JP2807565B2 - いき値リガンド‐レセプター検定 - Google Patents

いき値リガンド‐レセプター検定

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Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、1989年１月10日付けのアメリカ合衆国特
許出願第295560号の一部継続出願であり、それに対して
優先権を主張する。
発明の分野 この発明は、流体試料において選ばれたアナライト
（分析質、analyte）を検出することを目的とする、免
疫検定を含むリガンド−レセプター検定分野に属する。
さらに詳しくは、この発明は、リガンド−レセプター検
定におけるリガンド濃度に応じたシグナル発生のいき値
の提供方法に関するものである。この明細書に記載され
ている本発明検定法を用いることにより、シグナル検出
器具を必要としない単一試験形式において１種またはそ
れ以上の標的リガンド（複数も可）の半定量的および定
量的測定結果を得ることができる。この発明はまた、器
具で補助しながら単一較正点を用いることにより試料中
のリガンド濃度の定量を可能にする方法に関するもので
ある。
これらの検定形式では、シグナル強度は、直接試料中
のリガンド濃度に比例する。
発明の背景 この明細書で使用されている「リガンド−レセプタ
ー」検定という語は、リガンドおよびそのリガンドと特
異的に相互作用し得る別の物質、すなわちリガンドレセ
プター間における複合体の形成により検出され得るアナ
ライトの検定を意味する。このリガンドは、アナライト
自体、または検出される場合には、試料中におけるアナ
ライトの存在の推定に使用され得る物質である得る。こ
の発明の明細書において「リガンド」という語は、ハプ
テン、ホルモン、抗原、抗体、デオキシリボ核酸（DN
A）、リボ核酸（RNA）、前記物質の代謝物、および診断
的興味の対象であり得、その特異的結合相手、すなわち
リガンド−レセプター検定のリガンドレセプターを有す
る天然または合成起源の他の物質を包含する。この発明
の明細書において、「リガンドレセプター」という語
は、特異的結合相手が存在する物質、すなわちリガンド
−レセプター検定のリガンドを包含する。当技術分野の
熟練者には、興味の対象であるアナライト、すなわち特
異的結合対の一員が、検定設計次第でリガンドレセプタ
ーまたはリガンドであり得ることは当然である。
リガンド−レセプター検定は、一般に体液、食品、動
物流体および環境試料中におけるリガンドの存在および
濃度のインビトロ測定に有用である。例えば、ひと血液
または尿中の特定のホルモン、蛋白質、治療剤および毒
薬の測定は、ひとの状態の医学的診断を著しく改善させ
た。試料中におけるそれらのリガンドの定性的、半定量
的および定量的測定を目的とする簡単で迅速な検定法が
ひき続き要望されている。さらに、多くの状況におい
て、それらの検定は、非専門的使用者でも遂行および解
釈できる程度に簡単であることが必要である。
リガンド−レセプター検定は、レセプターによるリガ
ンドの結合に基づいて試料中のリガンドの濃度を測定す
る。リガンド−レセプター検定は、きっ抗的または非き
っ抗的なものとして記載され得る。非きっ抗的検定は、
一般に検定で測定されるリガンドの濃度をかなり上回る
量のレセプターを利用する。２つのレセプター、すなわ
ち検出を可能にすべく標識された第１のレセプターおよ
び非結合試薬、例えば非結合標識第１レセプターからの
分離を容易にするために固相に結合されていることが多
い第２のレセプターに対する結合によりリガンドを検出
するサンドイッチ検定は、非きっ抗的検定の例である。
きっ抗的検定は、一般に試料からのリガンド、検出を可
能にすべく標識されたリガンド類似体およびリガンドレ
セプターにより提供される限られた数の結合部位に関す
るこれらの種類のきっ抗を利用する。当技術分野の熟練
者には、この基本的なきっ抗的状況の多くの変形が以前
に記載されており、この発明の全般的対象に直接関係の
ある場合を除き、この明細書で詳細に検討されていない
ことは当然である。きっ抗的リガンド−レセプター検定
により通常測定されるリガンドの例としては、ハプテ
ン、ホルモンおよび蛋白質がある。これらの種類のリガ
ンドを結合し得る抗体は、これらの検定においてリガン
ドレセプターとして頻繁に使用される。
きっ抗的リガンド−レセプター検定は、ホモジニアス
的またはヘテロジニアス的方法としてさらに詳しく説明
され得る。ホモジニアス検定では、きっ抗に加わる試薬
の全てを一緒に混合し、リガンドレセプターおよび標識
リガンド類似体間の結合の程度に対するその作用により
リガンドの量を測定する。観察されるシグナルは、この
結合程度により変調され、試料中のリガンドの量に対応
し得る。アメリカ合衆国特許第3817837号は、標識リガ
ンド類似体がリガンド酵素コンジュゲートであり、リガ
ンドレセプターがリガンドまたはリガンド類似体に結合
し得る抗体である、前述のようなホモジニアスきっ抗的
免疫検定法を記載している。リガンド酵素コンジュゲー
トへの抗体の結合は、酵素が非結合状態であるときに観
察される活性と比べて酵素の活性を低下させる。抗体結
合部位に対して非結合リガンドおよびリガンド酵素コン
ジュゲートがきっ抗することから、リガンド濃度が増加
すると、非結合リガンド酵素コンジュゲートの量が増加
し、それによって観察されるシグナルも増加する。次い
で、分光光度計の使用により、酵素反応の生成物が反応
速度論的に測定され得る。
一般に、ホモジニアス検定システムは、結果を読み取
るための器具および既知濃度のリガンドを含む試料を用
いた別の試験による観察されたシグナルの較正の両方を
必要とする。ホモジニアス検定の開発はきっ抗的検定研
究において優位を占め、その結果幾つかの市販のシステ
ムが登場した。しかしながら、それらのシステムは、器
具を必要としない単一試験形式において試料中の多数の
リガンドの測定に関する結果を提供することができな
い。
ヘテロジニアスのきっ抗的リガンド−レセプター検定
は、遊離標識リガンドまたはレセプターからの結合標識
リガンドまたはレセプターの分離および結合または遊離
フラクションの測定を必要とする。それらの検定の実施
方法は、アメリカ合衆国特許第3654090号、同第4298685
号および同第4506009号に記載されている。しかしなが
ら、それらの方法は、検定応答を較正するための追加的
試験を用いなければ、試料中のリガンドの測定に関する
半定量的または定量的結果を提供することができない。
器具を使用せずに遂行され得るリガンド−レセプター
検定に対する要望により、遂行しやすく、視覚的に解釈
され得る応答結果を提供する免疫検定法が開発された。
アメリカ合衆国特許第4125372号、同第4200690号、同第
4246339号、同第4366241号、同第4446232号、同第44775
76号、同第4496654号、同第4632901号、同第4727019号
および同第4740468号は、結果の視覚的解釈を目的とし
た着色応答を発生するリガンド−レセプター検定用の装
置および方法について記載している。それらの装置は検
定結果の視覚的解釈を目的とする単純な形式を提供する
が、リガンドの存在または非存在しか測定され得ない。
これらの方法を用いた半定量的および定量的測定は、既
知濃度の標準を利用した別の試験を遂行することによ
り、観察された応答およびリガンド濃度間の関係を確立
することが必要である。
また、レファレンスゾーンにおける応答が特定濃度の
リガンドに関する検定応答を表すものであるレファレン
スゾーンを組み込んだ装置の提供によりリガンド−レセ
プター検定の内部較正方法が開発された。試験ゾーンに
おいて試料中の未知濃度のリガンドにより発生された応
答を、レファレンスゾーンにおける応答と比較すること
により、試料中のリガンドの濃度を半定量的または定量
的に測定する。ヨーロッパ特許出願第87302403.8号は、
非きっ抗的サンドイッチ検定において前記内部レファレ
ンスを用いることにより、結果の視覚的読み取り値から
半定量的測定結果を、および結果の器具による読み取り
値から定量的測定結果を得る方法を記載している。同様
に、アメリカ合衆国第4540659号およびヨーロッパ特許
出願第85307785.7号は、視覚的に解釈されるきっ抗的リ
ガンド−レセプター検定での半定量的測定結果の作成能
力を提供するレファレンスを組み入れたシステムについ
て記載している。これらのシステムは両方とも、固相固
定化レセプターに結合した標識リガンド類似体の量の視
覚的解釈を提供する。
きっ抗的リガンド−レセプター検定に関して記載され
た技術を用いた場合、レファレンスよりも色の強度が強
い検定結果は、試料が、レファレンスにより濃度で表さ
れた値よりも低い濃度でリガンドを含むことを意味する
と解釈される形で、得られた色の強度は試料中のリガン
ド濃度に逆比例する。しかしながら、それらの視覚的に
解釈されるきっ抗的リガンド−レセプター検定の広範な
利用にとって重大な障害となるのは、発生されたシグナ
ル強度および試料リガンド濃度間のこの逆比例関係であ
る。この関係の場合、低濃度のリガンドを含む試料は検
定において強いシグナルを発生し、逆に高濃度のリガン
ドを含む試料は検定において弱いシグナルを発生する。
それらの検定の別の不利な点は、単一試験にとって、多
数のリガンドを同時に測定することが必要条件であり、
それらのリガンドの各々に半定量的値を割り当てなけれ
ばならず、またそれらの各々が特異的な個々の濃度標的
を有する場合、個々の特定レファレンスゾーンを、測定
される各リガンドに対して提供しなければならないとい
うことである。そのような環境下では、多数のリガンド
に関する試験は製作困難であり、解釈も複雑になる。
検定において、試料中のリガンドが予め定められた量
を越えるまでシグナルが生成されない方法は、ヨーロッ
パ特許出願87309723.2および87309724.0並びにPCT出願
第PCT/US86/00668号（国際公開番号W086/06170）に記載
されている。これらの方法は、試料中のリガンドおよび
固定化レセプターとのリガンド類似体コンジュゲートを
接触させ得る固相アレイ上に固定化されたリガンドレセ
プターを利用する。この接触は、固相アレイを通して直
接的にリガンド含有液を引き出す形でクロマトグラフィ
ー的に行なわれる。固相をリガンド含有液が通過中に、
予め定められた量のリガンドが固相により結合するよう
に、固相の結合能力を経験的に調節する。リガンド、リ
ガンド類似体コンジュゲートおよび固定化レセプターの
アレイは、これらの方法におけるアレイ・プロセス中に
平衡状態には到達しない。当技術分野の熟練者であれ
ば、固定化レセプターの結合能力が、固定化状態、並び
にリガンドに対するレセプターの親和力およびリガンド
およびリガンド類似体コンジュゲートが固定化レセプタ
ーに結合し得る間の時間に対するそれらの作用により大
きく異なることは明白である。非平衡状態に対するこれ
らの方法の信頼性が低いため、それらの検定手段の製造
は、予測不可能かつ再生困難なものとなる。この発明で
は、平衡方法を用いることにより、検定の反応を予測す
ることができるため、検定の展開は直接的であり、検定
の目標達成機能は再生可能である。
さらに、この発明は、定量的結果が得られるリガンド
の検定について単純化された方法に関するものである。
当技術分野の熟練者であれば、定量的検定が精密かつ正
確な結果に到達するための較正操作を必要とすることは
明白である。一般にきっ抗的検定は、結果的に非直線的
応答関数を与えるため、それらの検定の場合、検定範囲
全体におよぶ応答を測定するためには幾つかの較正点が
必要とされる。較正プロセスを簡易化するために、先行
技術において２つの方法が考案された。一つの方法は、
応答の測定に必要とされるキャリブレーターまたは複製
の数を減らすのではなく、上記較正の頻度を減らすこと
である。それらの検定では、器具に頼ることによりその
検定を遂行し、検定応答に影響を与える可変要素を制御
する。その結果、較正数は少なくなるか、または製造者
により遂行され、検定の使用者が行う必要は無くなる。
第２の方法は、器具を使用せず、かつ検定応答を較正す
るための追加試験の必要性が無くなるように簡易化され
た較正手段を提供することである。この発明は、器具に
基づく検定および視覚的に解釈される検定の両方での使
用が簡単な新規検量方法を提供する。
アメリカ合衆国特許第4540659号の方法は、較正表面
および測定表面での予め定められた応答割合がリガンド
の濃度に対応する、試料中のリガンドの定量検定法を提
供する。この方法は未熟な定量手段を提供し得るが、器
具を利用する既存方法の精密性または正確性を与えるわ
けでもなく、器具を使用しない定量法を提供するわけで
もない。
別の先行技術による方法である非きっ抗的免疫クロマ
トグラフィー検定は、アメリカ合衆国特許第4168146号
および同第4435504号に記載されている。この検定は、
視覚的に解釈される免疫検定法において試料中の単一ア
ナライトの存在を定量的に測定する方法を提供するが、
多数の装置を用いなければ多数のアナライトの検定を行
うことができない。さらに、実際上、この方法は、きっ
抗的検定技術により通常測定されるリガンドに比べて試
料濃度が高いリガンドに限定される。従って、このタイ
プの方法は用途が限定される。明らかに、試料中の多数
のリガンドの存在を測定し得ると同時に、各リガンドに
関して個別化された半定量的結果を提供し得るリガンド
−レセプター検定法がこれまでになく要望されている。
さらに、そのような検定法は、非専門的使用者でも正確
に遂行および解釈できる程度に簡単な形式で上記結果を
与えるべきである。さらに、遂行および解釈が容易な広
く適用され得る定量的検定法が要望されている。この発
明による検定法は、これらの必要条件を満たしている。
この発明は、リガンド濃度の半定量的または定量的測
定を可能にするためのきっ抗的リガンド−レセプター検
定方法に関するものである。この発明により、リガンド
濃度が内部特定濃度、すなわちいき値濃度に対応させて
測定される形で標的リガンドの検定が行なわれ得る。い
き値濃度は、興味の対象であるリガンドに適した濃度と
同等になるように任意に予備選択され得、そのリガンド
の検定用の較正点として機能する。この発明は、較正点
としていき値濃度を利用することにより、簡易化された
定量方法を可能にする定量的方法を提供する。さらに、
この発明は、多数のリガンドを同時測定するためのきっ
抗的リガンド−レセプター検定の遂行方法であって、各
測定において、その各リガンドを標的として具体的に定
められた内部いき値濃度が含まれる方法を提供する。こ
の発明の一態様は、多数のリガンドを同時測定するため
のきっ抗的リガンド−レセプター検定の遂行方法であっ
て、各測定が、その各リガンドを標的として具体的に定
められた内部いき値濃度のコンペンディウム（種々の濃
度を集めたセット）を含む方法である。この発明の方法
は、使用が簡単かつ素直に解釈される形で行なわれる濃
度測定法を提供する。
発明の概要 この発明は、３つの主要な要素および所望による追加
要素 １）反応相および混合物、 ２）反応混合物から選択された種類を除去するための所
望による手段、 ３）末端固相、および ４）シグナル発生相 を有するリガンド−レセプター検定に関するものであ
る。
反応相は、部分的に、標的リガンドのレセプターおよ
びリガンド類似体コンジュゲートを含む。リガンド類似
体コンジュゲートは、リガンド類似体またはシグナル発
生成分に結合したリガンド類似体を含む。リガンド類似
体コンジュゲートのリガンド類似体部分は、リガンドレ
セプター上に存在する限られた数の結合部位をめぐって
標的リガンドときっ抗することができる。反応混合物
は、試料並びにリガンド類似体コンジュゲートおよびリ
ガンドレセプターを含む反応相から形成される。反応混
合物が実質的に平衡結合状態に到達したとき、リガンド
がいき値未満の濃度で存在する場合、実質的に全てのリ
ガンド類似体コンジュゲートがリガンドレセプターに結
合しているように、リガンドレセプターおよびリガンド
類似体コンジュゲートの量を選択する。その後、反応混
合物をリガンド−レセプター検定の次の成分と接触させ
る。
この時点で、反応混合物を、反応混合物からリガンド
レセプターを除去するための所望による手段と接触させ
得るか、または直ちに末端固相と接触させ得る。所望に
よる手段が必要または望ましいか否かは、興味の対象で
あるアナライト、それらの濃度および選ばれた検定形式
を含む多様な因子により異なる。所望による手段は、例
えば、広げられる濃度範囲が非常に大きいため「フッ
ク」作用が可能であるリガンドの検定において有効に使
用され得る。この開示は、所望による手段を用いた具体
的な検定形式について記載している。他の適用法は、当
業界の熟練者であれば明白である。この明細書で使用さ
れている「所望による手段」という語は、リガンドレセ
プターに対して指向したレセプター、すなわち（リガン
ドレセプター）レセプターと機能し得るように結合され
得る（すなわち、これと複合体を形成し得る）装置また
は物質を包含する。すなわち、反応混合物が所望による
手段と接触するとき、（リガンドレセプター）レセプタ
ーは、リガンドレセプターと結合した全ての種類のもの
と結合する。反応混合物において、これは、リガンドレ
セプター、リガンド：リガンドレセプター複合体および
リガンド類似体コンジュゲート：リガンドレセプター複
合体を含む。別法として、所望による手段は反応相の一
部であり得るか、またはそれは平衡へ近付く間に反応混
合物に導入され得る。
次に、反応混合物を末端固相と接触させる。末端固相
は、有効なリガンドまたはリガンド類似体コンジュゲー
トを結合し得る非拡散的に固定化されたリガンドレセプ
ターを有する。次いで、反応混合物においてリガンドレ
セプターに結合しなかったリガンドおよびリガンド類似
体コンジュゲートの一部分は、末端固相固定化リガンド
レセプターに結合する。必要ならば、次に反応混合物の
残りは洗浄段階を用いて除去され得る。洗浄段階では、
末端固相に固定化されたリガンドレセプターに結合しな
かったリガンド類似体コンジュゲートが全て除去され
る。すなわち、末端固相に結合したリガンド類似体コン
ジュゲートのみが残される。
次いで、現時点でリガンド類似体コンジュゲート：リ
ガンドレセプター複合体を含む末端固相を、シグナル発
生相と接触させる。シグナル発生相は、固相に結合した
リガンド類似体コンジュゲートのシグナル発生成分によ
る検出可能なシグナルの発生を可能にする。検出可能な
シグナルの解釈は、検出可能なシグナルが存在しないと
いうことが、標的リガンドは試料中に存在しないか、ま
たは標的リガンドはいき値濃度未満の濃度で試料中に存
在することを示すといった方式で行なわれる。他方、検
出可能なシグナルは、いき値濃度と実質的に同等または
それより高い濃度での標的リガンドの存在の指標であ
る。この発明により、リガンド濃度が定量的に測定され
得る単純な較正方法が可能になった。
定義 請求の範囲を含むこの明細書を解釈する上で、次の語
は下記の意味を有するものとする。
リガンド−結合相手またはリガンドレセプター。
リガンド類似体−他の種類、例えばシグナル発生成分
に共有的または非共有的に結合し得る標的リガンドの化
学的誘導体。リガンド類似体およびリガンドは同一であ
り得、両方ともリガンドレセプターに結合し得る。
リガンドレセプター−リガンド、一般的には抗体を結
合し得るが、リガンドであり得るレセプター。
リガンド類似体コンジュゲート−リガンド類似体およ
びシグナル発生成分のコンジュゲート。
シグナル発生（development）成分−シグナル発生相
と共に、検出可能なシグナル、例えば酵素を発生するリ
ガンド類似体コンジュゲートの成分。
いき値濃度−第一の検出可能なシグナル発生をもたら
す試料中のリガンドの濃度。いき値濃度は濃度レファレ
ンス点である。
反応相−通常リガンド類似体コンジュゲート、例えば
ハプテン−酵素コンジュゲートおよびリガンドレセプタ
ー、例えば抗体を含む相。
反応混合物−標的アナライトおよび反応相を含む疑い
のある試料の混合物。
リガンド：リガンドレセプター複合体−リガンドがリ
ガンドレセプターにより結合したとき生じる複合体。
リガンド類似体コンジュゲート：リガンドレセプター
複合体−リガンド類似体コンジュゲートがリガンドレセ
プターにより結合したときに生じる複合体。
所望による手段−反応混合物の選ばれた成分と結合し
得るレセプター、例えば抗体と機能し得るように結合さ
れた所望による手段。
末端固相−シグナル発生段階中シグナルがその上で最
終的に発生される固相。
シグナル発生相−シグナル発生成分にシグナルを発生
させ得る物質を含む相、例えば酵素基質溶液。
リガンド補体−リガンド類似体コンジュゲート、レセ
プター、リガンド類似体構築物またはシグナル発生成分
の標識に使用される特殊化リガンド。
リガンド補体レセプター−リガンド補体のレセプタ
ー。
リガンド類似体−リガンド補体コンジュゲート−リガ
ンド類似体、リガンド補体およびシグナル発生成分によ
り構成されるコンジュゲート。
レファレンスリガンド−レファレンス濃度点の提供に
使用されるレファレンスリガンド・コンジュゲートの生
成に使用されるリガンド補体。
レファレンスレセプター−レファレンスリガンドと結
合し得るレセプター。
レファレンスリガンド・コンジュゲート−レファレン
スリガンドおよびシグナル発生成分から成るコンジュゲ
ート。
レファレンス濃度−レファレンス濃度は、レファレン
スリガンドコンジュゲートおよびレファレンスレセプタ
ーを用いて生成される。それをいき値濃度と共に使用す
ることにより、濃度の範囲を確定する。
陰性対照リガンド−陰性対照リガンドコンジュゲート
の生成に使用されるリガンド補体。陰性対照リガンドお
よび（陰性対照リガンド）レセプターは、検定結果の有
効性を保証する手段を提供する。
（陰性対照リガンド）レセプター−陰性対照リガンド
と結合し得るレセプター。
リガンド・レセプター・コンジュゲート−リガンドレ
セプターおよびシグナル発生成分のコンジュゲート。
リガンド類似体構築物−リガンドレセプターコンジュ
ゲートと結合したとき、リガンドレセプターコンジュゲ
ートが末端固相上に固定化されたリガンド類似体と結合
するのを防ぐように固相または別の分子に結合したリガ
ンド類似体。
図面の簡単な記載 第１図は、総リガンドの関数としての総非結合リガン
ドのフラクションを示すグラフである。このグラフは、
Ｋの値がＬおよびＲの値に応じて増加すると、総リガン
ド濃度の関数としての遊離リガンドのプロットの関数形
態が段階関数に近付くことを示す。
第２図は、リガンドレセプター濃度における変動の影
響を示すグラフである。このグラフは、Ｒの値が増加す
ると、階段の位置に対応するリガンド濃度も増加するこ
とを示す。
第３図は、平衡結合定数がリガンドレセプターへのリ
ガンドの結合およびリガンドレセプターへのリガンド類
似体コンジュゲートの結合に関して実質的に同等ではな
い、リガンド−レセプター検定に関する応答関数を示す
グラフである。レセプター結合部位の濃度は、1/Kの単
位で0.1である。
第４図は、リガンド濃度に対する遊離対結合リガンド
類似体コンジュゲート・フラクションの比率の関数とし
てプロットしたリガンド−レセプター検定の応答関数を
示すグラフである。このグラフは、Ｒの値が1/Kの値に
応じて増加すると、遊離対結合コンジュゲート・フラク
ションの比率が、いき値濃度より上のリガンド濃度の一
次関数に近付くことを示す。
第５図は、理論的に誘導された直線関数と比較した、
リガンド濃度に対する遊離対結合リガンド・フラクショ
ンの比率の関数としてプロットしたリガンド−レセプタ
ー検定に関する応答関数を示すグラフである。このグラ
フは、線の近似性がこれらの条件下での検定応答と非常
によく一致することを示す。
第６図は、リガンド濃度の関数として、遊離対結合リ
ガンド・フラクション比率応答曲線から理論的に誘導さ
れた濃度関数および理論的一次濃度関数間の差異を示す
グラフである。このグラフは、線の近似性により導入さ
れた誤差が、実質的に全検定範囲にわたって無視してよ
いほど小さいものとなり得ることを示す。
第７図は、いき値濃度を一括する濃度のモルヒネを含
む試料の検定から視覚的に解釈された検定結果を示すグ
ラフである。このグラフは、この検定がいき値濃度およ
びそれより高い濃度のモルヒネを確実に検出し得ること
を示す。
第８図は、試料中のモルヒネ濃度の関数として人間の
目で知覚され得る最小限の検出可能な色の差異の単位で
の検定応答を示すグラフである。このグラフは、検定応
答の色がいき値濃度で初めて認識でき（水平線として示
されている視覚検出限界）、検定応答が試料中のモルヒ
ネ濃度の関数として急速に増加することを示す。
発明の詳細な記載 この頃では、この発明のリガンド−レセプター検定の
前記４要素、すなわち、１）反応相および混合物、２）
反応混合物から選ばれた種類の物質を除去するための所
望による手段、３）末端固相、並びに４）シグナル発生
相について詳細に説明する。
反応相および混合物 反応相は、普通、リガンド類似体およびシグナル発生
成分のコンジュゲートから成るリガンド類似体コンジュ
ゲート並びにリガンドレセプターの両方を含む。この発
明の好ましい態様は、非拡散的固相上に固定化された反
応相におけるリガンドレセプターを用いる。この発明の
特に好ましい態様では、リガンドレセプターは非拡散的
固相上に固定化されていないため、自由に溶液に拡散す
る。
一般に、この発明の第一反応相試薬の製造方法では、
次の因子について熟慮することが必要である。リガンド
類似体とシグナル発生成分を結合させてリガンド類似体
コンジュゲートを製造する工程は、非結合リガンドに対
して指向したリガンドレセプターによる結合リガンド類
似体の認識を実質的に損なわせないように行なわれなけ
ればならない。シグナル発生成分に結合したリガンドの
数は、リガンドレセプター上の結合部位に関してリガン
ドときっ抗するリガンド類似体コンジュゲートの能力が
実質的に損なわれないことを保証する程度に充分でなけ
ればならない。同様に、シグナル発生成分に結合したリ
ガンド類似体の数は、リガンドレセプター上の結合部位
に関してリガンド類似体コンジュゲートときっ抗するリ
ガンドの能力を実質的に損なうほど多くてはならない。
この発明の場合、シグナル発生成分に結合したリガンド
類似体の数が１ないし50であるリガンド類似体コンジュ
ゲートが好ましい。この発明の場合、シグナル発生成分
にコンジュゲートしたリガンド類似体の数が１ないし10
であるリガンド類似体コンジュゲートが特に好ましい。
シグナル発生成分は、検出可能なシグナルを生じ得る
成分である。当業界の熟練者であれば、放射性核種、蛍
光性物質、燐光性物質、化学発光物質、染料、酵素、お
よび金属、半金属、非金属または上記物質のいずれかを
組み込み得るゾル粒子を含む（これらに限定されない）
多くの成分がシグナル発生成分として機能し得ることを
認めるはずである。この発明の場合に好ましいシグナル
発生成分は、非器具的手段により検出され得るシグナル
を発生するものである。特に好ましいシグナル発生成分
は、視覚的手段より検出され得るシグナルを発生するも
の、例えば酵素基質と反応し得る酵素であり、この場
合、酵素反応の生成物は、電磁気スペクトルの可視領域
において電磁気放射線を吸収する分子である。特に好ま
しいシグナル発生成分は、コロイド状金という着色され
たゾル粒子である。蛋白質をコロイド状金に吸着させる
方法は、ゲオルクヘーガン等、「ジャーナル・オブ・ヒ
ストケミストリー・アンド・サイトケミストリー」、2
5、1187−1200（1977）およびルーバリング、アメリカ
合衆国特許第4313734号に記載されている。同様に、結
合したリガンド類似体を伴う蛋白質はコロイド状金に吸
着されて、視覚的に解釈する検定で有用なリガンド類似
体コロイドを提供し得る。この発明の場合、特に好まし
いのは、直径10−80ナノメートルで、各粒子に結合した
リガンド類似体の数が10ないし10000であるコロイド状
金粒子である。
きっ抗的飽和リガンドレセプター検定において応答関
数曲線を制御する係数を理解することにより、リガンド
類似体コンジュゲートに対する補助試薬を提供するため
のリガンドレセプターの選択を行わなければならない。
これらの係数の幾つかは、R.P.エイキンス、G.B.ニュー
マンおよびJ.L.H.オリオーダン、「セオレティカル・ア
スペクツ・オブ・『サチュレーション』・アンド・ラデ
ィオイミュノアッセイ」、ラディオアイソトープス・イ
ン・メディシン：インビトロ・スタディーズ、R.L.ヘイ
ズ、F.A.ゴスウィッツおよびB.E.P.マーフィー編、ユー
・エス・アトミック・エナジー・コミッション・オーク
・リッジ・テネシー、59−100（1968）において検討さ
れており、それらを引用して説明の一部とする。（以
後、この明細書に引用されている参考文献は全て説明の
一部として組み入れる）。それらの係数の中でも特に重
要なのは、リガンドに関するリガンドレセプターの平衡
結合定数およびリガンドレセプターのかかる重合に関す
る平衡結合定数の分布を描く関数の幅である。免疫検定
におけるリガンドレセプターとしての使用に好ましいの
は抗体であり、リガンドレセプターとしての使用に特に
好ましい抗体はモノクローナル抗体である。モノクロー
ナル抗体の生成方法は、当業界の熟練者にはよく知られ
ている。モノクローナル抗体は、108M-1より大きい結合
定数により容易に生成され得、モノクローナル性である
が故に、単一セルラインから誘導され、特異的リガンド
に対して指向した抗体集合は、狭い分布の平衡結合定数
により生成され得る。
エイキンス等は、それらのリガンドレセプターの集合
から選ばれたリガンドレセプターによるリガンドの結合
を描く反応の一般的形態が、Ｌ＋Ri＝LRi （式中、Ｌはリガンドを表し、Riはｉ番目のリガンドレ
セプター類の結合部位を表し、ｉ＝１、２、３、...nで
ある） という式により表され得ることを示した。平衡結合を描
く式は、 Ki［Ｌ］［Ri］＝［LRi］ として示される。式中、Kiは、RiがＬと結合する反応を
描く平衡結合定数である。Riが全て等しい平衡結合定数
を有する最も単純な例の場合、この式の閉じた解を得る
ことにより、一定量のレセプターに関するリガンドの総
量に対する非結合リガンドの割合を述べることができ
る。リガンドレセプターへのリガンドの結合およびリガ
ンドレセプターへのリガンド類似体コンジュゲートの結
合に関する平衡結合定数Ｋが実質的に等しい場合、この
状況は特に興味深い。Riが全て等しい最も単純な例に関
する閉じた形態の解は、エイキンスにより （Ff/b）2＋Ff/b（１−L/R−1/KR）−1/KR＝０ （式中、Ff/bは遊離対結合リガンドの割合であり、Ｌは
リガンドの総濃度であり、Ｒはリガンドレセプター結合
部位の総濃度であり、Ｋは平衡結合定数である） として与えられる。従って、この発明は、1/Kの値に応
じてＲの値が増加すると、総リガンド濃度の関数として
の遊離リガンドのプロットの関数形態が第１図に示され
ている通り階段関数の形態に近付くことを示す。さら
に、この発明は、階段での曲率が平衡結合定数Ｋおよび
総リガンドレセプター結合部位濃度Ｒ間の関係に対応す
ることを示す。第１図において、プロットされた関数
は、総リガンドの関数として遊離（非結合）状態の総リ
ガンドのフラクションである。1/Kに応じてＲが増加す
ると、第１図から明らかな通り、遊離リガンドフラクシ
ョンにおいてさらに劇的な階段の増加が生じる。通常の
例では、平衡定数Ｋが増加しているリガンドレセプター
を選ぶことにより、遊離リガンドフラクションにおける
劇的な段階的増加が達成される。遊離リガンド・フラク
ションおよび遊離対結合リガンドの割合の間の関係 Ff/bは、式Lf/L＝Ff/b／（Ff/b＋１） により与えられる。
この発明はこれらの関係を利用しており、さらにＲが
1/Kよりも充分に大きい場合、階段の濃度位置はＲの相
対値の関数であることを示すことにより、この概念を広
げている。第２図で示されている通り、Ｒの値が増加す
ると、階段の位置に対応する濃度も増加する。
リガンドレセプター検定においてこれらの関係を利用
するために、リガンド類似体コンジュゲートおよびリガ
ンドレセプターは、反応混合物中の試料との接触時およ
び平衡結合が実質的に達成された後、試料中リガンドの
非存在下で、実質的に全てのリガンド類似体コンジュゲ
ートがリガンドレセプターにより結合されている形で供
給されなければならない。当業界の熟練者には、実質的
に全てのリガンド類似体コンジュゲートを結合するのに
必要とされる数を越える結合部位が反応混合物中に供給
されるようにリガンドレセプターの量を選択できること
は明白である。試料中のリガンドの量が過剰結合部位の
量を越える場合、リガンドおよびリガンド類似体コンジ
ュゲートは、利用可能なリガンドレセプター結合部位に
関してきっ抗し始める。実質的平衡結合状態で反応混合
物において非結合リガンド類似体コンジュゲートの量の
最初の検出可能な増加をもたらす試料中のリガンドの濃
度が、いき値濃度である。第２図で示されている通り、
反応混合物中におけるリガンドレセプターの濃度を適当
に選ぶことにより、いき値濃度が選択され得る。リガン
ドがそのいき値濃度を越えるまでは一切応答が観察され
ないように検定応答の可視生成物を容易に制御できるた
め、視覚検定に対するこの方法の適用は特に重要であ
る。第１図から明らかな通り、平衡結合定数およびいき
値濃度に対するその関係により、非結合リガンド類似体
コンジュゲートの増加割合およびリガンドがいき値濃度
より低い濃度で存在する場合の非結合リガンド類似体コ
ンジュゲートのフラクションが測定される。平衡結合定
数は、非結合リガンド類似体コンジュゲートによる応答
を、他の雑音供給源により与えられる検定の応答雑音よ
り下に減少させるのに充分なものとすべきである。当業
界の熟練者であれば、リガンド類似体コンジュゲート、
シグナル発生相および検定方法が組み合わさって検定の
応答雑音を決定することは理解できるはずである。この
発明におけるリガンドレセプターとしての使用に好まし
いのは、平衡結合定数が102×（いき値濃度）-1より大
きいリガンドレセプターであり、用いるのに特に好まし
いのは結合定数が103×（いき値濃度）-1を越えるリガ
ンドレセプターである。
この発明により記載されている検定応答は、先行技術
により達成されなかった。先行技術は、感度を最大にす
るために、リガンドの非存在下でのリガンド類似体コン
ジュゲートの遊離フラクションが、検定における総リガ
ンド類似体コンジュゲートの重大なフラクションである
べきことを教えている。この発明では、リガンドの非存
在下またはリガンド濃度がいき値濃度未満の場合に、実
質的に全てのリガンド類似体コンジュゲートが結合して
いる。
さらに、この発明は、リガンドレセプターへのリガン
ドの結合およびリガンドレセプターへのリガンド類似体
コンジュゲートの結合に関する平衡結合定数が実質的に
等しくないリガンド−レセプター検定の例に関するもの
である。特に、この発明は、リガンドに関するリガンド
レセプターの平衡結合定数の大きさと比較したリガンド
類似体コンジュゲートに関するリガンドレセプターの平
衡結合定数の大きさにより、いき値濃度の上の応答関数
の傾きが測定されることを示す。これらの結合定数が実
質的に等しい場合、第１図に描かれた応答関数は検定応
答を示す。結合定数が実質的に等しくない場合、応答関
数は第３図で示された通りに変化する。リガンド類似体
コンジュゲートに関するリガンドレセプターの平衡結合
定数の大きさ（Ｋ＊）が、リガンドに関するリガンドレ
セプターの平衡結合定数の大きさより大きい場合、所定
の濃度のリガンド類似体コンジュゲートと有効にきっ抗
するためさらにリガンドが必要とされることから、応答
関数の傾きは低下する。同様に、リガンド類似体コンジ
ュゲートへの結合に関するリガンドレセプターの平衡結
合定数の大きさが、リガンドへの結合に関する平衡結合
定数より少ない場合、所定濃度のリガンド類似体コンジ
ュゲートとのきっ抗に必要とされるリガンドが少なくな
るため、応答関数の傾きはそれに応じて増加する。
従って、リガンド類似体コンジュゲートに関するリガ
ンドレセプターの平衡結合定数の大きさを変えることに
より、応答関数の傾きを変更することができる。１シグ
ナル発生成分当たりのリガンド類似体の数を変えること
により、この変更は実際上最も容易に達成される。リガ
ンド類似体対シグナル発生成分の比率が高いコンジュゲ
ートの場合、リガンドレセプターとの結合に関する平衡
結合定数の大きさがさらに大きくなり、リガンドにより
あまり誘導体化されていないコンジュゲートに対応して
傾きが少ない応答関数を有する。様々な手段でリガンド
類似体をシグナル発生成分に結合させることにより、リ
ガンドレセプターに関するそれらの平衡結合定数を変え
ることができる。それによって、リガンドレセプターに
関するリガンドの場合よりも平衡結合定数の大きさがが
大きいかまたは小さいリガンド類似体を設計することが
できる。応答関数の傾きを経験的に調節する能力は、検
定を最適化するのに有益である。
例えば、この発明によるいき値免疫検定（この明細書
に記載されている）の好ましい実施方法では、標的リガ
ンドを含み得る試料が加えられる反応相中において可溶
性抗体およびリガンド類似体コンジュゲートを使用す
る。この混合物を実質的に平衡結合状態に到達させる。
標的リガンドが存在しない場合、実質的に全てのリガン
ド類似体コンジュゲートは抗体に結合するため、末端固
相上に固定化された抗体への結合には関与できない。
反応相は多くの方法で提供され得る。それ未満ではシ
グナルが全くまたは殆ど発生されない標的リガンドのい
き値濃度を予め確立するためには、正確な相対および絶
対量のリガンド類似体コンジュゲートおよび抗体を供給
しなければならない。一方法では、一定試料容量を一定
量のリガンド類似体コンジュゲートと混合し、この混合
物を一定量の抗体に加え、この最終混合物を実質的に平
衡結合状態に到達させる。第二の方法では、一定試料容
量を一定抗体容量に加え、次いで一定量のリガンド類似
体コンジュゲートを加える。第三の方法では、試料をリ
ガンド類似体コンジュゲートおよび抗体から成る混合物
に加える。試料からのリガンドを加える前に抗体および
リガンド類似体コンジュゲートを反応させた場合、リガ
ンド類似体コンジュゲート：抗体複合体の解離は、平衡
結合状態への接近を支配する律速段階になる。大きなリ
ガンド類似体コンジュゲートの場合、これは、ほとんど
の適用に関して許容しがたいほど長い期間であることが
判明し得る。
実際上一考を要する問題は、抗体およびリガンド類似
体コンジュゲート試薬の費用である。いき値濃度が１μ
Ｍまたはそれより大が望ましいリガンドの場合、試薬の
費用はかなり高くなり得ることから、費用効率のよい検
定キットを製造するには試薬容量を小さくすべきであ
る。この問題と取り組むために、抗体およびリガンド類
似体コンジュゲート試薬の好ましい供給方法では、それ
らを互いに反応させずにそれらを一緒に凍結乾燥する。
上記方法は、正確な容量の第一試薬をガラス瓶に加え、
それを冷凍し、次に、第一試薬の溶解を回避することに
より２つの試薬を混合させ得るため急速冷凍しながら正
確な容量の第二試薬をガラス瓶に加えることにより達成
され得る。次いで、２つの冷凍試薬を凍結乾燥する。別
法として、抗体およびリガンド類似体コンジュゲート試
薬は、バルク状で別々に凍結乾燥され、適当な量での乾
燥製剤として一緒に混合され得る。
したがって、この発明は、検定応答関数曲線における
階段関数様要素を含むと同時に、具体的に選択されたリ
ガンド濃度、すなわちいき値濃度と階段の位置を関連付
ける機構を提供するリガンドレセプター検定方法を提供
する。このいき値濃度は、リガンド類似体コンジュゲー
トおよびリガンドレセプターの濃度の相対値を調節する
ことにより選択され得る。
さらにこの発明は、簡易化された定量的検定方法に関
するものである。エイキンス等は、遊離対結合リガンド
の割合がリガンド濃度の双曲線関数であること、および
遊離対結合リガンドの割合が大きくなると、それは漸近
的に一次関数に近付くことを示している。検定を構築す
る場合、リガンドの状態の鏡映として実際に測定される
のはリガンド類似体コンジュゲートである。この発明の
原理を用いて検定を構築する場合、遊離対結合リガンド
類似体コンジュゲートの割合は、実質的に検定範囲全体
に及ぶリガンド濃度の一次関数である。線の傾きおよび
軸の切片は、所定の試薬セットに関する検定システムの
一定したパラメータである。第４図は、総リガンド濃度
の関数として遊離対結合リガンド類似体コンジュゲート
の割合の理論的プロットを描いており、この場合、リガ
ンドに対するレセプターの親和力はレセプター濃度の逆
数よりも大きい。リガンドおよびリガンド類似体コンジ
ュゲートに関するレセプターの親和力が等しい場合、こ
れらのプロットは、リガンドおよびリガンド類似体コン
ジュゲートに関して同じである。第３図が示す通り、リ
ガンドに対するレセプターの親和力よりもリガンド類似
体コンジュゲートに関するレセプターの親和力の方が検
定応答の傾きに影響を与える。これは、遊離対結合リガ
ンド類似体コンジュゲートの割合として表される場合に
応答についても当てはまる。ここに記載されている例の
場合、リガンドおよびリガンド類似体コンジュゲートに
対するレセプターの親和力は等しい。リガンド類似体コ
ンジュゲートに対する親和力対レセプター濃度の逆数の
比率が1000に近付くと、遊離対結合リガンド類似体コン
ジュゲートの比率は、全検定範囲にわたるリガンド濃度
の一次関数に近付く。遊離対結合リガンド類似体コンジ
ュゲートの比率をリガンド濃度の関数としてプロットす
ると、第４図のようなプロットが得られる。第５図で
は、遊離対結合リガンド類似体コンジュゲートの理論的
比率および高い比率のみを用いて同じ理論的データから
得られた一次回帰を比較する。第５図で示す通りリガン
ド類似体コンジュゲートに対するレセプターの親和力が
レセプター濃度の逆数より約1000倍大きい場合、遊離対
結合リガンド類似体コンジュゲートの割合は、実質的に
検定範囲全体にわたってリガンド濃度の一次関数であ
る。この発明の線近似性を用いてリガンド濃度の測定時
に導入された誤差は、理論的応答から予測され、線近似
性により測定されたリガンド濃度の誤差をとり、第６図
で示す通り、リガンド濃度のパーセンテージとして誤差
を表すことにより評価され得る。リガンド類似体コンジ
ュゲートに対するレセプターの親和力が充分に高い場
合、線近似性から評価されたリガンド濃度における誤差
は、検定の他の局面により導入された典型的誤差と比べ
て問題にならないほど小さくなる。
関数が厳密に線形である場合リガンド濃度の範囲に存
するキャリブレーターを用いて検定を行うことにより、
所定の試薬セットについて一次関数の傾きおよび切片が
測定され得る。傾きおよび切片は検定システムの一定パ
ラメーターであるため、それらの値は例えば製造者が一
度測定するだけでよい。リガンド濃度の関数として検定
応答を測定するために、遊離対結合リガンド類似体コン
ジュゲートの割合を検定応答に対応させなければならな
い。これは、単一較正点により達成され得る。当業界の
熟練者には、検定応答が、遊離リガンド類似体コンジュ
ゲート濃度に直接比例するようにシグナル発生成分が使
用され得ることは当然である。次に、キャリブレーター
に関する遊離対結合リガンド類似体コンジュゲートの比
率は、 （この式で、リガンド類似体コンジュゲートの全部が遊
離であるとき、最大応答は検定応答である）により与え
られる。キャリブレーターに関する遊離対結合リガンド
類似体コンジュゲートの比率は既知定数であるため、キ
ャリブレーター応答が上式による最大応答を定める。次
いで、この最大応答を用いて、 により与えられる未知応答に関する遊離対結合リガンド
類似体コンジュゲートの比率を計算する。この比率およ
び一次関数は、試料中の未知のリガンド濃度を決定す
る。すなわち、この発明が教える原理を用いてきっ抗的
検定を行う場合、単一キャリブレーターを用いて試料を
定量的に検定することができる。
反応混合物からリガンドレセプターを除去するための所
望による手段。
反応混合物中のリガンド類似体コンジュゲート：リガ
ンドレセプター複合体が末端固相と接触するのを阻止す
ることが必要または望ましい場合は常に、反応混合物か
らリガンドレセプターを除去するための所望による手段
が含まれ得る。例えば、反応混合物中のリガンド類似体
コンジュゲート：リガンドレセプター複合体が、末端固
相とのインキュベーション中かなりの程度まで解離する
場合、末端固相固定化リガンドレセプターが解離したリ
ガンド類似体コンジュゲートを結合し、標的リガンドの
非存在下でも検出可能なシグナルを生じさせ得るような
形で、上記の所望による手段が必要とされる。反応混合
物からリガンドレセプターを除去するための所望による
手段は、反応混合物を末端固相と接触させる前にリガン
ドレセプターを反応混合物から除去する形でリガンドレ
セプターを結合する装置であればいかなる手段でもよ
い。例えば、上記の所望による手段は、（リガンドレセ
プター）レセプターおよびこれらの（リガンドレセプタ
ー）レセプターの固定用固相支持体により構成され得
る。この場合、所望による手段の固相支持体に固定化さ
れた（リガンドレセプター）レセプターへの反応混合物
リガンドレセプターの結合を通して、リガンドレセプタ
ーおよびリガンドレセプター会合複合体は、末端固相に
結合したリガンドレセプターと接触するのを阻止され
る。所望によるリガンドレセプター除去手段の構築に有
用であり得るレセプターおよび固相の例には、抗−抗体
抗体として、例えばやぎ抗マウスIgGまたはやぎ抗マウ
スFc、レセプターとして、例えばプロテインＡおよびプ
ロテインＧ、並びに固相として、例えば拡散性ビーズ、
マクロ多孔質アガロース・ビーズ、膜、フィルターおよ
び多孔質マトリックスがある。別法として、固相上に固
定化されたリガンド補体レセプターを用いることによ
り、反応混合物からリガンド補体で標識したリガンドレ
セプターを除去することができ、例えば、ビオチンによ
り標識したリガンドレセプターは、固相上に固定化され
たアビジンにより結合され得る。リガンドレセプターは
また、（リガンドレセプター）レセプターを用いること
により、反応混合物から沈澱し得る。ビーズを固相とし
て使用する場合、リガンドレセプターのレセプターは通
常ビーズ上に固定化されており、これらのビーズは、反
応混合物のインキュベーション中または反応混合物が実
質的に平衡結合状態に到達した後、反応相の一部として
反応混合物に加えられ得る。末端固相との接触前に反応
混合物からビーズを除去するため、遠心分離またはろ過
が必要とされ得る。膜およびフィルターを含む多孔質マ
トリックスを末端固相として使用する場合、反応混合物
は多孔質マトリックス内に含まれ得るか、または反応混
合物は、平衡結合状態に実質的に到達した後、多孔質マ
トリックス中に導入され得る。いずれにしても、多孔質
マトリックスは、末端固相との接触前にリガンドレセプ
ターおよびそれらの複合体を除去すべく機能する。
末端固相 末端固相は、標的リガンドおよびリガンド類似体コン
ジュゲートに対する局在化したリガンドレセプターを有
する固体支持体である。この発明の末端固体は、標的リ
ガンドおよびリガンド類似体コンジュゲートの両方を結
合し得る別々の位置にリガンドレセプターが局在化して
いる固体支持体であり得る。この発明の明細書におい
て、「局在化した」という語は、リガンド−レセプター
検定プロセスの実施中、実質的に全てのレセプターを予
め定められた位置に残存させる形でレセプターを固定化
する全ての物理的機構を包含する。それらの機構として
は、共有結合、非共有結合、化学的結合（カップリン
グ）、レセプターと機能し得るように会合した粒子の物
理的包括および疎水性／疎水性または親水性／親水性相
互作用による吸着がある。この発明の固相の固体支持体
上へのリガンドレセプターの局在化は、幾つかの方法に
より達成され得る。多孔質マトリックス固体支持体によ
るリガンドレセプター被覆粒子の包括技術により、リガ
ンドレセプターを局在化させ得る。多孔質マトリックス
への前記粒子の導入方法は、アメリカ合衆国特許第4446
232号、同第4740468号およびヨーロッパ特許出願863025
21.9に記載されている（これらを引用して説明の一部と
する）。固体支持体が多孔質マトリックスである場合、
固体支持体上へのリガンドレセプターの特に好ましい局
在化方法は、部分的に、共有または非共有化学的結合に
よる固体支持体上のリガンドレセプターの局在化を含
む。固体支持体へのリガンドレセプター結合技術は、当
業界ではよく知られている。この発明では、多孔質マト
リックス、非多孔質マトリックス、ビーズ、膜またはフ
ィルターを含む様々な固体支持体が使用され得る。それ
らの固体支持体は、計量棒並びに例えばアメリカ合衆国
特許第4200690号、同第4246339号、同第4366241号、同
第4632901号および同第4727019号に記載された装置を含
む様々な試験装置に組み込まれ得る。特に好ましい固相
は、反応混合物が膜と接触したとき、膜の全表面領域お
よび全レファレンス・ゾーンが反応混合物と接触するよ
うに、反応混合物が、暴露された膜の空隙（ボイドボリ
ューム）を完全に満たすのに充分なだけの容量を有する
形で装置に設置された膜である。上記装置はまた、必要
ならば、膜から非結合コンジュゲートを除去する手段お
よび膜上に固定されたレセプターに結合したコンジュゲ
ートとシグナル発生相を接触させる手段を組み込む。
明らかに、それらの装置を用いてこの発明の方法を使
用すると、各アナライトに関していき値免疫検定結果を
提供する単一試験装置を用いて単一試料から多数のアナ
ライトについて検定することができる。多重同時リガン
ド検定形式では、測定される各リガンドについて、前記
リガンドレセプターが局在化している少なくとも１つの
別々の反応ゾーンを含む固体支持体が使用され得る。さ
らに、別々の反応ゾーンにおける内部陰性対照、陽性レ
ファレンスおよびキャリブレーターの組み込みが、検定
結果により与えられた情報に加わる。
さらに、興味の対象である複数のリガンドの存在の同
時測定、例えば毒物学的応答の誘因の測定が非常に望ま
しい場合、上述の好ましい末端固相は特に有用である。
これは、支持体マトリックスの独立ゾーン内にリガンド
レセプターを結合させることにより容易に達成され得
る。上記固相システムは、本質的に、患者流体試料中に
存在し得る毒素についてスクリーニングし得る一群のリ
ガンドレセプターを提供する。従って、固相システム上
の反応性のパターンは、結合毒素類似体コンジュゲート
の存在により測定される通り、毒物学的応答を発する毒
素の性質の指標を提供する。
従って、この発明の実施態様の一つでは、部分的にリ
ガンド、リガンド類似体コンジュゲート、リガンドレセ
プター、リガンド：リガンドレセプター複合体およびリ
ガンド類似体コンジュゲート：リガンドレセプター複合
体を含み得る反応混合物を、上部にリガンドレセプター
を固定化させた末端固相と接触させる。好ましい実施態
様では、末端固相は、上部にレセプターを固定化させた
非拡散性ビーズ、膜またはフィルターにより構成され
る。特に好ましい実施態様では、末端固相は、上部にリ
ガンドレセプターを固定化させた多孔質マトリックスに
より構成される。リガンドレセプターは、直接共有化学
結合、間接共有化学結合、直接非共有化学結合、間接非
共通化学結合および物理的包括を含む（これらに限定さ
れない）様々な方法により固定化され得る。好ましい態
様では、末端固相上に固定化されたリガンドレセプター
は、リガンド類似体コンジュゲートを結合し得る。さら
に、免疫検定へのこの発明の適用に関する好ましい態様
では、リガンドレセプターは抗体である。特に好ましい
態様では、末端固相上に固定化されたリガンドレセプタ
ーは、最初に試料と接触する上記反応相に含まれるリガ
ンドレセプターと同じである。免疫検定へのこの発明の
適用に関する別の特に好ましい態様では、リガンドレセ
プターはモノクローナル抗体である。
シグナル発生相 シグナル発生相は、シグナル発生成分に検出可能なシ
グナルを発生させ得る相である。シグナル発生相の成分
は、下記検定成分、反応相、所望による手段、末端固相
およびシグナル発生相のいずれかまたは全てに存在し得
る。シグナル発生相の成分としての使用に好ましいの
は、非器具的手段により検出され得るシグナルをシグナ
ル発生相から発生させ得る物質である。シグナル発生相
における成分としての使用に特に好ましいのは、視覚的
手段により検出可能なシグナルをシグナル発生成分から
発生させ得る物質である。当業界の熟練者であれば、様
々な物質を用いてこの目標を達成し得ることは当然であ
る。前記物質の例としては、酵素基質溶液、例えば、結
合酵素を含む末端固相と接触したとき、酵素、例えば牛
腸アルカリ性ホスファターゼ（E.C.3.1.3.1.）により可
視的な青く着色した反応生成物、インディゴに変換され
る３−インドキシルホスフェートがある。シグナル発生
相の別の例には、アメリカ合衆国特許第4391904号に記
載された末端固相と組み合わせて使用する場合、アメリ
カ合衆国特許第4233402号に記載されたチャンネリング
方法がある。それらの方法は、実質的に洗浄機構により
非結合コンジュゲートを除去する必要性を排除してい
る。それらは、この発明のシグナル発生相として好まし
い。ゾル粒子、例えばコロイド状金をシグナル発生成分
として使用する場合、検定シグナルを露呈させるには一
般に末端固相を単に洗浄すれば充分であるため、シグナ
ル発生相は不要である。
リガンド−レセプター検定方法 この発明のリガンド−レセプター検定を始めるため
に、標的リガンドを含む疑いのある流体試料を、リガン
ド類似体コンジュゲートおよびリガンドレセプターの反
応相に導入する。リガンドレセプター上における限られ
た数の利用可能な結合部位に関して、リガンド類似体コ
ンジュゲートおよび標的リガンドの間できっ抗が起き
る。リガンド類似体コンジュゲートおよびリガンドレセ
プターは、標的リガンドの非存在下、実質的平衡結合状
態に達した後、リガンド類似体コンジュゲートにおける
実質的に全ての利用可能なリガンド類似体が結合するよ
うな相対量で存在する。当技術分野に精通しておれば、
一定量のリガンド類似体コンジュゲートおよびリガンド
レセプターについて、試料の容積を変えることによりい
き値濃度が変化し得ることは当然である。リガンド類似
体コンジュゲート上のリガンド類似体の有効濃度および
標的リガンド濃度の合計が、利用可能なリガンドレセプ
ター結合部位の濃度を越え始めなければ、顕著な量の非
結合リガンド類似体コンジュゲートは存在しない。この
明細書で使用されている「非結合」という語は、リガン
ドレセプターに結合し得る少なくとも１つの利用可能な
リガンド類似体を有するコンジュゲートを意味する。リ
ガンド類似体コンジュゲートは、複数のリガンド類似体
を有し得、それに結合したリガンドレセプターを有し得
るが、それにも拘わらず、それがリガンドレセプターに
結合し得る少なくとも１個の利用可能な追加的リガンド
類似体を有する場合、それは「非結合」と表現され得
る。「結合」リガンド類似体コンジュゲートは、結合に
利用され得るリガンド類似体を一切もたないものであ
る。リガンド類似体コンジュゲートの有効濃度は、単一
コンジュゲート分子に結合され得る抗体結合部位の数に
より異なることを理解すべきである。従って、多くのリ
ガンド類似体を含む多量に誘導体化されたコンジュゲー
トは、それほど誘導体化されていないコンジュゲートよ
りも高いリガンド類似体濃度を有する。結果的に基底値
雑音より上の検出可能な検定応答を生じさせる非結合リ
ガンド類似体コンジュゲートにおける最初の顕著な増加
をもたらすリガンド濃度は、いき値濃度である。当業界
に精通しておれば、検定の基底値雑音が、検定方法並び
にリガンド類似体コンジュゲートおよびシグナル発生相
の性質により異なることは当然である。基底値雑音は、
最大応答の１％未満であることが一般に望ましい。リガ
ンドの量がいき値濃度を越えて増加すると、リガンドレ
セプターに結合していないリガンド類似体コンジュゲー
トの量もまた増加する。実質的に全てのリガンド類似体
コンジュゲートがリガンドレセプターに結合していない
状態で存在するような値に標的リガンドの量が増加する
まで、リガンド類似体コンジュゲート上の非結合リガン
ド類似体の量は増加し続ける。
この発明の好ましい状態では、反応相中のリガンドレ
セプターは非拡散的に固定されているため、リガンドお
よびリガンド類似体コンジュゲート間で行なわれるリガ
ンドレセプター結合部位に関するきっ抗反応中に拡散運
動を行い得る。特に好ましい状態において、標的リガン
ドおよびリガンド類似体コンジュゲートは、拡散性リガ
ンドレセプター上の結合部位に関するきっ抗に参加す
る。この発明は、特に好ましい態様において、リガンド
レセプターが溶液中で自由に拡散するモノクローナル抗
体である免疫検定方法を提供する。反応混合物は、部分
的にリガンド、リガンド類似体コンジュゲート、リガン
ドレセプター、リガンド：リガンドレセプター複合体お
よびリガンド類似体コンジュゲート：リガンドレセプタ
ー複合体を含む。きっ抗反応に続いて、この反応混合物
を、（リガンドレセプター）レセプターと機能し得るよ
うに結合された所望による手段と接触させる。所望によ
る手段に結合した（リガンドレセプター）レセプター
は、リガンドレセプターと結合したあらゆる種類のもの
に結合する。従って、所望による手段に結合した（リガ
ンドレセプター）レセプターは、反応混合物からのリガ
ンドレセプター、リガンド：リガンドレセプター複合体
およびリガンド類似体コンジュゲート：リガンドレセプ
ター複合体に結合し得る。所望による手段により反応混
合物からリガンドレセプター結合成分を除去すると、非
結合リガンド類似体コンジュゲートのみが末端固相固定
化リガンドレセプターにより接触され得る。すなわち、
所望による手段を用いて反応混合物からリガンドレセプ
ターおよびリガンドレセプターに結合した部分を除去す
る場合、反応混合物中の非結合リガンド類似体コンジュ
ゲートは、リガンドレセプターに結合していないリガン
ド類似体コンジュゲートを指す。反応混合物からレセプ
ターを除去するための所望による手段を用いた検定方法
により一つのリガンドのみが測定されている場合、反応
混合物中の遊離リガンド類似体コンジュゲートによるシ
グナルは末端固相を必要としないで直接測定され得る。
次いで、反応混合物を、リガンドレセプターが固定化
されている末端固相と接触させる。従って、この発明
は、リガンドレセプターが固相に固定化されている方法
を提供する。レセプター固定化における使用に好ましい
固相としては、拡散性ビーズ、膜およびフィルターがあ
る。レセプター固定化用の固相としての使用に特に好ま
しいのは、多孔質マトリックスである。末端固相上に固
定化されたリガンドレセプターは、部分的に非結合リガ
ンドおよび非結合リガンド類似体コンジュゲートにより
構成される反応混合物の成分と接触する。反応混合物が
所望による手段と接触しなかった場合、反応混合物はま
た、非複合体化リガンドレセプター、リガンド：リガン
ドレセプター複合体およびリガンド類似体コンジュゲー
ト：リガンドレセプター複合体を含み得る。反応混合物
が所望による手段と接触しなかった場合、反応混合物か
らのリガンドレセプターが既にリガンド類似体コンジュ
ゲート上の幾つかのリガンド類似体に結合し得るとして
も、非結合リガンド類似体コンジュゲートは、末端固相
上の固定化リガンドレセプターに結合し得るリガンド類
似体コンジュゲートを指す。末端固相上に固定化された
リガンドレセプター上の利用可能な結合部位に関して、
非結合リガンドおよび非結合リガンド類似体コンジュゲ
ート間できっ抗が行なわれる。結合反応を続行させた
後、末端固相および反応混合物は分離され得る。末端固
相上に固定化されたリガンドレセプターに結合しなかっ
たリガンド類似体コンジュゲートがあれば分離段階によ
り必要ならば除去する。末端固相上に固定化されたリガ
ンドレセプターと複合体を形成したリガンド類似体コン
ジュゲートを、複合体化したリガンド類似体コンジュゲ
ートのシグナル発生成分に検出可能なシグナルを発生さ
せ得るシグナル発生相と接触させる。検定基底値雑音を
越える検出可能なシグナルが存在しない場合は、試料
中、標的リガンドがいき値濃度よりも低い濃度であるこ
とを示し、検定基底値雑音を越える検出可能なシグナル
が存在する場合、標的リガンドがいき値濃度と実質的に
同等またはそれより高い濃度で存在することを示すとい
った方式でシグナルを解釈する。
陰性対照リガンド 末端固相との接触前にこの発明の反応混合物を実質的
に平衡に到達させるべきである。そうすると、いき値未
満の濃度で標的リガンドが存在する場合、リガンド類似
体コンジュゲートは、反応混合物中において実質的に完
全にリガンドレセプターにより結合しており、末端固相
上に固定化されたリガンドレセプターには結合し得な
い。反応混合物が正確に平衡状態に到達し、後続の検定
結果が有効であることを測定するため、この発明の好ま
しい実践方法には、陰性対照リガンドコンジュゲートが
含まれる。陰性対照リガンドは、通常試料からは見出さ
れないリガンドである。検定が正確に遂行されたとき、
反応混合物は、実質的に全ての陰性対照リガンドコンジ
ュゲートが反応混合物中で（陰性対照リガンド）レセプ
ターにより結合されている平衡結合状態に実質的に到達
しているため、応答が末端固相上の（陰性対照リガン
ド）レセプター位置において観察されないように、陰性
対照リガンド・コンジュゲート、リガンド類似体コンジ
ュゲート、リガンドレセプターおよび（陰性対照リガン
ド）レセプターの組み合わせは提供される。反応混合物
を実質的に平衡状態に到達させる時間が不充分な場合ま
たはシグナル発生相が不正確に遂行された場合、いき値
よりも高い濃度での標的リガンドの存在を誤って示す応
答がリガンド特異的試験位置において観察され得る。こ
れらの環境下において、陰性対照位置はまた、観察可能
な応答を呈し、試験が無効であることを示す。上記陰性
対照は、検定プロトコルが正確に遂行されたという確証
を提供し、陰性結果があればそれらの有効性を確認す
る。当業界に精通しておれば、陰性対照リガンドコンジ
ュゲートおよび陰性対照リガンドレセプターの相対およ
び絶対濃度を調節することにより、平衡結合状態への実
質的到達に必要とされるインキュベーション時間を制御
することができることは明白である。平衡状態への到達
時間は、検定における最も遅いリガンド−レセプター対
の場合に必要とされる平衡到達時間と等しくなるよう調
節され得る。陰性対照リガンドとして有用なリガンド
は、興味の対照である試料中には通常存在しないが、リ
ガンドに関して適当な親和力を呈するリガンド補体レセ
プターおよびリガンド補体コンジュゲートの生成に使用
され得る同じ総合的種類のリガンド（すなわち、リガン
ド補体）から選択され得る。それらのリガンドには例え
ばフルオレセインがある。
確実に反応混合物が末端固相上の全反応ゾーンと接触
するように、この発明の好ましい実践方法では、反応混
合物中に陽性対照リガンドコンジュゲートを含ませる。
陰性対照リガンドレセプターを末端固相上の別々のゾー
ンに固定化することにより、反応混合物が末端固相と接
触したとき、陰性対照リガンドコンジュゲートがその各
レセプターに結合し、その結果、検出可能なシグナルが
末端固相上の陽性対照ゾーンで発生する。陽性対照ゾー
ンが反応混合物と接触した場合、末端固相上の他の独立
レセプター・ゾーンの全部が反応混合物と接触しなけれ
ばならないように、末端固相上の陽性対照ゾーンの位置
および形状を選択することができる。例えば、反応混合
物が矩形ストリップの一端部で末端固相と接触している
場合、陽性対照ゾーンはストリップの他端に設けられ
得、このストリップにおいて独立反応ゾーンは全てその
２端間に存在している。さらに、陽性対照ゾーンにおけ
る検出可能な結果は、反応混合物中の遊離コンジュゲー
トが固相に結合している場合、シグナル発生成分および
シグナル発生相が正確に機能して検定応答を発生させて
いることを意味する。陽性対照リガンドとして有用なリ
ガンドは、陰性対照リガンドと同種類のリガンド（すな
わち、リガンド補体）から選択され得る。
陰性対照リガンドコンジュゲート、陰性対照リガンド
レセプター、陽性対照リガンドコンジュゲートおよび陽
性対照リガンドレセプターを用いることにより、反応混
合物中のリガンド類似体コンジュゲートおよびリガンド
類似体レセプターの相対および絶対量が大きくは間違わ
ずに供給されたことを測定することができる。一般に、
陰性および陽性対照リガンドコンジュゲートを含むリガ
ンド類似体コンジュゲートは全て、混合物として供給さ
れる。同様に、陰性および陽性対照リガンドレセプター
を含むリガンド類似体レセプターは全て、混合物として
供給される。各リガンド類似体コンジュゲートおよびリ
ガンド類似体レセプター対の相対および絶対量は、検定
における各リガンドの測定に対していき値濃度を提供す
べく選択される。製造ロットの実質的部分には影響しな
い単発的事件として試薬充填に手違いが生じた場合、そ
の手違いは統計的定性対照試験方法によっては検出され
得ないが、誤った陽性または誤った陰性結果を生じ得る
検定となる。通常、それらの問題は、破壊的手段による
製造品の100％試験で発見され得るだけである。これは
この問題に対する明らかに許容できない解答である。こ
の発明は陽性および陰性対照を利用することにより、全
ての検定において、正確な試薬製剤を確認した結果、検
定が有効にされるか、または間違っていることが示され
た結果、検定が無効にされる。これらの目的を達成する
ため、陰性対照リガンドレセプターが、陰性対照リガン
ドコンジュゲートの全部との結合に必要とされる量より
も僅かに過剰、例えば10％過剰となるように、陰性対照
リガンドコンジュゲートを調節することができる。同様
に、陽性対照リガンドコンジュゲートが、陽性リガンド
レセプターにより結合され得る量よりも僅かに過剰、例
えば10％過剰となるように、陽性対照リガンドコンジュ
ゲートおよび陽性対照リガンドレセプターを供給する。
陰性対照リガンドコンジュゲートが誤ってその目標量の
10％を越える過剰量で供給された場合、他のリガンド類
似体コンジュゲートの全てについても同様の過剰量とな
り、末端固相上の陰性対照ゾーンで発生した応答は間違
いを表示し、結果は無効となる。同様に、陽性対照リガ
ンドレセプターが誤ってその目標量の10％を越える過剰
量で供給された場合、他のリガンドレセプターの全てに
ついても同様の過剰量となり、末端固相上の陽性対照ゾ
ーンにおける応答の欠如は間違いを表示し、結果は無効
となる。それらの対照機構は、正しい試薬製剤について
各検定を試験する手段を提供する。
いき値濃度およびレファレンス点の使用によるリガンド
の濃度範囲の測定 この発明の好ましい方法は、いき値濃度を利用するこ
とにより、標的リガンドに関する濃度範囲の下限および
レファレンス点を定め、その濃度範囲の上限を測定す
る。レファレンス応答は、試験応答位置から離れた位置
にあり、さらに濃度範囲の上限に対応する標的リガンド
濃度により発生された応答を表すべく選ばれる。レファ
レンス位置での応答は、レファレンス・レセプターがレ
ファレンス位置に固定され、レファレンス・リガンド
が、検出を可能にするシグナル発生成分により、例えば
レファレンス・リガンド・コンジュゲートを用いて標識
されているリガンド−レセプター対により提供され得
る。それらの目的に有用なリガンドは、興味の対象であ
る試料からは通常見出されないリガンド、すなわち、リ
ガンド補体であり、その結果、レファレンス・レセプタ
ーまたはリガンドレセプター結合部位に関してレファレ
ンス・リガンド・コンジュゲートおよび標的リガンド間
できっ抗は起こらない。リガンドとして例えばフルオレ
セインは、この目的用のレファレンス・リガンドとして
有用であり、フルオレセイン標識酵素は、レファレンス
応答を提供することにより、試験位置での検定応答が、
濃度範囲の上限より低いか、または実質的に等しいか、
またはそれより高いリガンド濃度に対応するか否かを測
定することを目的とする、レファレンス・レセプターと
しての抗フルオレセイン抗体と共にレファレンス・リガ
ンド・コンジュゲートとして有用である。別法として、
シグナル発生成分自体がレセプター・リガンド・コンジ
ュゲートとして機能し得、例えば、酵素はレファレンス
・レセプターとして抗酵素抗体と共に使用され得る。リ
ガンド類似体コンジュゲートの誘導体化の程度を調節す
ることにより検定応答関数の傾きを選ぶことができるた
め、検定応答関数を最適化することにより、選ばれた標
的リガンド濃度範囲全体にわたって検定応答関数の充分
な動的範囲を広げることができる。この方法は、標的リ
ガンド濃度が選択された濃度範囲より上か、下か、また
はその範囲内であるかを評価する最大能力を与える。試
験位置に検出可能なシグナルが無いということは、試料
が、濃度範囲の下限よりも低い濃度で標的リガンドを含
むことを示す。検出可能なシグナルの発生がレファレン
ス応答よりも低いということは、試料が、選択された濃
度範囲内の濃度で標的リガンドを含むことを示す。検定
応答がレファレンス応答と実質的に等しいか、またそれ
より大きいということは、試料が、選ばれた濃度範囲よ
り高い濃度で標的リガンドを含むことを示す。きっ抗的
検定において予め定められたリガンド濃度を表すレファ
レンスの使用は、アメリカ合衆国特許第4540659号およ
びヨーロッパ特許出願85307785.7に記載されている。し
かしながら、これらの適用は、濃度範囲を測定するため
に２つの上記レファレンス点を必要とする。必要性によ
り、これらの方法は、選択されたリガンド濃度の範囲に
対して使用され得る検定応答の動的範囲を圧縮する。こ
のため、それらのレファレンスを利用するこの発明の方
法は、２つの予め定められたリガンド濃度に対応させて
リガンド濃度を測定するそれらのきっ抗的リガンド−レ
セプター検定の遂行を顕著に改善するものである。この
発明の方法は、選択された濃度範囲に対応させてリガン
ド濃度を測定する場合に特に有用である。
単一較正点を用いたリガンドの定量的測定に関するリガ
ンド−レセプター検定方法 この発明の好ましい方法では、単一較正点を利用する
ことにより、濃度範囲全体にわたって標的リガンドを定
量的に検定する。単一較正点は、試料の試験と同時に行
なわれた別の試験からの外部キャリブレーター応答とし
て、または試験応答の位置から離れた位置でのレファレ
ンス応答として提供され得る。さらに、外部キャリブレ
ーター応答またはレファレンス応答は、所定の検定試薬
セットに関する定数である遊離対結合リガンド類似体コ
ンジュゲートの比率を有する特定標的リガンド濃度によ
り発生された応答を表すべく選択される。下記の関係に
よるキャリブレーターまたはレファレンス応答により、
検定の最大応答を測定する。
最大応答を用いることにより、下記関係を用いて試料
中の未知リガンド濃度に関する検定応答から遊離対結合
リガンド類似体コンジュゲートの比率を測定する。
未知リガンド濃度に対応する遊離対結合リガンド類似
体コンジュゲートの比率は、リガンド濃度の関数として
の遊離対結合リガンド類似体コンジュゲートの比率の既
知傾きおよび切片と一緒に、試料中の未知リガンド濃度
を決定する。
上記応答を用いて遊離対結合リガンド類似体コンジュ
ゲートの比率を測定するためには、結合反応が実質的に
平衡状態に達したとき、検定応答は、反応混合物中の遊
離リガンド類似体コンジュゲートの濃度に直接比例しな
ければならない。例えば所望による結合リガンド類似体
コンジュゲートの除去手段を使用し、次いで残りの遊離
リガンド類似体コンジュゲートを測定することにより、
反応混合物中の遊離リガンド類似体コンジュゲートから
直接試料採取する場合、別の必要条件は、シグナル発生
成分がシグナル発生相と一緒になって、試料採取された
遊離リガンド類似体コンジュゲートの濃度に比例する応
答を生じさせることだけである。シグナル発生成分とし
て酵素を選択し、シグナル発生相として存在する酵素の
量に直接比例した生成物を生じる基質溶液を選択するの
が、この発明におけるシグナル発生には好ましい。特に
好ましいのは、シグナル発生相を必要としないシグナル
発生成分としてのコロイド状金の使用である。反応混合
物を末端固相と接触させることにより、遊離リガンド類
似体コンジュゲートの試料採取を行う場合、固相上に固
定化されたリガンドレセプターは、反応混合物中に存在
する遊離リガンド類似体コンジュゲートの量に直接比例
する量のリガンド類似体コンジュゲートに結合しなけれ
ばならない。さらに、シグナル発生成分は、シグナル発
生相と一緒になって、末端固相に結合しているリガンド
類似体コンジュゲートの量に直接比例するシグナルを提
供しなければならない。独立した試験として実施された
外部キャリブレーターにより単一較正点が提供される場
合、リガンド濃度の関数として遊離対結合リガンド類似
体コンジュゲートの比率の傾きおよび切片に加えて、既
知濃度の標的リガンドを含む較正試料が提供される。単
一較正点が末端固相上のレファレンス応答により供給さ
れる場合、レファレンス位置における応答は、レファレ
ンス点に関して前述した機構により提供され得る。この
応答は、最大検定応答が測定されるように、既知濃度の
リガンドに関して得られた試験応答を表さなければなら
ず、それと共に既知比率の遊離対結合リガンド類似体コ
ンジュゲートをもたなければならない。末端固相上の試
験応答は、上記の通り反応混合物において遊離リガンド
類似体コンジュゲートの濃度に比例しなければならな
い。当業界の熟練者にとって、試験ゾーンに結合したリ
ガンド類似体コンジュゲートの量が、反応混合物におい
て遊離リガンド類似体コンジュゲートの濃度に直接比率
するためには、試験ゾーンの末端固相上に固定化された
リガンドレセプターが、試験ゾーンと接触したリガンド
およびリガンド類似体コンジュゲートの組み合わせより
多くなければならないことは当然である。これらの方法
は、較正頻度が少なくてすむようにする検定応答を明確
にするための広範な外部較正手段または検定応答に影響
を与える変動を制御するための高価な器具を必要としな
い簡易化された試料中のリガンドの定量化方法を提供す
る。
リガンドの定量的測定に関する可視的リガンドレセプタ
ー検定方法 反応混合物における遊離リガンド対結合リガンドの比
率間の直線関係により、可視定量的検定の基礎が与えら
れる。いき値濃度を越えるリガンド濃度において、結合
リガンド濃度が実質的に一定であるため、遊離リガンド
の濃度は、実質的にいき値濃度より上のリガンド濃度の
一次関数である。反応混合物において、試料中のリガン
ド濃度がいき値濃度より上の場合、遊離リガンドおよび
遊離リガンド類似体コンジュゲートの濃度合計は、リガ
ンド濃度の一次関数である。上記反応混合物を、例えば
アメリカ合衆国特許第4435504号記載の免疫クロマトグ
ラフィー装置と接触させた場合、遊離リガンドおよび遊
離リガンド類似体コンジュゲートは、末端固相上に固定
化されたレセプターに結合する。レセプターがリガンド
およびリガンド類似体コンジュゲートの両方に結合し得
る場合、リガンド類似体コンジュゲートが固相に結合す
る場合の移動距離は、試料中のリガンド濃度に直接比例
する。リガンド濃度がいき値を越えていない場合、末端
固相に結合したリガンド類似体コンジュゲートの移動距
離はゼロである。すなわち、最初に可視応答を発生する
リガンド濃度を、いき値となるように選ぶことができ、
着色応答の移動距離は、いき値濃度を越える試料中のリ
ガンド濃度に直接比例するため、この検定の較正は、外
部キャリブレーターまたは器具を必要とせずに達成され
る。この検定法により、リガンド類似体コンジュゲート
濃度が試料において臨床的に重大なリガンド濃度よりも
高い場合の濃度での試料中のリガンドの定量が可能にな
るため、先行技術の制限事項は回避される。
リガンド類似体−リガンド補体コンジュゲートを利用す
るリガンドに関するリガンドレセプター検定方法 この発明のリガンド−レセプター検定の別の態様で
は、リガンド補体という特殊化リガンドを含ませること
により、リガンド類似体コンジュゲートは増加する。リ
ガンド補体は、試験される試料からは通常見出されない
リガンドである。リガンド補体を含ませると、シグナル
発生成分に結合したリガンド類似体およびリガンド補体
の両方とのコンジュゲートが形成される。興味の対象で
ある標的リガンドに関するリガンド類似体−リガンド補
体コンジュゲートおよびリガンドレセプターの補体反応
対を有する反応相を流体試料と接触させる。リガンドレ
セプターは、固相上に固定化された抗体であり得る。標
的リガンドおよびリガンド類似体−リガンド補体コンジ
ュゲートは、固相固定化リガンドレセプターの結合部位
に関してきっ抗する。標的リガンドがいき値未満の濃度
で存在する場合、実質的に全部のリガンド類似体−リガ
ンド補体コンジュゲートはリガンドレセプターに結合す
る。特に好ましい態様では、リガンドレセプターは、反
応混合物中へ自由に拡散するモノクローナル抗体であ
る。リガンドレセプターが反応混合物中で自由に拡散す
る場合、固定化リガンド補体レセプターを含む末端固相
と接触する前に、反応混合物からリガンドレセプターを
除去するための所望による手段が必要とされる。リガン
ド類似体コンジュゲートによりリガンド補体を含ませる
ことにより、生じ得る「フック」作用の問題は排除され
る。
ある種の検定形式では、末端固相と接触する非結合リ
ガンドの残量が多すぎる結果、それが、固定化リガンド
レセプター上の結合部位に関して非結合リガンド類似体
コンジュゲートと効率的にきっ抗する場合、フック作用
が起こり得る。そのきっ抗が標的リガンドの結合に非常
に有利な場合、末端固相上に形成されたリガンド類似体
コンジュゲート：リガンドレセプター複合体により発生
されたシグナルは小さすぎて検出不可能となり得る。そ
の結果、試料中の標的リガンド濃度がいき値未満であっ
たことを示すため、この検定は不正確に解釈される。こ
の発明では、補体リガンド（すなわち、リガンド補体レ
セプター）に対して指向した固定化レセプターを含む末
端固相を用いることにより、この限界を克服することが
できる。反応混合物を、固定化リガンド補体レセプター
を有する末端固相と接触させた状態で置いた場合、残り
の標的リガンドおよびリガンド類似体−リガンド補体コ
ンジュゲート間で固定化リガンド補体レセプター上の結
合部位に関するきっ抗は起こらない。これらの環境下に
おいて、リガンド類似体−リガンド補体コンジュゲート
の結合は、最大であり、かつ残留標的リガンドによる影
響も受けない。フック作用は生じず、標的リガンド濃度
は正確に解釈される。従って、末端固相はシグナル発生
相との接触後、検出可能なシグナルが存在しないという
ことは、リガンドいき値未満の濃度であることを示し、
検出可能なシグナルが存在するということは、リガンド
がいき値濃度と実質的に同等またはそれより高い濃度で
存在することを示す。
多重リガンド同時測定を目的とするリガンド−レセプタ
ー検定方法 この発明は、同時多重リガンド−レセプター検定の遂
行に特に有用である。かなり多数の非相互作用性相補的
リガンド類似体コンジュゲート：リガンドレセプター反
応対を同時に用いることにより、単一試料中の興味の対
象である多数の標的リガンドを測定することができる。
この発明の検定では、興味の対象である標的リガンド
を含む疑いのある流体試料を、測定される標的リガンド
の数と等しい数の相補的リガンド類似体コンジュゲー
ト::リガンドレセプター反応対を含む反応相と接触させ
る。標的リガンドおよびそれらの各リガンド類似体コン
ジュゲート間で、相補的リガンドレセプター上の結合部
位に関してきっ抗が生じる。多重非相互作用性きっ抗反
応を全て、実質的平衡結合状態に到達させる。きっ抗シ
ステムの各々に関する平衡状態において、非結合リガン
ド類似体コンジュゲートの量を幾つかの因子により測定
する。この場合、特に重要なのは、試料中に存在する各
標的リガンドの量である。特異的標的リガンドが存在し
ない場合、各リガンド類似体コンジュゲートの本質的に
全てが適当なリガンドレセプターにより結合される。平
衡状態では、標的リガンド濃度が各いき値濃度と実質的
に同等またはそれより高い場合、検出可能量の特異的リ
ガンド類似体コンジュゲートが存在するだけである。各
いき値濃度またはそれより高い濃度での特異的リガンド
の存在を検出するため、反応混合物を、各リガンドに対
する固定化リガンドレセプターの独立ゾーンを含む末端
固相およびシグナル発生相と接触させることにより、リ
ガンドがあるとすれば、それらがそれらのいき値濃度ま
たはそれより高い濃度で存在したか否かを測定する。
さらに、末端固相上に固定化された各リガンドレセプ
ターは別々の位置（複数も可）に置かれているため、固
定化リガンド類似体コンジュゲートのシグナル発生成分
により発生されたシグナルは、特異的標的リガンドと特
有の形で会合し得る。リガンドと検出可能なシグナルの
１対１会合は、特異的リガンドレセプターの位置同定と
シグナル位置を相関させることにより達成される。従っ
て、この発明は、個々に予め定められたいき値濃度に関
して各々同時に評価される多数の標的リガンドの濃度を
与える。この方法では、末端固相上のリガンド特異的反
応ゾーンに検出可能なシグナルが存在しないということ
は、特異的標的リガンドがリガンド特異的いき値濃度未
満の濃度で試料中に存在することを示し、末端固相上の
リガンド特異的反応ゾーンに検出可能なシグナルが存在
するということは、特異的リガンドが、リガンド特異的
いき値濃度と実質的に同等またはそれより高い濃度で試
料中に存在することを示す。
各リガンドに対する多数のいき値濃度を用いて多数のリ
ガンドを同時に測定するリガンド−レセプター検定方法 この発明の態様の一つは、反応相が相補的試薬の群を
含み、各群が多数のリガンド類似体補体コンジュゲート
および適当なリガンドレセプターを有するものである、
多数の標的リガンドに関するリガンド−レセプター検定
である。リガンド類似体−リガンド補体コンジュゲート
は、相補的反応相リガンドレセプターに関して、それら
の各末端固相固定化リガンド補体レセプターとの複合体
形成段階で、シグナル発生が行なわれた結果、各相補的
リガンド類似体−リガンド補体コンジュゲート::固定化
リガンド補体レセプター対が、共有の標的リガンドに関
して特有のいき値濃度を呈するような比率で構成され
る。単一標的リガンドに関するいき値濃度のコンペンデ
ィウムは、いき値濃度範囲との比較により標的リガンド
濃度をさらに同定するための機構を提供する。反応相は
多数の群の相補的試薬対を含むため、多数の標的リガン
ドが同時に測定され得る（ただし、各リガンドは合同で
一連のいき値濃度を有する）。それによって、この方式
では、各標的リガンドは、一連の濃度範囲の一つに一括
され得る。上述のリガンド類似体−リガンド補体コンジ
ュゲートを用いて多重いき値レベルで多数のアナライト
を測定する例には、リガンド類似体−リガンド補体コン
ジュゲートの使用が含まれ、この場合、リガンド類似体
−リガンド補体コンジュゲートのリガンド類似体成分と
リガンドレセプターの複合体形成時、コンジュゲートの
リガンド補体成分は末端固相リガンド補体レセプターへ
の結合から立体障害を生じる。それらのコンジュゲート
は、アメリカ合衆国特許第4506009号に記載されてい
る。試料、リガンドレセプターおよびリガンド類似体−
リガンド補体コンジュゲートを含む反応混合物を実質的
に平衡状態に接近させる。次いで、反応混合物を、その
上にリガンド補体レセプターが局在している末端固相と
接触させる。コンジュゲート複合体はゼロの有効リガン
ド補体濃度を有するため、リガンド類似体−リガンド補
体コンジュゲート：リガンドレセプター複合体は、末端
固相固定化リガンド補体レセプターにより結合され得な
い。非結合リガンド類似体−リガンド補体コンジュゲー
トは固定化リガンド補体レセプターにより結合され得、
必要な遊離／結合分離段階があればそれを行い、シグナ
ル発生相と接触させた後、リガンド濃度はいき値濃度に
対して測定され得る。多数のリガンド補体レセプターを
末端固相上の特定位置に固定化するとき、ある位置での
検出可能なシグナルの存在が、リガンドが対応するいき
値濃度と実質的に同等またはそれより高い濃度で試料中
に存在することを示すように、各位置を特有のいき値濃
度と一致させる。
別の例では、反応混合物中でリガンド類似体−リガン
ド補体コンジュゲートを使用し、所望による手段を使用
する。反応混合物は、試料、リガンドレセプターおよび
リガンド類似体−リガンド補体コンジュゲートにより形
成される。リガンドレセプター上の限定された結合部位
をめぐるリガンドおよびリガンド類似体−リガンド補体
コンジュゲート間のきっ抗反応を実質的に平衡に接近さ
せる。次いで、リガンドレセプターと会合した反応混合
物の成分、すなわち、非結合リガンドレセプター、リガ
ンド：リガンドレセプター複合体およびリガンド類似体
−リガンド補体コンジュゲート：リガンドレセプター複
合体に結合し得る（リガンドレセプター）レセプターと
機能し得るように結合された所望による手段と反応混合
物を接触させる。次いで、生成した反応混合物を、その
上にリガンド補体レセプターが固定化されている末端固
相と接触させる。反応混合物中に残る非結合リガンド類
似体−リガンド補体コンジュゲートの一部分を末端固相
固定化リガンド補体レセプターと結合させ、必要なら
ば、分離段階で残りは除去され得る。最後に、末端固相
をシグナル発生相と接触させ、いき値濃度に対応させて
リガンド濃度を測定する。多数のリガンド補体レセプタ
ーを末端固相上の特定位置に固定するとき、ある位置で
の検出可能なシグナルの存在が、リガンドが対応するい
き値濃度と実質的に同等またはそれより高い濃度で試料
中に存在することを示すように、特有のいき値濃度と各
位置を一致させる。
レセプターコンジュゲートおよびリガンド類似体構築物
を用いたリガンド−レセプター検定 当業界の熟練者には、レセプターコンジュゲートおよ
びリガンド類似体構築物を反応混合物中で用いることに
より、リガンド−レセプター検定における標的リガンド
の測定用のいき値濃度が与えられ得ることは明白であ
る。レセプターコンジュゲートの実質的に全部をリガン
ド類似体構築物に結合させ、標的リガンドがいき値未満
の濃度で存在する場合に固定化リガンド類似体を含む末
端固相に結合するのを阻止する。この態様における使用
には、多数のリガンド結合部位を含むレセプターコンジ
ュゲートが好ましい。リガンド類似体構築物は、反応混
合物からレセプターコンジュゲートを分離する手段とし
て所望による固相にリガンド類似体を結合させることに
より形成され得る。別法として、リガンド類似体構築物
は、反応混合物から可溶性リガンド類似体構築物を分離
する手段を利用せずに、それらの可溶性リガンド類似体
構築物に結合したレセプターコンジュゲートが末端固相
上の固定化リガンド類似体に結合するのを阻止する大き
な種類の分子に、リガンド類似体を結合させることによ
り形成され得る。当業界の熟練者には、この発明が、単
一または多数の標的リガンドの検出におけるレセプター
コンジュゲートおよびリガンド類似体構築物の使用を予
期するものであることは明白である。
レセプターコンジュゲートおよびリガンド類似体構築物
を用いたリガンドレセプター検定 当業界の熟練者には、リガンドレセプターが興味の対
象である標的アナライトであり得ることは明白である。
この場合、標的リガンドレセプターを含む疑いのある試
料を加えることにより反応混合物を形成させたとき、反
応混合物が検定のいき値未満の濃度でリガンドレセプタ
ーを含む場合、実質的に全部のレセプターコンジュゲー
トが、リガンド類似体構築物に結合され、固定化リガン
ドを含む末端固相に結合するのを阻止されるようにレセ
プターコンジュゲートおよびリガンド類似体構築物を反
応相において供給する。レセプターコンジュゲートおよ
びリガンド類似体構築物の量は、検定における予め定め
られたいき値リガンドレセプター濃度を与えるように選
択される。当業界の熟練者には、この発明が、各標的リ
ガンドレセプターに関して、レセプターコンジュゲート
およびリガンド類似体構築物の相補対および末端固相上
の固定化リガンド類似体の独立ゾーンを提供することに
より多数のリガンドレセプターに関する検定を可能にす
るものであることは明白である。
この発明はきっ抗的免疫検定の遂行に特に有用である
が、当業界の熟練者には、この発明が、非きっ抗的免疫
検定を含む他のリガンド−レセプター検定にも利用され
得ることは明白である。例えば、サンドイッチ検定で
は、リガンドレセプターは、反応混合物中のリガンド分
子の異なる部位に結合するリガンドレセプターコンジュ
ゲートと一緒に供給され得る。リガンドを含む疑いのあ
る試料を反応相に加えたとき、リガンドレセプター、リ
ガンドレセプターコンジュゲートおよびリガンドの結合
は実質的平衡結合状態に到達し得る。リガンドレセプタ
ーの量は、固定化リガンドレセプターを含む固相と反応
混合物を接触させたとき、既知量のリガンドレセプタ
ー：リガンド：リガンドレセプターコンジュゲート複合
体が固相に結合するのを阻止されるため、試料中のリガ
ンド濃度が選択されたいき値濃度を越えるまで応答が発
生されないように、予め定められた量のリガンドを結合
するように選択される。
この発明に適当な標的として使用されるリガンドの例
には、排卵ステロイドおよびそれらの代謝物、例、プロ
ゲステロン、エストラジオール、プレグナンジオール−
３α−グルクロニドおよびエストロン−３−グルクロニ
ド、乱用性医薬およびそれらの代謝物、例、アンフェタ
ミン、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、カンナビノ
イド、コカイン、メタドン、メタアンフェタミン、メタ
カロン、オピエート、フェンシクリジン、プロポキシフ
ェン、および３環式抗うつ薬、治療剤およびそれらの代
謝物、例、アセトアミノフェン、ジゴキシン、サリチレ
ートおよびテオフィリン、排卵ホルモン、例、ヒトじゅ
う毛膜ゴナドトロピン、および黄体形成ホルモン、甲状
腺ホルモン、例、トリヨードチロニンおよびチロキシ
ン、マイコトキシン、例、アフラトキシンB1、アフラト
キシンB2、アフラトキシンG1、アフラトキシンM1、ゼア
ラレノン、Ｔ−２トキシンおよびデオキシニバレノー
ル、シグアトキシン、環境的毒素、例、ポリ塩化ビフェ
ニール、ダイオキシンおよびエチレンジブロミド、並び
に疾病分類学上価値のある蛋白質および抗体、例、アポ
リポ蛋白質、アルブミン、ｃ−反応性蛋白質、および肝
炎およびHIVウイルスに対する抗体がある。以下、実施
例によりこの発明を説明するが、限定的なものではな
い。
実施例１ （エストロン−３−グルクロニドのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルの作成） エストロン−３−グルクロニド（11.2mg、25μＭ）お
よびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（2.9mg、25μＭ）
を乾燥ジメチルホルムアミド0.1mlに溶解した。ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（5.7mg、27.5μＭ）を添加
し、フラスコの空気を窒素で追い出した。反応を室温で
３時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を除去
するため、反応混合物を小型の半融ガラスロートで過
した。生じたＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを
直ちにタンパク質への結合に使用した。
（エストロン−３−グルクロニド−アルカリ性ホスファ
ターゼ複合体の作成） エストロン−３−グルクロニドのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（114μｌ、230mM）のジメチルホル
ムアミド溶液をアルカリ性ホスファターゼの0.1Mホウ酸
カリウム、0.05Mリン酸カリウム、0.15M塩化ナトリウム
溶液（pH8.75）（0.26ml、9.8mg/ml）へ加えた。反応混
合物を室温で12時間撹拌した。エストロン−３−グルク
ロニド−アルカリ性ホスファターゼ複合体はセファデッ
クスＧ−25カラムによるクロマトグラフィーによって精
製した。
（ラテックスに固定化し、アフィニティー精製したマウ
スIgGFc断片に対するヤギIgG抗体の調製） アフィニティー精製したヤギ抗マウスFc（イムノサー
チ）およびポリスチレンラテックス粒子（硫酸化、1.07
μｍ）（インターフェーシャル・ダイナミックス）をそ
れぞれ別に45℃で１時間インキュベートし、抗体溶液を
0.1M ２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸でpH
5.5で緩衝化した。抗体溶液を撹拌しながら、抗体の最
終濃度が0.3mg/mlとなるようラテックス粒子の浮遊液を
抗体溶液へ加え、溶液は１％ラテックス固体を含有して
いた。浮遊液を45℃で２時間インキュベートしたのち、
浮遊液を遠心してラテックス粒子をペレット化した。ラ
テックスペレットを１％ウシ血清アルブミンのリン酸緩
衝化食塩水（PBS）溶液に再浮遊し、室温で１時間イン
キュベートした。遠心によってラテックスをペレット化
したのち、ペレットをPBS再浮遊および遠心によって３
回洗浄した。0.1％アジ化ナトリウムを含有するPBS（pH
7.0）に目的のペレットを、ラテックス濃度が１％固体
となるように再浮遊させた。この調製品を複合体の免疫
反応性の測定、およびエストロン−３−グルクロニド検
定の際、反応混合物からモノクローナル抗体を除去する
所望の手段として使用した。このラテックス調製品の１
％浮遊液はモノクローナル抗体40μg/mlを結合すること
が可能であった。
（複合体免疫反応性の測定） 抗体へ結合できたリガンド類似複合体の画分を測定す
るため、標的リガンドに対して特異的なモノクローナル
抗体を、結合可能なリガンドを付着して保有しているす
べての複合体へ結合するのに十分な抗体が利用され得る
ような量のリガンド類似複合体とインキュベートした。
モノクローナル抗体へ結合した複合体とともに、すべて
のモノクローナル抗体を完全に結合し得る十分量のヤギ
抗マウスFcラテックスを添加した。遠心によって混合物
からラテックスを分離し、上清に残存している酵素活性
量を検定し、混合物へ添加した酵素活性の全量と比較し
た。免疫反応性複合体の百分率はラテックスペレットへ
結合した全酵素活性の百分率であった。高い免疫反応性
を示した複合体はリガンド類似体で高度に誘導体化され
た複合体を表し、一方低い免疫反応性を示したものはそ
れより軽度に誘導体化された複合体を表している。
（反応混合物から抗体を除去するため所望の手段を用い
るエストロン−３−グルクロニドの検定） エストロン−３−グルクロニドとアルカリ性ホスファ
ターゼの複合体を調製し、モノクローナル抗体、クロー
ン＃27（インターファーム・ラボラトリーズ、レホボッ
ト（イスラエル）から入手）を使用して前記のようにそ
の免疫反応性を測定した。複合体には99.9％の免疫反応
性が認められ、酵素が高度に誘導体化されたことが判明
した。秤量した一定量のエストロン−３−グルクロニド
を溶解して調製した1mM保存溶液を希釈することによ
り、エストロン−３−グルクロニドの標準品を作成し
た。標準品と複合物の混合液を作成して、各混合物100
μｌずつを、微量滴定板ウエルの0.5％ヤギ抗マウスFc
ラテックス浮遊液中の等容量のモノクローナル抗体へ10
μg/mlの濃度で加えた。複合体の最終濃度4nM、抗体の
最終濃度31nMを含有した混合物を緩やかに振とうしなが
ら５分間インキュベートし、ついで遠心に掛けてラテッ
クスをペレット化した。各ウエルからの上清50μｌを、
固定化したモノクローナル抗体、クローン＃27を含有す
る微量滴定板ウエル（コバインド・プレート、マイクロ
メンブランズ、製造業者が指示するプロトコールを用
い、100μg/mlで抗体を固定化）へ添加し、緩やかに振
とうしながら室温で30分間インキュベートした。ウエル
をホウ酸緩衝化食塩水（pH8.2）で５回洗浄した。２−
アミノ−２−メチル−１−プロパノールでpH10.2に緩衝
化した10mMフェノールフタレインモノホスフェート200
μｌを添加し、UV極大微量滴定板読み取り装置（モレキ
ュラー・デバイシズ）を使用して560nmでフェノールフ
タレインの生成を反応速度論的に測定することにより、
結合した酵素活性の存在を測定した。またラテックスを
ペレット化したのち、上清10μｌを取り、上記と同様に
10mMフェノールフタレインモノホスフェート200μｌを
添加し560nmでフェノールフタレインの生成速度を反応
速度論的に測定することにより、上清に残存している酵
素活性を測定した。その成績を反応混合物中のエストロ
ン−３−グルクロニドの濃度と関連づけて、第Ｉ表に示
す。この成績から、エストロン−３−グルクロニドの濃
度が30nMに達するまで、ウエル内の抗エストロン−３−
グルクロニドへ結合している酵素活性および上清の酵素
活性はいずれも極めて低水準に留まっていることは明白
である。エストロン−３−グルクロニド濃度が検定限界
濃度を超えるまで（この場合、約30nM）、免疫反応性複
合体は、反応混合物中の抗体へ実質上すべて結合してい
る。ウエルに固定化した抗体量が、使用した遊離エスト
ロン−３−グルクロニド濃度の存在で利用可能な複合体
のすべてを結合するのに十分でないので、微量滴定板ウ
エルに固定化した抗体へ結合する酵素活性は上清中の浮
遊酵素活性が最高に達する以前に最高に達する。この結
果から、さらに高い抗体固定化能の可能性のある末端固
層であれば、この検定応答の動的範囲を改善するであろ
うことが判明した。
ウエル底部の要素としてインモビロン膜を含んでいる
16穴微量滴定板（ミリポア・コーポレーション）に、エ
ストロン−３−グルクロニドに対するモノクローナル抗
体、クローン155B3（インターファーム・ラボラトリー
ズ）を固定化した。6mg/ml抗体、0.1Mリン酸カリウム、
10mg/mlテトラゾール、0.1％ポリビニルアルコール（平
均分子量2000）を含有する溶液（pH7.4）0.6μｌずつを
加えることによって、抗体を膜−ウエルへそれぞれ添加
し、室温で20分間インキュベートした。ついで10mg/ml
カゼイン、0.1Mリン酸カリウム、10mg/mlテトラゾール
および0.1％ポリビニルアルコールを含有する溶液（pH
7.4）20μｌを加えて５分間インキュベートした。吸い
取り紙で過剰の溶液を吸い取り、末端固層として検定に
使用するまでプレートをデシケーター容器内で乾燥し
た。
エストロン−３−グルクロニド標準品およびエストロ
ン−３−グルクロニド−アルカリ性ホスファターゼ複合
体の等容量を混合し、標準品によって拡大された濃度幅
が、抗体濃度の選択によって決まる限界濃度期待値を含
むように選ばれだ抗エストロン−３−グルクロニド抗体
量をこれらの混合物へ添加することにより、検定を実施
した。反応全容量はいずれの混合物も60μｌであった。
10分間インキュベートしたのち、各反応混合物から20μ
ｌを分取し、抗体を固定化して膜に含んでいるウエルへ
加えた。膜を反応混合物と約１分間接触放置したのち、
0.05％ルブロールPXを含有するホウ酸緩衝化食塩水（pH
8.2）200μｌ容量で３回吸引過することにより洗浄し
た。10mMフェノールフタレインモノホスフェートを含有
する基質溶液（pH10.2）50μｌで吸引過することによ
りウエルをすすいだ。ウエルの底に吸い取り紙を接触さ
せることによってウエルを吸い取り、これと同じ基質溶
液50μｌを各ウエルへ添加した。UV極大微量滴定板読み
取り装置（モレキュラー・デバイシズ）を使用して560n
mでフェノールフタレインの生成速度を反応速度論的に
測定した。装置の読み取りが完了したら、10mM5−プロ
モ−４−クロロ−３−インドキシリルホスフェート（BC
IP）を含有する基質溶液（pH10.2）50μｌでウエルを洗
浄し、吸い取り紙でウエルを吸い取り、BCIP基質50μｌ
を添加して視覚検定応答を発現させた。約10分後に500m
M EDTA 50μｌを添加し、過剰の液体を膜から吸い取る
ことによって反応を停止させた。視覚応答を装置による
測定と比較し、特異的な信号の発現を確認した。本実施
例で報告した検定では、視覚および装置による応答はと
もに一致しており、エストロン−３−グルクロニドの濃
度が限界濃度以下であるウエルでは視覚応答は検出され
なかった。90％免疫反応性を示した高度に誘導体化され
た複合体を使用した検定と、26％免疫反応性を示したほ
とんど誘導体化されなかった別の複合体を使用した検定
の２つの検定結果を第II表に示す。高度に誘導体化され
た複合体は、この検定で約100nMの限界濃度を示し、次
第に応答を増大して約1000nMの最大値にまで達した。26
％免疫反応性を有する複合体を使用した検定では約120n
Mの限界濃度を示し、リガンド濃度の関数として一層急
速に増大する検定応答を示した。パーセント免疫反応性
によって複合体について測定される誘導体化度は、特定
の複合体によって示される検定特性を予知し得るよきパ
ラメーターであることが判明した。高度に誘導体化され
た複合体は、検定でそれよりも誘導体化が低い複合体よ
り一層緩やかな応答曲線勾配を示す。この特性は、当業
者の特殊応用のための検定を最適化するのに利用でき
る。
反応混合物が実質上平衡結合状態へ近付くのに要する
インキュベーション時間を決定するために検討すべき最
も重要なパラメーターは、これらの濃度では標的リガン
ドの平衡への接近が最も緩やかなので、限界濃度に隣接
した際の検定応答である。有用な方法は、限界濃度前後
の標的リガンド濃度を用いて検定を実施し、反応混合物
のインキュベーション時間の変化がこれらの濃度の検定
応答に及ぼす効果を検討することである。先の実施例で
報告したように、末端固層として膜を使用し、26％免疫
反応性を示した複合体を使用し、さらに観察された120n
Mの限界濃度をはさんで反応混合物中、100または140nM
のいずれかの濃度のようなエストロン−３−グルクロニ
ド標準品を使用してエストロン−３−グルクロニドの検
定を実施した。反応混合物を１、３、６または10分間イ
ンキュベートし、実質上、平衡結合状態に近付くのに要
する最小時間を決定した。第III表に示した結果から、
６分間のインキュベーション時間で100nMのエストロン
−３−グルクロニドを含有する検定では、視覚的に検出
し得る信号が何ら観察されないが、同一条件で140nMを
含有する検定の検定応答では視覚的に検出し得る信号が
なお残っていることから、６分間のインキュベーション
時間で十分であることが判明した。
実施例２ （５β−プレグナン−３α,20α−ジオール−グルクロ
ニドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの作成） プレグナンジオール−グルクロニド（13.3mg、25μ
Ｍ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（2.9mg、25
μＭ）を乾燥ジメチルホルムアミド0.1mlに溶解した。
ジシクロヘキシルカルボジイミド（5.7mg、27.5μＭ）
を添加し、フラスコの空気を窒素で追い出した。反応混
合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を小型の半融
ガラスロートで過して沈殿したジシクロヘキシル尿素
を除去し、真空で溶媒を除いた。残留物に無水メタノー
ルを加え、フラスコを−20℃で放置してＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルを沈殿させた。生じた結晶（12
mg）を単離し、乾燥し、デシケーター中で−20℃で貯蔵
した。
（プレグナンジオール−３α−グルクロニド−アルカリ
性ホスファターゼ複合体の作成） プレグナンジオール−グルクロニドのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルを乾燥アセトニトリルに溶解
し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの10倍モル
過剰を使用してアルカリ性ホスファターゼ（タンパク質
8mg/ml）と反応させた。反応はリン酸緩衝化食塩水（pH
7.0）中で90分間実施した。Ｇ−25クロマトグラフィー
によってタンパク質を反応物から分取し、前記と同様に
その免疫反応性を測定し、96％であることが分かった。
（末端固層として膜を使用するプレグナンジオール−３
α−グルクロニドの検定） プレグナンジオール−３α−グルクロニドに対するモ
ノクローナル抗体（クローンP44、インターファーム・
ラボラトリーズ）を前記と同様に16穴微量滴定板でイン
モビロン膜に固定化した。固定化に使用した抗体濃度は
16mg/mlであった。プレグナンジオール−３α−グルク
ロニド標準品およびプレグナンジオール−３α−グルク
ロニド−アルカリ性ホスファターゼ複合体のそれぞれ等
容量を混合し、標準品によって拡大された濃度幅が抗体
濃度の選択によって決定された限界濃度を含むように選
ばれた抗プレグナンジオール−３α−グルクロニド抗体
量をこの混合物に添加した。全反応混合物の容量はいず
れの混合物も60μｌであった。反応混合物を10分間イン
キュベートし、残りの検定方法はすべて前記のエストロ
ン−３−グルクロニドの検定と同様に実施した。その成
績を第IV表に示す。この表で最初に視覚的に検出可能な
結果では、約３μＭの限界濃度であった。またこの成績
は、反応混合物中の遊離リガンドと遊離リガンド類似複
合体の組合わせが、末端固層上に固定化したレセプター
量よりも実質上過剰であるような免疫測定で観察するこ
とができる「フック」効果を示している。この検定で、
約50μＭで発現される最大検定応答を、遊離リガンド類
似複合体がすべて末端固層へ結合した場合に達成し得る
最大可能性応答（複合体だけを含有している反応混合物
を末端固層へ接触させることによって測定される）と比
較すると、潜在的に利用可能な応答の僅か４％だけがこ
の検定で達成される。固定化した抗体量を増加させて末
端固層の使用、末端固層上の結合部位でリガンドと効果
的に競合できる高度に誘導体化された複合体の使用、お
よび高濃度のリガンド類似複合体の使用は、いずれも限
界濃度を高めて、実質上「フック」効果の危険性を最小
にする検定において最大応答を改善するのに有効な方法
である。検定を最適化するために使用されるこれらのパ
ラメーターの組合わせが、特定の免疫測定応用の目的に
よって変わることは当業者であれば理解し得よう。
実施例３ 乱用薬物の同時多剤検定 下記の実施例は、乱用薬物パネルに選ばれた薬物の検定
へのこの発明の応用を説明するものである。尿試料をス
クリーニングするのに有用な乱用薬物パネルとして、ナ
ショナル・インスチチュート・オブ・ドラッグ・アブユ
ーズ（NIDA）によって最も重要であると認められた５種
の薬物は、アンフェタミン、コカイン、アヘン類、フェ
ンシクリジンおよび大麻類である。これらのハプテンの
抗体を作り出すためには免疫原の合成が必要である。そ
のような免疫原の合成は当業者にとって既知である［例
えば、米国特許第3817837号、同第3878187号、同第3884
898号、同第4203802号、同第4281065号、およびロジャ
ーズ、R.、クラウル、C.P.、アイムスタット、W.M.、フ
ー、M.W.、カム、J.K.、ロナルド、R.C.、ローリー、G.
L.、ウルマン、E.F.、クリニカル・ケミストリー、24
巻、95〜100頁（1976年）参照］。これらの方法で生産
された免疫原を、ついで所望の薬物に対する免疫応答を
誘発させる目的でマウスを免疫するのに使用する。免疫
応答誘発のあと、動物を屠殺し、ひ臓細胞をミエローマ
細胞と融合させて、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞
系を生産する。さらに免疫化プロトコールに使用されて
いる免疫原を利用することによって、これらの細胞系由
来の抗体の特性決定を行う。モノクローナル抗体を生産
し、特性を決定する方法は、当業者にとって既知である
［例えばリウ、D.、パーセル、R.、レビー、J.G.、クリ
ニカル・トキシコロジー、25巻、527〜538頁（1987年）
参照］。また免疫原の生産に使用する薬物および化学
は、標的薬物で誘導体化したウシの腸アルカリ性ホスフ
ァターゼのような酵素からなる薬物−酵素複合体の合成
に使用される。そのような薬物で誘導体化された酵素の
生産方法は当業者既知のものである［例えば米国特許第
3817837号および同第4203802号参照］。
好適量の薬物−酵素複合体およびNIDA薬物パネルに対
するモノクローナル抗体から反応層を組立てる。限界薬
物濃度を測定する検定が、陰性試料から陽性試料をスク
リーニングするためのNIDAの勧告と一致するように抗体
量を選ぶ。これらの限界濃度は、アンフェタミン1000ng
/ml、大麻類100ng/ml、コカイン300ng/ml、アヘン類300
ng/ml、フェンシクリジン25ng/mlである。試料を反応層
と混合して反応混合物を作成し、多剤競合反応が実質上
平衡結合状態に近付くまで反応させる。ついで反応混合
物を、別々の鑑別反応ゾーンに抗薬物抗体を固定化させ
た膜を一部に含んでいる試験用具へ加えて接触させる。
抗薬物反応ゾーンの数は、薬物−酵素複合体：抗薬物抗
体の組合わせ対の数に一致させる。膜に抗体を固定化す
る方法は当業者周知のものである［例えばプラスカル、
M.G.、プルツェコップ、M.B.、カボニアン、M.R.、ベコ
リ、D.、ヒックス、D.A.、バイオテクニクス、４巻、27
2〜283頁（1986年）参照］。反応完結時、反応混合物中
で易溶性抗薬物抗体へ結合しなかった薬物−酵素複合体
をついで膜上の薬物特異性のある反応ゾーンに固定化し
た抗薬物抗体と複合化させる。遊離の薬物−酵素複合体
が反応混合物中に残存しておれば、洗浄液を使用して膜
に結合している薬物−酵素複合体から分離する。ついで
可視色を発色し得る好適な酵素基質を含有する溶液（例
えばウシの腸アルカリ性ホスファターゼであれば、３−
インドキシルホスフェートを含有する溶液が好適であ
る）と膜を接触させる。発色を起こし、各反応ゾーンの
応答を、検出し得る色が出なければそのゾーンでは標的
とする薬物が限界濃度を超えない濃度であることを示
し、検出し得る色が存在すれば標的薬物が限界濃度と実
質的に同等もしくはそれ以上の濃度で存在していること
を示しているとそれぞれ解釈する。各反応ゾーンを個々
に解釈し、このようにして５種の標的薬物のすべてにつ
いて、NIDAが規定した限界濃度と比較して陽性か陰性か
を判定する。
実施例４ （塩酸３−Ｏ−カルボキシメチルモルヒネの作成） 硫酸モルヒネ（1.67g、５×10-3モル）を、炭酸カリ
ウム（2.07g、1.5×10-2モル）とともにエタノール80ml
に溶解した。撹拌しながら溶液を加熱還流し、ブロモ酢
酸（0.7g、５×10-3モル）を含有するエタノール溶液
（2ml）をこれに加えた。反応混合物を２時間還流し、
ついでフラスコを氷水浴中で冷却した。12N塩酸でpH3に
調節し、沈殿を別した。真空下に溶媒を蒸発し、残留
物にエタノール10mlを加えた。沈殿を別し、真空下に
溶媒を蒸発した。残留物を水／アセトン（10:90）から
再結晶した。生成物約300mgを回収した。
（塩酸３−Ｏ−［２−アミノ−４−チオールブタン酸チ
オラクトン）−アセトアミド］−モルヒネ（モルヒネHC
TL）の製造） 塩酸ホモシステインチオラクトン（120mg、7.8×10-4
モル）、ピリジン62mg（7.8×10-4モル）および塩酸３
−Ｏ−カルボキシメチルモルヒネ296mg（7.8、10-4モ
ル）をジメチルホルムアミド5mlに溶解した。これにジ
シクロヘキシルカルボジイミド177mg（8.6×10-4モル）
を含有するジメチルホルムアミド溶液1mlを添加した。
フラスコの空気をアルゴンで追い出し、溶液を25℃で３
時間撹拌した。溶媒を真空下に蒸発し、残留物に水20ml
を加えた。溶液を５分間撹拌し、ついで不溶性のジシク
ロヘキシル尿素を別した。液を塩化メチレン10mlで
洗浄した。炭酸カリウム飽和水溶液で水層のpHを７に調
節した。水溶液を塩化メチレン10mlで６回抽出した。有
機抽出物を合わせて硫酸マグネシウム2gで乾燥し、過
し、溶媒を真空下に留去した。残留物にエタノール（20
ml）を加え、真空下に蒸発してピリジンを除去した。酢
酸エチル（10ml）を加え、不溶性の沈殿を別した。溶
液を撹拌しながら、pHがリトマスで赤くなるまでエーテ
ル性塩酸（1M）を加えた。白色の固体を取し、酢酸エ
チルで洗浄した。生成物を真空下に乾燥し、収量316mg
を得た。
（モルヒネ−アルカリ性ホスファターゼ複合体の作成） スルホ−SMCC（ピアス）3mg（6.9×10-6モル）を、0.
1Mリン酸カリウム、0.02Mホウ酸カリウム、0.15M塩化ナ
トリウム（pH7.5）に溶解したアルカリ性ホスファター
ゼ溶液（4.9mg/ml）2.2mlへ加えた。このタンパク質溶
液を25℃で１時間撹拌し、ついで0.1Mリン酸カリウム、
0.02Mホウ酸カリウム、0.15M塩化ナトリウム溶液（pH7.
0）で平衡化したGH25（アミコン・コーポレーション）4
0mlを含有するカラムによるゲル過クロマトグラフィ
ーによって、未反応のスルホ−SMCCからタンパク質を分
離した。カラムから溶出したタンパク質画分を採取し
た。0.12M炭酸カリウム、0.6mM EDTAを40％メタノール
に溶解した溶液63μｌをモルヒネ−HCTL 0.6mgへ加える
ことにより、モルヒネ−HCTLを加水分解した。溶液を25
℃で10分間静置し、ついで溶液の30μｌを、0.1Mリン酸
カリウム、0.02Mホウ酸カリウム、0.15M塩化ナトリウ
ム、0.4mM塩化マグネシウム溶液（pH7.0）中でスルホ−
SMCC（3.6mg/ml）で誘導体化したアルカリ性ホスファタ
ーゼ250μｌへ添加した。溶液を25℃で30分間撹拌し、
上記と同様なゲル過クロマトグラフィーによって未反
応の試薬からタンパク質を分離した。タンパク質画分を
採取し、検定に使用するため、１％ウシ血清アルブミ
ン、1mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、0.1％アジ
化ナトリウムおよび10mM3−（４−モルホリノ）−プロ
パンスルホン酸を含有する溶液（pH7.0）へ希釈した。
（単一検量点を用いたモルヒネの定量検定） モルヒネとアルカリ性ホスファターゼの複合体を作成
し、モルヒネに対する高い親和性のために選択されたモ
ノクローナル抗体を使用して、前記と同様にその免疫反
応性を測定した。複合体は99％以上の免疫反応性を有す
ることが判明した。既知容量を秤量したモルヒネを溶解
することにより、緩衝液に溶解したモルヒネの保存溶液
を調製した。この保存溶液から1000nMのモルヒネを含有
する標準品を調製し、さらにこの標準品から直接希釈に
より検定に使用する標準品を調製した。標準品によって
拡大された濃度範囲内の限界濃度を提供し得るよう選ば
れた抗体濃度の25μｌを各ウエルへそれぞれ添加するこ
とにより微量滴定板で検定を実施した。０、60、70、8
0、90、100、150、200、300、400および500nMのモルヒ
ネ濃度を含有する標準品を、１ウエル当り25μｌずつ微
量滴定板ウエルへ加え、使用した各濃度毎に６回ずつ測
定を繰り返した。アルカリ性ホスファターゼの最終濃度
が約1nMとなるよう各ウエルへモルヒネ−アルカリ性ホ
スファターゼ複合体を25μｌ容量ずつ添加した。反応混
合物を室温で30分間インキュベートし、ついでヤギ抗マ
ウスFcラテックスの１％浮遊液25μｌを添加して、さら
に５分間インキュベートした。反応混合物を遠心に掛け
てラテックスをペレット化し、ウエル毎に上清25μｌを
取り、これを２−アミノ−２−メチル−１−プロパノー
ル（AMP）でp10.2に緩衝化した10mMフェノールフタレイ
ンモノホスフェート200μｌと混合し、前記と同様に560
nmでフェノールフタレインの生成速度を反応速度論的に
測定することにより、酵素活性を検定した。検定の最大
可能性応答を測定するため、検定希釈液を抗体溶液に置
き換えて測定した活性が、すべての複合体が抗体によっ
て結合されないときに得られる全酵素活性を表す場合の
測定を５回反復して実施した。平均応答（遊離活性）を
平均最大活性と平均応答の差（結合活性）で割ることに
より、結合活性に対する遊離活性の比を各標準濃度につ
いて決定した。試料中のモルヒネ濃度の関数である結合
に対する遊離の比を、結合に対する遊離の比の計算誤差
が大きくなる最大応答にあまり接近しない限界濃度以上
の標準について線形回帰分析を行った。60、70および80
nMでは標準品は限界濃度以下であることが判明し、検定
系のバックグラウンド雑音を超える検定応答は生じなか
った。300、400および500nMでは標準品は最大応答に近
接した応答を生じ、結合に対する遊離の比の計算に大き
な誤差を生じた。90、100、150および200nMの標準品に
よって生じた検定応答を線形回帰分析に用いて、モルヒ
ネ濃度の関数として結合複合体に対する遊離体比直線の
従属変数を決定した。直線の傾きは１μＭ当り29.346単
位であり、結合に対する遊離の比軸の切片は−2.613単
位であった。これらのパラメーターは、検定試薬および
その容量を変えなければ検定系の定数である。これら
は、下式： （ここで、結合に対する遊離の比は試料の検定応答を最
大応答と検定応答の差で割ることによって決定される） からモルヒネの濃度を計算することによって、試料検定
の際に、モルヒネ濃度の決定に使用できる。この検定で
150nMのカリブレーターで６回反復測定を行い、得られ
た個々の応答を用いて最大検定応答を決定した。ついで
各最大検定応答を用いて標準品の90、100および200nMの
各検定応答について結合に対する遊離の比、および上記
の線形回帰式によって決定した対応するモルヒネの濃度
を計算した。この方法によって標準品濃度を測定した際
の精度および正確さから、試料中の未知のモルヒネ濃度
の測定は、この検定系の適用によって良好な近似を示
す。第Ｖ表に示した成績から、90〜200nMの範囲でこの
検定はモルヒネ濃度の定量に極めて精度が高いことが分
かる。標準品の実際の濃度は、前記の保存溶液の希釈に
よって定められた値と必ずしも一致する必要はないこと
に注目すべきである。一般に検定の有効範囲は、結合に
対する遊離の比の0.05〜４の範囲を包含する。この範囲
に対応するリガンド濃度の範囲は以上に説明した方法を
用いる検定系の目的によって選ぶことができる。
実施例５ （モルヒネ−ウシ血清アルブミン複合体の作成） アセトニトリル（1ml）にSMCC（ピアス）20mgを含有
する溶液75μｌを、0.1Mホウ酸カリウム、0.1Mリン酸カ
リウム、0.15M塩化ナトリウム（pH7.5）にウシ血清アル
ブミン（20mg/ml）を含有する溶液1.9mlへ加えた。溶液
を25℃で１時間撹拌し、ついで0.1Mリン酸カリウム、0.
02Mホウ酸カリウム、0.15M塩化ナトリウム（pH7.0）で
平衡化したGH25（アミコン・コーポレーション）を含有
しているカラムによるゲル過クロマトグラフィーによ
って未反応試薬からタンパク質を分離した。タンパク質
画分を採取した。0.12M炭酸カリウム、0.6mM EDTAの40
％メタノール溶液0.42ml容量をモルヒネ−HCTL 4mgへ添
加した。10分後、溶液の140μｌを、SMCCで誘導体化し
たウシ血清アルブミン（4.6mg/ml）8.2mlへ添加した。
溶液を25℃で２時間撹拌し、ついで10mM 2−（Ｎ−モル
ホリノ）−エタンスルホン酸（pH5.0）２リットルで透
析した。透析緩衝液を２回取り替えたのち、モルヒネ−
BSA複合体を採取した。
（モルヒネ−金コロイド複合体の作成） 平均直径45nmのコロイド金をフレンツの方法にしたが
って作成した［ネーチャー、フィジカル・サイエンシ
ズ、241巻、20頁（1973年）］。激しく撹拌しながら、
0.1M 2−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ME
S）5.6mlをコロイド金50mlへ滴下することにより、モル
ヒネ−コロイド金を作成した。モルヒネ−BSA複合体（1
0mM MES、0.02％アジ化ナトリウム（pH5.8）の溶液（3m
g/ml））を激しく撹拌しながら、コロイド金の塊りへ加
えた。混合が完了したのち撹拌を停止し、溶液を室温で
30分間インキュベートした。溶液を混合しながらBSA（1
0mM MES、0.02％アジ化ナトリウム（pH5.8）の溶液（3m
g/ml））1mlを添加し、５分間インキュベートした。ポ
リエチレングリコール（平均分子量20000）を１％溶液
（0.59ml）として加え、混合した。コロイド金を27000
×ｇで12分間４℃で遠心に掛け、ペレット化した。上清
を除去し、前記と同様にペレットを10mMリン酸カリウ
ム、0.01％ポリエチレングリコール、0.02％アジ化ナト
リウム（pH7.0）35mlで２回再浮遊し、遠心することに
よって洗浄した。最後の遠心ののちペレットを緩衝液0.
5mlに再浮遊して４℃で貯蔵した。
（モルヒネ−コロイド金を使用するモルヒネの限界免疫
検定） ナイロン膜（ポール・バイオダインＣ、細孔径1.2
μ）を使用し、表面に直径4mmの打ち抜き孔および感圧
接着剤（444アクリル製接着剤、3Mカンパニー）を有す
るポリスチレン製プラスチックのシートへ膜を積層する
ことによって末端固層を組み込んだ検定用具を組み立て
た。ポリスチレンの孔に露出しているナイロン膜へモル
ヒネに対するモノクローナル抗体を吸着により固定化し
た。0.1Mクエン酸ナトリウムを含有する緩衝液（pH3.
0）の抗体溶液（1mg/ml）を膜へ塗布し（孔１個当り６
μｌ）、数分間吸着させたのち、残りの吸着部位を封鎖
するため、0.5％カゼイン、0.5％BSA、0.1Mリン酸カリ
ウム、10％スクロースを含有する溶液（pH7.0）を加え
た（孔１個当り10μｌ）。反応混合物に使用した試薬お
よび試料は、１％BSA、0.1Mリン酸カリウム、0.15M塩化
ナトリウム、0.01M EDTA、0.01％ポリエチレングリコー
ル（平均分子量20000）、0.02％アジ化ナトリウム（pH
7.0）（以下、これを希釈液と言う）で上記のように３
倍に希釈したモルヒネ−コロイド金複合体、モルヒネに
対するモノクローナル抗体（希釈液に対し、0.27mg/m
l）およびモルヒネ標準品（尿中、0.1、0.15、0.2、0.2
5、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5μg/ml）であった。標準
品は、阿片類を含有しない尿の１μg/ml溶液から直接希
釈により調製した。秤量した量の硫酸モルヒネを溶解す
ることによって調製した1mg/ml濃度の保存溶液から１μ
g/ml溶液を作成した。微量滴定板ウエルに抗体溶液10μ
ｌ、試料20μｌおよび複合体10μｌを加えて５分間イン
キュベートしたのち、反応混合物20μｌを、検定用具に
固定化した抗体を含有する１枚のナイロン膜と接触させ
ることにより検定を実施した。ついで孔に露出している
膜を底側から吸い取り紙と接触させ、反応混合物を膜か
ら吸い取り紙へ吸い取った。膜に結合していない複合体
があれば、0.02％ルブロール、非イオン界面活性剤を含
有するホウ酸緩衝化食塩水（pH8.0）の１滴を加えるこ
とによって洗い流し、膜を吸い取り紙と接触させて洗浄
液を吸い取った。膜に残存している色を視覚的に記録
し、マクベス・カラーアイを使用して540nmで装置によ
り測定した。成膜をヒトの目視によって認めることがで
きる最低の色の差の尺度であるΔＥ★の単位に変換し
た。色の尺度であるこの単位に関するさらに完全な説明
は、「カラー・イン・ビジネス・サイエンス・アンド・
インダストリー［D.B.ジャッドおよびG.ワイセッキー著
（ジョン・ウイリー・アンド・サンズ）］に示されてい
る。検定期間中、試料の濃度が判らないように無作為に
コードした試料を使用する単純盲検法によって検定を実
施した。各試料毎に合計９回ずつ検定を繰り返して実施
した。膜のバックグラウンド色より明らかに検出可能な
色を生じた検定を陽性と判定した。検定を視覚的に解釈
した結果を第７図にまとめた。この結果から、検定が0.
3μｇ〜mlの限界濃度と比較して試料中のモルヒネ濃度
を正確に測定できることが分かる。装置による検定応答
の測定を第８図にまとめた。膜のバックグラウンド色よ
りも検出可能な最初の可視的信号は0.3μg/mlで起こる
ことが分かり、応答の色は限界濃度より急速に増大する
ことが分かる。
実施例６ （エストロン−３−グルクロン−（２−アミノ−４−チ
オールブタン酸チオラクトン）−アミド（E3G−HCTL）
の作成） エストロン−３−グルクロニド77mg（1.7×10-4モ
ル）、塩酸ホモシステインチオラクトン29mg（1.9×10
-4モル）およびピリジン0.015ml（1.9×10-4モル）をジ
メチルホルムアミド0.47mlに溶解した。この混合物をジ
シクロヘキシルカルボジイミド30mg（1.9×10-4モル）
をジメチルホルムアミド0.23mlに含有する溶液へ加え
た。フラスコの空気をアルゴンで追い出して密閉し、25
℃で３時間撹拌した。不溶性沈殿を別し、真空下に溶
媒を留去した。残留物をエタノール／水（15:12、v/v）
の溶液0.4mlに再溶解し、不溶性沈殿を過によって除
去した。
ついで粗製反応混合物をエタノール／水（15:12、v/
v）溶液0.5mlに溶解し、毎分2.0mlの流速を用いてメタ
ノール／水1:9の混合液で平衡化したC18HPLCカラム（1c
m×25cm）へ通導した。８分間でメタノール／水1:9の混
合液からメタノール／水1:1の混合液へ移行する勾配で
化合物を溶出し、ついで100％メタノール溶液でさらに2
0分間溶出した。E3G−HCTLは25〜27分の間で溶出した。
生成物を含有する画分を合わせて、真空下に溶媒を留去
した。E3G−HTCL 63mgを回収した。
（アルカリ性ホスファターゼ−エストロン−３−グルク
ロニドの作成） 0.12M K2CO3および0.6mM EDTAを40％メタノールに含
有する溶液20μｌへ、210mM E3G−HCTLのメタノール溶
液３μｌを加えることによりE3G−HCTLを加水分解し
た。25℃で10分経過後、溶液を、0.1Mリン酸カリウム、
0.02Mホウ酸カリウム、0.15M塩化ナトリウム、0.2mMMgC
l2（pH7.0）とともにアルカリ性ホスファターゼ−SMCC
1.8mg/mlを含有する溶液0.5mlへ添加した。スルホ−SMC
Cによるアルカリ性ホスファターゼの誘導体化は実施例
４で報告した。
反応を25℃で３時間撹拌し、ついで生じた溶液を0.1M
リン酸カリウム、0.02Mホウ酸カリウムおよび0.15M塩化
ナトリウムを含有する溶液（pH7.0）で平衡化したGH25
（アミコン）の14mlカラムでクロマトグラフィーに掛け
た。アルカリ性ホスファターゼ−E3G複合体溶出液を採
取し、0.16mg/mlの濃度で1.5mlを得た。
（固層ラミネートの作成） 抗−E3Gモノクローナル抗体（0.41mg/ml）および0.1M
クエン酸ナトリウムを含有する溶液（pH3.0）6mlへナイ
ロン膜片（5.0μｍ、ポール・バイオダインＣ）を加
え、1.8″×2.0″の膜片を６枚作成した。溶液を25℃で
1.5時間振とうし、ついで0.1Mリン酸カリウム、0.1％
（w/v）カゼイン、0.1％（v/v）トリトンＸ−100および
10％（w/v）スクロースを含有する溶液（pH7.0）へ膜片
を加え、膜片を３分間液に浸すことによって、膜の過剰
のタンパク質結合部位を封鎖した。膜を吸い取って乾燥
し、真空デシケーターに一夜放置した。
膜を0.3″×２″のストリップに裁断し、これを両面
に接着剤を有するポリスチレン・ストリツプ（１″×
３″×0.020″）（3M Co−444）へ張り付けた。ポリス
チレン・ストリップおよび粘着ラミネートは２層ラミネ
ートの中間に0.1″×1.5″の細い切れ込みを有する。
（ラミネートを固層として使用するエストロン−３−グ
ルクロニドの検定） エストロン−３−グルクロニドおよびアルカリ性ホス
ファターゼ−E3G（AP−E3G）を含有する試料を抗E3Gモ
ノクローナル抗体と混合することにより反応混合物を調
製した。このように調製した溶液は、AP−E3Gを0.9mg/m
l、抗E3Gモノクローナル抗体を0.18mg/ml濃度で含有
し、E3Gを0.1μＭ、1.6μＭ、2.6μＭ、7.8μＭ、26μ
Ｍおよび130μＭの濃度で含有する。反応混合物を25℃
で８分間インキュベートし、そのあと反応混合物の50μ
ｌを膜／ポリスチレンラミネート上の切り込みの１端へ
付着させた。反応混合物を検定用膜の上方へ垂直に移行
させた。反応混合物の移行が完了したあと（約12分以
内）、検定用膜を吸着剤と接触させて、50mMホウ酸カリ
ウム、0.15M NaClおよび0.05％（v/v）ルブロールを含
有する溶液0.5mlで洗浄した。ついで4mg/mlインドキシ
ルホスフェート、0.2M AMP、0.5Mトリスおよび0.1％（w
/v）アジ化ナトリウムを含有する酵素基質溶液（pH10.
2）の100μｌアリコートを膜に添加し、酵素を１分間基
質上で作用させた。基質のターンオーバー段階を0.5M E
DTAを含有する溶液（pH8.0）の300μｌアリコートで停
止させた。切れ込みの発色部分の長さを測定し、その結
果を第VI表にまとめた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンダソン、リチャード・レイ アメリカ合衆国92024 カリフォルニア、 エンシニタス、ホリーリッジ・ドライブ 634番 (56)参考文献 特開 平１−227963（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims (35)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】標的リガンドを含む疑いのある流体試料に
    おいて、リガンドレセプター上の利用可能な結合部位を
    めぐってリガンド類似体コンジュゲートと競合し得る少
    なくとも１種の標的リガンドの存在または量を測定する
    方法であって、前記リガンド類似体コンジュゲートは、
    検出可能なシグナルを発し得るシグナル発生成分に結合
    した少なくとも１種のリガンド類似体を含むものであ
    り、 a.上記流体試料をリガンド類似体コンジュゲートおよび
    リガンドレセプターと接触させることにより、反応混合
    物を形成させ、その際、リガンド類似体コンジュゲート
    とリガンドレセプターの相対量を、標的リガンドの非存
    在下、実質的平衡結合状態に到達後、実質的に全部のリ
    ガンド類似体コンジュゲートがリガンドレセプターに結
    合しているように定め、 b.非結合リガンド類似体コンジュゲートを検出し、 c.検出可能なシグナルを流体試料中の標的リガンドの存
    在または量に関係づける 段階を含む方法。
  2. 【請求項２】標的リガンドを含む疑いのある流体試料に
    おいて、リガンドレセプター上の利用可能な結合部位を
    めぐってリガンド類似体コンジュゲートと競合し得る少
    なくとも１種の標的リガンドの存在または量を測定する
    方法であって、前記リガンド類似体コンジュゲートは、
    検出可能なシグナルを発し得るシグナル発生成分に結合
    した少なくとも１種のリガンド類似体を含むものであ
    り、 a.上記流体試料をリガンド類似体コンジュゲートおよび
    リガンドレセプターと接触させることにより、反応混合
    物を形成させ、その際、リガンド類似体コンジュゲート
    とリガンドレセプターの相対量を、標的リガンドの非存
    在下、実質的平衡結合状態に到達後、実質的に全部のリ
    ガンド類似体コンジュゲートがリガンドレセプターに結
    合しているように定め、 b.反応混合物からリガンドレセプターおよびそれに結合
    している部分を除去し、 c.非結合リガンド類似体コンジュゲートを検出し、 d.検出可能なシグナルを流体試料中の標的リガンドの存
    在または量に関係づける 段階を含む方法。
  3. 【請求項３】標的リガンドを含む疑いのある流体試料に
    おいて、リガンドレセプター上の利用可能な結合部位を
    めぐってリガンド類似体コンジュゲートと競合し得る少
    なくとも１種の標的リガンドの存在または量を測定する
    方法であって、前記リガンド類似体コンジュゲートは、
    検出可能なシグナルを発し得るシグナル発生成分に結合
    した少なくとも１種のリガンド類似体を含むものであ
    り、 a.上記流体試料をリガンド類似体コンジュゲートおよび
    リガンドレセプターと接触させることにより、反応混合
    物を形成させ、その際、 （ｉ）リガンド類似体コンジュゲートとリガンドレセプ
    ターの相対量を、標的リガンドの非存在下、実質的平衡
    結合状態に到達後、実質的に全部のリガンド類似体コン
    ジュゲートがリガンドレセプターに結合しているように
    定め、そして （ii）リガンド類似体コンジュゲートとリガンドレセプ
    ターの相対および絶対量を、それ未満ではシグナルが殆
    どまたは全く検出されない少なくとも１種の目的とする
    いき値リガンド濃度が確立されるように定め、 b.非結合リガンド類似体コンジュゲートを検出し、 c.検出可能なシグナルを流体試料中の標的リガンドの存
    在または量に関係づける 段階を含む方法。
  4. 【請求項４】標的リガンドを含む疑いのある流体試料に
    おいて、リガンドレセプター上の利用可能な結合部位を
    めぐってリガンド類似体コンジュゲートと競合し得る少
    なくとも１種の標的リガンドの存在または量を測定する
    方法であって、前記リガンド類似体コンジュゲートは、
    検出可能なシグナルを発し得るシグナル発生成分に結合
    した少なくとも１種のリガンド類似体を含むものであ
    り、 a.上記流体試料をリガンド類似体コンジュゲートおよび
    リガンドレセプターと接触させることにより、反応混合
    物を形成させ、その際、 （ｉ）リガンド類似体コンジュゲートとリガンドレセプ
    ターの相対量を、標的リガンドの非存在下、実質的平衡
    結合状態に到達後、実質的に全部のリガンド類似体コン
    ジュゲートがリガンドレセプターに結合しているように
    定め、そして （ii）リガンド類似体コンジュゲートとリガンドレセプ
    ターの相対および絶対量を、それ未満ではシグナルが殆
    どまたは全く検出されない少なくとも１種の目的とする
    いき値リガンド濃度が確立されるように定め、 b.反応混合物からリガンドレセプターおよびそれに結合
    している部分を除去し、 c.非結合リガンド類似体コンジュゲートを検出し、 d.検出可能なシグナルを流体試料中の標的リガンドの存
    在または量に関係づける 段階を含む方法。
  5. 【請求項５】段階ｂで固体支持手段を使用することによ
    り、反応混合物からリガンドレセプターおよびそれに結
    合している部分を除去する、請求項２または４記載の方
    法。
  6. 【請求項６】少なくとも１種のレセプターが固体支持体
    上に固定されている、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】固体支持手段が、拡散性ビーズ、膜、フィ
    ルタおよび多孔質マトリックスから成る群から選ばれた
    ものである、請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】段階ｂで沈澱により、反応混合物からリガ
    ンドレセプターおよびそれに結合している部分を除去す
    る、請求項２または４記載の方法。
  9. 【請求項９】少なくとも１種のレセプターを用いること
    により、リガンドレセプターおよびそれに結合した部分
    を沈澱させる、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】反応混合物が、さらに少なくとも１種の
    リガンド補体レセプターおよびそこに結合し得る少なく
    とも１種のリガンド補体−リガンドレセプターを含み、
    前記リガンド補体レセプターを用いることにより、反応
    混合物からリガンド補体−リガンドレセプターおよびそ
    れに結合した部分を除去する、請求項２または４記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】リガンド補体がビオチンであり、リガン
    ド補体レセプターがアビジンである、請求項10記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】反応混合物中のリガンドレセプターが、
    リガンドレセプター結合部位をめぐってリガンドおよび
    リガンド類似体コンジュゲート間で行なわれる競合中に
    拡散運動をすることができる、請求項１または２または
    ３または４記載の方法。
  13. 【請求項１３】反応混合物中のリガンドレセプターが非
    拡散性固相上に固定されている、請求項１または２また
    は３または４記載の方法。
  14. 【請求項１４】上記方法が、リガンドレセプターが抗体
    である免疫検定である、請求項１または２または３また
    は４記載の方法。
  15. 【請求項１５】抗体がモノクローナルである、請求項14
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】シグナル発生成分に結合したリガンド類
    似体の数が１ないし50である、請求項１または２または
    ３または４記載の方法。
  17. 【請求項１７】シグナル発生成分に結合したリガンド類
    似体の数が１ないし10である、請求項１または２または
    ３または４記載の方法。
  18. 【請求項１８】反応混合物中の少なくとも１種の非結合
    リガンド類似体コンジュゲートを測定するために、少な
    くとも１種のリガンドレセプターが、少なくとも１つの
    明確な位置または複数の位置にある固相上に固定されて
    いる、請求項１または２または３または４記載の方法。
  19. 【請求項１９】固相が、多孔質および非多孔質マトリッ
    クス、ビーズ、膜並びにフィルターから成る群から選ば
    れたものである、請求項18記載の方法。
  20. 【請求項２０】固相が、反応混合物が膜と接触するよう
    に装置に組み込まれた膜である、請求項18記載の方法。
  21. 【請求項２１】膜から非結合コンジュゲートを除去する
    手段および膜上に固定されたレセプターに結合したリガ
    ンド類似体コンジュゲートをシグナル発生相と接触させ
    る手段を有する、請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】反応混合物が、さらにリガンド補体−リ
    ガンド類似体コンジュゲートを含み、少なくとも１つの
    リガンド補体レセプターが、反応混合物において少なく
    とも１種の非結合リガンド補体−リガンド類似体コンジ
    ュゲートを検出するための少なくとも１つの明確な位置
    にある固相上に固定されている、請求項２または４記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】反応混合物が、さらにリガンド補体−リ
    ガンド類似体コンジュゲートを含み、少なくとも１つの
    リガンドレセプターおよび少なくとも１つのリガンド補
    体レセプターが、反応混合物において少なくとも１種の
    非結合リガンド類似体コンジュゲートおよび少なくとも
    １種の非結合リガンド補体−リガンド類似体コンジュゲ
    ートを検出するための明確な複数位置にある固相上に固
    定されている、請求項２または４記載の方法。
  24. 【請求項２４】流体試料中における標的リガンドの少な
    くとも１つの濃度について少なくとも１種の標的リガン
    ドの半定量的測定を可能にする少なくとも１つの位置ま
    たは複数の位置を有する、請求項18または22または23記
    載の方法。
  25. 【請求項２５】シグナル発生成分が非器具的手段により
    検出され得る、請求項１または２または３または４記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】シグナル発生成分が視覚手段により検出
    され得る、請求項25記載の方法。
  27. 【請求項２７】シグナル発生成分が酵素である、請求項
    １または２または３または４記載の方法。
  28. 【請求項２８】流体試料中、リガンドレセプター上の利
    用可能な結合部位をめぐってリガンド類似体コンジュゲ
    ートと競合し得る少なくとも１種の標的リガンドの量を
    測定する方法であり、前記リガンド類似体コンジュゲー
    トは、検出可能なシグナルを発し得るシグナル発生成分
    に結合した少なくとも１種のリガンド類似体を含むもの
    であり、 a.上記流体試料をリガンド類似体コンジュゲートおよび
    リガンドレセプターと接触させることにより、反応混合
    物を形成させ、その際、リガンド類似体コンジュゲート
    およびリガンドレセプターの相対量を定め、標的リガン
    ドの非存在下、実質的平衡結合状態に到達後、実質的に
    全部のリガンド類似体コンジュゲートがリガンドレセプ
    ターに結合しているように定め、 b.非結合リガンド類似体コンジュゲートを検出し、 c.リガンド類似体コンジュゲートに対するレセプターの
    親和力がレセプター濃度の逆数よりも実質的に大きい場
    合、遊離対結合リガンド類似体コンジュゲートの比率
    は、実質的に検定範囲全体にわたるリガンド濃度の一次
    関数であるという関係を用いて、検出可能なシグナルを
    流体試料中の標的リガンドの量に関係づける 段階を含む方法。
  29. 【請求項２９】リガンド類似体コンジュゲートに対する
    レセプターの親和力が、レセプター濃度の逆数よりも少
    なくとも500倍大きい、請求項28記載の方法。
  30. 【請求項３０】流体試料中、リガンドレセプター上の利
    用可能な結合部位をめぐってリガンド類似体コンジュゲ
    ートと競合し得る少なくとも１種の標的リガンドの量を
    測定する方法であって、前記リガンド類似体コンジュゲ
    ートは、検出可能なシグナルを発し得るシグナル発生成
    分に結合した少なくとも１種のリガンド類似体を含むも
    のであり、 a.上記流体試料をリガンド類似体コンジュゲートおよび
    リガンドレセプターと接触させることにより、反応混合
    物を形成させ、その際、 （ｉ）リガンド類似体コンジュゲートとリガンドレセプ
    ターの相対量を、標的リガンドの非存在下、実質的平衡
    結合状態に到達後、実質的に全部のリガンド類似体コン
    ジュゲートがリガンドレセプターに結合しているように
    定め、そして （ii）リガンド類似体コンジュゲートとリガンドレセプ
    ターの相対および絶対量を、それ未満ではシグナルが殆
    どまたは全く検出されない少なくとも１つの目的とする
    いき値リガンド濃度が確立されるように定め、 b.非結合リガンド類似体コンジュゲートを検出し、 c.リガンド類似体コンジュゲートに対するレセプターの
    親和力がレセプター濃度の逆数よりも実質的に大きい場
    合、遊離対結合リガンド類似体コンジュゲートの比率
    は、実質的に検定範囲全体にわたるリガンド濃度の一次
    関数であるという関係を用いて、検出可能なシグナルを
    流体試料中の標的リガンドの量に関係づける 段階を含む方法。
  31. 【請求項３１】リガンド類似体コンジュゲートに対する
    レセプターの親和力が、レセプター濃度の逆数よりも少
    なくとも500倍大きい、請求項30記載の方法。
  32. 【請求項３２】反応混合物が、陰性対照リガンドコンジ
    ュゲートおよび陰性対照リガンドレセプターを含み、顕
    著な量の非結合陰性対照リガンドコンジュゲートの検出
    が無効な方法の結果を示す指標である、請求項１または
    ２または３または４記載の方法。
  33. 【請求項３３】反応混合物が少なくとも１つのレファレ
    ンス・リガンドコンジュゲートを含み、レファレンス・
    リガンドコンジュゲートの検出により、少なくとも１つ
    の標的アナライトに関する少なくとも１つのレファレン
    ス濃度が定められ、この濃度を前記アナライトに関する
    いき値濃度と共に用いることにより、アナライト濃度の
    範囲にこの方法による応答を対応させる、請求項１また
    は２または３または４記載の方法。
  34. 【請求項３４】シグナル発生成分がコロイド状金粒子で
    ある、請求項１または２または３または４記載の方法。
  35. 【請求項３５】流体試料が、検定応答を有効にするた
    め、（１）少なくとも１つの陰性対照リガンドコンジュ
    ゲートおよびそこに結合し得る少なくとも１つの陰性対
    照リガンドレセプター並びに（２）少なくとも１つの陽
    性対照リガンドコンジュゲートおよびそこに結合し得る
    少なくとも１つの陽性対照リガンドレセプターを含み、
    前記陰性対照リガンドレセプターは前記陰性対照リガン
    ドコンジュゲートの全部を結合するのに必要とされる量
    より僅かに過剰であり、前記陽性対照リガンドコンジュ
    ゲートは前記陽性対照リガンドレセプターの量より僅か
    に過剰である、請求項１または２または３または４記載
    の方法。
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