JPH01318962A - α―ハロアセトアミドの免疫定量法 - Google Patents
α―ハロアセトアミドの免疫定量法Info
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明はｆｌ［の免疫化学的定量法に関する。さらに詳
しくは本明細書の方法は、α−ハロアセトアミド検出の
ｔめの酵素結合免疫吸着定量法（ｒ ＥＬＩＳＡ Ｊ
）に関する。
しくは本明細書の方法は、α−ハロアセトアミド検出の
ｔめの酵素結合免疫吸着定量法（ｒ ＥＬＩＳＡ Ｊ
）に関する。
免疫定量法は急速に、農薬残基の分析用の重要な技術と
なってきている。本発明において「最薬」とは、農作物
に対し害を与える雑草や害虫を防止するために使用する
化学物質を言う。
なってきている。本発明において「最薬」とは、農作物
に対し害を与える雑草や害虫を防止するために使用する
化学物質を言う。
腸薬やアナライト（被分析物）を検出するのに今日使用
されている基本的な免疫定量法としては、「サンドイツ
チ法」、「標識アナライト法」、及び「第２抗体法」（
例えば酵素結合免疫吸着定量法（「ＥＬＩＳＡ」）など
がある。標識アナライト法の一変法として、酵素増幅免
疫測定法（ｒｇｖｘｒＪ）がある。これらの方法は後に
詳細に説明する。
されている基本的な免疫定量法としては、「サンドイツ
チ法」、「標識アナライト法」、及び「第２抗体法」（
例えば酵素結合免疫吸着定量法（「ＥＬＩＳＡ」）など
がある。標識アナライト法の一変法として、酵素増幅免
疫測定法（ｒｇｖｘｒＪ）がある。これらの方法は後に
詳細に説明する。
免疫定量法においては、抗体により特異性と達成できる
最大検出感度が決まるという点において、抗体が最も重
安な試薬である。抗体は哺乳類の免疫防御システムの一
部として産生される免疫グロブリン蛋白分子である。免
疫定着法におｈて最も頻繁に使用される抗体蛋白である
がンマーグロプリン（Ｉｇ（） ）は、分子倹約１６０
．０００であり、−分子あｆｃ！９２つの可変結合領域
と、各動物種に特徴的な一定のアミノ酸配列を有する非
結合領域よりなる。この蛋白は普通哺乳類の血液やリン
パ系中に存在し、血液試料から凝固又は遠心分離により
血球を除去することにより得られる。こうして得られる
調製液は血清であり、目的の抗体を含有する場合はしば
しば「抗血清」又は「免疫血清」と呼ばれる。抗血清は
多種類の抗体が集合したものであり、一部は目的のアナ
ライトに対する抗体であるが、多くは動物が接触した他
の異物に対するものである。こういう不均一性がある之
め抗血清はま九しばしばポリクローナル抗体と呼ばれる
。
最大検出感度が決まるという点において、抗体が最も重
安な試薬である。抗体は哺乳類の免疫防御システムの一
部として産生される免疫グロブリン蛋白分子である。免
疫定着法におｈて最も頻繁に使用される抗体蛋白である
がンマーグロプリン（Ｉｇ（） ）は、分子倹約１６０
．０００であり、−分子あｆｃ！９２つの可変結合領域
と、各動物種に特徴的な一定のアミノ酸配列を有する非
結合領域よりなる。この蛋白は普通哺乳類の血液やリン
パ系中に存在し、血液試料から凝固又は遠心分離により
血球を除去することにより得られる。こうして得られる
調製液は血清であり、目的の抗体を含有する場合はしば
しば「抗血清」又は「免疫血清」と呼ばれる。抗血清は
多種類の抗体が集合したものであり、一部は目的のアナ
ライトに対する抗体であるが、多くは動物が接触した他
の異物に対するものである。こういう不均一性がある之
め抗血清はま九しばしばポリクローナル抗体と呼ばれる
。
文献中の農薬の免疫定量法の１・１とんど全でで、（少
なくとも初期段階において）抗体源としてウサヤの抗血
清が用いられている。時間の経過とともに動物体内の抗
体集団は変化する九め、通常ある実験期間中は一回の採
血により得られた試料又は数回の採血に工り得られた試
料をプールしｔものが使用される。マウス、ヤギ、ウマ
などのウサヤ以外の動物の抗体も使用されるが、ウサヤ
は飼育したり採血しｔりすることが特に容易である。
なくとも初期段階において）抗体源としてウサヤの抗血
清が用いられている。時間の経過とともに動物体内の抗
体集団は変化する九め、通常ある実験期間中は一回の採
血により得られた試料又は数回の採血に工り得られた試
料をプールしｔものが使用される。マウス、ヤギ、ウマ
などのウサヤ以外の動物の抗体も使用されるが、ウサヤ
は飼育したり採血しｔりすることが特に容易である。
多くの研究者は希釈しただけの抗血清を測定に用いてい
るが、沈降法やアフィニティーカラム法で免疫グロブリ
ンを精製している研究者もいる。抗血清中に不要の抗体
が存在する九めに妨害反応がある場合には、精製抗体を
使用する利点が認識され、まな精製抗体の使用により感
度が上昇する場合もある。以下に記載するサンドイツチ
法で標識物質やトレーサー（微量物質）を抗体に共有結
合させる洗めには、まず抗体を精製することが必要であ
る。最新の方法を用いることにより、抗血清は免疫定靜
法に使用する前に緩衝液で１０００倍以上に希釈するこ
とが可能なことも多く、−回の血液試料から多くの測定
が可能である。
るが、沈降法やアフィニティーカラム法で免疫グロブリ
ンを精製している研究者もいる。抗血清中に不要の抗体
が存在する九めに妨害反応がある場合には、精製抗体を
使用する利点が認識され、まな精製抗体の使用により感
度が上昇する場合もある。以下に記載するサンドイツチ
法で標識物質やトレーサー（微量物質）を抗体に共有結
合させる洗めには、まず抗体を精製することが必要であ
る。最新の方法を用いることにより、抗血清は免疫定靜
法に使用する前に緩衝液で１０００倍以上に希釈するこ
とが可能なことも多く、−回の血液試料から多くの測定
が可能である。
モノクローナル抗体を使用している文献も現れている。
モノクローナル抗体は、ノ１イデリｒ−マ（融合細胞）
細胞株の培養液や、適当なノ・イブリドーマで免疫しｔ
マウス中に産生される腹水から得られる。ハイシリドー
マ細胞株は、ウサヤの場合と同様にして目的の抗体を産
生ずるようにあらかじめ誘導したマウスの膵臓細胞から
、手間のかかる方法で産生される。有用なモノクローナ
ル抗体を産生じ同定するためのこの方法は特殊な操作と
装置が必要なため、経験のある人間が実抱しなければな
らない。この方法は、目的の抗体が既に予備評価されて
おり、得られる・・イデリげ−マを使用する目的がはっ
きりしている場合に特に有効である。モノクローナル抗
体は、単一の均一な免疫グロブリンであり、非常に狭い
明瞭な特胃性を有しており、製造バッチ毎に変化するこ
ともなく、大検に得られるため有用である。このモノク
ローナル抗体の特徴は、診断キットの作成に特に有用で
ある。
細胞株の培養液や、適当なノ・イブリドーマで免疫しｔ
マウス中に産生される腹水から得られる。ハイシリドー
マ細胞株は、ウサヤの場合と同様にして目的の抗体を産
生ずるようにあらかじめ誘導したマウスの膵臓細胞から
、手間のかかる方法で産生される。有用なモノクローナ
ル抗体を産生じ同定するためのこの方法は特殊な操作と
装置が必要なため、経験のある人間が実抱しなければな
らない。この方法は、目的の抗体が既に予備評価されて
おり、得られる・・イデリげ−マを使用する目的がはっ
きりしている場合に特に有効である。モノクローナル抗
体は、単一の均一な免疫グロブリンであり、非常に狭い
明瞭な特胃性を有しており、製造バッチ毎に変化するこ
ともなく、大検に得られるため有用である。このモノク
ローナル抗体の特徴は、診断キットの作成に特に有用で
ある。
農薬は分子量が小さいｔめ、抗体の産生という点におい
て問題がある。高分子と異なり遊離の農薬自身は分子が
小さすぎて、産生された抗体と結合することはできても
、抗体産生を誘導することはできないため、低分子の農
薬は動物を免疫する前に担体蛋白に結合させておかなく
てはならない。
て問題がある。高分子と異なり遊離の農薬自身は分子が
小さすぎて、産生された抗体と結合することはできても
、抗体産生を誘導することはできないため、低分子の農
薬は動物を免疫する前に担体蛋白に結合させておかなく
てはならない。
この性質のため農薬は免疫学的用語で「ノ・ブテン」と
規定できる。農薬部分は担体に共有結合しておシ、普通
担体としてはウシ血清アルブミン（Ｂ８Ａ）、卵白アル
ブミン（ＯＡ）、ヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）、又は
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの蛋
白が用いられる。蛋白に結合しｔ後のハゲテンが遊離の
農薬と立体的及び電気的に類似している程度が、測定の
ｌＦＨ＆性と感度に影響する。担体蛋白として何を選択
するかは、測定の目的により民なり、ヒトの血清試料の
分析が目的の場合はＨ８Ａを使用するべきではない。
規定できる。農薬部分は担体に共有結合しておシ、普通
担体としてはウシ血清アルブミン（Ｂ８Ａ）、卵白アル
ブミン（ＯＡ）、ヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）、又は
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの蛋
白が用いられる。蛋白に結合しｔ後のハゲテンが遊離の
農薬と立体的及び電気的に類似している程度が、測定の
ｌＦＨ＆性と感度に影響する。担体蛋白として何を選択
するかは、測定の目的により民なり、ヒトの血清試料の
分析が目的の場合はＨ８Ａを使用するべきではない。
目的とする測定あ特異性を得るｔめには、注意深く方法
を考えてハプテン結合体を作成しなければならない。一
般的に、担体蛋白との結合に用いられた部分よりも、ハ
プテン中の結合点よりも遠い部分の方が抗体の特異性に
対する影響が強い。
を考えてハプテン結合体を作成しなければならない。一
般的に、担体蛋白との結合に用いられた部分よりも、ハ
プテン中の結合点よりも遠い部分の方が抗体の特異性に
対する影響が強い。
ハプテンと蛋白との結合ににほとんど全ての安定な共有
結合が使用できるが、通常はカルボジイミド試薬やその
他のカルボキシル基活性化試薬を用いて、蛋白のりジン
残基とのアミＰ結合形成を利用している。まｔ目的の農
薬の類似物又は代謝物で、結合を形成しやすい構造を有
するものは非常に有用である。さらにハプテンと担体と
の間にスペーサー分子（普通炭素原子２から６個位の長
さ）を挿入してもよい。各担体分子に結合するハプテン
の数を正確に決める場合もあるしく最もよい方法は放射
能標識ハゲテンを用いる方法であり、やや精度が劣るが
ＵＶ吸収法も使用できる）、ただ単に動物を免疫して結
合反応がうまくいっているかどうかをみる場合もある。
結合が使用できるが、通常はカルボジイミド試薬やその
他のカルボキシル基活性化試薬を用いて、蛋白のりジン
残基とのアミＰ結合形成を利用している。まｔ目的の農
薬の類似物又は代謝物で、結合を形成しやすい構造を有
するものは非常に有用である。さらにハプテンと担体と
の間にスペーサー分子（普通炭素原子２から６個位の長
さ）を挿入してもよい。各担体分子に結合するハプテン
の数を正確に決める場合もあるしく最もよい方法は放射
能標識ハゲテンを用いる方法であり、やや精度が劣るが
ＵＶ吸収法も使用できる）、ただ単に動物を免疫して結
合反応がうまくいっているかどうかをみる場合もある。
担体一分子当りの理想的なハプテンの数について一散し
た見解はないが、蛋白の分子量各５０００から２０．０
１］ ０ダルトンにつき１つのハプテンが最適であると
考える研究者が多い。このように結合体調製について一
定の規則はなく、いくつかの可能性のある方法を考え、
同時に実行するのが好ましい。結合体作成後に、ハプテ
ンではなく担体蛋白に対する抗体による反応を除去する
之め別のハプテン結合体が必要なこともあるｔめ、２つ
以上の担体を用りて結合体を作成することが好ましいこ
とが多い。まｔ同じハプテンの結合した異なる蛋白に対
して反応するということは、抗体が好ましい性質を有し
ているという予備的な証拠となる。さらに、アフィニテ
ィーカラムを用いて抗体を精製する場合も別の結合体が
有用である。
た見解はないが、蛋白の分子量各５０００から２０．０
１］ ０ダルトンにつき１つのハプテンが最適であると
考える研究者が多い。このように結合体調製について一
定の規則はなく、いくつかの可能性のある方法を考え、
同時に実行するのが好ましい。結合体作成後に、ハプテ
ンではなく担体蛋白に対する抗体による反応を除去する
之め別のハプテン結合体が必要なこともあるｔめ、２つ
以上の担体を用りて結合体を作成することが好ましいこ
とが多い。まｔ同じハプテンの結合した異なる蛋白に対
して反応するということは、抗体が好ましい性質を有し
ているという予備的な証拠となる。さらに、アフィニテ
ィーカラムを用いて抗体を精製する場合も別の結合体が
有用である。
動物の免疫には普通、まず体重１に９につきフロイント
完全アジュバント中約１■のハプテン結合体（「免疫原
」又は「抗原」）を皮下に数カ所投与すル。フロイント
完全アジュバントには加熱により死滅させｔ細菌が含ま
れており、動物の免疫反応を増強させる作用がある。以
後フロイント完全アジュバント中元々の免疫原の約２０
俤を用いて定期的に追加免疫する。一定期間の後（例え
ば各追加免疫の１０日後、最初の投与から数えて４−８
週後）に、動物から血液を採取する。
完全アジュバント中約１■のハプテン結合体（「免疫原
」又は「抗原」）を皮下に数カ所投与すル。フロイント
完全アジュバントには加熱により死滅させｔ細菌が含ま
れており、動物の免疫反応を増強させる作用がある。以
後フロイント完全アジュバント中元々の免疫原の約２０
俤を用いて定期的に追加免疫する。一定期間の後（例え
ば各追加免疫の１０日後、最初の投与から数えて４−８
週後）に、動物から血液を採取する。
測定法確立の方法の１つとして第２の抗体が文献に時々
登場する。後述するように多くの測定法ではアナライト
−抗体複合体を他の混合液から物理的に分離しなければ
ならない。その場合１つの有用な方法は最初（例えばウ
サザ）の免疫グロブリンの不変部分に対する、別の動物
種の第２抗体を用いることである。この工うな「第２抗
体」は、例えば「ヤヤ抗つサヤ」又はＧＡＲと呼ばれて
おり、免疫関連試薬の阪売会社から市販されている（こ
こにトレーサー分子が既に共有結合していることが多い
）。
登場する。後述するように多くの測定法ではアナライト
−抗体複合体を他の混合液から物理的に分離しなければ
ならない。その場合１つの有用な方法は最初（例えばウ
サザ）の免疫グロブリンの不変部分に対する、別の動物
種の第２抗体を用いることである。この工うな「第２抗
体」は、例えば「ヤヤ抗つサヤ」又はＧＡＲと呼ばれて
おり、免疫関連試薬の阪売会社から市販されている（こ
こにトレーサー分子が既に共有結合していることが多い
）。
動物から抗体を得た後は、これが目的の農薬の分析に応
用できるが否かを評価しなければならない。酵素が基質
に結合するように、免疫定量法では抗体が農薬に非共有
結合して複合体を形成することが最も重要である。免疫
定量法の他の工＠は全てこの複合体の形成の種度を検出
又は定量するために存在する。この目的に対して種々の
方法が′工夫されている。
用できるが否かを評価しなければならない。酵素が基質
に結合するように、免疫定量法では抗体が農薬に非共有
結合して複合体を形成することが最も重要である。免疫
定量法の他の工＠は全てこの複合体の形成の種度を検出
又は定量するために存在する。この目的に対して種々の
方法が′工夫されている。
１９８０年代の初期には固相免疫定量法が開発され、は
とんど全ての測定で他の方法にとって変わりつつある。
とんど全ての測定で他の方法にとって変わりつつある。
従って以後は固相法につめてのみ考察する。
固相法ハ、高い−でのポリスチレン又はラテックス表面
への蛋白−ハブテン結合体の吸着に依存している。この
非共有結合は、測定の間基本的に不可逆であり、免疫反
応に影響することなく選択されｔ蛋白を固定化するのに
役立つ。固相としては多くの形が存在するが、最も頻繁
に用いられてるのは、多くの会社から市販されている９
６穴のポリスチレン「マイクロタイター」プレートであ
る。各小穴の表面に目的の結合体を結合又は「被覆」シ
を後、残りの結合部位をゼラチンやＢＳＡのＬうな不活
性蛋白によりブロックする。プレートが変わると結合能
が変わるが、各プレートで９６穴が使用できることと自
動液分性装置がある九め、各プレートに標準物質を含め
ることが可能でありこの問題は解決される。次に固定し
友結合体を一連の試薬溶液に反応させ、これらの液を各
操作毎に捨てることにエリ、固定化されｔ蛋白に結合す
る分子を他の物質から分離できる。さらに名入に入る液
量は２００−３００μｍであるため反応液量を少なくす
るとともに単純化できる。このような改ａとマイクロタ
イタープレートの形の標準化に工り、プレート中の９６
穴を同時に処理する装置の製造が可能になった。このｔ
め各試料の身が１ｒＬｌ以下で数十検体の試料について
、例えば４重測定が可能になっ九〇 最近の免〜疫定惜法では、基本的に６種類の方法が用い
られるが、腸薬の分析にはそのうち２種類のみが適用で
きると考えられる。この３つの方法とは、「サンドイツ
チ法」、「標識アナライト法」及び「第２抗体法」であ
る。各方法に不可欠の操作は目的のアナライトの既知量
を用いて検量線を作成することである。「サンドイツチ
法」にはアナライトを認識する２種類の抗体が必要であ
る：この２つは実際には同じ蛋白であってもよく、−方
がトレーサー分子に結合している。サンドイツチ法の魅
力的な点は、測定完了後試料の穴の中に発現する信号は
、存在するアナライトの量に正比例することであり、蛋
白の競合的結合反応には依存しないことである。しかし
ながら分子の小さい農薬の場合には、２つの抗体分子が
同時に１つの農薬分子に結合することは立体的に難しく
、農薬の分析にサンげインチ法の適用は困難である。
への蛋白−ハブテン結合体の吸着に依存している。この
非共有結合は、測定の間基本的に不可逆であり、免疫反
応に影響することなく選択されｔ蛋白を固定化するのに
役立つ。固相としては多くの形が存在するが、最も頻繁
に用いられてるのは、多くの会社から市販されている９
６穴のポリスチレン「マイクロタイター」プレートであ
る。各小穴の表面に目的の結合体を結合又は「被覆」シ
を後、残りの結合部位をゼラチンやＢＳＡのＬうな不活
性蛋白によりブロックする。プレートが変わると結合能
が変わるが、各プレートで９６穴が使用できることと自
動液分性装置がある九め、各プレートに標準物質を含め
ることが可能でありこの問題は解決される。次に固定し
友結合体を一連の試薬溶液に反応させ、これらの液を各
操作毎に捨てることにエリ、固定化されｔ蛋白に結合す
る分子を他の物質から分離できる。さらに名入に入る液
量は２００−３００μｍであるため反応液量を少なくす
るとともに単純化できる。このような改ａとマイクロタ
イタープレートの形の標準化に工り、プレート中の９６
穴を同時に処理する装置の製造が可能になった。このｔ
め各試料の身が１ｒＬｌ以下で数十検体の試料について
、例えば４重測定が可能になっ九〇 最近の免〜疫定惜法では、基本的に６種類の方法が用い
られるが、腸薬の分析にはそのうち２種類のみが適用で
きると考えられる。この３つの方法とは、「サンドイツ
チ法」、「標識アナライト法」及び「第２抗体法」であ
る。各方法に不可欠の操作は目的のアナライトの既知量
を用いて検量線を作成することである。「サンドイツチ
法」にはアナライトを認識する２種類の抗体が必要であ
る：この２つは実際には同じ蛋白であってもよく、−方
がトレーサー分子に結合している。サンドイツチ法の魅
力的な点は、測定完了後試料の穴の中に発現する信号は
、存在するアナライトの量に正比例することであり、蛋
白の競合的結合反応には依存しないことである。しかし
ながら分子の小さい農薬の場合には、２つの抗体分子が
同時に１つの農薬分子に結合することは立体的に難しく
、農薬の分析にサンげインチ法の適用は困難である。
「標識アナライト法」は概念としては第２抗体法より簡
単であり、放射免疫定量法（ＲＩＡ ）ではとんどいつ
も使用される。ここでは典薬試料が、放射能標識されて
いるか又は酵素や螢光性トレーサーに共有結合している
必要がある。穴の表面〈結合し友一定数の抗体結合部位
に対して、標識農薬の一定の既知量と、未知試料中の遊
離の農薬を競合させる。（標識しｔもの及びしないもの
を含めて）結合しなかった＊薬を洗い売すと、穴の中に
残存する標識物の量は元々未知試料中に存在した農薬の
量に反比例する。標識アナライトと非標識アナライトが
同゛じ結合部位に対して競合し、目的の濃度範囲で実際
のアナライトの存在が標識物の結合を阻害するなら、原
理上標識アナライトと非標識アナライトは若干構造が異
なっていてもよい。ＰＣＢの場合は多くの類似構造が同
時に分析できることが目的のｔめこの方法が使用されて
きた。
単であり、放射免疫定量法（ＲＩＡ ）ではとんどいつ
も使用される。ここでは典薬試料が、放射能標識されて
いるか又は酵素や螢光性トレーサーに共有結合している
必要がある。穴の表面〈結合し友一定数の抗体結合部位
に対して、標識農薬の一定の既知量と、未知試料中の遊
離の農薬を競合させる。（標識しｔもの及びしないもの
を含めて）結合しなかった＊薬を洗い売すと、穴の中に
残存する標識物の量は元々未知試料中に存在した農薬の
量に反比例する。標識アナライトと非標識アナライトが
同゛じ結合部位に対して競合し、目的の濃度範囲で実際
のアナライトの存在が標識物の結合を阻害するなら、原
理上標識アナライトと非標識アナライトは若干構造が異
なっていてもよい。ＰＣＢの場合は多くの類似構造が同
時に分析できることが目的のｔめこの方法が使用されて
きた。
３種類の高も一般的な標識アナライトとしては、放射能
標識アナライト、アナライトに螢光物質又は酵素が共有
結合しｔものがある。
標識アナライト、アナライトに螢光物質又は酵素が共有
結合しｔものがある。
必要な第２抗体（酵素に共有結合したもの）が市販され
ているため、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩｓＡ ）
などの酵素免疫定量法（ＥＩＡ ）では、普通「第２抗
体法」が用いられる。この方法では、。
ているため、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩｓＡ ）
などの酵素免疫定量法（ＥＩＡ ）では、普通「第２抗
体法」が用いられる。この方法では、。
本来の免疫原として用いられた蛋白と喝なる蛋白と濃薬
との結合体が、穴の表面に被覆される（「被覆」又は「
スクリーニング」抗原と工ばれる）。
との結合体が、穴の表面に被覆される（「被覆」又は「
スクリーニング」抗原と工ばれる）。
次に限定量の抗体結合部位に対して、この被覆抗原中の
一定量のへブテン部分が、未知試料中の遊離の農薬分子
と競合する。液相中の抗体と農薬の反応により、同相の
被覆抗原即ちスクリーニング抗原に抗体が結合する反応
が阻害される。従って試験液中に高濃度の１１１薬が存
在する場合は、固相被覆抗原と反応する抗体の童が減少
し、逆に試験液中に存在する農薬の借が少ない場合は、
多量の抗体が固相被覆抗原に結合する。矢に固相に結合
し九抗体を、重版の標識第２抗体（農薬に特鴇的な重鎖
（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ）の定常部分に対する抗体
）を°用いて別の複合体を形成させることにより検出す
る。結合しなかった標識第２抗体を洗い流すと、各人に
残存している標識物の量は未知試料中の農薬の清に反比
例する。
一定量のへブテン部分が、未知試料中の遊離の農薬分子
と競合する。液相中の抗体と農薬の反応により、同相の
被覆抗原即ちスクリーニング抗原に抗体が結合する反応
が阻害される。従って試験液中に高濃度の１１１薬が存
在する場合は、固相被覆抗原と反応する抗体の童が減少
し、逆に試験液中に存在する農薬の借が少ない場合は、
多量の抗体が固相被覆抗原に結合する。矢に固相に結合
し九抗体を、重版の標識第２抗体（農薬に特鴇的な重鎖
（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ）の定常部分に対する抗体
）を°用いて別の複合体を形成させることにより検出す
る。結合しなかった標識第２抗体を洗い流すと、各人に
残存している標識物の量は未知試料中の農薬の清に反比
例する。
全ての免疫定量法で未知試料中の農薬の量は、最終的に
検量線と比較して求めなければならない。
検量線と比較して求めなければならない。
測定法のタイプは、ノ１ブテンに結合しｔ標識物、抗体
、又は第２抗体の性質により異なる。数年前まで放射免
疫定量法がもつとも頻繁に用いられており、今日でもま
だ広く使用されている。普通農薬の１４０−標識試料が
入手可能であるが、これらの化合物は比活性を高くする
ことが困難であり、ピコグラム又はナノグラム量の農薬
を正確に測定できない。農薬の免疫定量法の多くは競合
結合法であるため、測定の検出限界は未知試料と競合す
る標識物の情に依存し、従って放射能標識の比活性に依
存する。このｔめ高感度免疫定情法の開発にはトリチウ
ム又は１２５ ■を使用する必要がある。
、又は第２抗体の性質により異なる。数年前まで放射免
疫定量法がもつとも頻繁に用いられており、今日でもま
だ広く使用されている。普通農薬の１４０−標識試料が
入手可能であるが、これらの化合物は比活性を高くする
ことが困難であり、ピコグラム又はナノグラム量の農薬
を正確に測定できない。農薬の免疫定量法の多くは競合
結合法であるため、測定の検出限界は未知試料と競合す
る標識物の情に依存し、従って放射能標識の比活性に依
存する。このｔめ高感度免疫定情法の開発にはトリチウ
ム又は１２５ ■を使用する必要がある。
しかし多くの研究室で農薬の分析にあたって、この工う
な比活性の高い放射能標識物の合成、精製、使用及び廃
棄の問題が放射免疫定量法を使用するに際しての大きな
障害となっている。
な比活性の高い放射能標識物の合成、精製、使用及び廃
棄の問題が放射免疫定量法を使用するに際しての大きな
障害となっている。
免疫定量法において放射免疫定量法の代替法として魅力
的な方法は酵素標識成分の使用である。
的な方法は酵素標識成分の使用である。
測定の最終段階に存在する酵素の量の定量的測定は、（
酵素が容易に定量できる生成物に変換可能な）過剰前の
基質を添加することが基本になっている。この定めに無
色の基質に酵素を作用させて、着色しｔ生成物を得ると
いう方法がしばしば使用されてき友。この典型的な例と
しては、アルカリホスファターぜ／ｐ−ニトロフェニル
リン酸、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ１０−フ二二
レンジアミンの組合せがあるが、安定で定積の容易な生
成物の得られる速度の早い酵素／基質であれば、どのＬ
うなものでも使用可能である。上記の２つの酵素は活性
が高く、簡単な化学的方法で種々の「第２抗体」に共有
結合できる之め一般的に使用されている。螢光性フェノ
ール（例えばβ−ナフトール又は４−メチルウンベリフ
ェロン）とがラクトースとの結合体も、β−がラクトシ
ダーゼ標識物とともに使用され、酵素！１度に比例する
螢光信号が得られる。一般的に西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ又はアルカリホスファターゼにより得られる着色物
質は、試料が競合する信号を出していない限り、普通の
研究室の装置で測定できる便利さがある。舒外の試験キ
ットとしては、試料が反応を検出するのに複雑な装置は
不要であるというのは当然ながら好まし−ことである。
酵素が容易に定量できる生成物に変換可能な）過剰前の
基質を添加することが基本になっている。この定めに無
色の基質に酵素を作用させて、着色しｔ生成物を得ると
いう方法がしばしば使用されてき友。この典型的な例と
しては、アルカリホスファターぜ／ｐ−ニトロフェニル
リン酸、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ１０−フ二二
レンジアミンの組合せがあるが、安定で定積の容易な生
成物の得られる速度の早い酵素／基質であれば、どのＬ
うなものでも使用可能である。上記の２つの酵素は活性
が高く、簡単な化学的方法で種々の「第２抗体」に共有
結合できる之め一般的に使用されている。螢光性フェノ
ール（例えばβ−ナフトール又は４−メチルウンベリフ
ェロン）とがラクトースとの結合体も、β−がラクトシ
ダーゼ標識物とともに使用され、酵素！１度に比例する
螢光信号が得られる。一般的に西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ又はアルカリホスファターゼにより得られる着色物
質は、試料が競合する信号を出していない限り、普通の
研究室の装置で測定できる便利さがある。舒外の試験キ
ットとしては、試料が反応を検出するのに複雑な装置は
不要であるというのは当然ながら好まし−ことである。
ビオチン（ビタミンＨ）とアビジン（卵白工り得られる
ビオチン結合性蛋白）との強固な結合を用匹る、追加の
非共有結合段階を酵素標識物とともに使用する場合もあ
る。この場合は例えば、ビオチン標識第２抗体をアピジ
／酵素結合体と混合し、最終的な酵素信号をさらに増幅
している。しかし農薬の分析にこの方法は特に報告され
ていない。
ビオチン結合性蛋白）との強固な結合を用匹る、追加の
非共有結合段階を酵素標識物とともに使用する場合もあ
る。この場合は例えば、ビオチン標識第２抗体をアピジ
／酵素結合体と混合し、最終的な酵素信号をさらに増幅
している。しかし農薬の分析にこの方法は特に報告され
ていない。
時々使用される第３のタイプの標識物は螢光標識であり
、これは螢光性基質に作用する酵素標識物からは区別さ
れる。この場合、ノ１ブテン又は第２抗体は螢光性物質
（例えばフルオレセイン）に直接共有結合している。こ
の螢光標識物が放射能標識のように作用するが、最終的
な測定には励゛起と螢光段階があるという点で鴨なる。
、これは螢光性基質に作用する酵素標識物からは区別さ
れる。この場合、ノ１ブテン又は第２抗体は螢光性物質
（例えばフルオレセイン）に直接共有結合している。こ
の螢光標識物が放射能標識のように作用するが、最終的
な測定には励゛起と螢光段階があるという点で鴨なる。
妨害反応が問題になる時、螢光法では放射能を使用する
ことなく感度を上昇させパックグランドを低下させられ
る可能性がある。しかし螢光測定用の装置は、酵素標識
物を用いる比色法の場合のように一般的ではない。いく
つかの農薬について（主に専用のキット開発用に）発表
されている螢光法の１つの応用は、螢光偏光法である。
ことなく感度を上昇させパックグランドを低下させられ
る可能性がある。しかし螢光測定用の装置は、酵素標識
物を用いる比色法の場合のように一般的ではない。いく
つかの農薬について（主に専用のキット開発用に）発表
されている螢光法の１つの応用は、螢光偏光法である。
この方法では、側光励起光の螢光の光学的回転は抗体−
農薬複合体の形成量に相関する。しかしこの方法はあま
り広く用いられてはいない。
農薬複合体の形成量に相関する。しかしこの方法はあま
り広く用いられてはいない。
農薬の免疫定量法に対して魅力的な方法がもう１つある
。これは臨床診断への応用とめざしである会社に工り開
発された専用の方法である。この方法はＥＭ工Ｔ（酵素
増幅免疫定肴法）と呼ばれ、標識アナライト法の１つの
変法である。この方法では酵素の活性部位の近くでアナ
ライトが酵素に共有結合しており、アナライトが抗体と
結合することにエリ酵素反応を立体的に阻害する。この
ハプテン−酵素結合体を試料及び抗体と均一溶液中でイ
ンキユベートシ、基質を加えると結合していないハプテ
ン−酵素結合体のみが検出されるｔめ、結合部分と未結
合の部分を分離する必要がない。
。これは臨床診断への応用とめざしである会社に工り開
発された専用の方法である。この方法はＥＭ工Ｔ（酵素
増幅免疫定肴法）と呼ばれ、標識アナライト法の１つの
変法である。この方法では酵素の活性部位の近くでアナ
ライトが酵素に共有結合しており、アナライトが抗体と
結合することにエリ酵素反応を立体的に阻害する。この
ハプテン−酵素結合体を試料及び抗体と均一溶液中でイ
ンキユベートシ、基質を加えると結合していないハプテ
ン−酵素結合体のみが検出されるｔめ、結合部分と未結
合の部分を分離する必要がない。
従って抗体のハプテン−酵素結合体への阻害的結合を防
ぐのに遊離の農薬が必要なため、農薬を含む試料からの
み検出可能な酵素生成物が得られる。
ぐのに遊離の農薬が必要なため、農薬を含む試料からの
み検出可能な酵素生成物が得られる。
手間のかかる量に比較すると免疫定量法は極めて高感度
の方法である。多くの貴薬は免疫定量法では、精製や濃
縮をせずに少清の水、尿、血清、又は抽出試料が直接測
定さＫる。これは他の多くの機器分析法では最後の分析
段階の前に１何百−もの試料を抽出、分別、そして濃縮
しなければならないのとは極めて対照的である。直接的
な免疫定量法を用いた場合、農薬の免疫定量法について
報告されている典型的な検出限界は大体１１−１Ｏｎ／
ｄである。この感度はほとんどの農薬については充分す
ぎるものであり、この濃度は抽出や濃縮操作を適用する
ことによりさらに下げることも可能である。これらの方
法はおそらく実際の免疫定量性段階の前に多くのａ薬の
機器分析に使用されているであろうが、このｔめに多く
の時間を費やしていると思われる。
の方法である。多くの貴薬は免疫定量法では、精製や濃
縮をせずに少清の水、尿、血清、又は抽出試料が直接測
定さＫる。これは他の多くの機器分析法では最後の分析
段階の前に１何百−もの試料を抽出、分別、そして濃縮
しなければならないのとは極めて対照的である。直接的
な免疫定量法を用いた場合、農薬の免疫定量法について
報告されている典型的な検出限界は大体１１−１Ｏｎ／
ｄである。この感度はほとんどの農薬については充分す
ぎるものであり、この濃度は抽出や濃縮操作を適用する
ことによりさらに下げることも可能である。これらの方
法はおそらく実際の免疫定量性段階の前に多くのａ薬の
機器分析に使用されているであろうが、このｔめに多く
の時間を費やしていると思われる。
多くの免疫定量法の測定範囲は約２オーダー（例えば１
−１００ ｐｐＢ ）である。適当な濃度範囲以上の試
料を分析するときは、はとんどの結合部位は占有さｎて
おり余分量の農薬による信号は検出不可能である。多く
の場合、最適化されｔ免疫定量法はいくつかの農薬試料
を直接分析するのには感度が高すぎて、分析前に試料を
希釈するか、結合部位の総数を増加させて測定系の感度
を低下させるなど測定系を変更する必要がある。これら
の問題は競合結合法では当然起きることであり、この免
疫定量法に本質的である。試料中の農薬の濃度が故オー
ダーに渡って変化する場合には、最大の精度を得るため
の最適な測定法に分類するｔめに数回の免疫定量法を行
うという、層別法が有効である。免疫定量法は自動化が
容易であり、他の全ての操作が充分研究されているなら
ば、試料の量を２倍にしたり５倍にしたりしても測定系
にはそれほど負担にはならず、この層別法は容易である
。
−１００ ｐｐＢ ）である。適当な濃度範囲以上の試
料を分析するときは、はとんどの結合部位は占有さｎて
おり余分量の農薬による信号は検出不可能である。多く
の場合、最適化されｔ免疫定量法はいくつかの農薬試料
を直接分析するのには感度が高すぎて、分析前に試料を
希釈するか、結合部位の総数を増加させて測定系の感度
を低下させるなど測定系を変更する必要がある。これら
の問題は競合結合法では当然起きることであり、この免
疫定量法に本質的である。試料中の農薬の濃度が故オー
ダーに渡って変化する場合には、最大の精度を得るため
の最適な測定法に分類するｔめに数回の免疫定量法を行
うという、層別法が有効である。免疫定量法は自動化が
容易であり、他の全ての操作が充分研究されているなら
ば、試料の量を２倍にしたり５倍にしたりしても測定系
にはそれほど負担にはならず、この層別法は容易である
。
一般的に免疫定量法は目的のアナライトに対して非常に
選択性が高く、これが未精製の試料に対、して直接適用
できる基礎となっている。文献ではこの選択性は、交差
反応性という点で評価されている。この考え方は、妨害
の可能性のある一群の物質の既知槍に１９測定系に発現
される信号の強度を比較することである。この量は普通
的５０１の応答を与える目的のアナライトの着である。
選択性が高く、これが未精製の試料に対、して直接適用
できる基礎となっている。文献ではこの選択性は、交差
反応性という点で評価されている。この考え方は、妨害
の可能性のある一群の物質の既知槍に１９測定系に発現
される信号の強度を比較することである。この量は普通
的５０１の応答を与える目的のアナライトの着である。
目的のアナライトに比較して他の化合物にエリ得られる
信号の強度は、「チ交差反応性」として表現される。又
は測定系で５０％の応答を得るのに必要な各化合物の量
にエリ、同じ概念を表現することもある（ＩＣ５０と呼
ばれる）。類似物質による交差反応性の程度を予測する
ことは困雉である。光学的エナンショマー（鏡瞭体）が
存在する場合、免疫定量法はそのエナンチョマーを区別
することができる。他の重版の化合物が類似しているこ
とが免疫定量法の使用に対して重大な問題になることも
あるし、逆に他の類似物質の反応が有利な場合もある〔
例えば代榴物の分析や一群の類似化合物の分析の場合〕
。一般的に不要な交差反応物質を除去するのにアフィニ
ティーカラムにＬるポリクローナル抗体の精製が行われ
る。この方法の畿終的な方法は、完全に目的とする特異
性を有するＬうに選択されたモノクローナル抗体の使用
である。
信号の強度は、「チ交差反応性」として表現される。又
は測定系で５０％の応答を得るのに必要な各化合物の量
にエリ、同じ概念を表現することもある（ＩＣ５０と呼
ばれる）。類似物質による交差反応性の程度を予測する
ことは困雉である。光学的エナンショマー（鏡瞭体）が
存在する場合、免疫定量法はそのエナンチョマーを区別
することができる。他の重版の化合物が類似しているこ
とが免疫定量法の使用に対して重大な問題になることも
あるし、逆に他の類似物質の反応が有利な場合もある〔
例えば代榴物の分析や一群の類似化合物の分析の場合〕
。一般的に不要な交差反応物質を除去するのにアフィニ
ティーカラムにＬるポリクローナル抗体の精製が行われ
る。この方法の畿終的な方法は、完全に目的とする特異
性を有するＬうに選択されたモノクローナル抗体の使用
である。
農薬や環境汚染物質に対して多くの免疫定量法が文献に
報告されているが、血清中のパラチオン（ｐａｒａｔｈ
ｉｏｎ ）、パラオキソｙ （ｐａｒａｏｘｏｎ ）
、又ハハラコー） （ｐａｒａｑｕａｔ ）の免疫定量
法のみが現実に広く使用されているようである。これに
はいくつかの理由が考えられている。１つは試験さｎた
化合物の多くは免疫定量法が利用できるようになった時
期にあまり売れていなかったｔめ、天童に分析する必曽
がなかつｔこと。ま［ＤＤＴ、 ＰＣＢ 。
報告されているが、血清中のパラチオン（ｐａｒａｔｈ
ｉｏｎ ）、パラオキソｙ （ｐａｒａｏｘｏｎ ）
、又ハハラコー） （ｐａｒａｑｕａｔ ）の免疫定量
法のみが現実に広く使用されているようである。これに
はいくつかの理由が考えられている。１つは試験さｎた
化合物の多くは免疫定量法が利用できるようになった時
期にあまり売れていなかったｔめ、天童に分析する必曽
がなかつｔこと。ま［ＤＤＴ、 ＰＣＢ 。
ケトンなどの環境汚染物質は伝統的にがスクロマトグラ
フイーで測定されており、多くの化合物が一度で測定可
能であることである。この点において免疫定量法の選択
性は現実には短所となり、分析法の選択のための１つの
決定安因として考えるべきである。時間と試料の量とい
う点で免疫定量法は有利であり、測定の数が増えるほど
この長所が強調される。免疫定量法を使用できる程度に
まで開発するのに要する時間は、他の機器分析法を開発
する時間に比較すると明らに長い。ある免疫定量法が発
表されたとしても、それを別の研究室で使用可能な技術
に仕上げるにば多大の時間が必要である。さらに酵素（
ＥＬＪＳＡ ）や他の標識物の出現以前には、放射性同
位元素を使用しなければならないという点が免疫定量法
の有用性を制限していた。
フイーで測定されており、多くの化合物が一度で測定可
能であることである。この点において免疫定量法の選択
性は現実には短所となり、分析法の選択のための１つの
決定安因として考えるべきである。時間と試料の量とい
う点で免疫定量法は有利であり、測定の数が増えるほど
この長所が強調される。免疫定量法を使用できる程度に
まで開発するのに要する時間は、他の機器分析法を開発
する時間に比較すると明らに長い。ある免疫定量法が発
表されたとしても、それを別の研究室で使用可能な技術
に仕上げるにば多大の時間が必要である。さらに酵素（
ＥＬＪＳＡ ）や他の標識物の出現以前には、放射性同
位元素を使用しなければならないという点が免疫定量法
の有用性を制限していた。
免疫定量法により分析された農薬としては、アトラジン
（ａｔｒａｚｉｎｅ ）、りＯＱスルフロン（ｃｈｌｏ
ｒｏ−ａｕｌｆｕｒｏｎ ）、シアナジン（ｃｙａｎａ
ｚｉｎｅ ） Ｘ２ ＊ ４−Ｄ、％”りＱ ７オツグ
ーメチル（ｄｉｃｌｏｆｏｐ−ｍｅｔｈｙｌ）、ペンタ
クｏｏフェノ−ｋ （ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎ
ｏｌ ）、２．４．５−Ｔ及びテルデトリｙ （ｔｅｒ
ｂｕｔｒｙｎ ）などがある。われわれの知る限りにお
いてα−ノ・ロアセトアミド除草剤の免疫定量法は、本
発明以前には文献に報告されていない。まｔわれわれの
知る限りにおいては、α−ハロアセトアニリド（即ちア
ラク（２−Ａ／ （ａｌａｃｈｌｏｒ ）、メトラクロ
ール（ｍｅｔｏｌａｃｈｌｏｒ ）及びプロバクａ −
ル（ｐｒｏｐａ−ｃｈｌｏｒ ） ）は、殺菌剤メタラ
キシル（ｍｅｔａｌａｘｌ）を検出するための免疫定量
法において交差反応物質として１つの文献に現れている
。この系は、ダブりニー・エイチ・ニュウーサム（Ｗ、
Ｈ，Ｎｅｖｒｃｏｍａ）、ジャーナルオデアグリ力ルチ
ュラルアンドフッドケミストリー（Ｊ、 Ａｇｒｔ、
ｔｉ’ｏｏｄ Ｃｈｅｍ、） １９８５年、第３３巻、
５２８−５５０頁に記載されている。
（ａｔｒａｚｉｎｅ ）、りＯＱスルフロン（ｃｈｌｏ
ｒｏ−ａｕｌｆｕｒｏｎ ）、シアナジン（ｃｙａｎａ
ｚｉｎｅ ） Ｘ２ ＊ ４−Ｄ、％”りＱ ７オツグ
ーメチル（ｄｉｃｌｏｆｏｐ−ｍｅｔｈｙｌ）、ペンタ
クｏｏフェノ−ｋ （ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎ
ｏｌ ）、２．４．５−Ｔ及びテルデトリｙ （ｔｅｒ
ｂｕｔｒｙｎ ）などがある。われわれの知る限りにお
いてα−ノ・ロアセトアミド除草剤の免疫定量法は、本
発明以前には文献に報告されていない。まｔわれわれの
知る限りにおいては、α−ハロアセトアニリド（即ちア
ラク（２−Ａ／ （ａｌａｃｈｌｏｒ ）、メトラクロ
ール（ｍｅｔｏｌａｃｈｌｏｒ ）及びプロバクａ −
ル（ｐｒｏｐａ−ｃｈｌｏｒ ） ）は、殺菌剤メタラ
キシル（ｍｅｔａｌａｘｌ）を検出するための免疫定量
法において交差反応物質として１つの文献に現れている
。この系は、ダブりニー・エイチ・ニュウーサム（Ｗ、
Ｈ，Ｎｅｖｒｃｏｍａ）、ジャーナルオデアグリ力ルチ
ュラルアンドフッドケミストリー（Ｊ、 Ａｇｒｔ、
ｔｉ’ｏｏｄ Ｃｈｅｍ、） １９８５年、第３３巻、
５２８−５５０頁に記載されている。
従って本発明の目的は、α−ハロアセトアミげ、特にα
−りＱＱアセトアニリド（代表的な市販品としてはアラ
クロール（ａｌａｃｈｌｏｒ ） 、７ ’） Ｆ り
０−ル（ａｌｌｉｄｏｃｈｌｏｒ ）、アミドクロール
（ａｍｉｄｏ−ｃｈｌｏｒ ）、ブタクロール（ｂｕｔ
ａｃｈｌｏｒ ）、メタプラクロール（ｍｅｔａｚｏｌ
ａｃｈｌｏｒ ）、メトラクロール（ｍｅｔｏｌａｃｈ
ｌｏｒ ）、グレチラクロール（ｐｒｅｔｉｌａｃｈｌ
ｏｒ）及びグロパクロール（ｐｒｏρａｃｈｌｏｒ ）
がある）を検出するための新規抗血清中の新規抗体を作
成する定めの新規抗原を与えるＥＬＩＳＡ免疫定鎗法を
提供することである。
−りＱＱアセトアニリド（代表的な市販品としてはアラ
クロール（ａｌａｃｈｌｏｒ ） 、７ ’） Ｆ り
０−ル（ａｌｌｉｄｏｃｈｌｏｒ ）、アミドクロール
（ａｍｉｄｏ−ｃｈｌｏｒ ）、ブタクロール（ｂｕｔ
ａｃｈｌｏｒ ）、メタプラクロール（ｍｅｔａｚｏｌ
ａｃｈｌｏｒ ）、メトラクロール（ｍｅｔｏｌａｃｈ
ｌｏｒ ）、グレチラクロール（ｐｒｅｔｉｌａｃｈｌ
ｏｒ）及びグロパクロール（ｐｒｏρａｃｈｌｏｒ ）
がある）を検出するための新規抗血清中の新規抗体を作
成する定めの新規抗原を与えるＥＬＩＳＡ免疫定鎗法を
提供することである。
発明の要約
本発明の上記及び他の目的は、高分子担体に共有結合し
たα−八へアセトアミげハプテンエりなる抗原（ここで
は結合体と同義語として用いられる）を与え；宿主動物
（好ましくはウサヤ）を免疫し、ここで該ハゲテンに特
異的な抗体が作成され；宿主工り抗血清を抽出し、そこ
から抗体を得て、第２抗体阻害法（例えば西洋ワサげベ
ルオ卑シダーゼに結合したヤザ抗つサザがンマグａゾリ
ン）を用いる固相分析法で該ハプテンを検出するｔめに
使用し、標準的な比色検量線からハプテンの存在又は濃
度を測定することよりなる、抗原の１１ＬＩｓＡ免疫定
泄法系にエリ、達成されることが明らかになつｔｏ 蛋白の結合しｔ抗原を調製しそれに対する抗体を産生す
るのに有用なα−ハロアセトアミドは、以下の式を有す
るものである： （式中、Ｘはハロビンであり；Ｒ１とＲ２は独立に、ア
ルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキル
、ポリアルコキシアルキル、アシル又はアシルアミドメ
チルである８個以下の炭素原子を宵するラジカル；又は
１０個以下の炭素原子を有するアリール又はアリールア
ルキルラジカル；又は１０個以下の環原子（このうち１
−３個は窒素、酸素及び／又はイオウ原子でもよい）を
有する複素環又は複素環メチルラジカル；又は１つ以上
のアルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニ
ルで置換された、又は５個以下の炭素原子、ハｏｐン、
ニトロ基、又はシアノ基を有するアルコキシラジカルで
置換され友、上記のうち任意のラジカルである）。
たα−八へアセトアミげハプテンエりなる抗原（ここで
は結合体と同義語として用いられる）を与え；宿主動物
（好ましくはウサヤ）を免疫し、ここで該ハゲテンに特
異的な抗体が作成され；宿主工り抗血清を抽出し、そこ
から抗体を得て、第２抗体阻害法（例えば西洋ワサげベ
ルオ卑シダーゼに結合したヤザ抗つサザがンマグａゾリ
ン）を用いる固相分析法で該ハプテンを検出するｔめに
使用し、標準的な比色検量線からハプテンの存在又は濃
度を測定することよりなる、抗原の１１ＬＩｓＡ免疫定
泄法系にエリ、達成されることが明らかになつｔｏ 蛋白の結合しｔ抗原を調製しそれに対する抗体を産生す
るのに有用なα−ハロアセトアミドは、以下の式を有す
るものである： （式中、Ｘはハロビンであり；Ｒ１とＲ２は独立に、ア
ルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキル
、ポリアルコキシアルキル、アシル又はアシルアミドメ
チルである８個以下の炭素原子を宵するラジカル；又は
１０個以下の炭素原子を有するアリール又はアリールア
ルキルラジカル；又は１０個以下の環原子（このうち１
−３個は窒素、酸素及び／又はイオウ原子でもよい）を
有する複素環又は複素環メチルラジカル；又は１つ以上
のアルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニ
ルで置換された、又は５個以下の炭素原子、ハｏｐン、
ニトロ基、又はシアノ基を有するアルコキシラジカルで
置換され友、上記のうち任意のラジカルである）。
特に興味のあるα−クロａアセトアニＩＪ ）！は以下
の式を有するものである： （式中、ＡはＣ１−４の直鎖又は分岐鎖アル中レニルラ
ジカルで、ｎはゼロ又は１であり：Ｒ３Ｈ水素、Ｃｌ−
５アルキル又はハロアルキル；又ｔｒｉ Ｃ１−。
の式を有するものである： （式中、ＡはＣ１−４の直鎖又は分岐鎖アル中レニルラ
ジカルで、ｎはゼロ又は１であり：Ｒ３Ｈ水素、Ｃｌ−
５アルキル又はハロアルキル；又ｔｒｉ Ｃ１−。
アシル又はアジルア之ケ；又は１０個以下の環原子（こ
のうち１−５個は窒素、酸素及び／又はイオウ原子でも
工い）を有し、随時ＣＩ−，アルキル又はアルコキシラ
ジカルで置換された複素環又は複素環メチルラジカル；
又は−０Ｒ５ラジカル（ここでＲ５ｕ ＣＬ−、アルキ
ル、ハロアルキル、又はアルコキシアルキルラジカルで
ある）であＣ％Ｒ４はＲ５ラジカル、ＣＦ３、ＮＯ２又
は５個以下の炭素原子を有するアルコキシラジカルであ
り、ｍは０−５である）。
のうち１−５個は窒素、酸素及び／又はイオウ原子でも
工い）を有し、随時ＣＩ−，アルキル又はアルコキシラ
ジカルで置換された複素環又は複素環メチルラジカル；
又は−０Ｒ５ラジカル（ここでＲ５ｕ ＣＬ−、アルキ
ル、ハロアルキル、又はアルコキシアルキルラジカルで
ある）であＣ％Ｒ４はＲ５ラジカル、ＣＦ３、ＮＯ２又
は５個以下の炭素原子を有するアルコキシラジカルであ
り、ｍは０−５である）。
好ましい高分子担体はヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）、
卵白アルブミン（ＯＡ ） 、ウシ血清アルブミン（Ｂ
８Ａ ） 、ヒツジがンマ免疫グロブリン（ＩｇＧ）、
又社中−ホールリンペットへそシアニンなどの血清蛋白
である。試料中に存在する可能性のある担体蛋白は避け
なければならない（例えば卵白アルブミン結合体は卵白
の分析には適当な免疫原といえない）。
卵白アルブミン（ＯＡ ） 、ウシ血清アルブミン（Ｂ
８Ａ ） 、ヒツジがンマ免疫グロブリン（ＩｇＧ）、
又社中−ホールリンペットへそシアニンなどの血清蛋白
である。試料中に存在する可能性のある担体蛋白は避け
なければならない（例えば卵白アルブミン結合体は卵白
の分析には適当な免疫原といえない）。
担体蛋白にハプテンを共有結合させ結合体（抗原）を得
るのに好適な方法は、Ｎ−アセチルホモシスティンチオ
ラクトン（ＡＩ（’ｒ ）又はＳ−アセチルメルカプト
無水コハク酸（ＡＭｓＡ）などの化合物を用りて蛋白の
りジン残基上に導入されｔスルフヒ）、１１ ＩＪル基
を使用する方法である。ハプテンの蛋白への結合にスル
フヒげリル結合を使用することのＭ要な点は、チオール
基によりα−ハｏｆンが置換されて対応するチオイオエ
ーテルが得られることである。この結合により構造の関
連した化金物による、ハプテンに対する抗体の特性性が
上昇し、交差反応性が減小した。
るのに好適な方法は、Ｎ−アセチルホモシスティンチオ
ラクトン（ＡＩ（’ｒ ）又はＳ−アセチルメルカプト
無水コハク酸（ＡＭｓＡ）などの化合物を用りて蛋白の
りジン残基上に導入されｔスルフヒ）、１１ ＩＪル基
を使用する方法である。ハプテンの蛋白への結合にスル
フヒげリル結合を使用することのＭ要な点は、チオール
基によりα−ハｏｆンが置換されて対応するチオイオエ
ーテルが得られることである。この結合により構造の関
連した化金物による、ハプテンに対する抗体の特性性が
上昇し、交差反応性が減小した。
本発明の共有結合したハプテン−蛋白抗原は以下の式で
表される： （Ｉ Ｒ２−Ｎ−Ｃ−ＣＨ２−Ａ”Ｂ （式中、ＲとＲ１ｎα−ハロアセトアミドで規定しｔ物
と同じであり；Ａはチオール化剤の残基であり；ＢはＡ
に共有結合した血清蛋白である）。
表される： （Ｉ Ｒ２−Ｎ−Ｃ−ＣＨ２−Ａ”Ｂ （式中、ＲとＲ１ｎα−ハロアセトアミドで規定しｔ物
と同じであり；Ａはチオール化剤の残基であり；ＢはＡ
に共有結合した血清蛋白である）。
代表的かつ好ましい抗原構造は、上記式においてＢはＢ
ＳＡ又はＩｇＧであり、Ａは以下のチオール基の１つで
あるものである： さらに好ましいハプテ／−蛋白抗原は、上記式において
Ｒは−（Ａ）ｎ−Ｒ３ラジカルであすＲ１はフェニル又
ハ置換フェニルラジカルであるα−りａＯアセトアニリ
ドである。
ＳＡ又はＩｇＧであり、Ａは以下のチオール基の１つで
あるものである： さらに好ましいハプテ／−蛋白抗原は、上記式において
Ｒは−（Ａ）ｎ−Ｒ３ラジカルであすＲ１はフェニル又
ハ置換フェニルラジカルであるα−りａＯアセトアニリ
ドである。
特に好ましいハプテン−蛋白抗原は、上記式においてＢ
はＢＳＡ又はＩｇ（）であり、ＡはＡＨ’ｒ又はＡＭ８
Ａ由来のチオール残基であり、ハプテンは上記の市販の
α−クロロアセトアニリド除草剤であるものである。
はＢＳＡ又はＩｇ（）であり、ＡはＡＨ’ｒ又はＡＭ８
Ａ由来のチオール残基であり、ハプテンは上記の市販の
α−クロロアセトアニリド除草剤であるものである。
さらに好ましいへ１テ／−蛋白抗原は以下の実施例１で
図示しｔものである。
図示しｔものである。
本発明は別の点で、舒外のその場で試料中のα−八へア
セトアミドの存在及び量を測定するための免疫定量性診
断キットに関する。
セトアミドの存在及び量を測定するための免疫定量性診
断キットに関する。
発明の詳細な説明
本発明に工り与えられるα−ハΩアセトアミｒの免疫定
量性基は、α−クロロアセトアニリド、即ちアラクロー
ル（ａｌａｃｈｌｏｒ ） （α−クロロ−２’ 、
６’−ジエチル−Ｎ−メトキシメチルアセトアニリド）
（これはイネ科植物やいくつかの広葉樹植物の雑草に対
する主要な発芽前除草剤である）を参照して、実施例１
に例示する。測定に使用する全ての試薬は市販されてい
るか、又は公知の方法により得られる。
量性基は、α−クロロアセトアニリド、即ちアラクロー
ル（ａｌａｃｈｌｏｒ ） （α−クロロ−２’ 、
６’−ジエチル−Ｎ−メトキシメチルアセトアニリド）
（これはイネ科植物やいくつかの広葉樹植物の雑草に対
する主要な発芽前除草剤である）を参照して、実施例１
に例示する。測定に使用する全ての試薬は市販されてい
るか、又は公知の方法により得られる。
実施例１
結合体調製 ・・ブテン（１４ｃ標識アラクロール）１
ｋＢ８ＡとＩｇＧに共有結合させた。ＡＲＴとＡＭ８Ａ
を用いて蛋白のりジン残基に導入した８Ｈ基を、（アラ
クロールに関する）以下の式に従い、チオール部分にＬ
るハプテ／−塩素原子の置換に工りチオエステル結合を
形成させた（結合体の構造式は推定である）。
ｋＢ８ＡとＩｇＧに共有結合させた。ＡＲＴとＡＭ８Ａ
を用いて蛋白のりジン残基に導入した８Ｈ基を、（アラ
クロールに関する）以下の式に従い、チオール部分にＬ
るハプテ／−塩素原子の置換に工りチオエステル結合を
形成させた（結合体の構造式は推定である）。
ｎ １１
Ｉフクロ−ルー１ｇＣ）
蛋白（２００＃ｌ９Ｂ８Ａ又はＩｇＧ）と２５当量のＡ
Ｈ’Ｉ’又はＡＭ８Ａを、０℃で、水（６ｄ）に溶解さ
せた後、ジオキサン（Ｉ Ｉｌｌ ）に溶解したハプテ
ン（２５当量）をゆっくり添加した。次に炭酸緩衝液（
ＩＭ、ｐＨ１１）を添加して−を１１に調整して反応混
合液を０℃で１５分攪拌しｅ、２２−２５℃で２時間撹
拌した後、反応混合液を中和し、ハプテン−蛋白結合体
を、流水で２４時間透析するか又はセファデックスＧ−
２５’７”ル濾過クロマトグラフィー（２Ｘ５０ｃＷ１
カラムで０．２ＭのＮａＣ１を使用しｔ）にかけて精製
した。いずれの方法でも過剰のへブテンとチオール化剤
からハプテン−蛋白結合体を効率工〈分離できた。ノ・
ブチ／−蛋白結合体の放射能は液体シンチレーションカ
ウンターで計算Ｌｔｔ。ＢＳＡと工ｇＧの蛋白濃度は２
８０ｎｍのＵＶ吸収と分子吸光係数（ＢＳＡは３９ｍＭ
／（７）で、ＩｇＧは１８８ｍＭ／鐸である）から計算
しｔ０計算の結果ＢＳＡ １分子当り１２分子の７ラク
ロールとＩｇＧ１モル当り１９モルのアラクロールが蛋
白に結合してい九〇このＩｇ（）結合体をウサヤの免疫
に使用し、ＢＳＡ結合体を抗血清のスクリ−ニングに使
用しｔ０ハプテン−蛋白結合体は凍結乾燥して一２０℃
に保存しｔｏ 抗体／抗血清の作成 アラクロールのＩｇＧ結合体（０
，ｌｊのＰＢＳ中１９）をフロイント完全アジュバント
（は）中で乳化した後、雌のニュージーランドホワイト
ウサザの皮肉に注射した。フロイント完全アジュバント
中０．１から０．５Ｒ９の同じハゲテンを４−６週間間
隔で追加免疫しｔ０各追加免疫の１−２週後耳静脈から
全血（２５１！Ｊ？）を採取し、４℃で一晩凝固させ、
遠心分離して血清を得ｔ０血清を小バイアルに分注して
一２０℃に保存した。またアラクロール−ｒｇＧ結合体
は、モノクローナル抗体を得るのにも使用しｔ０ ゛ 免疫定量法 最初の追加免疫の後に血清について公
知の「チエッカ−が−ド測定法Ｊ （” ｃｈｅｃｋｅ
ｒ−ｂｏａｒｄ ａｓｓａｙ ” ）にエリアラクロー
ルに対する抗体の産生を調べた。炭酸緩衝液（０，０５
ｍＭ％ ｐＨ９−６） 中ｙ５りａ−ルー Ｂ８Ａ結合
体（５１２ｎｇｌｏ、１１１７ ）を同じ緩衝液で連続
希釈（１番から２番の順）した。９６穴のマイクロタイ
ターグレート（横に８列と縦に１２列）中の初めの１２
列に、スクリーニング抗原溶液を肌１ｍ（５１２ｎ、！
７１０．１ ａｊ ）ピペットで加え九。残りの７列に
はスクリー ニング抗原の連続希釈したものを加えた。
Ｈ’Ｉ’又はＡＭ８Ａを、０℃で、水（６ｄ）に溶解さ
せた後、ジオキサン（Ｉ Ｉｌｌ ）に溶解したハプテ
ン（２５当量）をゆっくり添加した。次に炭酸緩衝液（
ＩＭ、ｐＨ１１）を添加して−を１１に調整して反応混
合液を０℃で１５分攪拌しｅ、２２−２５℃で２時間撹
拌した後、反応混合液を中和し、ハプテン−蛋白結合体
を、流水で２４時間透析するか又はセファデックスＧ−
２５’７”ル濾過クロマトグラフィー（２Ｘ５０ｃＷ１
カラムで０．２ＭのＮａＣ１を使用しｔ）にかけて精製
した。いずれの方法でも過剰のへブテンとチオール化剤
からハプテン−蛋白結合体を効率工〈分離できた。ノ・
ブチ／−蛋白結合体の放射能は液体シンチレーションカ
ウンターで計算Ｌｔｔ。ＢＳＡと工ｇＧの蛋白濃度は２
８０ｎｍのＵＶ吸収と分子吸光係数（ＢＳＡは３９ｍＭ
／（７）で、ＩｇＧは１８８ｍＭ／鐸である）から計算
しｔ０計算の結果ＢＳＡ １分子当り１２分子の７ラク
ロールとＩｇＧ１モル当り１９モルのアラクロールが蛋
白に結合してい九〇このＩｇ（）結合体をウサヤの免疫
に使用し、ＢＳＡ結合体を抗血清のスクリ−ニングに使
用しｔ０ハプテン−蛋白結合体は凍結乾燥して一２０℃
に保存しｔｏ 抗体／抗血清の作成 アラクロールのＩｇＧ結合体（０
，ｌｊのＰＢＳ中１９）をフロイント完全アジュバント
（は）中で乳化した後、雌のニュージーランドホワイト
ウサザの皮肉に注射した。フロイント完全アジュバント
中０．１から０．５Ｒ９の同じハゲテンを４−６週間間
隔で追加免疫しｔ０各追加免疫の１−２週後耳静脈から
全血（２５１！Ｊ？）を採取し、４℃で一晩凝固させ、
遠心分離して血清を得ｔ０血清を小バイアルに分注して
一２０℃に保存した。またアラクロール−ｒｇＧ結合体
は、モノクローナル抗体を得るのにも使用しｔ０ ゛ 免疫定量法 最初の追加免疫の後に血清について公
知の「チエッカ−が−ド測定法Ｊ （” ｃｈｅｃｋｅ
ｒ−ｂｏａｒｄ ａｓｓａｙ ” ）にエリアラクロー
ルに対する抗体の産生を調べた。炭酸緩衝液（０，０５
ｍＭ％ ｐＨ９−６） 中ｙ５りａ−ルー Ｂ８Ａ結合
体（５１２ｎｇｌｏ、１１１７ ）を同じ緩衝液で連続
希釈（１番から２番の順）した。９６穴のマイクロタイ
ターグレート（横に８列と縦に１２列）中の初めの１２
列に、スクリーニング抗原溶液を肌１ｍ（５１２ｎ、！
７１０．１ ａｊ ）ピペットで加え九。残りの７列に
はスクリー ニング抗原の連続希釈したものを加えた。
プレートラパラフィルムでカバーして４℃に保存した。
翌朝、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，４の０．０１
Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭのＮａＣ！ｌ ； ＰＢ
Ｘ）で３回洗浄して名入の未結合スクリーニング抗原を
除去した。穴の残りの活性部位はＰＢＳ −１３％脱脂
粉乳溶液（ＮＦＤＭ、 ０．３Ｍ）で２２°Ｃで１時
間ゾロツクし友。−２０°Ｃで保存しておいた血清を！
１ＩｒＲに溶解し、ＰＢＳ −Ｔ （０，０２ｆｔツィ
ー７２０溶液を含有するＰＢＢ ）を用いて連続希釈（
１番から２番の順）した。最も濃度の高い溶液から初め
て、縦の第１列目の８個の穴に血清溶液の０・１Ｍをピ
ペットで加えｔ０残りの穴には、連続希釈した血清溶液
を加えた。プレートにカバーして２２℃で１．５時間イ
ンキュベートしｆｃｏ ＰＢＳ −Ｔで穴を３回洗浄し
ｔ後、西洋ワサビにルオキシダーゼに結合させｔヤヤ抗
つサヤがンマグロプリン（鴎−ＨＲＰ ） （新たに溶
解し、ｐｓｓ −１憾ＮＦ’ＤＭで４．（３３０倍に希
釈したもの）を０．１１加えた。最後にＰＢＳ−Ｔで洗
浄しｔ後（４回）、新ｔに溶解した〇−フェニレンシア
ξン（１）ＤＡ ） ａ質溶Ｈ（０，２ｄ、０．０５
Ｍクエン酸と０．１５Ｍリン醗ニナトリウム、ｐＨ５，
０中０．０４１９／ ｗｌ ｐＤＡと、０．０１憾Ｈ，
Ｏ，）を名入に加え、暗室で２２℃で５０−６０分イン
キュベートし友。名入に硫酸（４Ｎ、５０μｌ）を加え
て反応を停止させ、名入のｉ＆終吸光度（４９０ｎｍ
）を記碌した。血清中にスクリーニング抗原を認識する
抗体が存在する場合には、穴にスクリーニング抗原と血
清Ｓ度に依存する吸光度の勾配が現れた。
Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭのＮａＣ！ｌ ； ＰＢ
Ｘ）で３回洗浄して名入の未結合スクリーニング抗原を
除去した。穴の残りの活性部位はＰＢＳ −１３％脱脂
粉乳溶液（ＮＦＤＭ、 ０．３Ｍ）で２２°Ｃで１時
間ゾロツクし友。−２０°Ｃで保存しておいた血清を！
１ＩｒＲに溶解し、ＰＢＳ −Ｔ （０，０２ｆｔツィ
ー７２０溶液を含有するＰＢＢ ）を用いて連続希釈（
１番から２番の順）した。最も濃度の高い溶液から初め
て、縦の第１列目の８個の穴に血清溶液の０・１Ｍをピ
ペットで加えｔ０残りの穴には、連続希釈した血清溶液
を加えた。プレートにカバーして２２℃で１．５時間イ
ンキュベートしｆｃｏ ＰＢＳ −Ｔで穴を３回洗浄し
ｔ後、西洋ワサビにルオキシダーゼに結合させｔヤヤ抗
つサヤがンマグロプリン（鴎−ＨＲＰ ） （新たに溶
解し、ｐｓｓ −１憾ＮＦ’ＤＭで４．（３３０倍に希
釈したもの）を０．１１加えた。最後にＰＢＳ−Ｔで洗
浄しｔ後（４回）、新ｔに溶解した〇−フェニレンシア
ξン（１）ＤＡ ） ａ質溶Ｈ（０，２ｄ、０．０５
Ｍクエン酸と０．１５Ｍリン醗ニナトリウム、ｐＨ５，
０中０．０４１９／ ｗｌ ｐＤＡと、０．０１憾Ｈ，
Ｏ，）を名入に加え、暗室で２２℃で５０−６０分イン
キュベートし友。名入に硫酸（４Ｎ、５０μｌ）を加え
て反応を停止させ、名入のｉ＆終吸光度（４９０ｎｍ
）を記碌した。血清中にスクリーニング抗原を認識する
抗体が存在する場合には、穴にスクリーニング抗原と血
清Ｓ度に依存する吸光度の勾配が現れた。
このチエッカ−？−ト定量法により、抗血清中にアラク
ロール−Ｂ８Ａ結合体′ｔ−認識する抗体の存在が証明
され、以下の定量法で使用する、血清とスクリーニング
抗原１１１度の最も感度のよい組合せが求められた。こ
れＬアラクロールについては、スクリーニング抗原は５
ｎｇ／穴であり、７回目の採血後の血清については３，
５００倍希釈であった。スクリーニング抗原で被覆した
プレートを乾燥状態で一２０℃で保存し、４月間安定に
放置した。
ロール−Ｂ８Ａ結合体′ｔ−認識する抗体の存在が証明
され、以下の定量法で使用する、血清とスクリーニング
抗原１１１度の最も感度のよい組合せが求められた。こ
れＬアラクロールについては、スクリーニング抗原は５
ｎｇ／穴であり、７回目の採血後の血清については３，
５００倍希釈であった。スクリーニング抗原で被覆した
プレートを乾燥状態で一２０℃で保存し、４月間安定に
放置した。
阻害ＥｔＪＳＡ Ｋは、上記以外のもう１つ操作が必要
である。等量の希釈血清とアラクａ−ル標準物質水溶液
又は未知試料を混合して、２２°Ｃで１時間グレインキ
ュベートし友。次にこの混合液（０，１ゴ／穴）をプレ
ート上６重大測定で分析しｔ０遊離のアラクロールが存
在する場合は、アラクロール−８８Ａ結合体への抗体の
結合が阻害され、４９０ｎｍでの吸光度の発現が阻害さ
れた。遊離のアラクロールの借は発色の強度に間接的に
比例してい友。
である。等量の希釈血清とアラクａ−ル標準物質水溶液
又は未知試料を混合して、２２°Ｃで１時間グレインキ
ュベートし友。次にこの混合液（０，１ゴ／穴）をプレ
ート上６重大測定で分析しｔ０遊離のアラクロールが存
在する場合は、アラクロール−８８Ａ結合体への抗体の
結合が阻害され、４９０ｎｍでの吸光度の発現が阻害さ
れた。遊離のアラクロールの借は発色の強度に間接的に
比例してい友。
プレート上のアラクロール標準物質を基準にして未知水
溶液中のアラクロールの濃度を計算しｔ０７５クロール
標準物質（脱イオン水中０．０．２．０．５．１．Ｄ、
３−０．５．０．８．Ｏｐｐｂ ）は１１ずつ一２０℃
に保存し、各測定毎に新ｔに溶解しｔ０的な９６穴プレ
ートは横に８列Ｘ縦に１２列のものである。横の第１列
目の最初の６列はスクＩＪ−ニング抗原で被覆し、パッ
クグランド用の穴として使用した。残りの７列の涜初の
６列には上記のアラクロール標準物質（０から８ ｐｐ
ｂ ）用とした。
溶液中のアラクロールの濃度を計算しｔ０７５クロール
標準物質（脱イオン水中０．０．２．０．５．１．Ｄ、
３−０．５．０．８．Ｏｐｐｂ ）は１１ずつ一２０℃
に保存し、各測定毎に新ｔに溶解しｔ０的な９６穴プレ
ートは横に８列Ｘ縦に１２列のものである。横の第１列
目の最初の６列はスクＩＪ−ニング抗原で被覆し、パッ
クグランド用の穴として使用した。残りの７列の涜初の
６列には上記のアラクロール標準物質（０から８ ｐｐ
ｂ ）用とした。
８列中の残りの全ての穴は試料用とした。以下の計算で
は、バイオチック（Ｂｉｏ−ｔｅｋ社）リーダーで測定
した未補正の吸光度を使用した。パックグランド用の穴
の６重測定の中央値を計算し、標準物質と試料の中央値
から差し引’Ａ ［ｏ全ての中央値ヲ、アラクロールの
入っていない標準物質（ＯＰＰＢ ）の中央値で割り、
パーセント（チ）吸光度を求めｔ０欠にＹ軸にアラクａ
−ル標準物質のパーセント吸光度を、Ｘ軸にアラクロー
ル濃度の対数値（底１０）をプロットし友。標準物質に
ついて双曲線が得られ、この検量線を用いて未知試料中
のアラクａ−ル濃度を計算しｔｏ 上記の計算には普通計算機を使用し九〇バイオチックリ
ーダーの吸光度を直接デジタルパックス（Ｄｉｇｉ ｔ
ａｌ−Ｖａｘ ）コンぎユウターファイルに移し、Ｒ８
１プログラムで処理した。チ吸元度のロジツト値を計算
しくロジット％吸光度−Ｉｎ （’４吸光度／（１００
−％吸光度〕〕）Ｙ軸にプロットし、アラクロール濃度
（ｐｐｂ ）の（自然）対数をＸ軸にプロットした。ロ
ジット関数によりデータが部分的に線形化し、標準物質
の点上を通る曲線が得られた。曲線の式から各試料のロ
ジット値を計算し、試料中のアラクロールの濃度を求め
た。
は、バイオチック（Ｂｉｏ−ｔｅｋ社）リーダーで測定
した未補正の吸光度を使用した。パックグランド用の穴
の６重測定の中央値を計算し、標準物質と試料の中央値
から差し引’Ａ ［ｏ全ての中央値ヲ、アラクロールの
入っていない標準物質（ＯＰＰＢ ）の中央値で割り、
パーセント（チ）吸光度を求めｔ０欠にＹ軸にアラクａ
−ル標準物質のパーセント吸光度を、Ｘ軸にアラクロー
ル濃度の対数値（底１０）をプロットし友。標準物質に
ついて双曲線が得られ、この検量線を用いて未知試料中
のアラクａ−ル濃度を計算しｔｏ 上記の計算には普通計算機を使用し九〇バイオチックリ
ーダーの吸光度を直接デジタルパックス（Ｄｉｇｉ ｔ
ａｌ−Ｖａｘ ）コンぎユウターファイルに移し、Ｒ８
１プログラムで処理した。チ吸元度のロジツト値を計算
しくロジット％吸光度−Ｉｎ （’４吸光度／（１００
−％吸光度〕〕）Ｙ軸にプロットし、アラクロール濃度
（ｐｐｂ ）の（自然）対数をＸ軸にプロットした。ロ
ジット関数によりデータが部分的に線形化し、標準物質
の点上を通る曲線が得られた。曲線の式から各試料のロ
ジット値を計算し、試料中のアラクロールの濃度を求め
た。
交差反応性試験 抗体に対する一連のアラクｏ −ル類
似物質の反応性をアラクロールと比較し九。
似物質の反応性をアラクロールと比較し九。
阻害１１ｎｔ、ＩＳＡ法で吸光度の５０係阻害を示す濃
度をＩＣ５ｏ値と規定した（５０係阻害濃度）。アラク
ロールのＩｃｊｏ値（ピコモル／コ）を交差反応類似物
質のＩＣ５ｏ値で割ｐ、１ｏｏｔ−掛けて交差反応値を
求めｆｔ。
度をＩＣ５ｏ値と規定した（５０係阻害濃度）。アラク
ロールのＩｃｊｏ値（ピコモル／コ）を交差反応類似物
質のＩＣ５ｏ値で割ｐ、１ｏｏｔ−掛けて交差反応値を
求めｆｔ。
アフイニテイクロマトグラフイー 以下のようにしてウ
サギ抗血清のアフィニティーカラムｔ−調製した。膨潤
したプロティンＡ−アがロースデル５１ｔ−含むカラム
に５ゴの抗血清を通してウサギＩｇＧｒ！ＩＩＬ、た０
カラム溶出液の２８０ ｎｍの吸光度を追跡し、ＰＢＳ
で洗浄して非結合蛋白を除去し、次！ｃｐＨ２，３の酢
酸（０，５８係酢酸と０．１５ＭＮａＣ１）でＩｇＧを
溶出させ２． ＩｇＧを含む画分を集め中和しｆｃ、
； ２８０ ｎｍのＵＶ吸収に基づき、５ゴの血清から
約３３■のＩｇＧが単離された。次にこれを凍結乾燥し
一２０℃で保存した。再使用可能なプロティンＡ−アが
一一スデルカラムはＰＢＳ（０，０２％アジ化ナトリウ
今含有）中で４℃で保存した。
サギ抗血清のアフィニティーカラムｔ−調製した。膨潤
したプロティンＡ−アがロースデル５１ｔ−含むカラム
に５ゴの抗血清を通してウサギＩｇＧｒ！ＩＩＬ、た０
カラム溶出液の２８０ ｎｍの吸光度を追跡し、ＰＢＳ
で洗浄して非結合蛋白を除去し、次！ｃｐＨ２，３の酢
酸（０，５８係酢酸と０．１５ＭＮａＣ１）でＩｇＧを
溶出させ２． ＩｇＧを含む画分を集め中和しｆｃ、
； ２８０ ｎｍのＵＶ吸収に基づき、５ゴの血清から
約３３■のＩｇＧが単離された。次にこれを凍結乾燥し
一２０℃で保存した。再使用可能なプロティンＡ−アが
一一スデルカラムはＰＢＳ（０，０２％アジ化ナトリウ
今含有）中で４℃で保存した。
プロティンＡ精製ＩｇＧはアフィゲル−１０支持体上に
固定化した。アフイｒルー１０（５ｄ）ｉデフチーロー
ト上でイソプロピルアルコールで３回、冷蒸留水で６回
洗浄した後、デルを４℃でＩｇＣ）溶液（［１，ｉ Ｍ
ＩＰＩｌｉ：Ｓ緩衝液中３１１１％ ｐＨ７，５）に
添加しｔ０４時間攪拌しｔ後、デルを静かに遠心分離し
ＨＥＰＥ８緩衝液（＋ＸＩＡ’）で洗浄しｔ０Ｃル上の
残りの活性部位は、ケ９ルを水（２Ｋｇ ）の中に再Ｓ
濁し、Ｚ ｌ’ ／ −ｋ ７ ミ７ ＨＣＩ （Ｑ、
５ ｆｆ１ｌ。
固定化した。アフイｒルー１０（５ｄ）ｉデフチーロー
ト上でイソプロピルアルコールで３回、冷蒸留水で６回
洗浄した後、デルを４℃でＩｇＣ）溶液（［１，ｉ Ｍ
ＩＰＩｌｉ：Ｓ緩衝液中３１１１％ ｐＨ７，５）に
添加しｔ０４時間攪拌しｔ後、デルを静かに遠心分離し
ＨＥＰＥ８緩衝液（＋ＸＩＡ’）で洗浄しｔ０Ｃル上の
残りの活性部位は、ケ９ルを水（２Ｋｇ ）の中に再Ｓ
濁し、Ｚ ｌ’ ／ −ｋ ７ ミ７ ＨＣＩ （Ｑ、
５ ｆｆ１ｌ。
ＩＭ）を加えて混合液を２２℃で１時間攪拌して、ブロ
ックしｔ０アフィニティーカラムは水溶液からアラクロ
ールと他のアナライトを吸収するのに有用であつ九。ア
ラクロールを結合させｔ後カラムを水（２１１Ｌｔ／分
）で洗浄し結合してい々い物質を除去し、７５ｅｓメタ
ノール水溶液でアラクロールを溶出させｔｏこのｒルア
フィニティー力ラムは再使用が可能であり、ＰＢＳ （
０，０２チアジ化ナトリウム含有）中４℃で保存した。
ックしｔ０アフィニティーカラムは水溶液からアラクロ
ールと他のアナライトを吸収するのに有用であつ九。ア
ラクロールを結合させｔ後カラムを水（２１１Ｌｔ／分
）で洗浄し結合してい々い物質を除去し、７５ｅｓメタ
ノール水溶液でアラクロールを溶出させｔｏこのｒルア
フィニティー力ラムは再使用が可能であり、ＰＢＳ （
０，０２チアジ化ナトリウム含有）中４℃で保存した。
結果と考察 １４ｃ標識ハプテンの使用によりアラクロ
ールの蛋白に対する結合が容易に証明された。
ールの蛋白に対する結合が容易に証明された。
チエッカ−ポード測定法に工り免疫後１．５カ月後の血
清を分析すると、アラクロール−ＩｇＧｔ’免ｆｆｆｉ
したウサギはアラクロール−ＢＳＡスクリーニング抗原
ｔ−認識する抗体を産生じている仁とが証明されｔ０ア
ラクｑ−ル抗体を産生しているウサギに４−６週おきに
追加免疫し、各免疫後１０−１４日後に採血した。チエ
ッカ−ぜ−ｒ測定法と阻害１１ＣＩ、Ｉ ＳＡに工す、
血清試料中の抗体の抗体価と親和性を追跡し九。以下の
考察中の抗体は全てこのウサイが産生じｔものである。
清を分析すると、アラクロール−ＩｇＧｔ’免ｆｆｆｉ
したウサギはアラクロール−ＢＳＡスクリーニング抗原
ｔ−認識する抗体を産生じている仁とが証明されｔ０ア
ラクｑ−ル抗体を産生しているウサギに４−６週おきに
追加免疫し、各免疫後１０−１４日後に採血した。チエ
ッカ−ぜ−ｒ測定法と阻害１１ＣＩ、Ｉ ＳＡに工す、
血清試料中の抗体の抗体価と親和性を追跡し九。以下の
考察中の抗体は全てこのウサイが産生じｔものである。
アラクロールの阻害！１ＬＩｓＡ法の開発には第７回目
に採血しｔ血清を使用し之◎ ハゲテン−蛋白結合体の合成中、アラクロールはＡＭ８
Ａを使用してＩｇＧに、ＡＨＴを使用してＢ８ＡＫ結合
させｔｏこの２つのハプテン−蛋白結合体はアラクロー
ル部分のみが共通であるため、アラクロール−ＩｇＧ結
合体を用いて作成しｔ抗体でアラクロール−ＢＡＡと反
応するものは、アラクロール部分のみを認識し、結合試
薬や担体蛋白は認識しないものと考えられる。阻害ｇＬ
Ｉ８Ａでは、アラクロールの存在により抗体とアラクロ
ール−ＢＳＡ結合体の反応は阻害されなかったため、抗
体のアラクロールに対する特異性が確立されていること
が証明されｔ０７回目採血の血清で測定しｔ結果、アラ
クロール濃度が０．２から８．Ｏｐｐｂの範囲で、対応
するチ吸光度が８０％から１０％のとき、ア′ ラフロ
ール阻害ＩＥＬＩＳＡは最も有効であつ２ｏ ７種のア
ラクロール標準物質のチ吸光度は、腎なる日及び異なる
ル−トで実施した２０回の異なる測定より求め次。平均
、標準偏差、変動係数（俤Ｃ０ｖ、）を計算し表１に要
約した。％ Ｃ，Ｖ、は０．２ｐｐｂの４．２俤から８
−Ｏｐｐｂの１８．６チの範囲まであシ、測定間の実験
誤差を表してぃｔ０表１のデータに基づきアラクａ−ル
１１２の対数に対して平均チ吸光度をプロットして検量
線を求めｆｃ。
に採血しｔ血清を使用し之◎ ハゲテン−蛋白結合体の合成中、アラクロールはＡＭ８
Ａを使用してＩｇＧに、ＡＨＴを使用してＢ８ＡＫ結合
させｔｏこの２つのハプテン−蛋白結合体はアラクロー
ル部分のみが共通であるため、アラクロール−ＩｇＧ結
合体を用いて作成しｔ抗体でアラクロール−ＢＡＡと反
応するものは、アラクロール部分のみを認識し、結合試
薬や担体蛋白は認識しないものと考えられる。阻害ｇＬ
Ｉ８Ａでは、アラクロールの存在により抗体とアラクロ
ール−ＢＳＡ結合体の反応は阻害されなかったため、抗
体のアラクロールに対する特異性が確立されていること
が証明されｔ０７回目採血の血清で測定しｔ結果、アラ
クロール濃度が０．２から８．Ｏｐｐｂの範囲で、対応
するチ吸光度が８０％から１０％のとき、ア′ ラフロ
ール阻害ＩＥＬＩＳＡは最も有効であつ２ｏ ７種のア
ラクロール標準物質のチ吸光度は、腎なる日及び異なる
ル−トで実施した２０回の異なる測定より求め次。平均
、標準偏差、変動係数（俤Ｃ０ｖ、）を計算し表１に要
約した。％ Ｃ，Ｖ、は０．２ｐｐｂの４．２俤から８
−Ｏｐｐｂの１８．６チの範囲まであシ、測定間の実験
誤差を表してぃｔ０表１のデータに基づきアラクａ−ル
１１２の対数に対して平均チ吸光度をプロットして検量
線を求めｆｃ。
表 １
０・２ ７８．１ ５．３ ４．２
０．５ ５５．３ ４．６ Ｂ、５
．１．０ ３７．４ ５．６ ９．６
３．０ ２２．９ ３．４１４．８
５．８ １７．７ ３．０１６．９
８．０ １１．３ ２．１ １８．６
同じデータを用いてロジット関数（上記）検量線を求め
た。チ吸光度のロジットをアラクロール＃［の対数に対
してプロットして各点を通る線が得られた＠この計算と
曲線あてはめはスピードと効率を考魔して計算機プログ
ラムを使用し７’Ｃ。
た。チ吸光度のロジットをアラクロール＃［の対数に対
してプロットして各点を通る線が得られた＠この計算と
曲線あてはめはスピードと効率を考魔して計算機プログ
ラムを使用し７’Ｃ。
環境試料中のアラクロール濃度金求めるｔめ、アラクａ
−ルＥ［：ＬＩ ＳＡを開発し友。これまでの社内の研
究で、アラクロールは土壌や水中で２つの主要な代謝物
（オキデニル酸（ｏｒａｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ ）とス
ルホン酸）に分解することがわかっている。これらの代
謝物は環境水試料中に存在することがわかっているｔめ
、これらのアラクロール抗体に対する交差反応性を調べ
ｔが１、いずれもほとんど交差性を示さなかった（２．
５俤未満）。阻害Ｅ’ＩＪ ＳＡを用いて、アラクロー
ルと２３種の類似物質に対する、ウサヤの６つの血清試
料（４回目、６回目、７回目）の抗体のチ交差反応性を
測定し九〇抗体に対するアラクロールの交差反応性を１
００ｔｓとするとき、２，６−ジニチルアニリンとα−
クロロ−１，６′−ジエチルアセトアニリドはほとんど
抗体と反応せず、抗原−抗体反応における３級アミド構
造の重要性を示してい友、他のりａロアセトアニリド除
草剤（アセトクロール、ブタクロール、アミドクロール
、メトラクロール、及びプロパクロール）は抗体とほと
んど反応しないか又は全く反応しなかった。４回目採血
の抗体に対するアセトクロールの低い反応性（１０％）
は、以後の採血の血液に対してはやや減少した。塩素原
子を含まないノルクロローアファクΩ−ル（ｎｏｒｃｈ
ｌｏｒｏ−ａｌａｃｈｌｏｒ ）が２２憾の交差反応性
を示したことは、抗体との反応において塩素原子の存在
が重要であることを示している。
−ルＥ［：ＬＩ ＳＡを開発し友。これまでの社内の研
究で、アラクロールは土壌や水中で２つの主要な代謝物
（オキデニル酸（ｏｒａｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ ）とス
ルホン酸）に分解することがわかっている。これらの代
謝物は環境水試料中に存在することがわかっているｔめ
、これらのアラクロール抗体に対する交差反応性を調べ
ｔが１、いずれもほとんど交差性を示さなかった（２．
５俤未満）。阻害Ｅ’ＩＪ ＳＡを用いて、アラクロー
ルと２３種の類似物質に対する、ウサヤの６つの血清試
料（４回目、６回目、７回目）の抗体のチ交差反応性を
測定し九〇抗体に対するアラクロールの交差反応性を１
００ｔｓとするとき、２，６−ジニチルアニリンとα−
クロロ−１，６′−ジエチルアセトアニリドはほとんど
抗体と反応せず、抗原−抗体反応における３級アミド構
造の重要性を示してい友、他のりａロアセトアニリド除
草剤（アセトクロール、ブタクロール、アミドクロール
、メトラクロール、及びプロパクロール）は抗体とほと
んど反応しないか又は全く反応しなかった。４回目採血
の抗体に対するアセトクロールの低い反応性（１０％）
は、以後の採血の血液に対してはやや減少した。塩素原
子を含まないノルクロローアファクΩ−ル（ｎｏｒｃｈ
ｌｏｒｏ−ａｌａｃｈｌｏｒ ）が２２憾の交差反応性
を示したことは、抗体との反応において塩素原子の存在
が重要であることを示している。
上記したようにアラクロール分子にチオエーテル結合を
介して工ｇａを結合して免疫原とした。従って大きな交
差反応性を示すいくつかのアラクロール類似物質はチオ
エーテル基を含んでＶｈｆということはそれほど驚くべ
きことではない。塩素の代わりにメチルスルフィド基を
有する類似物質で最大（約２倍）の交差反応性（１８８
％）が得られた。しかしイオウをさらに酸化してスルホ
キシｒ類似物やスルホン類似物にすると交差反応性はそ
れぞれ１５％と９係に低下しｔ０アラクロールの２′−
ヒドロキシエチル−スルホン類似物と、α−クロＯ−２
’、６’−ジエチルアセトアニリドの２級アミドメチル
スルフィド類似物は全く交差反応性を示さなかった。式 を有するメルカプツレート類似物は有意に反応し、これ
は第４回目血液の１８慢から第７回目血液−０６５憾ま
で増加しｔ０対心するメチルエステルに陰イオン荷電が
なくなつｔｔめに反応性が８９．７チまで増加した。上
記メルカプツレート中のイオウを酸化してＳ−Ｏ誘導体
を作成するか又は６級アミドを２級アミドメルカ１ツレ
ートに変換すると、抗体との反応性が著しく減少するか
又は全くなくなつｔ０アラクロールのチオ酢酸とグルタ
チオン結合体はそれぞれ５７．０ ％と２７．５１の反
応性を示した。
介して工ｇａを結合して免疫原とした。従って大きな交
差反応性を示すいくつかのアラクロール類似物質はチオ
エーテル基を含んでＶｈｆということはそれほど驚くべ
きことではない。塩素の代わりにメチルスルフィド基を
有する類似物質で最大（約２倍）の交差反応性（１８８
％）が得られた。しかしイオウをさらに酸化してスルホ
キシｒ類似物やスルホン類似物にすると交差反応性はそ
れぞれ１５％と９係に低下しｔ０アラクロールの２′−
ヒドロキシエチル−スルホン類似物と、α−クロＯ−２
’、６’−ジエチルアセトアニリドの２級アミドメチル
スルフィド類似物は全く交差反応性を示さなかった。式 を有するメルカプツレート類似物は有意に反応し、これ
は第４回目血液の１８慢から第７回目血液−０６５憾ま
で増加しｔ０対心するメチルエステルに陰イオン荷電が
なくなつｔｔめに反応性が８９．７チまで増加した。上
記メルカプツレート中のイオウを酸化してＳ−Ｏ誘導体
を作成するか又は６級アミドを２級アミドメルカ１ツレ
ートに変換すると、抗体との反応性が著しく減少するか
又は全くなくなつｔ０アラクロールのチオ酢酸とグルタ
チオン結合体はそれぞれ５７．０ ％と２７．５１の反
応性を示した。
これらの交差反応性実験に工り、アラクロールの構造に
おいて抗体との反応に寄与する官能基の重要性が証明さ
れた。アラクロールのＮ−メトキシメチル−Ｎ−（２，
６−ジニチルフエニル）アセトアミド部分の構造を若干
変化させると、反応性が著しく低下した。アラクロール
分子の炭素２の位置にイオウ又は塩素が存在することが
反応性に重要であつ［０Ｌかしチオエーテル類似物のイ
オウ原子を酸化すると逆の効果も観察された。土壌及び
水中のアラクロールの２つの主要な代謝物（オキデニル
酸（ｏｘａｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ ）とスルホン酸）は
抗体とほとんど反応しなかつ九〇従ってこれらは環境試
料中でアラクロールのＥｔ、Ｉ ＳＡ法を妨害しないと
考えられる。
おいて抗体との反応に寄与する官能基の重要性が証明さ
れた。アラクロールのＮ−メトキシメチル−Ｎ−（２，
６−ジニチルフエニル）アセトアミド部分の構造を若干
変化させると、反応性が著しく低下した。アラクロール
分子の炭素２の位置にイオウ又は塩素が存在することが
反応性に重要であつ［０Ｌかしチオエーテル類似物のイ
オウ原子を酸化すると逆の効果も観察された。土壌及び
水中のアラクロールの２つの主要な代謝物（オキデニル
酸（ｏｘａｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ ）とスルホン酸）は
抗体とほとんど反応しなかつ九〇従ってこれらは環境試
料中でアラクロールのＥｔ、Ｉ ＳＡ法を妨害しないと
考えられる。
ウサギの第１回血液の血清から分離した抗体を用いてア
ラクロールのアフィニティーカラムラ作成し、その分離
手段及び精製手段としての有用性を検討し九〇アラクａ
−ルーＩｇＧ結合体で免疫したウサギの血清中のＩｇＧ
’ｉ、プロティンＡ−アがロースカラムで精製した。次
に精製工ｇＧをアフイｒルー１０支持体上に固定させ九
〇水溶液中のアラクロール（１４Ｃ標識）を２１／分の
速度でカラムに通し、カラムを水で洗浄し７５チメタノ
ール水溶液で溶出させｔ０洗浄液及び溶出液中の放射能
全液体シンチレーションカウンターで計測し友。
ラクロールのアフィニティーカラムラ作成し、その分離
手段及び精製手段としての有用性を検討し九〇アラクａ
−ルーＩｇＧ結合体で免疫したウサギの血清中のＩｇＧ
’ｉ、プロティンＡ−アがロースカラムで精製した。次
に精製工ｇＧをアフイｒルー１０支持体上に固定させ九
〇水溶液中のアラクロール（１４Ｃ標識）を２１／分の
速度でカラムに通し、カラムを水で洗浄し７５チメタノ
ール水溶液で溶出させｔ０洗浄液及び溶出液中の放射能
全液体シンチレーションカウンターで計測し友。
その結果添加した放射性アラクロールの約７０−から８
０％がアフィニティーカラムに結合し、残夛は洗浄液中
に溶出しｔ０カラムの能力は１μＩ以下のためこれ以上
のアラクａ−ルはカラムに結合しなかつ’ｆｔｏ添加し
た放射能の回収率は大体８０１から１００チであつ’ｎ
、ｏ ２番目の実験で、アラクａ−ル（０，５μｇ）を
溶かす水の量を１Ｗ１１から１００−まで増加させ九。
０％がアフィニティーカラムに結合し、残夛は洗浄液中
に溶出しｔ０カラムの能力は１μＩ以下のためこれ以上
のアラクａ−ルはカラムに結合しなかつ’ｆｔｏ添加し
た放射能の回収率は大体８０１から１００チであつ’ｎ
、ｏ ２番目の実験で、アラクａ−ル（０，５μｇ）を
溶かす水の量を１Ｗ１１から１００−まで増加させ九。
０．５μＥｌ／Ｉｌｌから０．５ ｔｔ９ ／ ５０
ａｔ （０，５ｐｐｍから１０ｐｐｂまでの溶液ではア
ラクロールはカラムから宵効に回収されたが、０．５μ
９／Ｉ Ｄｏｍｅ（５ｐｐｂ）ではカラムからのアラク
ロールの抽出効率は５０ｍ低下した。
ａｔ （０，５ｐｐｍから１０ｐｐｂまでの溶液ではア
ラクロールはカラムから宵効に回収されたが、０．５μ
９／Ｉ Ｄｏｍｅ（５ｐｐｂ）ではカラムからのアラク
ロールの抽出効率は５０ｍ低下した。
アラクロールのアフィニティーカラムに対する非特異結
合の可能性を排除するｔめ、他の１４０標識類似物につ
いて試験し九。これらはアセトアニリド除草剤のブタク
ロール、アセトクロール、メトラクロール、プロパクロ
ールそして前記しｔアラクロ−ルの代謝物であるメルカ
１ツレートとそのメチルエステルである。アフィニティ
ーカラムはブタクロールとアセトクロ２ルを結合させた
が、メトラクロール、プロパクロール又はメルカプッレ
ートは結合しなかつｔ０メルカプッレートのメチルエス
テルについても結合が観察されｔ０アフィニティーカラ
ムがもう少し複雑な試料からアラクロールを抽出できる
か否かを調べるため、ヒト尿中に加えｔアラクロールと
その類似物について同様の実験を行つｔｏその結果（表
２）尿中であってもアフィニティーカラムはアラクロー
ルに対する結合特異性を示しｔｏ 表 ２ アフイニテイ力ラムによるヒト尿から アラクロール ０．１ ２０．０ １２３
．０ １４３．０アラクロール ０．６ １
１．０ ６９．０ ８０．０アラクロール
１．４ ３７．０ ４８．０
Ｂ５．０アセトクロール １．０ ＋５１．０
３８．０ ９９．０１０バクロール １．２
８８．０ １１．０ ９９．０フエノ
ール ０．６ ９５．０ ４．０
９９．０放射能標識１４Ｃアナライトをヒト尿中に
加え友。アフィニティーカラムは、アラクロール−Ｉｇ
（）結合体で免疫したウサギの第１回目採血の血清から
調製し九〇 最後の実験では１４ｃアラクａ−ルを経口投与したラッ
トの尿を用いた。放射能検出を用りる高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ／ ＲＡＤ ）による分析の結果
、ラット尿中にはアラクロールは含まれておらず、その
かわり約１０種類以上の代謝物が含まれてい友。この尿
に０．５μｇの放射能標識アラクロールを加えて、その
混合液をアフィニティーカラムに通した。
合の可能性を排除するｔめ、他の１４０標識類似物につ
いて試験し九。これらはアセトアニリド除草剤のブタク
ロール、アセトクロール、メトラクロール、プロパクロ
ールそして前記しｔアラクロ−ルの代謝物であるメルカ
１ツレートとそのメチルエステルである。アフィニティ
ーカラムはブタクロールとアセトクロ２ルを結合させた
が、メトラクロール、プロパクロール又はメルカプッレ
ートは結合しなかつｔ０メルカプッレートのメチルエス
テルについても結合が観察されｔ０アフィニティーカラ
ムがもう少し複雑な試料からアラクロールを抽出できる
か否かを調べるため、ヒト尿中に加えｔアラクロールと
その類似物について同様の実験を行つｔｏその結果（表
２）尿中であってもアフィニティーカラムはアラクロー
ルに対する結合特異性を示しｔｏ 表 ２ アフイニテイ力ラムによるヒト尿から アラクロール ０．１ ２０．０ １２３
．０ １４３．０アラクロール ０．６ １
１．０ ６９．０ ８０．０アラクロール
１．４ ３７．０ ４８．０
Ｂ５．０アセトクロール １．０ ＋５１．０
３８．０ ９９．０１０バクロール １．２
８８．０ １１．０ ９９．０フエノ
ール ０．６ ９５．０ ４．０
９９．０放射能標識１４Ｃアナライトをヒト尿中に
加え友。アフィニティーカラムは、アラクロール−Ｉｇ
（）結合体で免疫したウサギの第１回目採血の血清から
調製し九〇 最後の実験では１４ｃアラクａ−ルを経口投与したラッ
トの尿を用いた。放射能検出を用りる高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ／ ＲＡＤ ）による分析の結果
、ラット尿中にはアラクロールは含まれておらず、その
かわり約１０種類以上の代謝物が含まれてい友。この尿
に０．５μｇの放射能標識アラクロールを加えて、その
混合液をアフィニティーカラムに通した。
表 ３
アフィニティーカラムによるアラクロール代謝物アラク
ロール ０．５ １４．７ ８３，３
９７．９尿（ラット） ４．５ １０２．６
９．０ １１１．６尿＋アラクロール ５．
０ ７８，４ ２９．５ １０７．８そ
の結果、尿のみを流しｔ場合放射能は抽出されなかった
が、アラクロールを加えた尿では約３０％の放射能がカ
ラムに結合しｔ０アフィニティーカラムのメタノール溶
出液の高速液体クロマトグラフィー分析にエリアラクロ
ールのみが検出され、カラムの洗浄液にはすべてのアラ
クロール代謝物と低濃度の非抽出アラクロールが含まれ
ていた。この結果もまｔ１近接した動物の代謝物の存在
下でもアラクロールに対する抗体の特異性があることを
示していｔｏ 上記実験により、免疫原としてアラクロール−ＩｇＧ結
合体を使用して、ウサギにおいてアラクロールに対する
ポリクローナル抗体がうまく作成されｔことが証明され
た。この抗体はアラクロールに対して特異的であり、Ｅ
ＬＩＳＡ法の開発に使用した。このＥＬＩＳＡ法の検量
線の範囲はアラクロール０．２から８．０ ｐｐｂであ
り、その変動係数は４慢から１９係であつｔｏこの抗体
は、アラクロールの土壌及び水中の２つの主要な代謝物
に対して反応性を示さなかつｔが、スルフィド類似物（
これはアラクロールが土壌及び水中で代謝されて低濃度
で産生される可能性がある）とは強い反応性を示した。
ロール ０．５ １４．７ ８３，３
９７．９尿（ラット） ４．５ １０２．６
９．０ １１１．６尿＋アラクロール ５．
０ ７８，４ ２９．５ １０７．８そ
の結果、尿のみを流しｔ場合放射能は抽出されなかった
が、アラクロールを加えた尿では約３０％の放射能がカ
ラムに結合しｔ０アフィニティーカラムのメタノール溶
出液の高速液体クロマトグラフィー分析にエリアラクロ
ールのみが検出され、カラムの洗浄液にはすべてのアラ
クロール代謝物と低濃度の非抽出アラクロールが含まれ
ていた。この結果もまｔ１近接した動物の代謝物の存在
下でもアラクロールに対する抗体の特異性があることを
示していｔｏ 上記実験により、免疫原としてアラクロール−ＩｇＧ結
合体を使用して、ウサギにおいてアラクロールに対する
ポリクローナル抗体がうまく作成されｔことが証明され
た。この抗体はアラクロールに対して特異的であり、Ｅ
ＬＩＳＡ法の開発に使用した。このＥＬＩＳＡ法の検量
線の範囲はアラクロール０．２から８．０ ｐｐｂであ
り、その変動係数は４慢から１９係であつｔｏこの抗体
は、アラクロールの土壌及び水中の２つの主要な代謝物
に対して反応性を示さなかつｔが、スルフィド類似物（
これはアラクロールが土壌及び水中で代謝されて低濃度
で産生される可能性がある）とは強い反応性を示した。
しかしこれが環境試料中のアラクロールのＥＬＩ ８μ
分析に問題となるか否かは不明である。ヒト以外の動物
の代謝物のいくつかもまｔ１抗体と有意に反応した。環
境中のこれらの代謝物の量は非常に少ないか又はぜ口で
あ゛るため、これら代謝物によるアラクロールのＥＬＩ
ＳＡ法に対する妨害はないと考えられる。この抗体は
まｔアフィニティーカラムの調製にも有用であり、水や
尿からアラクロールを分離及び精製する手段として利用
できる可能性が示されｔｏ 実施例２ 上記実験により、自然水中のスクリーニング試料のアラ
クロールの存在を調べるのにアラクロールＥＬＩ８Ａが
有効であることが示されｔｏこれを評価するために、い
くつかの環境水の試料をｌ１ｅＬ Ｉ ＳＡ法とＣ）０
７ＭＳ法で別々に分析しｔｏこれらの試料は春と夏にア
メリカ合衆国の中西部と東部地方の数カ所で集めた数百
種類の川の水である。既知量のアラクロールを添加し之
水試料を対照として加えｔｏ １１ｉＬＩＳＡ法による分析から約８０幅はアラクロー
ルの含量が３ ｎｇ／ １１未満であると予想され九〇
この予想の９９．７１は正しいことが機器分析（ＧＣ’
／ＭＳ）から確認された。しかしＥＬＩＳＡの結果から
アラクロールの含量が３ｎ９７Ｅ１以上と予想されｔ試
料のうち４６．２ ％のみがこの濃度であつｔｏこれら
の多くはアラクロールを添加した試料である。閾値の基
準を変えてデータを解析しても、−貫してＥＬＩＳＡ法
は陰性試料を正確に測定していたが、選択しｔ閾値以上
のアラクロールを含んでいたのは陽性とされｔ試料のわ
ずか３０から５０憾であつｔｏ この現象と、他の農薬、金属塩、顆粒物質、又は可能性
のある反応機構との相関について調べてみたが、妨害作
用の本質について同定することはできなかつ友。リン酸
緩衝液の代わりにトリス緩衝板金使用し、血清とＧＡＲ
−）（ＲＰ希釈液中にツイーン２０と脱脂粉乳を加える
と、多くの場合妨害の頻度が大きく減少したが、完全に
なくなることはなかつ友。さらに方法を変更して、分析
前に塩化メチレンなどの有機溶媒でアラクロールを抽出
し、選ばれた試料を再測定するとＥＬＩ ８Ａの偽陽性
の結果は出なくなつｔ。
分析に問題となるか否かは不明である。ヒト以外の動物
の代謝物のいくつかもまｔ１抗体と有意に反応した。環
境中のこれらの代謝物の量は非常に少ないか又はぜ口で
あ゛るため、これら代謝物によるアラクロールのＥＬＩ
ＳＡ法に対する妨害はないと考えられる。この抗体は
まｔアフィニティーカラムの調製にも有用であり、水や
尿からアラクロールを分離及び精製する手段として利用
できる可能性が示されｔｏ 実施例２ 上記実験により、自然水中のスクリーニング試料のアラ
クロールの存在を調べるのにアラクロールＥＬＩ８Ａが
有効であることが示されｔｏこれを評価するために、い
くつかの環境水の試料をｌ１ｅＬ Ｉ ＳＡ法とＣ）０
７ＭＳ法で別々に分析しｔｏこれらの試料は春と夏にア
メリカ合衆国の中西部と東部地方の数カ所で集めた数百
種類の川の水である。既知量のアラクロールを添加し之
水試料を対照として加えｔｏ １１ｉＬＩＳＡ法による分析から約８０幅はアラクロー
ルの含量が３ ｎｇ／ １１未満であると予想され九〇
この予想の９９．７１は正しいことが機器分析（ＧＣ’
／ＭＳ）から確認された。しかしＥＬＩＳＡの結果から
アラクロールの含量が３ｎ９７Ｅ１以上と予想されｔ試
料のうち４６．２ ％のみがこの濃度であつｔｏこれら
の多くはアラクロールを添加した試料である。閾値の基
準を変えてデータを解析しても、−貫してＥＬＩＳＡ法
は陰性試料を正確に測定していたが、選択しｔ閾値以上
のアラクロールを含んでいたのは陽性とされｔ試料のわ
ずか３０から５０憾であつｔｏ この現象と、他の農薬、金属塩、顆粒物質、又は可能性
のある反応機構との相関について調べてみたが、妨害作
用の本質について同定することはできなかつ友。リン酸
緩衝液の代わりにトリス緩衝板金使用し、血清とＧＡＲ
−）（ＲＰ希釈液中にツイーン２０と脱脂粉乳を加える
と、多くの場合妨害の頻度が大きく減少したが、完全に
なくなることはなかつ友。さらに方法を変更して、分析
前に塩化メチレンなどの有機溶媒でアラクロールを抽出
し、選ばれた試料を再測定するとＥＬＩ ８Ａの偽陽性
の結果は出なくなつｔ。
全体としてこの実験結果からアラクロールＥＬＩＢＡ法
は自然水に適用して、アラクロールを含む可能性があり
さらに分析が必要な試料を選択するのに使用できること
が証明された。わざとアラクロールを添加しｔ試料以外
に免疫定量法で選択されｔ試料は、全体のほんの一部で
あつｔため、これは時間の大幅な節約になると考えられ
る。試験し九閾値濃度にかかわらずこの方法で見逃され
九試料は０．５チ未満であつ７ｔｏ Ｌかし陽性試料中
にアラクロールが存在するかどうかを確昭するのに、２
回目の実験が必要であつｔ、最初の免疫定量法にＬり多
数の試料が選択されｔ場合には、これらの水試料を有機
溶媒で抽出してＥＬＩＳＡ法で再測定すれば選択法をさ
らに改良することができる。
は自然水に適用して、アラクロールを含む可能性があり
さらに分析が必要な試料を選択するのに使用できること
が証明された。わざとアラクロールを添加しｔ試料以外
に免疫定量法で選択されｔ試料は、全体のほんの一部で
あつｔため、これは時間の大幅な節約になると考えられ
る。試験し九閾値濃度にかかわらずこの方法で見逃され
九試料は０．５チ未満であつ７ｔｏ Ｌかし陽性試料中
にアラクロールが存在するかどうかを確昭するのに、２
回目の実験が必要であつｔ、最初の免疫定量法にＬり多
数の試料が選択されｔ場合には、これらの水試料を有機
溶媒で抽出してＥＬＩＳＡ法で再測定すれば選択法をさ
らに改良することができる。
実施例３
上記したアラクロールの場合と同じ方法を用いて、ブタ
クロール（２−クロロ−２’、６’−ジエチル−Ｎ−（
シトキシメチル）アセトアニリド）、アミドクロール（
２−クロロ−２’、６’−ジエチル−Ｎ−アセトアミド
メチルアセトアニリド）、及びメトラクロール（２−ク
ロロ−２′−エチル−６′−メチル−Ｎ−（２−メトキ
シ−１−メエチルエチル）アセトアニリド）について、
抗体を作成した。ＡＨＴを用いて各１４０標識クロロア
セトアニリドをＨ８Ａに共有結合させ、ＡＭＳＡを用い
てヒツジＩｇＧに共有結合させｔ０計算の結果、蛋白（
Ｈ８Ａ又はＩｇ（） ） ｉモルにつき１１から３１モ
ルのハプテン（ブタクロール、アセトクロール、又はメ
トラクロール）が結合してい九〇 ハプテン−■ｇＧ結合体を用いてウサギを免疫した。次
に対応するハプテン−ＢＳＡ結合体を用いてチエッカ−
ボード測定を・し仁ない、抗血清中に目的の抗体が存在
するかどうかを調べた。抗血清、デタクロールーＬＩＳ
Ａスクリーニング抗原、ブタクロールを使用して、ブタ
クロールの阻害ｇＬＩｓＡを組み立てｔ０アミドクロー
ルとメトラクロールについても同様の測定法を組み立て
ｔｏすぺでの阻害ＥＬＩＳＡ法で、遊離のハプテンの存
在に工す抗体とスクリーニング抗原との反応が阻害され
ｔ０従って抗血清中の抗体は遊離ハブテンに対して特異
的であることが証明され友。
クロール（２−クロロ−２’、６’−ジエチル−Ｎ−（
シトキシメチル）アセトアニリド）、アミドクロール（
２−クロロ−２’、６’−ジエチル−Ｎ−アセトアミド
メチルアセトアニリド）、及びメトラクロール（２−ク
ロロ−２′−エチル−６′−メチル−Ｎ−（２−メトキ
シ−１−メエチルエチル）アセトアニリド）について、
抗体を作成した。ＡＨＴを用いて各１４０標識クロロア
セトアニリドをＨ８Ａに共有結合させ、ＡＭＳＡを用い
てヒツジＩｇＧに共有結合させｔ０計算の結果、蛋白（
Ｈ８Ａ又はＩｇ（） ） ｉモルにつき１１から３１モ
ルのハプテン（ブタクロール、アセトクロール、又はメ
トラクロール）が結合してい九〇 ハプテン−■ｇＧ結合体を用いてウサギを免疫した。次
に対応するハプテン−ＢＳＡ結合体を用いてチエッカ−
ボード測定を・し仁ない、抗血清中に目的の抗体が存在
するかどうかを調べた。抗血清、デタクロールーＬＩＳ
Ａスクリーニング抗原、ブタクロールを使用して、ブタ
クロールの阻害ｇＬＩｓＡを組み立てｔ０アミドクロー
ルとメトラクロールについても同様の測定法を組み立て
ｔｏすぺでの阻害ＥＬＩＳＡ法で、遊離のハプテンの存
在に工す抗体とスクリーニング抗原との反応が阻害され
ｔ０従って抗血清中の抗体は遊離ハブテンに対して特異
的であることが証明され友。
ＤＩ水中で調製しｔ各標準物質を使用して、ブタクロー
ル、アミドクロール、メトラクロールの阻害ＥＬＩ８Ａ
の感度を試験しｔ０最良の抗血清を使用して、ブタクロ
ールのＥＬＩＳＡで８ ｐｐｂのｒｃ５０が得られた。
ル、アミドクロール、メトラクロールの阻害ＥＬＩ８Ａ
の感度を試験しｔ０最良の抗血清を使用して、ブタクロ
ールのＥＬＩＳＡで８ ｐｐｂのｒｃ５０が得られた。
メトラクロールの最良の抗血清でも８ ｐｐｂのＩＣ５
Ｑが得られ、アセトクロール抗血清では２ ｐｐｂのＩ
Ｃ５Ｑが得られた。スクリーニング抗原としてブタクロ
ール−Ｈ８Ａの代わりにアミドクロール−Ｈ８Ａ ｔ−
使用して、アミドクロールＥＬＩ８Ａの感度を上昇させ
た場合、Ｏ−２ｐｐｂのＩＣ’５Ｑが得られｔｏ アラクロール、アセトクロール、ブタクロール、アミド
クロール、メトラクロール、グロパクロールｔ−ＤＩ水
中で１０ ｐｐｂと５０ ｐｐｂの濃度に調製しｔ標準
溶液を使用して、ブタクロール、アミドクロール及びメ
トラクロールめＥＬｒＳＡの特喝性を調べ九〇これらの
１１１度でブタクロール、アミげクロール及びメトラク
ロールのＥＬＩＳＡは、各遊離のハプテンに裏ってのみ
阻害され、他のクロロアセトアニリｒにＬつでは阻害さ
れなかつｔ０アラクａ−ル、ブタクロール、アミげクロ
ール及びメトラクロールに対する我々の実験結果はすべ
て非常によく似ていｔ０クロａアセトアニリドに対する
抗体は、クロロアセトアニリドと蛋白トのチオエーテル
結合体でウサギを免疫することにエフ作成できる。これ
らのハプテン−蛋白結合体から産生されｔ抗体は遊離の
ハプテンにのみ反応性を示し、他のりＣ！ロアセトアニ
リド除草剤とは反応しなかつｔｏ 本発明のＥＴ、Ｉ ＳＡ法によるα−ハロアセトアミド
の定量用の免疫診断定量キットは： １、 α−ハロアセトアミドに特異的な抗体、２、固相
に固定化されたα−ハロアセトアミド−蛋白結合体、 ６、該抗体を認識し反応する抗免疫グロブリン酵素標識
試薬、及び該測定系において酵素の活性を停止及び測定
する方法（例えば、希硫酸又は炭酸停止緩衝液及びグリ
シン停と緩衝液及び比色測定）、 ４゜ 既知量の適当なα−ハロアセトアミドを含有する
標準物質、 ５、試験液中の試薬を希釈するための緩衝液、及び ６、溶液３の酵素用の基質液 よりなる。
Ｑが得られ、アセトクロール抗血清では２ ｐｐｂのＩ
Ｃ５Ｑが得られた。スクリーニング抗原としてブタクロ
ール−Ｈ８Ａの代わりにアミドクロール−Ｈ８Ａ ｔ−
使用して、アミドクロールＥＬＩ８Ａの感度を上昇させ
た場合、Ｏ−２ｐｐｂのＩＣ’５Ｑが得られｔｏ アラクロール、アセトクロール、ブタクロール、アミド
クロール、メトラクロール、グロパクロールｔ−ＤＩ水
中で１０ ｐｐｂと５０ ｐｐｂの濃度に調製しｔ標準
溶液を使用して、ブタクロール、アミドクロール及びメ
トラクロールめＥＬｒＳＡの特喝性を調べ九〇これらの
１１１度でブタクロール、アミげクロール及びメトラク
ロールのＥＬＩＳＡは、各遊離のハプテンに裏ってのみ
阻害され、他のクロロアセトアニリｒにＬつでは阻害さ
れなかつｔ０アラクａ−ル、ブタクロール、アミげクロ
ール及びメトラクロールに対する我々の実験結果はすべ
て非常によく似ていｔ０クロａアセトアニリドに対する
抗体は、クロロアセトアニリドと蛋白トのチオエーテル
結合体でウサギを免疫することにエフ作成できる。これ
らのハプテン−蛋白結合体から産生されｔ抗体は遊離の
ハプテンにのみ反応性を示し、他のりＣ！ロアセトアニ
リド除草剤とは反応しなかつｔｏ 本発明のＥＴ、Ｉ ＳＡ法によるα−ハロアセトアミド
の定量用の免疫診断定量キットは： １、 α−ハロアセトアミドに特異的な抗体、２、固相
に固定化されたα−ハロアセトアミド−蛋白結合体、 ６、該抗体を認識し反応する抗免疫グロブリン酵素標識
試薬、及び該測定系において酵素の活性を停止及び測定
する方法（例えば、希硫酸又は炭酸停止緩衝液及びグリ
シン停と緩衝液及び比色測定）、 ４゜ 既知量の適当なα−ハロアセトアミドを含有する
標準物質、 ５、試験液中の試薬を希釈するための緩衝液、及び ６、溶液３の酵素用の基質液 よりなる。
この定量中ツトｈ好ましくは以下の用に使用される：
試薬１を試薬５で希釈し、試薬４（又は試料）と室温で
反応させｔ後、この混合板金試薬２に加える。次に試薬
２の中の固相担体を５で洗浄し、試薬３を加える。試薬
２の中の固相担体を再び５で洗浄し、試薬６を加える。
反応させｔ後、この混合板金試薬２に加える。次に試薬
２の中の固相担体を５で洗浄し、試薬３を加える。試薬
２の中の固相担体を再び５で洗浄し、試薬６を加える。
試料と標準物質の色の強度を比較して、α−ハロアセト
アミドの濃度が求められる。
アミドの濃度が求められる。
上記したようにα−ハロアセトアミドクラスに代表的な
有名な市販の除草剤について、本発明の新規な免疫定量
法を説明したが、他のα−・・ロアセトアミド（例えば
アリ「クロール、メタ・戸クロール、グレチラクロール
、グロパクロールなト）を検出するｔめに、当業者の能
力に応じて、結合体作成、高分子担体、及び他の出発物
質や試薬に関し、必要に応じて改変して同じ免疫定量法
を使用することは明らかに本発明の範囲内である。
有名な市販の除草剤について、本発明の新規な免疫定量
法を説明したが、他のα−・・ロアセトアミド（例えば
アリ「クロール、メタ・戸クロール、グレチラクロール
、グロパクロールなト）を検出するｔめに、当業者の能
力に応じて、結合体作成、高分子担体、及び他の出発物
質や試薬に関し、必要に応じて改変して同じ免疫定量法
を使用することは明らかに本発明の範囲内である。
Claims (39)
- （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘはハロゲンであり；Ｒ＿１とＲ＿２は独立に
、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアル
キル、ポリアルコキシアルキル、アシル又はアシルアミ
ドメチルである８個以下の炭素原子を有するラジカル；
又は１０個以下の炭素原子を有するアリール又はアリー
ルアルキルラジカル；又は１０個以下の環原子（このう
ち１−３個は窒素、酸素及び／又はイオウ原子でもよい
）を有する複素環又は複素環メチルラジカル；又は１つ
以上のアルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアル
ケニルで置換された、又は５個以下の炭素原子、ハロゲ
ン、ニトロ基、又はシアノ基を有するアルコキシラジカ
ルで置換された、上記のうち任意のラジカルである）の
α−ハロアセトアミドよりなるハプテンに対する抗体。 - （２）ハプテンは式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＡはＣ＿１＿−＿４の直鎖又は分岐鎖アルキレ
ニルラジカルで、ｎはゼロ又は１であり；Ｒ＿３は水素
、Ｃ＿１＿−＿５アルキル又はハロアルキル；又はＣ＿
１＿−＿６アシル又はアシルアミド；又は１０個以下の
環原子（このうち１−３個は窒素、酸素及び／又はイオ
ウ原子でもよい）を有し、随時Ｃ＿１＿−＿５アルキル
又はアルコキシラジカルで置換された複素環又は複素環
メチルラジカル；又は−ＯＲ＿５ラジカル（ここでＲ＿
５はＣ＿１＿−＿６アルキル、ハロアルキル、又はアル
コキシアルキルラジカルである）であり、Ｒ＿４はＲ＿
５ラジカル、ＣＦ＿３、ＮＯ＿２又は５個以下の炭素原
子を有するアルコキシラジカルであり、ｍは０−５であ
る）のα−クロロアセトアニリドである、特許請求の範
囲第１項に記載の抗体。 - （３）α−クロロアセトアニリドは、アセトクロール（
ａｃｅｔｏｃｈｌｏｒ）、アラクロール（ａｌａｃｈｌ
ｏｒ）、アリドクロール（ａｌｌｉｄｏｃｈｌｏｒ）、
アミドクロール（ａｍｉｄｏｃｈｌｏｒ）、ブタクロー
ル（ｂｕｔａｃｈｌｏｒ）、メタゾクロール（ｍｅｔａ
ｚｏｃｈｌｏｒ）、メトラクロール（ｍｅｔｏｌａｃｈ
ｌｏｒ）、プレチラクロール（ｐｒｅｔｉｌａ−ｃｈｌ
ｏｒ）、又はプロパクロール（ｐｒｏｐａｃｈｌｏｒ）
である、特許請求の範囲第２項に記載の抗体。 - （４）α−クロロアセトアニリドはアラクロール（ａｌ
ａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３項に記載の抗
体。 - （５）α−クロロアセトアニリドはブタクロール（ｂｕ
ｔａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３項に記載の
抗体。 - （６）α−クロロアセトアニリドはメトラクロール（ｍ
ｅｔｏｌａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３項に
記載の抗体。 - （７）α−クロロアセトアニリドはプレチラクロール（
ｐｒｅｔｉｌａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３
項に記載の抗体。 - （８）α−クロロアセトアニリドはアセトクロール（ａ
ｃｅｔｏｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３項に記
載の抗体。 - （９）α−クロロアセトアニリドはアミドクロール（ａ
ｍｉｄｏｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３項に記
載の抗体。 - （１０）ハプテンと高分子担体が共有結合している結合
体よりなる、特許請求の範囲第１項から第８項までのい
ずれか１項又は第９項に記載のハプテンに対する抗体を
作成するための抗原。 - （１１）担体は血清蛋白である特許請求の範囲第１０項
に記載の抗原。 - （１２）蛋白はＢＳＡ、ＯＡ、ＨＳＡ、ＩｇＧ又はＫＬ
Ｈである、特許請求の範囲第１１項に記載の抗原。 - （１３）ハプテンはα−ハロアセトアミドである、特許
請求の範囲第１２項に記載の抗原。 - （１４）下記の式を有する特許請求の範囲第１３項に記
載の抗原： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１とＲ＿２は独立に、アルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アルコキシアルキル、ポリアルコキシ
アルキル、アシル又はアシルアミドメチルである８個以
下の炭素原子を有するラジカル；又は１０個以下の炭素
原子を有するアリール又はアリールアルキルラジカル；
又は１０個以下の環原子（このうち１−３個は窒素、酸
素及び／又はイオウ原子でもよい）を有する複素環又は
複素環メチルラジカル；又は１つ以上のアルキル、ハロ
アルキル、アルケニル、ハロアルケニルで置換された、
又は５個以下の炭素原子、ハロゲン、ニトロ基、又はシ
アノ基を有するアルコキシラジカルで置換された、上記
のうち任意のラジカルであり、Ａはチオール化剤の残基
であり、ＢはＡに共有結合した血清蛋白である）。 - （１５）Ｒはラジカル−（Ａ）＿−Ｒ＿３である特許請
求の範囲第１４項に記載の抗原（ただし、ＡはＣ＿１＿
−＿４の直鎖又は分岐鎖アルキレニルラジカルで、ｎは
ゼロ又は１であり；Ｒ＿３は水素、Ｃ＿１＿−＿５アル
キル又はハロアルキル；又はＣ＿１＿−＿６アシル又は
アシルアミド；又は１０個以下の環原子（このうち１−
３個は窒素、酸素及び／又はイオウ原子でもよい）を有
し、随時Ｃ＿１＿−＿５アルキル又はアルコキシラジカ
ルで置換された複素環又は複素環メチルラジカル；又は
−ＯＲ＿５ラジカル（ここでＲ＿５はＣ＿１＿−＿６ア
ルキル、ハロアルキル、又はアルコキシアルキルラジカ
ルである）でありＲ１は１−５個のラジカルで置換され
た又は置換されていないフエニルラジカル、ＣＦ＿３、
ＮＯ＿２又は５個以下の炭素原子を有するアルコキシラ
ジカルである）。 - （１６）ＢはＢＳＡ又はＩｇＧでありＡはチオール化剤
▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式
、表等があります▼ の１つである、特許請求の範囲第１５項に記載の抗原。 - （１７）アラクロール（ａｌａｃｈｌｏｒ）とＢＳＡが
共有結合している結合体である、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第１６項に記載の抗原。 - （１８）アラクロール（ａｌａｃｈｌｏｒ）とヒツジＩ
ｇＧが共有結合している結合体である、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第１６項に記載の抗原。 - （１９）ハプテンはブタクロール（ｂｕｔａｃｈｌｏｒ
）である、特許請求の範囲第１６項に記載の抗原。 - （２０）ハプテンはメトラクロール（ｍｅｔｏｌａｃｈ
ｌｏｒ）である、特許請求の範囲第１６項に記載の抗原
。 - （２１）ハプテンはプレチラクロール（ｐｒｅｔｉｌａ
ｃｈｌｏｒ）である、特許請求の範囲第１６項に記載の
抗原。 - （２２）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
か１項又は第９項に記載のハプテンに対する抗体を含有
する抗血清。 - （２３）ＥＬＩＳＡ法により試料中のα−ハロアセトア
ミドの量を検出及び測定するための免疫化学的方法。 - （２４）α−ハロアセトアミドは式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＡはＣ＿１＿−＿４の直鎖又は分岐鎖アルキレ
ニルラジカルで、ｎはゼロ又は１であり；Ｒ＿３は水素
、Ｃ＿１＿−＿５アルキル又はハロアルキル；又はＣ＿
１＿−＿６アシル又はアシルアミド；又は１０個以下の
環原子（このうち１−３個は窒素、酸素及び／又はイオ
ウ原子でもよい）を有し、随時Ｃ＿１＿−＿５アルキル
又はアルコキシラジカルで置換された複素環又は複素環
メチルラジカル；又は−ＯＲ＿５ラジカル（ここでＲ＿
５はＣ＿１＿−＿６アルキル、ハロアルキル、又はアル
コキシアルキルラジカルである）であり、Ｒ＿４はＲ＿
５ラジカル、ＣＦ＿３、ＮＯ＿２又は５個以下の炭素原
子を有するアルコキシラジカルであり、ｍは０−５であ
る）のα−クロロアセトアニリドである、特許請求の範
囲第２３項に記載の方法。 - （２５）α−クロロアセトアニリドは、アセトクロール
（ａｃｅｔｏｃｈｌｏｒ）、アラクロール（ａｌａｃｈ
ｌｏｒ）、アリドクロール（ａｌｌｉｄｏｃｈｌｏｒ）
、アミドクロール（ａｍｉｄｏｃｈｌｏｒ）、ブタクロ
ール（ｂｕｔａｃｈｌｏｒ）、メタゾクロール（ｍｅｔ
ａｚｏｃｈｌｏｒ）、メトラクロール（ｍｅｔｏｌａｃ
ｈｌｏｒ）、プレチラクロール（ｐｒｅｔｉ−ｌａｃｈ
ｌｏｒ）、又はプロパクロール（ｐｒｏｐａｃｈｌｏｒ
）である、特許請求の範囲第２４項に記載の方法。 - （２６）α−クロロアセトアニリドはアラクロール（ａ
ｌａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第２５項に記載
の方法。 - （２７）α−クロロアセトアニリドはブタクロール（ｂ
ｕｔａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第２５項に記
載の方法。 - （２８）α−クロロアセトアニリドはメトラクロール（
ｍｅｔｏｌａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第２５
項に記載の方法。 - （２９）α−クロロアセトアニリドはプレチラクロール
（ｐｒｅｔｉｌａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第
２３項に記載の方法。 - （３０）α−クロロアセトアニリドはアセトクロール（
ａｃｅｔｏｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第２３項
に記載の方法。 - （３１）α−クロロアセトアミドはアミドクロール（ａ
ｍｉｄｏｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第２３項に
記載の方法。 - （３２）ＥＬＩＳＡ法による、少なくとも１つのα−ハ
ロアセトアミドを含有する可能性のある試料の免疫化学
的測定キットにおいて、 １、α−ハロアセトアミドに特異的な抗体、 ２、固相に固定化されたα−ハロアセトアミド−蛋白結
合体、 ３、該抗体を認識し反応する抗免疫グロブリン酵素標識
試薬、及び該測定系において酵素の活性を停止及び測定
する方法（例えば、希硫酸又は炭酸停止緩衝液及びグリ
シン停止緩衝液及び比色測定）、 ４、既知量の適当なα−ハロアセトアミドを含有する標
準物質、 ５、試験液中の試薬を希釈するための緩衝液、及び ６、溶液３の酵素用の基質液 よりなる、免疫化学的測定キット。 - （３３）α−ハロアセトアミドは、アラクロール（ａｌ
ａ−ｃｈｌｏｒ）、ブタクロール（ｂｕｔａｃｈｌｏｒ
）、アセトクロール（ａｃｅｔｏｃｈｌｏｒ）、アミド
クロール（ａｍｉ−ｄｏｃｈｌｏｒ）、メトラクロール
（ｍｅｔｏｌａｃｈｌｏｒ）、プレチラクロール（ｐｒ
ｅｔｉｌａｃｈｌｏｒ）及びプロパクロール（ｐｒｏｐ
ａｃｈｌｏｒ）よりなる群から選ばれる、特許請求の範
囲第３２項に記載のキット。 - （３４）α−ハロアセトアミドはアラクロール（ａｌａ
−ｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３３項に記載の
キット。 - （３５）α−ハロアセトアミドはブタクロール（ｂｕｔ
ａ−ｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３３項に記載
のキット。 - （３６）α−ハロアセトアミドはアセトクロール（ａｃ
ｅｔｏｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３３項に記
載のキット。 - （３７）α−ハロアセトアミドはメトラクロール（ｍｅ
ｔｏｌａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３３項に
記載のキット。 - （３８）α−ハロアセトアミドはプレチラクロール（ｐ
ｒｅｔｉｌａｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３３
項に記載のキット。 - （３９）α−ハロアセトアミドはアミドクロール（ａｍ
ｉｄｏｃｈｌｏｒ）である特許請求の範囲第３３項に記
載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JPH087211B2 JPH087211B2 (ja) | 1996-01-29 |
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| CN106841598B (zh) * | 2017-04-17 | 2019-02-19 | 四川精卫食品检测科技有限公司 | 一种乙草胺检测酶联免疫试剂盒 |
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| CA1340525C (en) | 1999-05-04 |
| NZ228854A (en) | 1991-05-28 |
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