PT92828B - Metodo de ensaio relativo a receptores de ligandos limite - Google Patents

Metodo de ensaio relativo a receptores de ligandos limite Download PDF

Info

Publication number
PT92828B
PT92828B PT92828A PT9282890A PT92828B PT 92828 B PT92828 B PT 92828B PT 92828 A PT92828 A PT 92828A PT 9282890 A PT9282890 A PT 9282890A PT 92828 B PT92828 B PT 92828B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
ligand
receptor
conjugate
reaction mixture
concentration
Prior art date
Application number
PT92828A
Other languages
English (en)
Other versions
PT92828A (pt
Inventor
Kenneth Francis Buechler
Gunars Edward Valkirs
Richard Ray Anderson
Original Assignee
Biosite Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biosite Diagnostics Inc filed Critical Biosite Diagnostics Inc
Publication of PT92828A publication Critical patent/PT92828A/pt
Publication of PT92828B publication Critical patent/PT92828B/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/805—Test papers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/967—Standards, controls, materials, e.g. validation studies, buffer systems
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/81—Tube, bottle, or dipstick
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

BIOSITE DIAGNOSTICS, INC.
MÉTODO DE ENSAIO RELATIVO A RECEPTORES DE LIGANDOS LIMITE
a. contacto da referida amostra de fluido com o conjugado de análogo do ligando e o receptor do ligando, de modo a formar uma mistura reaccional, sendo as quantidades relativas do conjugado de análogo do ligando e de receptor do ligando tais que, na ausência de ligando alvo, e a seguir à ligação substancialmente de equilíbrio, substancialmente todo o conjugado de análogo do ligando é ligado ao receptor do ligando ;
b. detecção do conjugado de análogo do ligando não ligado;
c. relação do sinal detectável com a presença ou a quantidade de ligando alvo na amostra de fluido.
Num modelo de realização também se emprega um meio facultativo para remover o receptor da mistura de reacção. Em tipos de ensaio reivindicados idênticos o analito que interessa pode ser, quer receptor de ligando , quer ligando.
presente requerimento de patente constitui a continuação do requerimento da patente norte-americana N° 295.560, depositado em 10 de janeiro de 1989, para o qual se reivindica a prioridade.
Âmbito do Invento
O presente invento refere-se a ensaios para receptores de ligandos incluindo imuno-ensaios para a detecção de analitos seleccionados, numa amostra de fluido. Mais especialmete, o presente invento diz respeito a métodos capazes de estabelecerem valores-limiares para a emissão de sinais no âmbito de ensaios para receptores de ligandos , que estejam relacionados com concentrações do ligando durante ensaios para receptores de ligandos. O ensaio de acordo com o presente invento poderá ser utilizado para a obtenção de determinações semi-quantitativas e quantitativas para um ou mais ligandos-alvo, num único esquema experimental, sem necessidade de se receorrer a qualquer aparelhagem para a detecção de sinais. O presente invento refere-se também a métodos capazes de permitir a quantificação das concentrações de ligandos em amostras, por meio de um único ponto de calibração, com o auxilio de um instrumento de medição. Nestes esquemas experimentais, a intensidade do sinal está directamente relacionada com tração do ligando presente na amostra.
a concen-4-
Antecedentes do invento termo ensaio de 'receptor de ligando tal como é empregado no presente invento, refere-se a um ensaio para a detecção de um analito, susceptivel de ser identificado através da formação de um complexo entre um ligando e uma outra substância, susceptivel de interacção especifica com aguele ligando, isto é, o receptor do ligando. 0 ligando poderá ser a própria entidade que se pretende identificar (analito) ou poderá ser uma substância gue, quando detectada, pode ser utilizada para descobrir a presença do analito numa amostra. No âmbito do presente invento, o termo de 'ligando' abrange hapetnos, hormonas, antigénios, anticorpos, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN), metabolitos dos compostos/materiais atrás referidos e outras substâncias, quer de origem natural quer de origem sintética , que poderão ter especial intereesse diagnóstico e que possuem um parceiro de ligação especifico isto é , o receptor do ligando, no âmbito do referido ensaio para o receptor e ligando. No contexto do presente invento, o termo de ‘receptor de ligando' abrange materiais para os quais existe um parceiro de ligação especifico, isto é, o ligando do ensaio para o receptor do ligando. Os técnicos do ramo irão facilmente apreceber-se de que o analito que interessa, um membro de um par de ligação especifico, poderá ser quer o receptor do ligando ou o ligando, consoante a organização do ensaio.
Geralmente , os ensaios para os recepto res de ligandos são apropriados para o doseamento/determinação in vitro, da presença e da concentração de ligandos nos fluidos corporais, produtos alimentares , fluidos aniumais bem como de amostras provenientes do meio ambiente.
Assim , por ex., o doseamento de entidades especificas, tais como hormonas, proteínas, preparados farmacêuticos e drogas tóxicas (toxinas) presentes no sangue humano ou na urina humana , tem vindo a melhorar de forma significativa e diagnóstico médico de afecções que ocorrem no corpo humano. Existe uma procura cada vez maior para ensaios simples, rápidos, para a determinação qualitativa, para o doseamento semi-quantitativo e quantitativo destes ligandos presentes numa amostra. Além disso, em muitas situações, , ensaios deste género terão de ser suficientemente simples para que possam ser efectuados e interpretados por pessoal não-especializado.
Os ensaios para receptores ligandos baseiam-se na ligação de ligandos a receptores , permitindo a determinação da concentração dos ligandos presentes numa dada amostra. Os ensaios para receptores de ligandos podem ser encarados como sendo compeptivos ou não-competitivos, geralmente, nos ensaios não-compeptivos. Geralmente, nos ensaios não-competitivos utilizam-se receptores num excesso substancial em relação à concentração do ligando que se pretende dosear durante o ensaio. Exemplos de ensaios não-compeptitivos são os chamados ensaios 'sandwich' em que o ligando é detectado através da sua ligação a dois receptores; um receptor é marcado radioactivamente para permitir a detecção e um segundo receptor encontra-se frequentemente, ligado a uma fase sólida, para facilitar a separação dos reagentes não-ligados, tais como o primeiro receptor marcado e não-ligado.
Os ensaios competitivos compreendem geralmente, um ligando da amostra, um análogo do ligando marcado, para permitir a detecção e a competição destas espécies de unidades relativamente a um número limitado de locais de ligação apresentados pelo receptor do ligando.
os técnicos do ramo compreenderão de que muitas variações desta situação de competição básica já foram descritas , pelo que não serão discutidas pormenori zadamente na presente memória, a não ser que isso seja rele vante para os objectivos gerais do presente invento. Exempl de ligandos, que sãoçpralmente quantificados por meio de ensaios competitivos de receptores e ligandos , incluem haptenos , hormonas e proteínas.
Anticorpos, que são capazes de se combinarem com estas classes de ligandos , utilizam-se frequentemente nestes ensaios como receptores de ligandos.
Além disso, os ensaios competitivos para receptores de ligandos podem ainda ser identificados e classificados em ensaios homogéneos e heterogéneos. Nos ensaios homogéneos , todos os reagentes que intervêm nas reacções de competição são misturados entre si , determinando-se a quantidade do ligando através do seu efeito sobrea extensão da ligação entre o receptor do ligando e o análogo do ligando marcado.
O sinal observado é modulado pela extensão desta ligação e pode ser relacionado com a quantidade de ligando presente na amostra. A patente norte-americana Νθ 3.817.837 descreve um imunoensaio competitivo, homogéneo, deste género, em que o análogo do ligando mamado é um conjugado de ligando e enzima e o receptor do ligando é um anticorpo capaz de se ligar guer ao ligando guer ao análogo do ligando.
A ligação do anticorpo ao conjugado de ligando e enzima faz diminuir a actividade da enzima relativamente â actividade gue se observa guando a enzima se encontra no estado não-ligado.
-Ί-
Ειτι virtude da competição existente entre o ligando não-ligado e o conjugado de ligando-enzima relativamente a locais de ligação, no anticorpo, verifica-se que - à medida que vai aumentando a concentração do ligando - também aumenta a quzntidade do conjugado de ligando-enzima não-ligado , pelo que se regista uma intensificação do sina)l emitido. Em seguida, o produto da reacção enzimática poderá ser medido pela sua cintética lançando mão de um espectrofotómetro.
De uma maneira geral , os sistemas de ensaios homogéneos requerem tanto a presença de um instrumento para a leitura do resultado, como a calibração do sinal observado, mediante vários testes separados, com amostras contendo concentrações conhecidas de ligando. A elaboração/idealização de ensaios homogéneos tem vindo a dominar os trabalhos de investigação no dominio dos ensaios competitivos , dando origem a vários sistemas de ensaios que se podem adquirir ao comércio da eqaecialidade. No entanto , estes sistemas de ensaios não conseguem fornecer resultados para a determinação de ligandos múltiplos numa amostra, no âmbito de um teste único, que não necessite a presença de instrumentos.
Os ensaios competitivos , heterogéneos , para receptores de ligandos tornam necessário a separação do ligando marcado ligado ou do receptor a partir do ligando marcado livre ou a partir do receptor livre , bem como a medição, quer da fracção ligada, quer da fracção livre. Métodos para a realização destes ensaios vêm referidos nas patentes norte-americanas nos. 3.654.090,4298.685 e 4.506 .009 .
No entanto, métodos deste género não conseguem dar resultados semi-quantitativos ou quantitativos
para a determinação de ligandos numa amostra, exigindo a realização de ensaios adicionais para calibrar a resposta do ensaio.
A necessidade da existência de ensaios para receptores de ligandos gue possam ser efectuados sem o auxilio de instrumentos, tem vindo a fazer surgir imunoensaios simples de executar , e gue dêem uma resposta gue possa ser interpretado por simples observação visual. As patentes norte-americanas nos. 3.654.090, 4.298.685 e 4.506.009. revelam dispositivos e métodos para ensaios de receptores de ligandos , dando reçostas sob a forma de cores, gue possibilitam uma interpretação visual dos resultados . Enguanto tais dispositivos fornecem formatos simples para a interpretação visual dos resultados dos ensaios eles permitem apenas a determinação da presença ou ausência do ligando; as determinações semi-guantitativas ou quantitativas que utilizam os referidos métodos exigem a realização de ensaios separados, com padrões de concentrações conhec das, a fim de se poder estabelecer a correlação entre a resposta observada e a concentração do ligando.
Foram também idealizados métodos para a calibração interna de ensaios de receptores de ligandos, que colocam à disposição do utente dispositivos que apresentam zonas de referência, onde a resposta na zona de referência representa a resposta do ensaio (a sensibilidade do ensaio) relativamente a uma concentração especifica de ligando. A resposta gerada pela concentração desconhecida do ligando na amostra numa zona do ensaio é comparada com a resposta na zona de referência para se poder determinar a concentração do ligando na amostra, quer de forma semi-quantitativa ou quantitativa. O requerimento de patente europeia NS 87302403.8 descreve métodos para a utilização das citadas zonas de referência internas, no âmbito de ensaios 'sandwich' não-competitivos, fornecendo determinações semi-quantitativas por meio da leitura visual dos resultados e determinações quantitativas através da leitura, mediante instrumentos de medição, dos resultados obtidos.
A patente norte-americana N° 4.540.659 e o requerimento de patente europeia NQ 85307785.7 descrevem sistemas dotados de referências que dão a possibiolidade de proceder a doseamentos semi-quantitativos, no âmbito de ensaios competitivos de receptores de ligandos , os quais podem ser interpretados visualmente. Ambos estes sistemas dão uma interpretação visual da quantidade do análogo do ligando marcado que está combinado com o receptor imobilizado numa fase sólida.
Na utilização das técnicas referidas para os ensaios competitivos de receptores e ligandos , verifica-se de que a intensidade da cor resultante está numa relação inversa com a concentração do ligando presente na amostra, de modo tal que os resultados dos ensaios que se manifestem por uma intensificação cromática maior do que a da referência são interpretados no sentido de significar de que a amostra continha o ligando numa concentração inferior àquela representada pela concentração da entidade de referência. No ertanto, esta relação inversa entre a intensidade do sinal emitido e a concentração do ligando na amostra tem sido uma grande desvantagem para a utilização generalizada destes ensaios competitivos de receptores de ligandos, cujos resultados são interpretados visualmente. Esta correlação implica de que uma amostra com uma baixa concentração de ligando irá emitir um sinal forte no ensaio; e, em contrapartida, uma amostra com uma elevada concentração de ligando irá emitir um sinal fraco no ensaio.
Uma outra desvantagem destes ensaios reside na seguinte consideração e sua consequente ilação: se através de um ensaio único se pretende determinar ao mesmo tempo vários ligandos, a cada um dos quais deverá ser atribuído um valor semi-quantitativo e cada um dos quais apresenta valores-aLvo individuais, específicos, para a sua concentração, seria necessária a existência de várias zonas de referência especificas para cada ligando que se pretende dosear. Nestas circunstâncias, torna-se difícil elaborar um ensaio para ligandos múltiplos, cuja interpretação seria complexa.
Nos requerimentos das patentes europeias N°s 87309723.2 e 87309724.0, bem como no requerimento de PCT NS PCT / US 86 7 00668 (número de publicação internacional WO 86/06170) descrem-se métodos segundo os quais não se emitem quaisquer sinais no ensaio antes de o ligando na amostra ultrapassar uma concentração préviamente determinada. Os referidos métodos lançam mão de receptores de ligandos imobilizados numa fase sólida através de uma configuração experimental que permita o contacto do ligando na amostra e do conjugado de análogo do ligando com os receptores imobilizados. O contacto processa-se por meio de cromatografia de modo tal que o liquido que contém o ligando seja induzido a atravessar o sistema da fase sólida num determinado sentido. A capacidade de ligação da fase sólida ajusta-se de maneira empírica , por forma a que uma quantidade préviamente determinada do ligando seja unida à fase sólida durante a passagem do fluido, contendo o ligando, através da fase sólida. Nestes métodos ou esquemas experimentais, o ligando, o conjugado de análogo e ligando e o sistema do receptor imobilizado não atingem o equilíbrio durante o processo do ensaio. Os técnicos do ramo fácilmente se aperceberão de que a capacidade de ligação do receptor imobilizado depende muito das condições da imobilização
(fixação) e do seu efeito sobre a afinidade do receptor para o ligando, bem como depende do periodo durante o qual o ligando e o conjugado de análogo do ligando sejam capazes de se combinarem com o receptor imobilizado. Dado que estes métodos se fundamentam condições nas quais é inexistente qualquer estado de equilíbrio, a idelaização e realização destes ensaios se torna um tanto imprevisíveis e difíceis de reproduzir. De acordo com o presente invento, utilizam-se métodos em equilíbrio para se poder prever a capacidade dos ensaios, a fim de que seja simples a concepção técnica do ensaio e que se poseam realizar os ensaios em condições que permitam a reprodutibilidade dos seus resultados .
Além disso, o presente invento refere-se à idealização de métodos simplificados para o ensaio (doseamento) de ligandos, que deem resultados quantitativos, os Técnicos na matéria saberão certamente de que os ensaios quantitativos (doseamentos) requerem uma calibração para se conseguirem resultados exactos e correctos. Uma vez que os ensaios competitivos resultam geralmente , em funções de resposta não-lineares , necessitam-se de vários pontos de calibração para os referidos ensaios , a fim de determinar a resposta por toda a gama do ensaio, para simplificar o proces so de calibração, a técnica anterior idealizou dois métodos completamente diferentes entre si. Um destes métodos baseia-se na facto de não se reduzir o número dos calibradores e repetições de que se precisa para determinar a resposta do ensaio; reduz-se, apenas, o número de vezes que estas calibrações são executadas. Ensaios (doseamentos) deste género fundamentam-se no emprego de instrumentos/aparelhagens para a realização do ensaio e para o controlo de variáveis que afectem a resposta do ensaio, de maneira que a calibração não necessite de se realizar frequenetemente ou que esta calibração seja já efectuada pelo fabricante, dispensando o utente de qualquer tarefa neste sentido.
De acordo com o se utiliza qualquer instrumento, existi simples de calibração para tornar super de testes adicionais para calibrar a re 0 presente invento fornece novos método simples de utilizar, tanto no âmbito de mão de uma aparelhagem, como em ensaios visualmente.
segundo método, não ndo um dispositivo fula a realização sposta do ensaio, s de calibração ensaios que lançam que são interpretados método revelado na patente norte-americana NS 4.540.659 apresenta um ensaio para a quantificação de ligandos em amostras segundo o qual se relacionam proporções pré-determinadas de respostas numa superfície de calibração e numa superfície de medição com a concentração do ligando. Ao passo que este método oferece uma maneira grosseira de quantificação, não assegura a exactidão dos métodos existentes que empregam instrumentos , e não fornece qualquer resultado quantitativo a não ser quando se recorrer à utilização de instrumentos.
A patente americana N° 4.168.146 e a patente norte-americana NQ 4.435.504 descrevem um método diferente para solucionar os problemas atrás referidos , ou seja, um ensaio cromatográfico-imunológico, não-competitivo. Este ensaio oferece um método para a determinação quantitativ (doseamento) da presença de um único analito numa amostra (substância de ensaio), no âmbito de um imunoensaio que permite uma interpretação visual dos resultados, mas não permite o doseamento de vários analitos sem o recurso a dispositivos múltiplos. Além disso, na prática, este método fica limitado a ligandos cujas concentrações na amostra se apresentem elevadas relativamente a ligandos que normalmente se doseiam através de um ensaio competitivo. Por conseguinte, este género de métodos apenas é de utilidade restrita. Não há duvida de que existe uma procura crescente
para um ensaio para receptores e ligandos , capaz de determinar a presença de vários ligandos presentes numa amostra e de fornecer, ao mesmo tempo, resultados semi-quantitativos individuais, em relação a cada um dos ligandos.
Além disso, um ensaio deste género deveria fornecer resultados sob a forma de listagens (formato) suficientemente simples para que um utente não-especializado as possa correctamente obter e interpretar.
Existe ainda uma necessidade cada vez maior para métodos de ensaio quantitativos, de aplicações múltiplas, fácilmente realizáveis e interpretáveis. Os ensaios do presente invento vão ao encontro destas necessidades .
O presente invento refere-se a um método para realizar ensaios competitivos para receptores e ligandos (competições ou reacção de competição 'ligando-receptor 1 ) que permitem determinar, em termos semi-quantitativos ou quantitativos, a concentração do ligando. O processo ou método do presente invento permite a realização do doseamento do ligando-alvo por forma a que a concentração do ligando seja determinada relativamente a uma concentração especificada internamente, ou seja, a concentraçãolimiar. A concentração-limiar poderá ser préviamente escolhida de maneira arbitrária para que seja equivalente a qualquer concentração que é apropriada para o ligando que interessar e que serve como ponto de calibração para o doseamento deste ligando. 0 presente invento idealiza métodos quantitativos que utilizam a concentração-limiar como um ponto de calibração para permitir a realização de métodos mais simples de quantificação. Além disso, o presente invento apresenta um método para realizar ensaios competitivos para receptores de ligandos destinados ao doseamento simultâneo de vários ligandos; neste caso , cada doseamento in-14-
clui uma concentração-limiar interno (padrão interno) especificamente atribuída ao respectivo ligando. Uma forma de realização do presente invento consiste num método para realizar ensaios competitivos para receptores e ligandos. destinados ao doseamento simultâneo de uma série de ligandos em que cada doseamento inclui uma colecção de concentrações-limiares internas , especificamente destinadas ao respectivo ligando. O método do presente invento assegura que o doseamento das concentrações possa ser realizado de forma simples e fácilmente interpretado.
Resumo do Invento presente invento refere-se a ensaio de receptores e ligandos, constituído por 3 elementos principais e por um elemento adicional, facultativo:
1) Uma fase reaccional e mistura reaccional;
2) Um meio facultativo para remover as entidades seleccionadas da mistura da reacção;
) Uma fase sólida terminal, e ) Uma fase de desenvolvimento de sinal .
Em parte, a fase reaccional compreende o receptor para o ligando-alvo e o conjugado de análogo do ligando. 0 conjugado de análogo do ligando compreende
um análogo do ligando ou análogos de ligandos , ligados ou acoplados a um elemento de desenvolvimento de sinais. A fracção ou porção de análogo do ligando constituinte do conjugado de análogo do ligando, é capaz de competir com um ligando-alvo relativamente a um número limitado de locais de ligação presentes no receptor do ligando.
Forma-se uma mistura reaccional a partir da amostra e da fase reaccional , que abrange o conjugado de análogo e ligando e o receptor do ligando. As quantidades do receptor do ligando e do conjugado de análogo e ligando são seleccionadas de modo tal que à medida que a mistura reaccional se aproximar, mais ou menos , das condições em que as ligações se façam em equilíbrio, práticamente a totalidade do conjugado de análogo do ligando seja combinada com o receptor do ligando , se o ligando estiver presente numa concentração inferior à concentração-limiar.
Em seguida, a mistura da reacção é posta em contacto com o elemento seguinte do ensaio para receptores e ligandos.
a mistura com um meio
Nesta altura do ensaio reaccional poderá ser posta em contacto , quer facultativo para remover o receptor do ligando da mistura reaccional , quer poderá ser posta imediatamente em contacto com a fase sólida terminal. A necessidade de existir ou não qualquer meio facultativo depende de uma série de factores , inclusivé da natureza do analito em questão , das suas concentrações e da 'configuração' 'apresentação' do ensaio especifico, escolhido, (formato).
meio facultativo poderá ser utilizado com vantagem, por ex., num ensaio de ligandos, em que a gama de concentrações que se pretende abranger seja tão vasta a resultar num efeito hook (efeito de obliteração de resultados).
presente invento revela formatos de ensaios específicos que utilizam um meio ou dispositivo facultativo.
Outras aplicações serão facilmente intuiveis aos técnicos do ramo. Tal como se adopta na presente memória, o termo 'meio facultativo' significa um dispositivo ou uma substância que possa ser associada de forma articulada e efectiva (isto é, poderá formar um complexo com ) um receptor dirigido a um receptor do ligando , isto é , um receptor (receptor do ligando).
Assim , quanto a mistura reaccional esteja em contacto com o dispositivo facultativo, o receptor (receptor do ligando) combina-se com todas as espécies (entidades) associadas com o receptor do ligando. Na mistura reaccional , isto abrange o receptor do ligando, o complexo entre o ligando: receptor do ligando, e o complexo entre o conjugado de análogo do ligando: receptor de ligando.
Numa disposição alternativa, o meio facultativo poderá ser parte integrante da fase reaccional , ou ele poderá ser introduzido na mistura reaccional durante o período em que o equilíbrio esteja a estabelecer-se.
Em seguida, a mistura reaccional entra em contacto com a fase sólida terminal . A fase sólida terminal apresenta o receptor do ligando, imobilizado, não-difusor, que é capaz de se ligar ao ligando existente ou ao conjugado de análogo do ligando presente. Uma fracção de ligando e do conjugado de análogo do ligando, que não esteja ligada ao receptor do ligando, na mistura reaccional, combina-se depois com o receptor do ligado imobilizado na fase sólida terminal. Se for necessário, poder-se-à remover o resto da mistura reaccional, mediante uma operação
de lavagem. A operação de lavagem afasta gualquer conjugado de análogo e ligando não unido ao receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal ,assim , apenas permanece o conjugado de análogo e ligando combinado com a fase sólida terminal.
Em seguida, a fase sólida terminal, que contém agora o complexo entre o conjugado de análogo e ligando: receptor do ligando, é posta em contacto com uma fase de desenvolvimento de sinais. A fase de desenvolvimento de sinais faz com que o elemento de desenvdvimento de sinais do conjugado de análogo do ligando, ligado à fase sólida, passa a emitir um sinal detectável. A interpretação do sinal detectável processa-se de modo que a ausência de qualquer sinal detectável assinala gue o ligando-alvo não está presente na amostra ou que o ligando-alvo está presente na amostra numa concentração inferior à concentração-limiar. Por outro lado, um sinal detectável indica a presença do ligando-alvo , quer numa concentração substanci^l_ mente equivalente, ou superior à concentração-limiar.
presente invento permite a realização de métodos de calibração simples , através dos quais é possível determinar em termos quantitativos a concentração do ligando.
Definições :
Para uma apreciação dos significados dos termos utilizados nas reivindicações e na memória descritiva serve a seguinte enumeração de termos técnicos adoptados neste invento:
Ligando: Par de ligação para o receptor do ligando.
Análogo do ligando: Um derivado guimico do ligando-alvo , que se pode ligar, quer por uma ligação covalente , quer não-covalente, a outras espécies (entidades), por ex., ao elemento de desenvolvimento de sinais. 0 análogo do ligando e o ligando poderão ser idênticos , e ambos são capazes de se ligarem ao receptor do ligando.
Receptor do ligando: Receptor capaz de se combinar com o ligando, especialmente um anticorpo, mas que poderá ser um ligando .
Conjugado de análogo do ligando: Um conjugado de um análogo do ligando e de um elemento de desenvolvimento de sinais.
Elemento de desenvolvimento de sinais: análogo do ligando que, em conjunto com mento de sinais , gera o sinal detectável uma enzima.
Aquele elemento de a fase de desenvolvi , por ex.,
Concentração-limiar: A concentração de um ligando numa amostra, que dá origem ao desenvolvimento ou à emissão do primeiro sinal detectável. Uma concentração-limiar cons-19-
titui um ponto de referência para a concentração.
Fase reaccional: A fase que normalmente contém o conjugado de análogo do ligando, por ex., conjugado entre hapteno-enzima, e o receptor do ligando, por ex., um anticorpo.
Mistura reaccional: A mistura da amostra de que se suspeita conter o analito-alvo e da fase reaccional.
Complexo entre ligando/receptor do ligando: 0 complexo que se forma quando o ligando se combina com o receptor do ligando. Complexo entre o conjugado de análogo do ligando e o receptor do ligando: O complexo que se forma quando o conjugado de análogo do ligando se combina com o receptor do ligando.
Meio facultativo: Um meio/dispositivo facultativo, que está associado, funcionalmente, com um receptor, por ex., um anticorpo capaz de se ligar a componentes selecionados da mistura reaccioraL .
Fase sólida terminal: A fase sólida na qual se gera definitivamente o sinal durante a etapa do desenvolvimento do sinal.
Fase de desenvolvimento de sinais: A fase contendo os materiais através dos quais o elemento de desenvolvimento de sinais pode criar ou gerar sinais, por ex., uma solução so substracto para a enzima.
Complemento do ligando: Um ligando especifico utilizado na marcação radioactiva de conjugados de análogos de ligandos , de receptores, estruturas de análogos de ligandos ou elementos de desenvolvimento de sinais.
Receptor do complemento do ligando: Um receptor para o complemento do ligando.
Conjugado entre o análogo do ligando e o complemento do ligando: Um conjugado constituído por um análogo do ligando, um complemento do ligando e um elemento de desenvolvimento de sinais.
Ligando de referência: Um complemento do ligando utilizado para produzir um conjugado do ligando de referência para ser usado na fixação de um ponto para a concentração de referência.
Receptor de referência: Um receptor capaz de se ligar ao ligando de referência.
Conjugado do ligando de referência: Um conjugado constituído por um ligando de referência e por um elemento de desenvolvimento de sinais.
Concentração de referência: Uma concentração de referência pode ser estabelecida através de um conjugado do ligando de referência e de um receptor de referência. Usa-se em conjunto com a concentração-limiar para definir uma gama de concentrações .
Ligando-testemunha negativo: Um complemento do ligando usado para produzir um conjugado-testemunha do ligando negativo.
Um ligando de controlo negativo (ligando-testemunha negativo) e um receptor (-de ligando de controlo negativo) proporcionam um meio para assegurar a validade de um resultado obtido num determinado ensaio.
Receptor de (ligando de controlo negativo): Um receptor capaz de se combinar um ligando de controlo negativo (ligando-testemunha negativo).
Conjugado do receptor do ligando: Um conjugado de um receptor do ligando e de um elemento de desenvolvimento de sinais .
Estrutura de análogo do ligando: Um análogo do ligando ligado a uma fase sólida ou a uma outra molécula, de forma tal que aquando da sua ligação ao conjugado do receptor do ligando, o conjugado do receptor do ligando seja impedido de se combinar com o análogo do ligando imobilizado na fase sólida terminal.
Descrição sumária dos desenhos
A figura 1 apresenta um gráfico que mostra a fracção do ligando total não-combinado como função de ligando total. Este gráfico demonstra de que, à medida que aumenta o valor de K relativamente ao valor de L e R, a forma funcional de um diagrama (traçado) do ligando livre, como função da concentração de ligando total, aproximar-se-à de uma função de degrau.
A figura 2 é um gráfico que apresenta o efeito da variação na concentração do receptor do ligando. 0 gráfico demonstra de que o aumento do valor de R implica também a subida da concentração do ligando correspondente à posição do degrau.
A figura 3 representa um gráfico que evidencia a função de resposta para ensaios de receptores de ligandos , em que as constantes de ligação em equilibri não são substancialmente equivalentes para a ligação do ligan ao receptor do ligando e para a ligação do conjugado de análogo do ligando ao receptor do ligando. A concentração de locais de ligação no receptor é de 0,1 expressa em unidades de 1/K.
o do
Α figura 4 apresenta um gráfico que demonstra as funções de resposta para ensaios de receptores de ligandos , traçadas como função da razão da fracção livre de conjugado de análogo do ligando para a fracção ligada de conjugado de análogo do ligando relativamente à concentração do ligando. 0 gráfico mostra que à medida que aumenta o valor de R relativamente ao valor de 1/K, a razão da fracção de conjugado livre para a fracção de conjugado ligada aproxima-se de uma função linear da concentração do ligando acima da concentração-limiar.
A Figura 5 mostra um gráfico que apresenta a função de resposta para um ensaio de receptores e ligandos , traçada sob a forma de uma função da razão da fracção livre para a fracção ligada do ligando relativamente à concentração de ligando , em comparação com uma função linear derivada teoricamente. 0 gráfico demonstra de que a aproximação linear condiz muito bem com a resposta do ensaio nas referidas condições.
A figura 6 apresenta um gráfico que mostra a diferença da função da concentração, derivada teoricamente da razão da curva de resposta das fracções de ligando livre para as fracções de ligando ligada, e de uma função da concentração linear teórica como uma função da concentração do ligando. Mostra o gráfico de que o erro introduzido pela aproximação linear pode ser minimizado através de práticamente toda a gama do ensaio.
Descrição pormenorizada do invento
Nesta parte da memória descritiva irão ser explicados em pormenor os referidos 4 elementos dos ensaios para receptores de ligandos do presente invento, isto é, 1) uma fase de reacção e uma mistura reaccional;
2) um meio facultativo para remover espécies (entidades) seleccionadas da mistura reaccional ; 3) uma fase sólida terminal e 4) uma fase de desenvolvimento de sinais.
A figura 7 é um gráfico que apresenta os resultados interpetados por meios visuais , obtidos dos ensaios ou doseamentos de amostras contendo concentrações de morfina dentro da concentração-limiar. 0 gráfico mostra de que o ensaio consegue detectar de forma segura as concentrações de morfina que se situem na referida concentração-limiar ou acima desta. A figura 8 é um gráfico que apresenta a resposta do ensaio em unidades da diferença cromática mínima ainda detectável, pela vista humana, como função da concentração de morfina na amostra. 0 gráfico mostra de que a cor da resposta do ensaio se torna primeiro visível (limite da detecçâo visual representado sob a forma de traços horizontais) na concentração-limiar, e a resposta do ensaio aumenta ou intensifica-se rápidamente em função da concentração de morfina presente na amostra.
-24Fase e mistura reaccionais
Geralmente, a fase reaccional contém tanto um conjugado de análogo do ligando constituido por um conjugado de um análogo do ligando e por um elemento de desenvolvimento de sinais, como um receptor do ligando.
De acordo com uma forma de realização preferida do presente invento, utiliza-se o receptor do ligando na fase reaccional, imobilizado numa fase sólida não-difusora. Segundo uma forma de realização especialmente preferida do presente invento, o receptor do ligando não se encontra imobilizado numa fase sólida não-difusora, pelo que poderá difundir livremente na solução .
Geralmente , os métodos para a preparação dos primeiros reagentes da fase reaccional do present^ invento baseia-se na ponderação dos seguintes factores. O acoplamento do análogo do ligando ao elemento de desenvolvimento de sinais, que dá origem ao conjugado de análogo do invento, deverá realizar-se de modo tal que não fique muito afectada a identificação do análogo do ligando acoplado pelo receptor do ligando que se dirige ao ligando não-acoplado. 0 número de ligandos acoplados a um elemento de desenvdvimento de sinais deverá ser suficientemente elevado para garantir que a capacidade do conjugado de análogo do ligando de competir com o ligando relatívamente a locais de ligação, presentes no receptor do ligando, não seja substancialmente comprometida. De igual modo, o número de análogos do ligando acoplados a um elemento de desenvolvimento de sinais não deverá ser tão grande que possa prejudicar substancialmente a capacidade do ligando de competir com o conjugado de análogo do ligando para locais de ligação existentes no receptor do ligando.
No âmbito do presente invento , preferem-se conjugados de análogos de ligandos , em que o número de análogos de ligandos acoplados ao elemento de desenvolvimen to de sinais varia entre 1 e 50. Para os efeitos do presente invento preferem-se sobretudo os conjugados de análogos de ligandos, em que o número de análogos de ligandos conjugados com o elemento de desenvolvimento de sinais varia entre 1 e 10 .
Um elemento de desenvolvimento de sinais representa um elemento capaz de gerar um sinal detectável. Os técnicos do ramo deverão saber de que muitos elementos podem actuar como elemento de desenvolvimento de sinais ; assim , estes elementos abrangem , sem que a enumeração seja completa, radionuclídeos , particulas fluorescentes partículas fosforescentes, materiais químicos luminescentes tintas, enzimas, bem como particulas de soluções coloidais (sol), que podem incluir metais, semi-metais , compostos não-metálicos ou qualquer uma das particulas atrás referidas.
Um elemento de desenvolvimento de sinais preferido para os efeitos da presente invenção constitui um elemento capaz de emitir um sinal que possa ser detectado mediante meios que não requeiram a presença de instrumentos. Um elemento de desenvolvimento de sinais especialmente preferido é um elemento capaz de gerar um sinal que possa ser detectado através de meios visuais, por ex., uma enzima capaz de reagir com um substrato para a enzima, em que o produto da reacção enzimática é uma rrolécula que absorve radiação electromagnética na região visível do egpectro eLectromagnético.
Um elemento de desenvolvimento de sinais especialmente preferido é ouro coloidal, uma partícula de sol, colorida.
Métodos para a adsorção de proteínas a ouro coloidal vêm descritos em Georghegan, et al., J. Histochem, Cytochem
25, 1187-1200 (1977) e em Leuvering, U.S. Patent No.
4.313.734 .
Proteinas com análogos de ligandos acoplados poderão também ser adsorvidos a ouro coloidal, fornecendo um conjugado de análogo do ligando que se mostre útil no âmbito de ensaios que podem ser interpretados por meios visuais, para os efeitos do presente invento preferem-se sobretudo particulas de ouro coloidal, com um diâmetro de 10 a 80 nanómetros , e em que o número de análogos de ligandos acoplados a cada partícula varia entre 10 e 10.000 .
A selecção de receptores de ligandos com o fim de obter o reagente complementar para o conjugado de análogo do ligando deverá assentar no conhecimento dos factores que influem nas curvas das funções de respostas no âmbito de ensaios para receptores de ligandos competitivos , em condições de saturação. Alguns desses factores são discutidos em R.P. Ekins, G.B. Newman and J.L.H. O' Riordan, Theoretical Aspects of Saturation and Radioimmunoassay, Radioisotopes in Medicine: In Vitro Studies, R.L. Hayes , F.A. Goswitz and B.E.P. Murphy , Eds. U.S. Atomic Energy Commission Oak Ridge, Tenn., 59-100 (1968), que se incorporam no presente invento a titulo de referência.
(Todas as referências que irão ser mencionadas mais adiante estão incorporadas no presente invento a titulo de referência). Entre os citados factores revestem-se de especial interesse a constante de ligação de equilíbrio do receptor do ligando para o ligando, bem como a extensão (largura) da função que define a distribuição das constantes de ligação de equilíbrio para o referido conjunto de receptores de ligandos.
Para a utilização como receptores de ligandos no âmbito do imunoensaios preferem-se anticorpos e anticorpos monoclonais são especialmente preferidos como anticorpos utilizados como receptores de ligandos.
Os técnicos do ramo conhecem certamente os métodos para a obtenção de anticorpos monoclonais.
Podem obter-se prontamente anticorpos monoclonais com 8 — 1 ccnstantes de ligação superiores a 10 M e, em virtude de serem anticorpos monoclonais, os conjuntos de anticorpos derivados a partir de uma única linhagem celular e orientados para um ligando especifico, podem ser cultivados e obtidos com constantes de ligação em equilíbrio que apresentam uma margem estreita dos seus valores extremos.
Ekins et al., conseguiram demonstrar de que a forma geral da reacção que se refere à ligação ou captação de um ligando por um receptor desse ligando , escolhido de um conjunto dos referidos receptores de ligandos , poderá ser expressa através da fórmula
L + R. = LR. ι 1 onde L representa o ligando e R^ representa o local de ligação i espécie de receptor do ligando , em que i = l,2,3,...n. A expressão que descreve a ligação de equilíbrio é dada sob a forma de Ki L LJ L Ri_7 = / LRí_7 em que fC representa a constante de ligação de equilíbrio que descreve a reacção, em que se combina com L. Admitindo o caso mais simples, em que todos os símbolos R^ apresentem constantes de ligação de equilíbrio idênticas , poderá chegar-se a uma solução especifica (restrita) para a expressão, a fim de se relacionar a fracção de ligando não-combinado com a quantidade total de ligando, para uma
quantidade fixa de receptor. Esta situação tem especial interesse no caso em que as constantes de ligação de equilibrio K, para a ligação do ligando ao receptor do ligando e para a ligação do conjugado de análogo do ligando ao receptor do ligando, sejam substancialmente equivalentes. A solução em forma fechada para o caso mais simples , em que todos os símbolos FL sejam equivalentes, é dada por Ekins da seguinte maneira:
(F£/b>' f/b (1- L/R - 1/KR
1/KR = 0 em que é a razão de ligando livre para ligando ligado
L é a concentração total de ligando , R é a concentração total de locais de ligação do receptor do ligando, e K é a constante de ligação de equilibrio. Por conseguinte, o presente invento demonstra de que - à medida que aumenta o valor de R relativamente ao valor de 1/K - a forma funcional de um traçado (diagrama) de ligando livre como função da concentração total de ligando, aproxima-se de ou assemelha-se com uma função de degrau , tal como se mostra na figura 1.
Além disso, o presente invento mostra de que a curvatura no degrau está associada a relação entre a constante de ligação de equilibrio, K, e a concentração total de locais de ligação existentes no receptor do ligando, R.
Na figura 1 , a função traçada representa a fracção de ligando total que se encontra livre (não-combinado) como função de ligando total. A medida que R aumenta relativamente a 1/K, depreende-se da figura 1 de que se verifica uma subida mais drástica de degrau na fracção de ligando livre. No caso normal, escolher-se-ão receptores de ligandos dotados de uma constante de equilibrio crescente, K, a fim de ss conseguir um aumento gradual mais brusco
f/b na fracção de ligando livre.
A afinidade entre a fracção do ligando livre e a razão de ligando livre para ligando ligado F é dada pela expressão:
Lf/L - Ff/b/ (Ff/b + D presente invento aproveita estas afinidades e interrelações, e estende este conceito ainda mais , mostrando que - no caso de R ser suficientemente maior do que 1/K - então a posição da concentração do degrau é uma função dos valores relativos de R. Tal como se vê na figura 2 , qualquer aumento no valor R implica um aumento da concentração correspondente à posição do degrau.
Para aproveitar as referidas relações no âmbito de ensaios para receptores de ligandos, a concentração do conjugado de análogo do ligando e do receptor do ligando deverá ser tal que - quando postos em contacto com a amostra numa mistura reaccional - e depois de se ter estabelecido súbstancialmente a ligação de equilíbrio - na ausência de qualquer ligando na amostra , práticamente a total;, dade do conjugado de análogo do ligando se tenha combinado com o receptor do ligando. Os técnicos do ramo dar-se-ão conta de que a quantidade do receptor do ligando poderá ser escolhida por forma a que na mistura reaccional existam locais: de ligação em excesso do número necessário para a ligação de súbstancialmente todo o conjugado de análogo do ligando. Quando a quantidade de ligando na amostra ultrapassar o numero de locais de ligação em excesso , então o ligando e o conjugado de análogo do ligando começarão a entrar em competição para locais de ligação disponíveis no receptor
do ligando.
Aquela concentração do ligando na amostra que resulta no primeiro aumento detectável da quantidade de conjugado de análogo do ligando não-combinado na mistura reaccional, em condições de ligação substancialmente em equilíbrio, representa a concentração-limiar. Tal como se vê na figura 2, a concentração-limiar poderá ser escolhida através de uma selecção apropriada da concentração do receptor do ligando na mistura reaccional. A aplicação deste método aos ensaios visuais reveste-se de especial significado , dado que o produto visivel da resposta do ensaio pode ser facilmente controlado, não se observando qualquer resposta até que o ligando ultrapasse a sua concentração-limiar. Como se demonstra na figura 1, a taxa de aumento do conjugado de análogo do ligando não-ligado e a fracção de conjugado de análogo do ligando não-ligado, na presença do ligando numa concentração inferior à concentração-limiar , são determinadas através da constante de ligação de equilíbrio e da sua relação com a concentração-limiar. A constante de ligação de equilíbrio deverá ser suficientemente elevada para reduzir a resposta devida ao conjugado de análogo do ligando não-combinado a um nivel abaixo do ruído da resposta do ensaio que se apresenta em consequência da presença de outras fontes de ruidos. os peritos do ramo deverão compreender de que o conjugado de análogo do ligando, a fase de desenvolvimento de sinais, e o método do ensaio determinam, em conjunto o ruido da resposta do ensaio. Preferem-se como receptores de ligandos no presente invento os receptores de ligandos com uma constante de ligação de equilíbrio superior ~ -1 a 10 x (concentração - limiar ) , e preferem-se sobretudo receptores de ligandos com uma constante de ligação superior
-1 a 10 x (concentração-limiar)
A resposta do ensaio descrita no presente invento não foi conseguida pela técnica anterior.
Na verdade , a técnica anterior preconiza de que a fracção livre do conjugado de análogo do ligando, na ausência de qualquer ligando, deveria representar uma fracção significati va da totalidade do conjugado de análogo do ligando no ensaio , para se conseguir a maximização de sensibilidade do ensaio. Segundo os preceitos do presente invento, substancial mente todo o conjugado de análogo do ligando encontra-se ligado, quer na ausência de qualquer ligando, quer no caso de a concentração de ligando ser inferior à concentraçãolimiar .
presente invento refere-se ainda a exemplos de ensaios de receptores de ligandos, em que as constantes de ligação de equilíbrio não são substancialmente equivalentes para a ligação do ligando ao receptor do ligando e para a ligação do conjugado de análogo do ligando ao receptor do ligando. Em especial, o presente invento mostra de que a inclinação da função de reçosta acima da ccncentração-limiar é determinada pela grandeza da constante de ligação de equilíbrio do receptor do ligando para o conjugado de análogo do ligando relativamente à grandeza da constante de ligação de equilíbrio do receptor do ligando para o ligando. Quando estas constantes de ligação forem substancialmente equivalentes , as funções de resposta representadas na figura 1 definem ou descrevem a resposta do ensaio. Quando as constantes de ligação não forem substancialmente equivalentes, a função de resposta varia, tal como se depreende da figura 3.
Se a grandeza da constante de ligação de equilíbrio do receptor do ligando para o conjugado de analogo do ligando (K ) for superior à grandeza da constante de ligação de equilíbrio do receptor do ligando para o ligan-32-
do, então a inclinação da função de resposta apresenta-se mercB acentuada, dado que se necessita de uma maior quantidade de ligando para poder competir eficazmente com uma dada concentração do conjugado de análogo do ligando. De igual mod<() se a grandeza da constante de ligação em quilibrio do receptor do ligando para a ligação ao conjugado de análogo do ligando for inferior à grandeza da constante de ligação de equilíbrio para a ligação ao ligando , então a inclinação da função de resposta será correspondentemente aumentada dado que se precisa de uma quantidade menor de ligando para competir com uma dada concentração do conjugado de análogo do ligando.
Assim, torna-se possível variar a inclinação da função de resposta, modificando a grandeza da constante de ligação de equilíbrio do receptor do ligando para o conjugado de análogo do ligando. Esta variação poderá realizar-se, prontamente, na prática, mudando o número de análogos do ligando por cada elemento de desenvolvimento de sinais. Os conjugados com razões maiores de análogo do ligando para o elemento de desenvolvimento de sinais apresentam maiores constantes de ligação de equilíbrio para a ligação ao receptor do ligando , e têm funcções de resposta que apresentam inclinações reduzidas de forma correspondente em relação a conjugados menos derivados por ligandos.
Os análogos de ligandos podem ser acoplados de várias formas a elementos de desenvolvimento de sinais para variar as suas constantes de ligação de equilíbrio para o receptor do ligando. Desta forma é possível idealizar análogos de ligandos que apresentem constantes de ligação de equilíbrio, de maior ou menor grandeza do que as forncidas pelo ligando para o receptor do ligando. A possibilidade de se poder ajustar de manara empírica a inclinação da função de resposta representa uma feição
-33benéfica
no sentido de uma optimização dos ensaios.
Assim, por ex., segundo o presente invento, o método preferido para a realização de imunoensaios com concentrações-limiares (tal como vêm descritos no presente invento) utiliza um anticorpo solúvel e um conj do de análogo do ligando solúvel , numa fase reaccional , à qual se junta uma amostra que poderá conter um ligando-alvo. Deixa-se que nesta mistura se possam estabelecer condições que favoreçam a ligação de equilíbrio.
Na ausência de qualquer ligando-alvo práticamente todo o conjugado de análogo do ligando será ligado ao anticorpo e não está disponível para a ligação a um anticorpo imobilizado na fase sólida terminal.
A fase reaccional poderá apresentar-se de várias maneiras. As quantidades correctas , relativas e absolutas, de conjugado de análogo do ligando e de anticorpo devem existir a fim de se poder estabelecer, préviamente, uma concentração-limiar do ligando-alvo abaixo da qsl se dê nenhum ou pouco desenvolvimento de sinais.
Um método baseia-se na misturação de um volume de amostra fixo com uma quantidade fixa de conjugado de análogo do ligando, na adição desta mistura a uma quantidade fixa de anticorpo, deixando que a mistura final atinja as condições em que se verifique a ligação de equilíbrio. De acordo com um segundo método junta-se um volum fixo de uma amostra a um volume fixo de anticorpo e, em seguida, adiciona-se uma quantidade fixa de conjugado de análogo do ligando. De acordo com um terceito método, junta-se uma amostra a uma mistura de conjugado de análogo do ligando e de anticorpo. Caso o anticorpo e o conjugado de análogo do ligando tenham sido deixado de poder reagir antes
da adição do ligando da amostra, a dissociação do complexo entre o conjugado de análogo do ligando e o anticorpo passa a constituir o passo limitador da velocidade reaccional , que determina o período dentro do qual se possam estabelecer as condições para a ligação de equilíbrio. Em relação a grandes conjugados de análogos de ligandos este facto poderá significar um período inaceitávelmente longo para a maioria das aplicações práticas.
Uma das considerações de ordem prática prende-se com o custo do anticorpo e do conjugado de análogo do ligando (reagentes). Para ligandos para os quais se pretende obter concentrações -limiares da ordem de 1 gm ou mais , o custo dos reagentes poderá assumir um aspecto importante, pelo que os volumes dos reagentes terão de ser pequenos para a obtenção de um kit de ensaio não muito dispendioso. Para resolver este problema, um método preferido para a obtenção dos reagentes e anticorpos e conjugados de análogos de ligandos consiste em proceder-se à sua liofilização conjunta, não os deixando reagir entre si. Um processo deste tipo pode realizar-se , adicionando o volume correcto do primeiro reagente a um frasco e congelando-o; em seguida, adiciona-se o volume correcto do segundo reagente ao frasco, sob congelação rápida para evitar o derretimento do primeiro reagente e a possível misturação dos dois reagentes.
Em seguida, os dois reagentes congelados são co-liofilizados. Segundo um processo alternativo, o anticorpo e o conjugado de análogo do ligando (reagentes) podem ser liofilizados em separado, nao-dissolvidos e misturados sob a forma de formulações anidras , em quantidades apropriadas.
Por conseguinte , o presente invento fornece um processo para um ensaio de receptores de ligandos que se caracteriza por conter um elemento semelhante a uma função de degrau na curva de resposta do ensaio e, ao mesmo tempo , por incluir um mecanismo que permita a relação ou associação da posição do degrau com uma concentração de ligando escolhida especificamente, ou seja, a concentração-limiar e que se pode ajustar através dos valores relativos das concentrações do conjugado de análogo do ligando e do receptor do ligando.
Além disso, o presente invento refere-se a métodos simplificados para ensaios quantitativos (doseamentos ) . Ekins et al, demonstram de que a razão de ligando livre para ligando ligado representa uma função hiperbólica da concentração do ligando e de que - à medida que aumenta a r$ão entre o ligando livre e o ligando ligado -a razão aproxima-se, assimptóticamente, de uma função linear. Na estruturação de ensaios verifica-se de que o conjugado de análogo do ligando é a entidade efetivamente doseada como reflexo do estado do ligando. Quando se idealizar um ensaio que se fundamente nos princípios básicos enunciados pela presente invenção, a razão de conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando combinado representa uma função linear da concentração do ligando ao longo de substancialmente toda a gama ou extensão do ensaio. A inclinação da linha e seus segmentos de linha entre dois pontos dos eixos representam parâmetros constantes do sistema do ensaio para um dado conjun to de reagentes . A figura 4 descreve traçados teóricos da razão de conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando ligado em forma de funções da concentração de ligando total , quando a afinidade do receptor para o ligando for maior do que o inverso da concentração do receptor.
Caso sejam iguais as afinidades do receptor para o ligando e para o conjugado de análogo do ligando, então os traçados serão os mesmos para o ligando e o conjugado de análogo do ligando. Como se observa na figura 3 , a afinidade do receptor para o conjugado de análogo do ligando, relativamente à afinidade do receptor para o ligando, influi na inclinação da curva da resposta do ensaio. Esta afirmação é verdadeira para a resposta quando seja também expressa em termos da razão de conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando ligado.
Em relação aos exemplos que aqui se mencionam, são iguais as respectivas afinidades do receptor para o ligando e para o conjugado de análogo do ligando.
A medida que a razão da afinidade para o conjugado de análogo do ligando para o inverso da concentração do receptor se aproximar de 1000, a razão de conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando ligado vai se aproximar de uma função linear da concentração de ligando por toda a extensão do ensaio. Quando a razão de conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando combinado for indicada em forma de função da concentração do ligando, obter-se-ão traçados como aqueles que se representam na figura 4. Na figura 5, comparam-se o traçado da razão teórica de conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando ligado e uma regressão linear obtida a partir dos mesmos dados teóricos, utilizando apenas razões elevadas. Quando a afinidade do receptor para o conjugado de análogo do ligando for cerca de 1000 vezes maior do que o inverso da concentração do receptor, tal como se mostra na figura 5 , então a razão entre o conjugado de análogo do ligando livre e o conjugado de análogo dc ligando combinado será uma função linear da concentração do ligando ao longo de substancíalmente toda
-37a extensão do ensaio.
erro , introduzido pela determinação da concentração do ligando, utilizando a aproximação linear do presente invento , pode ser calculado , tomando em consideração a diferença da concentração do ligando prevista da resposta teórica e determinada pela aproximação linear, e expressando o erro sob a forma de uma percentagem da concentração do ligando, tal como se mostra na figura 6.
Se a afinidade do receptor para o conjugado de análogo do ligando for suficientemente grande , o erro na concentração do ligando , tal como foi calculada a partir da aproximação linear, será insignificantemente pequeno em comparação com os erros típicos introduzidos por outros aspectos do ensaio.
A inclinação e o segmento de linha entre dois pontos da função linear podem ser determinados para um dado conjunto de reagentes , realizando o ensaio com calibradores que se situem dentro da gama das concentrações do ligando, em que a função é rigorosamente linear.
Dado que a inclinação (declive) e o segmento de linha entre dois pontos são parâmetros constantes do sistema do ensaio só se necessita determinar-lhes uma única vez os seus valores , o que poderá ser realizado pelo próprio fabricante do ensaio. Para a determinação da resposta do ensaio em forma de uma função da concentração do ligando , é necessário relacionar a razão do conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando ligado com a resposta do ensaio. Pode conseguir-se este fim por meio de um único ponto de calibração. Os técnicos do ramo compreenderão de que é possível utilizar elementos de desenvolvimento de sinais de forma a que a resposta do ensaio seja directamente proporcional à concentração do conjugado de análogo do li-38-
gando livre. Neste caso, a razão do conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando ligado para o calibrador será dada pela equação (resposta do calibrador) Razão = _ (resposta máxima )-(resposta do calibrador ) onde a resposta máxima significa a resposta do ensaio no caso de todo o conjugado de análogo do ligando ser livre. Dado que a razão do conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando combinado é uma constante conhecida, a resposta do calibrador define a resposta máxima de acordo com a equação acima indicada. Esta resposta máxima, entra, seguidamente, no cálculo da razão entre o conjugado de análogo do ligando livre e o conjugado de análogo do ligando combinado para a resposta desconhecida, dada pela equação (resposta desconhecida) (resposta máxima) - (reçosta desconhecida)
Esta razão e a função linear definem a concentração desconhecida do ligando na amostra. Assim, pode utilizar-se apenas um único calibrador para o doseamento de amostras quando se realiza um ensaio competitivo em que se adoptem os princípios enunciados na presente invenção.
Meio facultativo para remover o receptcr do ligando da mistura reaccional
Sempre que seja necessário ou desejável de evitar que os complexos entre o conjugado de análogo do ligando e o receptor do ligando, na mistura reaccional , entrem em contacto com a fase sólida terminal poderá juntar-se um meio facultativo capaz de remover os receptores de ligandos da mistura reaccional.
Este meio facultativo deverá existir se, por ex. , o complexo entre o conjugado de análogo do ligando e o receptor do ligando na mistura reaccional se dissociar num grau significativo durante a incubação com a fase sólida terminal , de maneira que o receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal possa combinar-se com o conjugado de análogo do ligando dissociado, dando origem a um sinal detectável mesmo na ausência de qualquer ligando-alvo. O meio facultativo para a remoção dos receptores de ligandos da mistura reaccional poderá ser qualquer meio apropriado para induzir a ligação ou captação de receptores de ligandos, de modo que estes sejam removidos da mistura reaccional antes de entrarem em contacto com a mistura reaccional contendo a fase sólida terminal. Assim, por exemplo , um meio facultativo deste género poderá ser constitu:. do por receptores para (receptores de ligandos) e por suportes para a fase sólida para imobilizar os referidos receptores para receptores de ligandos, para que, através da ligação de receptores de ligandos na mistura reaccional aos receptores para (receptores de ligandos ) imobilizados no suporte de fase sólida do meio facultativo, os receptores de ligandos e os complexos de receptores de ligandos associados fiquem impedidos de entrar em contacto com os receptores de ligandos ligados à fase terminal sólida.
Exemplos de receptores e de fases sólidas que poderão ser úteis para a edificação de um meio facultativo para a remoção de receptores de ligandos, incluem anticorpos dirigidos a outros anticorpos , tais como IgG de cabra-anti rato ou Fc cabra anti-ratinho, receptores, tais como proteína A e proteína G, e fases sólidas, tais como grânulos difusores, grânulos de agarose macro-porosos, membranas, filtros, bem como matrizes porosas. Além disso, receptores de complementos de ligandos imobilizados em fases sólidas podem ser utilizados para remover receptores de ligandos , marcados com o complemento do ligando , da mistura reaccional, por ex., receptores de ligandos marcados com biotina podem ser ligados/captados por avidina imobilizada em fases sólidas. Os receptores de ligandos podem também ser precipitados a partir da mistura reaccional mediante um receptor (para o receptor do ligando). Quando se utilizarem grânulos ('contas') como fase sólida, os receptores para os receptores de ligandos são geralmente imobilizados nas contas (grânulos) e os grânulos ('contas') poderão ser adicionados à mistura reaccional como parte integrante da fase reaccional, durante a incubação da mistura reaccional , ou depois de se terem estabelecido na mistura reaccional condições para a ligação substancialmente de equilíbrio.
Poderá ser necessário proceder a centrifugação ou filtração para separar os grânulos ('contas') da mistura reaccional antes de entrarem em contacto com a fase sólida terminal .
Ao utilizarem-se matrizes porosas, inclusivé , membranas e filtros, como fase sólida, a mistura reaccional poderá estar contida no seio da matriz porosa ou a mistura reaccional poderá ser introduzida na matriz porosa depois de se terem estabelecido, substancialmente, as condições para a ligação de equilíbrio. Em qualquer umdos casos, a matriz porosa actua como agente capaz de contacto com a fase sólida terminal.
-41Fase sólida terminal
 fase sólida terminal é um suporte sólido que apresenta receptores de ligandos definidos ou localizados , para ligandos-alvo e conjugados de análogo de ligandos-alvo.
A fase sólida terminal de acordo com o presente invento poderá ser um suporte sólido no qual se encontram localizados (imobilizados) receptores de ligandos em locais cfeterminados, capazes de se combinarem tanto com ligandos-alvo como com conjugados de análogos de ligandos-alvo. No contexto do presente invento, o termo 'localizado' abrange todos os mecanismos físicos para a imobilização de receptores de forma tal que durante o decurso do ensaio para receptores de ligandos práticamente todo o receptor se mantenha num local préviamente determinado. Mecanismos ou processos incluem a ligação covalente , ligação não-covalente , acoplamento quimico , captação fisica de partículas funcionalmente associadas com receptores , bem como a adsorção que aproveita os fenómenos de interacção hidrófoba-hidrófoba ou hidrófila-hidrófila. A localização ou imobilização do receptor do ligando no suporte sólido da fase sólida do presente invento poderá ser efectuada por várias maneiras. 0 receptor do ligando poderá ser imobilizado mediante a técnica de captação de partículas revestidas do receptor do ligando, através de um suporte sólido sob a forma de uma matriz porosa. Métodos para a introdução das referidas partículas numa matriz porosa discutem-se nas patentes norte-americanas Nos. 4.446.232, 4.740.468 e no requerimento da patente europeia No. 86302521.9, mencionados a titulo de referência. Um método especialmente preferido para a imobilização ou colocação do receptor do ligando no suporte sólido, segundo o qual o suporte sólido repre-42-
senta uma matriz porosa, é caracterizado, em parte, por se imobilizar o receptor do ligando no suporte sólido através de uma ligação covalente ou não-covalente. As técnicas para a ligação de receptores de ligandos a um suporte sólido são bem conhecidos no ramo da especialidade. Para os efeitos do presente invento podem utilizar-se variadíssimos suportes sólidos, incluindo uma matriz porosa, uma matriz não-porosa 'contas' (grânulos), membranas ou filtros. Estes suportes sólidos podem ser incorporados num grande número de disposit_i vos experimentais , inclusivé varetas graduadas, bem como dispositivos como aqueles referidos nas patentes norte-americanas Nos . 4.200.690, 4.246.339, 4.366.241, 4.632.901 e 4.727.019.
□ma fase sólida especiaLmente preferida é uma membrana suspensa num dispositivo de modo tal que, aguando do contacto da mistura reaccional com a membrana, a mistura reaccional tenha um volume suficiente para poder infiltrar-se nos poros vazios da membrana exposta, de maneira que a área superficial total da membrana e todas as zonas do receptor sejam impregnadas com a mistura reaccional. Caso seja necessário, um dispositivo deste género poderia ainda apresentar um meio para remover os conjugados não-ligados da membrana, bem como um meio para estabelecer a ligação entre a fase de desenvolvimento de sinais e os conjugados ligados aos receptores imobilizados na membrana.
Não há duvida de que o método do presente invento com os referidos dispositivos dá a possibili^ dade de dosear vários analitos numa única amostra através de um único dispositivo experimental , capaz de fornecer resultados dentro de um valor-limiar para cada um dos analitos , no âmbito de um imunoensaio. Nos formatos de ensaios para o doseamento simultâneo de múltiplos ligandos pode utilizar-se um suporte sólido constituído - para cada ligando
que se pretende dosear - por pelo menos uma zona de reacção discreta onde está imobilizada um dos referidos receptores de ligandos. Além disso, a incorporação de controles negativos internos (padrão interno), referências positivas (testemunhas positivas) e calibradores nas zonas de reacção discretas irão ainda mais melhorar a qualidade das informações forneceidas pelo resultado do ensaio.
Acresce que a fase sólida terminal preferida, tal como ela vem descrita atraás , é especialmente útil quando seja muito desejável de determinar simultânea^ mente a presença de mais de um ligando-alvo, tal como sucede no doseamento de agentes responsáveis por uma determinada reacção toxicológica. Pode-se conseguir este objectivo de maneira fácil pela ligação de receptores de ligandos dentro de zonas discretas da matriz de suporte. Um sistema de fase sólida deste tipo fornece, fundamentalmente, um conjunto de receptores de ligandos capazes de detectar/identificar toxinas eventualmente presentes na amostra de fluido de um paciente. Por conseguinte, a natureza ou grau de reactivi_ dade no sistema de fase sólida, revelada pela presença de conjugados de análogos de toxinas ligadas, oferece uma indicação da natureza das toxinas que provocaram a reacção toxicológica.
Assim,segundo uma das formas de realização do presente invento, a mistura reaccional que poderá conter, em parte, o ligando, o conjugado de análogo do ligand o receptor do ligando, o complexo de ligando: receptor do ligando, e o complexo entre o conjugado de análogo do ligando e o receptor do ligando, é posta em contacto, ou é levada a reagir com uma fase sólida terminal na qual se encontra imobilizado o receptor do ligando. De acordo com uma forma de realização preferida do invento, a fase sólida terminal compreende uma 'conta' (granulado) não-difusora
ou uma membrana ou um filtro não-difusores, nos quais está imobilizado o receptor. Segundo uma forma de realização especialmente preferida, a fase sólida terminal é constituída por uma matriz porosa na qual está imobilizado o receptor do ligando. O receptor do ligando poderá ser imobilizado por várias maneiras, das quais podemos assinalar a junção química directa por meio de uma ligação covalente , junção química indirecta por ligação covalente, junção química directa por ligação não-covalente , junção química indirecta por ligação não-covalente, bem como captação por meios físicos. De acordo com uma forma de realização preferida, o receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal é capaz de se combinar com o conjugado de análogo do ligando. Além disso, e segundo uma forma de realização para a aplicação dos preceitos do presente invento a imunoensaios , o receptor do ligando é um anticorpo. De acordo com uma forma de realização especialmente preferida, o receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal é idêntico ao receptor do ligando que está contido na fase reaccional atrás referida, que entre primeiro em contacto com a amostra. De acordo com uma outra forma de realização especiaimente preferida do invento, para a aplicação dos pre ceitos do invento a imunoensaios , o receptor do ligando é um anticorpo monoclonal.
Fase de desenvolvimento de sinais
A fase de desenvolvimento de sinais é uma fase através da qual o elemento de desenvolvimento de sinais pode emitir ou gerar um sinal detectável. Elementos da fase de desenvolvimento de sinais poderão existir em todas ou numa qualquer das seguintes componentes do ensaio, na fase reaccional, no meio facultativo, na fase sólida terminal e na fase de desenvolvimento de sinais. Preferem-se como materiais que servam para componentes da fase de desenvolvimento de sinais , aqueles materiais que possibilitem à fase de desenvolvimento de sinais de emitir ou gerar um sinal que possa ser detectável por meios não constituídos por instrumentos de medição. Preferem-se como componentes da fase de desenvolvimento de sinais sobretudo os materiais através dos quais o elemento de desenvolvimento de sinais possa gerar um sinal detectável por via visual .
Os peritos do ramo sabem certamente de que existe um grande número de materiais que podem ser utilizados para alcançar este objectivo, e a titulo de exemplos , indicar-se-ão os seguintes: uma solução de um substracto de uma enzima, por ex., fosfato de 3-indolilo, que,ao reagir com a fase sólida terminal contendo a enzima ligada , sofre transformação , mediada pela enzima, por ex., fosfatase alcalina do intestino bovino (E.C. 3.1.3.1), o que dá origem a um produt reaccional visível, azulado ,o indigo.
Outro exemplo de uma fase de desenvol vimento de sinais compreende os métodos de orientação (channelling), tal como se refere na patente norte-americana N° 4.233.402, quando utilizados juntamente com uma fase sólida terminal, tal como se revela na patente norte-americana N° 4.391.904. Geralmente, estes métodos praticamente tornam superfula a operação de lavagem para remover os con-46-
'ϊjugados não-ligados de desenvolvimento invento. Quando se como ouro coloidal, sinais , uma simples minai é geralmente do ensaio, de modo desenvolvimento de ; são meios que se preferem como fase de sinais para os objectivos do presente utilizarem partículas de sol, tais como elemento de desenvolvimento de operação de lavagem da fase sólida tersuficiente para que seja revelado o sinal que se pode prescindir de uma fase de sinais.
Metodologia do ensaio para ligandos e receptores
Para se iniciar os ensaios para ligandos e receptores de acordo com o presente invento, introduz-se uma amostra de um fluido, de que se suspeita conter um ligando-alvo, na fase reaccional de um conjugado de análogo do ligando e de um receptor do ligando. Começa então a competição entre o conjugado de análogo do ligando e o ligando-alvo relativamente a um número restrito de locais de ligação existentes no receptor do ligando. As quantidades relativas de conjugado de análogo do ligando e de receptor do ligando são tais que, na ausência de um ligando-alvo, e após se terem estabelecido substancialmente as condições de ligação de equilíbrio, praticamente todos os análogos de ligando disponíveis no conjugado de análogo do ligando sejam ligados. Os técnicos do ramo fácilmente compreenderão de que para quantidades fixas do conjugado de análogo do ligando e de receptor de ligando , o volume da amostra poderá ser áLterada a fim de se poder variar a concentração-limiar. Quantidades significativas do conjugado de análogo do ligando não-ligado só estarão presentes se a soma da concentração efectiva do análogo do ligando no conjugado de análogo do ligando e da concentração do ligando-alvo começar a exceder a concentração dos locais de ligação disponiveis no receptor do ligando. Tal como é utilizado no presente invento, o termo 'não-ligado' significa um conjugado que apresente, pelo menos, um análogo do ligando disponível, capaz de se ligar ao receptor do ligando. 0 conjugado de análogo do ligando poderá ter mais de um análogo do ligando, e poderá ainda ter um receptor do ligando que lhe está associado (ligado); no entanto, poderá atribuir-se-lhe o termo 'não-ligado' desde que apresente, pelo menos, um análogo do ligando adicional , disponível, que seja capaz de se ligar ao receptor do ligando.
Conjugados de análogos de ligandos 'ligados' são aqueles que não apresentem qualquer análogos de ligandos capazes de se combinarem ao receptor do ligando. Convém frisar de que a concentração efectiva de conjugado de análogo do ligando está dependente do número de locais. de ligação ao anticorpo que se possam combinar com uma única molécula de conjugado. Assim, conjugados altamente derivados , que contenham muitos análogos de ligandos , apresentarão concentrações de análogos de ligandos mais elevados do que os conjugados menos fortemente substituídos (derivados ). A concentração do ligando que dê origem ao primeiro au mento significativo da concentração do conjugado de análogo do ligando não-ligado, que suscite uma resposta do ensaio que sobressaia do ruido de fundo, represente a concentração-limiar. Os peritos do ramo certamente não ignoram de que o ruido do ensaio depende do processo de doseamento (ensaio) adoptado e da natureza do conjugado de análogo do ligando e da fase de desenvolvimento de sinais. Geralmente, é vantajoso que a intensidade do ruido de fundo seja
inferior a 1% da resposta máxima do ensaio.
A medida que vai aumentando a quantidade de ligando , ficando acima da concentração-limiar , também aumenta a quantidade de conjugado de análogo do ligando não-ligado ao receptor do ligando. Continuará a verificar-se a subida da quantidade de análogo de ligando não-ligado no conjugado de análogo do ligando até que a quantidade de ligando-alvo tenha aumentado para um valor tal que substancialmente todo o conjugado de análogo do ligando exista num estado em que não se encontra ligado ao receptor do ligando.
De acordo com uma forma de realização preferida do presente invento, o receptor do ligando na fase reaccional não está imobilizado de forma não-difusora, pelo que é capaz de realizar deslocações difusoras durante a reacção de competição para locais de ligação no receptor do ligando, que ocorre entre o ligando e o conjugado de análogo do ligando.
Segundo uma forma de realização especialmente preferida, o ligando-alvo e o conjugado de análogo do ligando participam numa reacção de competição relativamente a locais de ligação no receptor do ligando difusor. Consoante uma outra forma de realização especialmente preferida, o presente invento revela um processo para um imunoensaio , segundo o qual o receptor do ligando é um anticorpo monoclonal que é capaz de difundir livremente em soluções. Em parte, a mistura reaccional contém o ligando, conjugado de análogo do ligando, receptor do ligando, complexo entre ligando e receptor do ligando e o complexo entre o conjugado de análogo do ligando e o receptor do ligando. A seguir à reacção de competição, a mistura reaccional é levada a reagir com um meio facultativo, associado fun
cionalmente com um receptor para o receptor do ligando.
receptor para o receptor do ligando , associado ao meio facultativo , liga-se a todas as espécies associadas com o receptor do ligando. Por conseguinte, o receptor para o receptor do ligando, associado com o meio facultativo poderá combinar-se com o receptor do ligando , com o complexo do ligante: receptor do ligando, e com o complexo entre conjugado de análogo do ligando e o receptor do ligando na mistura reaccional. Pela remoção dos constituintes, associados com o receptor do ligando, da mistura reaccional, mediante o meio facultativo, apenas o conjugado de análogo do ligando não-ligado entra em contacto com o receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal.
Assim , quando se utilizar um meio facultativo para a remoção do receptor do ligando e de fracções ligadas ao receptor do ligando da mistura reaccional o conjugado de análogo do ligando não-ligado na mistura reaccional representa um conjugado de análogo de ligando não-combinado com o receptor do ligando. Se apenas se estiver a dosear um único ligando mediante um processo de ensaio que lança mão de um meio facultativo para remover o receptor da mistura reaccional , então o sinal devido à presença do conjugado de análogo do ligando livre na mistura reaccional pode ser detectado directamente, sem a existência de qualquer fase sólida terminal.
Em seguida, a mistura reaccional é levada a reagir com a fase sólida terminal , na qual se encontra imobilizado o receptor do ligando. Por conseguinte, o presente invento apresenta um processo segundo o qual o receptor do ligando está imobilizado numa fase sólida.
Fases sólidas preferidas que se utilizam para a imobilização do receptor incluem 'contas' (grânulos) membranas e filtros difusores. (Jma matriz porosa é especialmente prefe-50-
rida para constituir a fase sólida para a imobilização do receptor. O receptor do ligando, imobilizado na fase sólida terminal, entra em contacto com os componentes da mistura reaccional, que é constituída, em parte, por ligando não-ligado e conjugado de análogo do ligando não-ligado.
Caso a mistura reaccional não tenha reagido com qualquer meio facultativo, a mistura reaccional poderá também conter o receptor do ligando não-complexado, o complexo entre ligando e receptor do ligando, bem como o complexo entre o conjugado de análogo do ligando e o receptor do ligando. Caso a mistura reaccional não tenha entrado em contacto com qualquer meio facultativo, o conjugado de análogo do ligando não-combinado representa os conjugados de análogos de ligandos capazes de se ligarem aos receptores do ligando imobilizados na fase sólida terminal, muito embora os receptores de ligandos da mistura reaccional já se encontras sem ligados a alguns análogos de ligandos do conjugado de análogo do ligando. Verifica-se competição entre qualquer ligando não-ligado e qualquer conjugado de análogo do ligando não-ligado para os locais de ligação disponíveis no receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal.
Depois de deixar qje as reacções de ligação prossigam, poderão separar-se a fase sólida terminal e a mistura de reacção. Caso seja necessário, qualquer conjugado de análogo de ligando que não esteja ligado ao receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal , poderá ser removido, por meio de uma operação de separação.
O conjugado de análogo do ligando, que formou um complexo com o receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal , é levado a reagir com uma fase de desenvolvimento de sinais , através da qual o elemento de desenvolvimento de sinais do conjugado de análogo do ligando complexado é capaz de gerar um sinal detectável. A interpretação do sinal efectua-se de maneira que a ausência de um sinal
detectável acima do ruido de fundo do ensaio indica de que o ligando-alvo se encontra na amostra numa concentração inferior à concentração-limiar, enquanto que a presença de um sinal detectável acima do ruido de fundo do ensaio significa de que o ligando-alvo está presente, quer numa concentração substancialmente equivalente à quer numa concentração superior, à concentração-limiar.
Ligando de controlo negativo (Ligando-testemunha negativo)
Antes do contacto com a fase sólida terminal , a mistura reaccional do presente invento deverá ter atingido substancialmente o equilíbrio quimico , a fim de que, na presença do ligando-alvo numa concentração inferior à concentração-limiar, o conjugado de analogo do ligando esteja ligado práticamente na sua totalidade ao receptor do ligando da mistura reaccional , ficando impedido de se ligar ao receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal. Para se poder verificar a existência do estado de equilíbrio e, por conseguinte, a validade dos resultados do ensaio subsequentes, o presente invento prevê a introdução de um conjugado de um ligando de controlo negativo, o que representa um método preferido para a realização do processo do presente invento. O ligando de controlo negativo é um ligando que geralmente não se encontra nas amostras. A combinação do conjugado do ligando de controlo negativo, do conjugado de análogo do ligando, do receptor do ligando e receptor (do ligando de controlo negativo), irá verificar-se na medida em que - sempre que o ensaio seja efectuado correctamente - não se observará qualquer resposta no local do receptor do (ligando de controlo nega52-
tivo) imobilizado na fase sólida terminal, dado que a mistura reaccional atingiu substancíalmente as condições para a ligação de equilíbrio, nas quais práticamente a totalidade do conjugado de ligando de controlo negativo se encontra ligada aos receptoresth (ligandos de controlo negativo) na mistura reaccional.
Se se deixar passar um periodo de tempo insuficiente para que a mistura reaccional possa atingir o seu estado de equilíbrio, ou se a fase de desenvolvimento de sinais for concebida de forma incorrecta, poder-se-ão observar respostas (reaeçoes) nos locais específicos de ligandos do ensaio que indicam, erradamente, a presença de ligandos-alvo em concentrações superiores à concentração-limiar. Nestas circunstâncias, o local de controlo negativo também apresentaria uma resposta observável , indicando que o ensaio é inválido. Um controlo negativo deste tipo daria a certeza de que tinha sido seguido de forma correcta o procedimento do ensaio e confirmaria a validade de quaisquer resultados positivos. Os peritos nesta matéria deverão saber de que as concentrações relativas e absolutas do conjugado de ligando de controlo negativo e do receptor de ligando de controlo negativo podem ser ajustadas a fim de controlar o periodo de incubação necessário para que se estabeleçam substancíalmente, as condições para a ligação de equilíbrio. 0 tempo até ao equilíbrio poderá ser ajustado para igualar o tempo necessário para se conseguir o equilíbrio para o par ligando-receptor mais lento no ensaio. Ligandos que são apropriados como ligandos de controlo negativo poderão ser seleccionados da mesma categoria geral de ligandos que não estão normalmente presentes nas amostras que interessarem (isto é, complementos de ligandos ) , mas que se podem empregar para obter conjugados de complementos de ligandos e receptores de complementos de ligandos que tenham a afinidade adequada para o ligando. Ligandos deste género, incluem,
-53por ex., fluoresceína
Para se ter a certeza de que todas as zonas de reacção na fase sólida terminal tenham sido postas em contacto com a mistura reaccional , um método preferido para a realização do presente invento consiste na introdução de um conjugado do ligando de controlo positivo na mistura reaccional. Um receptor do ligando de controlo positivo fica imobilizado numa zona discreta na fase sólida terminal; assim, quando a mistura reaccional é levada a reagir com a fase sólida terminal , o conjugado do ligando de controlo positivo vai ligar-se ao seu receptor respectivo , o que dá origem a um sinal detectável na zona de controlo positivo da fase sólida terminal. A posição e o tamanho da zona de controlo positivo na fase sólida terminal poderão ser escolhidos de modo tal que todas as restantes zonas receptoras discretas da fase terminal sólida tenham de ser postas em contacto com a mistura reaccional , se a zona de controlo positivo for posta em contacto com a mistura reaccional. Assim, por ex., se a mistura reaccional for levada a entrar em contacto com uma fase sólida terminal numa extremidade de uma tira rectangular , a zona de controlo positivo poderá ser colocada na outra extremidade da tira, sendo que todas as zonas de reacção discretas passam a situar-se entre as duas extremidades da tira.
Um resultado detectável na zona de controlo positivo significa também de que o elemento de desenvolvimento de sinais e a fase de desenvolvimento de sinais estão a funcionar convenientemente, podendo dar respostas 'de doseamento' desde que, os conjugados livres na mistura reaccional se liguem à fase sólida. Ligandos que são apropriados como ligandos de controlo positivo podem ser seleccionados da mesma classe de ligandos (isto é, complementos de ligandos) que os ligandos de controlo negativo.
Um conjugado de ligando de controlo negativo, um receptor do ligando de controlo negativo, um conjugado de ligando de controlo positivo e um receptor do ligando de controlo positivo podem ser empregados para confirmar de que as quantidades relativas e absolutas dos conjugados de análogo do ligando e dos receptores de análogos de ligandos na mistura reaccional não tenham sido adicionadas incorrectamente. Geralmente, todos os conjugados de análogos de ligandos, inclusivé conjugados de ligandos, de controlo negativo e positivo, são fornecidos em forma de misturas. Também são fornecidos como mistura todos os receptores de análogos de ligandos, incluindo os receptores de ligandos, de controlo negativo e positivo. As quantidades relativas e absolutas de cada par de conjugado de análogo do ligando e de receptor de análogo do ligando são selecionadas a fim de que se possa dispor de uma concentração-limiar para a determinação (doseamento) de cada ligando durante o ensaio. Caso venha a verificar-se um erro no enchimento dos reagentes como acidente isolado , que não afecte uma fracção substancial do lote de fabrico, este erro poderá não ser detectado por meio de métodos de ensaio de controlo de qualidade estatísticos, mas resultaria num ensaio que poderia dar origem a um resultado positivo errado ou a um resultado negativo errado.
Geralmente, os problemas deste género só podem ser detectados pela verificação/experimentação a 100%, do produto fabricado por meio de métodos destrutivos; no entanto, um procedimento deste tipo é inaceitável por razões óbvias.
De acordo com o processo do presente invento , utilizam-se controlos positivos e controlos negativos, de maneira que em cada ensaio seja confirmada a presença de uma formulação correcta de reagentes com validação correspondente do ensaio, ou que seja demonstra-55da a sua imperfeição, com a correspondente rejeição do ensaio. Para se conseguir os referidos objectivos,. o conjugado do ligando de controlo negativo pode ser ajustado de tal modo que o receptor do ligando de controlo negativo esteja presente num pequeno excesso, por ex. , a 10%, relativí mente à quantidade necessária para a ligação da totalidade de conjugado do ligando de controlo negativo. De igual modo , o conjugado do ligando de controlo positivo e o receptor do ligando de controlo positivo serão ajustados de maneira a que o conjugado do ligando de controlo positivo esteja presente num ligeiro excesso, por ex., a 10%, relativamente à quantidade que possa ser ligada pelo receptor do ligando de controlo positivo.
Se, por engano, o conjugado de ligando de controlo negativo for ajustado de modo a que esteja presente num excesso superior a 10%, da sua quantidade prevista, então a quantidade total dos restantes conjugados de análogos de ligandos encontrar-se-ão num excesso similar , de modo que a resposta resultante na zona de controlo negativo, na fase sólida terminal, assinalará o erro e invalidaria o resultado.
De igual modo , se houver um excesso do receptor do ligando de controlo positivo superior a 10% da sua quantidade-alvo, então também os restantes receptores do ligando estarão presentes num excesso semelhante , e a ausência subsequente de uma resposta na zona de controlo positivo, na fase sólida terminal, indicará o erro inavlidando o resultado fornecido. Estes mecanismos de controlo oferecem um meio para verificar cada ensaio em relação à existência de uma correcta formulação de reagentes .
V
Utilização da concentração-limiar e do ponto de referência para a determinação da gama (extensão ) de concentração do 1igando
De acordo com um método preferido do presente invento, utiliza-se uma concentração-limiar para a definição do limite inferior de uma dada gama de concentrações para um ligando-alvo, bem como um ponto de referência para determinar o limite superior daquela gama de concentrações. A resposta de referência verifica-se num local diferente do local da resposta do ensaio, sendo também escolhida para representar a resposta produzida por uma concentração do ligando-alvo correspondente ao limite superior da gama de concentrações. A resposta no local de referência pode ser 'suscitada' por um par de ligan· do-receptor, em que o receptor de referência se encontra imobilizado no local de referência e o ligando de referência está marcado com um elemento de desenvolvimento de sinais permitindo a sua detecção, por ex., pelo emprego de um conjugado do ligando de referência.
Ligandos que são úteis para estes fins são ligandos que. geralmente , não se encontram nas amostras que interessam , isto é, complementos de ligandos , de forma que não se verifica qualquer reacção de competição entre o conjugado do ligando de referência e o ligando alvo, relativamente aos locais de ligação no receptor de referência ou aos locais de ligação no receptor do ligando. Ligandos, tais como fluoresceina , são apropriados como ligandos de referência para esta finalidade, e enzimas marcadas com fluoresceín são úteis como conjugados de ligandos de referência, em associação com anti-corpos para a fluoresceina como receptores de referência, servindo para
suscitar uma resposta de referência para determinar se a resposta do doseamento no local do ensaio, corresponde a uma concentração do ligando gue seja inferior, ou substancialmente equivalente, ou superior ao limite superior da gama de concentrações. De acordo com uma forma de realização alternativa, o próprio elemento de desenvolvimento de sinais poderia actuar como conjugado do ligando de referência, por ex., poder-se-ia utilizar uma enzima com um anticorpo para a enzima, como receptor de referência.
Dado que a inclinação de uma função de resposta do ensaio pode ser escolhida, pelo ajustamento do garu ou extensão de substituição (derivação) do conjugado de análogo do ligando, pode optimizar-se a função de respost do ensaio a fim de que se possa estender toda a gama -dinâmica da função de resposta do ensaio através da extensão seleccionada das concentrações dos ligandos-alvo.
Este procedimento fornece a maior segurança na determinação da concentração do ligando-alvo dando a possibilidade de verificar se esta concentração se situa acima, abaixo ou dentro da extensão das concentrações seleccionadas. A ausência da emissão de sinais no local de ensaio (doseamento) assinalará que a amostra contém o ligando-alvo numa concentração inferior ao limite inferior da gama de concentrações escolhidas. Qualquer desenvolvimento detectável de sinais, que seja menor do que a resposta de referência, assinala que a amostra contém o ligando-alvo numa concentração dentro da gama de concentrações seleccionadas. Quaisquer respostas do ensaio que sejam substancialmente equivalentes, ou superiores, em intensidade, à resposta de referência, indicam de que a amostra contém o ligando-alvo numa concentração superior à gama de concentrações escolhidas. A utilização de pontos de referência que representem concentrações pré-determinadas
de ligandos no âmbito de ensaios competitivos, já foram descritos na patente norte-americana N° 4.540.659 e no requerimento de patente europeia N2 85307785.7.
No entanto, nesses requerimentos seriam necessários dois pontos de referência deste género para determinar uma gama de concentrações. Os referidos métodos iriam, necessáriamente , apertar a gama dinâmica da resposta do ensaio , que se poderia utilizar para a extensão de concentrações de ligandos seleccionadas. Por este motivo, o método do presente invento para a utilização dos referidos pontos de referência, constitui uma melhoria significativa para a execução destes ensaios competitivos para receptores e ligandos, em que se determina a concentração do ligando em relação a duas concentrações de ligando pré-determinadas
O método do presente invento reveste-se de particular utilidade para a determinação da concen tração do ligando em relação/comparação com uma gama de concentrações seleccionadas.
-59Ensaio para receptores e ligandos para o doseamento de ligandos mediante um único ponto de calibração
Segundo um método preferido do presente invento, utiliza-se um único ponto de calibração para o doseamento quantitativo de um ligando-alvo através de uma dada gama ou extensão de concentração. O ponto de calibração isolado poderá obter-se , quer sob a forma de uma resposta de calibração externa derivada de um ensaio separado, realizado simultaneamente com o ensaio para a amostra, ou sob a forma de uma resposta de referência num local distinto do local da resposta do ensaio. Além disso, a resposta de calibração externa ou a resposta de referência são escolhidas para representarem a resposta dada por uma concentração especifica do ligando-alvo, numa proporção de conjugado de análogo do ligando ligado para conjugado de análogo do ligando não ligado que seja uma constante para um dado conjunto de respostas do ensaio.
A resposta máxima do ensaio é determinada pela resposta de calibração ou de referência, segundo a relação (resposta de calibração)
Razão = _ (resposta máxima) -(resposta de calibração)
Utiliza-se a resposta máxima para a determinação da razão entre conjugado de análogo do ligando livre e o conjugado de análogo do ligando ligado, obtida da resposta do ensaio . para a concentração desconhecida do ligando na amostra, baseando-se na relação seguinte:
_ ~ (resposta desconhecida)
Razao = (resposta máxima)-(resposta desconhecida)
A razão de conjugado de análogo do ligando livre para o conjugado de análogo do ligando ligado, correspondente à concentração do ligando desconhecida , juntamente com a inclinação conhecida e a extensão do espaço entre dois pontos (intercepto) da razão de conjugado de análogo do ligando livre para conjugado de análogo do ligandc ligado, como função da concentração do ligando, definem a concentração desconhecida do ligando na amostra.
A fim de se poder aproveitar a respos ta atrás referida para a determinação das razões entre o conjugado de análogo do ligando ligado e o conjugado de análogo de ligando livre , a resposta do ensaio deverá ser directamente proporcional à concentração do conjugado de análogo do ligando livre, na mistura reaccional , quando as reacções de ligação tiverem substancialmente atingido as condições de equilíbrio. Quando o conjugado de análogo do ligando livre na mistura reaccional for doseado directamente, por ex. mediante um meio facultativo para a remoção do conjugado de análogo do ligando ligado e , seguidamente , pela medição da restante quantidade do conjugado de análogo do ligando livre, então apenas deverá se certificar que o elemento de desenvolvimento de sinais , juntamente com a fase de desenvolvimento de sinais, dêem uma resposta que seja proporcional à concentração do conjugado de análogo do ligando livre gue esteja a ser doseado. Segundo os preceitos do presente invento, a escolha de uma enzima como elemento de desenvolvimento de sinais e de uma solução de substrato capaz de resultar num produto numa proporção di-61-
recta à quantidade de enzima presente como fase de desenvolvimento de sinais , é uma opção preferida para a emissão de sinais.
Prefere-se sobretudo o emprego de ouro coloidal como elemento de desenvolvimento de sinais , para o qual se pode prescindir de uma fase de desenvolvimento de sinais. Se o doseamento do conjugado de análogo do ligando livre for realizado, pondo em contacto a mistura reaccional com uma fase sólida terminal , torna-se necessário que o receptor do ligando imobilizado na fase sólida se combine com uma quantidade de conjugado de análogo do ligando que seja directamente proporcional à quantidade de conjugado de análogo do ligando livre presente na mistura reaccional. Além disso, o elemento de desenvolvimento de sinais em conjunto com a fase de desenvolvimento de sinais, deverão fornecer um sinal cuja intensidade seja directamente proporcional à quantidade do conjugado de análogo do ligando ligado â fase sólida terminal.
Quando o único ponto de calibração seja dado mediante uma série de calibrações externas , como ensaio separado, obter-se-à uma amostra de calibração contendo uma concentração conhecida do ligando-alvo, para além da inclinação e da extensão do espaço entre dois pontos de intersecção (intercepto) da razão entre o conjugado de análogo do ligando livre e o conjugado de análogo do ligando ligado, como função da concentração do ligando. Quando o único ponto de calibração for conhecido por uma resposta de referência numa fase sólida terminal, a resposta no local de referência poderá ser suscitada através de mecanismos atrás discutidos em relação ao ponto de referência.
A resposta deverá representar a resposta do ensaio obtida para uma concentração conhecida do ligando e deverá implicar uma razão conhecida entre o conjugado de análogo do ligando livre e o conjugado de análogo do ligando ligado, que lhe esteja associada, a fim de se obter uma resposta máxima do ensaio. A resposta do ensaio na fase sólida terminal deverá ser proporcional à concentração do conjugado de análogo do ligando livre na mistura reaccional , tal como atrás se refere. Os peritos na matéria certamente sabem de que o receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal, na zona de ensaio, deverá estar presente num excesso em relação à associação entre o ligando e o conjugado de análogo do ligando , em contacto com a zona do ensaio , de modo a que a quantidade de conjugado de análogo do ligando combinada com a zona de ensaio seja dírectamente proporcional à concentração do conjugado de análogo do ligando livre na mistura reaccional. Estes processos oferecem métodos simplificados para a quantificação de ligandos em amostras, sem a necessidade de recorrer a qualquer calibração externa demorada para a definição da resposta do ensaio e sem a presença de aparelhagem dispendiosa para a verificação das variáveis que afectam a resposta do ensaio, dispensando de calibrações frequentes.
-63Ensaio visual para o doseamento quantitativo de ligandos
A relação linear entre a razão de ligando livre para ligando combinado na mistura reaccional constitui o ponto de partida para um ensaio visual , quantitativo. Com concentrações de ligando acima da concentração-limiar, a concentração de ligando ligado é substancialmente constante, de modo que a concentração de ligando livre é práticamente uma função linear da concentração do ligando acima da concentração-limiar.
Se, numa mistura reaccional, a concen tração do ligando na amostra se situar acima da concentração-limiar , então a soma das concentrações do ligando livre e do conjugado de análogo do ligando livre representa uma função linear da concentração do ligando. Ao pôr uma mistura reaccional deste género em contacto com um dispositivo imunocromatográfico , tal como se descreve na patente norte-americana NQ 4.435.504, verifica-se a ligação do ligando livre e do conjugado de análogo do ligando livre aos receptores imobilizados na fase sólida terminal.
O processo de migração ao longo do qual o conjugado de análogo do ligando se liga à fase sólida é directamente proporcional à concentração do ligando na amostra, se o receptor for capaz de se combinar com o ligando e o conjugado de análogo do ligando. A não ser que a concentração do ligando se situe acima da concentração-limiar , a distância de migração que percorre o conjugado de análogo do ligando ligado à fase sólida terminal será igual a zero. Assim, a concentração do ligando que der primeiro origem a uma resposta visual , pode ser escolhida de modo a constituir a concentração-limiar , e a distância de migração da resposta de cor é directamente
proporcional à concentração do ligando na amostra que excede a concentração-limiar, de modo que se consegue a calibração do ensaio sem necessidade de qualquer calibração externa ou aparelhagem adicional. O ensaio permite a quantificação de ligandos , em amostras , em concentrações nas quais a concentração do conjugado de análogo do ligando é maior do que a concentração, clinicamente significativa, do ligando na amostra , pelo que elimina os inconvenientes inerentes aos ensaios da técnica anterior .
Ensaio de receptores e ligandos para o doseamento de um ligando por meio de um conjugado de análogo do ligandocomplemento do ligando
De acordo com uma outra forma de realização dos ensaios para receptores e ligandos do presente invento , aumenta-se o conjugado de análogo do ligando pela incorporação de um ligando especializado, chamado complemento de ligando. 0 complemento do ligando é um ligando que se não encontra, geralmente, nas amostras de ensaio.
A incorporação de um complemento do ligando cria um conjugado , em que tanto o análogo do ligando e o complemento do ligando estão ligados ao elemento de desenvolvimento de sinais. Faz-se reagir uma amostra de um fluido com uma fase reaccional contendo um par reaccional , complementar , de um conjugado de análogo do ligando e de complemento do ligando , bem como um receptor do ligando para o ligando-alvo em análise. O receptor do ligando poderá ser um anticorpo imobilizado numa fase sólida.
O ligando-alvo e o conjugado de análogo do ligando e de complemento do ligando competem para locais de ligação no receptor do ligando imobilizado na fase sólida. Caso o ligando-alvo esteja presente numa concentração inferior à concentração-limiar substancialmente todo o conjugado de análogo do ligando e de complemento do ligando encontra-se ligado ao receptor do ligando. De acordo com uma forma de realização especialmente preferida, o receptor do ligando é um anticorpo capaz de difundir livremente através da mistura reaccional. No caso de o receptor do ligando poder difundir livremente na mistura reaccional , precisa-se de um meio facultativo para remover os receptores do ligando da mistura reaccional antes do contacto com a fase sólida terminal contendo o receptor do complemento do ligando nela imobilizado. A incorporação de um complemento do ligando no conjugado de análogo do ligando elimina o problema relacionado com o efeito 'hook'.
Em determinados formatos de ensaios , poderá verificar-se um efeito 'hook' se a quantidade remanes cente de ligando livre , que entre em contacto com a fase sólida terminal , for tão grande a competir de maneira eficaz com o conjugado de análogo do ligando não-ligado , relativamente a locais de ligação no receptor do ligando imobilizado. Se da competição resultar o pEdominio da ligação do ligando-alvo, o sinal desenvolvido por quaisquer complexos entre conjugado de análogo do ligando e o receptor do ligando, formados na fase sólida terminal, poderá ser ténue demais para ser detectado.
Nestes casos , o ensaio poderia ser interpretado de forma incorrecta, na medida em que indicasse de que a concentração do ligando-alvo na mais baixa do que a concentração-limiar.
amostra seria
De acordo com o presente invento, torna-se possível obviar a estas limitações do doseamento, dado que se utiliza uma fase sólida terminal que contém um receptor imobilizado orientado para um ligando complementar (ou seja, um receptor de complemento do ligando). Ao fazer reagir a mistura reaccional com uma fase sólida terminal contendo um receptor de complemento do ligando imobilizado , não se verificará qualquer reacção de competição entre o ligando-alvo e o conjugado de complemento do ligando e de análogo do ligando para locais de ligação no receptor de complemento do ligando imobilizado. Nestas circunstâncias a ligação do conjugado de análogo do ligando e de complemente do ligando será mais intensa (máxima) e não ficará afectada pela presença do ligando-alvo residual . Não se dá o efeito 'hook' , e a concentração do ligando-alvo poderá ser interpretada de maneira correcta. Assim, a seguir ao contacto da fase sólida terminal com uma fase de desenvolvimento de sinais , a ausência de qualquer sinal detectável assinalará de que o ligando está presente numa concentração inferior à concentração-limiar, enquanto a presença de um sinal detectável indica a presença do ligando numa concentração substancialmente equivalente à, ou superior à concentração-limiar.
Ensaio de receptores e ligandos para o doseamento simultâneo de ligandos múltiplos presente invento mostra-se especialmente útil para a realização de doseamentos simultâneos de ligandos múltiplos.
Podem empregar-se simultâneamente quaisquer quantidades de pares de reacção inertes , complementares , de conjugado de análogo do ligando; receptor do ligando para o doseamento de vários ligandos-alvo numa única amostra.
De acordo com o processo dos ensaios do presente invento . uma amostra de um fluido , de que se suspeita conter ligandos-alvo de interesse analítico , é levada a reagir com uma fase reaccional contendo pares complementares de conjugado de análogo do ligando e de receptor do ligando , cujo número é igual ao número de ligandos-alvo que se pretende dosear.
Verificar-se-à a reacção de competição entre os ligando-alvo e os seus respectivos conjugados de análogos de ligandos para os locais de ligação disponíveis no receptor do ligando complementar. Deixa-se que as várias reacções competitivas, de acção não-reciproca atinjam condições em que se estabelecem, substancialmente as ligações de equilíbrio. Em condições de equilíbrio para cada um dos sistemas de competição, determinar-se-à a quantidade de conjugado de análogo do ligando não-ligada através de uma série de factores; reveste-se de especial importância a quantidade do respectivo ligando-alvo, que está presente na amostra.
caso esteja ausente o ligando-alvo especifico, práticamente a totalidade do respectivo conjugado de análogo do ligando estará ligada ao receptor do ligando apropriado. Em condições de equilíbrio, quaisquer quantidades detectáveis do conjugado de análogo do ligando especifico só estarão presentes se a concentração do ligando-alvo for substancialmente equivalente à, ou superior à respectiva concentração-limiar.
Para possibilitar a determinação da presença de ligandos específicos nas respectivas concentrações que se apresentem a um nivel igual à ou a um nivel superior à respectiva concentração-limiar, a mistura reaccio nal é levada a reagir com uma fase sólida terminal, que contém zonas discretas de receptores de ligandos imobilizados para os correspondentes ligandos e uma fase de desenvolvimento de sinais, para se poder determinar quais dos ligandos, eventualmente presentes, existiam numa concentração , quer igual à, quer superior à sua respectiva concentração-limiar .
Além disso e dado que cada receptor do ligando imobilizado na fase sólida terminal se encontra num local discreto ou em locais discretos , o sinal produzido pelo elemento de desenvolvimento de sinais de um conjugado de análogo do ligando imobilizado poderá ser inequivocamente associado a um ligando-alvo especifico. A associação de cada um dos sinais detectáveis ao respectivo ligando consegue-se pela correlação da localização dos sinais com a identificação posicionai dos receptores de ligandos específicos. Assim, o presente invento revela a concentração de uma série de 1igandos-alvo que se pretendem dosear, simultaneamente, cada um deles relativamente a uma concentração-limiar individualmente pré-determinada , de modo que a ausência de um sinal detectável numa zona de reacção
especifica de um ligando, na fase sólida terminal, assinalará de que o ligando-alvo especifico está presente na amostra numa concentração inferior à concentração-limiar, especifica do ligando, enquanto que a presença de um sinal detectável numa zona de reacção, especifica de um ligando, na fase sólida terminal , indica de que o ligando especifico está presente na amostra numa concentração substancialmente equivalente à, ou superior à concentração-limiar, especifica do ligando.
Ensaio para ligandos e receptores para o doseamento simultâneo de ligandos múltiplos com base em concentrações-limiar múltiplas para cada ligando
Uma das formas de realização do presente invento refere-se a um ensaio de receptores e ligandos para o doseamento de uma série de ligandos-alvo segundo o qual a fase reaccional inclui grupos de reagentes complementares, tendo cada grupo vários conjugados de análogos de ligandos-complementos de ligandos e um receptor de ligando apropriado. Os conjugados de complementos de ligandos-análogos de ligandos são formados proporcionalmente ao receptor do ligando da fase reaccional complementar , de modo tal que na altura em que se dê a formação de um complexo com os respectivos receptores de complementos de ligandos imobilizados na fase sólida terminal , se verifica a produção de um sinal , de modo que cada par complementar de conjugado do complemento do ligando; receptor do complemento do ligando imobilizado se encontra numa concentra-70-
ção-limiar única para o ligando-alvo compartilhado. O conjunto de concentrações-limiares para um único ligando-alvo representa um meio para uma melhor determinação/identificação da concentração do ligando-alvo através da comparação com a gama de concentrações-limiar. Dado que a fase reaccional inclui uma série de grupos de pares reaccionais complementares , torna-se possível determinar simultâneamente uma série de ligandos-alvo, existindo para cada ligando uma série especifica de concentrações-limiar. Desta maneira, cada ligando-alvo poderá ser 'desdobrado' numa série de gamas de concentrações.
Exemplos destas aplicações de conjugados de análogo de ligando-complementos de ligandos à determinação de analitos múltiplos, em concentrações-limiar múltiplas, incluem a utilização de conjugados de análogos de ligandos- complementos de ligandos , em que o componente complemento do ligando do conjugado fica estèricamente impedido de se ligar ao receptor do complemento do ligando imobilizado na fase sólida terminal, após a complexação do receptor do ligando com o componente análogo do ligando do conjugado de análogo do ligando-complemento do ligando. Conjugados deste género vêm descritos na patente norte-americana N° 4.506.009.
Deixa-se que uma mistura reaccional contendo a amostra, o receptor do ligando e o conjugado de complemento do ligando e de análogo do ligando, atinja substancialmente as condições para a ligação de equilíbrio. Em seguida, a mistura reaccional é levada a a reagir com uma fase sólida terminal , sobre a qual se encontra imobilizado o receptor do complemento do ligando. O complexo formado entre o receptor do ligando e o conjugado de complemento do ligando e de análogo do ligando não se pode combinar com o receptor do complemento do ligando imobilizado na
fase sólida terminal , uma vez que o complexo do conjugado apresenta uma concentração efectiva do complemento do ligando de zero. No entanto, o conjugado de análogo do ligando e de complemento do ligando não-ligado pode ligar-se ao recepto^· do complemento do ligando imobilizado e, a seguir a quaisquer operações de separação necessárias das partículas ligadas e não-ligadas, e depois de se estabelecer o contacto com uma fase de desenvolvimento de sinais , pode-se determinar a concentração do ligando relativamente a uma concentração-limiar. Quando vários receptores de complementos de ligandos estão imobilizados em determinados locais na fase sólida terminal , cada local de ligação pode ser identificado por uma única concentração-limiar, de modo tal que a presença de um sinal detectável num local assinala de que o ligando está presente na amostra numa concentração substancialmente equivalente à, ou superior à correspondente concentração-limiar .
Um outro exemplo diz respeito a um método que lança mão de um conjugado de complemento do ligando-análogo do ligando presente na amostra reaccional , e utiliza um meio (elemento) facultativo. Forma-se uma mistura reaccional a partir de uma amostra , um receptor do ligando e um conjugado de complemento do ligando e de análogo do ligando. Deixa-se que a reacção de competição entre o ligando e o conjugado de complemento do ligando e de análogo do ligando, para os locais de ligação disponíveis em número limitado no receptor do ligando, atinja substancialmente as condições para a ligação de equilíbrio.
Em seguida , faz-se reagir a mistura reaccional com um meio facultativo, associado funcionalmente com um receptor para (um receptor do ligando), que se pode ligar àqueles compo-72-
nentes da mistura reaccional que estejam associados ao receptor do ligando, isto é, ao receptor do ligando não-ligado, complexo de ligando e receptor do ligando, bem como ao complexo entre o receptor do ligando e o conjugado de complemento do ligando e de análogo do ligando. Em segui da, faz-se reagir a mistura reaccional resultante com uma fase sólida terminal , na qual se encontra imobilizado o receptor do complemento do ligando.
Uma fracção do conjugado de complemento do ligando e de análogo do ligando não-ligado, que pe manece na mistura reaccional , liga-se ao receptor do comple mento do ligando imobilizado na fase sólida terminal , e a porção remanescente pode remover-se, se for necessário, através de uma operação de separação. Por último, põe-se defase sólida terminal em contacto com uma fase de desenvolvimento de sinais , e a concentração do ligando é determinada com base na concentração-limiar. Quando receptores de complementos de ligandos múltiplos estão imobilizados em locais específicos na fase sólida terminal, cada local de ligação pode ser identificado através de uma única concentração-limiar, de tal modo que a presença de um sinal detectável num determinado local indica de que o ligando está presente na amostra numa concentração substancíalmente equivalente à , ou superior à correspondente concentração-limiar.
-73Ensaios para receptores e ligandos em que se utilizam um conjugado de receptor e uma estrutura de análogo do ligando
Os peritos da matéria aqui apresentada certamente sabem de que se podem utilizar um conjugado de receptor e uma estrutura de análogo do ligando numa mistura reaccional para se obter concentrações-limiar necessárias para a determinação de ligandos-alvo no âmbito de ensaie para ligandos e receptores. Práticamente a totalidade do conjugado de receptor encontra-se ligada à estrutura de análogo do ligando, ficando impedida de se ligar a uma fase sólida terminal contendo o análogo do ligando imobilizado, quando o ligando-alvo estiver presente numa concentração inferior à concentração-limiar.
para os fins da presente forma de realização, prefere-se utilizar conjugados de receptores que contenham locais de ligação múltiplos para o ligando.
Pode formar-se uma estrutura de análogo do ligando pela ligação do análogo a uma fase sólida facultativa como meio para a separação do conjugado de receptor da mistura reaccional. Segundo uma forma de realização alternativa, podem fo mar-se estruturas de análogos de ligandos pela ligação de análogos de ligandos e espécies de moléculas grandes , que sejam capazes de impedirem que os conjugados de receptores , que estão ligados às referidas estruturas de análogos de ligandos solúveis, se venham a ligar aos análogos de ligandos imobilizados na fase sólida terminal , sem que se necessite qualquer meio para a separação das estruturas de análogos de ligandos solúveis da mistura reaccional.
Os peritos na matéria compreenderão de que o presente invento prevê também esta utilização de conjugados de receptores e de estruturas de análogos de ligandos para a detecção de ligandos-alvo, individuais ou múltiplos.
Ensaio para o doseamento de receptores e ligandos utilizando um conjugado de receptor e uma estrutura de análogo do ligando
Os técnicos do ramo decerto não ignoram de que os receptores de ligandos podem ser o analito-alvo que se pretende dosear. Neste caso, existirão na fase reaccional um conjugado de receptor e uma estrutura de análogo do ligando, de modo tal que ao adicionar-se a amostra, de que se suspeita conter o receptor-alvo do ligando , para a formação da mistura reaccional, práticamente a totalidade do conjugado do receptor fica ligada à estrutura de análogo do ligando , ficando impedida de se ligar a uma fase sólida terminal contendo o ligando imobilizado, caso a mistura reaccional contenha o receptor do ligando numa concentração inferior à concentração-limiar do ensaio.
Escolhem-se as quantidades do conjugado de receptor e daestrutura de análogo do ligando de modo a que dêem origem a uma concentraç ão-limiar pré-determinada do receptor do ligando para o ensaio. Os peritos do ramo certamente notarão de que o presente invento idealiza um ensaio para múltiplos receptores de ligandos , uma vez que existe um par complementar de conjugado de receptor e de estrutura de análogo do ligando e uma zona discreta de um análogo do ligando imobilizado na zona sólida terminal para cada receptor-alvo do ligando.
Muito embora o presente invento seja especialmente apropriado para a realização de imunoensaios competitivos, os peritos na matéria fácilmente se aperceberão de que o invento também pode ser aplicado a outros ensaios para ligandos e receptores, incluindo imunoensaios não-competitivos.
Assim, por ex., no âmbito de ensaios 'sandwich', pode existir um receptor de um ligando, juntamente com um conjugado do receptor do ligando , que se liga a um local diferente na molécula do ligando presente numa mistura reaccional. Quando se adicionar uma amostra de que se suspeita conter um ligando, à fase reaccional, a ligação do receptor do ligando, do conjugado do receptor do ligando e do ligando poderá decorrer em condições que se aproximam substancialmente do estado de equilíbrio. Ajusta-se a quantidade do receptor do ligando para que se ligue uma quantidade préviamente determinada do ligando , de modo tal, que ao fazer reagir a mistura reaccional com uma fase sólida contendo um receptor de um ligando imobilizado, uma quantidade conhecida de um complexo entre receptor do ligando ligando e conjugado de receptor do ligando, seja impedida de se ligar à fase sólida, pelo que apenas se obterá qualquer resposta do ensaio quando a concentração do ligando na amostra ultrapassar uma concentração-limiar seleccionada.
Exemplos de ligandos que poderiam servir de alvos apropriados para os fins do presente invento incluem as seguintes substâncias: esteróides ováricos e seus metabólitos, por ex. , progesterona , estradiol, pregnanodiol-3alfa-glucurónido e estrona3-glucurónido; drogas tomadas de forma abusiva e seus metabólitos, por ex., anfetamina, barbituratos, benzodiazepinas, canabinóides , cocaína, metadona , metanfetamina, metaqualona, opiatos fenociclidina , propoxifeno, e preparados tricíclicos de acção anti-depressiva; medicamentos e seus metabólitos, por ex., acetaminofeno, digoxina, salicilato e teofilina; hormonas ováricas, por ex., gonadotropina coriónica humana e a hormona leuteínica; hormonas da tiróide, por ex., triiodotironina e tiroxina; mico-toxinas, por ex., aflatoxina BI , aflatoxina B2, aflatoxina G1, aflatoxina Ml , zearalenona; T-2 toxina e desosinivalenol; ciguatoxina; toxinas provenientes do meio ambiente, por ex., compostos bifenilicos policlorados, dioxina e dibrometo de etileno; bem como proteinas e anticorpos de interesse nosológico , por ex. , apolipoproteinas, albumina, proteína c-reactiva e anticorpos contra a hepatite e HlV-virus. Os seguintes exemplos práticos apenas servem para melhor ilustrar o presente invento e não pretendem limitar-lhe o seu alcance inventivo.
EXEMPLO 1
Preparação do éster da N-hidroxi-succinimida de estrona-3-glucurónido
11,2 mg (25 gmoles ) de estrona-3-glucurónido e 2,9 mg (25 çimoles ) de N-hidroxi-succinimida foram dissolvidos em 0,1 ml de dimetilformamida anidra. Juntaram-se 5,7 mg (27,5 ymoles ) de diciclohexilcarbodiimi da; fez-se passar uma corrente de azoto através do balão.
A mistura reaccional foi agitada , à temperatura ambiente durante 3 horas. Em seguida, a mistura reaccional foi filtrada através de um pegueno funil de frita para remoção da diciclohexilureia gue precipitou. O éster de N-hidroxi-succinimida resultante foi utilizado imediatamente para a conjugação à proteína.
Preparação de um conjugado de estrona-3-glucurónido e de fosfatase alcalina
Uma solução do éster de N-hidroxi -succinimida da estrona-3-glucurónido (114 çl, 230 mmoles) em dimetilformamida, foi adicionada a uma solução de fosfa tase alcalina (0,26 ml; 9,8 mg/ml ) , em borato de potássio O,1M, fosfato de potássio 0,05M e cloreto de sódio 0,15M, pH = 8,75. A mistura reaccional foi agitada, à temperatura ambiente, durante 12 horas. O conjugado de fosfatase alcalina e de estrona-3-glucurónido foi purificada mediante cromatografia, numa coluna de Sephadex G-25.
-78Preparação de anticorpos de IgG caprina , imobilizados sobre látex , purificados relativamente à sua afinidade (especificidade ) contra o fragmento de Fc de IgG de ratos
IgG caprina para Fc de ratos , purificadas relativamente à sua afinidade (Imunosearch ) e partículas de látex de poliestireno (sulfatadas, 1,07 çm ) (Interfacial. Dynamics) foram incubados, em separado a 45°C, durante 1 hora, e a solução de anticorpos foi tamponada com ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico 0,1 M, a um pH de 5,5.
Durante a centrifugação desta solução, a suspensão das partículas de látex foi adicionada à solução de anticorpos , de modo tal que a concentração final atingisse 0,3 mg/ml e a solução contivesse 1% de sólidos de látex. A suspensão resultante foi incubada durante 2 horas, a 45QC, antes da centrifugação da suspensão para a homogenização das partículas de látex. A massa do látex (pellets ) foi novamente suspensa em soroalbumina bovina, a 1% , numa solução salina tamponada com fosfato (PBS), e foi incubada durante 1 hora, à temperatura ambiente. A seguir à centrifugação para homogenizar o látex , o látex conglomerado foi lavada , 3 vezes por suspensão em PBS e centrifugação. A massa final homogenizada foi de novo suspensa em PBS, contendo azida de sódio, a 0,1%, pH = 7,0, numa concentração de látex de 1% de sólidos. Esta preparação foi utilizada para determinar a reacção imunológica de conjugados e como meio facultativo para a remoção de anticorpos monoclonais da mistura reaccional no âmbito do ensaio para estrona-3-glucurónido. Uma suspensão a 1% desta preparação de látex foi capaz de se combinar com 40 yg/ml do anticorpo monoclonal.
Medição da reacção imunológica de conjugados
Para determinar a fracção do conjugado de análogo do ligando que se podia ligar ao anticorpo, o anticorpo monoclonal especifico para o ligando-alvo foi incubado com uma quantidade de conjugado de análogo do ligando tal que estivesse presente um número de anticorpos suficiente para a ligação de todos os conjugados associados a ligandos ligáveis. Adicionou-se uma quantidade suficiente de látex de IgG caprina para Fc de ratos para a ligação total de todos os conjugados monoclonais , juntamente com qualquer conjugado que estivesse a eles ligados. 0 látex foi separado da mistura mediante centrifugação, e a quantidade da actividade enzimática remanescente no material que sobrenadava foi medida e comparada com a quantidade total de actividade enzimática adicionada à mistura. A percentagem de conjugado imunoreactivo erá a percentagem da actividade enzimática total ligada à massa de látex. Conjugados que apresentavam uma elevada imunoreacção representavam conjugados altamente substituídos por análogos de ligandos , enquanto que os conjugados com uma baixa imunoreacção representavam conjugados menos intensamente substituídos.
Ensaio para estrona-3-glucurónido mediante um meio facultativo para a remoção de anticorpos da mistura reaccional
Preparou-se um conjugado de estrona-3-glucurónido e de fosfatase alcalina e determinou-se a sua imunoreacção da maneira referida atrás , mediante um anticorpo monoclonal, clone -fe 27, fornecido pelos Interpharm Laboratories, Rehovot, Israel.
Verificou-se que o conjugado tinha uma imunoreacção de 99,9% indicando de que a enzima estava altamente substituída. Prepararam-se padrões de estrona-3-glcurónido a partir de diluições de uma solução-stock 1 mM , preparada pela dissolução de uma quantidade ponderada de estrona-3-glucurónido. Prepararam-se misturas dos padrões e do conjugado, e 100 çl de cada mistura foram adicionados a um volume igual ao anticorpo monoclonal , numa concentração de 10 çg/ml , numa suspensão de látex de IgG caprina para Fc de ratos, em pratos de microtitulação. As misturas contendo os conjugados numa concentração final de 4 nM , e os anticorpos numa concentração final de 31 mM , foram incubadas durante 5 minutos, sob agitação moderada, antes de se proceder à centrifugação para homogeneizar o látex.
yl do material sobrenadante de cada prato ou tubo foram adicionados a recipientes de micro-titulação , contendo um anticorpo monoclonal imobilizado, clone ~t 27 (placas COBIND MicroMembranes , anticorpo imobilizado numa concentração de 100 çg/ml, seguindo as instruções do fabricante/, e incubados durante 30 minutos, à temperatura ambiente, sob agitação moderada. Lavaram-se os pratos ou tubos, 5 vezes com uma solução salina tamponada com borato, pH = 8,2, e a presença da actividade de enzima ligada foi determinada pela adição de 200 çl de monofosfato de fenolftaleina 10 mM , tamponado com 2-amino-2-metil-l-propanol, a pH = 10,2;
mediu-se a cinética da formação de fenolftaleína , a 560 nm , mediante um dispositivo explorador de tubos de microtitulação , de raios UV , max (Molecular Devices). Além disso, determinou-se a actividade enzimática remanescente no material que sobrenadava , removendo 10 gl do material sobrenadante após a homogeneização do látex , e adicionando-os a 200 çl de monofosfato de fenolftaleina 10 mM, em seguida, procedeu-se à medição da cinética da formação de fenolftaleína a 560 nm, tal como atrás se descreve.
Os resultados obtidos vêm apresentadas na Tabela I, relativamente à concentração de estrona-3-glucurónido na mistura reaccional. Os resultados mostram nitidamente de que até a concentração de estrona-3-glucurónido atingir 30 mM , tanto a actividade enzimática ligada a anti-estrona-3-glucurónido nos pratos, como a actividade enzimática no material sobrenadante, permanecem a niveis muito baixos. Práticamente a totalidade do conjugado imunoreactivo encontra-se ligada ao anticorpo na mistura reaccional , até que a concentração de estrona-3-glucurónido exceda a concentração-limiar do ensaio que , no presente caso, é de cerca de 30 mM. A actividade da enzima ligada ao anticorpo imobilizado nos pratos de microtitulação chega ao seu valor máximo antes de a actividade de enzima livre no material sobrenadante atingir o máximo, dado que a quantidade de anticorpo imobilizado nos pratos (tubos) é insuficiente para a ligação da totalidade do conjugado disponível na presença das concentrações de estrona-3-glucurónido adoptadas neste caso. Os resultados apurados indicam de que uma fase sólida terminal dotada de uma maior capacidade potencial para a imobilização de anticorpos poderia melhorar a extensão dinâmicacfes respostas deste ensaio.
Tabela I
Estrona-3-glucurónido Actividade de enzima ligada à fase sólida (nM) terminal (mOD/min)
Actividade de enzima no material que sobrenada (moD/min)
0 0,3 0,8
10 0,4 0,6
20 0,4 0,4
30 5,3 2,6
40 V 3Λ
50 2,7 3I5
60 4,8 5)5
70 6,8 6,7
80 12,6 9,4
90 10,2 9Z2
100 10,2 10,6
200 18,8 23,3
500 16.8 37,1
1000 X3,5 46,8
Ensaio para estrona-3-glucurónido, utilizando uma membrana como fase sólida terminal
Um anticorpo monoclonal contra estrona-3-flucurónido, clone 155 B3 (Interpharm Laboratories) foi imobilizado em tubos ou pratos de microtitulação (16-well), que continham uma membrana Immobilon como demento inferior dos pratos (Millipore Corporation). Os anticorpos foram dispersos sobre cada prato com membranas , pela aplicação de 0,6 pl de uma solução contendo 6 mg/ml de anticorpo, fosfato de potássio 0,1 M, 10 mg/ml de tetrazole e álcool polivinilico a 0,1% (peso molecular médio = 2000) pH = 7,4, e foram incubados durante 20 minutos, à temperatura ambiente , antes de se juntar 20 pl de uma solução contendo 10 mg/ml de caseína, fosfato de potássio 0,1M, 10 mg/ml de tetrazole, e 0,1% de álcool polivinilico, pH = 7,4, proce deu-se à incubação durante 5 minutos.
A solução em excesso foi removida mediante papel absorvente e os pratos foram secos numa câmara exsicadora, antes de serem utilizados em ensaios, como fase sólida terminal.
Realizaram-se ensaios , misturando volumes iguais de amostras padrão de estrona-3-glucurónido e de conjugados de estrona-3-glucurónido-fosfatase alcalina, juntando-se a estas misturas uma quantidade de um anticorpo contra estrona-3-glucurónido, tal que a gama de concen trações coberta pelas amostras-padrão abrangisse a concentração-limiar esperada, e determinada pela selecção da concentração de anticorpos. Para cada uma das misturas , o volume reaccional total foi de 60 pl.
separaram-se 20
Ol
Passados de cada mistura minutos reaccional de incubação sendo adicio-84-
nados aos pratos contendo o anticorpo imobilizado sobre membranas. As membranas ficavam em contacto com a mistura reaccional durante aerca de 1 minuto, antes de se lavar cada prato, por meio de filtração, sob vácuo, com 3 porções de 200 pl de uma solução salina tamponada com borato, contendo 0,05% de Lubrol PX, pH = 8,2.
Os pratos foram enxaguados por filtração, sob vácuo, com 50 pl de uma solução de substracto contendo monofosfato de fenolftaleína 10 mM, pH = 10 ,2.
Os pratos foram secos, aplicando-se nos fundos dos pratos um papel absorvente, sendo 50 pl da mesma solução de substracto adicionados a cada prato.
A velocidade de formação de fenolftaleína foi medida, cinéticamente, mediante um dispositivo de leitura para pratos de microtitulação à luz UV (560 nm) (Molecular Devices). Terminada a leitura do instrumento, os pratos foram lavados com 50 pl de uma solução-substracto contendo 10 mM de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo (BCIP) a pH = 10,2; em seguida,, os pratos foram libertos de solução em excesso com papel absorvente , juntando-se 50 pl de BCIP-substracto, para se obter uma resposta visual do ensaio.
Decorridos cerca de 10 minutos , a reacção foi interrompida pela adição de 50 pl de EDTA 500 mM; os fluidos em excesso foram retirados das membranas mediante papel absorvente. As respostas visuais foram comparadas com as medições obtidas por meio dos instrumentos, a fim de se poder confirmar o desenvolvimento de sinais específicos; coincidiam tanto as respostas visuais como as respostas obtidas mediante instrumentos no ensaio aqui descrito, e não se detectaram quaisquer reqeostas visuais em pratos onde a concentração de estrona-3-glucurónido se encontrava abaixo da concentração-limiar.
A Tabela II apresenta os resultados de dois desses ensaios; um ensaio em que foi utilizado um conjugado fortemente substituído, com uma reactividade imunológica de 90% , e um segundo ensaio, em que foi empregado um conjugado fracamente substituído, com uma reactividade imunológica de 26%. O conjugado altamente substituído (derivado) apresentas uma concentração-limiar de cerca de 100 mM neste ensaio, verificando-se um aumento gradual da intensidade da resposta, até a um valor máximo, a que se chegou numa concentração de cerca de 1000 mM.
No ensaio em que se utilizou o conjugado com uma reactividade imunológica de 26%, apresentou uma concentração-limiar de cerca de 120 mM e uma resposta do ensaio, cuja intensidade aumentava mais rapidamente em função da concentração do ligando. Verificámos de que a extensão da substituição, tal como vem revelado pela reactividade imunológica (%) para o conjugado, é útil para prognosticar as características em termos de resposta do ensaio que cada conjugado irá apresentar. Conjugados altamente substituídos resultam em respostas de ensaio que apresentam 'declives' (gradientes) de respostas menos elevadas do que os conjugados menos substituídos. Esta propriedade pode ser aproveitada pelos peritos na matéria para optimizar um ensaio para uma aplicação especifica.
Tabela II
Estrona-3-glucurónido 25 (nM ) Conjugado com uma reactividade imunológica de 90% Actividade de enzima ligada à fase sólida terminal (mOD/min) Conjugado com uma reactividade imunológica de 26%. Actividade de enzima ligada à fase sólida
terminal (mOD/min)
0 0,0 0,0
20 0,0 0,0
40 0,1 0,0
60 0,0 0,0
80 0,0 0,1
100 0,2 0,1
120 0,3 0,4
140 0,3 1,0
160 0,9 2,9
180 b2 4,0
200 4r3
1000 17,0 18,9
Determinação da altura em que se aproximam as condições para a ligação de equilíbrio no âmbito de um ensaio para estrona-3-glucurónido
Para a determinação do periodo de incubação necessário para que na mistura reaccional se estabeleçam, substancialmente, as condições para a ligação de equilíbrio, o parâmetro mais importante que convém examinar é a resposta do ensaio que se dá próximo da concentração-limiar, dado que a aproximação das condições de ligação de equilíbrio se processa da forma mais lenta nestas concentrações do ligando-alvo. Um método adequado para a realização do ensaio consiste na utilização de concentrações do ligando-alvo acima e átaixo da concentração-limiar e na verificação do efeito da variação do periodo de incubação da mistura reaccional sobre a resposta do ensaio, naquelas concentrações. O ensaio para estrona-3-glucurónido foi raelizado tal como se descreve no exemplo anterior , utilizando uma membrana como fase sólida terminal e o conjugado com uma reactividade imunológica de 26%, com amostras-padrão de estrona-3-glucurónido em número apropriado para que a concentração na mistura reaccional se elevasse a 100 ou a 140 nM, abrangendo a concentração-1imiar observada de 120 mM. As misturas reaccionais foram incubadas durante 1, 3, 6 ou 10 minutos, para se dteerminar o tempo mínimo necessário para se chegar substancialmente às condições de ligação de equilíbrio. Os resultados indicados na tabela III mostram de que um periodo de incubação de 6 minutos é suficiente, de modo que não se observa qualquer sinal detectável em msituras de ensaio contendo 100 nM estrona-3-glucurónido, ao passo que a resposta do ensaio, em imunoensaios contendo 140 nM , continua a ser visivel .
TABELA III
Mistura reaccional (mOD/min)
Tempo de incubação (min)
Actividade de enzima ligada à fase sólida terminal 100 nM 140 nM
0,6 2,5
0,3 1,4
0 ,05 1,1
0,0 0,5
EXEMPLO 2
Preparação do éster de N-hidroxi-succinimida de 5beta-pregnano-3alfa,20alfa-diol-glucurónido dissolveram-se 13,3 mg (25 çmoles de pregnanodiol-glucurónido e 2,9 mg (25 çmoles ) de N-hidroxi-succinimida em 0,1 ml de dimetilformamida anidra. Juntaram-se 5,7 mg (27,5 ymoles) de diciclohexilcarbodiimida e o tubo de ensaio foi submetido a uma corrente de azoto A mistura reaccional foi agitada, à temperatura ambiente durante 3 horas . A mistura reaccional foi filtrada através de um pequeno funil de frita para remover a diciclohexi1ureia precipitada, e o solvente foi separado, num vácuo. Juntou-se metanol anidro ao resíduo e o balão foi arrefe-89cido a -20SC, para precipitar o éster de N-hidroxi-succinimida. Os cristais resultantes foram isolados, secos e conservados em estado anidro, a -20QC. (rendimento: 12 mg).
Preparação do conjugado de pregnanodiol-3alfa-glucurónido e de fosfatase alcalina éster de N-hidroxi-succinimida de pregnanodiol-glucurónido foi dissolvido em acetonitrilo anidro; a solução foi lavada a reagir com fosfatase alcalina, numa concentração de 8 mg/ml de proteína, utilizando-se um excesso molar décuplo do éster N-hidroxi-succinimida.
A reacção decorreu em solução salina tamponada com fosfato , a pH de 7,0, durante 90 minutos. Removeu-se o material proteico dos reagentes mediante cromatografia (coluna G-25), medindo-se a sua reactividade imunológica tal como atrás se refere. Resultado: rea±ividade imunológica de 96%.
Doseamento de pregnanodiol-3alfa-glucurónido, em que se emprega uma membrana como fase sólida terminal
Imobilizou-se um anticorpo monoclonal para pregnanodiol-3-alfa-glucurónido (clone P 44 , Interpham Laboratories) sobre membranas 'Immobilon' em caixas de microtitulação ('16-well') tal como se descreve atrás; no entanto, no presente caso a concentração do anticorpo que se adoptou para a imobilização foi de 16 mg/ml.
Realizaram-se ensaios, misturando volumes iguais de amostras-padrão de pregnanodiol-3-alfa-glucurónido e o conjugado de fosfatase alcalina e de pregnano-diol-3alfa-glucurónido; às misturas assim obtidas adicionaram-se quantidades do anticorpo para pregnanodiol -3-alfa-glucurónido que foram selecionadas de modo a que a gama de concentrações abrangida pelas amostras-padrão incluísse a concentração-limiar determinada pela concentração de anticorpo escolhida. Para cada mistura, o volume total da mistura reaccional foi de 60 yl. A mistura reaccional foi incubada durante 10 minutos , e todos os restantes doseamentos realizaram-se tal como se descreve atrás , no ensaio para estrona-3-glucurónido. Os resultados obtidos apresentam-se na tabela IV; eles refelctem uma concentração-limiar de cerca de 3 mmoles para o primeiro resultado visualmente detectável . Além disso, os resultados revelam um efeito hook que se pode observar naqueles ensaios imunológicos nos quais a asssociação de ligando livre e de conjugado de análogo do ligando livre na mistura reaccional existe num excesso substancial em relação à quantidade do receptor imobilizado na fase sólida terminal.
Se compararmos a resposta máxima do ensaio que, no presente imunoensaio , vai surgindo a cerca de 50 ymoles , com a resposta máxima potencial que se poderia obter se a totalidade do conjugado de análogo do ligand^ livre estivesse ligada à fase sólida terminal (o que se pode determinar , fazendo reagir apenas se a mistura reaccional contendo o conjugado com a fase sólida terminal ) , então apenas se conseguirá 4% da resposta máxima potencial. A utilização de fases sólidas terminais com quantidades crescentes do anticorpo imobilizado, a utilização de conjugados altamente substituídos, gue são capazes de competir de forma eficaz com o ligando para os locais de ligação disponíveis na fase sólida terminal , bem como a adopção de elevadas
concentrações do conjugado de análogo do ligando, representam vias eficazes para melhorar a resposta máxima nos ensaios, em que seja elevada a concentração-limiar, de modo a minimizar o perigo de um efeito de hook . Os peritos na matéria certamente sabem de que qualquer combinação destes paramêtros para optimizar a resposta de um ensaio sempre dependerá dos objectivos de uma determinada aplicação de um imunoensaio.
Tabela IV /_Pregnano-diol-3alfa-glucurónido7 Actividade de enzima (gmole )_ ligada à fase sólida terminal (nDO/min )
100
0,0
0,1
0,3
0,9
1,6
2,7
2.9
2.7
3.9
4.7
4.8 6,5
-92EXEMPLO 3
Doseamentos múltiplos , simultâneos , de drogas de dependência seguinte exemplo vai explicitar a aplicação do processo do invento a um ensaio para drogas que podem causar um quadro de dependência (toximania). Um conjunto de drogas deste tipo, que são úteis para o doseamento de amostras de urina, deverá incluir as 5 drogas consids radas especialmente importantes pelo Instituto nacional de Drogas (NIDA), ou seja, anfetanina , cocaína, opiatos, fenociclidina e canabinóides. A produção de anticorpos para estes haptenos requer a síntese de agentes imunológicos. Métodos para a preparação destes ' iminogénios' são conhecidos dos peritos na matéria. Cf., por ex., as patentes norte-americanas Nos. 3.817.837, 3.878.187, 3.884.898 4.203.802 e 4.281.065 e Rodgers R., Crowl, C.P., Eimstad ,
W.M., Hu , M.W., Kam, K. J. Ronald, R.C., Rowley , G.L. e Ullman , E.F., Clin. Chem. 24, 95-100 (1976).
Em seguida, utilizam-se os imunogénios , produzidos pelos referidos métodos , para imunizar ratos com o fim de suscitar uma resposta imunológica relativamente às drogas em questão. A seguir à obtenção da resposta imunológica, os ratos são sacrificados e as células do baço são combinadas com células de mieloma para a produção de estirpes de células de hibridoma capazes de segregar anticorpos.
Uma caracterização mais exacta dos anticorpos derivados das estirpes de células é conseguida pela utilização dos imunogénios empregados no âmbito dos métodos de imunização. Os métodos para produzir e caracterizar antinrpos monoclonais são bem conhecidos dos técnicos do ramo; cf., por ex., Liu, D., Purssell , R., e Levy,
-93J.G. , Clinicai Toxicology, 25, 527-538 (1987). As drogas e agentes químicos que se utilizam para a criação de imunogénios são também utilizados na sintese de conjugados de droga-enzima , que se compõem de enzimas , tal como fosfatase alcalina do intestino de vitelos, substituídas (modificadas por drogas-alvo. Os peritos na matéria também conhecem métodos para a preparação destas enzimas modificadas por drogas; cf., por ex., as patentes norte-americanas Nos. 3.817. 837 e 4.203.802.
Prepara-se uma fase reaccional a partir de quantidades apropriadas dos conjugados de droga-enzima e dos 'anticorpos monoclonais contra o conjugado de drogas 'preconizadas' pelo NIDA.
As quantidades dos anticorpos são escolhidas de modo a que as concentrações-limiares das drogas, determinadas pelo ensaio, sejam compatíveis com as concentrações recomendadas pelo NIDA para a 'destrinça ' de amostras negativas e de amostras positivas. Estas concentrações-limiar são para a anfetamina; 1000 ng/ml , para as drogas derivadas de Cánnabis: 100 ng/ml, para a cocaína:
300 ng/ml, para os cpiatos : 300 ng/ml e para a fenociclidina 25 ng/ml. A amostra é misturada com a fase reaccional, pelo que se forma uma mistura reaccional; Prossegue a reacção na mistura reaccional até que as várias reacções de competição tenham chegado, substancialmente, às condições de ligação em equilíbrio. Em seguida, a mistura reaccional é posta em contacto com um dispositivo experimental, que é constituído, em parte por uma membrana sobre a qual foram imobilizados anticorpos contra as drogas , em zonas reaccionais discretas, separadas. O número de zonas reaccionais 'anti-droga' corresponde ao número de pares de conjugado de droga-enzima: os anticorpos 'anti-droga'. Métodos para a imobilização de anticorpos sobre membranas são bem conhe-94cidos dos peritos na matéria; cf. , por ex. , Pluskal, M.G. , Przekop, M.B., Kavonian, M.R., Vecoli, D., Hicks , D.A., BioTechniques, £, 272-283 (1986).
Qualquer conjugado de 'droga-enzima' que não estivesse ligado ao anticorpo 'anti-droga' solúvel na mistura reaccional , terminada a reacção passa então a formar complexos com o anticorpo 'anti-droga ' imobilizado sobre a membrana, dentro da zona reaccio nal, especifica para a droga. Utiliza-se uma solução de lavagem para separar qualquer conjugado de droga enzima livre , remanescente , na mistura reaccional , do conjugado de droga-enzima ligado à membrana.
Em seguida, a membrana reage com uma solução contendo um substracto aproipriado para a enzima, capaz de suscitar um sinal de cor visível, por ex., para a fosfatase alcalina do intestino do vitelo , uma solução contendo fosfato de 3-indoxilo seria adequada. Espera-se pelo aparecimento da cor, e a resposta de cada zona reaccional é interpretada no sentido de a ausência de qualquer cor detectável assinalar de que a droga 'captada' naquela zona se encontra numa concentração inferior à concentração-limiar e a presença de uma cor detectável indicar de que a droga-alvo está presente numa concentração substancialmente equivalente à , ou superior à concentração-limiar . Cada zona reaccional pode ser avaliada em separado, o que permite a caracterização de todas as 5 drogas-alvo como sendo positivas ou negativas em relação às concentrações-limiar especificadas pelo NIDA.
-95EXEMPLO 4
Preparação de Hidrocloreto de 3-0-carboximetil-mor fina
Dissolveram-se 1,67 g ( 5 x 10 -2 moles) de sulfato de morfina com 2,07 g (1,5 x 10”^ moles) de carbonato de potássio, em 80 ml de etanol. A solução resultante foi aquecida, ao refluxo , sob agitação , juntando-se uma solução contendo ácido bromoacético (0,7 g;
x 10 3 moles) em 2 ml de etanol. A solução foi mantida ao refluxo durante 2 horas; em seguida, o balão foi arrefecido num banho de água gelada. Ajustou-se a 3 o valor do pH, pela adição de ácido clorídrico 12N, e filtraram-se os precipitados. Os solventes foram evaporados, num vazio, adicionaram-se ao residuo 10 ml de etanol.
Filtraram-se os precipitados e evaporaram-se os solventes num vácuo. O residuo foi recris talizado a partir de água/acetona (10 : 90). Recolheram-se cerca de 300 mg de produto final.
Preparação de hidrocloreto de 3-0-/2-tiolactona de ácido 2amino-4-tiolbutanóico)-acetamida7-morfina (HCTL de morfina)
Dissolveram-se 120 mg (7,8 x 10 moles) de cloridrato de tiolactona da homo-cisteina, 62 — 4 — 4 mg (7,8 x 10 moles) de piridina e 296 mg (7,8 x 10 moles de cloridrato de 3-O-carboximetilmorfínio em 5 ml de dimetilf ormamida. Segiu-se a adição de 1 ml de uma solução de dimetilformamida contendo 177 mg (8,6 x 10-^ moles) de
diciclohexilcarbodiimida. Fez-se passar uma corrente de árgon através do balão, e a solução foi agitada, a 25°C, durante 3 horas. 0 solvente foi evaporado, num vácuo, juntando-se 20 ml de água ao residuo formado. A solução foi agitada durante 5 minutos e, em seguida, a diciclohexilureia insolúvel foi separada por filtração. O filtrado foi lavado com 10 ml de cloreto de metileno, o valor do pH da fase aquosa foi ajustado a 7 pela adição de uma solução aquosa saturada de carbonato de potássio. A solução aquosa foi extraída 6 vezes com 10 ml de cloreto de metileno. Os extractos orgânicos reunidos foram secos sobre 2 mg de sulfato de magnésio, filtrados, e o solvente foi removido num vácuo. Juntaram-se 20 ml de etanol ao residuo e a solução foi evaporada, num vácuo, para remover a piridina.
Juntaram-se 10 ml de acetato de etilo e filtraram-se os precipitados insolúveis. Adicionou-se à solução ácido clorídrico eterificado (1M) sob agitação, até o indicador (tornassol) da reacção ácida (vermelho) O sólido branco foifiltrado e lavado com acetato de etilo.
produto foi seco, num vácuo, rendimento: 316 mg.
Preparação de um conjugado de morfina e de fosfatase alcalin
Adicionaram-se 3 mg (6,9 x 10“ moles) de sulfo-SMCC (Pierce) e 2,2 ml de fosfatase alcalina (4,9 mg/ml) em fosfato de potássio 0 , 1M , borato de potássio 0,02 M, cloreto de sódio 0,15M (pH = 7,5).
A solução proteica foi agitada durante 1 hora, a 259C, e, em seguida, a proteina foi separada do sulfo-SMCC que não reagiu , mediante cromatogra fia de filtração em gel, numa coluna contendo 40 ml de GH 25 (Amicon Corp.) equilibrada em fosfato de potássio 0,1 M borato de potássio 0 ,02M, cloreto de sódio 0 ,15 M, (pH = = 7,0). Colheu-se a fracção proteica eluida da coluna. Procedeu-se à hidrólise da HCTL-morfina pela adição de 63 gl de carbonato de potássio 0,12M, e de EDTA 0,6 mmoles em 40 % de metanol, a 0,6 mg de HCTL de morfina. Deixou-se a solução em repouso, a 25°C, durante 10 minutos, e, em seguida, 30 gl da solução foram adicionados a 250 gl da fosfatase alcalina modificada com sulfo-SMCC (3,6 mg/ml) em fosfato de potássio 0 , 1M , borato de potássio 0,02 M, cloreto de sódio 0,15M, cloreto de magnésio 0,4 mmoles, pH - 7,0. A solução foi agitada durante 30 minutos, a 25°C e a proteina foi separada dos reagentes que não reagiram, mediante cromatografia de filtração em gel, tal como atrás se descreve.
Colheu-se a fracção proteica e diluiu-se o conjugado, para poder ser utilizado nos ensaios , numa solução contendo 1% de soro albumina bovina cloreto de magnésio 1 mmole, cloreto de zinco 0,1 mmole, azida de sódio a 0 ,1%, e ácido 3-(4-morfolino)-propanossulfónico 10 mmoles, pH = 7,0.
Doseamento de morfina com utilização de um único ponto de calibração
Preparou-se um conjugado de morfina e de fosfatase alcalina; determinou-se a reactividade imunológica de maneira atrás referida, utilizando um anticorpo monoclonal seleccionado em virtude da sua elevada afinidade para a morfina. Verificou-se de que a imunoreactividade do conjugado foi de } 99%.
Preparou-se uma solução-stock de morfina , num tampão, dissolvendo-se uma quantidade ponderada de morfina num volume conhecido. Uma solução-padrão contendo 1000 moles de morfina foi preparada a partir da solução-stock e soluções-padrão adicionais a utilizar no ensaio foram preparadas a partir desta solução-padrão por diluição directa. 0 ensaio foi raelizado com uma placa de microtitulação juntando-se a cada caixa 25 yl de anticorpo numa concentração escolhida de modo a obterem-se concentrações-limiar dentro da gama de concentrações abrangida pelas soluções-padrão.
Adicionaram-se soluções-padrão contendo 0 , 60 , 70 , 80 , 90 , 100 , 150 , 200 , 300 , 400 e 500 mmoles de morfina, aos tubos (caixas) de microtitulação (25 yl por tubo, 6 réplicas por cada uma das concentrações utilizadas ) . O conjugado de morfina e de fosfatase alcalina foi adicionado, em volumes de 25 yl, a cada tubo ou caixa de ensaio, numa concentração final de fosfatase alcalina de cerca de 1 nmole. As misturas reaccionais foram incubadas durante 30 minutos , à temperatura ambiente , antes de se adici<{> narem 25 yl de uma suspensão a 1% de látex de IgG caprina para Fc de ratos prosseguindo a incubação por mais 5 minutos. As misturas reaccionais foram submetidas a centrifugação para
se obter o látex sob a forma de grânulos (grumos ) e 25 çl do material sobrenadante foram removidos de cada tubo, analisando-se a respectiva actividade enzimática , misturando o material com 200 çl de monofosfato de fenolftaleína 10 nM , tamponado com 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP) a um pH de 10,2, mediu-se a cinética da formação de fenolftaleína a 560 nm , tal como atrás se descreve. Para a determinação da resposta máxima potencial do ensaio , efectuaram-se 6 doseamentos repetidos (réplicas), substituindo-se a solução de anticorpo pelo diluente do ensaio , de modo que a actividade medida representasse a totalidade da actividade enzimática obtida, no caso de a totalidade do conjugado não ter sido ligada aos anticorpos.
A proporção de actividade livre para actividade ligada para cada concentração-padrão foi determinada, dividindo a resposta 'média' (actividade livre) pela diferença entre a resposta média máxima e a resposta média (actividade ligada).
A razão da actividade livre para a actividade ligada como função da concentração de morfina na amostra foi determinada por meio de análise de regressão linear, em relação à soluções-padrão que apresentavam concentrações acima da concentração-limiar que não se aproximasse da resposta máxima, quando o erro no cálculo da razão entre 'livre' e 'ligado' se fazia sentir de forma mais evidente.
Verificou-se de que as soluções-padrão em concentrações de 60, 70 e 80 nM se situavam abaixo da concentração-limiar e não suscitaram qualquer resposta do ensaio acima do ruido de fundo do sistema de ensaio. Os padrões de 300, 400 e 500 nM geraram respostas próximas do nivel da resposta máxima, dando erros consideráveis no cálculo da relação de 'livre' para 'ligado'. As respostas do ensaio obtidas com os padrões de 90, 100, 150 e 200 nM, foram empregadas para a análise de regressão linear, a fim de se poder determinar a dependência linear da razão de conjugado livre para conjugado ligado como função da concentração de morfina. A inclinação da linha foi equivalente a 29,346 unidades por gM e o 'intercept' (Parte de linha entre dois pontos de intersecção com outras linhas ) da razão de eixo livre para eixo ligado correspondia a -2,613 unidades. Estes parâmetros são constantes do sistema de ensaio , desde que não se verifiquem quaisquer alterações nos reagentes de ensaio e nos seus volumes respectivos.
Eles podem utilizar-se para a determinação da concentração de morfina no âmbito de ensaios de amostras, pelo cálculo da concentração de morfina através da expressão (R + 2,613) / Morfina 7 = _ (29 , 346 ) onde a razão de conjugado livre para conjugado ligado é determinada, dividindo a resposta do ensaio relativamente à amostra pela diferença entre a resposta máxima e a respost do ensaio. Com utilização das respostas individuais obtidas no presente ensaio para as 6 réplicas do calibrador, a 150 nM , determinaram-se as respostas máximas do ensaio.
do co en a
ensaio n jugado saio em determin
Em seguida, cada resposta máxima foi aproveitada para o cálculo da razão entre livre e conjugado ligado para cada resposta do relação aos padrões de 90, 100 e 200 nM, e para ação da correspondente concentração de morfina
-101-
por meio da regressão linear atrás referida. A precisão e exactidão da determinação das concentrações das soluções-padrão por meio deste método constituem uma boa aproximação para a avaliação do rendimento (performance) do sistema do ensaio no que se refere à determinação de concentrações desconhecidas de morfina em amostras. Os resultados reunidos no quadro V indicam de que o ensaio fornece respostas muito exactas para a quantificação de concentrações de morfina dentro da gama de 90 a 200 nM. Há que sublinhar-se de que as concentrações efectivas dos padrões não são necessariamente idênticas aos valores atribuidos pela diluição das soluções-stock atrás mencionados. Geralmente, a gama 'util ' do ensaio abrange a extensão de 0,05 a 4 na razão de livre para ligado. A extensão da concentração do ligando que corresponde a esta gama pode ser seleccionada consoante os objectivos do sistema de ensaio que lança mão dos métodos descritos na presente memória.
Tabela V
Doseamento de morfina mediante um único ponto de calibração (150 nM)
Resposta Resposta Cale.mor Cale.mor Cale.mor
calibrador máxima Resposta Cina Resposta fina Resposta fina
(mOO/min) (mOD/min) (mOD/min) (nM) (mOD/min) (nM) (mOD/min) (nM)
37, 1 58,5823 5,2 92,36 .14,4 100,15 44,9 200,87
91,34 12,7 98,47 45,6 208,73
5,9 92,86 13,6 99,34 45,2 204 ,14
5,0 92,22 13,5 99,25 45,5 207,56
5r5 92,57 13,3 99,05 45,7 209,93
4,3 91,74 10,9 96,83 45,0 201,94
média 92.18 / 98,85 205,53
C. V. 0,60% 1,14% 1,82%
36,8 58,1086 5,2 92,39 14,4 100,27 44,9 204,88
3,7 91,36 12,7 98,57 45,6 213,27
5f9 92,89 13f 6 99,45 45,2 208,36
5,0 92,25 13,5 99,35 45,5 212,01
5r5 92;60 13,3 99,16 45,7 214,54
4,3 91,76 10,9 96,91 45,0 206,02
média 92,21 98,95 209,85
C. V. 0,61% 1, 15% 1,91%
38,1 60,1614 5,2 92,27 14r4 99,76 44,9 189,30
3,7 91,27 12,7 98,16 45,6 195,75
5,9 92,75 13,6 98,99 45,2 191,99
5,0 92,13 13,5 98,90 45,5 194,79
5,5 92r47 13,3 98,71 45,7 196,73
4,3 91,66 10,9 96,58 45, 0 190,18
média 92,09 98,52 193,12
C.V. 0,59% 1,10% lr59%
36{ 9 58j2665 5,2 92,38 14,4 100,23 44,9 203,51
3,7 91,35 12,7 98,54 45,6 211,72
5>9 92,88 13,6 99,42 45,2 206,92
5,0 92,24 13,5 99,32 45,5 210,49
5;5 92,59 13,3 99,12 45,7 212,96
4,3 91,76 10,9 96,88 45, 0 204,63
média 92,20 98,92 208,37
C.V. 0,68% 0,79% 1,75%
38T 0 60,0035 5,2 92,27 14,4 99,80 44,9 190,34
3,7 91,28 12,7 99,19 45,6 196,92
5r9 92,76 13,6 99,03 45,2 193,09
5,0 92, 14 13,5 98 ,93 45,5 195,94
5,5 92 ,48 13,3 98,75 45,7 197,92
4,3 91,67 10, 9 96,61 45,0 191,25
média 92,10 98,55 194 ,24
C.V. 0,59% 1,10% 1,61%
37t 7 59,5298 5,2 92,30 14,4 99,91 44,9 193,62
3,7 91,30 12,7 98,28 45,6 200r59
5,9 92,79 13,6 99,13 45,2 196,53
5,0 92.,17 13,5 99,04 45,5 199,55
5,5 92,51 13,3 98, 84 45,7 201,64
4,3 91,69 10,9 96,68 45,0 194,58
média 92,13 98,65 197,75
C.V. 0,59% 1,11% 1,68%
média global
C.V.
92,15
0,56%
98,74
1,02%
201,48 3 ,80%
EXEMPLO 5
Preparação de um conjugado de morfina e de soralbumina bovine gl de uma solução contendo 20 mg de SMCC (Plerce) em 1 ml de acetonitrilo, foram adicionados a 1,9 ml de soroalbumina bovina (20 mg/ml), em borato de potássio 0,1 M, fosfato de potássio 0,1 M, cloreto de sódio 0,15 M, pH = 7,5.
A solução foi agitada durante 1 hora, a 252C, e, em seguida, a proteina foi separada do reagente que não reagiu mediante cromatografia de filtração em gel, numa coluna contendo GH 25 (Amicon Corporation) equilibrada com fosfato de potássio 0,1 M borato de potássio 0,02 M, cloreto de sódio 0,15 M, pH = 7,0.
Colheu-se a fracção proteica, Juntou-se um volume de 0,42 ml de carbonato de potássio 0,12M, EDTA 0,6 M, em metanol a 40%, a 4 mg de HCTL de morfina. Decorridos 10 minutos, juntaram-se 140 çl da solução a 8,2 ml de soroalbumina bovina modificada com SMCC (4,6 mg/ /ml). A solução foi agitada durante 2 horas, a 25QC, e, em seguida, foi dialisada em 2 litros de ácido (2-(N-morfolino)) -etanossulfónico 10 mM, pH =5,0.
O tampão para a diálise foi substituído duas vezes antes da recolha do conjugado de morfina-soroalbumina bovina.
-10 5-
Preparação de um conjugado de morfina-ouro coloidal
Preparou-se ouro coloidal com um diâmetro médio de 45 nm de acordo com o método divulgado por Frens , Nature, Physical Sciences , 241 , 20 (1973). Preparou-se um conjugado de morfina ouro coloidal , adicionando 5,6 ml de ácido (2-(N-morfolino)-etanossulfónico (MES)
O,1M, pH = 5,8, gota a gota, a 50 ml de ouro coloidal, sob agitação rápida. O conjugado de morfina-soroalbumina bovina (BSA) (3 mg/ml, em MES 10 mM, 0,02% de azida de sódio) foi adicionado numa única porção(bolus) ao ouro coloidal sob agitação rápida. Depois da misturação total, suspendeu -se a agitação, e a solução foi incubada durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Seguiram-se a adição de 1 de BSA (3 mg/ml, em 10 mM MES, 0,02% de zida de sódio, pH = - 5,8), sob misturação após o que se segiu um periodo de incubação de 5 minutos.
Adicionou-se polietileno glicol (peso molecular médio = 20.000) numa solução de 1% (0,59 ml) e misturou-se a Solução.
Submeteu-se o ouro coloidal a centrifugação (27.000 G) durante 12 minutos, a 42C, a fim de se obter um granulado. O material que sobrenadava foi re movido e o grânulo foi lavado 2 vezes com 35 ml de fosfato de potássio 10 mM , polietileno glicol a 0 ,01%, azida de sódio a 0,02%, pH = 7,0, sendo novamente suspenso e centrifugado , tal como atrás se descreve. Após a centrifugação final, o grânulo foi de novo suspenso em 0,5 ml do tampão e a suspensão foi conservada a 42C.
-106Imunoensaio-limiar para morfina mediante um conjugado de morfina-ouro coloidal
Preparou-se um dispositivo de ensaio, com uma fase sólida terminal, utilizando-se uma membrana de nylon (Pall Biodyne C, tamanho dos poros =1,2 y), que foi colada sobre uma folha de poliestireno de material plástico com orifícios puncionados de 4 mm de diâmetro e uma fita adesiva sensível a pressão (adesivo de acrilo 444, 3M Company ) na sua superficie.
Um anticorpo monoclonal para a morfina foi imobilizado sobre a membrana de nylon, exposta nos orifícios no poliestireno, por adsorção. Uma solução' de 1 mg/ml do anticorpo, num tampão contendo citrato de sódio 0,1M, pH = 3,0, foi aplicada sobre a membrana (6 yl por cada orifício ) para a sua adsorção durante um período de alguns minutos , antes de se adicionar uma solução contend 0,5% de caseína, 0,5% de BSA, fosfato de potássio O,1M,
10% de sucrose , pH = 7,0 (10 yl por cada orifício) para bloquear os restantes locais de acforção. Os reagentes e amostras utilizados nas misturas reaccionais foram o conjuga do de morfina-ouro colidal atrás-descrito , diluído por um factor de 3, em 1% de BSA, fosfato de potássio 0 , 1M , cloreto de sódio 0,15 M, EDTA 0,01M, 0,01% de polietileno glicol (massa molecular média = 20.000) 0,02% de azida de sódio pH = 7,0 (a seguir designado por diluente), um anticorpo monoclonal para a morfina numa concentração de 0,27 mg/ml no diluente, e soluções-padrão de morfina de 0,1, 0,15, 0,2 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 e 0,5 yg/ml, em urina. As soluções-padrão foram preparadas por diluição directa, a partir de uma solução (1 yg/ml foi preparada a partir de uma solução-stock de 1 mg/ml , obtida pela dissolução de uma quantidade ponderada de sulfato de morfina. Os ensaios foram realizados em tubos de microtitulação pela adição de 10 yl da solução do anticorpo, 20 yl da amostra e 10 yl do conjugado, seguida de um periodo de incubação de 5 minutos, antes de por 20 yl da mistura reaccional em contacto com uma das membranas de nylon contendo o anticorpo imobilizado no dispositivo de ensaio.
A membrana exposta no orifício foi seguidamente posta em contacto com papel absorvente , do lado do fundo, de modo tal que a mistura reaccional fosse impelida através da mmebrana para dentro do papel absorvente. Qualquer conjugado que não ficasse ligado à membrana foi removido pela adição de uma gota de uma solução salina tamponada com borato, contendo 0,02% de Lubrol, um detergente não-ionogénico, pH = 9,0, enquanto a membrana ainda estava em contacto com o papel absorvente, para que a solução de lavagem pudesse atravessar o papel absorvente. A cor que surgia na membrana pode ser observada à vista desarmada , tendo sido registada mediante um dispositivo colorimétrico (Macbeth color-eye) a 540 nm. Os dados obtidos pela medição colorimetrica foram convertidos em unidades de E que são uma medida da diferença cromática minima que ainda se possa detectar à vista desarmada. Uma descrição mais detalhada desta unidade colorimétrica pode encontrar-se em Color in Business, Science and Industry by D.B. Judd and G. Wyszecki, John Wiley and Sons.
Os ensaios foram realizados num esquema cego, simples, com utilização de amostras codifi_ cadas, numa sequência randomizada, de modo que as concentrações das amostras não eram conhecidas durante os ensaios. Com cada uma das amostras realizaram-se, num total, 9 doseamentos repetidos (réplicas). Foi considerado como sendo positivo qualquer ensaio que resultasse numa cor visualmente detectável para além da cor de fundo da membrana.
-108♦,
os resultados das interpretações visuais dos ensaios estão apresentados, sumáriamente na figura 7. Indicam os resultados de que o ensaio é capaz de determinar de forma exacta a concentração de morfina em amostras em relação a uma concentração-limiar de 0 ,3 ílg/ml.
A figura 8 apresenta os resultados obtidos através das medições colorimétricas das respostas dos ensaios.
verifica-se de que o primeiro sinal visual detectável para além da cor de fundo da membrana surge a uma concentração de 0,3 çg/ml, notando-se de que a cor da resposta se intensifica rápidamente, elevando-se acima da concentração-limiar.
EXEMPLO 6
Preparação de estron-3-glucuron-(tiolactona de ácido 2-amino-4-tiolbutanóico)-amida (E3G-HCTL) mg (1,7 x 10 moles) de estrona-3-glucurónido, 29 mg de hídrocloreto de homo-4
-tiolactona de cisteina (1,9 χ 10 moles ) e 0,015 ml (1,9 -4 χ 10 moles) de piridina foram dissolvidos em 0,47 ml de dimetilformamida. A mistura resultante foi adicionada a uma _ 4 solução contendo 30 mg (1,9 χ 10 moles) de diciclohexilcarbodiimida em 0,23 ml de dimetilformamida. Faz-se borbulhar uma corrente de árgon através do balão; fechou-se o balão e procedeu-se a agitação durante 3 horas, a 25QC. Filtrou-se o precipitado insolúvel e removeu-se o solvente, num vácuo.
O residuo foi de novo suspenso em 0,4 ml de uma solução de etanol/água (15; 12 v/v) e os precipitados insolúveis foram removidos por meio de filtração.
Em seguida , a mistura reaccional bruta foi dissolvida em 0,5 ml de uma solução de etanol/água (15: 12 v/v) e aplicada sobre uma coluna C^g de HPLC (1 cm x 25 cm) equilibrada com uma mistura (1:9) de metanol/ /água, utilizando um débito de 2,0 ml/minuto.
O composto foi eluido com um gradiente entre uma mistura de 1: 9 de metanol/água e uma mistura de 1: 1 de metanol/água,durante 8 minutos e, em seguida, foi eluida com um gradiente de uma solução de 100% de metanol, dentro de mais 20 minutos. E3G-HCTL foi eluido dentro de 25 a 27 minutos. Reuniram-se as fracções que continham o produto final e os solventes foram removidos num vácuo.
Obtiveram-se 63 mg de E3G-HCTL.
Preparação de fosfatase alcalina-estrona-3-glucurónido
Procedeu-se à hidrólise de E3G-HCTL, introduzindo 3 gl de uma solução metan ólica de E3G-HCTL 210 mM em 20 gl de uma solução contendo ^2^θ3 M e EDTA 0,6 mM em 40% de metanol.
Deixada em repouso durante 10 minutos, a uma temperatura de 252C, a solução foi adicionada a 0 ,5 ml de uma solução contendo 1,8 mg/ml de fosfatase alcalina-SMCC, com fosfato de potássio 0,1 M, borato de potássio 0,02 M, cloreto de sódio 0,15 M e MgCl2 0 ,2 mM , a um pH de 7,0. A modificação da fosfatase alcalina com sulfo-SMCC vem descrita no exemplo 4.
-110-
A mistura reaccional foi agitada durante 3 horas, a 252C, e, em seguida, a solução resultante foi cromatografada numa coluna de 14 ml de GH 25 (Amicon ) , que tinha sido equilibrada com uma solução contendo fosfato de potássio 0,1 M, borato de potássio 0,02 M e clore to de sódio 0,15 M, a um pH de 7,0. 0 eluente de conjugado de fosfatase alcalina-E3G foi colhido, num rendimento de 1,5 ml, numa concentração de 0,16 mg/ml.
Preparação do laminado como fase sólida
Prepararam-se 6 folhas de uma membrana de nylon de 4,57 x 5,08 cm (5,0 ym de pall Biodine C) colocando as folhas em 6 ml de uma solução contendo 0,41 mg/ml de um anticorpo monoclonal para E3G e citrato de sódio 0,1 Μ, a um pH de 3,0. A solução foi agitada durante 1,5 horas a 25QC, e, em seguida, os locais de ligação em excesso para a proteina, disponíveis nas membranas, foram bloqueados, introduzindo as folhas de membrana em 20 ml de uma solução contendo fosfato de potássio 0,1 M, 0,1 $ de caseína (peso/volume ) 0 ,1% de Triton X-100 (v/v) e 10% de sucrose (peso/volume ) a um pHcfe 7,0;
em seguida, as folhas foram deixadas em repouso para poderem absorver a referida solução, durante 3 minutos. As membranas foram limpas com papel absorvente até ficarem secas e, em seguida, foram colocadas numa estufa (num vácuo) durante a noite.
As membranas foram cortadas em tiras de 0,76 x 5,08 cm e, em seguida, foram fixadas
sobre uma Tira de poliestireno (2,54 x 7,62 x 0,051 cm) com camada adesiva em ambas as faces. (3M Co.444). A tira de poliestireno e o laminado adesivo apresentavam uma fenda (abertura) de 0,254 χ 3,81 cm praticada no centro do laminado bi-estratifiçada.
Ensaio para estrona-3-glucurónido utilizando um laminado como a fase sólida
Prepararam-se as misturas reaccionais misturando amostras contendo estrona-3-glucurónido e fosfatase alcalina-E3G (AP-E3G) com um anticorpo monoclonal para E3G. Obtiveram-se, desta forma, Soluções contendj) 0,9 mg/ml de AP-E3G, 0,18 mg/ml de anticorpo monoclonal para E3G e E3G nas seguintes concentrações: 0,1 yM, 1,6 yM , 2,6 yM , 7,8 yM, 26 yM e 120 yM. Deixaram-se incubar as misturas reaccionais durante 8 minutos, a 25°C, após o que se aplicaram 50 yl da mistura reaccional a uma das extremida des da fenda praticada na membrana/laminado de poliestireno. Desta forma, a mistura reaccional pode migrar em sentido vertical sobre a membrana. Terminada a migração da mistura reaccional (dentro de cerca de 12 minutos), lavou-se a membrana , pondo a membrana em contacto com um agente absorvente e utilizando 0,5 ml de uma solução contendo borato de potássio 50 mM, naCl 0,15 M e 0,05% de Lubrol (v/v) como solução de lavagem. Em seguida, uma parte aliquot de 100 yl de uma Solução-substracto para a enzima contendo 4 mg/ ml de fosfato de indoxilo , AMP 0,2 M, Tris 0,5 M e 0,1% de azida de sódio (peso/volume) a um pH de 10,2, foi aplicada â membrana, deixando-se que a enzima traisformasse
-112-
X
ο substracto (turn-over) durante 1 minuto.
Pôs-se termo à fase de transforma ção do substracto pela adição de uma parte alíquota de 300 ql de uma solução contendo EDTA 0,5 M, pH = 8,0. Mediu-se o comprimento da fracção colorida da fenda e os resultados estão reunidos na Tabela VI.
Tabela VI
E3G (yM)
,0 1 ,0 ,6 2 ,6
7,8 ,00 0 ,00 ,17 0 ,50 , 74 ,0
130 ,0 ,97
O valor de indica a distância percorrida pelo conjugado de AP-E3G ao longo da membrana como função da distância total de migração da mistura reaccional .

Claims (37)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Ia. - Método para determinar a presença ou a quantidade de pelo menos um ligando alvo, capaz de competir com um conjugado de análogo de ligando pela ligação a locais disponíveis num receptor de ligando, compreendendo o referido conjugado de análogo de ligando pelo menos um análogo de ligando acoplado a um elemento de desenvolvimento de sinal capaz de emitir um sinal detectável, numa amostra de fluido suspeita de conter o referido ligando alvo, caracterizado por compreender os passos de:
    a) contacto da referida amostra de fluido com o referido conjugado de análogo de ligando e o com referido receptor de ligando para formar uma mistura de reacção, sendo as quantidades relativas do referido conjugado de análogo de ligando e do referido receptor de ligando seleccionadas tais que, na ausência do referido ligando alvo e a seguir à ligação súbstancialmente de equilíbrio na referida mistura de reacção, súbstancialmente todo o referido conjugado de análogo de ligando é ligado ao referido receptor de ligando tal que nenhum conjugado de análogo de ligando não ligado é detectado como resultado do método de ensaio;
    b) detecção do referido conjugado de análogo de ligando não ligado na referida mistura de reacção;
    c) relação do sinal detectável à presença ou quantidade do referido ligando alvo na referida amostra de fluido.
  2. 2a. - Método para determinar a presença ou a quantidade de pelo menos um ligando alvo, a ou acima de pelo menos um limiar pré-determinado de
    -2concentração de ligando, sendo o referido ligando alvo capaz de competir com um conjugado de análogo de ligando pela ligação a locais disponíveis num receptor de ligando, compreendendo o referido conjugado de análogo de ligando pelo menos um análogo de ligando acoplado a um elemento de desenvolvimento de sinal capaz de emitir um sinal detectável, numa amostra de fluido suspeita de conter o referido ligando alvo, caracterizado por compreender os passos de;
    a) contacto da referida amostra de fluido com o referido conjugado de análogo de ligando e o com referido receptor de ligando para formar uma mistura de reacção;
    (i) sendo as quantidades relativas do referido conjugado de análogo de ligando e do referido receptor de ligando seleccionadas tais que, na ausência do referido ligando alvo e a seguir à ligação substancialmente de equilíbrio na referida mistura de reacção, substancialmente todo o referido conjugado de análogo de ligando é ligado ao referido receptor de ligando tal que nenhum conjugado de análogo de ligando não ligado é detectado como resultado do método de ensaio; e (ii) sendo as quantidades relativas e absolutas do referido conjugado de análogo de ligando e do referido receptor de ligando seleccionadas tais que pelo menos um dos referidos limiares pré-determinados de concentração de ligando é estabelecido, abaixo do qual nenhum conjugado de análogo de ligando não ligado é detectado como resultado do método de ensaio;
    b) detecção do referido conjugado de análogo de ligando não ligado na referida mistura de reacção;
    c) relação do sinal detectável à presença ou quantidade do referido ligando alvo a ou abaixo do referido limiar pré-determinado de concentração de ligando.
  3. 3a. - Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o receptor de ligando ser removido da mistura de reacção depois do passo (a).
  4. 4a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por um meio de suporte sólido ser usado no passo de remoção para remover o receptor de ligando da mistura de reacção.
  5. 5a. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por pelo menos um receptor dirigido contra o referido receptor de ligando ser imobilizado sobre o referido suporte sólido.
  6. 6a. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido meio de suporte sólido ser seleccionado do grupo constituído por contas, membranas, filtros e matrizes porosas difusíveis.
  7. 7a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por no passo de remoção o receptor de ligando e porções a ele ligadas serem removidos da mistura de reacção por precipitação.
  8. 8a. - Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pelo menos um receptor dirigido contra o referido receptor de ligando ser usado para precipitar o receptor de ligando e porções a ele ligadas.
  9. 9a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por pelo menos um dos referidos receptores de ligando na referida mistura de reacção
    -4ser uma molécula de complemento de ligando-receptor de ligando e a referida mistura de reacção ser posta em contacto com pelo menos um receptor de complemento de ligando capaz de se ligar a ele, e por o referido receptor de complemento de ligando ser usado para remover o complemento de ligando-receptor de ligando e porções a ele ligadas da referida mistura de reacção.
  10. 10a. - Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a referida molécula de complemento de ligando-receptor de ligando ser biotina covalentemente ligada ao referido receptor de ligando e o referido receptor de complemento de ligando ser avidina.
  11. 11a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por o referido receptor de ligando experimentar um movimento difusivo durante a competição pelos locais de ligação do receptor de ligando que ocorre entre o referido ligando alvo e o referido conjugado de análogo de ligando.
  12. 12a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por o referido receptor de ligando ser imobilizado sobre uma fase sólida não difusora.
  13. 13a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por o referido método ser um imunoensaio no qual o referido receptor de ligando é um anticorpo.
  14. 14a. - Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido anticorpo ser monoclonal.
  15. 15a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por o número de análogos de ligando acoplados ao referido elemento de desenvolvimento de sinal se situar entre 1 e 50.
  16. 16a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por o número de análogos de ligando acoplados ao referido elemento de desenvolvimento de sinal se situar entre 1 e 10.
  17. 17a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por compreender também pelo menos um receptor de ligando imobilizado na fase sólida em pelo menos um local ou locais distintos para a detecção de pelo menos um conjugado de análogo de ligando não ligado na referida mistura de reacção.
  18. 18a. - Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a referida fase sólida ser seleccionada do grupo constituído por matrizes porosas e não porosas, contas, membranas e filtros.
  19. 19a. - Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a referida fase sólida ser uma membrana incorporada num dispositivo tal que a referida mistura de reacção ser posta em contacto com a referida membrana.
  20. 20a. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ter um meio para a remoção do referido conjugado de análogo de ligando não ligado da referida membrana e um meio para promover o contacto da fase de desenvolvimento de sinal com o conjugado de análogo de ligando ligado ao receptor imobilizado na referida membrana.
  21. 21a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida mistura de reacção conter também complemento de ligando-conjugado de análogo de ligando e por pelo menos um receptor de complemento de ligando ser imobilizado numa fase sólida em pelo menos um local ou locais distintos para a detecção de pelo menos um complemento de ligando-conjugado de análogo de ligando não ligado na referida mistura de reacção.
  22. 22a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida mistura de reacção conter também complemento de ligando-conjugado de análogo de ligando e por pelo menos um receptor de ligando e pelo menos um receptor de complemento de ligando serem imobilizados numa fase sólida em locais distintos para a detecção de pelo menos um análogo de ligando não ligado e pelo menos um complemento de ligando-conjugado de análogo de ligando não ligado na referida mistura de reacção.
  23. 23a. - Método de acordo com as reivindicações 19, 21 ou 22, caracterizado por ter pelo menos um local ou locais capazes da determinação semiquantitativa de pelo menos um ligando alvo para pelo menos uma concentração do referido ligando alvo na referida amostra de fluido.
  24. 24a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por o referido elemento de desenvolvimento de sinal ser detectado por meios não instrumentais.
  25. 25a. - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o referido elemento de desenvolvimento de sinal ser detectado por meios visuais.
  26. 26a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por o elemento de desenvolvimento de sinal ser uma enzima.
    -727a. - Método para determinar a quantidade de pelo menos um ligando alvo, capaz de competir com um conjugado de análogo de ligando pela ligação a locais disponíveis num receptor de ligando, compreendendo o referido conjugado de análogo de ligando pelo menos um análogo de ligando acoplado a um elemento de desenvolvimento de sinal capaz de emitir um sinal detectável, numa amostra de fluido, caracterizado por compreender os passos de:
    a) . contacto da referida amostra de fluido com o referido conjugado de análogo de ligando e o com referido receptor de ligando para formar uma mistura de reacção, sendo as quantidades relativas do referido conjugado de análogo de ligando e do referido receptor de ligando seleccionadas tais que, na ausência do referido ligando alvo e a seguir à ligação substancialmente de equilíbrio, substancialmente todo o referido conjugado de análogo de ligando é ligado ao referido receptor de ligando tal que nenhum conjugado de análogo de ligando não ligado é detectado como resultado do método de ensaio;
    b) detecçâo do referido conjugado de análogo de ligando não ligado na referida mistura de reacção;
    c) relação do sinal detectável à quantidade do referido ligando alvo na referida amostra de fluido usando a relação que, quando a afinidade do receptor relativamente ao conjugado de análogo de ligando é substancialmente maior do que o inverso da concentração do receptor, então a razão de conjugado de análogo de ligando livre para ligado é uma função linear da concentração de ligando ao longo de substancialmente toda a extensão do ensaio.
  27. 28a. - Método para determinar a quantidade de pelo menos um ligando alvo, capaz de competir com um conjugado de análogo de ligando pela li-8gação a locais disponíveis num receptor de ligando, compreendendo o referido conjugado de análogo de ligando pelo menos um análogo de ligando acoplado a um elemento de desenvolvimento de sinal capaz de emitir um sinal detectável, numa amostra de fluido, caracterizado por compreender os passos de:
    a) contacto da referida amostra de fluido com o referido conjugado de análogo de ligando e o com referido receptor de ligando para formar uma mistura de reacção;
    (i) sendo as quantidades relativas do referido conjugado de análogo de ligando e do referido receptor de ligando seleccionadas tais que, na ausência do referido ligando alvo e a seguir à ligação substancialmente de equilíbrio, substancialmente todo o referido conjugado de análogo de ligando é ligado ao referido receptor de ligando tal que nenhum conjugado de análogo de ligando não ligado é detectado como resultado do método de ensaio; e (ii) sendo as quantidades relativas do conjugado de análogo de ligando e do receptor de ligando seleccionadas tais que pelo menos um limiar pré-determinado de concentração de ligando é estabelecido, abaixo do qual nenhum sinal de conjugado de análogo de ligando não ligado é detectado como resultado do método de ensaio;
    b) detecção do referido conjugado de análogo de ligando não ligado;
    c) relação do sinal detectável à quantidade de ligando alvo numa amostra de fluido usando a relação que, quando a afinidade do receptor relativamente ao conjugado de análogo de ligando é substancialmente maior do que o inverso da concentração do receptor, então a razão de conjugado de análogo de ligando livre para ligado é uma função linear da concentração de ligando ao longo de substancialmente toda a extensão do ensaio.
  28. 29a. - Método de acordo com as reivindicações 27 ou 28, caracterizado por a afinidade do receptor relativamente ao conjugado de análogo de ligando ser pelo menos 500 vezes maior que o inverso da concentração do receptor.
  29. 30a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por a referida mistura de reacção conter um conjugado de ligando de controlo negativo e um receptor de ligando de controlo negativo em que a detecção do conjugado de ligando de controlo negativo não ligado na referida mistura de reacção é uma indicação de um resultado inválido do método.
  30. 31a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por a referida mistura de reacção conter pelo menos um conjugado de ligando de referência em que a detecção do conjugado de ligando de referência define pelo menos uma concentração de referência para pelo menos um ligando alvo que é usada em conjugação com o referido limiar pré-determinado de concentração para o referido ligando alvo para relacionar a resposta do método com uma gama de concentração do ligando alvo.
  31. 32a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por o referido elemento de desenvolvimento de sinal ser uma partícula de ouro coloidal.
  32. 33a. - Método de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por a referida mistura de reacção conter:
    -10(1) pelo menos um conjugado de ligando de controlo negativo e pelo menos um receptor de ligando de controlo negativo capaz de se ligar a ele, estando o referido receptor de ligando de controlo negativo em ligeiro excesso relativamente à quantidade necessária para ligar todo o referido conjugado de ligando de controlo negativo, e (2) pelo menos um receptor de ligando de controlo positivo capaz de se ligar a ele, estando o referido receptor de ligando de controlo positivo em ligeiro excesso relativamente à quantidade do referido receptor de ligando de controlo positivo, para a validação da resposta do ensaio.
  33. 34a. - Método para determinar a presença de pelo menos um ligando alvo, capaz de competir com um conjugado de análogo de ligando pela ligação a locais disponíveis num receptor de ligando, compreendendo o referido conjugado de análogo de ligando pelo menos um análogo de ligando acoplado a uma partícula de ouro coloidal, numa amostra de fluido suspeita de conter o referido ligando alvo, caracterizado por compreender os passos de;
    a) contacto da referida amostra de fluido com o referido conjugado de análogo de ligando e o com referido receptor de ligando para formar uma mistura de reacção, sendo as quantidades relativas do referido conjugado de análogo de ligando e do referido receptor de ligando seleccionadas tais que, na ausência do referido ligando alvo e a seguir à ligação substancialmente de equilíbrio na referida mistura de reacção, substancíalmente todo o referido conjugado de análogo de ligando é ligado ao referido receptor de ligando tal que nenhum conjugado de análogo de ligando não ligado é detectado como resultado do método de ensaio;
    -11b) detecção do conjugado de análogo de ligando não ligado na referida mistura de reacção por meios visuais usando pelo menos um receptor de ligando imobilizado na fase sólida em pelo menos um local distinto;
    c) relação do sinal detectável à presença ou quantidade do referido ligando alvo na referida amostra de fluido.
  34. 35a. - Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o receptor de ligando ser removido da mistura de reacção após o passo (a).
  35. 36a. - Método para determinar a presença de pelo menos um ligando alvo, a ou acima de pelo menos um limiar pré-determinado de concentração de ligando, sendo o referido ligando alvo capaz de competir com um conjugado de análogo de ligando pela ligação a locais disponíveis num receptor de ligando, compreendendo o referido conjugado de análogo de ligando pelo menos um análogo de ligando acoplado a uma partícula de ouro coloidal, numa amostra de fluido suspeita de conter o referido ligando alvo, caracterizado por compreender os passos de:
    a) contacto da referida amostra de fluido com o referido conjugado de análogo de ligando e o com referido receptor de ligando para formar uma mistura de reacção;
    (i) sendo as quantidades relativas do referido conjugado de análogo de ligando e do referido receptor de ligando seleccionadas tais que, na ausência do referido ligando alvo e a seguir à ligação substancialmente de equilíbrio na referida mistura de reacção, substancialmente todo o referido conjugado de análogo de ligando é ligado ao referido receptor
    -12t de ligando tal que nenhum conjugado de análogo de ligando não ligado é detectado como resultado do método de ensaio; e (ii) sendo as quantidades relativas e absolutas do referido conjugado de análogo de ligando e do referido receptor de ligando seleccionadas tais que pelo menos um dos referidos limiares pré-determinados de concentração de ligando é estabelecido, abaixo do qual nenhum conjugado de análogo de ligando não ligado é detectado como resultado do método de ensaio;
    b) detecção do conjugado de análogo de ligando não ligado na referida mistura de reacção por meios visuais usando pelo menos um receptor de ligando imobilizado na fase sólida em pelo menos um local distinto;
    c) relação do sinal detectável à presença do referido ligando alvo a ou acima do referido limiar pré-determinado de concentração de ligando na referida amostra de fluido.
  36. 37a. - Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por o receptor de ligando ser removido da mistura de reacção após o passo (a).
  37. 38a. - Método para determinar a presença ou a quantidade de pelo menos um ligando alvo, capaz de se ligar num primeiro local de ligação a um primeiro receptor de ligando e, simultaneamente, capaz de se ligar num segundo local de ligação a um segundo conjugado de receptor de ligando, compreendendo o referido segundo conjugado de receptor de ligando pelo menos um receptor de ligando acoplado a um elemento de desenvolvimento de sinal capaz de emitir um sinal detectável, numa amostra de fluido suspeita de conter o referido ligando alvo, método esse caracterizado por compreender os passos de:
    -13a) contacto da referida amostra de fluido com o referido primeiro receptor de ligando e com o referido segundo conjugado de receptor de ligando para formar uma mistura de reacção, sendo a quantidade do referido primeiro receptor de ligando seleccionada tal que a seguir à ligação substancialmente de equilíbrio na referida mistura de reacção, uma quantidade pré-determinada do complexo primeiro receptor de ligando:ligando alvo:segundo conjugado de receptor de ligando é formada;
    b) contacto da referida mistura de reacção com uma fase sólida contendo o primeiro receptor de ligando imobilizado;
    c) detecção do segundo conjugado de receptor de ligando ligado à referida fase sólida;
    d) relação do sinal detectável à presença do referido ligando alvo a ou acima de um limiar pré-determinado de concentração de ligando alvo.
PT92828A 1989-01-10 1990-01-10 Metodo de ensaio relativo a receptores de ligandos limite PT92828B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/295,568 US5028535A (en) 1989-01-10 1989-01-10 Threshold ligand-receptor assay

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT92828A PT92828A (pt) 1991-09-13
PT92828B true PT92828B (pt) 1996-04-30

Family

ID=23138252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT92828A PT92828B (pt) 1989-01-10 1990-01-10 Metodo de ensaio relativo a receptores de ligandos limite

Country Status (12)

Country Link
US (3) US5028535A (pt)
EP (1) EP0378391B1 (pt)
JP (1) JP2807565B2 (pt)
AT (1) ATE127921T1 (pt)
AU (1) AU633874B2 (pt)
CA (1) CA2007532C (pt)
DE (1) DE69022254T2 (pt)
DK (1) DK0378391T3 (pt)
ES (1) ES2079434T3 (pt)
GR (1) GR3018366T3 (pt)
PT (1) PT92828B (pt)
WO (1) WO1990008319A1 (pt)

Families Citing this family (312)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3842702A1 (de) * 1988-12-19 1990-06-21 Boehringer Mannheim Gmbh Testtraeger zur analytischen untersuchung einer probenfluessigkeit mit hilfe einer spezifischen bindungsreaktion zweier bioaffiner bindungspartner und entsprechendes testverfahren
US5939272A (en) * 1989-01-10 1999-08-17 Biosite Diagnostics Incorporated Non-competitive threshold ligand-receptor assays
US6352863B1 (en) * 1990-01-19 2002-03-05 La Mina, Inc. Assay device
US5922615A (en) 1990-03-12 1999-07-13 Biosite Diagnostics Incorporated Assay devices comprising a porous capture membrane in fluid-withdrawing contact with a nonabsorbent capillary network
ES2089057T3 (es) * 1990-07-18 1996-10-01 Abbott Lab Un reactivo sustituto de un analito para uso en metodos de ensayo de fijacion especifica, dispositivos y kits.
US5143852A (en) 1990-09-14 1992-09-01 Biosite Diagnostics, Inc. Antibodies to ligand analogues and their utility in ligand-receptor assays
AU658374B2 (en) * 1990-09-14 1995-04-13 Biosite Diagnostics Incorporated Antibodies to complexes of ligand receptors and ligands and their utility in ligand-receptor assays
CA2056698A1 (en) * 1990-12-11 1992-06-12 John L. Palmer Assay, employing analog to digital signaling, for the presence of an analyte in a sample in conjunction with a binding component, apparatus for performing said process, and a method of performing said assay
EP0579767B1 (en) * 1991-04-11 2000-08-23 Biosite Diagnostics Inc. Novel conjugates and assays for simultaneous detection of multiple ligands
US5877028A (en) 1991-05-29 1999-03-02 Smithkline Diagnostics, Inc. Immunochromatographic assay device
US6168956B1 (en) 1991-05-29 2001-01-02 Beckman Coulter, Inc. Multiple component chromatographic assay device
US5998220A (en) 1991-05-29 1999-12-07 Beckman Coulter, Inc. Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them
ATE185424T1 (de) * 1991-07-29 1999-10-15 Serex Inc Differentielle bindungsaffinitäten und darauf beruhende dissoziationstestverfahren
US5451504A (en) * 1991-07-29 1995-09-19 Serex, Inc. Method and device for detecting the presence of analyte in a sample
JPH07500185A (ja) * 1991-10-09 1995-01-05 ハワイ　ケムテクト　インターナショナル 分析物を検査するための現場キット
US5623053A (en) * 1992-01-10 1997-04-22 California Institute Of Technology Soluble mammal-derived Fc receptor which binds at a pH ranging from about 5.5 to 6.5 and releases at a pH ranging from about 7.5 to 8.5
EP0643777A4 (en) * 1992-01-22 1995-06-07 Abbott Lab CALIBRATION REAGENTS FOR SEMI-QUANTITATIVE BINDING ASSAYS AND DEVICES.
US5541069A (en) * 1992-02-28 1996-07-30 Quidel Corporation Assay having improved dose response curve
AU3972993A (en) * 1992-04-01 1993-11-08 Regents Of The University Of California, The Non-instrumented enzyme immunoassay: general method utilizing kinetic binding effects
US5458852A (en) * 1992-05-21 1995-10-17 Biosite Diagnostics, Inc. Diagnostic devices for the controlled movement of reagents without membranes
US6905882B2 (en) * 1992-05-21 2005-06-14 Biosite, Inc. Diagnostic devices and apparatus for the controlled movement of reagents without membranes
US6156270A (en) 1992-05-21 2000-12-05 Biosite Diagnostics, Inc. Diagnostic devices and apparatus for the controlled movement of reagents without membranes
US5885527A (en) * 1992-05-21 1999-03-23 Biosite Diagnostics, Inc. Diagnostic devices and apparatus for the controlled movement of reagents without membrances
US7524456B1 (en) 1992-05-21 2009-04-28 Biosite Incorporated Diagnostic devices for the controlled movement of reagents without membranes
US6767510B1 (en) 1992-05-21 2004-07-27 Biosite, Inc. Diagnostic devices and apparatus for the controlled movement of reagents without membranes
CA2096495C (en) * 1992-06-16 2002-07-09 Kathy Palmer Ordonez Dual analyte immunoassay
EP0663071B1 (en) * 1992-09-28 2003-12-03 Biex, Inc. Method for prediction of premature labor
DE69332084T2 (de) * 1992-12-01 2003-10-09 Ensys Environment Prod Inc Eine petroleum immuntestmethode und ihre komponenten
FI96143C (fi) * 1993-03-16 1996-05-10 Wallac Oy Biospesifinen määritysmenetelmä
US7322927B2 (en) 1993-09-24 2008-01-29 Biosite, Inc. Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US5824799A (en) * 1993-09-24 1998-10-20 Biosite Diagnostics Incorporated Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US7083984B2 (en) 1993-09-24 2006-08-01 Biosite, Inc. Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US5527711A (en) * 1993-12-13 1996-06-18 Hewlett Packard Company Method and reagents for binding chemical analytes to a substrate surface, and related analytical devices and diagnostic techniques
US5589344A (en) * 1994-06-15 1996-12-31 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Test kit and method for competitive specific binding assay
US6653066B1 (en) 1994-06-17 2003-11-25 Trinity Biotech Device and method for detecting polyvalent substances
AU2103495A (en) * 1994-08-04 1996-03-04 Biex, Inc. Method for prediction of premature delivery using estetrol (e4) as an indicator
US5521102A (en) * 1994-08-08 1996-05-28 Quidel Corporation Controlled sensitivity immunochromatographic assay
US5710256A (en) * 1995-04-03 1998-01-20 Biosite Diagnostics Incorporated Methadone derivatives and protein and polypeptide methadone derivative conjugates and labels
US5824292A (en) * 1995-04-12 1998-10-20 Quest International B.V. Oral care compositions
US6416714B1 (en) 1995-04-25 2002-07-09 Discovery Partners International, Inc. Remotely programmable matrices with memories
US6329139B1 (en) 1995-04-25 2001-12-11 Discovery Partners International Automated sorting system for matrices with memory
US6331273B1 (en) 1995-04-25 2001-12-18 Discovery Partners International Remotely programmable matrices with memories
US5741462A (en) * 1995-04-25 1998-04-21 Irori Remotely programmable matrices with memories
US5751629A (en) * 1995-04-25 1998-05-12 Irori Remotely programmable matrices with memories
US5874214A (en) 1995-04-25 1999-02-23 Irori Remotely programmable matrices with memories
US6017496A (en) 1995-06-07 2000-01-25 Irori Matrices with memories and uses thereof
US5567302A (en) * 1995-06-07 1996-10-22 Molecular Devices Corporation Electrochemical system for rapid detection of biochemical agents that catalyze a redox potential change
US7635597B2 (en) 1995-08-09 2009-12-22 Bayer Healthcare Llc Dry reagent particle assay and device having multiple test zones and method therefor
US6803040B1 (en) 1995-08-22 2004-10-12 Biosite, Inc. Derivatives of tricyclic antidepressants and protein and polypeptide tricyclic antidepressant derivative conjugates and labels
US5874216A (en) * 1996-02-23 1999-02-23 Ensys Environmental Products, Inc. Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof
EP0904066A4 (en) * 1996-05-03 2002-04-24 Roger S Cubicciotti DRUG COMPOSITIONS AND METHOD FOR ADMINISTERING DRUGS USING SYNTHETIC RECEPTORS
US5879951A (en) 1997-01-29 1999-03-09 Smithkline Diagnostics, Inc. Opposable-element assay device employing unidirectional flow
US20050101032A1 (en) * 1997-02-10 2005-05-12 Metrika, Inc. Assay device, composition, and method of optimizing assay sensitivity
US5939252A (en) 1997-05-09 1999-08-17 Lennon; Donald J. Detachable-element assay device
US6670196B1 (en) 1997-05-14 2003-12-30 Biosite, Inc. Rapid evaluation of the ratio of biological molecules
GB2326712B (en) * 1997-06-25 2001-09-26 Fujirebio Kk Colour devoloping method,enzyme immunoassay using the colour developing method,and immunochromatography incorporating the enzyme immunoassay
US6319466B1 (en) * 1997-07-16 2001-11-20 Charm Sciences, Inc. Test device for detecting the presence of a residue analyte in a sample
US5985675A (en) 1997-12-31 1999-11-16 Charm Sciences, Inc. Test device for detection of an analyte
BE1012049A6 (fr) * 1998-06-25 2000-04-04 Ucb Bioproducts Procede pour la determination d'antibiotique a noyau beta-lactame dans un liquide biologique.
US7713703B1 (en) 2000-11-13 2010-05-11 Biosite, Inc. Methods for monitoring the status of assays and immunoassays
US6194222B1 (en) 1998-01-05 2001-02-27 Biosite Diagnostics, Inc. Methods for monitoring the status of assays and immunoassays
US6392894B1 (en) 1998-01-05 2002-05-21 Biosite Incorporated Media carrier for an assay device
US6830731B1 (en) * 1998-01-05 2004-12-14 Biosite, Inc. Immunoassay fluorometer
US6284194B1 (en) 1998-03-11 2001-09-04 Albert E. Chu Analytical assay device and methods using surfactant treated membranes to increase assay sensitivity
SE9801563D0 (sv) * 1998-04-30 1998-04-30 Pharmacia & Upjohn Diag Ab Förfarande med separation och kit att användas vid förfarandet
AU2003200222B2 (en) * 1998-04-30 2006-02-02 Maiia Ab Ligand binding assay and kit with a separation zone for disturbing analytes
US20060019404A1 (en) * 1998-05-06 2006-01-26 Blatt Joel M Quantitative assay with extended dynamic range
DE69836493T2 (de) 1998-07-22 2007-09-06 Syntron Bioresearch, Inc., Carlsbad Vorrichtung zur bestimmung von mehreren analyten
US6656876B1 (en) * 1998-10-16 2003-12-02 Amersham Biosciences Ab Squaric acid activated carrier usable for immobilization of compounds containing amine groups
CA2254223A1 (en) 1998-11-16 2000-05-16 Biophys, Inc. Device and method for analyzing a biologic sample
US7297554B2 (en) * 1998-11-18 2007-11-20 Microdiagnostics, Inc. Immunoassay system
US6136610A (en) * 1998-11-23 2000-10-24 Praxsys Biosystems, Inc. Method and apparatus for performing a lateral flow assay
US6528323B1 (en) 1999-06-14 2003-03-04 Praxsys Biosystems, Inc. Bidirectional lateral flow test strip and method
US6727073B1 (en) 1999-11-19 2004-04-27 Binax, Inc. Method for detecting enteric disease
DE10009503A1 (de) * 2000-02-29 2001-08-30 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Immobilisierung von Konjugaten in diagnostischen Tests
JP2003527584A (ja) * 2000-03-09 2003-09-16 ヘスカ コーポレイション 動物の免疫状態を決定するための組換え抗原の使用
US6699722B2 (en) 2000-04-14 2004-03-02 A-Fem Medical Corporation Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes
JP2004505638A (ja) * 2000-08-03 2004-02-26 インバーネス・メデイカル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング エストラジオール分析物についてのミモトープとして機能することができるペプチド
EP1947459A3 (en) * 2000-08-24 2008-09-24 Nanogen, Inc. Differential immunoassay
US6777198B2 (en) 2000-10-11 2004-08-17 Pharmacia Diagnostics Ab Assay method and kit therefor
SE0003662D0 (sv) * 2000-10-11 2000-10-11 Pharmacia Diagnostics Ab Assay method and kit therefor
AU2002231736A1 (en) 2000-12-22 2002-07-08 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Use of repulsive guidance molecule (rgm) and its modulators
US6770434B2 (en) 2000-12-29 2004-08-03 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy & Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Biological assay method
US6767710B2 (en) * 2001-03-30 2004-07-27 Praxsys Biosystems, Llc Prewetting stop flow test strip
US6833111B2 (en) 2001-04-13 2004-12-21 Varian, Inc. Multiple analyte assaying device with a multiple sample introduction system
US7632647B2 (en) * 2001-04-13 2009-12-15 Biosite Incorporated Use of B-type natriuretic peptide as a prognostic indicator in acute coronary syndromes
US20040121350A1 (en) * 2002-12-24 2004-06-24 Biosite Incorporated System and method for identifying a panel of indicators
US20040253637A1 (en) * 2001-04-13 2004-12-16 Biosite Incorporated Markers for differential diagnosis and methods of use thereof
US20040126767A1 (en) * 2002-12-27 2004-07-01 Biosite Incorporated Method and system for disease detection using marker combinations
US20030219734A1 (en) * 2001-04-13 2003-11-27 Biosite Incorporated Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use
US20030199000A1 (en) * 2001-08-20 2003-10-23 Valkirs Gunars E. Diagnostic markers of stroke and cerebral injury and methods of use thereof
US7524635B2 (en) * 2003-04-17 2009-04-28 Biosite Incorporated Methods and compositions for measuring natriuretic peptides and uses thereof
WO2003016910A1 (en) * 2001-08-20 2003-02-27 Biosite, Inc. Diagnostic markers of stroke and cerebral injury and methods of use thereof
US7713705B2 (en) * 2002-12-24 2010-05-11 Biosite, Inc. Markers for differential diagnosis and methods of use thereof
US20040203083A1 (en) * 2001-04-13 2004-10-14 Biosite, Inc. Use of thrombus precursor protein and monocyte chemoattractant protein as diagnostic and prognostic indicators in vascular diseases
CA2414073A1 (en) 2001-05-04 2002-11-14 Gunars E. Valkirs Diagnostic markers of acute coronary syndromes and methods of use thereof
DE10125258A1 (de) * 2001-05-23 2003-01-09 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch bindenden Liganden
EP1417491A4 (en) * 2001-07-18 2004-08-11 Siliang Zhou TEST STRIP FOR SIDE FLOW ASSAY OF A SAMPLE CONTAINING WHOLE CELLS
US7270959B2 (en) 2001-07-25 2007-09-18 Oakville Hong Kong Company Limited Specimen collection container
US7300633B2 (en) 2001-07-25 2007-11-27 Oakville Hong Kong Company Limited Specimen collection container
US20040209307A1 (en) * 2001-08-20 2004-10-21 Biosite Incorporated Diagnostic markers of stroke and cerebral injury and methods of use thereof
US20040219509A1 (en) * 2001-08-20 2004-11-04 Biosite, Inc. Diagnostic markers of stroke and cerebral injury and methods of use thereof
AU2002341621A1 (en) * 2001-09-10 2003-03-24 Meso Scale Technologies, Llc Methods, reagents, kits and apparatus for protein function analysis
WO2003028582A2 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Aspenbio, Inc. Bovine pregnancy test
US8481334B1 (en) 2001-11-06 2013-07-09 Charm Sciences, Inc. Method of attaching a ligand to a solid support
CA2511372C (en) * 2002-12-26 2014-07-08 Jeff D. Debad Methods, compositions and kits for biomarker extraction
US7560272B2 (en) 2003-01-04 2009-07-14 Inverness Medical Switzerland Gmbh Specimen collection and assay container
US7943166B2 (en) 2003-04-10 2011-05-17 Neurogesx, Inc. Methods and compositions for administration of TRPV1 agonists
WO2004094460A2 (en) 2003-04-17 2004-11-04 Ciphergen Biosystems, Inc. Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use
CN100360938C (zh) * 2003-04-23 2008-01-09 北京科美东雅生物技术有限公司 甾体类激素-碱性磷酸酶结合物制备方法
US7517495B2 (en) 2003-08-25 2009-04-14 Inverness Medical Switzerland Gmbh Biological specimen collection and analysis system
JP2007518062A (ja) * 2003-09-29 2007-07-05 バイオサイト インコーポレイテッド 敗血症を診断する方法および診断するための組成物
US7410808B1 (en) * 2003-12-08 2008-08-12 Charm Sciences, Inc. Method and assay for detection of residues
US7150995B2 (en) * 2004-01-16 2006-12-19 Metrika, Inc. Methods and systems for point of care bodily fluid analysis
US20050227370A1 (en) * 2004-03-08 2005-10-13 Ramel Urs A Body fluid analyte meter & cartridge system for performing combined general chemical and specific binding assays
US8003407B2 (en) * 2004-07-29 2011-08-23 Relia Diagnostic Systems, Llc Lateral flow system and assay
US20060105419A1 (en) * 2004-08-16 2006-05-18 Biosite, Inc. Use of a glutathione peroxidase 1 as a marker in cardiovascular conditions
US20060051825A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Buechler Kenneth F Methods and compositions for measuring canine BNP and uses thereof
WO2006073682A2 (en) * 2004-12-09 2006-07-13 Meso Scale Technologies, Llc Diagnostic test
US20080050832A1 (en) * 2004-12-23 2008-02-28 Buechler Kenneth F Methods and compositions for diagnosis and/or prognosis in systemic inflammatory response syndromes
WO2006078813A2 (en) * 2005-01-21 2006-07-27 Biosite Incorporated Arginine analogs, and methods for their synthesis and use
US7396689B2 (en) * 2005-02-04 2008-07-08 Decision Biomarkers Incorporated Method of adjusting the working range of a multi-analyte assay
ZA200707492B (en) * 2005-02-14 2009-02-25 Neurogesx Inc Device for delivery of TRPV1 agonists
US20060222690A1 (en) * 2005-03-30 2006-10-05 Bley Keith R Low-concentration capsaicin patch and methods for treating neuropathic pain
US7939342B2 (en) 2005-03-30 2011-05-10 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Diagnostic test kits employing an internal calibration system
US7393919B2 (en) 2005-05-25 2008-07-01 Cure Dm, Inc. Peptides, derivatives and analogs thereof, and methods of using same
WO2006132666A1 (en) 2005-06-06 2006-12-14 Decision Biomarkers, Inc. Assays based on liquid flow over arrays
CA2610910A1 (en) * 2005-06-09 2006-12-21 Paul H. Mcpherson Methods and compositions for the diagnosis of venous thromboembolic disease
EP1929295A4 (en) * 2005-08-30 2010-03-17 Biosite Inc USE OF SOLUBLE FLT-1 AND ITS FRAGMENTS IN CARDIOVASCULAR CONDITIONS
US7829347B2 (en) * 2005-08-31 2010-11-09 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Diagnostic test kits with improved detection accuracy
WO2007039256A2 (de) 2005-09-30 2007-04-12 Abbott Gmbh & Co. Kg Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
US11237171B2 (en) 2006-02-21 2022-02-01 Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution
US8460879B2 (en) 2006-02-21 2013-06-11 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution
WO2007103568A2 (en) * 2006-03-09 2007-09-13 Biosite, Inc. Methods and compositions for the diagnosis of diseases of the aorta
US8940527B2 (en) * 2006-03-31 2015-01-27 Lamina Equities Corp. Integrated device for analyte testing, confirmation, and donor identity verification
US7879623B2 (en) * 2006-03-31 2011-02-01 Guirguis Raouf A Integrated device for analyte, testing, confirmation, and donor identity verification
US7741103B2 (en) * 2006-03-31 2010-06-22 Guirguis Raouf A Integrated screening and confirmation device
US11906512B2 (en) 2006-03-31 2024-02-20 Zeus Diagnostics, LLC Integrated device for analyte testing, confirmation, and donor identity verification
US20080118924A1 (en) * 2006-05-26 2008-05-22 Buechler Kenneth F Use of natriuretic peptides as diagnostic and prognostic indicators in vascular diseases
GB0611116D0 (en) 2006-06-06 2006-07-19 Oxford Genome Sciences Uk Ltd Proteins
EP2029745B1 (en) 2006-06-07 2011-10-12 Otago Innovation Limited Diagnostic methods and markers
EP2049902A4 (en) * 2006-07-28 2010-09-01 Biosite Inc DEVICES AND METHODS FOR PERFORMING BINDING TESTS WITH RECEIVERS USING MAGNETIC PARTICLES
WO2008030122A1 (en) 2006-09-07 2008-03-13 University Of Otago Biomarkers
WO2008060607A2 (en) 2006-11-14 2008-05-22 Biosite Incorporated Methods and compositions for monitoring and risk prediction in cardiorenal syndrome
WO2008061149A2 (en) * 2006-11-14 2008-05-22 Biosite Incorporated Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal artery stenosis
US20080112847A1 (en) * 2006-11-15 2008-05-15 Nancy Yu Chen Collecting and testing device and method of use
TW200826088A (en) * 2006-12-08 2008-06-16 Lite On It Corp Optical disk drive with defocus-prohibited device
EP1933140B1 (en) * 2006-12-11 2011-08-17 AraGen Biotechnology Co. Ltd. Antibody detection method involving an oligonucleotide enhanced collodial gold signal
CN101021526B (zh) 2007-03-16 2012-01-25 艾博生物医药(杭州)有限公司 一种直观显示检测结果的装置和方法
US8221995B2 (en) * 2007-03-23 2012-07-17 Seok-Won Lee Methods and compositions for diagnosis and/or prognosis in systemic inflammatory response syndromes
US20090004755A1 (en) * 2007-03-23 2009-01-01 Biosite, Incorporated Methods and compositions for diagnosis and/or prognosis in systemic inflammatory response syndromes
WO2009029073A1 (en) 2007-08-30 2009-03-05 The Trustees Of Tufts College Methods for determining the concentration of an analyte in solution.
KR20100080519A (ko) 2007-08-30 2010-07-08 큐어디엠 인코포레이티드 프로섬 펩타이드 및 이의 유사체의 조성물 및 이의 이용 방법
EP2183289A2 (en) * 2007-08-31 2010-05-12 Corning Incorporated Reactive surface on a polymeric substrate
WO2009049222A1 (en) * 2007-10-12 2009-04-16 Curedm, Inc. Compositions and methods of using the human proislet peptide receptor
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
DK2265641T3 (en) 2008-03-12 2018-04-23 Otago Innovation Ltd Biomarkers
JP2011516038A (ja) 2008-03-12 2011-05-26 オタゴ イノベーション リミテッド バイオマーカー
MX2011002233A (es) 2008-08-28 2011-09-27 Astute Medical Inc Metodos y composiciones para la diagnosis y prognosis de daño renal y falla renal.
WO2010025434A1 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US8222047B2 (en) 2008-09-23 2012-07-17 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays
WO2010048347A2 (en) 2008-10-21 2010-04-29 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
NZ628843A (en) 2008-10-21 2016-02-26 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
BRPI0922021A2 (pt) 2008-11-10 2019-09-24 Astute Medical Inc método para avaliar a condição renal em um indivíduo, e, uso de um ou mais marcadores de lesão renal
ES2528799T3 (es) 2008-11-22 2015-02-12 Astute Medical, Inc. Métodos para el pronóstico de insuficiencia renal aguda
EP2194381B1 (de) 2008-12-03 2015-12-02 Roche Diagnostics GmbH Testelement mit kombinierter Kontroll- und Kalibrationszone
US20100204055A1 (en) * 2008-12-05 2010-08-12 Bonner-Ferraby Phoebe W Autoantibody detection systems and methods
US9234889B1 (en) 2008-12-18 2016-01-12 Charm Sciences, Inc. Method and test strip for detecting residues
NZ601575A (en) 2009-02-06 2014-08-29 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and failure
CN105675881A (zh) 2009-02-06 2016-06-15 阿斯图特医药公司 肾损伤和肾衰竭的诊断及预后
WO2011017654A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
NZ596163A (en) * 2009-04-15 2014-01-31 Relia Diagnostic Systems Inc Diagnostic devices and related methods
JP5728005B2 (ja) * 2009-06-30 2015-06-03 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ 磁気センサ装置、このような装置の作動方法及びサンプル
WO2011006119A2 (en) 2009-07-09 2011-01-13 The Scripps Research Institute Gene expression profiles associated with chronic allograft nephropathy
AU2010279302B2 (en) 2009-08-07 2015-06-18 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2894473B1 (en) 2009-08-28 2016-09-21 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
MX2012003168A (es) 2009-09-18 2012-05-08 Astute Medical Inc Metodos y composiciones para diagnosis y prognosis de lesion renal e insuficiencia renal.
EP2480882A4 (en) 2009-09-21 2013-07-10 Astute Medical Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF RENAL LESIONS AND FAILURES
US10324093B2 (en) 2009-11-07 2019-06-18 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP2013510321A (ja) 2009-11-07 2013-03-21 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物
CN102656190A (zh) 2009-12-08 2012-09-05 雅培股份有限两合公司 用于在视网膜神经纤维层变性治疗中使用的针对rgm a蛋白质的单克隆抗体
CA2784889C (en) 2009-12-20 2018-06-19 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US11275084B2 (en) * 2010-01-15 2022-03-15 Stanford University Successive sampling device and associated method
SI2666872T1 (sl) 2010-02-05 2016-08-31 Astute Medical, Inc. Postopki in sestavki za diagnozo in prognozo ledvične poškodbe in odpovedi ledvic
MX339765B (es) 2010-02-05 2016-06-08 Astute Medical Inc Metodos y composiciones para diagnostico y pronostico de lesion renal y falla renal.
EP2531621A4 (en) 2010-02-05 2013-07-31 Astute Medical Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSIS AND FORECASTING kidney injury and kidney insufficiency
NZ602056A (en) 2010-02-26 2014-11-28 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US8415171B2 (en) * 2010-03-01 2013-04-09 Quanterix Corporation Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles
US8236574B2 (en) 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects
WO2011109379A1 (en) 2010-03-01 2011-09-09 Quanterix Corporation Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles
US9678068B2 (en) * 2010-03-01 2017-06-13 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules using dual detection methods
PT2566949T (pt) 2010-05-06 2023-05-18 Charm Sciences Inc Aparelho leitor e incubador
US20130203074A1 (en) 2010-06-23 2013-08-08 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
NZ606124A (en) 2010-06-23 2015-05-29 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2011162821A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2596010B1 (en) 2010-07-19 2017-04-12 Otago Innovation Limited Signal biomarkers
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
US10557856B2 (en) 2010-09-24 2020-02-11 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Biomarkers of renal injury
BR112013006631A2 (pt) 2010-09-24 2017-10-24 Astute Medical Inc métodos e composições para a avaliação de lesão renal utilizando ácido hialurônico
CN103238068B (zh) 2010-10-07 2016-06-08 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
CN103370619B (zh) 2010-11-29 2016-01-20 美艾利尔圣地亚哥有限公司 诊断或风险预测心力衰竭的方法和试剂
CN102121901B (zh) * 2010-11-30 2012-07-04 南通市伊士生物技术有限责任公司 一种金标试条半定量快速检测电子笔装置的检测方法
CN102095851A (zh) * 2010-11-30 2011-06-15 南通市伊士生物技术有限责任公司 金标试条半定量快速检测电子笔装置的检测方法
JP6056138B2 (ja) * 2010-12-28 2017-01-11 東ソー株式会社 免疫学的測定方法
US20140147864A1 (en) 2011-01-08 2014-05-29 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP3761034A3 (en) 2011-01-26 2021-02-17 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Urine biomarkers for prediction of recovery after acute kidney injury: proteomics
US9952237B2 (en) 2011-01-28 2018-04-24 Quanterix Corporation Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles
US20130330752A1 (en) 2011-01-29 2013-12-12 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US20140370616A1 (en) * 2011-03-25 2014-12-18 Nanospeed Diagnostics Inc. Lateral flow immunoassay for detecting vitamins
WO2012142301A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patients recovery from a brain injury
ES2721907T3 (es) 2011-08-26 2019-08-06 Astute Medical Inc Métodos y composiciones para el diagnóstico y pronóstico de lesión renal e insuficiencia renal
IN2014MN00949A (pt) 2011-11-22 2015-04-24 Astute Medical Inc
EP2788759B1 (en) 2011-12-08 2019-02-20 Astute Medical, Inc. Methods and uses for diagnosis of renal injury and renal failure
EP2791173B1 (en) 2011-12-14 2020-07-29 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
US9636398B2 (en) 2011-12-14 2017-05-02 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
IL305223A (en) 2012-01-27 2023-10-01 Abbvie Inc The composition and method for the diagnosis and treatment of diseases related to the degeneration of nerve cells
CN104335045B (zh) 2012-02-27 2017-02-22 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
EP2825891A1 (en) 2012-03-13 2015-01-21 AbbVie Inc. Method for selecting or identifying a subject for v1b antagonist therapy
WO2013141716A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Christopher Joseph Pemberton Biomarkers
EP3699591A1 (en) 2012-04-02 2020-08-26 Astute Medical, Inc. Methods for diagnosis and prognosis of sepsis
US10145842B2 (en) 2012-04-11 2018-12-04 Quidel Cardiovascular Inc. Microfluidic device, system and method
CN104364652A (zh) * 2012-04-20 2015-02-18 Zbx公司 用于检测样品中的分析物的固相载体和方法
US9733261B2 (en) 2012-04-24 2017-08-15 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of stroke or other cerebral injury
DE102012013888A1 (de) 2012-07-09 2014-05-22 Schebo Biotech Ag Testkit (Kombi-Schnelltest) zum synchronen Nachweis von Biomarkern im Stuhl zur Erkennung pathologischer Veränderungen im Gastrointestinaltrakt, insbesondere im Darm
DE202012012084U1 (de) 2012-07-09 2013-04-15 Schebo Biotech Ag Testkit (Kombi-Schnelltest) zum synchronen Nachweis von Biomarkern im Stuhl zur Erkennung pathologischer Veränderungen im Gastrointestinaltrakt, insbesondere im Darm
WO2014018464A1 (en) 2012-07-23 2014-01-30 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of sepsis
WO2014028339A1 (en) 2012-08-11 2014-02-20 Astute Medical, Inc. Evaluating renal injury using hyaluronic acid
WO2014113502A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Quanterix Corporation Detection of dna or rna using single molecule arrays and other techniques
CN105074466B (zh) 2013-01-17 2018-01-09 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
CA2905484C (en) 2013-03-14 2020-07-21 Alere San Diego, Inc. 6-acetylmorphine analogs, and methods for their synthesis and use
US10545140B2 (en) 2013-03-14 2020-01-28 Kasaac Laboratories, Corp. Test strip housing system
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
EP3004873B1 (en) 2013-06-05 2024-01-24 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US10183988B2 (en) 2013-06-07 2019-01-22 Duke University Anti-Complement factor H antibodies
EP3030582A4 (en) 2013-08-07 2017-05-17 Astute Medical, Inc. Assays for timp2 having improved performance in biological samples
EA201690456A1 (ru) 2013-08-23 2016-06-30 Рита Фармасьютикалз, Инк. Способы лечения и предотвращения эндотелиальной дисфункции с применением бардоксолона метила или его аналогов
WO2015031626A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Abbvie Inc. Soluble cmet assay
WO2015179773A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 The Scripps Research Institute Tissue molecular signatures of kidney transplant rejections
CN108627651A (zh) 2013-09-20 2018-10-09 阿斯图特医药公司 用于阑尾炎的诊断和预后及腹痛病因的区分的方法和组合物
CA3185700A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 Astute Medical, Inc. Assays for igfbp7 having improved performance in biological samples
CN105917229B (zh) 2013-12-03 2019-04-26 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断和预后的方法和组合物
AU2014373792A1 (en) 2013-12-30 2016-07-07 Genomatix Genomic rearrangements associated with prostate cancer and methods of using the same
US10443100B2 (en) 2014-05-22 2019-10-15 The Scripps Research Institute Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection
EP3825418A3 (en) 2014-05-22 2021-09-15 The Scripps Research Institute Molecular signatures for distinguishing liver transplant rejections or injuries
WO2015179777A2 (en) 2014-05-22 2015-11-26 The Scripps Research Institute Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection
US11104951B2 (en) 2014-05-22 2021-08-31 The Scripps Research Institute Molecular signatures for distinguishing liver transplant rejections or injuries
CA2965153C (en) 2014-10-20 2023-10-24 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2016090244A2 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Mbio Diagnostics, Inc. Methods and devices for performing high dynamic range immunoassays
US10473671B2 (en) 2014-12-18 2019-11-12 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP3281011A4 (en) 2015-04-09 2018-11-21 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP2018521307A (ja) 2015-05-12 2018-08-02 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎障害および腎不全の診断および予後のための方法および組成物
WO2016201349A1 (en) 2015-06-11 2016-12-15 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP3311164B1 (en) 2015-06-17 2022-04-20 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of appendicitis and differentiation of causes of abdominal pain
CA2992139A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 West Virginia University Markers of stroke and stroke severity
CA3001918C (en) 2015-10-15 2023-08-22 Inbios International, Inc. Multiplexed lateral flow assay systems and methods for their use
WO2017146631A1 (en) * 2016-02-24 2017-08-31 Emanuel Smeds Method for using biological material for determination of differences in binding to a molecule of interest
AU2017267728B2 (en) 2016-05-18 2021-11-04 Alere San Diego, Inc. 2-ethylidene-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine analogs and methods for their synthesis and use
WO2017214203A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Astute Medical, Inc. Management of acute kidney injury using insulin-like growth factor-binding protein 7 and tissue inhibitor of metalloproteinase 2
NL2017267B1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Aduro Biotech Holdings Europe B V Anti-pd-1 antibodies
BR112019006710A2 (pt) 2016-10-03 2019-06-25 Abbott Lab métodos aprimorados para avaliação do estado da uch-l1 em amostras de pacientes
EP3522893A4 (en) 2016-10-04 2020-08-26 University Of Maryland, Baltimore METHODS OF TREATMENT OF SEPTICEMIA USING LIPID A-BASED THERAPEUTIC AGENTS (ASLA) ANTISEPSY
BR112019009256A2 (pt) 2016-11-08 2019-07-16 Reata Pharmaceuticals Inc métodos para tratar síndrome de alport usando bardoxolona metil ou análogos do mesmo
JP6795951B2 (ja) * 2016-11-09 2020-12-02 旭化成株式会社 濃度推定方法、検出装置、処理装置、プログラムおよび検出システム
EP3568695A4 (en) 2017-01-12 2020-12-16 Astute Medical, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE EVALUATION AND TREATMENT OF KIDNEY INJURY AND RENAL FAILURE BASED ON A MEASUREMENT OF LIGAND CHEMIOKINE ON C-C 14
US10564155B2 (en) 2017-01-27 2020-02-18 Raouf A Guirguis Dual swab fluid sample collection for split sample testing and fingerprint identification device
WO2018164580A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Rijksuniversiteit Groningen Biomarkers for cellular senescence
US11016092B2 (en) 2017-03-23 2021-05-25 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and determination of the extent of traumatic brain injury in a human subject using the early biomarker ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1
WO2018191531A1 (en) 2017-04-15 2018-10-18 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers
BR112019022476A2 (pt) 2017-04-28 2020-05-12 Abbott Laboratories Métodos para o auxílio no diagnóstico e determinação hiperagudos de lesão cerebral traumática usando biomarcadores iniciais em pelo menos duas amostras a partir do mesmo ser humano
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
JP2020519904A (ja) 2017-05-07 2020-07-02 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎代替療法の管理におけるインスリン様増殖因子結合タンパク質７および組織メタロプロテアーゼ阻害物質２の使用
CA3078725A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Abbott Laboratories Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers
BR112019025313A2 (pt) 2017-05-30 2020-06-23 Abbott Laboratories Métodos para auxílio no diagnóstico e avaliação de uma lesão cerebral traumática leve em um indivíduo humano usando troponina cardíaca i
EP3649474A1 (en) 2017-07-03 2020-05-13 Abbott Laboratories Improved methods for measuring ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 levels in blood
EP3721233A2 (en) 2017-12-09 2020-10-14 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and evaluation of a subject who has sustained an orthopedic injury and that has or may have sustained an injury to the head, such as mild traumatic brain injury (tbi), using glial fibrillary acidic protein (gfap) and/or ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 (uch-l1)
US11016105B2 (en) 2017-12-09 2021-05-25 Abbott Laboratories Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of GFAP and UCH-L1
WO2019133902A2 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Astute Medical, Inc. Antibodies and assays for ccl14
EP3732489A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 Abbott Laboratories Novel biomarkers and methods for diagnosing and evaluating traumatic brain injury
US20210239700A1 (en) 2018-05-04 2021-08-05 Abbott Laboratories Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
US20210205264A1 (en) 2018-09-04 2021-07-08 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute Inc. Use of delta-tocotrienol for treating cancer
EP3903103B1 (en) 2018-12-28 2024-05-15 Abbott Laboratories Direct detection of single molecules on microparticles
WO2020144535A1 (en) 2019-01-08 2020-07-16 Aduro Biotech Holdings, Europe B.V. Methods and compositions for treatment of multiple myeloma
US11079395B2 (en) 2019-03-01 2021-08-03 Abbott Laboratories Methods for predicting major adverse cardiovascular events in subjects with coronary artery disease
WO2020180645A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Meso Scale Technologies, Llc. Electrochemiluminescent labeled probes for use in immunoassay methods, methods using such and kits comprising same
EP4136459A1 (en) 2020-04-13 2023-02-22 Abbott Laboratories Methods, complexes and kits for detecting or determining an amount of a ss-coronavirus antibody in a sample
WO2021222830A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Meso Scale Technologies, Llc. Viral serology assays
MX2022014034A (es) 2020-05-09 2023-01-11 Reata Pharmaceuticals Holdings Llc Métodos para tratar covid-19 con el uso de bardoxolona metilo o análogos de esta.
EP4158352A1 (en) 2020-06-01 2023-04-05 Loop Diagnostics, S.L. Method and kit for the early detection of sepsis
KR20230042301A (ko) 2020-08-04 2023-03-28 애벗트 라보라토리이즈 샘플에서 sars-cov-2 단백질을 검출하기 위한 개선된 방법 및 키트
WO2022029494A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Abbott Rapid Diagnostics International Unlimited Company Assays for detecting sars-cov-2
WO2022119841A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2023102384A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
EP4259155A1 (en) 2020-12-11 2023-10-18 Reata Pharmaceuticals Holdings, LLC Synthetic triterpenoids for use in therapy
EP4271998A1 (en) 2020-12-30 2023-11-08 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
US20220381796A1 (en) 2021-05-18 2022-12-01 Abbott Laboratories Methods of evaluating brain injury in a pediatric subject
WO2022246215A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Meso Scale Technologies, Llc. Viral strain serology assays
EP4356129A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Abbott Laboratories Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind
CN117999482A (zh) 2021-06-28 2024-05-07 中尺度技术有限责任公司 用于测定信号扩增的方法、组合物和试剂盒
WO2023028186A1 (en) 2021-08-27 2023-03-02 Abbott Laboratories Methods for detecting immunoglobulin g, subclass 4 (igg4) in a biological sample
CA3230038A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Hongwei Zhang Methods and systems of diagnosing brain injury
AU2022354059A1 (en) 2021-09-30 2024-03-28 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
WO2023114978A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Abbott Laboratories Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples
US20230213536A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Abbott Laboratories Use of biomarkers to determine sub-acute traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography (ct) scan that is negative for a tbi or no head ct scan
WO2023144206A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 Sanofi Pasteur Modified vero cells and methods of using the same for virus production
WO2023150652A1 (en) 2022-02-04 2023-08-10 Abbott Laboratories Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample
WO2023212294A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Angiopoietin-related protein 7-specific antibodies and uses thereof
WO2023212298A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease
WO2023212293A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof
WO2023245184A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 Meso Scale Technologies, Llc. Viral strain serology assays
WO2024059708A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Abbott Laboratories Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury
WO2024059692A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Abbott Laboratories Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
US20240103002A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Meso Scale Technologies, Llc. Orthopoxvirus serology assays

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3654090A (en) * 1968-09-24 1972-04-04 Organon Method for the determination of antigens and antibodies
US4203802A (en) * 1971-05-14 1980-05-20 Syva Company Inhibitable enzyme amplification assay
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3884898A (en) * 1972-08-18 1975-05-20 Syva Co Normorphine derivatives bonded to proteins
US3878187A (en) * 1972-09-11 1975-04-15 Syva Co Polypeptide derivatives of amphetamine and analogs for immunoassays
SE388694B (sv) * 1975-01-27 1976-10-11 Kabi Ab Sett att pavisa ett antigen exv i prov av kroppvetskor, med utnyttjande av till porost berarmaterial bundna eller adsorberande antikroppar
JPS51114985A (en) * 1975-04-01 1976-10-09 Kyoto Daiichi Kagaku:Kk Mothod to analyse urine, etc.
US4120945A (en) * 1976-07-06 1978-10-17 Becton, Dickinson & Company Substrate coated with receptor and labeled ligand for assays
US4200690A (en) * 1976-12-16 1980-04-29 Millipore Corporation Immunoassay with membrane immobilized antibody
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4277437A (en) * 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4791055A (en) * 1978-04-10 1988-12-13 Miles Inc. Homogenous specific binding assay reagent system and labeled conjugates
JPS5510590A (en) * 1978-05-04 1980-01-25 Wellcome Found Enzyme immunity quantity analysis
NL7807532A (nl) * 1978-07-13 1980-01-15 Akzo Nv Metaal-immunotest.
US4246339A (en) * 1978-11-01 1981-01-20 Millipore Corporation Test device
US4281065A (en) * 1979-01-25 1981-07-28 Syva Company Phencyclidine conjugates to antigenic proteins and enzymes
US4299916A (en) * 1979-12-26 1981-11-10 Syva Company Preferential signal production on a surface in immunoassays
US4540659A (en) * 1981-04-17 1985-09-10 Syva Company Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay
US4533629A (en) * 1981-04-17 1985-08-06 Syva Company Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay
US4391904A (en) * 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4366241A (en) * 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
US4425438A (en) * 1981-03-13 1984-01-10 Bauman David S Assay method and device
US4446232A (en) * 1981-10-13 1984-05-01 Liotta Lance A Enzyme immunoassay with two-zoned device having bound antigens
DE3382044D1 (de) * 1982-03-19 1991-01-17 Ekins Verfahren zur pruefung von freien liganden.
US4506009A (en) * 1982-03-30 1985-03-19 University Of California Heterogeneous immunoassay method
US4435504A (en) * 1982-07-15 1984-03-06 Syva Company Immunochromatographic assay with support having bound "MIP" and second enzyme
US4477576A (en) * 1982-07-26 1984-10-16 Mex Research Associates Antigen assay method and kit
EP0114614A2 (en) * 1983-01-25 1984-08-01 Abbott Laboratories Determination of steroid hormone glucuronides
US4496654A (en) * 1983-04-08 1985-01-29 Quidel Detection of HCG with solid phase support having avidin coating
GB8331514D0 (en) * 1983-11-25 1984-01-04 Janssen Pharmaceutica Nv Visualization method
US4703017C1 (en) * 1984-02-14 2001-12-04 Becton Dickinson Co Solid phase assay with visual readout
US4632901A (en) * 1984-05-11 1986-12-30 Hybritech Incorporated Method and apparatus for immunoassays
GB2161165A (en) * 1984-06-12 1986-01-08 Cambridge Patent Dev Secondary antibodies
AU560779B2 (en) * 1985-01-24 1987-04-16 Quidel Assay for drugs of abuse
US4740468A (en) * 1985-02-14 1988-04-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Concentrating immunochemical test device and method
GB2171999A (en) * 1985-03-04 1986-09-10 Iq Antibodies
CA1272127A (en) * 1985-04-04 1990-07-31 Hybritech Incorporated Solid phase system for use in ligand-receptor assays
JPS62502495A (ja) * 1985-04-10 1987-09-24 イムニコン・コ−ポレ−ション 直接均質検定
US4743542A (en) * 1985-04-11 1988-05-10 Ortho Diagnostic Method for forestalling the hook effect in a multi-ligand immunoassay system
US4803170A (en) * 1985-05-09 1989-02-07 Ultra Diagnostics Corporation Competitive immunoassay method, device and test kit
US4746631A (en) * 1985-05-09 1988-05-24 Ultra Diagnostics Corporation Immunoassay method, device, and test kit
JPS62231168A (ja) * 1986-03-21 1987-10-09 ハイブリテツク・インコ−ポレイテツド アナライト−レセプタ−分析用内部標準を設けるための改良法
US4778751A (en) * 1986-05-12 1988-10-18 Diagnostic Products Corporation Method for measuring antigens or antibodies in biological fluids using ligand labeled antigens or ligand labeled antibodies
US5030558A (en) * 1986-11-07 1991-07-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Qualitative immunochromatographic method and device
EP0271204A3 (en) * 1986-11-07 1989-10-25 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunochromatographic method and device
US4817837A (en) * 1987-09-03 1989-04-04 Grover Betty L Strap for holding skis and ski poles
US4952517A (en) * 1988-02-08 1990-08-28 Hygeia Sciences, Inc. Positive step immunoassay

Also Published As

Publication number Publication date
EP0378391B1 (en) 1995-09-13
ATE127921T1 (de) 1995-09-15
WO1990008319A1 (en) 1990-07-26
AU5021590A (en) 1990-08-13
CA2007532A1 (en) 1990-07-10
ES2079434T3 (es) 1996-01-16
GR3018366T3 (en) 1996-03-31
PT92828A (pt) 1991-09-13
US5089391A (en) 1992-02-18
JP2807565B2 (ja) 1998-10-08
DE69022254T2 (de) 1996-02-15
US5028535A (en) 1991-07-02
EP0378391A2 (en) 1990-07-18
DK0378391T3 (da) 1996-01-02
DE69022254D1 (de) 1995-10-19
JPH03503215A (ja) 1991-07-18
CA2007532C (en) 2002-10-01
US5679526A (en) 1997-10-21
AU633874B2 (en) 1993-02-11
EP0378391A3 (en) 1991-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT92828B (pt) Metodo de ensaio relativo a receptores de ligandos limite
US5939272A (en) Non-competitive threshold ligand-receptor assays
AU608866B2 (en) Non-metal colloidal particle immunoassay
US5296347A (en) Bridge immunoassay
US4469787A (en) Immunoassay involving soluble complex of second antibody and labeled binding protein
JP4846573B2 (ja) 基準としての天然分析物を有するラテラルフローアッセイ装置および方法
JP4619372B2 (ja) 改良された対照区画を有する免疫学的試験素子
KR920005963B1 (ko) 특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법
US4952517A (en) Positive step immunoassay
EP0864090A1 (en) Method and apparatus for quantitative and semi-quantitative determination of an analyte
JPH0654317B2 (ja) イムノアッセイ装置
JPH04230857A (ja) 結合アッセイ法および装置
JPH05501922A (ja) リガンド類似体に対する抗体及びリガンド―レセプター検定におけるそれらの用途
US8101429B2 (en) Native analyte as a reference in lateral flow assays
US20040171069A1 (en) Kinetic assay
ES2309353T3 (es) Metodo para la eliminacion de interferencias en analisis inmunocromatograficos.
JP3493544B2 (ja) 抗体アッセイ装置
US4752568A (en) Labeled hydantoin conjugate and its use in analytical element and immunoassays
WO1993017335A1 (en) Bridge immunoassay
KR20220007021A (ko) 라텍스 비드, 링커 및 항체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 및 이를 포함하는 래피드 키트
AU710737B2 (en) Method and apparatus for quantitative and semi-quantitative determination of an analyte
Monroe Enzyme Channelling Immunoassay (ECIA): A Unique and Rapid Quantitative Technique
JPH02201265A (ja) 酵素定量ウィッキングアッセイ

Legal Events

Date Code Title Description
FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 19960123

MM3A Annulment or lapse

Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES

Effective date: 19990731