JP2009539370A - 診断方法およびマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、前立腺癌(PRC)、前立腺上皮内腫瘍(prostatic intraepithelial neoplasia)(PIN)または同疾患の素因を検出し、診断し、モニターし、および治療する方法;およびそのような方法において有用なマーカーに関する。
前立腺癌は欧州および北米の男性において最もよく診断される癌である。該地域では、前立腺癌は肺癌に次ぐ第二位の男性の死因である(Frankel et al. 2003)。該疾患はまた、日本などの世界の他の地域でも次第に増加している。それは東洋諸国で西洋の食事が導入されたことを反映しているかもしれない。
第一の態様では、本発明は、配列番号3の配列または機能上等価なその変異体もしくは断片、またはストリンジェントな条件下で配列番号3にハイブリダイズする配列またはその変異体もしくは断片を含む、単離された核酸分子を提供する。
(a) 上記核酸配列、好ましくは配列番号3、またはその相補配列;
(b) 上記核酸配列またはその相補配列に対応するcDNAの完全長コード配列;
(c) (a)または(b)の逆相補配列
にハイブリダイズする、上記核酸配列(好ましくは配列番号3)またはその相補配列の少なくとも10ヌクレオチドの断片を含む、単離された核酸分子を提供する。
(a) 本発明のポリペプチドを発現可能な本発明の遺伝子構築物、例えば本明細書中で定義される発現構築物を含む宿主細胞を培養するステップ;
(b) 本発明のポリペプチドを発現する細胞を選択するステップ;
(c) 発現されたポリペプチドを細胞から分離するステップ;および場合により
(d) 発現されたポリペプチドを精製するステップ
を含む方法を提供する。
(a) 該核酸を発現する試験細胞を試験化合物と接触させるステップ;
(b) 該核酸の発現レベルを決定するステップ;および
(c) 試験化合物の不存在下での発現レベルと比較して発現レベルを改変する化合物を選択するステップ
を含む方法を提供する。
(a) 該核酸分子によってコードされるペプチドと試験化合物を接触させるステップ;
(b) ペプチドの生物学的活性を検出するステップ;および以下のいずれか:
(c) 化合物の不存在下で検出される生物学的活性と比較してペプチドの生物学的活性を改変する化合物を選択するステップ;または
(d) ペプチドに結合する化合物を選択するステップ
を含む方法を提供する。
(a) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸配列、好ましくはPSPU43(配列番号3)にハイブリダイズするヌクレオチドプローブとサンプルを接触させるステップ;および
(b) サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の存在を検出するステップ
を含む方法であるアッセイを提供する。
(a) 該核酸分子のDNA配列またはその相補配列を増幅するステップ;または
(b) 該核酸分子のcDNA配列またはその相補配列を増幅するステップ;および
(c) 該サンプル中の1種以上のDNA、cDNAまたはRNAのレベルを測定するステップ
を含む方法に関する。
(a) サンプルを本発明の抗体と接触させるステップ;および
(b) サンプル中の結合ポリペプチドの存在を検出するステップ
を含む方法であるアッセイを提供する。
(a) トランスゲリン1をコードする核酸(配列番号7)またはその相補配列;
(b) トランスゲリン2をコードする核酸(配列番号8)またはその相補配列;
(c) PCA3をコードする核酸(配列番号6)またはその相補配列;および
(d) PSAをコードする核酸(配列番号5)またはその相補配列
のうち1種以上をさらに含む。
以後、添付の図面の図を参照して本発明を説明する。
本明細書および特許請求の範囲で使用される用語「含む(comprising)」は、「少なくとも部分的に〜からなる(consisting at least in part of)」を意味し、すなわち、該用語を含む本明細書および特許請求の範囲の記載を解釈する場合、各記載中の該用語が前に記載された特徴は全て存在する必要があるが、他の特徴が存在することもありうる。関連用語、例えば「comprise」および「comprised」も同様に解釈されるものとする。
bl2seq -i nucleotideseq1 -j nucleotideseq2 -F F -p blastn
パラメータ-F Fは複雑さが低いセクションのフィルタリングをオフにする。パラメータ-pは配列ペアに適切なアルゴリズムを選択する。bl2seqプログラムは、同一ヌクレオチドの数およびパーセンテージの両者として「同一性=」の行に配列同一性を報告する。
bl2seq -i peptideseq1 -j peptideseq2 -F F -p blastp
変異ポリペプチド配列は、好ましくは、具体的に特定されている配列のいずれか1種と比較して、1 x 10-5未満、より好ましくは1 x 10-6未満、より好ましくは1 x 10-9未満、より好ましくは1 x 10-12未満、より好ましくは1 x 10-15未満、より好ましくは1 x 10-18未満、最も好ましくは1 x 10-21未満のE値を示す。
(1) 疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2) 中性親水性:cys、ser、thr;
(3) 酸性:asp、glu;
(4) 塩基性:asn、gln、his、lys、arg:
(5) 鎖の配向に影響する残基:gly、pro;および
(6) 芳香族性:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、前記クラスのうちの1クラスのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴う。
(a) 構築物が形質導入される対象の宿主細胞において機能的なプロモーター、
(b) 発現対象のポリヌクレオチド、および
(c) 構築物が形質導入される対象の宿主細胞において機能的なターミネーター
を含む。
出願人(発明者)らは、配列決定済み前立腺cDNAライブラリーを発掘する新しいバイオインフォマティクス手法を使用して前立腺癌またはPINの新規マーカーを同定した。データパニングは、転写産物が有する、所定の組織への特異性の程度を決定する技術である。この方法はUniGeneデータベースを利用する(www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)。UniGeneクラスター内のESTを起源のライブラリーについて評価し、指定された組織由来のESTの集計量を維持する。この集計量をUniGeneクラスターにおけるESTの総数のパーセンテージとして表す。該パーセンテージが高いほど、指定組織以外の組織での該転写産物の検出例が少ない。この手法は他のテクノロジー、例えばcDNAマイクロアレイ(Carlisle et al., 2000)よりも優れた利点を有し、それは、不偏性遺伝子選択、および疾患状態間の差異の特定における高い識別力に起因する。前立腺癌での遺伝子発現をプロファイリングするための以前の試みでは、分析対象の発現配列タグの数が限定されている方法(Huang et al., 1999)または遺伝子選択が偏っている方法(Carlisle et al., 2000)を使用していた。
名称 Unigene # 配列番号 集積% 組織
PSPU 43 161160 3 83 前立腺、その他
(a) 本発明の核酸配列、好ましくは配列番号3またはその相補配列;
(b) 本発明の核酸配列またはその相補配列に対応するcDNAの完全長コード配列;
(c) (a)または(b)の逆相補配列
にハイブリダイズする、本発明の核酸配列、好ましくは配列番号3またはその相補配列、の少なくとも10ヌクレオチドの断片からなる単離された核酸分子を提供する。
(a) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブとサンプルを接触させるステップ;および
(b) サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の存在を検出するステップ
を含むアッセイ方法を提供する。
1. 転写産物のAUG開始コドンから出発し、AAジヌクレオチド配列に関して下流をスキャンする。各AAの出現および3'隣接19ヌクレオチドを潜在的siRNA標的部位として記録する。Harborth et al. (2003)は、5'および3'非翻訳領域(UTR)および開始コドン付近の領域(75塩基以内)に対するsiRNAの設計をしないよう推奨する。これらが調節タンパク質結合部位に富むからである。エンドヌクレアーゼおよび、前記領域に対して設計されたsiRNAの複合体はUTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体の結合を妨害する可能性がある。
ヒト抗体は当技術分野において公知の種々の技術を使用して生産することもでき、該技術にはファージディスプレイ技術(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991));およびトランスジェニック法が含まれる。例えばNature Biotechnology 14, 826 (1996); およびVaughan et al, Nature Biotechnology 16:535-539 (1998)を参照のこと。
序論
発明者らは、自動データマイニング(発明者らはデータパニングと称する)の系を開発した。この系の出発点は、組織サンプルからの転写産物(mRNA)を捕捉し、さらにそれをcDNAライブラリーの形態の安定な産物(cDNA)に変換することである。cDNAライブラリーの大規模なシークエンシングの結果、GenBankに多数の発現配列タグ(Expressed Sequence Tag)(EST)が蓄積された。これらの発現配列はUniGeneデータベース(Schuler et al. 1996)中のESTの起源である。現在、ヒトUniGeneデータベースには約410万のヒトEST/mRNAが存在する。
各UniGeneクラスター中の記録データは、そのcDNAライブラリーがシークエンシングされておりdbESTライブラリーIDが割り当てられている任意の組織または細胞タイプに関して集積遺伝子発現プロファイルを作製する方法を提供する。UniGeneアルゴリズムによってクラスター化された各セットのESTにUniGene番号を割り当てる。この番号は、クラスターの起源の遺伝子、該遺伝子に関するSTSマーカー、可能性としてのタンパク質類似性、染色体局在、などについての任意の既知の情報を伴う、UniGeneデータベース中のクラスターエントリーを表す。「scount」と称されるUniGene記録内のフィールドは、UniGeneクラスターを形成する配列の数を示す。各UniGene記録の最終セクションは該クラスターを形成する全ての配列を列挙している。このリストの形式は、各配列のアクセッション番号、および該ESTがcDNAライブラリーの一部分としてシークエンシングされた場合には、dbESTライブラリーID番号を含む。該dbEST ID番号は所定の配列の生物学的起源に関するマーカーとして機能している。
UniGene データファイル(Hs.data.gz)をftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/repository/UniGeneからダウンロードした。Bioperlツールキット(Stajich et al. 2002)を利用する3つのPerlスクリプトを使用して前記ファイルを編集した。具体的には、これらスクリプトはBio::Cluster::UnigeneおよびBio::ClusterIOモジュールを呼び出す。第一のスクリプト、「lib_extract」では、各UniGeneクラスター中のEST配列系統の数を自動的に検査し、寄与する配列の数が指定の閾値レベルを超えた場合はこれらUniGeneを排除した。
ヒトdbESTライブラリーリストをウェブサイトhttp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/dbESTからダウンロードした。該リストをプログラムBBeditで開き、前立腺ライブラリーを特定し、GREP機能を使用して編集済みリストを得た。前立腺組織から構築された290のライブラリーを特定した。ヒト前立腺特異的配列を同定するためにこの解析に使用されたdbESTライブラリーは以下のものであった:689, 787, 792, 876, 910, 924, 925, 926, 928, 934, 935, 940, 994, 1016, 1017, 1053, 1054, 1055, 1333, 1410, 1498, 1654, 1655, 1668, 1670, 1671, 1672, 1673, 4267, 4268, 4711, 4712, 4713, 4714, 4715, 4716, 4717, 4718, 4719, 4720, 6013, 6014, 6015, 6016, 6017, 6018, 6019, 6020, 6021, 6022, 6023, 6024, 6025, 6026, 6027, 6028, 6029, 6030, 6031, 6032, 6033, 6034, 6035, 6036, 6037, 6038, 6039, 6040, 6041, 6042, 6043, 6044, 6045, 6046, 6047, 6048, 6049, 6050, 6051, 6052, 6053, 6054, 6055, 6056, 6057, 6058, 6059, 6060, 6061, 6062, 6063, 6064, 6065, 6066, 6067, 6068, 6069, 6070, 6071, 6072, 6073, 6074, 6075, 6076, 6077, 6078, 6079, 6080, 6081, 6082, 6083, 6084, 6085, 6086, 6087, 6088, 6089, 6090, 6091, 6092, 6093, 6094, 6095, 6096, 6097, 6098, 6099, 6100, 6101, 6102, 6103, 6104, 6105, 6106, 6107, 6308, 6309, 6310, 6311, 6312, 6313, 6314, 6315, 6316, 6317, 6318, 6319, 6320, 6321, 6322, 6323, 6324, 6325, 6326, 6327, 6328, 6329, 6330, 6331, 6332, 6333, 6334, 6335, 6336, 6337, 6338, 6339, 6340, 6341, 6342, 6343, 6344, 6345, 6346, 6347, 6348, 6349, 6350, 6351, 6352, 6353, 6354, 6355, 6356, 6357, 6358, 6359, 6360, 6361, 6362, 6363, 6364, 6365, 6366, 6367, 6368, 6369, 6370, 6371, 6372, 6373, 6374, 6375, 6376, 6377, 6378, 6379, 6380, 6381, 6382, 6383, 6384, 6385, 6386, 6387, 6388, 6389, 6390, 6391, 6392, 6393, 6394, 6395, 6396, 6397, 6398, 6399, 6400, 6401, 6402, 6601, 6602, 6603, 6763, 6831, 7180, 7181, 8480, 8481, 8482, 8483, 8484, 8485, 8486, 8487, 8488, 8489, 8490, 8491, 8492, 8493, 8494, 8495, 8496, 8497, 8498, 8499, 8500, 8501, 8502, 8503, 8504, 8505, 8506, 8507, 8508, 8509, 8510, 8511, 8512, 8513, 8514, 8515, 8585, 8834, 9134, 9135, 9136, 9137, 9138, 10161, 10549, 11034, 11037, 14129, 14130, 14131。前記ライブラリーは全て、正常または罹患前立腺材料から構築された。2004年3月4日に入手可能なヒトUniGeneビルドについて演算処理を行った。その結果をソートのためにMicrosoft Excelにインポートした。
複数の研究で、ほとんど全ての前立腺癌において、および重要なことに、前立腺癌の前駆症である可能性が非常に高い前立腺上皮内腫瘍(PIN)(Bostwick, 1996)において、8番染色体の短腕(8p)からの遺伝子配列の喪失がその初期分子イベントであることが提唱されている(Cher et al., 1994; Macoska et al., 1994; 1995; 2000; Haggman et al., 1997)。100%、75%および80%の集積レベル(下記表2)でデータパニングアルゴリズムを使用して同定される3種の転写産物は8p上に位置する。2種は、in silicoで、正常組織と罹患組織の間での発現の喪失と一致するパターンを示した。前立腺発現に関して83%集積を示す別の転写産物は8qに位置した。発明者らは、これらの転写産物を前立腺特異的unigene 1(Pspu1)、前立腺特異的unigene 2(Pspu2)、前立腺特異的unigene 8(Pspu8)および前立腺特異的unigene 43(Pspu43)と命名した。これらの転写産物は以前に報告されていない。Pspu1は8p12に位置し、Pspu2は8p21に見出され、Pspu8は8p22-23に位置し、Pspu43は8q23に位置する。
発明者らは、UniGeneデータマイニングアルゴリズムを使用して、前立腺に特異的な4つの核酸配列、Pspu1、Pspu2、Pspu8およびPspu43を同定した。Pspu1、Pspu2およびPspu8はそれぞれ8p12/21境界、8p21および8p22-p23に位置する。これらの遺伝子座からの欠失は前立腺癌における既知の初期イベントである(MacGrogan et al. 1994)。疾患において前記配列のうち2つが喪失することが、正常な前立腺と前立腺癌との間の遺伝子発現のメタ分析によって裏付けられる。Pspu43は8番染色体の長腕の8q23に位置する。隣接領域8q24は、最近、前立腺癌感受性に遺伝的に結び付けられた(Amundadottir et al. 2006)。発明者らは、Pspu1、Pspu2、Pspu8およびPspu43が、前立腺癌の発生における初期イベントとして生じる8番染色体の変化についての有用なマーカーであることを提唱する。
序論
上記実施例1に記載のデータパニングアルゴリズムを使用してcDNA組織ライブラリーをデータマイニングすることによって、Pspu43が前立腺に対して重要であると特定した。データパニングアプローチを使用して、合計で、8番染色体に位置付けられる4つの配列を同定した。3つの配列は8番染色体の短腕上に位置し、一方、Pspu43はこの染色体の長腕上に位置した。Pspu43は、前立腺腫瘍においてしばしば変化し、前立腺癌への遺伝的感受性と結び付けられている(Amundadottir et al., 2006)8番染色体上の領域に、近接して位置する。
PCRプライマー設計
ESTクラスターHs.161160によって生成されたコンティグからPspu43に対するPCRプライマーを設計した。該コンティグをBLASTN(Altschul et al., 1990)で解析し、クローニングベクター配列が該コンティグ中に含まれないことを確実にした。この編集済み配列をPCRプライマー設計プログラム(Primer3, Rozen and Skaletsky, 2000)に読み込ませた。最長アンプリコンを生じた最適なプライマーペアを選択し、BLASTNを使用してNCBIの非冗長遺伝子配列データベースと比較した。AMPLIFYプログラム(William Engles, Genetics Department, University of Wisconsin)を使用して、コンティグおよびプライマー配列を用いて、PCRシミュレーションを実施し、適合の忠実度を確実にし、プライマー二量体形成を回避し、可能性のあるプライマー二次構造を試験した。プライマーはInvitrogen(USA)によって合成された。プライマー配列を表5に示す。
正常な前立腺上皮細胞および間質細胞(PrECおよびPrSC; Clonetics, San Diego CA)を培養し、専用培地(PrEGM BulletKit; Clonetics, San Diego CA)で維持した。一方、前立腺癌セルラインLNCaP(ATCC CRL 1740, Manassas, VA)、DU145(ATCC HTB-81, Manassas, VA)およびRWPE-2(ATCC CRL-11610, Manassas, VA)を培養し、10%ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640培地で維持した。
QIAgen PCR精製系(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)を使用してPCR産物をゲル精製した。QX1バッファーを製造元の使用説明書に従って使用して1%アガロースゲルからDNAを取り出した。精製カラムから滅菌milliQ水中にDNAを溶出させた。
表6は、3つの前立腺セルラインから合成されたゲノムDNAおよびcDNAの両者から得られたPCRの結果を示す。これらはLNCaP、PrECおよびPrSCセルラインであった。PrECおよびPrSCはそれぞれ正常な前立腺上皮細胞および間質細胞に由来する。LNCaPは前立腺癌患者からのリンパ節転移病変に由来する。3つのセルラインから単離された全てのゲノムDNA中でPspu43配列を検出した。これは、Pspu43がヒトゲノムの一部分であり、LNCaPセルラインから完全には失われていないことを示す。
Pspu43は、正常および癌性の前立腺組織の両方から作製されたcDNAライブラリーにもっぱら存在するとして同定された発現RNA配列である。それは、通常、前立腺上皮で発現されるようである。したがってPspu43発現は前立腺の健康についての可能性のあるマーカーである。
序論
発明者らは、前立腺疾患の臨床検査を受けた男性群の尿中でPspu43が検出可能かどうかを試験したいと考えた。尿サンプルはDepartment of Urology, Dunedin Hospital, Dunedin, New Zealandから収集した。それら尿サンプルからRNAを抽出し、RT-PCRに付して、Pspu43、トランスゲリン2およびPSAを検出した。これらアッセイはスコア化した。RT-PCRの結果を得た後にのみ患者の診断が可能になった。
この研究への全参加者は承諾書を提出し、このプロジェクトはLower South Regional Ethics Committeeから倫理上の承認を受けた(「Development of non-invasive, diagnostic and prognostic tests of prostate cancer」LRS/05/05/016)。男性群は、その前立腺の物理的状態を判定するための通常の検査手順の部分として前立腺触診を受けた。前立腺触診では、人差し指を両側面に3回滑らせることによる右葉および左葉ならびに先端から基部までの指診を行った。その後、20〜30 mlの尿サンプルを収集した。等しい容量のリン酸バッファー(pH7.0)を尿サンプルに加えた。このサンプルを4℃で一晩保存した。4℃で15分間2500gで遠心分離することによって細胞を回収し、上清を除去し、細胞ペレットを800μlのTriZol(Invitrogen, Carlsbad, USA)に再懸濁した。グリコーゲン(Invitrogen, Carlsbad, USA)を加えて、終濃度250μg/mlとした。製造元のプロトコルに従ってRNAを抽出した。RNAペレットを16.5μlのH2Oに再懸濁した。8マイクロリットルのサンプルをDnase I(Roche, Switzerland)で製造元の使用説明書通りに処理した。Superscript II(Invitrogen, Carlsbad, USA)を製造元の使用説明書通りに使用して、Dnase I処理サンプルの半分をcDNAに変換した。下記プライマーを使用して、1〜2.5μlの範囲のcDNAおよび等量のDnase I処理RNAに対してPCR増幅を実施した(表9)。Amplitaq GoldTM master mix(Applied Biosystems, NJ, USA)を使用してPCRを行った。PCR条件を最適化し、65℃の有効なアニーリング温度を確立した。
発明者らは、疑われる疾患について前立腺検査を受けた8人の男性によって提供された尿サンプル、および前立腺疾患の症状を有さない男性からの1つの尿サンプルから信頼性のあるRT-PCRの結果を得た。RNAのみのサンプルがPCR産物を生じなければ、PCRの結果は信頼性ありとした。発明者らのPCR系で使用される酵素は鋳型としてRNAを利用できない。したがってRNAのみの反応から生じるPCR産物はサンプル中のゲノムDNAの存在を示す。これが事実である場合、遺伝子発現をゲノム混入と識別することができない。これらの結果を表10にまとめる。
Pspu43を男性の尿中で検出することができた。後に前立腺生検により前立腺腫瘍を有すると診断された患者においては、腫瘍を有さないかまたは良性前立腺肥大(BPH)を有する男性よりも頻繁にPspu43が検出された。PSAおよびトランスゲリン2は全てのサンプル中で検出された。したがって、マーカーの有無を調べる単純な診断検査には、PSAまたはトランスゲリン2は適さないであろう。他方、Pspu43は、腫瘍を有する患者において検出することができるであろう。このことは、前立腺癌のマーカーとしてのPspu43の用途を裏付ける。前立腺癌の進行の予測因子としてのPSA増大に伴う問題は、それが前立腺癌と他の病理を識別できないことである。BPHおよび前立腺炎でも、ともに、血中PSAスコアが高くなりうる。Pspu43はBPHと前立腺癌を識別できるので、癌存在のマーカーとしてより高い感度を潜在的に有する。
序論
この実験の目的は、疾患状態を有する前立腺におけるPspu43発現の変化を調べることであった。
組織
組織生検試料はCancer Society Tissue Bank(Christchurch, New Zealand)から入手した。組織バンクに材料を提供した全ての患者から承諾書を得た。また、このプロジェクトに対する個別の承認をCancer Society Tissue Bank Governing BoardおよびLower South Regional Ethics Committeeから得た(「Development of non-invasive, diagnostic and prognostic tests of prostate cancer」LRS/05/05/016)。組織は、患者から取り出された後15〜30分以内に液体窒素中で瞬間凍結された凍結組織ブロックとして供給された。組織および対応する患者の詳細を表11および12に示す。全ての腫瘍は組織学的タイプでは前立腺腺癌であり、全てが神経周囲の浸潤を示した。
各前立腺組織ブロックをOCT(Lab Tek products, Tennessee, USA)中、Cryomould内にマウントした。次いでRNA調製のために組織を切片にした。採取された最初および最後の切片は8μm切片からなり、それをスライドガラス上にマウントした。このスライドガラスを-80℃で保存し、必要であれば組織学参照試料として使用した。最初および最後の切片の間で10個の60μm切片を切り出してポトル容器に入れた。
1マイクロリットルの5μg/μlランダムヘキサマー(Roche, Switzerland)を600ngのRNAに加えた。この混合物を5分間95℃に加熱し、次いで5分間25℃にした。次いでサンプルを氷に移した。4μl 第一鎖バッファー(Invitrogen, Carlsbad, USA)、4μl dNTP(それぞれ2.5mM)、2μl 0.1M DTT、0.5μl 40U/μl Rnaseインヒビター(Invitrogen, Carlsbad, USA)および1μl 200U/μl Superscript II(Invitrogen, Carlsbad, USA)からなる反応混液をRNAに加え、ピペッティングすることによって混合した。これを42℃で120分間インキュベートし、次いで70℃で10分間インキュベートし、80℃で1分間インキュベートした。
cDNAを7.5ng/μlの濃度に希釈し、各サンプルの2 x 5μlアリコートを96ウェルオプティプレートのウェル中にピペットで加えた。またRNAサンプルを7.5ng/μlに希釈し、1 x 5μlアリコートを96ウェルプレート上のウェル中にピペットで加えた。PCR混入を確認し、かつ標準曲線cDNAを複製するための鋳型コントロールは各96ウェルプレートに加えなかった。各サンプルに、適切なプローブ/プライマー混合物またはSYBR green(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を加え、qPCR master mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を加えた。該プレートを密封し、混合した後、短時間遠心分離して内容物が各ウェルの底に集まることを確保した。ABI7000装置(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)でqPCRを実施した。
前立腺摘除を受けた個体から採取された前立腺由来の適合した腫瘍および正常サンプルの各ペアからRNAを抽出した。各抽出物から得られたRNAの平均量は586ng/μlであり、260/280比は1.77〜2の範囲であった。
この実験は、疾患状態にかかわらず、トランスゲリン1および2、ならびにPspu 1、2、8および43は全て前立腺組織において発現されることを示した。マーカーT2、Pspu1、Pspu2またはPspu8に関して明らかな癌を識別する発現パターンは実証されなかった。しかし、T1は腫瘍組織において下方制御される傾向を示し、これは肺、乳房および結腸癌に関する他者の知見と一致した(Chang et al., 2001, Shields et al., 2002)。反対に、Pspu43は、正常なサンプルと比較して腫瘍組織において上方制御される傾向を示した。これは顕である。発明者らは、8番染色体のこの領域が多数の男性の早期疾患過程で変化することを承知している。それらの結果はPspu43の増加が前立腺癌の指標になることを示す。
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Claims (92)
- 配列番号3の配列または機能上等価なその断片もしくは変異体、またはストリンジェントな条件下で配列番号3にハイブリダイズする配列またはその断片もしくは変異体を含む単離された核酸分子。
- 配列番号3に対して70%、好ましくは75%、好ましくは80%、好ましくは90%、好ましくは95%、好ましくは99%の配列同一性を有する、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 請求項1に記載の核酸配列、好ましくは配列番号3、の少なくとも10ヌクレオチドの断片またはその相補配列を含む単離された核酸分子であって、該断片または相補配列が以下の配列:
(a) 請求項1に記載の核酸配列、好ましくは配列番号3、またはその相補配列;
(b) 請求項1に記載の核酸配列またはその相補配列に対応するcDNAの完全長コード配列;
(c) (a)または(b)の逆相補配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。 - 少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、または好ましくは少なくとも100ヌクレオチド長である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子を含む遺伝子構築物。
- 発現構築物である、請求項5に記載の遺伝子構築物。
- 請求項6に記載の遺伝子構築物を含むベクター。
- 請求項5〜7のいずれか一項に記載の遺伝子構築物またはベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドまたは機能上等価なその変異体もしくは断片。
- 少なくとも5アミノ酸長である、請求項9に記載の単離されたポリペプチド。
- (a)配列番号9、(b)配列番号10、(c)配列番号11、(d)配列番号12、(e)配列番号13、または(f)配列番号14の配列;または(a)、(b)、(c)、(d)、(e)または(f)の機能上等価な変異体もしくは断片、またはストリンジェントな条件下で(a)、(b)、(c)、(d)、(e)もしくは(f)のいずれかにハイブリダイズする配列を含む単離されたポリペプチド。
- 請求項9〜11のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドであって、請求項9〜11のいずれか一項に記載のポリペプチドに対して少なくとも70% 好ましくは75%、好ましくは80%、好ましくは85%、好ましくは90%、好ましくは95%、好ましくは99%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド。
- 請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能上等価な変異体もしくは断片に特異的に結合する抗体。
- ポリクローナル、モノクローナル、単鎖抗体もしくはヒト化抗体、または免疫学的に活性なその断片である、請求項13に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項14に記載の抗体。
- 検出可能なマーカーで標識されている、請求項13〜15のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドを組換え生産する方法であって、以下のステップ:
(a) 請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現可能な、請求項5または請求項6に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞を培養するステップ;および
(b) 本発明のポリペプチドを発現する細胞を選択するステップ;
(c) 発現されたポリペプチドを細胞から分離するステップ;および場合により
(d) 発現されたポリペプチドを精製するステップ
を含む方法。 - 宿主細胞を前記構築物でトランスフェクトすることを事前ステップとして含む、請求項17に記載の方法。
- PSPU43(配列番号3)に結合する1種以上の核酸配列を含むアレイ。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の1種以上の核酸配列を含むアレイ。
- トランスゲリン1(配列番号7)に結合する1種以上の核酸配列をさらに含む、請求項19または請求項20に記載のアレイ。
- トランスゲリン2(配列番号8)に結合する1種以上の核酸配列をさらに含む、請求項19〜21に記載のいずれか一項のアレイ。
- PCA3(配列番号6)に結合する1種以上の核酸配列をさらに含む、請求項19〜22のいずれか一項に記載のアレイ。
- 前立腺特異抗原(PSA)(配列番号5)に結合する1種以上の核酸配列をさらに含む、請求項19〜23のいずれか一項に記載のアレイ。
- 核酸配列がRNAである、請求項19〜24のいずれか一項に記載のアレイ。
- 核酸配列がDNAである、請求項19〜25のいずれか一項に記載のアレイ。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子の発現を改変する化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップ:
(a) 該核酸分子を発現する細胞を試験化合物と接触させるステップ;
(b) 該核酸分子の発現レベルを決定するステップ;および
(c) 試験化合物の不存在下での発現レベルと比較して発現レベルを改変する化合物を選択するステップ
を含む方法。 - 核酸分子がPSPU43(配列番号3)である、請求項27に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子の活性を改変する化合物のスクリーニング方法であって、以下:
(a) 該核酸分子によってコードされるペプチドと試験化合物を接触させること;
(b) ペプチドの生物学的活性を検出すること;および以下のいずれか:
(c) 化合物の不存在下で検出される生物学的活性と比較してペプチドの生物学的活性を改変する化合物を選択すること;または
(d) ペプチドに結合する化合物を選択すること
を含む方法。 - 核酸分子がPSPU43(配列番号3)である、請求項29に記載の方法。
- 請求項27〜30のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によって選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子、好ましくはPSPU43(配列番号3)、の発現または活性を改変する化合物。
- 前立腺上皮内腫瘍(PIN)または前立腺癌(PRC)を治療または予防するための医薬の製造における請求項31に記載の化合物の使用。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子を含めたマーカー発現のパターンを含むPINまたはPRCの発現プロファイル。
- 核酸分子がPSPU43(配列番号3)である、請求項33に記載のプロファイル。
- PCA3(配列番号6)、トランスゲリン1(配列番号7)、トランスゲリン2(配列番号8)およびPSA(配列番号5)から選択される1種以上のマーカーをさらに含む、請求項33または34に記載のプロファイル。
- マーカーPSPU 43(配列番号3)、PCA3(配列番号6)、トランスゲリン1(配列番号7)、トランスゲリン2(配列番号8)およびPSA(配列番号5)を含む、請求項33〜35のいずれか一項に記載のプロファイル。
- 患者のPINまたはPRCを治療または予防する方法であって、患者の請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子の発現レベルを改変することを含むか、または請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの活性を改変することによる方法。
- 核酸分子がPSPU43(配列番号3)である、請求項374に記載の方法。
- アンチセンス組成物、siRNA組成物、またはリボザイム組成物であって請求項1に記載の核酸分子に相補的な1種以上のヌクレオチド配列を含む組成物を患者に投与することによって発現を阻害する、請求項37または請求項38に記載の方法。
- 核酸分子がPSPU43(配列番号3)である、請求項39に記載の方法。
- 組成物がワクチンである、請求項39または40に記載の方法。
- 請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体を投与することによって発現を阻害する、請求項37に記載の方法。
- ポリペプチドがPSPU43(配列番号3)によってコードされる、請求項42に記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項42または請求項43に記載の方法。
- 患者のPINまたはPRCを治療または予防する方法であって、請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの発現または活性を改変する化合物を該患者に投与することを含む方法。
- ポリペプチドが配列番号3によってコードされる、請求項45に記載の方法。
- 請求項1に記載の核酸分子が過剰発現されている患者のPINまたはPRCを治療または予防する方法であって、該核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を減少させる化合物を該患者に投与することを含む方法。
- 核酸分子がPSPU43(配列番号3)である、請求項47に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの医薬有効量を含む組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはsiRNAの医薬有効量を含む組成物。
- 核酸分子がPSPU43(配列番号3)である、請求項49または請求項50に記載の組成物。
- 請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片の医薬有効量を含む組成物。
- ポリペプチドが配列番号3によってコードされる、請求項52に記載の組成物。
- 請求項27〜30のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によって選択される化合物の医薬有効量を含む組成物。
- 製薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項49〜54のいずれか一項に記載の組成物。
- 患者のPINまたはPRCを治療または予防する方法であって、それを必要としている患者に、請求項31に記載の化合物または請求項49〜55のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
- 患者のPINまたはPRCを治療または予防するための医薬の製造におけるPSPU43(配列番号3)、または同核酸によってコードされるポリペプチドの使用。
- 患者のPINまたはPRCを治療または予防するための医薬の製造における、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 請求項1に記載の核酸分子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはリボザイム。
- PSPU43(配列番号3)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはリボザイム。
- サンプル中の請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子、好ましくはPSPU43(配列番号3)、の存在を検出するためのアッセイであって、以下:
(a) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項1に記載の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチドプローブとサンプルを接触させること;および
(b) サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の存在を検出すること
を含む方法であるアッセイ。 - プローブが標識されたプローブである、請求項61に記載のアッセイ。
- プローブが蛍光標識されている、請求項62に記載のアッセイ。
- プローブが配列番号3の相補配列である、請求項59〜63のいずれか一項に記載のアッセイ。
- 患者サンプル中の請求項1に記載の核酸分子、好ましくはPSPU43(配列番号3)、の発現レベルを決定する方法であって、該核酸分子を直接的または間接的に測定することを含む方法。
- 核酸分子をin situハイブリダイゼーションまたはRT-PCR解析に用いる、請求項65に記載の方法。
- 患者サンプル中の請求項1に記載の核酸分子の発現レベルを決定する方法であって、以下:
(a) 該核酸分子のDNA配列またはその相補配列を増幅すること;または
(b) 該核酸分子のcDNA配列またはその相補配列を増幅すること;および
(c) 該サンプル中の1種以上のDNA、cDNAまたはRNAのレベルを測定すること
を含む方法。 - 核酸分子がPSPU43(配列番号3)である、請求項67に記載の方法。
- PCRを使用してDNAまたはcDNAを増幅する、請求項67または請求項68に記載の方法。
- 電気泳動を使用してサンプル中のDNA、cDNA、またはRNAのレベルを測定する、請求項65〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 患者サンプル中の、請求項9〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの存在を検出するためのアッセイであって、以下:
(a) 請求項13〜16のいずれか一項に記載の抗体とサンプルを接触させること;および
(b) サンプル中の結合ポリペプチドの存在を検出すること
を含む方法であるアッセイ。 - 該抗体が検出可能に標識されている、請求項71に記載のアッセイ。
- 患者における前立腺上皮内腫瘍(PIN)、前立腺癌(PRC)またはPINもしくはPRCの発生の素因を診断する方法であって、患者サンプル中の請求項1に記載の核酸分子の発現レベルを決定することを含み、コントロールレベルと比較した該核酸分子の発現レベルの変化が、患者がPIN、PRCを有するかまたはPINもしくはPRCを発生するリスクを有することを示す、方法。
- 変化が発現レベルの増加である、請求項73に記載の方法。
- 発現レベルの変化が正常なコントロールレベルを少なくとも10%上回ることである、請求項74に記載の方法。
- 正常な前立腺由来のサンプル中でコントロールレベルを測定する、請求項73〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 患者における前立腺上皮内腫瘍(PIN)、前立腺癌(PRC)状態を検査する方法であって、患者サンプル中の請求項1に記載の核酸分子の発現レベルを決定することを含み、コントロールレベルと比較した該分子の発現レベルの増加が、患者がPINもしくはPRC状態を有するかまたはPINもしくはPRCを発生するリスクを有することを示す、方法。
- 被験体でのPINまたはPRCの治療に対する応答をモニターする方法であって、患者サンプル中の請求項1に記載の核酸分子の発現レベルを決定すること、および該核酸分子のレベルをコントロールレベルと比較することを含み、コントロールレベルからの決定レベルの統計学的に有意な変化が、治療に対する応答を示す、方法。
- 核酸分子がPSPU43(配列番号3)である、請求項73〜78のいずれか一項に記載の方法。
- PINまたはPRCの1種以上の追加のマーカーのレベルを決定することおよび該レベルをコントロール由来のマーカーレベルと比較することをさらに含み、コントロールレベルからの該レベルの有意な偏差、およびそれと併せた請求項1に記載の核酸分子、好ましくはPSPU43(配列番号3)、のレベルの統計学的に有意な増加が、PRCもしくはPINを示し、またはそれをPINもしくはPRC状態をモニターするために使用することができる、請求項73〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 追加のマーカーが、トランスゲリン1(配列番号7)、前立腺特異抗原(配列番号5)、およびPCA3(配列番号6)からなる群から選択される、請求項80に記載の方法。
- サンプルが、尿、リンパ液、血液、血漿、精液、前立腺マッサージ液(prostate massage fluid)、または前立腺組織サンプルである、請求項73〜81のいずれか一項に記載の方法。
- トランスゲリン2(配列番号8)を参照マーカーとして使用する、請求項73〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項73〜82のいずれか一項に記載の方法における参照マーカーとしての、トランスゲリン2(配列番号8)の使用。
- サンプル中の請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子、好ましくはPSPU43(配列番号3)、の存在を検出するためのキットであって、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子が含まれる少なくとも1つの容器を含むキット。
- 該核酸分子を検出するための1種以上の試薬をさらに含む、請求項85に記載のキット。
- 請求項1に記載の核酸分子、好ましくはPSPU43(配列番号3)、または該核酸分子によってコードされるポリペプチドに結合する、1種以上の検出試薬を含むキット。
- 請求項85〜87のいずれか一項に記載のキットであって、以下:
(a) トランスゲリン1をコードする核酸分子(配列番号7)またはその相補配列;
(b) トランスゲリン2をコードする核酸分子(配列番号8)またはその相補配列;
(c) PCA3をコードする核酸分子(配列番号6)またはその相補配列;および
(d) PSAをコードする核酸分子(配列番号5)またはその相補配列
のうち1種以上をさらに含むキット。 - (a)、(b)、(c)および(d)を含む、請求項88に記載のキット。
- 請求項1に記載の核酸分子が改変、破壊、除去または付加されているゲノムを有する非ヒト動物。
- マウスである、請求項90に記載の動物。
- 核酸分子がPSPU 43(配列番号3)である、請求項90または請求項91に記載の動物。
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