min后用乙醇胺封闭空余羧基3min。然后用1mol/L甲酸洗去游离及非特异结合之蛋白分子。将包被好AFP的样品池放入生物传感器，平衡10min，①基线(baseline):加入pH7.2，0.01mol/L PBS50μl，等待5min，作一平稳基线。②结合(asso-ciation):吸去PBS，加入45μlPBS和5μl单抗，待单抗结合至饱和时吸去单抗液。③解离(dissociation):换50μlPBS，待单抗结合与解离达到平衡。④再生(regeneration):换20mmol/LHCl50μl作用2min以完全洗脱结合的单抗。⑤回复基线:换PBS，再次回到基线，即可开始下1个循环。将每种单抗用PBS稀释为5个不同浓度，依次分别测定各浓度单抗与包被抗原结合、解离速率，并通过随机附送之专用软件FASTfit计算各株单抗的亲和常数。结果如表2所示。

抗体名称	亲和常数(nM)
		6F3单克隆抗体	6.73±0.11

从表2的结果可以看出，6F3单克隆抗体具有较好的亲和能力，结合能力较好。

用小鼠抗体亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类。ELISA板包被抗原，50ul/孔，置4℃过夜。弃上清，加封闭液200ul/孔，置于37℃孵育1小时。洗涤液洗3次，将1B4或5C5单抗分别加到9个不同孔中，50ul/孔，设复孔。将阳性对照加到第10孔中，置37℃孵育l小时。移去液体，洗涤液洗3次。将正常兔血清加到第1个孔中，兔抗小鼠免疫球蛋白类或亚类的特异性抗体分别加到2-9孔中，阳性对照孔加入兔抗小鼠IgGl抗体，50ul/孔，37℃孵育1小时。移去液体，洗涤液洗3次。加入HRP-羊抗兔lgG抗体，50ul/孔，37℃孵育l小时。移去液体，洗涤液洗3次。加入TMB显色液，50ul/孔。室温显色5min，加入100ul终止液终止反应，于450nm处测OD值，记录并判定结果。结果显示，6F3单克隆抗体是IgG1亚型，轻链是κ链。

采用试剂盒提取杂交瘤细胞的总RNA，逆转录合成cDNA。设计引物，扩增重链和轻链，测序，测序结果用软件进行分析，经过序列鉴定，获得了单克隆的轻重链序列，其重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示

轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示

实施例4 6F3单克隆抗体荧光微球免疫层析试纸条的制备

以5mL标记体系标记优化后的60μg/mg(抗体/微球)的免疫微球，具体方法：烧杯(用前铬酸浸泡3d，再用蒸馏水洗涤并浸泡1d，pH 5.0的PB缓冲液润洗30min)中加入定量的PB缓冲液(pH 5.0)，加入荧光微球3mg，快速搅拌下加入相应标记量的抗体(稀释10倍并缓慢加入)，再缓慢加入10mg/mL EDC 19.2μL，保证最终体系体积为5mL。室温缓慢搅拌反应2h，再加入500μL 10％BSA封闭30min。8000r/min，4℃离心10min，弃上清，并以PB清洗，相同条件离心，即制备获得6F3单克隆抗体荧光微球，将所述微球可以重悬于500μL免疫微球复溶液中，4℃保存备用。

另分别取荧光微球和免疫荧光微球，多次清洗，超纯水重悬，以超细微粒粒度分析仪分别测定不同微球粒度及zeta电位，以荧光分光光度计连续扫描各微球荧光光谱。

由图2可知，微球偶联前后在纯水中均带负电荷，zeta电位相对时间均比较稳定；偶联前，微球平均粒径为229.5nm，颗粒多分散性指数为0.164。表明所用微球在溶液中性质稳定，颗粒规则、大小均匀。偶联后zeta电势有所下降，平均粒径有所增大(309.1nm)，表明由EDC介导的通过表面羧基的偶联方法成功，多分散性指数依然较小(0.264)，说明得到的免疫微球颗粒均一，适合作为免疫层析检测。

以XYZ3050点喷系统分别将免疫微球复溶液重悬后的荧光微球喷涂到结合垫上，喷涂量4μL/cm，得到结合垫，30℃真空干燥2h，干燥保存备用。

用XYZ3050点喷系统分别在NC膜的适当位置喷涂AFP全抗原、羊抗鼠二抗形成检测线(T线)和质控线(C线)，30℃真空干燥1h，制成AFP NC膜，干燥环境保存。

取结合垫和NC膜，于干燥环境中，依次按聚酯膜、样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫的顺序将各部分粘贴于试纸条PVC底板上，用切条机切成4mm宽的试纸条，组装卡壳，干燥保存。

将试纸条平放，滴加不同浓度的标准品样品(AFP标准品以用PBS将内容物完全复溶，调整终浓度为1000，100，50，10，5，1，0.1ng/mL)50μL于加样孔，10min后于手持式荧光读取仪中观察。若T线显色(有可见条带)则判读为阴性，样本中不含AFP或低于检测限；T线不显色(无可见条带)则判读为阳性，样本溶液中AFP浓度大于检测限。若C线不显色，则判定为试纸条无效，重复3次。结果如下表所示。

表3 6F3单克隆抗体荧光微球免疫层析试纸条检测范围

“+”表示判读阳性，“-”表示判读阴性。

由表3可知，本发明的试纸条有效检测限为1ng/mL，试纸条检测结果大于1ng/mL浓度范围内有效。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。

虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。

序列表

<110> 北京科跃中楷生物技术有限公司

<120> 荧光微球标记的抗体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Ala Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Phe Ala His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Pro Asp Ala Asp Pro Glu Glu Asn Leu Val Leu Ser His Asn Ala

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Asn Ala Gln Cys Phe Ile Ser Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Ile Thr Gln Arg Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Asp Val Tyr His Ile Ile Met

20 25 30

Gly Gln Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Leu Asp Asn Glu Glu Gly Asp Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Ala Ala Ile Cys Leu Ile

85 90 95

Glu His Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

Claims

1.一种荧光微球标记的甲胎蛋白AFP的单克隆抗体6F3，其中所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示；荧光微球标记的方法是将抗体和微球按照60μg：1mg的比例在PB缓冲液搅拌混匀，再缓慢加入10mg/mL EDC，室温缓慢搅拌反应2h，再加入10％BSA封闭30min，离心后用PB清洗，离心即制备获得荧光微球标记的甲胎蛋白AFP的单克隆抗体6F3。

2.一种AFP检测试纸条，其特征在于在结合垫上喷涂有权利要求1所述的荧光微球标记的甲胎蛋白AFP的单克隆抗体6F3。

3.如权利要求2所述的检测试纸条，其特征在于：所述喷涂是以XYZ3050点喷系统将荧光微球喷涂到结合垫上，喷涂量4μL/cm，得到结合垫，30℃真空干燥2h。

4.一种AFP检测试剂盒，其特征在于含有权利要求2或3所述的检测试纸条。

5.权利要求2或3所述的检测试纸条在用于制备AFP检测的试剂盒中的用途。

6.甲胎蛋白AFP的单克隆抗体6F3在用于制备AFP检测的试剂盒中的用途，其中所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。