KR20240051109A - 검정 신호 증폭을 위한 방법, 조성물 및 키트 - Google Patents
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Abstract
발명은 검정 신호 증폭을 위한 방법, 조성물, 키트 및 검정 시스템에 관한 것이다. 또한 신호 증폭 시약이 본 명세서에 제공되며, 여기서 신호 증폭 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
Description
발명은 검정 신호 증폭을 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 또한 신호 증폭 시약이 본 명세서에 제공되며, 여기서 신호 증폭 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
면역검정, 예를 들어 샌드위치 면역검정은 일반적으로 샘플에서 분석물을 검출하는데 사용된다. 전형적인 면역검정은 종종 샘플에서 낮은 존재량의 분석물을 정확하게 검출할 만큼 민감하지 않거나 검정 장비 자체가 낮은 신호 수준을 검출하는데 제한된다. 검정 민감도를 개선시키는 방법은 종종 복잡한 최적화 절차를 포함하며 이는 시간- 및 노동-집약적인 프로세스가 될 수 있다. 더욱이, 최적화된 검정에는 더 긴 실행 시간 및/또는 복잡한 분석 방법이 필요할 수 있다.
실시형태에서, 발명은 다음을 포함하는 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지인, 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) (1) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (2) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 단계; 및 (b) (I) 제2 검출가능한 표지 또는 (II) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(c) (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지인, 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) 효소의 기질과 접촉시키는 단계; 및 (d) 효소 활성을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(e) (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지인, 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 선택적으로 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계; 및 (f) (I) 제1 검출가능한 표지; (II) 제2 검출가능한 표지; 또는 (III) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(g) (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지인, 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 신호 증폭 시약은 신호 증폭(SA) 핵산 프로브를 포함하며, 이에 의해 제1 복합체와 신호 증폭 시약을 포함하는 제2 복합체를 형성하는, 단계; (h) 핵산 프로브를 연장하여 연장된 서열을 형성하는 단계; 및 (i) 연장된 서열의 양을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 있다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함하고, 표면은 그 위에 고정화된 앵커링 시약을 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함하고, 방법은 표면 상에 앵커링 시약을 고정화하는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 방법의 단계 (h) 이전에 또는 동안에 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 연장된 서열의 앵커링 영역에 결합하고, 측정은 앵커링 시약을 통해 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 발명은 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에, (a) 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; (b) 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약으로서, 여기서 검출 시약은 제1 검출가능한 표지를 포함하며, 여기서 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지인, 검출 시약; 및 (c) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 포함하는, 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 실시형태에서, 키트는 표면을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 발명은 다음을 포함하는, 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법을 제공한다: (a) 표면 상에 관심있는 분석물; 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약으로서, 여기서 포획 시약은 표면 상에 고정화되거나 또는 포획 시약은 표면에 고정화될 수 있는, 시약; 및 분석물에 특이적으로 결합하고 제1 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체를 형성하는 단계; (b) 제1 핵산 프로브를 연장시켜 제1 앵커링 영역을 포함하는 제1 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 여기서 제1 앵커링 영역은 표면 상에 고정화된 제1 앵커링 시약에 결합하는, 단계; (c) 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1의 표지된 프로브에 제1 연장된 서열을 결합하는 단계로서, 여기서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지인, 단계; 및:
(d) 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를 (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) (1) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (2) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 단계; (e) 표면 상의 (I) 제2 검출가능한 표지 또는 (II) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(f) 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를 (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) 효소의 기질과 접촉시키는 단계; 및 (g) 효소 활성을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(h) 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 선택적으로 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계; 및 (i) (I) 제1 검출가능한 표지; (II) 제2 검출가능한 표지; 또는 (III) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(j) 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 신호 증폭 시약은 제2 핵산 프로브를 포함하고, 이에 의해 신호 증폭 시약 및 제1 표지된 프로브를 포함하는 제2 복합체를 형성하는, 단계; (k) 제2 핵산 프로브를 연장시켜 제2 앵커링 영역을 포함하는 제2 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 여기서, 제2 앵커링 영역은 표면 상에 고정화된 제2 앵커링 시약에 결합하는, 단계; 및; (l) (I) 제2 연장된 서열 또는 (II) 제1 연장된 서열과 제2 연장된 서열이 표면에 결합된 양을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계.
실시형태에서, 발명은 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에 (a) 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; (b) 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약으로서, 여기서 검출 시약은 제1 핵산 프로브를 포함하는, 시약; (c) 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 표지된 프로브로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지인, 프로브; 및 (d) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 포함하는 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 실시형태에서, 키트는 표면을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 발명은 ECL 표지에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태에서, 발명은 ECL 표지 및 접합 링커에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태에서, 발명은 (a) 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 핵산 프로브를 포함하는 것; 및 (b) 핵산 프로브에 결합할 수 있는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시형태에서, 발명은 본 명세서에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 핵산 프로브를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 (i) 핵산 프로브에 결합할 수 있는 주형 올리고뉴클레오티드, 및 (ii) 검출가능한 표지를 포함하는 표지된 프로브를 추가로 포함하며, 여기서 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 주형 올리고뉴클레오티드는 원형 올리고뉴클레오티드 주형이다. 실시형태에서, 키트는 (iii) 앵커링 시약을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트는 핵산 증폭 효소(예를 들어, 중합효소), 표면, 포획 시약 및/또는 검출 시약을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 발명은 (a) 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 효소를 포함하는 것; 및 (b) 효소의 기질을 포함하는 조성물을 제공한다. 실시형태에서, 발명은 본 명세서에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 효소를 포함한다.
실시형태에서, 발명은 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 발명은 본 명세서에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출가능한 표지를 포함한다.
실시형태에서, 발명은 (a) 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 결합 모이어티를 포함하는 것; 및 (b) (i) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (ii) 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시형태에서, 발명은 본 명세서에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 결합 모이어티를 포함한다.
실시형태에서, 발명은 적어도 하나의 메모리 유닛; 적어도 하나의 메모리 유닛에 대한 명령에 따라 프로그램된 적어도 하나의 처리 유닛; 및 적어도 하나의 처리 유닛에 의해 제어되도록 구성된 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 포함하는 검정 시스템을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 처리 유닛은 샘플에서 더 높은 존재량의 분석물의 제1 측정 및 샘플에서 더 낮은 존재량의 분석물의 제2 측정 중 하나 또는 둘 모두를 수행하도록 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 제어하도록 구성되며, 여기서 더 높은 존재량의 분석물은 더 낮은 존재량의 분석물보다 대략적으로 10 내지 100,000 더 높은 배수로 샘플에 존재하며, 여기서 더 높은 존재량의 분석물은 ECL 표지를 포함하는 검출 시약을 사용하여 검출되며, 그리고 여기서 더 낮은 존재량의 분석물은 (i) ECL 표지를 포함하는 검출 시약 및 (ii) ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 사용하여 검출된다.
실시형태에서, 발명은 적어도 하나의 처리 유닛에 의해 실행될 때 적어도 하나의 처리 유닛이, 검정 시스템의 제어를 통해, 샘플에서 더 높은 존재량의 분석물의 제1 측정; 및 샘플에서 더 낮은 존재량의 분석물의 제2 측정 중 하나 또는 둘 모두를 수행하게 하는 명령이 그 안에 저장된 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체를 제공하며, 여기서 더 높은 존재량의 분석물은 더 낮은 존재량의 분석물보다 대략적으로 10 내지 100,000 더 높은 배수로 샘플에 존재하며, 여기서 더 높은 존재량의 분석물은 ECL 표지를 포함하는 검출 시약을 사용하여 검출되며, 그리고 여기서 더 낮은 존재량의 분석물은 (i) ECL 표지를 포함하는 검출 시약 및 (ii) ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 사용하여 검출된다.
실시형태에서, 발명은 적어도 하나의 메모리 유닛; 적어도 하나의 메모리 유닛에 대한 명령에 따라 프로그램된 적어도 하나의 처리 유닛; 및 적어도 하나의 처리 유닛에 의해 제어되도록 구성된 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 포함하는 검정 시스템을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 처리 유닛은 샘플에서 분석물의 측정을 수행하기 위해 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 제어하도록 구성되며, 여기서 분석물은 ECL 표지를 포함하는 단일 검출 시약을 사용하여 0.0001 내지 100000pg/mL 내의 농도로 존재할 때 샘플에서 검출될 수 있다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고 본 발명의 특정 양태의 예시적인 실시형태를 더 입증하기 위해 포함된다.
도 1a-1d는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 도 1a에서, 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 포획 시약은 표면 상의 표적화제에 대한 포획 시약 상의 표적화제 상보체의 결합을 통해 표면에 고정화된다. 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약("핵산 프로브를 갖는 Sig. Amp. 시약")을 제1 복합체에 첨가하고, 이에 의해 제2 복합체를 형성한다. 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하여 다중 신호 증폭 시약이 각각의 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 실시형태에서, 각각의 신호 증폭 시약의 핵산 프로브는 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 증폭된다. 도 1b는 포획 시약("CR"), 분석물, 제1 검출가능한 표지("1ST 표지")를 포함하는 검출 시약("DR") 및 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약("SAR")을 포함하는 제2 복합체를 도시하며, 여기서 핵산 프로브는 연장되어 주형 올리고뉴클레오티드("주형 올리고")를 통해 연장된 서열("연장된 seq")을 형성하고, 표지된 프로브는 연장된 서열에 결합된다. 도 1c는 검출 시약이 3개의 제1 검출가능한 표지를 포함하며, 그 각각이 2개의 표지된 프로브에 결합된 연장된 서열을 포함하는 제1 신호 증폭 시약에 결합된 추가 실시형태를 도시한다. 도 1d는 검출 시약이 2개의 제1 검출가능한 표지를 포함하는 추가 실시형태를 나타내며, 여기서 각각의 검출가능한 표지는 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약에 결합되고, 2개의 주형 올리고뉴클레오티드는 2개의 핵산 프로브에 혼성화되며, 여기서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 두 핵산 프로브 모두에 혼성화된다. 실시형태에서, 2개의 주형 올리고뉴클레오티드는 함께 결찰되어 원형 주형을 형성할 수 있다.
도 2는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. (1) 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약 및 (2) 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티 둘 모두는 하나 이상의 단계에서 제1 복합체에 첨가된다. 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하여 다중 신호 증폭 시약이 각각의 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티(들)을 통해 각각의 신호 증폭 시약에 결합한다.
도 3은 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 포획 시약은 표면 상의 표적화제에 대한 포획 시약 상의 표적화제 상보체의 결합을 통해 표면에 고정화된다. (1) 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약 및 (2) 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 올리고뉴클레오티드 검출가능한 모이어티 둘 모두는 하나 이상의 단계에서 제1 복합체에 첨가된다. 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하여 다중 신호 증폭 시약이 각각의 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티(들)을 통해 각각의 신호 증폭 시약에 결합한다.
도 4는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 복수의 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티가 혼합되며, 여기서 각각의 검출가능한 모이어티는 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하고, 각각의 검출가능한 모이어티는 다중 결합 모이어티에 결합할 수 있어 복수의 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티를 포함하는 신호 증폭 복합체를 형성한다. 그런 다음 신호 증폭 복합체는 제1 복합체에 추가된다. 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하여, 신호 증폭 복합체의 다중 신호 증폭 시약이 각각의 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티(들)을 통해 각각의 신호 증폭 시약에 결합한다.
도 5는 항-혈청 및 하이브리도마를 스크리닝하기 위해 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 염소-항-마우스(GAM) 항체는 검정 플레이트의 결합 도메인("스팟") 상에 고정화되고 샘플에서 마우스-생성된 항체와 결합한다. 검정 형식 1에서, BSA-접합된 MSD SULFO-TAG™ ECL 표지("SULFO-TAG")는 샘플에서 SULFO-TAG에 특이적인 항체를 검출하는데 사용된다. 검정 형식 2에서, 접합되지 않은 SULFO-TAG를 사용하여 샘플에서 SULFO-TAG에 특이적인 항체를 검출한다.
도 6은 신호 증폭 시약으로서 11개의 항-SULFO-TAG 항체 클론을 스크리닝하기 위한 예시적인 면역검정의 결과를 보여준다. 면역검정을 위한 분석물은 인간 ZnT8, 인간 IA-2, 인간 TGM-2 또는 마우스 IL-1b였다. 각각의 분석물-특이적 면역검정에서 각각의 항-SULFO-TAG 항체에 대해 측정된 ECL 검정 신호가 표시된다.
도 7은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 인간 ZnT8로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 7가지 상이한 농도의 인간 ZnT8 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 07로 번호지정됨)와 블랭크(STD 08)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 04에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 04/STD 08 값 기준) 및 STD 04에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 04/STD 08 값 기준)이 표시된다.
도 8은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 인간 TGM-2로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 7가지 상이한 농도의 인간 TGM-2 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 07로 번호지정됨)와 블랭크(STD 08)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 04에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 04/STD 08 값 기준) 및 STD 04에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 04/STD 08 값 기준)이 표시된다.
도 9는 도 7 및 8에 나타난 바와 같은 동일한 인간 ZnT8 및 TGM-2 캘리브레이터를 사용한 예시적인 캘리브레이션 적정 면역검정의 결과를 보여주지만, 면역검정은 신호 증폭 시약으로서 항-SULFO-TAG 없이 수행되었다. 측정된 ECL 신호, 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 04에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 04/STD 08 값 기준) 및 STD 04에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 04/STD 08 값 기준)이 표시된다.
도 10은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 마우스 IL-23으로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 3가지 다른 농도의 마우스 IL-23 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 03으로 번호지정됨)와 블랭크(STD 04)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 02에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 02/STD 04 값 기준) 및 STD 02에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 02/STD 04 값 기준)이 표시된다.
도 11은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 마우스 IL-17C로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 3가지 다른 농도의 마우스 IL-17C 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 03으로 번호지정됨)와 블랭크(STD 04)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 02에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 02/STD 04 값 기준) 및 STD 02에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 02/STD 04 값 기준)이 표시된다.
도 12는 도 10 및 11에 나타난 바와 동일한 마우스 IL-23 및 IL-17C 캘리브레이터를 사용한 예시적인 캘리브레이션 적정 면역검정의 결과를 보여주지만, 면역검정은 신호 증폭 시약으로서 항-SULFO-TAG 없이 수행되었다. 측정된 ECL 신호와 검출 최저 한계(LLOD)가 표시된다.
도 13은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 인간 IL-10으로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 3가지 다른 농도의 인간 IL-10 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 03으로 번호지정됨)와 블랭크(STD 04)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 02에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 02/STD 04 값 기준) 및 STD 02에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 02/STD 04 값 기준)이 표시된다.
도 14는 도 13에 나타난 바와 동일한 인간 IL-10 캘리브레이터를 사용한 예시적인 캘리브레이션 적정 면역검정의 결과를 보여주지만, 면역검정은 신호 증폭 시약으로서 항-SULFO-TAG 없이 수행되었다. 측정된 ECL 신호와 검출 최저 한계(LLOD)가 표시된다.
도 15는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 포획 시약, 분석물, 및 제1 핵산 프로브를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 제1 핵산 프로브가 연장되어("증폭 1") 제1 연장된 서열이 형성된다. 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하는 복수의 제1 표지된 프로브는 제1 연장된 서열에 결합한다. 각각 제2 핵산 프로브를 포함하는 다중 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 결합한다. 제2 핵산 프로브 각각은 연장되어("증폭 2") 제2 연장된 서열을 형성한다. 각각 제2 검출가능한 표지를 포함하는 하나 이상의 제2 표지된 프로브는 제2 연장된 서열에 결합한다.
도 16a-16c는 도 6에 도시된 항-SULFO-TAG 항체 클론의 신호 억제 및 신호 강화를 측정하기 위해 수행된 예시적인 검정의 결과를 보여준다. 도 16a는 각각의 항-SULFO-TAG 항체 클론에 대한 신호 억제 퍼센트(%) 및 신호 증가 %를 보여준다. 도 16b는 각각의 항체 클론에 대한 신호 억제 %의 막대 그래프 플롯을 보여준다. 도 16b는 각각의 항체 클론에 대한 신호 증가 %의 막대 그래프 플롯을 보여준다.
도 17은 본 명세서에 기술된 방법의 실시예를 보여준다. 포획 시약, 분석물, 및 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 있다. 효소 및 효소 기질을 포함하는 신호 증폭 시약은 하나 이상의 단계에서 제1 복합체에 첨가된다. 효소는 기질에 작용하여 검출가능한 신호를 생성한다.
도 18a는 다양한 수의 설포메틸-바이피리딘("SM"), 바이피리딘("Bpy") 또는 산("A") 리간드를 갖는 예시적인 유기금속 Ru2+ 화합물("TAG 화합물")을 보여준다. 도 18b는 예시적인 TAG 화합물로부터의 ECL 생성 능력을 보여준다.
도 19는 도 18a에 도시된 TAG 화합물과 실시예 4에 기술된 항-SULFO-TAG 항체 클론으로 예시적인 결합 검정의 결과를 보여준다. 더 높은 신호가 더 강한 결합 친화도를 나타내는, 항-SULFO-TAG 항체로부터의 ECL 신호가 측정되었다. 오른쪽 삽입도는 더 높은 농도(10 내지 1000nM)에서 Ru+2(Bpy)3 화합물에 결합하는 항체를 보여준다.
도 20은 실시예 4에 기술된 항-SULFO-TAG 항체 클론으로 도 18a에 도시된 TAG 화합물과 도 18a에 도시된 SM, Bpy, 또는 A 리간드 사이의 예시적인 경쟁적 결합 검정의 결과를 보여준다. 그래프는 항-SULFO-TAG 항체가 2μM의 각각의 리간드에 노출된 다음 각각의 TAG 화합물의 농도가 변한 후 남아 있는 ECL 신호를 보여준다. 낮은 ECL 신호는 특정 리간드에 대한 결합 친화도가 더 강하다는 것을 나타낸다. 가장 오른쪽 열에서의 세 패널은 항-SULFO-TAG 항체 클론을 10nM의 TAG 화합물 단독(리간드 없음)에 노출시키는 ECL 신호를 보여준다.
도 21은 바이피리딘 리간드 상의 치환기로서 상이한 하전된 작용기를 함유하는 예시적인 유기금속 Ru2+ 화합물을 보여준다.
도 22a-22d는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 보여준다. 각각의 도 22a-22d에서, 복합체는 포획 시약("CR"), 분석물, 제1 검출가능한 표지("1ST 표지")를 포함하는 제1 검출 시약("1ST DR"), 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제2 검출 시약("2ND DR"), 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 동시에 결합하는 신호 증폭 시약("SAR")을 포함한다. 도 22a에서, 신호 증폭 시약은 임의의 다른 구성성분 없이 묘사된다. 도 22a에 표지된 바와 같은 구성성분은 도 22b-22d에 대한 것과 동일하다. 도 22b에서, 신호 증폭 시약은 결합 모이어티의 결합 파트너를 포함하는 검출가능한 모이어티에 결합하는 결합 모이어티 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 도 22c에서, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 도 22d에서, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 주형 올리고뉴클레오티드를 통해 연장되어 제2 검출가능한 표지를 포함하는 하나 이상의 표지된 프로브에 결합하는 연장된 서열을 형성하는, 핵산 프로브를 포함한다.
도 1a-1d는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 도 1a에서, 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 포획 시약은 표면 상의 표적화제에 대한 포획 시약 상의 표적화제 상보체의 결합을 통해 표면에 고정화된다. 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약("핵산 프로브를 갖는 Sig. Amp. 시약")을 제1 복합체에 첨가하고, 이에 의해 제2 복합체를 형성한다. 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하여 다중 신호 증폭 시약이 각각의 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 실시형태에서, 각각의 신호 증폭 시약의 핵산 프로브는 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 증폭된다. 도 1b는 포획 시약("CR"), 분석물, 제1 검출가능한 표지("1ST 표지")를 포함하는 검출 시약("DR") 및 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약("SAR")을 포함하는 제2 복합체를 도시하며, 여기서 핵산 프로브는 연장되어 주형 올리고뉴클레오티드("주형 올리고")를 통해 연장된 서열("연장된 seq")을 형성하고, 표지된 프로브는 연장된 서열에 결합된다. 도 1c는 검출 시약이 3개의 제1 검출가능한 표지를 포함하며, 그 각각이 2개의 표지된 프로브에 결합된 연장된 서열을 포함하는 제1 신호 증폭 시약에 결합된 추가 실시형태를 도시한다. 도 1d는 검출 시약이 2개의 제1 검출가능한 표지를 포함하는 추가 실시형태를 나타내며, 여기서 각각의 검출가능한 표지는 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약에 결합되고, 2개의 주형 올리고뉴클레오티드는 2개의 핵산 프로브에 혼성화되며, 여기서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 두 핵산 프로브 모두에 혼성화된다. 실시형태에서, 2개의 주형 올리고뉴클레오티드는 함께 결찰되어 원형 주형을 형성할 수 있다.
도 2는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. (1) 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약 및 (2) 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티 둘 모두는 하나 이상의 단계에서 제1 복합체에 첨가된다. 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하여 다중 신호 증폭 시약이 각각의 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티(들)을 통해 각각의 신호 증폭 시약에 결합한다.
도 3은 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 포획 시약은 표면 상의 표적화제에 대한 포획 시약 상의 표적화제 상보체의 결합을 통해 표면에 고정화된다. (1) 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약 및 (2) 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 올리고뉴클레오티드 검출가능한 모이어티 둘 모두는 하나 이상의 단계에서 제1 복합체에 첨가된다. 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하여 다중 신호 증폭 시약이 각각의 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티(들)을 통해 각각의 신호 증폭 시약에 결합한다.
도 4는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 복수의 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티가 혼합되며, 여기서 각각의 검출가능한 모이어티는 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하고, 각각의 검출가능한 모이어티는 다중 결합 모이어티에 결합할 수 있어 복수의 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티를 포함하는 신호 증폭 복합체를 형성한다. 그런 다음 신호 증폭 복합체는 제1 복합체에 추가된다. 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하여, 신호 증폭 복합체의 다중 신호 증폭 시약이 각각의 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티(들)을 통해 각각의 신호 증폭 시약에 결합한다.
도 5는 항-혈청 및 하이브리도마를 스크리닝하기 위해 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 염소-항-마우스(GAM) 항체는 검정 플레이트의 결합 도메인("스팟") 상에 고정화되고 샘플에서 마우스-생성된 항체와 결합한다. 검정 형식 1에서, BSA-접합된 MSD SULFO-TAG™ ECL 표지("SULFO-TAG")는 샘플에서 SULFO-TAG에 특이적인 항체를 검출하는데 사용된다. 검정 형식 2에서, 접합되지 않은 SULFO-TAG를 사용하여 샘플에서 SULFO-TAG에 특이적인 항체를 검출한다.
도 6은 신호 증폭 시약으로서 11개의 항-SULFO-TAG 항체 클론을 스크리닝하기 위한 예시적인 면역검정의 결과를 보여준다. 면역검정을 위한 분석물은 인간 ZnT8, 인간 IA-2, 인간 TGM-2 또는 마우스 IL-1b였다. 각각의 분석물-특이적 면역검정에서 각각의 항-SULFO-TAG 항체에 대해 측정된 ECL 검정 신호가 표시된다.
도 7은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 인간 ZnT8로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 7가지 상이한 농도의 인간 ZnT8 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 07로 번호지정됨)와 블랭크(STD 08)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 04에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 04/STD 08 값 기준) 및 STD 04에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 04/STD 08 값 기준)이 표시된다.
도 8은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 인간 TGM-2로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 7가지 상이한 농도의 인간 TGM-2 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 07로 번호지정됨)와 블랭크(STD 08)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 04에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 04/STD 08 값 기준) 및 STD 04에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 04/STD 08 값 기준)이 표시된다.
도 9는 도 7 및 8에 나타난 바와 같은 동일한 인간 ZnT8 및 TGM-2 캘리브레이터를 사용한 예시적인 캘리브레이션 적정 면역검정의 결과를 보여주지만, 면역검정은 신호 증폭 시약으로서 항-SULFO-TAG 없이 수행되었다. 측정된 ECL 신호, 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 04에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 04/STD 08 값 기준) 및 STD 04에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 04/STD 08 값 기준)이 표시된다.
도 10은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 마우스 IL-23으로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 3가지 다른 농도의 마우스 IL-23 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 03으로 번호지정됨)와 블랭크(STD 04)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 02에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 02/STD 04 값 기준) 및 STD 02에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 02/STD 04 값 기준)이 표시된다.
도 11은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 마우스 IL-17C로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 3가지 다른 농도의 마우스 IL-17C 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 03으로 번호지정됨)와 블랭크(STD 04)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 02에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 02/STD 04 값 기준) 및 STD 02에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 02/STD 04 값 기준)이 표시된다.
도 12는 도 10 및 11에 나타난 바와 동일한 마우스 IL-23 및 IL-17C 캘리브레이터를 사용한 예시적인 캘리브레이션 적정 면역검정의 결과를 보여주지만, 면역검정은 신호 증폭 시약으로서 항-SULFO-TAG 없이 수행되었다. 측정된 ECL 신호와 검출 최저 한계(LLOD)가 표시된다.
도 13은 신호 증폭 시약으로서 6개의 상이한 항-SULFO-TAG 항체 클론을 사용하여 분석물로서 인간 IL-10으로의 예시적인 캘리브레이터 적정 면역검정의 결과를 보여준다. 3가지 다른 농도의 인간 IL-10 캘리브레이터(STD 01 내지 STD 03으로 번호지정됨)와 블랭크(STD 04)로 측정된 ECL 신호가 표시된다. 경사 슬로프, R 제곱 값, 검출 최저 한계(LLOD), STD 02에 대한 신호-대-배경 비율(S/B)(STD 02/STD 04 값 기준) 및 STD 02에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)(STD 02/STD 04 값 기준)이 표시된다.
도 14는 도 13에 나타난 바와 동일한 인간 IL-10 캘리브레이터를 사용한 예시적인 캘리브레이션 적정 면역검정의 결과를 보여주지만, 면역검정은 신호 증폭 시약으로서 항-SULFO-TAG 없이 수행되었다. 측정된 ECL 신호와 검출 최저 한계(LLOD)가 표시된다.
도 15는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 예시한다. 포획 시약, 분석물, 및 제1 핵산 프로브를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 제1 핵산 프로브가 연장되어("증폭 1") 제1 연장된 서열이 형성된다. 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하는 복수의 제1 표지된 프로브는 제1 연장된 서열에 결합한다. 각각 제2 핵산 프로브를 포함하는 다중 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 결합한다. 제2 핵산 프로브 각각은 연장되어("증폭 2") 제2 연장된 서열을 형성한다. 각각 제2 검출가능한 표지를 포함하는 하나 이상의 제2 표지된 프로브는 제2 연장된 서열에 결합한다.
도 16a-16c는 도 6에 도시된 항-SULFO-TAG 항체 클론의 신호 억제 및 신호 강화를 측정하기 위해 수행된 예시적인 검정의 결과를 보여준다. 도 16a는 각각의 항-SULFO-TAG 항체 클론에 대한 신호 억제 퍼센트(%) 및 신호 증가 %를 보여준다. 도 16b는 각각의 항체 클론에 대한 신호 억제 %의 막대 그래프 플롯을 보여준다. 도 16b는 각각의 항체 클론에 대한 신호 증가 %의 막대 그래프 플롯을 보여준다.
도 17은 본 명세서에 기술된 방법의 실시예를 보여준다. 포획 시약, 분석물, 및 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 있다. 효소 및 효소 기질을 포함하는 신호 증폭 시약은 하나 이상의 단계에서 제1 복합체에 첨가된다. 효소는 기질에 작용하여 검출가능한 신호를 생성한다.
도 18a는 다양한 수의 설포메틸-바이피리딘("SM"), 바이피리딘("Bpy") 또는 산("A") 리간드를 갖는 예시적인 유기금속 Ru2+ 화합물("TAG 화합물")을 보여준다. 도 18b는 예시적인 TAG 화합물로부터의 ECL 생성 능력을 보여준다.
도 19는 도 18a에 도시된 TAG 화합물과 실시예 4에 기술된 항-SULFO-TAG 항체 클론으로 예시적인 결합 검정의 결과를 보여준다. 더 높은 신호가 더 강한 결합 친화도를 나타내는, 항-SULFO-TAG 항체로부터의 ECL 신호가 측정되었다. 오른쪽 삽입도는 더 높은 농도(10 내지 1000nM)에서 Ru+2(Bpy)3 화합물에 결합하는 항체를 보여준다.
도 20은 실시예 4에 기술된 항-SULFO-TAG 항체 클론으로 도 18a에 도시된 TAG 화합물과 도 18a에 도시된 SM, Bpy, 또는 A 리간드 사이의 예시적인 경쟁적 결합 검정의 결과를 보여준다. 그래프는 항-SULFO-TAG 항체가 2μM의 각각의 리간드에 노출된 다음 각각의 TAG 화합물의 농도가 변한 후 남아 있는 ECL 신호를 보여준다. 낮은 ECL 신호는 특정 리간드에 대한 결합 친화도가 더 강하다는 것을 나타낸다. 가장 오른쪽 열에서의 세 패널은 항-SULFO-TAG 항체 클론을 10nM의 TAG 화합물 단독(리간드 없음)에 노출시키는 ECL 신호를 보여준다.
도 21은 바이피리딘 리간드 상의 치환기로서 상이한 하전된 작용기를 함유하는 예시적인 유기금속 Ru2+ 화합물을 보여준다.
도 22a-22d는 본 명세서에 기술된 방법의 실시형태를 보여준다. 각각의 도 22a-22d에서, 복합체는 포획 시약("CR"), 분석물, 제1 검출가능한 표지("1ST 표지")를 포함하는 제1 검출 시약("1ST DR"), 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제2 검출 시약("2ND DR"), 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 동시에 결합하는 신호 증폭 시약("SAR")을 포함한다. 도 22a에서, 신호 증폭 시약은 임의의 다른 구성성분 없이 묘사된다. 도 22a에 표지된 바와 같은 구성성분은 도 22b-22d에 대한 것과 동일하다. 도 22b에서, 신호 증폭 시약은 결합 모이어티의 결합 파트너를 포함하는 검출가능한 모이어티에 결합하는 결합 모이어티 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 도 22c에서, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 도 22d에서, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 주형 올리고뉴클레오티드를 통해 연장되어 제2 검출가능한 표지를 포함하는 하나 이상의 표지된 프로브에 결합하는 연장된 서열을 형성하는, 핵산 프로브를 포함한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 더욱이, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. 관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은, 본 개시내용이 단지 대안 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지하지만, 대안만을 언급하도록 명시적으로 나타내지 않거나 대안이 상호배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하는" (및 "포함하다" 및 "포함한다"와 같은 포함하는의 임의의 변형 또는 형태), "갖는" (및 "갖다" 및 "가진다"와 같은 갖는의 임의의 변형 또는 형태), "포괄하는" (및 "포괄하다" 및 "포괄한다"와 같은 포괄하는의 임의의 변형 또는 형태) 또는 "함유하는" (및 "함유하다" 및 "함유한다"와 같은 함유하는의 임의의 변형 또는 형태)은 포괄적이거나 개방적이고 추가적, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.
용어 "예를 들어" 및 그에 상응하는 약어 "e.g."(이탤릭체로 표시되었는지 여부에 관계없이)의 사용은 인용된 특정 용어는 달리 명시적으로 언급하지 않는 한 참조되거나 인용된 특정 예로 제한되도록 의도되지 않은 본 개시내용의 대표적인 예 및 실시형태임을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "사이"는 범위의 말단을 포함하는 범위이다. 예를 들어, x와 y 사이의 숫자에는 x와 y라는 숫자와 x와 y 내에 속하는 임의의 숫자가 명시적으로 포함된다.
발명은 당업계에 기술된 검정 방법에 비하여 여러 가지 장점을 제공한다. 예를 들어, 발명은 검정에서 검출가능한 신호를 증가시키는 간단하고 편리한 방법을 제공하여, 검출가능한 표지가 더 낮은 비용 및/또는 더 낮은 복잡성의 기기를 사용하여 측정될 수 있도록 한다. 예를 들어, 신호에서의 이 증가는 검출가능한 신호를 증폭함에 의해 검정의 민감도를 향상시키는 간단하고 편리한 방법을 제공할 수도 있다. 실시형태에서, 본 명세서의 방법은 신호-대-잡음 비를 개선하고, 예를 들어 샘플에서 낮은 존재량의 종의 더 정확한 검출을 가능하게 한다.
실시형태에서, 본 명세서에서의 방법은 이미 상업적으로 이용가능한 면역검정에 이용될 수 있는 검출가능한 표지, 예를 들어 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 활용한다. 현재 상업적으로 이용가능한 면역검정은 샘플에서의 분석물의 농도에 따라 동일한 분석물에 대해 상이한 검출 시약을 요구할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약은 분석물 농도가 상대적으로 높을 때(예를 들어, 약 1pg/mL 이상) 사용할 수 있는 반면, 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약은 분석물 농도가 상대적으로 낮을 때(예를 들어, 약 1pg/mL 미만) 사용할 수 있다. 현재 상업적 면역검정은 또한 상이한 검정 형식을 요구할 수 있고/있거나 샘플에 상이한 농도로 존재하는 다중 분석물을 측정할 때 샘플을 희석하거나 농축해야 할 수도 있다. 실시형태에서, 발명의 방법은 분석물 농도가 낮을 때 검정 신호를 증폭하기 위해 신호 증폭 시약을 사용하고, 이에 의해 다중 유형의 검출 시약을 사용하고, 상이한 분석물 농도에 대해 상이한 형식으로 검정을 수행하고/하거나 샘플에서 상이한 분석물을 측정하기 위해 샘플을 농축하거나 희석해야 하는 요구사항을 제거한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약에 의해 결합된 각각의 제1 검출가능한 표지에 대해, 신호 증폭 시약은 다중 제2 검출가능한 표지를 제공 및/또는 동원하고 이에 의해 검정 신호를 증폭시킨다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 샘플에 낮은 농도(예를 들어, 1pg/mL 미만)로 존재하는 분석물을 검출할 수 있고 이에 의해 샘플 공급이 제한될 때(예를 들어, 대뇌 척수액 샘플, 유아로부터 생물학적 샘플 및/또는 마우스와 같은 작은 동물로부터 생물학적 샘플) 샘플을 희석할 수 있으며, 따라서 귀중한 샘플을 보존한다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 하나 이상의 검출가능한 표지, 예를 들어 ECL 표지(들)를 포함하거나; 또는 신호 증폭 시약은 하나 이상의 검출가능한 표지, 예를 들어 ECL 표지(들)의 결합을 동원하는 모이어티, 예를 들어 본 명세서에 기술된 결합 모이어티를 포함하거나 형성한다. 따라서, 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 신호 증폭 시약은 (1) (예를 들어, 본 명세서에 기술된 검출 시약 상의) 제1 검출가능한 표지를 특이적으로 인식하고 결합하고, (2) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 동원하여 검정 신호를 증폭시킬 수 있다. 신호 증폭 시약이 제1 및 제2 검출가능한 표지가 동일한 표지인 실시형태에서도 놀랍게도 높은 수준의 신호 증폭을 제공한다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 이러한 상황 하에서, 제2 검출가능한 표지는 신호 증폭 시약에 대해 제1 검출가능한 표지와 경쟁할 것으로 예상되며 즉, 제2 검출가능한 표지에 결합하는 신호 증폭 시약은 신호 증폭 시약이 제1 및 제2 검출가능한 표지 둘 모두에 대해 동일한 친화도를 갖기 때문에 제1 검출가능한 표지에 결합하지 않을 것이다. 제2 검출가능한 표지에 대한 신호 증폭 시약의 결합은 제2 검출가능한 표지가 검출되는 것을 방지하고, 또한 신호 증폭 시약이 표면 상에 복합체의 일부가 되는 것을 방지하고, 이에 의해 신호의 손실을 초래할 것으로 예상되었다. 따라서, 특히 제1 및 제2 검출가능한 표지가 동일한 표지인 실시형태에서 높은 수준의 신호 증폭은 예상치 못한 것이었다.
방법의 실시형태가 도 1a-1d에 예시되어 있다. 도 1a에서, 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 포획 시약은 표면 상의 표적화제에 대한 포획 시약 상의 표적화제 상보체의 결합을 통해 표면에 고정화된다. 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약을 제1 복합체에 첨가하고, 이에 의해 도 1b에 도시된 바와 같이 포획 시약, 분석물, 검출 시약 및 신호 증폭 시약을 포함하는 제2 복합체가 형성된다. 실시형태에서, 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하고 이에 의해 다중 신호 증폭 시약이 도 1a, 1c 및 1d에 도시된 바와 같이 동일한 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 실시형태에서, 연장된 서열은 도 1b 및 1c에 도시된 바와 같이 검출 시약에 결합된 각각의 신호 증폭 시약으로부터 형성된다. 실시형태에서, 각각 핵산 프로브를 포함하는 2개의 신호 증폭 시약은 검출 시약 상의 2개의 제1 검출가능한 표지에 결합한다. 실시형태에서, 2개의 주형 올리고뉴클레오티드는 2개의 핵산 프로브에 혼성화되며, 예를 들어 여기서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 도 1d에 도시된 바와 같이 두 핵산 프로브 모두에 혼성화한다. 실시형태에서, 2개의 주형 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 결찰을 통해 원형 주형을 형성하고, 핵산 프로브 중 하나 또는 둘 모두는 연장되어 연장된 서열을 형성한다. 실시형태에서, 연장된 서열은 표면 상의 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 제1 복합체의 형성 전, 동안, 또는 후에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 각각의 연장된 서열은 다중 표지된 프로브에 결합하며(예를 들어, 도 1c에 도시된 바와 같음), 이들 각각은 다중 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 따라서, 실시형태에서, 각각의 제1 검출가능한 표지는 다중 제2 검출가능한 표지에 상응하고, 이에 의해 측정을 위한 신호를 증폭시킨다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다.
방법의 추가 실시형태가 도 2에 도시되어 있다. 도 2에서, 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. (1) 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약 및 (2) 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티 둘 모두가 제1 복합체에 첨가된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티는 제1 복합체와 동시적으로 접촉된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티는 제1 복합체와 순차적으로 접촉된다. 실시형태에서, 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하여, 다중 신호 증폭 시약이 동일한 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 따라서, 도 2에 도시된 바와 같이, 실시형태에서, 검출 시약 상의 각각의 제1 검출가능한 표지는 검출가능한 모이어티 상의 다중 제2 검출가능한 표지에 상응하고, 이에 의해 측정을 위한 신호를 증폭시킨다. 방법의 구성성분은 본 명세서에 추가로 기술된다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다.
방법의 추가 실시형태가 도 1에 도시되어 있다. 도 3에서, 포획 시약, 분석물, 및 다중 제1 검출가능한 표지를 갖는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성되어 있다. 포획 시약은 표면 상의 표적화제에 대한 포획 시약 상의 표적화제 상보체의 결합을 통해 표면에 고정화된다. (1) 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약 및 (2) 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 올리고뉴클레오티드 검출가능한 모이어티 둘 모두가 제1 복합체에 첨가된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티는 제1 복합체와 동시적으로 접촉된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티는 제1 복합체와 순차적으로 접촉된다. 실시형태에서, 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 이에 의해 다중 신호 증폭 시약이 동일한 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 검출가능한 모이어티는 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티에 결합한다. 따라서, 도 3에 도시된 바와 같이, 실시형태에서, 검출 시약 상의 각각의 제1 검출가능한 표지는 검출가능한 모이어티 상의 다중 제2 검출가능한 표지에 상응하고, 이에 의해 측정을 위한 신호를 증폭시킨다. 방법의 구성성분은 본 명세서에 추가로 기술된다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다.
방법의 추가 실시형태가 도 4에 도시되어 있다. 도 4에서, 포획시약, 분석물, 및 검출시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 복수의 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티가 혼합되며, 여기서 각각의 검출가능한 모이어티는 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하고, 각각의 검출가능한 모이어티는 다중 결합 모이어티에 결합할 수 있고, 이에 의해 복수의 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티를 포함하는 신호 증폭 복합체를 형성할 수 있다. 실시형태에서, 제1 복합체와 신호 증폭 복합체는 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체와 신호 증폭 복합체는 순차적으로 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 형성되고, 신호 증폭 복합체는 별도의 용기 또는 별도의 반응 용기에 형성된다. 그런 다음 신호 증폭 복합체가 제1 복합체에 추가된다. 실시형태에서, 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 이에 의해 신호 증폭 복합체의 다중 신호 증폭 시약이 각각의 검출 시약에 결합할 수 있게 한다. 따라서, 도 4에 도시된 바와 같이, 검출 시약 상의 각각의 제1 검출가능한 표지는 검출가능한 모이어티 상의 다중 제2 검출가능한 표지에 상응하고, 이에 의해 측정을 위한 신호를 증폭시킨다. 방법의 구성성분은 본 명세서에 추가로 기술된다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다.
방법의 추가 실시형태는 표면 상에 제1 복합체의 형성을 포함하며, 제1 복합체는 포획 시약, 분석물, 및 제1 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약을 포함한다. 제1 핵산 프로브는 연장되어 제1 연장된 서열을 형성한다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 롤링 서클 증폭에 의해 연장된다. 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하는 복수의 제1 표지된 프로브는 제1 연장된 서열에 결합한다. (1) 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약 및 (2) 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티 중 하나 이상이 제1 복합체와 접촉된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티는 제1 복합체와 동시적으로 접촉된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티는 제1 복합체와 순차적으로 접촉된다. 실시형태에서, 제1 연장된 서열에 결합된 각각의 제1 표지된 프로브는 신호 증폭 시약에 결합한다. 따라서, 각각의 제1 검출가능한 표지는 검출가능한 모이어티 상의 다중 제2 검출가능한 표지에 상응하고, 이에 의해 측정을 위한 신호를 증폭시킨다. 방법의 구성성분은 본 명세서에 추가로 기술된다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다.
방법의 추가 실시형태가 도 15에 예시되어 있다. 도 15에서, 포획 시약, 분석물, 및 제1 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. 제1 핵산 프로브는 연장되어 제1 연장된 서열을 형성한다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 롤링 서클 증폭에 의해 연장된다. 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하는 복수의 제1 표지된 프로브는 제1 연장된 서열에 결합한다. 각각 제2 핵산 프로브를 포함하는 다중 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 결합한다. 각각의 제2 핵산 프로브는 연장되어 제2 연장된 서열을 형성한다. 실시형태에서, 제2 핵산 프로브는 롤링 서클 증폭에 의해 연장된다. 각각 제2 검출가능한 표지를 포함하는 하나 이상의 제2 표지된 프로브는 제2 연장된 서열에 결합한다. 따라서, 도 15에 도시된 바와 같이, 각각의 제1 검출가능한 표지는 제2 검출가능한 표지를 포함하는 다중 제2 표지된 프로브에 결합할 수 있는 제2 연장된 서열에 상응하고, 이에 의해 측정을 위한 신호를 증폭시킨다. 방법의 구성성분은 본 명세서에 추가로 기술된다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다.
방법의 추가 실시형태가 도 17에 예시되어 있다. 도 17에서, 포획 시약, 분석물, 및 제1 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체가 표면 상에 형성된다. (1) 효소를 포함하는 신호 증폭 시약 및 (2) 효소의 기질 둘 모두가 제1 복합체에 첨가된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약 및 효소 기질은 제1 복합체와 동시적으로 접촉된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약 및 효소 기질은 제1 복합체와 순차적으로 접촉된다. 실시형태에서, 효소는 기질에 작용하여 검출가능한 신호를 생성한다. 실시형태에서, 방법은 검출가능한 신호를 검출하는 것을 포함한다. 방법의 구성성분은 본 명세서에 추가로 기술된다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다.
방법의 추가 실시형태가 도 22a-22d에 예시된다. 각각의 도 22a-22d에서, 복합체는 포획 시약("CR"), 분석물, 제1 검출가능한 표지("1ST 표지")를 포함하는 제1 검출 시약("1ST DR"), 및 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제2 검출 시약("2ND DR"), 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 동시적으로 결합하는 신호 증폭 시약("SAR")을 포함한다. 실시형태에서, 2개의 제1 검출가능한 표지에 대한 신호 증폭 시약의 결합은 분석물에 대한 제1 및 제2 검출 시약의 결합을 안정화시킨다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 2개의 검출 시약 사이의 테더로 작용하고 분석물에 대한 2개의 검출 시약의 결합을 유지한다. 예를 들어, 2개의 검출 시약 중 하나가 분석물에서 해리되지만 신호 증폭 시약에 결합된 상태로 남아 있는 경우, 해리된 검출 시약은 재결합을 촉진하기 위해 분석물의 근처에 유지된다. 따라서, 신호 증폭 시약은 검출을 위한 복합체를 안정화시킴에 의해 검정 신호를 증폭시킨다.
도 22a에서, 신호 증폭 시약은 임의의 다른 구성성분 없이 묘사된다. 도 22a에 표지된 바와 같은 구성성분은 도 22b-22d에 대한 것과 동일하다. 도 22b에서, 신호 증폭 시약은 결합 모이어티의 결합 파트너를 포함하는 검출가능한 모이어티에 결합하는 결합 모이어티 및 본 명세서에 기술된 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 도 22c에서, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 도 22d에서, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같이 주형 올리고뉴클레오티드를 통해 연장되어 제2 검출가능한 표지를 포함하는 하나 이상의 표지된 프로브에 결합하는 연장된 서열을 형성하는 핵산 프로브를 포함한다. 따라서, 도 22b-22d에서, 신호 증폭 시약은 2-배수 방식으로, 즉 본 명세서에 기술된 바와 같이 복합체를 안정화시키고 본 명세서에 기술된 바와 같이 제2 검출가능한 표지를 통해 추가로 검출가능한 신호를 제공함에 의해 검정 신호를 증폭시킨다.
검정 구성성분 및 방법
실시형태에서, 발명은 다음을 포함하는 방법을 제공한다: (a) ECL 표지를 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서:
신호 증폭 시약은 결합 모이어티를 포함하고, 방법은 ECL 표지를 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하거나; 또는
신호 증폭 시약은 효소를 포함하고, 방법은 ECL 표지를 효소의 기질과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하거나; 또는
신호 증폭 시약은 선택적으로 제2 검출가능한 표지를 포함하거나; 또는
신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함하고, 방법은 핵산 프로브를 연장하여 연장된 서열을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 단계,
(b) 검출가능한 모이어티, 효소 활성, 제2 검출가능한 표지 또는 연장된 서열을 검출하고, 이에 의해 ECL 표지를 검출하는 단계. 실시형태에서, ECL 표지는 표면 상에 존재한다. 실시형태에서, ECL 표지는 단계(a)에서의 표면 상에 존재한다. 실시형태에서, ECL 표지는 단계(b)에서의 표면 상에 존재한다. 실시형태에서, ECL 표지는 그 위에 고정화된 앵커링 시약을 포함하는 표면 상에 존재한다.
실시형태에서, 발명은 다음을 포함하는, 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) (A) 제1 검출가능한 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) (1) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (2) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 단계; 및 (b) 표면 상의 (I) 제2 검출가능한 표지 또는 (II) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(c) (A) 제1 검출가능한 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) 효소의 기질과 접촉시키는 단계; 및 (d) 효소 활성을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(e) (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지인, 표지, 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 선택적으로 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계; 및 (f) (I) 제1 검출가능한 표지; (II) 제2 검출가능한 표지; 또는 (III) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(g) (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지인, 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함하고, 이에 의해 제1 복합체와 신호 증폭 시약을 포함하는 제2 복합체를 형성하는, 단계; (h) 핵산 프로브를 연장하여 연장된 서열을 형성하는 단계; 및 (i) 연장된 서열의 양을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 있다. 실시형태에서, 제1 복합체는 관심있는 분석물; 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약으로서, 여기서 포획 시약은 표면 상에 고정화되거나 포획 시약은 표면에 대해 고정화될 수 있는, 시약; 및 분석물에 특이적으로 결합하고 제1 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약을 포함한다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함하고, 표면은 그 위에 고정화된 앵커링 시약을 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함하고, 방법은 표면 상에 앵커링 시약을 고정화하는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 방법의 단계 (h) 이전에 또는 동안에 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 연장된 서열의 앵커링 영역에 결합하고, 측정하는 것은 앵커링 시약을 통해 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체는 관심있는 분석물; 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약으로서, 여기서 포획 시약은 표면 상에 고정화되거나 포획 시약은 표면에 대해 고정화될 수 있는, 시약; 및 분석물에 특이적으로 결합하고 제1 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약을 포함한다.
실시형태에서, 발명은 다음을 포함하는, 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법을 제공한다: (a) 관심있는 분석물; 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약으로서, 여기서 포획 시약은 표면 상에 고정화되거나 포획 시약은 표면에 대해 고정화될 수 있는, 시약; 및 분석물에 특이적으로 결합하고 제1 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체를 표면 상에 형성하는 단계; (b) 제1 핵산 프로브를 연장시켜 제1 앵커링 영역을 포함하는 제1 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 여기서, 제1 앵커링 영역은 표면 상에 고정화된 제1 앵커링 시약에 결합하는, 단계; (c) 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1의 표지된 프로브에 제1 연장된 서열을 결합하는 단계; 및:
(d) 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를, (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) (1) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (2) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 단계; 및 (e) (I) 제2 검출가능한 표지 또는 (II) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(f) 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를, (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) 효소의 기질과 접촉시키는 단계; (g) 효소 활성을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(h) 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 선택적으로 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계; (i) (I) 제1 검출가능한 표지; (II) 제2 검출가능한 표지; 또는 (III) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
(j) 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 신호 증폭 시약은 제2 핵산 프로브를 포함하고, 이에 의해 신호 증폭 시약 및 제1 표지된 프로브를 포함하는 제2 복합체를 형성하는, 단계; (k) 제2 핵산 프로브를 연장시켜 제2 앵커링 영역을 포함하는 제2 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 여기서, 제2 앵커링 영역은 표면 상에 고정화된 제2 앵커링 시약에 결합하는, 단계; 및; (l) (I) 제2 연장된 서열 또는 (II) 제1 연장된 서열과 제2 연장된 서열이 표면에 결합된 양을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다.
포획 시약
실시형태에서, 포획 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 합텐, 에피토프, 미모토프 또는 압타머를 포함한다. 실시형태에서, 포획 시약은 항체 또는 이의 항원/에피토프-결합 부분을 포함한 이의 변이체, 항체 단편 또는 유도체, 항체 유사체, 조작된 항체, 또는 항체에 대해 유사한 방식으로 항원에 결합하는 물질을 포함한다. 실시형태에서, 포획 시약은 항체의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 실시형태에서, 포획 시약은 하나 이상의 항체로부터의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 실시형태에서, 포획 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 포획 시약은 분석물에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에 사용된 "특이적으로 결합한다"는 시약(예를 들어, 포획 시약)이 무작위적이고 관련되지 않은 물질에 비해 그의 결합 파트너(예를 들어, 분석물의 에피토프)에 우선적으로 결합한다는 것을 의미한다. 실시형태에서, 포획 시약은 분석물의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 포획 시약은 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상에 고정화될 수 있다. 포획 시약을 표면에 고정화하는 방법이 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 포획 시약은 티오에스테르, 티오에테르, 디설파이드, 또는 이의 조합을 통해 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 본 명세서에 기술된 표적화제를 통해 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 본 명세서에 기술된 제1 복합체의 형성 전, 동안 또는 후에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 방법의 단계 (a) 전에 표면에 고정화된다.
검출 시약
실시형태에서, 검출 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 합텐, 에피토프, 미모토프 또는 압타머를 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 항체 또는 이의 항원/에피토프-결합 부분을 포함한 이의 변이체, 항체 단편 또는 유도체, 항체 유사체, 조작된 항체, 또는 항체에 대해 유사한 방식으로 항원에 결합하는 물질을 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 항체의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 하나 이상의 항체로부터의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 검출 시약은 분석물에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 검출 시약은 분석물의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 포획 시약과 다른 분석물의 에피토프에 결합한다.
실시형태에서, 제1 복합체는 하나 초과의 검출 시약을 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체는 적어도 2개의 검출 시약을 포함한다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 제1 복합체의 검출 시약은 제1 검출 시약이고, 제1 복합체는 제2 검출 시약을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출 시약과 제2 검출 시약은 각각 분석물에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 제1 검출 시약과 제2 검출 시약은 분석물의 동일한 에피토프에 결합한다. 실시형태에서, 분석물은 제1 및 제2 검출 시약에 결합하기 위한 에피토프의 다중 카피를 포함하여, 제1 및 제2 검출 시약은 분석물 상의 에피토프의 별도의 카피에 동시적으로 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약은 분석물의 상이한 에피토프에 결합한다. 실시형태에서, 각각의 포획 시약과 제1 및 제2 검출 시약은 분석물 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 실시형태에서, 포획 시약은 분석물 상의 제1 에피토프에 결합하고, 제1 및 제2 검출 시약 각각은 분석물 상의 제2 에피토프에 결합한다. 실시형태에서, 분석물은 제2 에피토프의 다중 카피를 포함하여, 제1 및 제2 검출 시약은 분석물 상의 제2 에피토프의 별도의 카피에 동시적으로 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제1 복합체는 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하며, 여기서 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 결합되어 있다.
실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약은 각각 독립적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 합텐, 에피토프, 미모토프 또는 압타머를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약 각각은 항체 또는 이의 항원/에피토프-결합 부분을 포함하는 이의 변이체, 항체 단편 또는 유도체, 항체 유사체, 조작된 항체, 또는 항체에 대해 유사한 방식으로 항원에 결합하는 물질을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약 각각은 항체의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약 각각은 하나 이상의 항체로부터의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약 각각은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
제1 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약
실시형태에서, 검출 시약은 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 제1 복합체가 제1 및 제2 검출 시약을 포함하는 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약 각각은 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약 각각은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체의 검출 시약, 또는 제1 복합체의 제1 및 제2 검출 시약 각각은 적어도 2개의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학 발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 검출될 수 있다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함한다.
실시형태에서, ECL 표지는 전기화학발광 유기금속 복합체를 포함한다. 실시형태에서, 전기화학발광 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴, 이리듐, 레늄 및/또는 란탄족 금속을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 루테늄을 포함한다. 실시형태에서, 전기화학발광 유기금속 복합체는 치환된 또는 비치환된 바이피리딘 또는 치환된 또는 비치환된 페난트롤린을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 치환된 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 설포네이트 기를 포함하는 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다:
(I).
실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 검출 시약에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 제3 리간드는 검출 시약에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환기를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴 또는 레늄을 포함한다.
예시적인 ECL 표지는 US 5,714,089; US 6,136,268; US 6,316,607; US 6,468,741; US 6,479,233; US 6,808,939; 및 US 9,499,573에서 찾아볼 수 있다.
실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 II의 화합물이다:
(II).
실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 III의 화합물이다:
(III).
실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물이다:
(IV).
실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 V의 화합물이다:
(V), 여기서 각각의 X는 인산염, 탄산염, 붕산염, 또는 이의 조합을 포함함.
실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물이다:
(VI).
실시형태에서, 검출 시약(예를 들어, 본 명세서에 기술된 제1 및/또는 제2 검출 시약)은 접합 링커를 통해 제1 검출가능한 표지에 공유원자가로 연결된다. 실시형태에서, 접합 링커는 아미드, 티오에스테르, 티오에테르, 디설파이드, 이민, 트리아졸, 디하이드로피리다진, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 친수성 중합체, 또는 이의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 접합 링커의 아미드는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르와 아민 사이의 반응으로부터 생성된다. 실시형태에서, 접합 링커의 티오에스테르는 NHS 에스테르와 티올(설프히드릴로도 지칭됨) 사이의 반응으로부터 생성된다. 실시형태에서, 접합 링커의 티오에테르는 말레이미드 또는 알켄과 티올 사이의 반응으로부터 생성된다. 실시형태에서, 접합 링커의 디설파이드는 디설파이드와 티올 사이의 반응으로부터 생성된다. 실시형태에서, 접합 링커의 이민은 알데히드 또는 케톤과 아민 사이의 반응으로부터 생성된다. 실시형태에서, 접합 링커의 트리아졸은 알킨 또는 사이클로알킨과 아지드 사이의 반응으로부터 생성된다. 실시형태에서, 접합 링커의 디하이드로피리다진은 트랜스-사이클로옥텐과 테트라진 사이의 반응으로부터 생성된다.
실시형태에서, 접합 링커는, 예를 들어 검출 시약과 제1 검출가능한 표지 사이의 거리 및/또는 이동 유연성을 증가시키기 위해 스페이서를 포함한다. 실시형태에서, 접합 링커는 펩티드를 포함한다. 실시형태에서, 접합 링커는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 접합 링커는 친수성 중합체를 포함한다. 실시형태에서, 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
제1 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약
실시형태에서, 검출 시약은 제1 핵산 프로브를 포함한다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 연장되어 제1 연장된 서열을 형성할 수 있다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 추가 올리고뉴클레오티드에 결찰되어 제1 연장된 서열을 형성할 수 있다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 추가 올리고뉴클레오티드에 결찰될 수 있으며, 여기서 추가 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 제1 핵산 프로브에 상보적인 서열을 포함하여 제1 연장된 서열을 형성한다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 주형 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 연장 반응을 위한 프라이머이다. 실시형태에서, 연장 반응은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 자가-지속된 합성 반응(3SR), 등온 증폭(예컨대, 예를 들어, 헬리카제-의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭) 또는 이의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 주형 올리고뉴클레오티드에 결합하고 PCR, LCR, SDA, 3SR, 등온 증폭(예컨대, 예를 들어, 헬리카제-의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭) 또는 이의 조합에 의해 연장되어 제1 연장된 서열을 형성한다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 주형 올리고뉴클레오티드에 결합하고 PCR에 의해 연장되어 제1 연장된 서열을 형성한다. 실시형태에서, 제1 핵산 프로브는 주형 올리고뉴클레오티드에 결합하고, (예를 들어, 선형 주형 올리고뉴클레오티드의 결찰에 의해) 원형 주형 올리고뉴클레오티드를 형성하고, 롤링 서클 증폭에 의해 연장되어 제1 연장된 서열을 형성한다. 제1 복합체가 제1 및 제2 검출 시약을 포함하는 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약 각각은 근접 핵산 프로브를 포함하며, 여기서 근접 핵산 프로브 중 하나 또는 둘 모두는 연장되어 2개의 근접 핵산 프로브가 근접해 있을 때에만 제1 연장된 서열을 형성할 수 있다.
실시형태에서, 제1 연장된 서열은 제1 앵커링 영역을 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 영역은 표면 상의 제1 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 본 명세서에 기술된 제1 복합체를 형성하기 전, 동안, 또는 후에 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 본 명세서에 기술된 방법의 단계 (a) 전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 제1 연장된 서열을 형성하기 이전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 티오에스테르, 티오에테르, 디설파이드, 또는 이의 조합을 통해 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같이 표적화제를 통해 표면에 고정화된다.
실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 올리고뉴클레오티드, 압타머, 압타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 합텐, 에피토프 또는 미모토프를 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 압타머 리간드를 포함하고, 제1 앵커링 영역은 압타머를 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 올리고뉴클레오티드-결합 단백질을 포함하고, 제1 앵커링 영역은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약과 제1 앵커링 영역은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약은 앵커링 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 영역은 앵커링 올리고뉴클레오티드에 상보적인 앵커링 올리고뉴클레오티드 상보체를 포함한다.
실시형태에서, 제1 연장된 서열을 제1 앵커링 시약에 결합하는 것은 제1 앵커링 시약과 제1 앵커링 영역 사이에 삼중 나선을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 연장된 서열을 제1 앵커링 시약에 결합하는 것은 결합 이전에 제1 앵커링 영역을 변성시켜 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 영역을 노출시키는 단계; 결합 이전에 제1 앵커링 영역을 헬리카제 활성에 노출시키는 단계; 및/또는 결합 이전에 제1 앵커링 영역을 뉴클레아제 처리에 노출시키는 단계를 포함하며, 여기서 제1 앵커링 영역은 하나 이상의 합텐-변형된 염기를 포함하고, 제1 앵커링 시약은 합텐에 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하고; 및/또는 제1 앵커링 영역은 하나 이상의 리간드-변형된 염기를 포함하고 제1 앵커링 시약은 리간드에 특이적인 하나 이상의 수용체를 포함한다.
실시형태에서, 포획 시약, 분석물 및 검출 시약(또는 제1 및 제2 검출 시약)을 포함하는 제1 복합체는 제1 핵산 프로브의 신장에 이어서 표면에 결합된다. 실시형태에서, 제1 연장된 서열은 표면 상의 제1 복합체로부터 약 1nm 내지 약 500nm, 약 5nm 내지 약 250nm, 약 10nm 내지 약 200nm, 또는 약 15nm 내지 약 150nm 내의 위치에서 제1 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 제1 연장된 서열은 표면 상의 제1 복합체로부터 1μm 미만의 위치에서 제1 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 제1 연장된 서열은 표면 상의 제1 복합체로부터 500nm 미만의 위치에서 제1 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 제1 연장된 서열은 표면 상의 제1 복합체로부터 200nm 미만의 위치에서 제1 앵커링 시약에 결합한다.
실시형태에서, 방법은 제1 핵산 프로브의 연장 및/또는 제1 연장된 서열의 제1 앵커링 시약에의 결합에 이어서, 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 표지된 프로브에 제1 연장된 서열을 결합시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 연장된 서열 및 제1 표지된 프로브는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 하나 초과의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 접합 링커를 통해 제1 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된다.
제1 검출가능한 표지가 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 검출될 수 있다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 제1 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체을 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 여기서 제3 리간드는 제1 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴 또는 레늄을 포함한다.
실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함한다.
신호 증폭 시약
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 합텐, 에피토프, 미모토프 또는 압타머를 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 항체 또는 이의 항원/에피토프-결합 모이어티를 포함한 이의 변이체, 항체 단편 또는 유도체, 항체 유사체, 조작된 항체, 또는 항체에 대해 유사한 방식으로 항원에 결합하는 물질을 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 항체의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 하나 이상의 항체로부터의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG2a, IgG2b 또는 IgG2c 서브클래스 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스, 랫트, 염소, 토끼, 닭, 기니피그, 햄스터, 말 또는 양으로부터 유래된다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스로부터 유래된다. 항체 및 항원-결합 단편은 본 명세서에 추가로 기술되어 있다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 적어도 2개의 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합할 수 있다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 항원 결합 도메인은 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은, 예를 들어 도 22a에 묘사된 바와 같이, 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 결합할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제1 및 제2 검출 시약 상의 적어도 2개의 검출가능한 표지에 결합할 수 있는 신호 증폭 시약은 분석물에 대한 검출 시약의 결합을 안정화시키고, 이에 의해 분석물을 검출하기 위한 검정 신호를 증폭시킨다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약에 의해 결합된 적어도 2개의 제1 검출가능한 표지는 동일한 구조를 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약에 의해 결합된 적어도 2개의 제1 검출가능한 표지는 상이한 구조를 포함한다.
제1 검출가능한 표지가 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 ECL 표지이다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 2개의 제1 검출가능한 표지에 결합하며, 여기서 신호 증폭 시약에 의해 결합된 각각의 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같은 ECL 표지이다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 리간드 중 적어도 하나는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 하나는 리간드 중 하나는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 식 II의 화합물에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 식 IV의 화합물에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 식 VI의 화합물에 특이적으로 결합한다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 2개의 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하며, 여기서 2개의 제1 검출가능한 표지는 동일한 구조를 포함하며, 예를 들어 각각의 제1 검출가능한 표지는 식 II, III, IV, V 또는 VI의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 2개의 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하며, 여기서 2개의 제1 검출가능한 표지는 상이한 구조를 포함하며, 예를 들어 2개의 제1 검출가능한 표지 각각은, 2개의 제1 검출가능한 표지가 동일한 화합물을 포함하지 않는다면 식 II, III, IV, V 또는 VI의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 각각의 제1 검출가능한 표지는 독립적으로 식 II, III, IV, V 또는 VI의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 각각의 제1 검출가능한 표지는 독립적으로 식 II, IV 또는 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 검출 시약(예를 들어, 제1 및/또는 제2 검출 시약) 또는 제1 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지 및 접합 링커에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지 및 접합 링커에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 접합되지 않은 제1 검출가능한 표지에 결합하지 않는다(즉, 검출 시약 또는 제1 표지된 프로브에 부착되지 않음). 접합되지 않은 제1 검출가능한 표지는, 예를 들어 제1 검출가능한 표지를 검출 시약 또는 제1 표지된 프로브에 부착하기 위한 접합 반응으로부터 검정 혼합물에 존재할 수 있다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지 및 접합 링커에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 활용하는 방법은 제1 검출가능한 표지에 단독으로 결합하는 신호 증폭 시약을 활용하는 방법에 비해 개선된 특이성을 갖는다.
실시형태에서, 접합 링커는 아미드, 티오에스테르, 티오에테르, 디설파이드, 이민, 트리아졸, 디하이드로피리다진, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 친수성 중합체, 또는 이의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 아미드에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 티오에스테르에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 티오에테르에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 디설파이드에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 이민에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 트리아졸에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 디하이드로피리다진에 특이적으로 결합한다.
실시형태에서, 접합 링커는 스페이서(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 친수성 중합체)를 포함하고, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지 및 접합 링커의 적어도 일부의 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 친수성 중합체에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 접합 링커의 적어도 일부의 펩티드에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 접합 링커의 적어도 일부의 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 접합 링커의 적어도 일부의 친수성 중합체에 특이적으로 결합한다.
놀랍게도 항체 신호 증폭 시약이 설폰화된 ECL 표지를 포함하여 본 명세서에 기술된 ECL 표지에 대해 높은 특이성을 갖는다는 것이 추가로 발견되었다. 대부분의 항체는 특이성을 위해 소수성 패치를 필요로 하므로 설포네이트기는 비-설폰화된 표지에 비해 면역원성이 덜할 것으로 예상되었다.
I. 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 복합체의 신호 증폭
실시형태에서, 발명은 (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지인, 표지, 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, 신호 증폭 시약과 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 제1 복합체는 관심있는 분석물, 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약, 및 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약을 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 제1 검출 시약이고, 제1 복합체는 분석물에 특이적으로 결합하고 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제2 검출 시약을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 있다. 실시형태에서, 제1 복합체는 분석물, 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약, 및 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약을 포함한다. 실시형태에서, 방법은 접촉 이전에 제1 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체를 형성하는 것을 관심있는 분석물을 (i) 표면; (ii) 포획 시약; 및 (iii) 검출 시약과 접촉시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체를 형성하는 것은 샘플을 (i) 표면; (ii) 포획 시약; 및 (iii) 검출 시약과 접촉시키는 것을 포함한다.
실시형태에서, 제1 복합체는 관심있는 분석물, 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약, 분석물에 특이적으로 결합하는 제1 검출 시약, 및 분석물에 특이적으로 결합하는 제2 검출 시약을 포함하며, 여기서 각각의 제1 및 제2 검출 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 방법은 접촉 이전에 제1 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체를 형성하는 것을 관심있는 분석물을 (i) 표면; (ii) 포획 시약; (iii) 제1 검출 시약; 및 (iv) 제2 검출 시약과 접촉시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체를 형성하는 것은 샘플을 (i) 표면; (ii) 포획 시약; (iii) 제 1검출 시약; 및 (iv) 제2 검출 시약과 접촉시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체는 분석물을 포획 시약과, 제1 및 제2 검출 시약과 임의의 순서로 접촉시킴에 의해 형성된다.
실시형태에서, 포획 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같이 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상에 고정화될 수 있다. 실시형태에서, 방법은 제1 복합체의 형성 전, 동안, 또는 후에 포획 시약을 표면에 고정화하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 방법은 방법의 단계 (a) 이전에 포획 시약을 표면에 고정화하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 방법은 제1 복합체를 신호 증폭 시약과 접촉시키기 이전에 표면 상의 제1 복합체를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 검출은 예를 들어 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 제1 복합체가 제1 및 제2 검출 시약을 포함하는 실시형태에서, 검출하는 것은 제1 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 제1 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 검출 시약은 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 다중 신호 증폭 시약은 검출 시약에 결합하며, 여기서 각각의 신호 증폭 시약은 검출 시약 상의 별도의 제1 검출가능한 표지에 결합한다.
실시형태에서, 제1 복합체는 제1 및 제2 검출 시약을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 검출 시약 각각은 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 신호 증폭 시약은 예를 들어, 도 22a-22d에 도시된 바와 같이, 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 동시적으로 결합할 수 있다.
I.A. 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약
실시형태에서, 포획 시약, 분석물, 및 제1 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체는 (1) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (2) 검출가능한 모이어티와 접촉되며, 여기서 검출가능한 모이어티는 (i) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (ii) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체는 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 및 제2 검출 시약을 포함하고, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술되고 도 22b에 묘사된 바와 같이, 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합한다.
실시형태에서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 검출가능한 모이어티는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티 및 검출가능한 모이어티는 수용체-리간드 쌍, 항원-항체 쌍, 합텐-항체 쌍, 에피토프-항체 쌍, 미모토프-항체 쌍, 압타머-표적 분자 쌍, 또는 인터칼레이터-표적 분자 쌍을 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 대해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 결합 부위를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티에 대해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 하나의 스트렙타비딘은 4개의 비오틴 분자를 결합할 수 있다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 비오틴을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 비오틴을 포함한다.
실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 하나 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다.
실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 검출될 수 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 검출가능한 모이어티에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 여기서 제3 리간드는 검출가능한 모이어티에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴 또는 레늄을 포함한다.
실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 검출 시약(예를 들어, 제1 및/또는 제2 검출 시약)의 제1 검출가능한 표지와 검출가능한 모이어티의 제2 검출가능한 표지는 동일하다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 본 명세서에 기술된 바와 같은 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 상이하다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 일단 신호 증폭 시약에 의해 결합되면 검출가능하지 않다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고, 제2 검출가능한 표지에는 결합하지 않는다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 III, IV, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, IV, V, 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 V 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다. 본 명세서에 사용된, "검출가능하게 구별되는" 2개의 종은 2개의 종을 검출하기 위해 상이한 검출 방법 또는 매개변수가 사용된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 형광 종은 화학발광 또는 전기화학발광 종과 검출가능하게 구별된다. 추가 예에서, 전기화학발광 종은 발색 종과 검출가능하게 구별된다. 또 다른 예에서, 상이한 비-중첩하는 여기 및/또는 방출 파장을 갖는 2개의 형광 종은 검출가능하게 구별된다. 실시형태에서, 예를 들어 신호 증폭 시약에 의해 결합된 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지의 존재는 제2 검출가능한 표지의 검출을 방해하지 않는다.
실시형태에서, 제1 복합체는 먼저 신호 증폭 시약과 접촉된 다음, 검출가능한 모이어티와 접촉된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티와 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 접촉된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "동시의"는 하나 이상의 사건(예를 들어, 제1 결합 복합체를 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 것)과 관련하여 사건이 정확하게 동시에 또는 실질적으로 동시에 발생함을 의미하며, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 동시 사건은 약 10분 이하의 간격, 약 5분 이하의 간격, 약 2분 이하의 간격, 약 1분 이하의 간격, 약 30초 이하의 간격, 약 15초 이하 간격, 또는 약 5초 이하 간격으로 발생할 수 있다.
실시형태에서, 접촉시키는 것은 (i) 신호 증폭 시약과 검출가능한 모이어티를 포함하는 신호 증폭 복합체를 형성하는 것; (ii) 제1 복합체를 신호 증폭 복합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함하고/하거나 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함하고, 신호 증폭 복합체는 복수의 신호 증폭 시약을 포함하고, 여기서 각각의 신호 증폭 시약은 하나 이상의 검출가능한 모이어티에 결합된다. 실시형태에서, 제1 복합체와 신호 증폭 복합체는 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체와 신호 증폭 복합체는 순차적으로 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 형성되고, 신호 증폭 복합체는 별도의 반응 용기 또는 용기에 형성된다.
결합 모이어티가 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하고 검출가능한 모이어티가 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티에 대한 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 실시형태에서, 방법은 검출가능한 모이어티에 결합하기 이전에 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티의 길이를 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티의 길이를 증가시키는 것은 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티를 추가 올리고뉴클레오티드에 결찰시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티의 길이를 증가시키는 것은 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티를 추가 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 것을 포함하며, 여기서 추가 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티에 대한 상보적인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 추가 올리고뉴클레오티드는 표지된 프로브에 대해 하나 초과의 상보적인 서열을 추가로 포함하고, 이에 의해 본 명세서의 실시형태에서 기술된 바와 같이, 검출가능한 모이어티의 하나 초과의 카피가 제2 복합체에 결합하고 검정 신호를 추가로 증폭시킬 수 있게 한다.
복수의 가교된 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티를 포함하는 신호 증폭 복합체의 예시적 실시형태로서, 각각의 검출가능한 모이어티가 다중 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 실시형태가 도 4에 예시되어 있다. 신호 증폭 복합체를 형성하는 것을 포함하고 제1 및 제2 검출가능한 표지가 동일한 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지 및 검출 시약의 접합 링커에 특이적으로 결합하고, 이에 의해 검출가능한 모이어티 상의 제2 검출가능한 표지에 대한 신호 증폭 시약의 결합을 감소시킨다. 신호 증폭 복합체를 형성하는 것을 포함하는 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 상이하고, 이에 의해 검출가능한 모이어티 상의 제2 검출가능한 표지에 대한 신호 증폭 시약의 결합을 감소시킨다.
실시형태에서, 방법은 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 검출가능하게 구별된다. 실시형태에서, 방법은 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 별도로 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 ECL 표지를 포함하고, 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
실시형태에서, 방법은 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
I.B. 효소를 포함하는 신호 증폭 시약
실시형태에서, 포획 시약, 분석물 및 검출 시약을 포함하는 제1 복합체는 (1) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (2) 효소의 기질과 접촉된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 및 제2 검출 시약을 포함하고, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같이 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합한다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 기질에 작용하는 효소를 포함한다. 실시형태에서, 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP), β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제(GO), 아세틸콜린에스테라제, 카탈라제 또는 β-락타마제이다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은, 예를 들어 도 17에 예시된 바와 같이 기질에 작용하는 효소를 포함한다. 실시형태에서, 효소는, 예를 들어 산화, 환원, 가수분해 또는 이의 조합을 통해 기질에 결합하고 기질에 작용하여 검출가능한 신호를 생성한다. 실시형태에서, 검출가능한 신호는 발색 신호, 화학발광, 형광, 또는 이의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 효소는 HRP, AP 또는 β-갈락토시다제이다. 실시형태에서, 효소는 HRP이고, 기질은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), 2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염(ABTS), 또는 o-페닐렌디아민 이염산염(OPD)이다. 실시형태에서, TMB는 HRP에 의한 산화 시 무색에서 청색으로 전환된다. 실시형태에서, ABTS는 HRP에 의한 산화 시 무색에서 녹색으로 전환된다. 실시형태에서, OPD는 HRP에 의한 산화 시 무색에서 황색-주황색으로 전환된다. 실시형태에서, 효소는 AP이고, 기질은 p-니트로페닐 포스페이트(PNPP)이다. 실시형태에서, PNPP는 AP에 의한 가수분해 시 무색에서 황색으로 전환된다. 실시형태에서, 효소는 β-갈락토시다제이고, 기질은 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(ONPG)이다. 실시형태에서, ONPG는 β-갈락토시다제에 의한 가수분해 시 무색에서 황색으로 전환된다. HRP에 대한 기질의 추가 비-제한적 예는 화학발광 기질 예컨대 SUPERSIGNAL™, 및 형광 기질 예컨대 QUANTABLU™, QUANTARED™ 및 AMPLEX™ Red를 포함한다. AP에 대한 기질의 추가 비-제한적인 예는 화학발광 기질 CDP™ 및 DYNALIGHT™을 포함한다. 본 명세서에 기술된 기질을 검출하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Crowther, J.R. "The ELISA Guidebook." Methods in Molecular Biology. Humana Press; Totowa, NJ (2001)에 의해 기술되어 있다.
실시형태에서, 방법은 효소의 활성을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 측정하는 것은 기질에 작용하는 효소에 대해 생성된 검출가능한 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 신호는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 기질은 TMBM, ABTS, OPD, PNPP 또는 ONPG이고 효소와 반응 시 발색 신호를 생성한다. 실시형태에서, 기질은 효소와 반응 시 형광성 신호를 생성한다. 실시형태에서, 기질은 효소와 반응 시 화학발광성 신호를 생성한다. 실시형태에서, 측정된 검출가능한 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 결정하는데 사용된다. 실시형태에서, 측정된 검출가능한 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
I.C. 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약
실시형태에서, 포획 시약, 분석물 및 검출 시약을 포함하는 제1 복합체는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 및 제2 검출 시약을 포함하고, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술되고 도 22c에 도시된 바와 같이 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합한다.
제2 검출가능한 표지가 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 검출될 수 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같은 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각의 식 I의 화합물이고, 여기서 제3 리간드는 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴 또는 레늄을 포함한다.
실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 검출 시약(예를 들어, 제1 및/또는 제2 검출 시약)의 제1 검출가능한 표지와 신호 증폭 시약의 제2 검출가능한 표지는 동일하다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 본 명세서에 기술된 바와 같은 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 상이하다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 일단 신호 증폭 시약에 의해 결합되면 검출가능하지 않다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고, 제2 검출가능한 표지에는 결합하지 않는다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 III, IV, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, IV, V, 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 V 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다.
실시형태에서, 방법은 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 검출가능하게 구별된다. 실시형태에서, 방법은 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 별도로 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 ECL 표지를 포함하고, 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
실시형태에서, 방법은 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
I.D. 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약
실시형태에서, 포획 시약, 분석물 및 검출 시약을 포함하는 제1 복합체는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 및 제2 검출 시약을 포함하고, 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술되어 있고 도 22d에 도시된 바와 같이 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 방법은 제1 복합체와 신호 증폭 시약을 포함하는 표면 상에 제2 복합체를 형성하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 제1 복합체는, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같이 제1 및 제2 검출 시약 상에 존재하거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 단일 검출 시약 상에 존재하는 적어도 2개의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 방법은 제1 복합체를 적어도 2개의 신호 증폭 시약과 접촉시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 제2 복합체의 신호 증폭 시약은 제1 신호 증폭 시약이고, 제2 복합체는 제2 신호 증폭 시약을 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2 신호 증폭 시약은 각각 하나 이상의 검출 시약 상에 존재하는 별개의 제1 검출가능한 표지에 결합한다. 실시형태에서, 제2 복합체는 적어도 2개의 신호 증폭 시약을 포함하며, 여기서 각각의 신호 증폭 시약은, 예를 들어 도 1c(검출 시약에 결합된 3개의 신호 증폭 시약을 나타냄) 및 도 1d(검출 시약에 결합된 2개의 신호 증폭 시약을 나타냄)에 도시된 바와 같이 핵산 프로브를 포함한다. 따라서, 실시형태에서, 제2 복합체는 하나 이상의 핵산 프로브를 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체의 각각의 핵산 프로브는 동일한 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체의 각각의 핵산 프로브는 동일한 서열로 구성된다. 실시형태에서, 제2 복합체의 각각의 핵산 프로브는 상이한 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체의 핵산 프로브 중 2개 이상은 동일한 서열을 포함한다.
실시형태에서, 방법은 핵산 프로브(예를 들어, 제2 복합체의 각각의 핵산 프로브)를 연장하여 연장된 서열을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 핵산 프로브(예를 들어, 제2 복합체의 각각의 핵산 프로브)를 추가 올리고뉴클레오티드에 결찰하여 연장된 서열을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 핵산 프로브(예를 들어, 제2 복합체의 각각의 핵산 프로브)를 추가 올리고뉴클레오티드에 혼성하여 연장된 서열을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 추가 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 핵산 프로브에 대한 상보적인 서열을 포함한다.
실시형태에서, 연장하는 것은 연장 반응을 위해 핵산 프로브(예를 들어, 제2 복합체의 각각의 핵산 프로브)를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시켜 연장된 서열을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체는 다중, 예를 들어 적어도 2개의 핵산 프로브를 포함하고, 연장하는 것은 각각의 핵산 프로브를 별개의 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고 각각의 핵산 프로브를 연장하여 다중, 예를 들어 적어도 2개의 연장된 서열을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체는 다중, 예를 들어 적어도 2개의 핵산 프로브를 포함하고, 연장하는 것은 2개의 핵산 프로브를 단일 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고 하나 또는 둘 모두의 핵산 프로브를 연장하여 연장된 서열을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체는 다중, 예를 들어 적어도 2개의 핵산 프로브를 포함하고, 연장하는 것은 2개의 핵산 프로브를 2개의 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고, 하나 또는 둘 모두의 핵산 프로브를 연장하여 연장된 서열을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 2개의 핵산 프로브의 각각의 일부에 결합한다.
실시형태에서, 핵산 프로브는 연장 반응을 위한 프라이머이다. 실시형태에서, 연장 반응은 PCR, LCR, SDA, 3SR, 등온 증폭(예컨대, 예를 들어, 헬리카제-의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭) 또는 이의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고 PCR, LCR, SDA, 3SR, 등온 증폭(예컨대, 예를 들어, 헬리카제-의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭) 또는 이의 조합에 의해 핵산 프로브를 연장하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고 PCR에 의해 핵산 프로브를 연장하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고, (예를 들어, 선형 주형 올리고뉴클레오티드의 결찰에 의해) 원형 주형 올리고뉴클레오티드를 형성하고, 롤링 서클 증폭에 의해 핵산 프로브를 연장하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 제2 복합체는 적어도 2개의 핵산 프로브를 포함하고, 연장하는 것은, 예를 들어 도 1c에 도시된 바와 같이, 각각의 핵산 프로브를 별개의 주형 올리고뉴클레오티드에 결합하는 것, 각각의 주형 올리고뉴클레오티드로부터 원형 주형을 형성하는 것, 및 RCA에 의해 각각의 핵산 프로브를 연장하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체는 2개의 핵산 프로브를 포함하고, 연장하는 것은, 예를 들어 도 1d에 도시된 바와 같이, 2개의 핵산 프로브를 2개의 주형 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것으로서, 여기서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 2개의 핵산 프로브의 각각의 일부에 동시적으로 결합하는 것; 2개의 주형 올리고뉴클레오티드를 결찰하여 원형 주형을 형성하는 것; 및 RCA에 의해 핵산 프로브 중 하나 또는 둘 모두를 연장시키는 것을 포함한다.
실시형태에서, 제2 복합체는 제1 및 제2 신호 증폭 시약을 포함하고, 제1 및 제2 신호 증폭 시약의 핵산 프로브는 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 실시형태에서, 제1 및 제2 신호 증폭 시약의 핵산 프로브는 상이한 서열을 포함한다. 제1 및 제2 신호 증폭 시약의 핵산 프로브가 상이한 서열을 포함하는 실시형태에서, 주형 올리고뉴클레오티드는 2개의 핵산 프로브가 근접해 있을 때 결찰될 수 있고, 이에 의해 분석물을 검출하는 방법의 특이성을 증가시킬 수 있다.
실시형태에서, 제2 복합체는 상이한 서열을 포함하는 적어도 2개의 핵산 프로브를 포함한다. 실시형태에서, 2개의 핵산 프로브는 주형 올리고뉴클레오티드의 인접한 영역에 결합한다. 실시형태에서, 주형 올리고뉴클레오티드는 2개의 핵산 프로브 중 제1의 것에 상보적인 내부 서열; 및 2개의 핵산 프로브 중 제2의 비-중첩하는 영역에 상보적인 5' 및 3' 서열을 포함한다. 실시형태에서, 2개의 핵산 프로브는 2개의 핵산 프로브 중 제1의 것 상의 제1 영역 및 2개의 핵산 프로브 중 제2의 것 상의 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 제1 주형 올리고뉴클레오티드; 및 2개의 핵산 프로브 중 제1의 것 상의 제2 영역 및 2개의 핵산 프로브 중 제2의 것 상의 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 제2 주형 올리고뉴클레오티드와 접촉되며, 여기서 각각의 핵산 프로브 상의 제1 영역 및 제2 영역은 비-중첩하고; 제1 및 제2 주형 올리고뉴클레오티드를 결찰하여 원형 주형을 형성하는 단계; 및 RCA에 의해 하나 또는 둘 모두의 핵산 프로브를 연장시켜 연장된 서열을 형성하는 단계로 된다.
실시형태에서, 연장된 서열은 앵커링 시약에 결합할 수 있는 앵커링 영역을 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 있고, 방법은 앵커링 시약을 표면 상에 고정화하는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 있고, 표면은 고정화된 앵커링 시약을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 티오에스테르, 티오에테르, 디설파이드 또는 이의 조합을 통해 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같이 표적화제를 통해 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 본 명세서에 기술된 제1 복합체의 형성 전, 동안 또는 후에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 방법의 단계 (a) 전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 연장된 서열을 형성하기 이전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 연장된 서열의 양을 측정하기 이전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 방법은 연장된 서열의 앵커링 영역을 앵커링 시약에 결합시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 측정하는 것은 앵커링 시약을 통해 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 앵커링 시약은 올리고뉴클레오티드, 압타머, 압타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 합텐, 에피토프 또는 미모토프를 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 압타머 리간드를 포함하고, 연장된 서열의 앵커링 영역은 압타머를 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 올리고뉴클레오티드-결합 단백질을 포함하고, 연장된 서열의 앵커링 영역은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약과 앵커링 영역은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 앵커링 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 연장된 서열의 앵커링 영역은 앵커링 올리고뉴클레오티드에 상보적인 앵커링 올리고뉴클레오티드 상보체를 포함한다.
실시형태에서, 연장된 서열을 앵커링 시약에 결합하는 것은 앵커링 시약과 연장된 서열의 앵커링 영역 사이에 삼중 나선을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 연장된 서열을 앵커링 시약에 결합하는 것은 앵커링 영역을 변성시켜 결합 이전에 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 영역을 노출시키는 단계; 결합 이전에 앵커링 영역을 헬리카제 활성에 노출시키는 단계; 및/또는 결합 이전에 앵커링 영역을 뉴클레아제 처리에 노출시키는 단계를 포함하며, 여기서 앵커링 영역은 하나 이상의 합텐-변형된 염기를 포함하고 앵커링 시약은 합텐에 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하고; 및/또는 앵커링 영역은 하나 이상의 리간드-변형된 염기를 포함하고 앵커링 시약은 리간드에 특이적인 하나 이상의 수용체를 포함한다.
실시형태에서, 제1 복합체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 분석물, 포획 시약, 검출 시약을 포함한다. 실시형태에서, 제1 복합체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 분석물, 포획 시약, 제1 검출 시약, 및 제2 검출 시약을 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체는 포획 시약, 분석물, 검출 시약 및 신호 증폭 시약을 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체는 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약, 제2 검출 시약 및 신호 증폭 시약을 포함한다. 실시형태에서, 제2 복합체는 표지된 프로브의 연장에 이어서 표면에 결합된다. 실시형태에서, 제2 복합체는 표지된 프로브와 접촉되기 이전에 표면에 결합된다. 실시형태에서, 연장된 서열은 표면 상의 제2 복합체로부터 약 1nm 내지 약 500nm, 약 5nm 내지 약 250nm, 약 10nm 내지 약 200nm, 또는 약 15nm 내지 약 150nm 내의 위치에서 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 연장된 서열은 표면 상의 제2 복합체로부터 1μm 미만의 위치에서 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 연장된 서열은 표면 상의 제2 복합체로부터 500nm 미만의 위치에서 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 연장된 서열은 표면 상의 제2 복합체로부터 200nm 미만의 위치에서 앵커링 시약에 결합한다.
실시형태에서, 연장된 서열의 양을 측정하는 것은 연장된 서열을 제2 검출가능한 표지를 포함하는 표지된 프로브와 접촉시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 표지된 프로브는 하나 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 표지된 프로브는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지를 포함하는 표지된 프로브는 연장된 서열에 결합한다. 실시형태에서, 연장된 서열 및 표지된 프로브는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 연장된 서열은 변형된 염기를 포함하고, 연장된 서열의 양을 측정하는 것은 연장된 서열을 변형된 염기에 결합하는 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 변형된 염기는 압타머, 압타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 합텐, 에피토프 또는 미모토프를 포함하고, 검출가능한 모이어티는 변형된 염기의 결합 파트너와 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 변형된 염기는 스트렙타비딘 또는 아비딘을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 비오틴 및 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 변형된 염기는 비오틴을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 아비딘 및 제2 검출가능한 표지를 포함한다.
제2 검출가능한 표지가 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 검출될 수 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같은 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 여기서 제3 리간드는 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴 또는 레늄을 포함한다.
실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 검출 시약(예를 들어, 제1 및/또는 제2 검출 시약)의 제1 검출가능한 표지와 표지된 프로브의 제2 검출가능한 표지는 동일하다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 본 명세서에 기술된 바와 같은 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 상이하다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 일단 신호 증폭 시약에 의해 결합되면 검출가능하지 않다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고, 제2 검출가능한 표지에는 결합하지 않는다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 III, IV, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, IV, V, 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 V 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다.
실시형태에서, 방법은 표면 상의 제2 검출가능한 표지의 양을 측정함에 의해 연장된 서열의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
실시형태에서, 방법은 표면 상의 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 검출가능하게 구별된다. 실시형태에서, 방법은 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 별도로 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 ECL 표지를 포함하고, 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
II. 제1 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약의 신호 증폭
실시형태에서, 발명은 다음을 포함하는, 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법을 제공한다:
제1 복합체를 표면 상에 형성하는 단계로서, 여기서 제1 복합체는 관심있는 분석물, 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약, 및 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약을 포함하고, 여기서 검출 시약은 제1 핵산 프로브를 포함하는, 단계;
제1 핵산 프로브를 연장시켜 제1 앵커링 영역을 포함하는 제1 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 여기서 제1 앵커링 영역은 표면 상에 고정화된 제1 앵커링 시약에 결합하는, 단계;
제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1의 표지된 프로브에 제1 연장된 서열을 결합하는 단계; 및
제1 표지된 프로브를 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 제1 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약; 제1 연장된 서열을 형성하기 위한 제1 핵산 프로브의 연장; 및 제1 연장된 서열에 대한 제1 표지된 프로브의 결합이 본 명세서에 추가로 기술되어 있다.
실시형태에서, 제1 복합체는 관심있는 분석물을 (i) 표면; (ii) 포획 시약; 및 (iii) 검출 시약과 접촉시킴에 의해 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 샘플을 (i) 표면; (ii) 포획 시약; 및 (iii) 검출 시약과 접촉시킴에 의해 형성된다.
실시형태에서, 제1 복합체의 검출 시약은 제1 검출 시약이고, 제1 복합체는 제2 검출 시약을 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2 검출 시약 각각은 본 명세서에 기술된 바와 같이 근접 핵산 프로브를 포함한다. 실시형태에서, 근접 핵산 프로브 중 하나 또는 둘 모두는 연장되어 본 명세서에 기술된 바와 같이 제1 앵커링 영역을 포함하는 제1 연장된 서열을 형성한다. 실시형태에서, 제1 복합체는 관심있는 분석물 및/또는 샘플을 (i) 표면; (ii) 포획 시약; (iii) 제1 검출 시약; 및 (iv) 제2 검출 시약과 접촉시킴에 의해 형성된다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 포획 시약과 제1 및 제2 검출 시약은 임의의 순서로 샘플 및/또는 분석물과 접촉될 수 있다.
실시형태에서, 포획 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같이 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상에 고정화될 수 있다. 실시형태에서, 방법은 제1 복합체의 형성 전, 동안, 또는 후에 포획 시약을 표면에 고정화하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 방법은 방법의 단계 (a) 이전에 포획 시약을 표면에 고정화하는 것을 포함한다. 포획 시약을 표면에 고정화하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
실시형태에서, 방법은 제1 표지된 프로브를 신호 증폭 시약과 접촉시키기 이전에 표면 상에서 제1 복합체를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 검출은 표면에 결합된 제1 연장된 서열의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 검출하는 것은 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 검출하는 것은 제1 표지된 프로브의 제1 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 제1 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 다중 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 다중 신호 증폭 시약은 제1 표지된 프로브에 결합하며, 여기서 각각의 신호 증폭 시약은 검출 시약 상의 별도의 제1 검출가능한 표지에 결합한다. 실시형태에서, 제1 연장된 서열은 다중 제1 표지된 프로브에 결합하고, 별도의 신호 증폭 시약은 다중 제1 표지된 프로브의 각각에 결합한다.
II.A. 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약
실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 (1) 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (2) 검출가능한 모이어티와 접촉되며, 여기서 검출가능한 모이어티는 (i) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (ii) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함한다:
실시형태에서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 검출가능한 모이어티는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티 및 검출가능한 모이어티는 수용체-리간드 쌍, 항원-항체 쌍, 합텐-항체 쌍, 에피토프-항체 쌍, 미모토프-항체 쌍, 압타머-표적 분자 쌍, 인터칼레이터-표적 분자 쌍, 또는 효소-기질 쌍을 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 대해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 결합 부위를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티에 대해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 하나의 스트렙타비딘은 4개의 비오틴 분자를 결합할 수 있다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 비오틴을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 비오틴을 포함한다.
실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 하나 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다.
실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 검출될 수 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같은 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하고, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 검출가능한 모이어티에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 여기서 제3 리간드는 검출가능한 모이어티에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴 또는 레늄을 포함한다.
실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 표지된 프로브의 제1 검출가능한 표지와 검출가능한 모이어티의 제2 검출가능한 표지는 동일하다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 본 명세서에 기술된 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 상이하다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 일단 신호 증폭 시약에 의해 결합되면 검출가능하지 않다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고, 제2 검출가능한 표지에는 결합하지 않는다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 III, IV, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, IV, V, 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 V 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다.
실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 먼저 신호 증폭 시약과 접촉된 다음 검출가능한 모이어티와 접촉된다. 실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티와 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 접촉된다.
실시형태에서, 접촉시키는 것은 (i) 신호 증폭 시약과 검출가능한 모이어티를 포함하는 신호 증폭 복합체를 형성하는 단계; (ii) 제1 표지된 프로브를 신호 증폭 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함하고/하거나 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함하고, 신호 증폭 복합체는 복수의 신호 증폭 시약을 포함하고, 여기서 각각의 신호 증폭 시약은 하나 이상의 검출가능한 모이어티에 결합된다. 실시형태에서, 제1 복합체와 신호 증폭 복합체는 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체와 신호 증폭 복합체는 순차적으로 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 형성되고, 신호 증폭 복합체는 별도의 반응 용기 또는 용기에 형성된다.
결합 모이어티가 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하고 검출가능한 모이어티가 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티에 대한 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 실시형태에서, 방법은 검출가능한 모이어티에 결합하기 이전에 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티의 길이를 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티의 길이를 증가시키는 것은 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티를 추가 올리고뉴클레오티드에 결찰시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티의 길이를 증가시키는 것은 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티를 추가 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 것을 포함하며, 여기서 추가 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티에 대한 상보적인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 추가의 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티에 대해 하나 초과의 상보적인 서열을 포함하고, 이에 의해 본 명세서의 실시형태에 기술된 바와 같이 검출가능한 모이어티의 하나 초과의 카피가 제2 복합체에 결합하도록 하고 검정 신호를 추가로 증폭시킨다.
실시형태에서, 방법은 표면 상의 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 검출가능하게 구별된다. 실시형태에서, 방법은 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 별도로 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 ECL 표지를 포함하고, 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
실시형태에서, 방법은 표면 상에서 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
II.B. 효소를 포함하는 신호 증폭 시약
실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 (1) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (2) 효소의 기질과 접촉된다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 기질에 작용하는 효소를 포함한다. 실시형태에서, 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP), β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제(GO), 아세틸콜린에스테라제, 카탈라제 또는 β-락타마제이다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 효소에 대한 기질에 작용하는 효소를 포함한다. 실시형태에서, 효소는 예를 들어 산화, 환원, 가수분해 또는 이의 조합을 통해 기질에 결합하고 기질에 작용하여 검출가능한 신호를 생성한다. 실시형태에서, 검출가능한 신호는 발색 신호, 화학발광, 형광, 또는 이의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 효소는 HRP, AP 또는 β-갈락토시다제이다. 실시형태에서, 효소는 HRP이고, 검출가능한 모이어티는 TMB, ABTS 또는 OPD이다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 AP이고, 검출가능한 모이어티는 PNPP이다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 β-갈락토시다제이고, 검출가능한 모이어티는 ONPG이다. HRP에 대한 기질의 추가 비-제한적 예는 SUPERSIGNAL™과 같은 화학발광 기질, 및 QUANTABLU™, QUANTARED™ 및 AMPLEX™ Red와 같은 형광 기질을 포함한다. AP에 대한 기질의 추가 비-제한적 예는 화학발광 기질 CDP™ 및 DYNALIGHT™을 포함한다. TMB, ABTS, OPD, PNPP 및 ONPG를 포함하는 다양한 효소 기질에 대한 검출 방법이 본 명세서에 추가로 기술되어 있다.
실시형태에서, 방법은 효소의 활성을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 측정하는 것은 기질에 작용하는 효소에 대해 생성된 검출가능한 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 신호는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 기질은 TMBM, ABTS, OPD, PNPP 또는 ONPG이고 효소와 반응할 때 발색 신호를 생성한다. 실시형태에서, 기질은 효소와 반응할 때 형광 신호를 생성한다. 실시형태에서, 기질은 효소와 반응할 때 화학발광 신호를 생성한다. 실시형태에서, 측정된 검출가능한 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 결정하는데 사용된다. 실시형태에서, 측정된 검출가능한 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
II.C. 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약
실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉된다.
제2 검출가능한 표지가 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 검출될 수 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환기를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 여기서 제3 리간드는 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴 또는 레늄을 포함한다.
실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 표지된 프로브의 제1 검출가능한 표지와 신호 증폭 시약의 제2 검출가능한 표지는 동일하다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 본 명세서에 기술된 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 상이하다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 일단 신호 증폭 시약에 의해 결합되면 검출가능하지 않다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고, 제2 검출가능한 표지에는 결합하지 않는다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 III, IV, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, IV, V, 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 V 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다.
실시형태에서, 방법은 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 검출가능하게 구별된다. 실시형태에서, 방법은 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 별도로 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 ECL 표지를 포함하고, 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
실시형태에서, 방법은 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
II.D. 제2 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약
실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 제2 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉된다. 실시형태에서, 방법은 제1 표지된 프로브와 신호 증폭 시약을 포함하는 표면 상에 제2 복합체를 형성하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 방법은 제2 핵산 프로브를 연장하여 제2 연장된 서열을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 제2 핵산 프로브를 추가의 올리고뉴클레오티드에 결찰하여 제2 연장된 서열을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 연장시키는 것은 제2 핵산 프로브를 추가 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 것을 포함하며, 여기서 추가 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 제2 핵산 프로브에 상보적인 서열을 포함하여 제2 연장된 서열을 형성한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 제2 핵산 프로브를 연장 반응을 위한 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시켜 제2 연장된 서열을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 핵산 프로브는 연장 반응을 위한 프라이머이다. 실시형태에서, 연장 반응은 PCR, LCR, SDA, 3SR, 등온 증폭(예컨대, 예를 들어, 헬리카제-의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭) 또는 이의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 제2 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고 PCR, LCR, SDA, 3SR, 등온 증폭(예컨대, 예를 들어, 헬리카제-의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭) 또는 이의 조합에 의해 제2 핵산 프로브를 연장하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 제2 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고 PCR에 의해 제2 핵산 프로브를 연장하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 연장하는 것은 제2 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고, (예를 들어, 선형 주형 올리고뉴클레오티드의 결찰에 의해) 원형 주형 올리고뉴클레오티드를 형성하고, 롤링 서클 증폭에 의해 제2 핵산 프로브를 연장하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 제2 연장된 서열은 제2 앵커링 영역을 포함한다. 실시형태에서, 제2 앵커링 영역은 표면의 제2 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 본 명세서에 기술된 제1 복합체의 형성 전, 동안 또는 후에 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 본 명세서에 기술된 제2 복합체의 형성 전, 동안 또는 후에 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 방법의 단계 (a) 전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 제2 연장된 서열을 형성하기 이전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 제2 연장된 서열의 양을 측정하기 이전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 티오에스테르, 티오에테르, 디설파이드, 또는 이의 조합을 통해 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같이 표적화제를 통해 표면에 고정화된다.
실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 올리고뉴클레오티드, 압타머, 압타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 합텐, 에피토프 또는 미모토프를 포함한다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 압타머 리간드를 포함하고, 제2 앵커링 영역은 압타머를 포함한다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 올리고뉴클레오티드-결합 단백질을 포함하고, 제2 앵커링 영역은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약과 제2 앵커링 영역은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제2 앵커링 시약은 제2 앵커링 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제2 앵커링 영역은 제2 앵커링 올리고뉴클레오티드에 상보적인 제2 앵커링 올리고뉴클레오티드 상보체를 포함한다.
실시형태에서, 제2 연장된 서열을 제2 앵커링 시약에 결합하는 것은 앵커링 시약과 제2 앵커링 영역 사이에 삼중 나선을 형성하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 연장된 서열을 제2 앵커링 시약에 결합하는 것은 결합 이전에 제2 앵커링 영역을 변성시켜 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 영역을 노출시키는 것; 결합 이전에 제2 앵커링 영역을 헬리카제 활성에 노출시키는 것; 및/또는 결합 이전에 제2 앵커링 영역을 뉴클레아제 처리에 노출시키는 것을 포함하며, 여기서 제2 앵커링 영역은 하나 이상의 합텐-변형된 염기를 포함하고, 제2 앵커링 시약은 합텐에 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하고; 및/또는 제2 앵커링 영역은 하나 이상의 리간드-변형된 염기를 포함하고 제2 앵커링 시약은 리간드에 특이적인 하나 이상의 수용체를 포함한다.
실시형태에서, 제2 연장된 서열은 제2 표지된 프로브와 접촉되기 이전에 제2 앵커링 시약에 결합된다. 실시형태에서, 제2 복합체는 제2 핵산 프로브의 연장에 이어서 표면에 결합된다. 실시형태에서, 제2 연장된 서열은 표면 상의 제2 복합체로부터 약 1nm 내지 약 500nm, 약 5nm 내지 약 250nm, 약 10nm 내지 약 200nm, 또는 약 15nm 내지 약 150nm 내의 위치에서 제2 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 제2 연장된 서열은 표면 상의 제2 복합체로부터 1μm 미만의 위치에서 제2 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 제2 연장된 서열은 표면 상의 제2 복합체로부터 500nm 미만의 위치에서 제2 앵커링 시약에 결합한다. 실시형태에서, 제2 연장된 서열은 표면 상의 제2 복합체로부터 200nm 미만의 위치에서 제2 앵커링 시약에 결합한다.
실시형태에서, 제1 앵커링 영역과 제2 앵커링 영역은 동일한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 영역과 제2 앵커링 영역은 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약과 제2 앵커링 시약은 동일한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약과 제2 앵커링 시약은 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 영역과 제2 앵커링 영역은 제1 및/또는 제2 앵커링 시약의 별도의 부분에 결합한다.
실시형태에서, 방법은 표면 상의 제1 연장된 서열, 제2 연장된 서열, 또는 둘 모두의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 연장된 서열은 제2 검출가능한 표지를 포함하는 제2 표지된 프로브와 접촉된다. 실시형태에서, 제1 표지된 프로브 및 제2 표지된 프로브는 동일한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 표지된 프로브 및 제2 표지된 프로브는 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시형태에서, 제2 표지된 프로브는 하나 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제2 표지된 프로브는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지를 포함하는 제2 표지된 프로브는 제2 연장된 서열에 결합한다. 실시형태에서, 제2 연장된 서열 및 제2 표지된 프로브는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제2 연장된 서열은 변형된 염기를 포함하고, 연장된 서열의 양을 측정하는 것은 연장된 서열을 변형된 염기에 결합하는 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 것을 포함한다. 실시형태에서, 변형된 염기는 압타머, 압타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 합텐, 에피토프 또는 미모토프를 포함하고, 검출가능한 모이어티는 변형된 염기의 결합 파트너와 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 변형된 염기는 스트렙타비딘 또는 아비딘을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 비오틴 및 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 변형된 염기는 비오틴을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 아비딘 및 제2 검출가능한 표지를 포함한다.
제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 검출될 수 있다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 제2 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체을 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 여기서 제3 리간드는 제2 표지된 프로브에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴 또는 레늄을 포함한다.
실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 검출 시약의 제1 검출가능한 표지와 제2 표지된 프로브의 제2 검출가능한 표지는 동일하다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 본 명세서에 기술된 바와 같이 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 상이하다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 일단 신호 증폭 시약에 의해 결합되면 검출가능하지 않다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고, 제2 검출가능한 표지에는 결합하지 않는다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 III, IV, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, IV, V, 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 V 중 임의의 하나의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기재된 바와 같이 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다.
실시형태에서, 방법은 표면 상의 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정함에 의해 제1 연장된 서열 및 제2 연장된 서열의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 검출가능하게 구별된다. 실시형태에서, 방법은 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 별도로 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 ECL 표지를 포함하고, 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
실시형태에서, 방법은 표면 상의 제2 검출가능한 표지의 양을 측정함에 의해 제2 연장된 서열의 양을 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 측정된다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 존재를 검출하는데 사용된다. 실시형태에서, 측정된 ECL 신호의 양은 샘플에서 분석물의 양을 결정하는데 사용된다.
표면
실시형태에서, 제1 복합체는 포획 시약을 포함하고, 포획 시약은 표면에 고정화되어 있다. 실시형태에서, 제1 복합체는 포획 시약을 포함하고, 포획 시약은 표면 상에 직접적으로 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 2차적인 결합 시약, 예를 들어 표적화제를 통해 표면 상에 간접적으로 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상에 고정화된 표적화제에 결합하는 표적화제 상보체에 연결된다. 실시형태에서, 표적화제 상보체는 표적화제에 직접적으로 결합한다. 실시형태에서, 표적화제 및 표적화제 상보체는 상보성 올리고뉴클레오티드, 수용체-리간드 쌍, 항원-항체 쌍, 합텐-항체 쌍, 에피토프-항체 쌍, 미모토프-항체 쌍, 압타머-표적 분자 쌍, 혼성화 파트너 또는 인터칼레이터-표적 분자 쌍을 포함한다. 실시형태에서, 표적화제 및 표적화제 상보체는 교차-반응성 모이어티, 예를 들어 티올 및 말레이미드 또는 요오도아세트아미드; 알데히드 및 히드라지드; 또는 아지드 및 알킨 또는 사이클로알킨이다. 실시형태에서, 표적화제는 비오틴이고, 표적화제 상보체는 아비딘 또는 스트렙타비딘이다.
실시형태에서, 표적화제 상보체는 표적화제 및 표적화제 상보체 둘 모두의 결합 파트너인 표적화 가교제를 통해 표적화제에 결합한다. 실시형태에서, 표적화 가교제는 다중 결합 부위를 포함한다. 실시형태에서, 표적화 가교제는 스트렙타비딘 또는 아비딘이고, 표적화제 및 표적화제 상보체는 각각의 비오틴이다.
실시형태에서, 포획 시약, 분석물 및 검출 시약을 포함하는 제1 복합체는 단일 단계에서 형성된다. 실시형태에서, 포획 시약, 분석물, 제1 및 제2 검출 시약을 포함하는 제1 복합체는 단일 단계에서 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 하나 이상의 단계에서 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 용액에서 형성된 다음 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면 상에 고정화된 포획 시약에 분석물을 결합시킨 다음, 검출 시약을 분석물에 결합시켜 표면 상에 제1 복합체를 형성함에 의해 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 표면에 고정화된 포획 시약에 분석물을 결합시킨 다음, 제1 및 제2 검출 시약을 분석물에 결합시켜 표면 상에 제1 복합체를 형성함에 의해 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 분석물을 표면 상에 고정화된 포획 시약 및 검출 시약에 동시적으로 결합시킴에 의해 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 분석물을 표면 상에 고정화된 포획 시약과 제1 및 제2 검출 시약 중 하나 또는 둘 모두에 동시적으로 결합시킴에 의해 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 분석물을 용액에서의 검출 시약에 결합시켜 분석물-검출 시약 복합체를 형성한 다음, 분석물-검출 시약 복합체를 표면 상의 포획 시약에 결합시킴에 의해 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 분석물을 용액에서의 제1 및 제2 검출 시약에 결합시켜 분석물-검출 시약 복합체를 형성한 다음, 분석물-검출 시약 복합체를 표면 상의 포획 시약에 결합시킴에 의해 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 분석물을 용액에서의 포획 시약 및 검출 시약에 결합시킨 다음, 본 명세서에 기술된 바와 같이 표면에 포획 시약을 고정화시킴에 의해 형성된다. 실시형태에서, 제1 복합체는 분석물을 용액에서의 포획 시약과 제1 및 제2 검출 시약에 결합시킨 다음, 본 명세서에 기술된 바와 같이 표면에 포획 시약을 고정화시킴에 의해 형성된다. 제1 복합체가 제1 및 제2 검출 시약을 포함하는 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약은 분석물에 동시적으로 또는 순차적으로 결합될 수 있다.
앵커링 시약(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 연장된 서열에 결합하기 위한 앵커링 시약, 제1 연장된 서열에 결합하기 위한 제1 앵커링 시약, 및/또는 제2 연장된 서열에 결합하기 위한 제2 앵커링 시약)을 포함하는 실시형태에서, 앵커링 시약은 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 표면 상에 직접적으로 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 2차적인 결합 시약, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적 시약을 통해 표면 상에 간접적으로 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약에 대한 표적화제 및 표적화제 상보체는 앵커링 시약과 연관된 표적화제 및 표적화제 상보체가 포획 시약과 연관된 표적화제 및 표적화제 상보체와 실질적으로 비-교차-반응성이도록 선택된다. 실시형태에서, 동일한 표적화제 및 표적화 상보체 쌍이 포획 시약 및 앵커링 시약과 연관되어 있다. 실시형태에서, 표적화제 상보체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 표적화 가교제를 통해 표적화제에 결합한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 포획 시약이 표면에 고정화되는 것과 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 포획 시약이 표면에 고정화되기 전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 포획 시약이 표면에 고정화된 후에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 본 명세서에 기술된 제1 복합체의 형성 전, 동안 또는 후에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 본 명세서에 기술된 연장된 서열을 형성하기 이전에 표면에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 연장된 서열의 양을 측정하기 이전에 표면에 고정화된다.
실시형태에서, 표면은 입자를 포함한다. 실시형태에서, 표면은 다중-웰 플레이트의 웰을 포함한다. 실시형태에서, 표면은 복수의 별개의 결합 도메인을 포함하고, 포획 시약 및 앵커링 시약은 표면 상의 2개의 별개의 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 웰을 포함하는 실시형태에서, 웰은 복수의 별개의 결합 도메인을 포함하고, 포획 시약 및 앵커링 시약은 웰 내의 2개의 별개의 결합 도메인 상에 위치한다. 실시형태에서, 표면은 복수의 별개의 결합 도메인을 포함하고, 포획 시약 및 앵커링 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 웰을 포함하는 실시형태에서, 웰은 복수의 별개의 결합 도메인을 포함하고, 포획 시약 및 앵커링 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약의 약 1nm 내지 약 500nm, 약 5nm 내지 약 250nm, 약 10nm 내지 약 200nm, 또는 약 15nm 내지 약 150nm 이내에 있다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약으로부터 1μm 미만에 있다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약으로부터 500nm 미만에 있다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약으로부터 200nm 미만에 있다.
검출 시약이 제1 연장된 서열을 형성하는 제1 핵산 프로브를 포함하고 신호 증폭 시약이 제2 연장된 서열을 형성하는 제2 핵산 프로브를 포함하는 실시형태에서, 표면은 제1 연장된 서열에 결합할 수 있는 제1 앵커링 시약 및 제2 연장된 서열에 결합할 수 있는 제2 앵커링 시약을 포함한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약과 제2 앵커링 시약은 표면 상의 별개의 결합 도메인 상에 위치한다. 실시형태에서, 제1 앵커링 시약과 제2 앵커링 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인에 있다. 실시형태에서, 포획 시약은 각각의 제1 및 제2 앵커링 시약으로부터 추가로 별개의 결합 도메인에 있다. 실시형태에서, 포획 시약은 제1 및 제2 앵커링 시약과 동일한 결합 도메인에 있다.
실시형태에서, 표면은 전극을 포함한다. 실시형태에서, 전극은 탄소 잉크 전극이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 것은 ECL 신호를 일반화하기 위해 전극에 전압 파형(예를 들어, 전위)을 적용하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 표면은 입자를 포함하고, 방법은 전극 상에 입자를 수집하고 전극에 전압 파형(예를 들어, 전위)을 적용하여 ECL 신호를 생성하는 것을 포함한다.
다중화된 방법
실시형태에서, 방법은 다중 분석물을 검출할 수 있는 다중화된 방법이다. 실시형태에서, 다중화된 방법은 다중 분석물을 동시적으로 검출한다. 실시형태에서, 다중화된 방법은 다중 분석물을 측정하기 위해 하나 이상의 방법 단계를 반복하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 각각의 방법 단계는 각각의 분석물에 대해 병렬로 수행된다. 실시형태에서, 각각의 분석물은 상이한 포획 및/또는 검출 시약에 결합한다. 실시형태에서, 각각의 분석물의 그에 상응하는 포획 시약에 대한 결합은 표면(들)을 다중 분석물을 포함하는 샘플과 접촉시킴에 의해 병렬로 수행된다. 실시형태에서, 다중 분석물은 샘플에 상이한 양(예를 들어, 농도)으로 존재한다. 예를 들어, 하나의 분석물은 다른 분석물보다 10, 100, 1000, 10000, 100000, 106, 107, 108, 109 또는 1010 배수 더 낮거나 높은 농도로 존재한다. 따라서 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 다중화된 방법의 장점은 이것이 약 0.0001pg/mL 내지 약 100000pg/mL, 약 0.0005pg/mL 내지 약 50000pg/mL, 약 0.001pg/mL 내지 약 10000pg/mL, 약 0.005pg/mL 내지 약 5000pg/mL, 약 0.01pg/mL 내지 약 1000pg/mL, 약 0.05pg/mL 내지 약 500pg/mL, 약 0.1pg/mL 내지 약 100pg/mL, 약 0.5pg/mL 내지 약 50 pg/mL, 또는 약 1pg/mL 내지 약 10pg/mL의 범위인 분석물의 농도를 검출할 수 있다는 것이다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 10pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 약 10pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 1pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 1pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 0.5pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 0.5pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 0.3pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 0.3pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 0.1pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 0.1pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 1pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 약 0.0001pg/mL 내지 약 1pg/mL의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 0.1pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 약 0.0001pg/mL 내지 약 0.1pg/mL의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 샘플에 존재하는 가장 높은 존재량의 분석물의 양은 샘플에 존재하는 가장 낮은 존재량의 분석물의 양보다 약 1.5-배수, 약 2-배수, 약 3-배수, 약 4-배수, 약 5-배수, 약 10-배수, 약 15-배수, 약 20-배수, 약 30-배수, 약 40-배수, 약 50-배수, 약 60-배수, 약 70-배수, 약 80-배수, 약 90-배수, 약 100-배수, 약 250-배수, 약 500-배수, 약 750-배수, 약 1000-배수, 약 10000-배수, 약 100000-배수, 약 106-배수, 약 107-배수, 약 108-배수, 약 109-배수, 약 1010-배수, 또는 1010-배수 초과로 더 높다.
실시형태에서, 발명은 다음 단계를 포함하는, 분석물이 약 0.0001pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 범위인 농도로 존재하는 샘플에서 관심있는 다중 분석물을 검출하는 방법을 제공한다: 본 명세서에 기술된 바와 같은 복수의 제1 복합체를 형성하는 단계로서, 여기서 각각의 제1 복합체는 고유한 분석물과 포획 시약 및 검출 시약 또는 고유한 분석물에 대한 제1 및 제2 검출 시약을 포함하는, 단계; (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 검출가능한 표지의 양을 측정함에 의해) 제1 복합체의 양을 측정하고, 이에 의해 샘플에서 더 높은 존재량의 분석물을 검출하는 단계; 복수의 제1 복합체를 본 명세서에 기술된 바와 같은 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 신호 증폭 시약은 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티에 결합하는 결합 모이어티를 포함하거나, 여기서 신호 증폭 시약은 효소의 기질에 작용하는 효소를 포함하거나, 또는 여기서 신호 증폭 시약은 연장된 서열을 형성하는 핵산 프로브를 포함하는, 단계; 및 본 명세서에 기술된 바와 같이 (예를 들어, 연장된 서열에 결합하는 제2 검출가능한 표지를 측정함에 의해) 제2 검출가능한 표지의 양, 효소 활성, 또는 연장된 서열의 양을 측정하고, 이에 의해 샘플에서 더 낮은 존재량의 분석물을 검출하는 단계로서; 여기서 샘플에 존재하는 더 높은 존재량의 분석물의 양은 더 낮은 존재량의 분석물의 양보다 약 1.5-배수, 약 2-배수, 약 5-배수, 약 10-배수, 약 25-배수, 약 50-배수, 약 75-배수, 약 100-배수, 약 500-배수, 약 1000-배수, 약 106-배수, 약 107-배수, 약 108-배수, 약 109-배수, 또는 1010-배수 더 높고, 및/또는 여기서 더 높은 존재량의 분석물은 약 1pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 약 0.0001pg/mL 내지 약 1pg/mL의 농도로 샘플에 존재하는, 단계. 실시형태에서, 측정되는 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양은 실질적으로 동일하다. 실시형태에서, 측정되는 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양은 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 또는 약 1% 이내이다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 더 높은 존재량의 분석물 및 더 낮은 존재량의 분석물이 검정 장치의 검출 한계 내에서 검정 신호를 제공하도록, (예를 들어, 제2 검출가능한 표지의 양에 상응하는) 더 낮은 존재량의 분석물로부터 검정 신호를 증폭한다. 따라서 신호 증폭 시약은 동일한 검정 장치를 사용하여 동일한 샘플의 희석에서, 즉 개별 분석물의 측정을 위해 샘플을 희석하거나 농축할 필요 없이 광범위한 농도(예를 들어, 약 0.0001pg/mL 내지 약 100000pg/mL)에서 다중 분석물의 검출을 가능하게 한다.
실시형태에서, 표면은 복수의 결합 도메인을 포함하고, 각각의 분석물은 상이한 결합 도메인에서 복합체(예를 들어, 본 명세서에 기술된 제1 복합체)를 형성한다. 실시형태에서, 복수의 결합 도메인은 단일 표면 상에 있다. 실시형태에서, 표면은 다중-웰 플레이트를 포함하고, 각각의 결합 도메인은 상이한 웰에 있다. 실시형태에서, 표면은 다중-웰 플레이트의 웰을 포함하고, 각각의 결합 도메인은 웰의 별도의 부분에 있다. 실시형태에서, 복수의 결합 도메인은 하나 이상의 표면 상에 있다. 실시형태에서, 표면은 입자를 포함하고, 각각의 결합 도메인은 다른 입자 상에 있다. 실시형태에서, 입자는 입자 배열로 배열된다. 실시형태에서, 입자는 특정 입자의 식별을 허용하고 각각의 결합 도메인을 구별할 수 있도록 코딩된다.
실시형태에서, 결합 도메인은 서로 분리가능하다. 실시형태에서, 표면은 탈착가능한 웰을 포함하는 다중 웰-플레이트이고, 각각의 결합 도메인은 상이한 웰에 있다. 실시형태에서, 표면은 하나 이상의 입자를 포함하고, 각각의 입자는 나머지 입자로부터 분리가능하다. 입자를 분리하는 방법은 해당 분야에 알려져 있고, 예를 들어 유세포분석, 자기 분리, 친화도 분리 등을 포함한다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는 제1 복합체는 검출된 후 반응 혼합물로부터 제거된다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는 제1 복합체는 검출된 후 표면으로부터 분리 및/또는 제거된다. 실시형태에서, 분리 및/또는 제거하는 것은 예를 들어, 그 결합 도메인의 선택적인 세정에 의해 그 결합 도메인으로부터 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는 제1 복합체를 제거하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 분리 및/또는 제거하는 것은 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는 제1 복합체를 함유하는 결합 도메인을 나머지 결합 도메인, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 탈착가능한 웰 및/또는 분리가능한 입자로부터 분리하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 각각의 결합 도메인은 표적화제 상보체에 결합할 수 있는 표적화제를 포함하고, 각각의 포획 시약 및/또는 앵커링 시약(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 연장된 서열에 결합하기 위한 앵커링, 제1 연장된 서열에 결합하기 위한 제1 앵커링 시약, 및/또는 제2 연장된 서열에 결합하기 위한 제2 앵커링 시약)은 연결제에 결합할 수 있는 보충 연결제를 포함한다. 실시형태에서, 포획 시약 및 앵커링 시약은 (1) 보충 연결제를 통해 포획 및 앵커링 시약을 연결제에 연결된 표적화 시약 상보체에 결합시키고; 및 (2) (1)의 생성물을 표적화제를 포함하는 결합 도메인에 결합시킴에 의해 결합 도메인에 고정화되며, 여기서 (i) 각각의 결합 도메인은 상이한 표적화제를 포함하고, (ii) 각각의 표적화 시약 상보체는 표적화제 중 하나에 선택적으로 결합하고, 이에 의해 각각의 포획 시약과 앵커링 시약을 그의 연관된 결합 도메인에 고정화시킨다.
실시형태에서, 연결제와 보충 연결제 둘 모두의 결합 파트너인 선택적 가교제는 연결제와 보충 연결제를 가교하여, 그 각각의 표적화제 상보체에 각각 결합된 포획 및/또는 앵커링 시약이 결합 도메인과 접촉되고 가교제, 각각의 포획 및/또는 앵커링 시약 상의 표적화제 상보체, 및 각각의 결합 도메인 상의 표적화제를 통해 그 각각의 표적화제에 결합되도록 한다.
실시형태에서, 표적화제 및 표적화제 상보체는 아비딘-비오틴, 스트렙타비딘-비오틴, 항체-합텐, 항체-항원, 항체-에피토프 태그, 핵산-상보적인 핵산, 압타머-압타머 표적, 및 수용체-리간드로부터 선택된 결합 파트너 쌍의 두 구성원이다. 실시형태에서, 표적화제 및 표적화제 상보체는 교차-반응성 모이어티, 예를 들어 티올 및 말레이미드 또는 요오도아세트아미드; 알데히드 및 히드라지드; 아지드 및 알킨 또는 사이클로알킨; 알켄 및 말레이미드; 티올 및 디설파이드; 알데히드 또는 케톤 및 아민; 또는 트랜스-사이클로옥텐 및 테트라진이다. 실시형태에서, 표적화제는 비오틴이고, 표적화제 상보체는 아비딘 또는 스트렙타비딘이다.
실시형태에서, 연결제 및 보충 연결제는 아비딘-비오틴, 스트렙타비딘-비오틴, 항체-합텐, 항체-항원, 항체-에피토프 태그, 핵산-상보적인 핵산, 압타머-압타머 표적 및 수용체-리간드로부터 선택된 결합 파트너 쌍의 두 구성원이다. 실시형태에서, 연결제 및 보충 연결제는 교차-반응성 모이어티, 예를 들어 티올 및 말레이미드 또는 요오도아세트아미드; 알데히드 및 히드라지드; 아지드 및 알킨 또는 사이클로알킨; 알켄 및 말레이미드; 티올 및 디설파이드; 알데히드 또는 케톤 및 아민; 또는 트랜스-사이클로옥텐 및 테트라진이다. 실시형태에서, 연결제는 아비딘 또는 스트렙타비딘이고, 보충 연결제는 비오틴이다. 실시형태에서, 표적화제 및 표적화제 상보체는 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 표적화제 상보체는 스트렙타비딘이고, 표적화제는 비오틴이고, 연결제 및 보충 연결제는 상보적인 올리고뉴클레오티드이다.
가교제를 포함하는 실시형태에서, 가교제는 스트렙타비딘 또는 아비딘이고, 연결제 및 보충 연결제는 각각 비오틴이다. 다중화된 검정을 수행하는 방법은, 예를 들어 US 10,189,023 및 US 10,201,812에 추가로 기술되어 있다.
분석물 및 샘플
실시형태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 실시형태에서, 샘플은 환경 샘플이다. 실시형태에서, 샘플은 인간 대상체로부터 획득된다. 실시형태에서, 샘플은 동물 대상체로부터 획득된다. 실시형태에서, 샘플은 포유동물의 체액, 분비물 또는 배설물을 포함한다. 실시형태에서, 샘플은 정제된 포유동물의 체액, 분비물 또는 배설물이다. 실시형태에서, 포유동물의 체액, 분비물 또는 배설물은 전혈, 혈장, 혈청, 가래, 누액, 림프액, 활막액, 흉막 삼출액, 소변, 땀, 뇌척수액, 복수, 우유, 대변, 기관지 세척액, 타액, 양수, 코 분비물, 질 분비물, 표면 생검, 정자, 정액/생식액, 상처 분비물 및 배설물, 또는 이들로부터의 추출, 정제 또는 이의 희석물이다. 추가 예시적인 샘플은 생리학적 샘플, 점막 면봉, 조직 흡인물, 조직 균질액, 세포 배양물 및 세포 배양 상등액과 같은 세포의 현탁액을 함유하는 샘플을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 실시형태에서, 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 소변, 타액, 또는 이들로부터의 추출 또는 정제, 또는 이의 희석물이다. 실시형태에서, 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 실시형태에서, 혈장은 EDTA, 헤파린 또는 시트레이트에 있다.
샘플은 본 명세서에 기술된 단일 공급원으로부터 획득될 수 있거나, 2개 이상의 공급원으로부터의 혼합물을 함유할 수 있다.
발명의 방법을 사용하여 측정될 수 있는 분석물은 단백질, 독소, 핵산, 미생물, 바이러스, 세포, 진균, 포자, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지질단백질, 다당류, 약물, 호르몬, 스테로이드, 영양소, 대사산물 및 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상 또는 이의 조합을 포함하는 임의의 복합체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 샘플에서 관심있는 분석물의 수준은 질환 또는 질환 상태를 나타낼 수 있거나, 대상체가 그 분석물에 노출되었는지 여부를 간단히 나타낼 수 있다.
실시형태에서, 샘플은 다중 관심있는 분석물을 포함한다. 실시형태에서, 다중 분석물은 샘플에 상이한 양(예를 들어, 농도)으로 존재한다. 예를 들어, 하나의 분석물은 다른 분석물보다 10, 100, 1000, 10000, 100000, 106, 107, 108, 109 또는 1010 배수 더 낮거나 높은 농도로 존재한다. 따라서, 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법의 장점은 이것이 약 0.0001pg/mL 내지 약 100000pg/mL, 약 0.0005pg/mL 내지 약 50000pg/mL, 약 0.001pg/mL 내지 약 10000pg/mL, 약 0.005pg/mL 내지 약 5000pg/mL, 약 0.01pg/mL 내지 약 1000pg/mL, 약 0.05pg/mL 내지 약 500pg/mL, 약 0.1pg/mL 내지 약 100pg/mL, 약 0.5pg/mL 내지 약 50 pg/mL, 또는 약 1pg/mL 내지 약 10pg/mL의 범위인 분석물의 농도를 검출할 수 있다는 것이다. 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법의 추가 장점은 이들이 샘플의 동일한 희석에서, 즉 개별 분석물의 측정을 위해 샘플을 희석하거나 농축할 필요 없이 다양한 농도(예를 들어, 약 0.0001pg/mL 내지 약 100000pg/mL)에서 다중 분석물을 검출할 수 있다는 것이다. 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법의 추가 장점은 그것이 약 0.0001pg/mL 내지 약 100000pg/mL 사이의 임의의 농도에서 검출되어 지는 임의의 특정 분석물에 대해 제1 검출가능한 표지를 포함하는 동일한 검출 시약(또는 동일한 제1 및 제2 검출 시약)을 사용할 수 있다는 것이다.
실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 10pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 약 10pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 1pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 1pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 0.5pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 0.5pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 0.3pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 0.3pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 0.1pg/mL 이상의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 0.1pg/mL 미만의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 1pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재비의 분석물은 약 0.0001pg/mL 내지 약 1pg/mL의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 가장 높은 존재량의 분석물은 약 0.1pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 농도로 샘플에 존재하고, 가장 낮은 존재량의 분석물은 약 0.0001pg/mL 내지 약 0.1pg/mL의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 샘플에 존재하는 가장 높은 존재량의 분석물의 양은 샘플에 존재하는 가장 낮은 존재량의 분석물의 양보다 약 1.5-배수, 약 2-배수, 약 3-배수, 약 4-배수, 약 5-배수, 약 10-배수, 약 15-배수, 약 20-배수, 약 30-배수, 약 40-배수, 약 50-배수, 약 60-배수, 약 70-배수, 약 80-배수, 약 90-배수, 약 100-배수, 약 250-배수, 약 500-배수, 약 750-배수, 약 1000-배수, 약 10000-배수, 약 100000-배수, 약 106-배수, 약 107-배수, 약 108-배수, 약 109-배수, 약 1010-배수, 또는 1010-배수 초과로 더 높다.
실시형태에서, 분석물은 엑소솜이다. 실시형태에서, 샘플은 정제된 엑소솜을 포함한다. 세포외 소포 또는 EV로도 알려진 엑소좀은 대부분의 세포 유형에 의해 방출되는 작은 막 소포이다. 엑소좀의 방출과 후속하는 흡수는 세포-대-세포 통신의 방법이고 많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 조절하는 역할을 한다. 엑소좀은 표면-결합 및 세포질 단백질, 지질, mRNA 및 miRNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 아주 다양한 시그널링 분자를 함유하는 것으로 나타났으며, 각각의 엑소좀에서 이들 종의 정체와 농도를 사용하여 그 세포의 기원과 기능을 추론할 수 있다는 것이 제안되었다. 따라서, 환자의 전체 엑소좀 모집단의 게놈 또는 단백체 프로파일링은 암, 전염병, 신장 및 간 질환, 및 외상성 뇌 손상 등을 포함한 다양한 병리학적 상태에 대한 귀중한 예후 정보를 제공할 수 있다.
실시형태에서, 포획 시약과 검출 시약, 또는 포획 시약과 제1 및 제2 검출 시약은 엑소좀의 표면 상의 표면 마커에 결합한다. 예를 들어, 대부분의 엑소좀에서 발현되는 일반적인 단백질은 CD9, CD63, CD81, Hsp70, PDCD6IP 및 Tsg101을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 실시형태에서, 포획 시약과 검출 시약, 또는 포획 시약과 제1 및 제2 검출 시약은 특정 세포 유형에 의해 방출된 엑소좀에 의해 특이적으로 발현되는 마커에 결합한다. 예를 들어, 방법은 예를 들어 질환과 연관되거나 질환을 전개할 위험이 있는 특정 엑소좀 하위모집단을 검출하는데 사용될 수 있다. 실시형태에서, 포획 시약과 검출 시약, 또는 포획 시약과 제1 및 제2 검출 시약은 질환-연관된 엑소좀 표면 마커에 결합한다.
실시형태에서, 분석물은 엑소좀의 내부 분석물, 예를 들어 카고 단백질, 지질 또는 핵산이다. 실시형태에서, 엑소좀은 포획 시약에 결합하기 전 또는 후에, 그러나 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약을 첨가하기 전에 투과화된다.
추가 실시형태
실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 경쟁적 검정 형식으로 된다. 일반적인 용어로, 경쟁적 검정, 예를 들어 경쟁적 면역검정 또는 경쟁적 억제 검정, 분석물 및 경쟁자는 포획 및/또는 검출 시약(또는 제1 및 제2 검출 시약)에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 이러한 검정에서 분석물은 전형적으로 경쟁자를 직접적으로 측정함에 의해 간접적으로 측정된다. 본 명세서에 사용된 "경쟁자"는 분석물과 동일한 포획 및/또는 검출 시약(또는 제1 및 제2 검출 시약)에 결합할 수 있는 화합물을 지칭하여, 포획 및/또는 검출 시약(또는 제1 및 제2 검출 시약)은 분석물이나 경쟁자 둘 모두가 아닌, 어느 하나에만 결합할 수 있다. 실시형태에서, 경쟁적 검정은 하나 초과의 포획 및/또는 검출 시약(또는 제1 및 제2 검출 시약)과 결합할 수 없는 분석물, 예를 들어, 소분자 분석물 또는 하나 초과의 별도의 결합 부위를 갖지 않는 분석물을 검출하고 측정하는데 사용된다. 실시형태에서, 경쟁적 검정은 항체 바이오마커를 검출하고 측정하기 위해 사용된다. 경쟁적 면역검정의 예는 US 4,235,601; US 4,442,204; 및 US 5,028,535에 기술된 것들을 포함한다.
본 명세서에서의 방법은 검정 플레이트의 단일 웰과 같은 단일 검정 챔버에서 수행될 수 있다. 본 명세서에서의 방법은 검정 카트리지의 검정 챔버에서도 수행될 수 있다. 본 발명에 적합한 검정 측정을 수행하기 위한 검정 모듈, 예를 들어 검정 플레이트 또는 검정 카트리지, 방법 및 장치는 예를 들어 US 8,343,526; US 9,731,297; US 9,921,166; US 10,184,884; US 10,281,678; US 10,272,436; US 2004/0022677; US 2004/0189311; US 2005/0052646; US 2005/0142033; US 2018/0074082; 및 US 2019/0391170에 기술되어 있다.
시스템
실시형태에서, 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법을 수행하기 위한 검정 시스템을 제공한다. 실시형태에서, 샘플은 다중 분석물을 포함하며, 여기서 분석물은 약 0.0001pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 범위인 농도로 존재한다. 실시형태에서, 샘플은 가장 낮은 존재량의 분석물보다 10, 100, 1000, 10000, 100000, 106, 107, 108, 109 또는 1010 배수 더 높은 농도를 갖는 하나 이상의 분석물을 포함한다. 실시형태에서, 검정 시스템은 본 명세서에 기술된 바와 같이 포획 시약, 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약, 및 신호 증폭 시약을 활용하여 약 0.0001pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 전체 농도 범위에 걸쳐 분석물을 검출할 수 있다. 실시형태에서, 검정 시스템은 포획 시약 및 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약을 활용하여 약 1pg/mL 이상의 농도에서 분석물을 검출할 수 있고, 검정 시스템은 포획 시약, 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약, 및 신호 증폭 시약을 활용하여 1pg/mL 미만의 농도에서 추가로 분석물을 검출할 수 있다. 실시형태에서, 검정 시스템은 제1 검출가능한 표지를 포함하는 동일한 검출 시약, 또는 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하는 동일한 제1 및 제2 검출 시약을 이용하여 약 0.0001pg/ml 내지 약 100000pg/mL 사이의 임의의 농도에서 분석물을 검출한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다.
실시형태에서, 검정 시스템은 적어도 하나의 메모리 유닛, 적어도 하나의 메모리 유닛에 대한 명령에 따라 프로그래밍된 적어도 하나의 처리 유닛; 및 적어도 하나의 처리 유닛에 의해 제어되도록 구성된 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 처리 유닛은 샘플에서 분석물의 측정을 수행하기 위해 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 제어하도록 구성된다. 실시형태에서, 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분은 판독기 기기이다. 실시형태에서, 검정 시스템은 하나 초과의 판독기 기기를 포함한다. 실시형태에서, 측정은 검출가능한 표지를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같은 검출 시약, 제1 및 제2 검출 시약, 표지된 프로브, 또는 검출가능한 모이어티 상에 존재한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 처리 유닛은 다음 중 하나 또는 둘 모두를 수행하기 위해 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 제어하도록 구성된다: 본 명세서에 기술된 바와 같이 더 높은 존재량의 분석물의 제1 측정; 및 본 명세서에 기술된 바와 같이 더 낮은 존재량의 분석물의 제2 측정. 실시형태에서, 샘플에 존재하는 더 높은 존재량의 분석물의 양은 샘플에 존재하는 더 낮은 존재량의 분석물의 양보다 약 1.5-배수, 약 2-배수, 약 5-배수, 약 10-배수, 약 25-배수, 약 50-배수, 약 75-배수, 약 100-배수, 약 500-배수, 약 1000-배수, 약 10000-배수, 약 100000-배수, 약 106-배수, 약 107-배수, 약 108-배수, 약 109-배수, 1010-배수, 또는 1010-배수 초과로 더 높다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물은 약 1pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 농도로 샘플에 존재하고, 더 낮은 존재량의 분석물은 약 0.0001pg/mL 내지 약 1pg/mL의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물과 더 낮은 존재량의 분석물은 샘플의 동일한 희석에서 검출될 수 있다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물은 ECL 표지를 포함하는 검출 시약을 사용하여 검출된다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물은 각각 ECL 표지를 포함하는 제1 및 제2 검출 시약을 사용하여 검출된다. 실시형태에서, 더 낮은 존재량의 분석물은 (i) ECL 표지를 포함하는 검출 시약 및 (ii) ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 사용하여 검출된다. 실시형태에서, 더 낮은 존재량의 분석물은 (i) 각각 ECL 표지를 포함하는 제1 및 제2 검출 시약 및 (ii) ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 사용하여 검출된다.
실시형태에서, 발명은 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체를 제공한다. 실시형태에서, 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체에는 적어도 하나의 처리 유닛에 의해 실행될 때 적어도 하나의 처리 유닛이 샘플에서 분석물의 측정을 검정 시스템의 제어를 통해 수행하게 하는 명령이 그곳에 저장되어 있다. 실시형태에서, 측정은 검출가능한 표지를 측정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 검출 시약, 제1 및 제2 검출 시약, 표지된 프로브, 또는 검출가능한 모이어티 상에 존재한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 처리 유닛은 다음 중 하나 또는 둘 모두를 수행한다: 본 명세서에 기술된 바와 같이 더 높은 존재량의 분석물의 제1 측정; 및 본 명세서에 기술된 바와 같이 더 낮은 존재량의 분석물의 제2 측정. 실시형태에서, 샘플에 존재하는 더 높은 존재량의 분석물의 양은 샘플에 존재하는 더 낮은 존재량의 분석물의 양보다 약 1.5-배수, 약 2-배수, 약 5-배수, 약 10-배수, 약 25-배수, 약 50-배수, 약 75-배수, 약 100-배수, 약 500-배수, 약 1000-배수, 약 10000-배수, 약 100000-배수, 약 106-배수, 약 107-배수, 약 108-배수, 약 109-배수, 1010-배수, 또는 1010-배수 초과로 더 높다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물의 양은 약 1pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 농도로 샘플에 존재하고, 더 낮은 존재량의 분석물의 양은 약 0.0001pg/mL 내지 약 1pg/mL의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물은 ECL 표지를 포함하는 검출 시약을 사용하여 검출된다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물은 각각 ECL 표지를 포함하는 제1 및 제2 검출 시약을 사용하여 검출된다. 실시형태에서, 더 낮은 존재량의 분석물은 (i) ECL 표지를 포함하는 검출 시약 및 (ii) ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 사용하여 검출된다. 실시형태에서, 더 낮은 존재량의 분석물은 (i) 각각 ECL 표지를 포함하는 제1 및 제2 검출 시약 및 (ii) ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 사용하여 검출된다.
실시형태에서, 제1 측정은 본 명세서에 기술된 제1 검출가능한 표지의 측정이다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 검출 시약 상에 존재한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 제1 검출 시약과 제2 검출 시약의 각각 상에 존재한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 검출 시약의 핵산 프로브를 연장함에 의해 형성된 연장된 서열에 결합하는 표지된 프로브로 구성된다. 실시형태에서, 제2 측정은 본 명세서에 기술된 바와 같은 검출가능한 모이어티의 측정이다. 실시형태에서, 제2 측정은 본 명세서에 기술된 바와 같은 효소 활성의 측정이다. 실시형태에서, 제2 측정은 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 검출가능한 표지의 측정이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 신호 증폭 시약에 결합하는 검출가능한 모이어티 상에 존재한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 신호 증폭 시약의 핵산 프로브를 연장함에 의해 형성된 연장된 서열에 결합하는 표지된 프로브로 구성된다. 검출가능한 모이어티, 효소 활성, 표지된 프로브, 및 제1 및 제2 검출가능한 표지가 본 명세서에 기술되어 있다.
실시형태에서, 제1 및/또는 제2 측정은 검출가능한 신호의 측정이다. 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 측정은 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광(ECL), 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합의 측정이다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출가능한 표지 각각은 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제1 측정과 제2 측정 각각은 ECL 측정이다. 실시형태에서, 제1 측정은 ECL 측정이고, 제2 측정은 본 명세서에 기술된 바와 같은 효소 활성의 측정이다. 실시형태에서, 제1 측정은 ECL 측정이고, 제2 측정은 발색 신호, 형광 또는 화학발광의 측정이다.
실시형태에서, 제1 측정의 측정된 절대값은 제2 측정의 측정된 절대값의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 또는 약 1% 이내이거나, 또는 제2 측정의 측정된 절대값과 실질적으로 동일하다. 실시형태에서, 시스템의 검출 상한 및 하한은 제1 측정과 제2 측정 사이에 조정되지 않는다. 실시형태에서, 검정 시스템은 제1 측정과 제2 측정 사이에서 시스템의 검출 상한 및 하한을 조정하도록 구성된다.
실시형태에서, 다중 분석물을 포함하는 샘플은 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 표면과 접촉되며, 여기서 각각의 결합 도메인은 고유한 분석물에 대한 포획 시약을 포함한다. 실시형태에서, 표면은 (i) 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인 및 (ii) 더 낮은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 샘플에 존재하는 더 높은 존재량의 분석물의 양은 샘플에 존재하는 더 낮은 존재량의 분석물의 양보다 약 1.5-배수, 약 2-배수, 약 5-배수, 약 10-배수, 약 25-배수, 약 50-배수, 약 75-배수, 약 100-배수, 약 500-배수, 약 1000-배수, 약 10000-배수, 약 100000-배수, 약 106-배수, 약 107-배수, 약 108-배수, 약 109-배수, 1010-배수, 또는 1010-배수 초과로 더 높다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물의 양은 약 1pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 농도로 샘플에 존재하고 더 낮은 존재량의 분석물은 약 0.0001pg/mL 내지 약 1pg/mL의 농도로 샘플에 존재한다. 실시형태에서, 검정 시스템은 더 높은 존재량의 분석물을 함유하는 결합 도메인에 대해 제1 측정을 선택적으로 수행하고, 더 낮은 존재량의 분석물을 함유하는 결합 도메인에 대해 제2 측정을 선택적으로 수행하도록 구성된다. 실시형태에서, 검정 시스템은 제1 측정으로부터 미리정의된 역치보다 낮은 값을 가진 결합 도메인에 대해 제2 측정을 선택적으로 수행하도록 구성된다. 실시형태에서, 제1 측정과 제2 측정은 순차적으로 수행된다. 실시형태에서, 검정 시스템은 먼저, 더 높은 존재량의 분석물을 함유하는 결합 도메인(들)의 제1 측정; 둘째로, 더 낮은 존재량의 분석물을 함유하는 결합 도메인(들)의 제2 측정을 수행하도록 구성된다. 실시형태에서, 검정 시스템은 제1 측정과 제2 측정을 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 수행하도록 구성된다. 실시형태에서, 검정 시스템은 제1 측정을 수행하고 사용자가 제2 측정이 수행되어야 하는지 여부를 결정할 수 있도록 구성된다. 실시형태에서, 검정 시스템은 제1 측정을 수행하고, 예를 들어 제1 측정에서 측정된 하나 이상의 더 높은 및/또는 더 낮은 존재량의 분석물의 값을 기반으로 제2 측정이 수행되어야 하는지 여부를 자동적으로 결정하도록 구성된다. 예를 들어, 제1 측정이 샘플에서 더 높은 및 더 낮은 존재량의 분석물 둘 모두를 측정하는데 충분한 경우, 제2 측정은 수행되지 않을 수 있다.
본 명세서에서의 방법은 수동으로, 자동화된 기술, 또는 둘 모두를 사용하여 수행될 수 있다. 자동화된 기술은, 예를 들어, 하나 이상의 모듈식 기기 또는 완전히 통합된 자동화된 기기로 부분적으로 자동화될 수 있다. 예시적인 자동화된 시스템 및 장치는 WO 2018/017156, WO 2017/015636 및 WO 2016/164477에 기술되어 있다.
실시형태에서, 본 명세서에서의 방법을 수행하기 위한 자동화된 시스템, 예를 들어 모듈식 및 완전히 통합된 시스템은 다음 자동화된 하위시스템 중 하나 이상을 포함한다: 하드웨어(예를 들어, 개인용 컴퓨터, 랩탑, 하드웨어 프로세서, 디스크, 키보드, 디스플레이, 프린터), 소프트웨어(예를 들어, 드라이버, 드라이버 조절자 및 데이터 분석기와 같은 프로세스), 및/또는 데이터베이스를 포함하는 컴퓨터 하위시스템; 예를 들어 로봇식 피펫팅 핸드, 주사기, 교반 장치, 초음파 혼합 장치 및/또는 자기 혼합 장치를 포함하는 샘플 및/또는 시약 취급을 위한 액체 취급 하위시스템; 예를 들어, 로봇식 조작기, 튜브 또는 뚜껑 또는 포일 천공 장치, 뚜껑 제거 장치, 운반 장치 예컨대 선형 또는 원형 컨베이어, 튜브 랙, 플레이트 캐리어, 트로프 캐리어, 피펫 팁 캐리어, 플레이트 셰이커 및/또는 원심분리기를 포함하는, 샘플, 시약 및/또는 소모품 저장 및 취급 하위시스템; 예를 들어, 유체-기반 및/또는 소모품-기반(예컨대 튜브 및 다중-웰 플레이트)인 검정 반응 하위시스템; 예를 들어, 플레이트 세정 장치를 포함하는 용기 및 소모품 세정 하위시스템; 예를 들어, 플로우 셀 유형, 튜브 유형 및/또는 플레이트 유형인 자성 분리기 또는 자성 입자 농축기 하위시스템; 예를 들어, 유세포분석기 및/또는 쿨터 계수기를 포함하는 세포 및 입자 검출, 분류 및/또는 분리 하위시스템; 예를 들어, 비색계 검출기, 비탁계 검출기, 형광 검출기 및/또는 ECL 검출기를 포함하는 검출 하위시스템; 예를 들어, 공기 처리 시스템, 공기 냉각 시스템, 공기 가온 시스템, 팬, 송풍기 및/또는 수조를 포함하는 온도 제어 하위시스템; 예를 들어, 액체 및/또는 고체 폐기물 용기를 포함하는 폐기물 하위시스템; 예를 들어, 1D 및/또는 2D 바코드 스캐너 예컨대 플랫 베드 및 원드 유형 스캐너를 포함하는 글로벌 고유 식별자(GUI) 검출 하위시스템. 실시형태에서, 자동화된 시스템은 모듈식 또는 완전히 통합된 분석적 하위시스템, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)와 같은 크로마토그래피 시스템, 또는 질량 분석계를 추가로 포함한다.
실시형태에서, 샘플 식별 및 준비를 수행하는 시스템 또는 모듈은 본 명세서의 검정을 수행 및/또는 검출하는 시스템 또는 모듈과 조합, 결부, 인접 및/또는 로봇식으로 연결되거나 커플링된다. 동일한 유형의 다중 모듈식 시스템을 조합하여 처리량을 증가시킬 수 있다. 실시형태에서, 모듈식 시스템은 화학적, 생화학적 및/또는 핵산 분석과 같은 다른 유형의 분석을 수행하는 모듈과 조합된다.
실시형태에서, 자동화된 시스템은 배치, 연속, 무작위-접근 및/또는 현장-검사 작업흐름과 단일, 중간 및 높은 샘플 처리량을 허용한다.
실시형태에서, 자동화된 시스템은 다음 장치 중 하나 이상을 포함한다: 플레이트 밀봉기(예를 들어, ZYMARK), 플레이트 와셔(예를 들어, BIOTEK, TECAN), 시약 분배기, 자동화된 피펫팅 스테이션 및/또는 액체 핸들링 스테이션(예를 들어, TECAN, ZYMARK, LABSYSTEMS, BECKMAN, HAMILTON), 인큐베이터(예를 들어, ZYMARK), 플레이트 셰이커(예를 들어, Q.INSTRUMENTS, INHECO, THERMOFISHER SCIENTIFIC), 플레이트 판독기(예를 들어, MESO® SECTOR S 600, MESO® QUICKPLEX SQ 120, 및 US 6,977,722에 기술된 플레이트 판독기), 화합물 라이브러리 모듈, 샘플 저장 모듈, 및/또는 화합물 및/또는 샘플 검색 모듈. 실시형태에서, 이들 장치 중 하나 이상은 전체 검정 과정이 자동적으로 수행될 수 있도록 로봇식 조립체를 통해 자동화된 시스템에 커플링된다. 실시형태에서, 용기(예를 들어, 플레이트)는 본 명세서에 기술된 장치와 다양한 기구(예를 들어, 플레이트의 더미) 사이에서 수동으로 이동된다.
실시형태에서, 자동화된 시스템은 다음 기능 중 하나 이상을 수행하도록 구성된다: 플레이트와 같은 소모품을 검출 하위시스템 안으로, 그 내로 및 외부로 이동시키는 것; 다른 하위시스템 사이에 소모품을 이동시키는 것; 소모품을 보관하는 것; 샘플 및 시약 핸들링(예를 들어, 시약을 혼합하고/하거나 소모품 안으로 시약 도입하도록 적합화됨); 소모품 쉐이킹(예를 들어, 시약을 혼합 및/또는 반응 속도를 증가시키기 위함); 소모품 세정(예를 들어, 플레이트 세정 및/또는 검정 세정 단계 수행(예를 들어, 웰 흡인)); 플로우 셀 또는 소모품 예컨대 튜브나 플레이트에서 검출가능한 신호, 예를 들어 ECL 신호를 측정하는 것. 자동화된 시스템은 랙 및/또는 다중-웰 플레이트 예컨대 96 또는 384 웰 플레이트에 배치된 개별 튜브를 핸들링하도록 구성될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 자동화된 시스템에 구성성분과 모듈을 통합하는 방법은, 예를 들어 Sargeant 등, "Platform Perfection," Medical Product Outsourcing, May 17, 2010에 의해 논의된다.
실시형태에서, 자동화된 시스템은 완전히 자동화되고, 모듈식이고, 컴퓨터화되고, 다양한 분석물에 대해 시험관내 정량적 및 정성적 테스트를 수행하고/하거나 광도측정 검정, 이온-선택성 전극 측정 및/또는 전기화학발광(ECL) 검정을 수행한다. 실시형태에서, 시스템은 다음 하드웨어 장치 중 하나 이상을 포함한다: 제어 장치, 코어 장치 및 적어도 하나의 분석적 모듈.
실시형태에서, 제어 장치는 그래픽 사용자 인터페이스를 활용하여 모든 기구 기능을 제어하고 판독 장치, 예컨대 모니터; 입력 장치, 예컨대 키보드 및 마우스; 및 예를 들어 윈도우 운영 체제를 사용하는 개인용 컴퓨터를 포함한다. 실시형태에서, 코어 장치는 각각의 할당된 분석적 모듈로의 샘플의 전달을 관리하는 하나 이상의 구성성분을 포함한다. 코어 장치의 실제 구성은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 구성될 수 있는 분석적 모듈의 구성에 따라 달라진다. 실시형태에서, 코어 장치는 적어도 샘플링 장치와 하나의 랙 로터를 주요 구성성분으로 포함한다. 실시형태에서, 제어 장치는 연장 장치, 예를 들어 컨베이어 라인 및/또는 제2 랙 로터를 더 포함한다. 실시형태에서, 코어 장치는 샘플 랙 로더/언로더, 포트, 바코드 판독기(랙 및 샘플용), 물 공급, 및 시스템 인터페이스 포트를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 자동화된 시스템은 ECL 검정을 수행하고 시약 영역, 측정 영역, 소모품 영역 및 사전-세정 영역을 포함한다.
본 명세서에서의 실시형태와 일치하는 검정 장치는, 예를 들어 다음의 바람직한 특성 중 하나 이상을 갖는 다중-웰 플레이트 형식에서 검정을 수행하는데 이용될 수 있다: (i) 높은 인감도, (ii) 큰 동적 범위, (iii) 작은 크기 및 중량, (iv) 어레이-기반 다중화 가능성, (v) 자동화된 작동; (vi) 다중 플레이트를 핸들링하는 능력. 장치 및 방법은 하나 이상의 검출가능한 신호를 측정하는 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 검정 검출 기술과 함께 사용될 수 있다. 일부 양태는 전기화학발광 측정, 특히 미국 특허 번호 7,842,246; 7,807,448; 및 10,281,678에 기술된 것과 같은 통합된 전극이 있는 다중-웰 플레이트(및 이들 플레이트를 사용하는 검정 방법)와 사용하기에 적합한 실시형태에 적합하다.
실시형태에서, 다중-웰 플레이트에서 발광 검정을 수행하기 위한 검정 장치가 제공된다. 예로서, 검정 장치의 실시형태는 광 검출 하위시스템 및 플레이트 핸들링 하위시스템을 포함하며, 여기서 플레이트 핸들링 하위시스템은 발광 측정이 수행될 수 있는 빛이 없는 환경을 제공하는 차광 인클로저를 포함한다. 차광 인클로저는 하우징과 하우징 내에 배치되는 제거가능한 서랍을 포함한다. 하우징은 또한 (수동으로 또는 기계적으로) 서랍 내의 플레이트 전환 스테이지 위로 플레이트가 하강되거나 제거될 수 있는 하나 이상의 플레이트 도입 통공을 갖는 하우징 상부를 포함한다. 하우징에서의 슬라이딩 차광 도어는 발광 측정을 수행하기 이전에 환경의 광으로부터 플레이트 도입 통공을 밀봉하는데 사용된다. 하우징은 하우징 상부에 장착된 광 검출기에 커플링된 검출 통공 및 플레이트 도입 통공 상의 하우징 상부에 장착된 하나 이상의 플레이트 스태커를 더 포함하며, 여기서 플레이트 스태커는 제거가능한 서랍 내의 플레이트 엘리베이터에 플레이트를 전달하거나 수용하도록 구성된다. 제거가능한 서랍에는 특정 검정 처리 및/또는 검출 단계가 수행되는 장치 내의 구역으로 서랍에서 수평으로 플레이트를 전환시키기 위한 플레이트 전환 스테이지가 포함되어 있다. 제거가능한 서랍은 또한 서랍 내에서 상승 및 하강할 수 있는 플레이트 리프팅 플랫폼을 갖는 하나 이상의 플레이트 엘리베이터를 포함하며, 여기서 플레이트 엘리베이터는 하나 이상의 플레이트 도입 통공 아래에 위치된다. 플레이트 전환 스테이지는 검출 통공 아래에 플레이트를 위치시키고 플레이트 리프팅 플랫폼 상의 플레이트 엘리베이터 위에 플레이트를 위치시키도록 구성된다.
검정 장치는 또한 (예를 들어, 차광 커넥터 또는 배플을 통해) 하우징 상단 상의 검출 통공에 장착되는 광 검출기를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 광 검출기는 CCD 카메라와 같은 이미징 광 검출기이고 렌즈를 포함할 수도 있다. 광 검출기는 포토다이오드, 애벌런치 포토다이오드, 광전자증배관 등과 같은 통상적인 광 검출기일 수 있다. 적합한 광 검출기는 또한 그러한 광 검출기의 어레이를 포함한다. 사용될 수 있는 광 검출기는 CCD 및 CMOS 카메라와 같은 이미징 시스템을 또한 포함한다. 광 검출기는 또한 검출기 상에 광을 지향시키고, 집중시키고/시키거나 이미징하기 위한 렌즈, 광 가이드 등을 포함할 수 있다. 특정한 특정 실시형태에서, 이미징 시스템은 검정 플레이트의 하나 이상의 웰에서의 결합 도메인의 어레이로부터 발광을 이미지화하기 위해 사용되고, 검정 장치는 어레이의 개별 요소로부터 방출되는 발광에 대한 발광 값을 보고한다. 광 검출기는 차광 씰로 하우징 상단 상에 장착된다. 장치의 추가 구성성분은 플레이트에 전기적 접촉을 만들고 광 검출기 아래에 위치한 웰에서의 전극에 전기 에너지를 제공하기 위한(예를 들어 ECL을 유도하기 위한) 플레이트 접점을 포함한다.
실시형태에서, 검정 장치는 샘플 플레이트의 자동화된 식별을 위한 식별자 조절자와 같은 특징을 포함한다. 실시형태에서, 식별자 조절자는 하우징 상단에서의 통공 위에 차광 씰을 통해 장착된 바코드 판독기이며, 여기서 바코드 판독기는 하우징 내의 플레이트 전환 스테이지 상에 배치된 플레이트 상의 바코드를 판독하도록 구성된다. 바람직한 실시형태에서, 플레이트가 서랍 안으로 내려갈 때 플레이트 상의 바코드가 판독된다. 대안적인 또는 추가 실시형태에서, 플레이트는 EEPROM 또는 RFID와 같은 식별자를 포함하고, 하우징 상부 및/또는 서랍은 이들 식별자 각각과 통신하기에 적합한 식별자 조절자를 포함한다. 추가 실시형태에서, 식별자 조절자는 장치와 별도로 제공될 수 있다. 이 실시형태에서, 플레이트에 부착되거나 플레이트 또는 플레이트 세트와 연관된 식별자에 저장된 정보는 컴퓨터 및/또는 그에 부착된 네트워크를 통해 장치로 전송되고/되거나 컴퓨터의 사용자 인터페이스 및/또는 네트워크를 통해 수동으로 입력된다. 이와 관련하여, 미국 특허 공개 번호 2011/0022331 및 미국 특허 번호 8,770,471을 참조한다.
일부 경우에, 플레이트 핸들링 하위시스템은 플레이트 도입 통공 위의 하우징 상부에 장착된 하나 이상의 플레이트 스태커를 더 포함하며, 플레이트 스태커는 플레이트 엘리베이터에 플레이트를 전달하거나 수용하도록 구성된다. 플레이트 핸들링 하위시스템은 원하는 조건 하에서 하위시스템의 온도를 유지하기 위해 가열 및/또는 냉각 메커니즘(예를 들어, 저항 히터, 팬, 방열판 또는 열전기 히터/쿨러)을 선택적으로 포함한다. 이는 또한 원하는 조건 하에서 하위시스템의 습도를 유지하기 위한 습도 제어 메커니즘(예를 들어, 가습기 및/또는 제습기 또는 건조제 챔버를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이 검정 장치는 보정 검정과 샘플 검정 둘 모두 수행하도록 구성된다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 보정 검정은 정의된 양의 분석물을 갖는 보정 샘플에 대해 수행되는 검정을 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 각각의 알려지지 않은 양의 분석물을 갖는 하나 이상의 테스트 샘플에 대한 샘플 검정. 테스트 샘플에 대한 샘플 검정을 수행하면 샘플 검정 신호 값이 생성된다. 샘플 검정 신호 값은 이와 연관된 분석물의 알려지지 않은 양을 나타낸다.
실시형태에서, 컴퓨터 시스템이 본 명세서에 제공된다. 컴퓨팅 시스템은 하나 이상의 프로세서(본 명세서에서는 처리 유닛로도 상호교환적으로 지칭됨), 하나 이상의 저장 장치(들), 및/또는 기타 구성성분을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 프로세서의 기능성은 하드웨어(예를 들어, 주문형 집적 회로("ASIC"), 프로그래밍가능한 게이트 어레이("PGA"), 필드 프로그래밍가능한 게이트 어레이("FPGA"), 등) 또는 하드웨어와 소프트웨어의 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다. 저장 장치는 임의의 유형의 비-일시적 컴퓨터 판독가능한 저장 매체(또는 매체들) 및/또는 비-일시적 컴퓨터 판독가능한 저장 장치를 포함한다. 이러한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체 또는 장치는 프로세서가 본 명세서에 기술된 하나 이상의 방법론을 수행하게 하기 위한 컴퓨터 판독가능한 프로그램 명령을 저장할 수 있다. 컴퓨터 판독가능한 저장 매체 또는 장치의 예는 전자 저장 장치, 자기 저장 장치, 광학 저장 장치, 전자기 저장 장치, 반도체 저장 장치 또는 이의 임의의 적합한 조합, 예를 들어, 예컨대, 이들 예에만 제한되지는 않지만, 컴퓨터 디스켓, 하드 디스크, 랜덤 액세스 메모리(RAM), 읽기-전용 메모리(ROM), 지울 수 있는 프로그래밍가능한 읽기-전용 메모리(EPROM 또는 플래시 메모리), 정적 기억 장치(SRAM), 휴대용 컴팩트 디스크 읽기-전용 메모리(CD-ROM), 디지털 다목적 디스크(DVD), 메모리 스틱을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
프로세서는 저장 장치에 저장되고 프로세서에 의해 실행가능한 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 명령에 의해 프로그래밍된다. 예를 들어, 프로세서는 프로토콜 관리자, 네트워크 관리자, 데이터 관리자, 보정 맞춤 관리자, 분석 관리자 및 사용자 인터페이스 관리자에 의해 프로그래밍된다. 본 명세서에 논의된 다양한 관리자의 기능성은 대표적인 것이고 제한적이지 않다는 것이 이해될 것이다. 추가적으로, 저장 장치는 검정 시스템 환경에 대한 데이터 저장을 제공하는 데이터 저장 장치로서 작용할 수 있다. 편의상 본 명세서에서 사용된, 다양한 "관리자"는 실제로는 관리자가 작동을 수행하도록 프로세서(그리고 따라서 컴퓨팅 시스템)를 프로그래밍할 때 작동을 수행하는 것으로 기술될 것이다.
프로토콜 관리자는 컴퓨팅 시스템에서 작동할 수 있는 소프트웨어 프로토콜(예를 들어, 소프트웨어 모듈 또는 라이브러리)이다. 프로토콜 관리자는 하나 이상의 검정 장치에 하나 이상의 제어 신호를 제공하도록 구성된다. 프로토콜 관리자에 의해 제공된 제어 신호는 하나 이상의 검정 장치를 작동하는데 필요한 명령을 제공하도록 구성된다. 제어 신호는 하나 이상의 검정 장치에 의해 수행되는 하나 이상의 검정 프로토콜을 특정할 수 있다. 프로토콜 관리자에 의해 제공된 제어 신호는 본 명세서에 기술된 검정 장치가 수행할 수 있는 임의의 프로세스를 개시 및/또는 제어하는데 사용될 수 있다.
실시형태에서, 프로토콜 관리자는 하나 이상의 검정 장치의 작동 중에 수집된 데이터를 수신하도록 추가로 작동할 수 있다. 이러한 데이터는, 예를 들어 보정 검정 데이터 및 샘플 검정 데이터를 포함할 수 있다. 수신된 데이터는 데이터 관리자를 통해 처리되거나 저장될 수 있다.
프로토콜 관리자는 보정 검정을 수행하기 위해 하나 이상의 검정 장치를 제어하도록 작동하도록 구성된다. 검정 장치는 정의된 양의 분석물을 갖는 복수의 보정 샘플(예를 들어, 다중-웰 플레이트에서의 캘리브레이터로 저장된 보정 샘플)에 대한 보정 검정 측정을 얻기 위해 프로토콜 관리자에 의해 제어될 수 있다. 복수의 보정 샘플은 상이한 양의 분석물을 포함할 수 있다. 프로토콜 관리자는 복수의 보정 샘플에 상응하는 보정 검정 신호 값을 결정하도록 작동한다. 프로토콜 관리자는 하나 이상의 보정 데이터 세트를 결정하기 위해 보정 검정을 수행하도록 구성된다. 보정 데이터 세트는 복수의 수량 값을 상응하는 복수의 보정 검정 신호 값에 관련시키는 정보를 포함한다.
프로토콜 관리자는 샘플 검정을 수행하기 위해 하나 이상의 검정 장치를 제어하도록 작동하도록 추가로 구성된다. 검정 장치는 알려지지 않은 양의 분석물을 갖는 복수의 테스트 샘플(예를 들어, 다중-웰 플레이트에 배치된 테스트 샘플)에 대한 샘플 검정 측정을 얻기 위해 프로토콜 관리자에 의해 제어될 수 있다. 프로토콜 관리자는 복수의 테스트 샘플에 상응하는 샘플 검정 신호 값을 결정하도록 작동한다. 프로토콜 관리자는 하나 이상의 샘플 검정 데이터 세트를 결정하기 위해 샘플 검정을 수행하도록 구성된다. 샘플 검정 데이터 세트는 샘플 검정 신호 값을 샘플 식별 데이터에 관련시키는 정보를 포함할 수 있다. 샘플 식별 데이터는 플레이트 위치와 같이 테스트 샘플을 식별하는데 적합한 임의의 데이터를 포함할 수 있다.
네트워크 관리자는 컴퓨팅 시스템에서 동작할 수 있는 소프트웨어 프로토콜(예를 들어, 소프트웨어 모듈 또는 라이브러리)이다. 네트워크 관리자는 네트워크, 검정 장치, 데이터 저장 장치 및/또는 검정 시스템 환경에서의 임의의 기타 장치 간에 네트워크 통신을 확립하도록 구성된다. 확립된 통신 경로는 임의의 적절한 네트워크 전송 프로토콜을 활용하고 단방향 또는 양방향 데이터 전송을 제공할 수 있다. 네트워크 관리자는 검정 시스템 환경의 다양한 요소와 통신하는데 필요한 만큼 많은 네트워크 통신을 확립할 수 있다.
네트워크 관리자는 샘플 검정 데이터, 보정 검정 데이터(보정 검정 정보로도 지칭됨), 샘플 검정 및 보정 검정 프로토콜, 보정 모델, 임의의 기타 정보의 송부 및 수신을 용이하게 하고/하거나 검정 시스템 환경의 작동과 일치한다.
데이터 관리자는 컴퓨팅 시스템 상에서 작동할 수 있는 소프트웨어 프로토콜 또는 소프트웨어 모듈이다. 데이터 관리자는 검정 시스템 환경의 하나 이상의 검정 장치의 샘플 검정 데이터 및 보정 검정 데이터와 같은 검정 데이터에 접근하도록 구성된다. 검정 데이터는, 예를 들어 거의 실시간으로 얻을 수 있는 샘플 검정 데이터 세트 및 보정 데이터 세트를 포함할 수 있고, 수록된 데이터일 수 있고/있거나 데이터 추출물뿐만 아니라, 프로세스 정보와 프로세스 매개변수 정보 및 검정 장치에 의해 생성되거나 저장된 임의의 기타 정보 또는 데이터일 수 있다. 데이터 관리자는 하나 이상의 데이터 저장 장치, 로컬 검정 컴퓨터 시스템 및/또는 네트워크로 연결된 컴퓨터 시스템에 액세스하고 이들 중 임의의 것 또는 전부에 저장된 검정 데이터를 저장 및/또는 수신하도록 추가로 구성된다. 추가 실시형태에서, 데이터 관리자는 검정 데이터를 저장할 수 있는 다양한 제거가능한 물리적 저장 매체에 액세스하도록 구성된다.
데이터 관리자는 사용자 인터페이스 관리자를 통해 사용자에게 데이터를 제공할 수 있다. 실시형태에서, 데이터 관리자는 검정 데이터(검정 시스템 데이터로도 지칭됨)를 관리하고 조작하기 위해 사용자에게 액세스 도구를 제공하도록 추가로 구성된다. 예를 들어, 데이터 관리자 616은 보고서를 생성하고, 검정 시스템 데이터를 대조하고, 검정 시스템 데이터를 교차-참조하고, 데이터베이스에 검정 시스템 데이터를 채우는 등을 하도록 구성될 수 있다. 실시형태에서, 데이터 관리자는 데이터 보유 가능성을 제공할 수 있다. 데이터 관리자는 검정 시스템 환경 내에서 수집 및/또는 사용되는 임의의 및 모든 데이터를 수신하고 저장하도록 추가로 구성된다.
항체 및 조성물
실시형태에서, 발명은 전기화학발광(ECL) 표지에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
일반적으로, 항체(용어 "면역글로불린"과 상호교환적으로 사용됨)는 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하고; 전형적으로 항체는 중쇄와 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 중쇄와 경쇄 둘 모두는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 분할된다. 일반적으로, 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정하고, 중쇄(CH1, CH2, 또는 CH3) 또는 경쇄(CL)의 불변 도메인은 분비, 수용체 결합, 상보체 결합 등과 같은 생물학적 특성을 부여한다. 일반적으로, 항체 사슬의 N-말단 부분은 가변 부분이고, C-말단 부분은 불변 영역이고; CH3 및 CL 도메인은 전형적으로 각각 중쇄 및 경쇄의 C-말단을 포함한다.
일반적으로, 항체는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 인코딩된다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 각각 면역글로불린 부류인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 차례로 정의한다.
일반적으로, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합할 수 있게 한다. 따라서, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인 내의 상보성 결정 영역(CDR)의 서브세트가 결합하여 항원 결합 도메인을 형성하는 가변 영역을 형성한다. 항원 결합 도메인은 전형적으로 각각의 VL 및 VH 도메인 상의 3개의 CDR에 의해 정의된다. 전형적으로 각각의 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치되는 아미노산의 짧은 비-연속 서열이다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 이 상보적인 표면은 그 동족 에피토프에 대한 항체의 비-공유 결합을 촉진한다.
실시형태에서, 발명은 전기화학발광(ECL) 표지에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG2a, IgG2b 또는 IgG2c 서브클래스 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스, 랫트, 염소, 토끼, 닭, 기니피그, 햄스터, 말 또는 양으로부터 유래된다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스로부터 유래된다.
ECL 표지는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, ECL 표지는 전기화학발광 유기금속 복합체을 포함한다. 실시형태에서, 전기화학발광 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴, 이리듐, 레늄 및/또는 란탄족 금속을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 루테늄을 포함한다. 실시형태에서, 전기화학발광 유기금속 복합체는 치환된 또는 비치환된 바이피리딘 또는 치환된 또는 비치환된 페난트롤린을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 치환된 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트기를 포함한다. 실시형태에서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하고, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 공유 연결을 형성할 수 있는 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하고, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 여기서 제3 리간드는 공유 연결을 형성할 수 있는 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, 제3 리간드는 접합 링커를 포함하는 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 접합 링커는 본 명세서에서 추가로 기술된다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 식 II, 식 IV, 또는 식 VI의 화합물에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 다음에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다:
또는
실시형태에서, 발명은 ECL 표지에 특이적인 항원 결합 도메인 및 접합 링커를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 접합 링커가 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 접합 링커는 아미드, 티오에스테르, 티오에테르, 디설파이드, 이민, 트리아졸, 디하이드로피리다진, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 친수성 중합체, 또는 이의 조합을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 아미드를 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 티오에스테르를 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 티오에테르를 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 디설파이드을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 이민을 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 트리아졸을 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지 및 디하이드로피리다진에 특이적으로 결합한다.
실시형태에서, 접합 링커는 스페이서(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 친수성 중합체)를 포함하고, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 접합 링커의 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 친수성 중합체의 적어도 일부를 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 접합 링커의 펩티드의 적어도 일부를 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 접합 링커의 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 접합 링커의 친수성 중합체의 적어도 일부를 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 핵산 프로브를 추가로 포함한다. 핵산 프로브는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 핵산 프로브는 주형 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 핵산 프로브는 연장 반응, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 자가-지속된 합성 반응(3SR) 및/또는 등온 증폭(예컨대, 예를 들어, 헬리카제-의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭)을 위한 프라이머이다.
실시형태에서, 발명은 (a) 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 핵산 프로브를 포함하는 것; 및 (b) 핵산 프로브에 결합할 수 있는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 주형 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 추가로 기술되어 있다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 결합 모이어티는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 본 명세서에 기술된 검출가능한 모이어티에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 비오틴을 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함한다.
실시형태에서, 발명은 (a) 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 결합 모이어티를 포함하는 것; 및 (b) (i) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (ii) 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티를 포함하는 조성물을 제공한다. 검출가능한 모이어티는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 하나 초과의 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 표지된 프로브는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과의 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 결합한다. 결합 모이어티가 올리고뉴클레오티드를 포함하는 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 결합 모이어티가 비오틴을 포함하는 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다. 결합 모이어티가 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 비오틴을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함한다.
검출가능한 표지는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장 또는 이의 조합에 의해 검출될 수 있다. 실시형태에서, 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 ECL 표지를 포함한다.
실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 여기서 제2 리간드는 검출가능한 모이어티에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다. 실시형태에서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 여기서 제3 리간드는 검출가능한 모이어티에 공유원자가로 연결된 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함한다.
실시형태에서, 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 효소를 추가로 포함한다. 효소는 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 효소는 HRP, AP 또는 β-갈락토시다제이다.
실시형태에서, 발명은 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 효소를 포함한다. 실시형태에서, 조성물은 효소의 기질을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 효소는 HRP이고 기질은 TMB, ABTS 또는 OPD이다. 실시형태에서, 효소는 AP이고 기질은 PNPP이다. 실시형태에서, 효소는 β-갈락토시다제이고 기질은 ONPG이다. HRP, AP 및 β-갈락토시다제와 같은 효소, 및 TMB, ABTS, OPD, PNPP 및 ONPG를 포함한 이의 기질은 본 명세서에 추가로 기술되어 있다.
키트
실시형태에서, 발명은 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에: (a) 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; (b) 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약으로서, 여기서 검출 시약은 제1 검출가능한 표지를 포함하는, 검출 시약; 및 (c) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 포함하는 관심있는 분석물을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 키트는 표면을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 제1 검출 시약이고, 키트는 분석물에 특이적으로 결합하는 제2 검출 시약을 추가로 포함하며, 여기서 제2 검출 시약은 제1 검출가능한 표지를 포함한다.
실시형태에서, 발명은 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에: (a) 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; (b) 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약으로서, 여기서 검출 시약은 제1 핵산 프로브를 포함하는, 검출 시약; (c) 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 표지된 프로브; 및 (d) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 포함하는 관심있는 분석물을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 키트는 표면을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 발명은 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에: (a) 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; (b) 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약으로서, 여기서 검출 시약은 ECL 표지를 포함하는, 검출 시약; 및 (c) ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 포함하는 관심있는 분석물을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 실시형태에서, 키트는 표면을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 검출 시약은 제1 검출 시약이고, 키트는 분석물에 특이적으로 결합하는 제2 검출 시약을 추가로 포함하며, 여기서 제2 검출 시약은 ECL 표지를 포함한다.
실시형태에서, 발명은 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에: (a) 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; (b) 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약으로서, 여기서 검출 시약은 제1 핵산 프로브를 포함하는, 검출 시약; (c) 제1 ECL 표지를 포함하는 제1 표지된 프로브; 및 (d) 제1 ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 포함하는 관심있는 분석물을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 실시형태에서, 키트는 표면을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은, ECL 표지에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하고, 결합 모이어티를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 실시형태에서, 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은, ECL 표지에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하고 효소를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 실시형태에서, 키트는 포획 시약 및 검출 시약 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함하며, 여기서 검출 시약은 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 포획 시약, 제1 검출 시약, 제2 검출 시약 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2 검출 시약은 각각 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 표면을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은, ECL 표지에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하고 핵산 프로브를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 실시형태에서, 키트는 앵커링 시약, 주형 올리고뉴클레오티드, 표지된 프로브, 중합효소, 리가제, 완충액, 차단제, 공-반응물, 희석제, 안정화제, 보정제, 검정 소모품 또는 이의 조합을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트는 포획 시약 및 검출 시약 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함하며, 여기서 검출 시약은 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 포획 시약, 제1 검출 시약, 제2 검출 시약 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2 검출 시약은 각각 ECL 표지를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 표면을 추가로 포함한다.
포획 시약, 검출 시약, 예를 들어 제1 및 제2 검출 시약, 제1 검출가능한 표지 및 신호 증폭 시약은 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 포획 시약, 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약, 및 신호 증폭 시약은 각각 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 합텐, 에피토프, 미모토프 또는 압타머를 포함한다. 실시형태에서, 포획 시약, 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약, 및 신호 증폭 시약은 각각 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 IgG 항체이다.
실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지이다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 ECL 표지에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. ECL 표지는 본 명세서에 기술되어 있다.
실시형태에서, ECL 표지는 식 II의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 식 III의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 식 IV의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 식 V의 화합물이다. 실시형태에서, ECL 표지는 식 VI의 화합물이다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 결합 모이어티를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 결합 모이어티를 신호 증폭 시약에 접합시키기 위한 시약을 추가로 포함한다. 결합 모이어티는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 비오틴을 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다. 실시형태에서, 키트는 (i) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (ii) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티를 추가로 포함한다. 검출가능한 모이어티는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 검출가능한 모이어티는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 결합 모이어티는 비오틴을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다. 결합 모이어티가 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 비오틴을 포함한다.
실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 하나 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 검출가능한 모이어티는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 효소를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 효소의 기질을 추가로 포함한다. 효소 및 이의 기질은 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 효소는 HRP이고 기질은 TMB, ABTS 또는 OPD이다. 실시형태에서, 효소는 AP이고 기질은 PNPP이다. 실시형태에서, 효소는 β-갈락토시다제이고 기질은 ONPG이다. 실시형태에서, 기질은 본 명세서에 기술된 바와 같은 발색 기질, 형광 기질, 또는 화학발광 기질이다.
실시형태에서, 신호 증폭 시약은 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 하나 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 ECL 표지이다.
실시형태에서, 검출 시약은 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 검출 시약은 각각 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 핵산 프로브를 신호 증폭 시약에 접합시키기 위한 시약을 추가로 포함한다. 핵산 프로브는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 핵산 프로브는, 본 명세서에 기술된 바와 같이 연장된 서열을 형성하기 위한 연장 반응, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 자가-지속된 합성 반응(3SR) 및/또는 등온 증폭(예컨대, 예를 들어, 헬리카제-의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭)을 위한 프라이머이다. 실시형태에서, 키트는 예를 들어 연장 반응을 수행하기 위한 주형 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트는 예를 들어 연장 반응으로부터 생성된 연장된 서열에 결합하기 위한 앵커링 시약을 추가로 포함한다. 주형 올리고뉴클레오티드 및 앵커링 시약은 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 표지된 프로브를 추가로 포함하며, 여기서 표지된 프로브 및 연장된 서열은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 표지된 프로브는 하나 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 표지된 프로브는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과의 검출가능한 제2 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다.
실시형태에서, 검출 시약은 제1 핵산 프로브를 포함하고, 신호 증폭 시약은 제2 핵산 프로브를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 제1 핵산 프로브를 검출 시약에 접합시키기 위한 시약을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트는 제2 핵산 프로브를 신호 증폭 시약에 접합시키기 위한 시약을 추가로 포함한다. 제1 및 제2 핵산 프로브는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 키트는 예를 들어 제1 및 제2 핵산 프로브를 연장시키기 위한 하나 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같이 각각 제1 및 제2 연장된 서열에 결합하는 제1 및 제2 앵커링 시약을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 표지된 프로브를 추가로 포함하며, 여기서 제1 표지된 프로브 및 제1 연장된 서열은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 하나 초과의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제1 표지된 프로브는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 제2 표지된 프로브를 추가로 포함하며, 여기서 제2 표지된 프로브 및 제2 연장된 서열은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에서, 제2 표지된 프로브는 하나 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 실시형태에서, 제2 표지된 프로브는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 제1 및 제2 표지된 프로브는 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 제2 검출가능한 표지와 검출가능하게 구별된다.
실시형태에서, 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약은 동결건조된다. 실시형태에서, 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약은 용액에 제공된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 동결건조된다. 실시형태에서, 신호 증폭 시약은 용액에 제공된다. 실시형태에서, 포획 시약은 키트에 제공된 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 동결건조되거나 용액에 제공되고, 키트는 포획 시약을 표면에 고정화시키기 위한 시약을 추가로 포함한다. 앵커링 시약(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 연장된 서열에 결합하기 위한 앵커링, 제1 연장된 서열에 결합하기 위한 제1 앵커링 시약, 및/또는 제2 연장된 서열에 결합하기 위한 제2 앵커링 시약)을 포함하는 실시형태에서, 앵커링 시약은 키트에 제공된 표면 상에 고정화된다. 실시형태에서, 앵커링 시약은 동결건조되거나 용액에 제공되고, 키트는 앵커링 시약을 표면에 고정화시키기 위한 시약을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약의 약 1nm 내지 약 500nm, 약 5nm 내지 약 250nm, 약 10nm 내지 약 200nm, 또는 약 15nm 내지 약 150nm 내에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약으로부터 1μm 미만에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약으로부터 500nm 미만에 고정화된다. 실시형태에서, 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약으로부터 200nm 미만에 고정화된다. 예를 들어 표적화제/표적화제 상보체, 연결제/보조 연결제 및 가교제를 통해 포획 및/또는 앵커링 시약을 표면에 고정화시키기 위한 시약 및 방법은 본 명세서에 기술되어 있다.
실시형태에서, 본 명세서에 제공된 키트는 표면을 추가로 포함한다. 실시형태에서 표면은 플레이트이다. 실시형태에서, 표면은 다중-웰 플레이트이다. 실시형태에서 표면은 입자이다. 실시형태에서, 키트는 입자 배열을 포함한다. 실시형태에서 표면은 카트리지이다. 실시형태에서, 표면은 전극을 포함한다. 실시형태에서, 전극은 탄소 잉크 전극이다.
실시형태에서, 포획, 검출 및/또는 신호 증폭 시약 및 키트의 기타 구성성분은 별도로 제공된다. 실시형태에서, 키트의 구성성분은 최적의 배송 또는 보관 온도에 따라 별도로 제공된다.
실시형태에서, 키트는 보정 시약을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 보정 시약은 알려진 양의 분석물을 포함한다. 실시형태에서, 키트는 광범위한 농도의 분석물을 포함하는 다중 보정 시약을 포함한다. 실시형태에서, 다중 보정 시약은 방법에 대한 정량화의 상한 및 하한에 가까운 분석물의 농도를 포함한다. 실시형태에서, 다중 보정 시약은 방법의 전체 동적 범위에 걸쳐 있다. 실시형태에서, 보정 시약은 양성 대조군 시약이다. 실시형태에서, 보정 시약은 음성 대조군 시약이다. 실시형태에서, 양성 또는 음성 대조군 시약은 본 발명의 방법으로 테스트되는 샘플에 대한 비교의 기반을 제공하는데 사용된다. 실시형태에서, 보정 시약은 동결건조된다. 실시형태에서 보정 시약은 용액에 제공된다.
실시형태에서, 키트는 중합효소, 리가아제, 완충액, 차단제, 공-반응물, 희석제, 안정화제, 보정제, 검정 소모품, 전극 또는 이의 조합을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 키트는 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 자가-지속된 합성 반응(3SR) 및/또는 등온 증폭(예를 들어, 헬리카제-의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭)을 수행하기 위한 중합효소를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트는 예를 들어 주형 올리고뉴클레오티드를 결찰하기 위한 리가아제를 추가로 포함한다.
실시형태에서, 키트는 완충액, 예를 들어 검정 완충액, 재구성 완충액, 저장 완충액, 판독 완충액 또는 이의 조합을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트는, 예를 들어 전기화학발광 측정을 수행하기 위한 공-반응물을 추가로 포함한다. 예시적인 공-반응물은, 예를 들어 WO 2020/142313에 기재되어 있다.
실시형태에서, 키트는, 예를 들어 본 명세서에 기술된 포획 시약 및 검출 시약, 또는 포획 시약 및 제1 및 제2 검출 시약에 대한 관심있는 분석물 이외의 구성성분에 의한 비-특이적 결합을 감소시키기 위한 차단제를 추가로 포함한다. 예시적인 차단제는 mBSA, 전단된 폴리(A), 폴리BSA-I, mIgG, Tween, 폴리BSA-II, 효모 RNA, mBSA + 폴리(a) 및/또는 폴리BSA + 폴리(A)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 실시형태에서, 키트는 키트의 하나 이상의 구성성분에 대한 희석제를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 상기의 구성성분을 포함하는 키트는 본 명세서에 제공된 방법에 대한 작업 농도의 5X, 10X, 20X, 30X, 40X, 50X, 60X, 70X, 80X, 90X, 100X, 125X, 150X 또는 더 높은 배수 농도인 구성성분의 스톡 농도를 포함한다. 실시형태에서, 키트는, 예를 들어 키트의 하나 이상의 구성성분을 보관하기 위한 안정화제를 추가로 포함한다.
실시형태에서, 키트는 검정 소모품, 예를 들어 검정 모듈, 바이알, 튜브, 피펫 팁, 커버 및 밀봉재, 랙, 표지 등과 같은 액체 핸들링 및 전달 장치를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트는, 예를 들어 전기화학발광 측정을 수행하기 위한 전극을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 전극은 본 명세서에 제공된 표면에 적용된다. 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위한 검정 도구 및/또는 명령을 추가로 포함한다.
당업자는 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에 제공될 수 있는 본 명세서에 기술된 키트의 구성성분이 반드시 동일한 용기, 예를 들어 동일한 상자에 및/또는 동시에 포함될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 키트의 구성성분은 동시적으로 또는 순차적으로 하나 이상의 별도 용기 또는 구획에 제공된다. 사용자가 키트의 구성성분(예를 들어, 본 명세서에 기술된 신호 증폭 시약)을 별도로, 예를 들어 하나 이상의 별도 용기 또는 구획에서 획득(예를 들어, 구매 또는 소유)할 수 있으나, 그럼에도 불구하고 구성성분은, 예를 들어 본 명세서의 실시형태에 기술된 것처럼 조합하여 사용될 때 "키트"의 일부로 간주된다는 것이 당업자에 의해 추가로 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 단일 포장 또는 용기에 함께 공급되는 다중 용기, 바이알 또는 구획을 포함한다.
실시형태에서, 발명은 복수의 제1 키트와 제2 키트를 포함하는 키트 세트를 제공하며, 여기서 각각의 제1 키트는 고유한 관심있는 분석물을 검출하기 위한 것이며, 여기서 각각의 제1 키트는: (a) 고유한 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; 및 (b) 각각 (i) 고유한 분석물에 특이적으로 결합하고 (ii) 제1 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약을 포함하고; 여기서 제2 키트는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 키트는 표면을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트 세트는 표면을 포함하는 제3 키트를 추가로 포함한다. 키트의 구성성분은 본 명세서에 추가로 기술되어 있다.
실시형태에서, 발명은 복수의 제1 키트와 제2 키트를 포함하는 키트 세트를 제공하며, 여기서 각각의 제1 키트는 고유한 관심있는 분석물을 검출하기 위한 것이며, 여기서 각각의 제1 키트는: (a) 고유한 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; (b) (i) 고유한 분석물에 특이적으로 결합하고 (ii) 제1 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약; 및 (c) 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 표지된 프로브를 포함하고; 여기서 제2 키트는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 포함한다. 실시형태에서, 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지이다. 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 키트는 표면을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트 세트는 표면을 포함하는 제3 키트를 추가로 포함한다. 키트의 구성성분은 본 명세서에 추가로 기술되어 있다.
실시형태에서, 키트 세트는 샘플에서 관심있는 다중 분석물을 검출할 수 있으며, 여기서 분석물은 약 0.0001pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 범위인 농도로 존재한다. 실시형태에서, 샘플은 가장 낮은 존재량의 분석물보다 10, 100, 1000, 10000, 100000, 106, 107, 108, 109 또는 1010 배수 더 높은 농도를 갖는 하나 이상의 분석물을 포함한다. 실시형태에서, 각각의 제1 키트는 샘플에서 더 높은 존재량의 분석물을 검출할 수 있다. 실시형태에서, 각각의 제1 키트는 샘플에서 더 낮은 존재량의 분석물을 검출할 수 없다. 실시형태에서, 제1 키트와 제2 키트의 구성성분의 조합은 샘플에서 더 낮은 존재량의 분석물을 검출할 수 있다. 실시형태에서, 샘플에 존재하는 더 높은 존재량의 분석물의 양은 더 낮은 존재량의 분석물의 양보다 약 1.5-배수, 약 2-배수, 약 5-배수, 약 10-배수, 약 25-배수, 약 50-배수, 약 75-배수, 약 100-배수, 약 500-배수, 약 1000-배수, 약 10000-배수, 약 100000-배수, 약 106-배수, 약 107-배수, 약 108-배수, 약 109-배수, 또는 1010-배수 초과로 더 높다. 실시형태에서, 더 높은 존재량의 분석물의 양은 약 1pg/mL 내지 약 100000pg/mL의 농도로 샘플에 존재하고, 더 낮은 존재량의 분석물의 양은 약 0.0001pg/mL 내지 약 1pg/mL의 농도로 샘플에 존재한다.
실시형태에서, 사용자는 하나 이상의 제1 키트의 구성성분을 사용하여 하나 이상의 관심있는 분석물을 검출하는 단계; 및, 임의의 하나 이상의 분석물이 실질적으로 검출되지 않는 경우, 제2 키트의 신호 증폭 시약을 추가하여 하나 이상의 실질적으로 검출되지 않은 분석물에 대한 증폭된 검정 신호를 제공하는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 수행한다.
실시형태에서, 발명은 사용자에게 제1 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하기 위한 제1 키트를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 키트는 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에: (a) 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; 및 (b) 각각 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약 또는 제1 및 제2 검출 시약을 포함하는, 단계; 사용자에게 제2 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 제2 키트를 제공하는 단계로서, 여기서 제2 키트는 신호 증폭 시약을 포함하고; 제1 샘플은 제2 샘플에 비해 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는, 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 키트는 표면을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키트 세트는 표면을 포함하는 제3 키트를 추가로 포함한다. 키트의 구성성분은 본 명세서에 추가로 기술되어 있다. 실시형태에서, 발명은 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하기 위한 제2 키트를 사용자에게 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 키트는 표지된 검출 시약 또는 표지된 제1 및 제2 검출 시약 상의 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 포함하고, 여기서 제2 키트는 (a) 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약; 및 (b) 각각 분석물에 특이적으로 결합하는 표지된 검출 시약 또는 표지된 제1 및 제2 검출 시약을 포함하는 제1 키트와 연계하여 사용하기 위해 설계된다.
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등을 포함하여 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌과 거기에 인용된 참고문헌은 그것이 아직 있지 않은 정도로 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
실시예
실시예 1. ECL 표지에 대한 단일클론 항체 개발
MSD SULFO-TAG™ ECL 표지(MESO SCALE DISCOVERY®, 메릴랜드주 록빌 소재)에 대한 항체를 개발하고 스크리닝하기 위한 실험을 수행하였다.
a) 시약 제조
접합되지 않은 MSD GOLD SULFO-TAG™ NHS-에스테르(이하 "SULFO-TAG"로 지칭함)를 IMJECT™ EDC mcKLH Spin Kit(Thermo Fisher Scientific, 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 별도로 접합시켰다. SULFO-TAG는 전형적인 단백질 접합 프로토콜을 사용하여 단량체 소 혈청 알부민(BSA)에 별도로 접합시켰다. KLH-접합된 SULFO-TAG를 면역원으로 사용하였고, BSA-접합된 SULFO-TAG를 스크리닝 시약으로 사용하였다. 각각의 웰에 7개의 별개의 결합 도메인("스팟")을 함유하는 96-웰 검정 플레이트를 스팟 중 하나에 염소-항-마우스("GAM") 항체로 고정시키는 반면 나머지 스팟은 BSA로 코팅했다. 플레이트를 항-혈청 또는 하이브리도마 스크리닝에 사용하였다.
b) 면역화
6마리 6 내지 8주령의 암컷 마우스(Balb/C 마우스 2마리, CFW 마우스 2마리, CD-1 마우스 2마리)의 그룹을 면역화에 사용하였다. 모든 마우스에게 0일차에 완전 프로인트 보조제와 혼합된 40μg의 KLH-SULFO-TAG를, 그리고 14, 28, 42 및 56일차에 불완전 프로인트 보조제와 혼합된 20μg의 KLH-SULFO-TAG를 피하로(SC) 및 복강내로(IP) 주사했다. 36 및 64일차에 수집된 혈청 샘플을 2가지 다른 검정에 의해 다양한 희석에서 면역 반응에 대해 테스트했다. 상기에서 기술된 바와 같이, GAM은 96-웰 검정 플레이트에서의 7개 스팟 중 하나에 고정화되었으며 나머지 스팟은 BSA로 코팅되었다. 1x TBS-T/3% BSA로 플레이트를 30분 동안 차단한 후, 마우스로부터 항-혈청의 다양한 희석액을 플레이트에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션했다. TBS-T로 플레이트를 세정한 후, BSA-접합된 SULFO-TAG(검정 형식 1) 또는 접합되지 않은 SULFO-TAG(검정 형식 2)를 0.75μg/ml의 농도에서 플레이트에 첨가한 다음 1시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 플레이트를 세정하고 판독 완충액을 사용하여 현상했다. 모든 인큐베이션은 실온에서 수행되었다. 스크리닝에 사용된 검정 형식은 도 5에 묘사되어 있다.
사전-융합(최종) 부스팅은 보조제의 부재에서 15μg의 면역원을 주사함에 의해 최고의 면역 역가를 갖는 마우스에 대해 77일차에 수행하였다. 나머지 모든 마우스는 70 및 84일차에 SIGMA ADJUVANT SYSTEM®(MilliporeSigma, 미주리주 세인트루이스 소재) 및 MAGIC™ Mouse Adjuvant(Creative Diagnostics, 뉴욕주 셜리 소재)와 혼합된 20μg의 면역원으로 추가로 부스팅했다. 92일차에 이들 마우스로부터 수집한 혈청 샘플을 상기에 기술된 바와 같이 면역 반응에 대해 다시 테스트했다. 최고의 항체 역가를 가진 마우스에 대해 98일차에 사전-융합 부스팅을 수행하였다. 면역화, 혈청 수집, 비장 수확 및 동물 유지관리는 미국 메릴랜드에 있는 전임상 계약 실험실에서 수행하였다.
64일차(마우스 번호 262 및 265 경우) 및 92일차(마우스 번호 261, 263, 264 및 266 경우)에 수집된 항-혈청에 대한 스크리닝 데이터가 표 1에 나타나 있다. 마우스는 1:37,500 희석에서 상대적 ECL 신호 강도에 기반한 융합을 위해 선택되었다. 면역화된 6마리의 마우스 중에서, 2마리의 Balb/C 및 2마리의 CFW 마우스가 상대적으로 더 나은 면역 반응을 나타냈고 따라서 융합을 위해 선택되었다. 상대적으로 면역 반응이 좋지 않은 2마리의 CD-1 마우스는 연구에서 제외되었다.
표 1. 면역 반응의 평가를 위한 혈청 스크리닝
c) 하이브리도마 전개
융합을 위해 선택된 마우스로부터 최종 부스팅 3일 후에 비장을 수집하였다. 비장세포를 마우스 골수종 세포주 P3X63Ag8.653과 2:1 비율로 혼합하고 PEG-보조된 세포 융합을 수행했다. 융합-후, 세포를 최소 세포 밀도 20 × 106 세포/플레이트에서 AH 선택 배지에서의 평평한-바닥 96-웰 플레이트에 시딩했다. 모든 융합 플레이트로부터의 하이브리도마 배양 상등액을 융합 후 12일에 수집하고 상기 기재된 바와 같은 검정 형식 1에 의해 항원 특이성에 대해 테스트하였다. 모든 항원-양성 하이브리도마를 48-웰 플레이트로 연장하고 상기에 기술된 2가지 검정 형식에 의한 추가 확인을 위해 항원 특이성에 대해 다시 테스트했다. 이들 하이브리도마를 제한 희석에 의해 후속적으로 서브클로닝하였다.
총 4개의 융합으로부터, SULFO-TAG에 특이적인 23개 모 하이브리도마 클론이 식별된 39개 플레이트를 스크리닝했다(표 2). 융합 F144 및 F145로부터 모든 항원-특이적 클론을 48-웰 단계에서 추가 테스트를 수행함이 없이 직접적으로 서브클로닝하였다. 따라서, 검정 형식 2에서 이들 클론에 대한 데이터는 이용가능하지 않다.
표 2에 나타난 바와 같이, ECL 신호 강도는 2가지 검정 형식 사이에 다양했지만 유의미한 차이는 관찰되지 않았다.
표 2. 융합 단계에서의 하이브리도마 스크리닝 및 클론 선택
d) 하이브리도마 서브클로닝 및 항체 정제
항원-특이적 모 하이브리도마를 96-웰 플레이트에서 희석을 제한함에 의해 서브클로닝하고, 1개, 2개(클론 ID에서 "t"로 표시됨) 또는 다중 콜로니("m"으로 표시됨)가 있는 웰을 현미경 하에서 시각적 검사에 의해 표시했다. 이들 웰로부터의 상등액을 시딩 후 12일에 수집하고 상기에 기술된 바와 같이 항원 특이성에 대해 테스트했다. 최상의 항원 특이성을 갖는 각각의 모 계통으로부터 적어도 하나의 서브클론을 초저 IgG FBS가 보충된 DMEM 배지에서 최대 50mL까지 연장했다. 항체 정제는 제조업체의 지침에 따라 GenScript로부터의 AMMAG™ Protein A Magnetic Beads를 사용하여 수행했다.
23개 모 하이브리도마 중에서, 11개 클론이 서브클로닝에서 생존했다. 이들 클론에 대한 스크리닝 데이터는 표 3에 나타나 있다. 융합 스크리닝 결과와 일치하여, 2가지 검정 형식 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 총 11개의 정제된 단일클론 항체가 생성되었다. 정제된 항-SULFO-TAG 항체가 표 4에 나열되어 있다.
표 3. 서브클론 단계에서의 하이브리도마 스크리닝 및 클론 선택
표 4. 7개의 항-SULFO TAG 항체
항체를 생성하는 특정 생식계열 유전자가 식별되었다. 경쇄는 IGLV1*01 F 유전자에 의해 생산되었고, 중쇄는 IGHV2-9*02 F 유전자에 의해 생산되었다.
실시예 2. 핵산 프로브에 대한 항체의 접합
실시예 1에서 생성된 각각의 항-SULFO-TAG 항체는 본 명세서에서 실시형태에 기재된 바와 같이 핵산 프로브에 접합되었다. 핵산 프로브 접합을 위해, 1mg/mL 농도 이상의 항체는 PBS에서 1mg/mL로 희석하였고, 1mg/mL 농도 미만의 항체는 농도를 조정하지 않았다. 모든 항체에 대한 완충액을 0.5M EDTA 스톡 용액을 사용하여 1mM EDTA로 하였다. 다음으로, 각각의 항체를 5-몰 과잉의 PEG화된 SMCC 가교결합제, SM(PEG)4와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음, 핵산 프로브를 8-배수 몰 과잉으로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 모든 접합 반응을 최종 농도 1mM 요오도아세트아미드로 켄칭하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다.
실시예 3. 항체 스크리닝
실험 1
실시예 2에 기술된 바와 같이, 핵산 프로브와 접합된 항-SULFO-TAG 항체를 본 명세서에서 실시형태에 기술된 바와 같이 신호 증폭 시약으로서의 성능에 대해 스크리닝하였다. 타당성 시험은 인간 ZnT8, 인간 IA-2, 인간 TGM-2 및 마우스 IL-1b에 대한 포획 및 검출 항체를 갖는 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 검정 플레이트에서 수행하였다. 단일 분석물의 농도를 검출하기 위한 검정은 다음과 같이 수행하였다:
1) 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 검정 플레이트를 코팅 용액/희석제 혼합물에서 0.25μg/mL에서의 비오티닐화 포획 항체 50μL 및 0.2ng/mL 비오티닐화 앵커링 시약으로 코팅한다. 실온에서 1시간 동안 705rpm에서 쉐이킹한다.
2) 플레이트를, 매번 300μL의 세정 완충액으로, 3회 세정한다.
3) 25μL의 차단 용액 및 25μL의 캘리브레이터 또는 샘플을 희석제에 첨가한다. 실온에서 1.5시간 동안 705rpm으로 쉐이킹한다.
4) 플레이트를, 매번 300μL의 세정 완충액으로, 3회 세정한다.
5) 1μg/mL에서 SULFO-TAG를 함유하는 검출 항체("SULFO-TAG-검출 항체") 50μL를 희석제에 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 705rpm으로 쉐이킹한다.
6) 플레이트를, 매번 300μL의 세정 완충액으로, 3회 세정한다.
7) 0.125μg/mL에서 항-SULFO-TAG 항체 50μL를 희석제에 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 705rpm으로 쉐이킹한다.
8) 플레이트를, 매번 300μL의 세정 완충액으로, 3회 세정한다.
9) 항-SULFO-TAG 항체의 핵산 프로브를 연장하기 위한 구성성분을 함유하는 강화 용액 50μL를 첨가하여 연장된 서열을 형성한다.
10) 플레이트를, 매번 300μL의 세정 완충액으로, 3회 세정한다.
11) 연장된 서열을 검출하기 위한 구성성분을 함유하는 검출 용액 50μL를 첨가한다.
12) 플레이트를, 매번 300μL의 세정 완충액으로, 3회 세정한다.
13) 150μL의 판독 완충액을 추가한다.
14) 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독한다.
ECL 검정 신호의 결과는 도 6에 도시되어 있다. 측정된 ECL 검정 신호에 기반하여, 항-SULFO-TAG 항체 클론 F136-1B4-8, F136-3F10-6, F136-6F9-3, F136-7D11-4m, F136-8E1-1 및 F137-6B9-1이 후속 실험에서 캘리브레이터 적정을 위해 선택되었다.
실험 2
항-SULFO-TAG 항체 클론 F136-1B4-8, F136-3F10-6, F136-6F9-3, F136-7D11-4m, F136-8E1-1 및 F137-6B9-1을 면역검정에서 인간 ZnT8 및 TGM-2에 대한 비오티닐화된 포획 항체 및 SULFO-TAG-검출 항체로 캘리브레이터 적정 면역검정에서 신호 증폭 시약으로서의 수행성에 대해 테스트했다. 실험 프로토콜은 실험 1에 요약되어 있다. 인간 ZnT8 검정에 사용된 항체는 비오티닐화된 항-인간 ZnT8 포획 항체 클론 번호 F67-7C2-8 및 항-인간 ZnT8 SULFO-TAG-검출 항체 클론 번호 F67-1A7-6이었다. 인간 TGM-2 검정에 사용된 항체는 비오티닐화된 항-인간 TGM-2 포획 항체 클론 번호 F74-6A5-6 및 항-인간 TGM-2 SULFO-TAG-검출 항체 클론 번호 F69-5E8-3t였다.
표준 4(STD 04)에 대한 ECL 검정 신호, 변동 계수(CV), 경사 슬로프, R 제곱값, 검출 최저 한계(LLOD), 신호-대-배경 비율(S/B), 및 STD 04에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)의 결과는 도 7 및 8에 도시되어 있다. S/B 및 S/N은 STD 04/STD 08(블랭크)의 값으로부터 결정되었다. 도 9는 ZnT8 및 TGM-2에 대한 동일한 포획 및 검출 항체를 사용하지만 항-SULFO-TAG 항체 없이 수행된 면역검정으로부터 비교 결과를 보여준다.
데이터에 의해 입증된 바와 같이, 항-SULFO-TAG 항체의 사용은 항-SULFO-TAG 항체를 사용하지 않고 수행된 검정과 비교하여 두 검정 모두에 대해 검정 신호의 강력한 강화 및 LLOD의 >10-배수 감소를 제공했다.
실험 3
항-SULFO-TAG 항체 클론 F136-1B4-8, F136-3F10-6, F136-6F9-3, F136-7D11-4m, F136-8E1-1 및 F137-6B9-1을 면역검정에서 마우스 IL-23 및 마우스 IL-17C에 대한 비오티닐화된 포획 항체 및 SULFO-TAG-검출 항체로 캘리브레이터 적정에서 신호 증폭 시약으로서의 수행성에 대해 테스트했다. 실험 프로토콜은 실험 1에 요약되어 있다. 마우스 IL-23 검정에 사용된 항체는 상업적 공급원으로부터 비오티닐화된 항-마우스 IL-23 포획 항체 및 SULFO-TAG-항-마우스 IL-23 검출 항체였다. 마우스 IL-17C 검정에 사용된 항체는 상업적 공급원으로부터 비오티닐화된 항-마우스 IL-17C 포획 항체 및 SULFO-TAG-항-마우스 IL-17C 검출 항체였다.
표준 2(STD 02)에 대한 ECL 검정 신호, 변동 계수(CV), 경사 슬로프, R 제곱값, 검출 최저 한계(LLOD), 신호-대-배경 비율(S/B), 및 STD 02에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)의 결과는 도 10 및 11에 도시되어 있다. S/B 및 S/N은 STD 02/STD 04(블랭크)의 값으로부터 결정되었다. 도 12는 마우스 IL-23 및 마우스 IL-17C에 대해 동일한 포획 및 검출 항체를 사용하지만 항-SULFO-TAG 항체 없이 수행된 면역검정으로부터 비교 결과를 보여준다.
데이터에서 입증된 바와 같이, 항-SULFO-TAG 항체의 사용은 항-SULFO-TAG 항체를 사용하지 않고 수행된 검정과 비교하여 마우스 IL-23 검정의 경우 검정 신호의 강력한 강화 및 LLOD의 40- 내지 230-배수 감소 및 마우스 IL-17C 검정의 경우 LLOD의 4- 내지 120-배수 감소를 제공했다.
실험 4
항-SULFO-TAG 항체 클론 F136-1B4-8, F136-3F10-6, F136-6F9-3, F136-7D11-4m, F136-8E1-1 및 F137-6B9-1을 면역검정에서 인간 IL-10에 대한 비오티닐화된 포획 항체 및 SULFO-TAG-검출 항체로 캘리브레이터 적정에서 수행성에 대해 테스트했다. 실험 프로토콜은 단계 5)에서 SULFO-TAG-검출 항체를 0.5μg/mL에서 첨가한 것을 제외하고 실험 1에 설명된 바와 같았다. 인간 IL-10 검정에 사용된 항체는 비오티닐화된 항-인간 IL-10 포획 항체 클론 번호 2108-A82-8 및 SULFO-TAG 항-인간 IL-10 검출 항체 클론 번호 1299-A06-5였다.
표준 2(STD 02)에 대한 ECL 검정 신호, 변동 계수(CV), 경사 슬로프, R 제곱값, 검출 최저 한계(LLOD), 신호-대-배경 비율(S/B), 및 STD 02에 대한 신호-대-잡음 비율(S/N)의 결과는 도 13에 도시되어 있다. S/B 및 S/N은 STD 02 / STD 04(블랭크)의 값으로부터 결정되었다. 도 14는 인간 IL-10에 대한 동일한 포획 및 검출 항체를 사용하지만 항-SULFO-TAG 항체 없이 수행된 면역검정으로부터 비교 결과를 보여준다.
데이터에 의해 입증된 바와 같이, 항-SULFO-TAG 항체의 사용은 항-SULFO-TAG 항체를 사용하지 않고 수행된 검정에 비해 인간 IL-10 검정에 대한 검정 신호의 강력한 강화 및 LLOD의 50- 내지 140-배수 감소를 제공했다.
실시예 4. 항-SULFO-TAG 항체에 의한 신호 억제 및 강화
다중화된 샌드위치 검정 패널을 사용하여, 실시예 3의 스크린으로부터 식별된, 도 6에 도시된 11개의 항-SULFO-TAG 항체(본 명세서에서는 "a-STAG Ab"로도 지칭됨) 클론의 신호 억제 및 신호 강화를 평가했다. 패널에서 각각의 분석물에 대한 SULFO-TAG 표지된 검출 항체를 함유하는 검출 항체 혼합물을 활용하는 검정 패널은 검정을 위해 제공된 캘리브레이터 블렌드를 사용하여 수행되었다. 캘리브레이터 블렌드는 패널에서 분석물 중 하나인 IL-4의 대략적으로 100pg/mL를 제공하기 위해 재구성된 동결건조된 캘리브레이터를 대략적으로 2.43-배수 희석함에 의해 준비되었다. 표준 샌드위치 검정 프로토콜이 수행되었으며 다음과 같이 간략하게 요약되었다:
1) 검정 패널 플레이트를 세정 완충액으로 세정한다;
2) 플레이트의 각각의 웰에 캘리브레이터를 추가한다;
3) 검정 패널 플레이트를 세정 완충액으로 세정한다;
4) 검출 항체 혼합물을 첨가하여 각각의 웰에 포획 항체, 분석물 및 SULFO-TAG-표지된 검출 항체("cAb-분석물-dAb")와 샌드위치 복합체를 형성한다;
5) 검정 패널 플레이트를 세정 완충액으로 세정한다.
샌드위치 복합체의 형성 후, 플레이트를 3개의 섹션인: 표준 신호; 신호 억제; 및 신호 강화로 나누었다. 각각의 섹션의 웰에 추가된 후속 구성성분은 다음과 같이 요약된다:
따라서, 표준 신호 섹션에는 샌드위치 복합체에 임의의 항-SULFO-TAG 항체가 추가되지 않았다. 신호 억제 섹션에는 항-SULFO-TAG 항체에 cAb-분석물-dAb 복합체가 결합되었다. 신호 강화 섹션에는 항-SULFO-TAG 항체에 cAb-분석물-dAb 복합체가 결합되었고 항-SULFO-TAG 항체의 핵산 프로브에 SULFO-TAG 표지된 올리고뉴클레오티드가 결합되었다. 신호 억제 및 신호 강화 섹션의 경우, 11개의 항-SULFO-TAG 항체 클론 각각이 테스트되었다. 검정은 9번 반복하여 수행되었다.
검정 패널 플레이트를 단계 6 및 7 각각에 대해 705rpm에서 쉐이킹하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 인큐베이션 후 세정 완충액으로 세정하였다. 단계 6 및 7 중 하나 또는 둘 모두에 대한 희석제로 표준 신호 및 신호 억제 조건의 인큐베이션은 세 섹션 모두에서 측정된 신호가 모든 인큐베이션 단계에 걸쳐 희석제에서의 항체 오프 속도에 관하여 동등함을 보장했다. ECL 판독 완충액을 플레이트에 추가하고 플레이트를 이미저에서 판독했다.
결과는 도 16a-16c에 도시되어 있다. 도 16a는 각각의 항-SULFO-TAG 항체 클론에 대한 신호 억제 퍼센트(%) 및 신호 증가 %를 보여준다. 도 16b 및 16c는 각각 신호 억제 % 및 신호 증가 %의 막대 그래프 플롯을 보여준다. 신호 억제 퍼센트(%)는 1 - (신호 억제 / 표준 신호)로 계산되었다. 신호 증가 선형 퍼센트(%)는 (신호 강화 - 신호 억제) / [모든 11개의 항-SULFO-TAG 항체에 걸친 (신호 강화 - 신호 억제)의 MAX]로 계산되었다. 신호 증가 비율 %는 (신호 강화 / 표준 신호) - 1로 계산될 수 있다. SULFO-TAG-표지된 올리고가 있거나 없는 신호의 비율은 (신호 강화 / 신호 억제)로 계산될 수 있다.
도 16a-16c에 도시된 바와 같이, 항-SULFO-TAG 항체 클론 F136-1B4-8, F136-3F10-6 및 F136-6F9-3은 가장 높은 신호 억제 % 및 가장 높은 신호 증가 %를 가져 SULFO-TAG 표지에 대한 특이성을 입증했다. 각각의 항-SULFO-TAG 항체 클론의 친화도는 표 5에 나타난 바와 같이 계산되었다.
표 5. 항-SULFO-TAG 항체 클론으로 신호 증가 %
실시예 5. 항-SULFO-TAG 항체 에피토프 인식 연구
에피토프 인식 연구를 실시예 4에 기술된 11개의 항-SULFO-TAG 항체 클론에 대해 수행했다. 이들 항체 클론의 에피토프 인식을 연구하기 위해, 도 18a에 도시된 바와 같은 다양한 수의 설포메틸-바이피리딘("SM") 또는 바이피리딘("Bpy") 리간드를 갖는 4개의 유기금속 Ru2+ 화합물("TAG 화합물")을 준비하였다. SULFO-TAG는 Bpy 그룹 중 하나에 산성 리간드("A")를 포함하고 구조가 SM보다 Bpy와 더 유사한 Ru+2(SM)2A1로 표시된다. 각각의 TAG 화합물로부터 ECL 생성은 TAG 화합물을 ECL 판독 완충액 안으로 스파이킹함에 의해 확인되었고, 각각의 유리 TAG 화합물로부터 ECL 신호는 96-웰 베어 탄소 플레이트 상에서 측정되었다. 결과는 도 18b에 나타내었고 모든 TAG 화합물이 TAG 화합물의 농도로 정규화될 때 거의 동일한 ECL 신호를 생성함을 나타내며, 이는 바이피리딘 리간드의 변형이 ECL 생성 효율에 최소한의 영향을 미친다는 것을 입증한다. 농도에 대해 정규화될 때 Ru(Bpy)3 ECL 신호는 다른 TAG 화합물과 유사하게 248,576 ECL 단위가 된다.
TAG 화합물에 대한 항-SULFO-TAG 항체 특이성 및 친화도를 연구하기 위해, 항체를 MSD® 96-웰 스몰 스팟 스트렙타비딘 플레이트 상에 코팅한 다음 다양한 농도의 4가지 TAG 화합물에 노출시켰다. 항-SULFO-TAG 항체로부터 ECL 신호는 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정되었으며, 신호가 높을수록 결합 친화도가 더 강하다는 것을 나타낸다. 결과는 도 19에 도시되어 있다. 결과는 항-SULFO-TAG 항체 클론이 다양한 리간드를 갖는 TAG 화합물에 대한 그 친화도에 따라 그룹화될 수 있음을 보여준다. 4개의 항체(클론 번호 1, 3, 5 및 7)는 SULFO-TAG에 대해 < 1nM 친화도(KD)를 갖는 반면, 나머지 항체는 KD > 20nM을 가져 일부는 아마도 마이크로몰 범위에 있을 수 있다. 3개의 SM 리간드를 갖는 Ru+2(SM)3의 경우, 동일한 친화도 패턴이 관찰되었다. 하나의 SM 리간드와 2개의 Bpy 리간드만 갖는 Ru+2(Bpy)2(SM)의 경우, 항체 클론 1, 3 및 5는 상대적으로 높은 친화도를 유지했지만 항체 클론 7은 < 100nM의 유의하게 감소된 친화도를 가졌다. Bpy로 나머지 SM 리간드의 추가 대체인, Ru+2(Bpy)3은 모든 항체 클론에 의한 인식을 거의 제거하였다. 이들 결과는 SM 리간드가 항체 클론 1, 3, 5 및 7에 대한 강한 결합에 대해 적어도 부분적으로 담당하고 있음을 입증한다. 독특하게도 항체 클론 7은 인식을 위해 2개의 SM 리간드가 필요했다.
항체 인식에서 리간드의 역할을 추가로 확인하기 위해, 항체를 MSD® 96-웰 스몰 스팟 스트렙타비딘 플레이트 상에 코팅하고 먼저 2μM의 리간드 SM, Bpy 또는 A에 노출시킨 다음 경쟁 검정으로서 다양한 농도의 TAG 화합물에 노출시켰다. 경쟁 검정 결과는 도 20에 도시되어 있다. 결과는 TAG 화합물 상의 SM 리간드가 항체 클론 1, 3, 5 및 7에서의 강한 결합을 위한 핵심 에피토프임을 보여준다. 이들 4개의 항체 클론 중에서 클론 1, 3 및 5에는 강한 결합을 위해 TAG 화합물에서 단지 하나의 SM 리간드를 필요로 했지만 클론 7에는 강한 결합을 위해 2개의 SM 리간드를 필요로 했다. 모든 항체 클론은 3개의 Bpy 리간드를 갖는 TAG 화합물을 인식하지 못했다. 리간드 경쟁 연구는 가장 강한 결합을 갖는 SM 리간드가 항체에 의해 인식되는 우세한 리간드인 반면, Bpy 및 A 리간드는 Ru+2(SM)3 및 SULFO-TAG 화합물에 대한 항체 결합을 유의하게 능가할 수 없었음을 추가로 입증했다.
실시예 6. 추가 에피토프 인식 연구
추가 에피토프 인식 연구가 SM 리간드 상의 설포네이트 작용기가 항체 인식에 필요한지, 그리고 메틸렌기에 상이한 하전된 기능성의 추가가 항체 인식을 변경하는지 여부를 결정하기 위해 수행된다. 본 연구를 위한 유기금속 Ru2+ 화합물이 도 21에 도시되어 있다.
Claims (161)
- 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
a. (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지인, 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를:
(I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및
(II) (1) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (2) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 단계; 및
b. (I) 제2 검출가능한 표지 또는 (II) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
c. (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지인, 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를:
(I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및
(II) 효소의 기질과 접촉시키는 단계; 및
d. 효소 활성을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
e. (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 ECL 표지인, 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 선택적으로 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계; 및
f. (I) 제1 검출가능한 표지; (II) 제2 검출가능한 표지; 또는 (III) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
g. (A) 제1 검출가능한 표지로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지인, 표지 및 (B) 관심있는 분석물을 포함하는 제1 복합체를, 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함하며, 이에 의해 제1 복합체와 신호 증폭 시약을 포함하는 제2 복합체를 형성하는, 단계;
h. 핵산 프로브를 연장하여 연장된 서열을 형성하는 단계; 및
i. 연장된 서열의 양을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 제1 복합체는 표면 상에 있는, 방법.
- 제2항에 있어서, 제1 복합체는 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약으로서, 여기서 포획 시약은 표면 상에 고정화되거나, 여기서 포획 시약은 표면에 고정화될 수 있는, 포획 시약; 및 분석물에 특이적으로 결합하고 제1 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약을 포함하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 검출 시약은 제1 검출 시약이고, 여기서 제1 복합체는 분석물에 특이적으로 결합하는 제2 검출 시약을 추가로 포함하고, 제2 검출 시약은 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 여기서 신호 증폭 시약은 제1 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출 시약 상의 제1 검출가능한 표지에 동시적으로 결합될 수 있는, 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 포획 시약은 표면 상에 고정화되는, 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 포획 시약은 표면에 고정화될 수 있고, 방법은 (a), (c), (e) 또는 (g)의 접촉하는 단계 이전에 포획 시약을 표면에 고정화하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) (1) 결합 모이어티의 결합 파트너, 및 (2) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티와 접촉되는, 방법.
- 제7항에 있어서, (b)의 측정하는 단계는 제2 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하거나; 또는 (b)의 측정하는 단계는 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 제1 복합체는 먼저 신호 증폭 시약과 접촉된 다음, 검출가능한 모이어티와 접촉되거나; 또는 여기서 제1 복합체는 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티와 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 접촉되는, 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 접촉하는 단계는 (I) 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티를 포함하는 신호 증폭 복합체를 형성하는 단계; 및 (II) 제1 복합체를 신호 증폭 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함하고/하거나 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함하고, 여기서 신호 증폭 복합체는 복수의 신호 증폭 시약을 포함하고, 각각의 신호 증폭 시약은 하나 이상의 검출가능한 모이어티에 결합하는, 방법.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티 및 검출가능한 모이어티는 상보적인 올리고뉴클레오티드, 수용체-리간드 쌍, 항원-항체 쌍, 합텐-항체 쌍, 에피토프-항체 쌍, 미모토프-항체 쌍, 압타머-표적 분자 쌍, 또는 인터칼레이터-표적 분자 쌍을 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 검출가능한 모이어티가 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하거나; 또는
여기서 결합 모이어티는 비오틴을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘 및 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하거나; 또는
여기서 결합 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 비오틴 및 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) 효소의 기질과 접촉되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉되고, (f)의 측정하는 단계는 제1 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉되고, (f)의 측정하는 단계는 제1 검출가능한 표지, 제2 검출가능한 표지 또는 둘 모두를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉되고, 이에 의해 제1 복합체와 신호 증폭 시약을 포함하는 제2 복합체를 형성하는, 방법.
- 제17항에 있어서, (h)의 연장하는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 자가-지속된 합성 반응(3SR), 등온 증폭, 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, (h)의 연장하는 단계는 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고 PCR에 의해 핵산 프로브를 연장시키는 단계를 포함하거나; 또는 여기서 연장하는 단계는 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고, 원형 주형을 형성하고, 롤링 서클 증폭(RCA)에 의해 핵산 프로브를 연장시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 적어도 2개의 제1 검출가능한 표지를 포함하고;
여기서 신호 증폭 시약은 제1 신호 증폭 시약이고, (g)의 접촉하는 단계는 제1 복합체를 핵산 프로브를 포함하는 제2 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2 신호 증폭 시약은 각각 별개의 제1 검출가능한 표지에 결합하고, 제2 복합체는 제1 복합체와 제1 및 제2 신호 증폭 시약을 포함하고; 그리고
여기서 (h)의 연장하는 단계는 제1 및 제2 신호 증폭 시약의 핵산 프로브 중 하나 또는 둘 모두를 연장하여 연장된 서열을 형성하는 단계를 포함하는, 방법. - 제20항에 있어서, (h)의 연장하는 단계는 제1 및 제2 신호 증폭 시약의 핵산 프로브 중 하나 또는 둘 모두를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키는 단계, 원형 주형을 형성하는 단계, 및 RCA에 의해 하나 또는 둘 모두의 핵산 프로브를 연장시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, (h)의 연장하는 단계는 각각의 핵산 프로브를 별개의 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키는 단계; 각각의 주형 올리고뉴클레오티드로부터 원형 주형을 형성하는 단계; 및 RCA에 의해 각각의 핵산 프로브를 연장시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, (h)의 연장하는 단계는:
두 핵산 프로브 모두를 2개의 주형 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 여기서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 각각의 핵산 프로브의 일부에 결합하는, 단계;
2개의 주형 올리고뉴클레오티드를 결찰하여 원형 주형을 형성하는 단계; 및
RCA에 의해 핵산 프로브 중 하나 또는 둘 모두를 연장시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 신호 증폭 시약의 핵산 프로브는 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 방법.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 표면 상에 있고, 여기서 방법은 앵커링 시약을 표면 상에 고정화하는 단계를 추가로 포함하며, 앵커링 시약은 연장된 서열의 앵커링 영역에 결합하고, 여기서 (i)의 측정하는 단계는 앵커링 시약을 통해 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 표면 상에 있고, 여기서 표면은 고정화된 앵커링 시약을 포함하고, 앵커링 시약은 연장된 서열의 앵커링 영역에 결합하고, 여기서 (i)의 측정하는 단계는 앵커링 시약을 통해 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 앵커링 시약은 (h)의 연장시키는 단계 이전 또는 동안 표면에 고정화되는, 방법.
- 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 표면 상에 있고, 여기서 제2 복합체는 연장시키는 단계에 이어서 표면에 결합되는, 방법.
- 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 앵커링 시약과 앵커링 영역은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 서열은 표면 상의 제2 복합체로부터 100μm 미만의 위치에서 앵커링 시약에 결합하는, 방법.
- 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 측정하는 단계는 연장된 서열을 제2 검출가능한 표지를 포함하는 표지된 프로브에 결합시키는 단계 및 표면 상의 (I) 제2 검출가능한 표지 또는 (II) 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제31항에 있어서, 표면 상의 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 단계; 또는 표면 상의 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 연장된 서열 및 표지된 프로브는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제3항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 검출가능한 표지는 접합 링커를 통해 검출 시약에 연결되는, 방법.
- 제4항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 검출가능한 표지는 접합 링커를 통해 제2 검출 시약에 연결되는, 방법.
- 제2항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 입자를 포함하거나, 또는 여기서 표면은 다중-웰 플레이트의 웰을 포함하는, 방법.
- 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 포획 시약을 포함하고, 여기서 표면은 복수의 별개의 결합 도메인을 포함하고, 포획 시약 및 앵커링 시약은 표면 상의 2개의 별개의 결합 도메인에 위치되거나; 또는 포획 시약 및 앵커링 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인에 위치되는, 방법.
- 제25항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 포획 시약을 포함하고, 여기서 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약으로부터 1μm 미만에 있는, 방법.
- 제2항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 전극을 포함하고, 측정하는 단계는 전극에 전압 형태를 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 표면은 입자를 포함하고, 방법은 전극 상에 입자를 수집하는 단계를 추가로 포함하고, 측정하는 단계는 전극에 전압 파형을 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 (a), (c), (e), 또는 (g)의 접촉하는 단계 이전에, 제1 복합체를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제41항에 있어서, 제1 복합체를 검출하는 단계는 제1 검출가능한 표지의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 표면 상에 관심있는 분석물, 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약으로서, 여기서 포획 시약은 표면 상에 고정화되거나 또는 포획 시약은 표면에 고정화될 수 있는, 포획 시약; 및 분석물에 특이적으로 결합하고 제1 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약을 포함하는 제1 복합체를 형성하는 단계;
b. 제1 핵산 프로브를 연장시켜 제1 앵커링 영역을 포함하는 제1 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 여기서 제1 앵커링 영역은 표면 상에 고정화된 제1 앵커링 시약에 결합하는, 단계;
c. 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1의 표지된 프로브에 제1 연장된 서열을 결합하는 단계로서, 여기서, 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지인, 단계; 및
d. 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를:
(I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및
(II) (1) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (2) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티와 접촉시키는 단계; 및
e. (I) 제2 검출가능한 표지 또는 (II) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
f. 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를:
(I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및
(II) 효소의 기질과 접촉시키는 단계; 및
g. 효소 활성을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
h. 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 선택적으로 제2 검출가능한 표지를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계; 및
i. (I) 제1 검출가능한 표지; (II) 제2 검출가능한 표지; 또는 (III) 제1 및 제2 검출가능한 표지를 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계;
또는
j. 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 신호 증폭 시약은 제2 핵산 프로브를 포함하고, 이에 의해 신호 증폭 시약 및 제1 표지된 프로브를 포함하는 제2 복합체를 형성하는, 단계;
k. 제2 핵산 프로브를 연장시켜 제2 앵커링 영역을 포함하는 제2 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 여기서 제2 앵커링 영역은 표면 상에 고정화된 제2 앵커링 시약에 결합하는, 단계; 및;
l. (I) 제2 연장된 서열 또는 (II) 제1 연장된 서열과 제2 연장된 서열이 표면에 결합된 양을 측정하고, 이에 의해 관심있는 분석물을 검출하는 단계를 포함하는, 방법. - 제43항에 있어서, 포획 시약은 표면 상에 고정화되는, 방법.
- 제43항에 있어서, 포획 시약은 표면에 고정화될 수 있고, 여기서 방법은 단계 (a) 이전에 또는 동안에 포획 시약을 표면에 고정화시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제45항에 있어서, (b)의 연장시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 자가-지속된 합성 반응(3SR), 등온 증폭, 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 연장시키는 단계는 제1 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키는 단계 및 PCR에 의해 제1 핵산 프로브를 연장시키는 단계를 포함하거나; 또는
여기서 (b)의 연장시키는 단계는 제1 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키는 단계, 원형 주형을 형성하는 단계, 및 롤링 서클 증폭(RCA)에 의해 제1 핵산 프로브를 연장시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 복합체는 (b)의 연장시키는 단계에 이어서 표면에 결합되는, 방법.
- 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 이전에 또는 동안에 제1 앵커링 시약을 표면에 고정화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 앵커링 시약과 제1 앵커링 영역은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 연장된 서열과 제1 표지된 프로브는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브는 (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 결합 모이어티를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) (1) 결합 모이어티의 결합 파트너, 및 (2) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티와 접촉되는, 방법.
- 제52항에 있어서, 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브는 먼저 신호 증폭 시약과 접촉된 다음, 검출가능한 모이어티와 접촉되거나; 또는
여기서 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브는 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티와 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 접촉되는, 방법. - 제52항 또는 제53항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 접촉하는 단계는: (I) 신호 증폭 시약 및 검출가능한 모이어티를 포함하는 신호 증폭 복합체를 형성하는 단계; 및 (II) 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브를 신호 증폭 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제54항에 있어서, 검출가능한 모이어티는 결합 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함하고/하거나 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티에 대한 다중 결합 부위를 포함하고, 여기서 신호 증폭 복합체는 복수의 신호 증폭 시약을 포함하고, 각각의 신호 증폭 시약은 하나 이상의 검출가능한 모이어티에 결합되는, 방법.
- 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티 및 검출가능한 모이어티는 상보적인 올리고뉴클레오티드, 수용체-리간드 쌍, 항원-항체 쌍, 합텐-항체 쌍, 에피토프-항체 쌍, 미모토프-항체 쌍, 압타머-표적 분자 쌍, 또는 인터칼레이터-표적 분자 쌍을 포함하는, 방법.
- 제56항에 있어서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 검출가능한 모이어티는 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하거나; 또는
여기서 결합 모이어티는 비오틴을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘 및 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하거나; 또는
여기서 결합 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 비오틴 및 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 방법. - 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브는 (I) 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 효소를 포함하는 신호 증폭 시약, 및 (II) 효소의 기질과 접촉되는, 방법.
- 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉되고, (i)의 측정하는 단계는 제1 검출가능한 표지를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약과 접촉되고, (i)의 측정하는 단계는 제1 검출가능한 표지, 제2 검출가능한 표지 또는 둘 모두를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 연장된 서열에 결합된 제1 표지된 프로브는 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하고 제2 핵산 프로브를 포함하는 신호 증폭 시약과 접촉되고, 이에 의해 신호 증폭 시약과 제1 표지된 프로브를 포함하는 제2 복합체를 형성하는, 방법.
- 제61항에 있어서, (k)의 연장시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 자가-지속된 합성 반응(3SR), 등온 증폭, 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
- 제61항 또는 제62항에 있어서, (k)의 연장시키는 단계는 2차 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키고 PCR에 의해 2차 핵산 프로브를 연장시키는 단계를 포함하거나; 또는
여기서 (k)의 연장시키는 단계는 2차 핵산 프로브를 주형 올리고뉴클레오티드에 결합시키는 단계, 원형 주형을 형성하는 단계, 및 롤링 서클 증폭(RCA)에 의해 2차 핵산 프로브를 연장하는 단계를 포함하는, 방법. - 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, (k)의 연장시키는 단계 이전에 또는 동안에 제2 앵커링 시약을 표면에 고정화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 복합체는 (k)의 연장시키는 단계에 이어서 표면에 결합되는, 방법.
- 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 앵커링 시약 및 제2 앵커링 영역은 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 앵커링 영역 및 제2 앵커링 영역은 동일한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 제1 앵커링 영역 및 제2 앵커링 영역은 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
- 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, (l)의 측정하는 단계는 제2 검출가능한 표지를 포함하는 제2의 표지된 프로브에 제2의 연장된 서열을 결합시키는 단계 및 표면 상의 (I) 제2 검출가능한 표지 또는 (II) 제1 및 제2 검출가능한 표지의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제68항에 있어서, 제2 연장된 서열과 제2 표지된 프로브는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제69항에 있어서, 제1 표지된 프로브 및 제2 표지된 프로브는 동일한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 제1 표지된 프로브 및 제2 표지된 프로브는 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 검출가능한 표지는 접합 링커를 통해 제1 표지된 프로브에 연결되는, 방법.
- 제43항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 입자를 포함하거나; 또는 표면은 다중-웰 플레이트의 웰을 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 복수의 별개의 결합 도메인을 포함하고, 포획 시약 및 제1 앵커링 시약은 표면 상의 2개의 별개의 결합 도메인 상에 위치되거나; 또는 포획 시약 및 제1 앵커링 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치되는, 방법.
- 제43항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 시약은 표면 상의 제1 앵커링 시약으로부터 1μm 미만에 있는, 방법.
- 제43항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 전극을 포함하고, 측정하는 단계는 전극에 전압 형태를 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제75항에 있어서, 표면은 입자를 포함하고, 방법은 전극 상에 입자를 수집하는 단계를 추가로 포함하고, 측정하는 단계는 전극에 전압 파형을 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 (d), (f), (h) 또는 (j)의 접촉시키는 단계 이전에, 표면 상의 제1 복합체를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제77항에 있어서, 검출하는 단계는 표면 상의 제1 검출가능한 표지의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항 또는 제71항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭 시약은 제1 검출가능한 표지 및 접합 링커에 특이적으로 결합하는, 방법.
- 제79항에 있어서, 접합 링커는 아미드, 티오에스테르, 티오에테르, 디설파이드, 이민, 트리아졸, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 친수성 중합체, 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
- 제3항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 시약, 검출 시약 및 신호 증폭 시약은 각각 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 합텐, 에피토프, 미모토프 또는 압타머를 포함하는, 방법.
- 제81항에 있어서, 포획 시약, 검출 시약 및 신호 증폭 시약은 각각 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭 시약은 전기화학발광(ECL) 표지에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
- 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 검출가능한 표지, 제2 검출가능한 표지, 또는 둘 모두는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합을 사용하여 측정되는, 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 각각 전기화학발광(ECL) 표지를 포함하는, 방법.
- 제85항에 있어서, ECL 표지는 적어도 하나의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하는 유기금속 복합체를 포함하고, 여기서 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트 기를 포함하고, 선택적으로 유기금속 복합체는 적어도 2개의 치환된 바이피리딘 리간드를 포함하고, 여기서 각각의 치환된 바이피리딘 리간드는 적어도 하나의 설포네이트 기를 포함하는, 방법.
- 제86항에 있어서, 치환된 바이피리딘 리간드는 식 I의 화합물인, 방법:
(I). - 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 제1 리간드는 식 I의 화합물이고, 제2 리간드는 공유 연결을 형성하는 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함하는, 방법.
- 제85항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, ECL 표지는 3개의 리간드를 포함하며, 여기서 리간드 중 2개는 각각 식 I의 화합물이고, 제3 리간드는 공유 연결을 형성하는 적어도 하나의 치환체를 갖는 바이피리딘을 포함하는, 방법.
- 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 유기금속 복합체는 루테늄, 오스뮴 또는 레늄을 포함하는, 방법.
- 제85항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, ECL 표지는 식 II의 화합물인, 방법:
(II). - 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 동일한 표지를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 검출가능한 표지는 상이한 표지를 포함하는, 방법.
- 제93항에 있어서, 제1 검출가능한 표지는 식 II의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 III, IV, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함하는, 방법:
(III);
(IV);
(V), 여기서 X는 인산염, 탄산염, 붕산염 또는 이의 조합임;
(VI). - 제93항에 있어서, 제1 검출가능한 표지는 식 III의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, IV, V, 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함하는, 방법.
- 제93항에 있어서, 제1 검출가능한 표지는 식 IV의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, V 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함하는, 방법.
- 제93항에 있어서, 제1 검출가능한 표지는 식 V의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 VI 중 임의의 하나의 화합물을 포함하는, 방법.
- 제93항에 있어서, 제1 검출가능한 표지는 식 VI의 화합물을 포함하고, 제2 검출가능한 표지는 식 II, III, IV 또는 V 중 임의의 하나의 화합물을 포함하는, 방법.
- 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에 다음을 포함하는 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하기 위한 키트:
a. 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약;
b. 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약으로서, 여기서 제1 검출 시약은 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 여기서 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지인, 검출 시약; 및
c. 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약. - 제99항에 있어서, 검출 시약은 제1 검출 시약이고, 여기서 키트는 분석물에 특이적으로 결합하는 제2 검출 시약을 추가로 포함하며, 제2 검출 시약은 제1 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
- 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획에 다음을 포함하는 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하기 위한 키트:
a. 분석물에 특이적으로 결합하는 포획 시약;
b. 분석물에 특이적으로 결합하는 검출 시약으로서, 여기서 검출 시약은 제1 핵산 프로브를 포함하는, 검출 시약;
c. 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 표지된 프로브로서, 여기서 제1 검출가능한 표지는 전기화학발광(ECL) 표지인, 제1 표지된 프로브; 및
d. 제1 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약. - 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 신호 증폭 시약은 각각 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 합텐, 에피토프, 미모토프 또는 압타머를 포함하는, 키트.
- 제102항에 있어서, 포획 시약, 검출 시약 및 신호 증폭 시약은 각각 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 키트.
- 제99항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭 시약은 전기화학발광(ECL) 표지에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 키트.
- 제99항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭 시약은 결합 모이어티를 포함하는, 키트.
- 제99항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티를 신호 증폭 시약에 접합시키기 위한 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제105항 또는 제106항에 있어서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 결합 모이어티는 비오틴을 포함하는, 키트.
- 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (ii) 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티를 추가로 포함하는, 키트.
- 제108항에 있어서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 검출가능한 모이어티는 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하거나; 또는 여기서 결합 모이어티는 비오틴을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 스트렙타비딘 및 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
- 제99항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭 시약은 효소를 포함하는, 키트.
- 제110항에 있어서, 효소의 기질을 추가로 포함하는, 키트.
- 제99항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭 시약은 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
- 제99항 또는 제100항, 또는 제102항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭 시약은 핵산 프로브를 포함하는, 키트.
- 제99항 또는 제100항, 또는 제102항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 프로브를 신호 증폭 시약에 접합시키기 위한 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭 시약은 제2 핵산 프로브를 포함하는, 키트.
- 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 핵산 프로브를 신호 증폭 시약에 접합시키기 위한 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 키트.
- 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 앵커링 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제99항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 표면을 추가로 포함하는, 키트.
- 제119항에 있어서, 표면은 입자를 포함하거나, 표면은 다중-웰 플레이트의 웰을 포함하는, 키트.
- 제119항 또는 제120항에 있어서, 포획 시약은 표면 상에 고정화되는, 키트.
- 제119항 또는 제120항에 있어서, 포획 시약을 표면에 고정화시키기 위한 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 키트는 앵커링 시약을 포함하고, 여기서 앵커링 시약은 표면 상에 고정화되는, 키트.
- 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 키트는 앵커링 시약 및 앵커링 시약을 표면에 고정화시키기 위한 시약을 포함하는, 키트.
- 제123항 또는 제124항에 있어서, 표면은 복수의 별개의 결합 도메인을 포함하고, 포획 시약 및 앵커링 시약은 표면 상의 2개의 별개의 결합 도메인 상에 위치되거나, 또는 포획 시약 및 앵커링 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치되는, 키트.
- 제123항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 시약은 표면 상의 앵커링 시약으로부터 1μm 미만에 있는, 키트.
- 제119항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 전극을 포함하는, 키트.
- 제99항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 중합효소, 리가제, 완충액, 차단제, 공-반응물, 희석제, 안정화제, 보정제, 검정 소모품, 전극, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 키트.
- 전기화학발광(ECL) 표지에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- ECL 표지 및 접합 링커에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제129항 또는 제130항에 있어서, ECL 표지는 식 II의 화합물을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제130항 또는 제131항에 있어서, 접합 링커는 아미드, 티오에스테르, 티오에테르, 디설파이드, 이민, 트리아졸, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 친수성 중합체를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
- 제129항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 프로브를 추가로 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
- a. 제133항의 항체 또는 항원-결합 단편; 및
b. 핵산 프로브에 결합할 수 있는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물. - 제129항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 효소를 추가로 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
- a. 제135항의 항체 또는 항원-결합 단편; 및
b. 효소의 기질을 포함하는, 조성물. - 제129항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 표지를 추가로 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
- 제129항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티를 추가로 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
- a. 제138항의 항체 또는 항원-결합 단편; 및
b. (I) 결합 모이어티의 결합 파트너 및 (II) 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함하는 검출가능한 모이어티를 포함하는, 조성물. - 제139항에 있어서, 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 검출가능한 모이어티는 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함하거나; 또는 여기서 결합 모이어티는 비오틴을 포함하고, 검출가능한 모이어티는 스트렙타비딘 및 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함하는, 조성물.
- 제137항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 표지는 광 산란, 광학 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생물발광, 인광, 방사능, 자기장, 또는 이의 조합에 의해 측정될 수 있는, 조성물.
- 제141항에 있어서, 검출가능한 표지는 전기화학발광 표지인, 조성물.
- 제133항의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는, 키트.
- 제135항, 제137항 또는 제138항의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는, 키트.
- 제143항 또는 제144항에 있어서, 앵커링 시약, 주형 올리고뉴클레오티드, 표지된 프로브, 중합효소, 리가제, 완충액, 차단제, 공-반응물, 희석제, 안정화제, 보정제, 검정 소모품 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 키트.
- 제143항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 시약 및 검출 시약 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함하며, 여기서 검출 시약은 ECL 표지를 포함하는, 키트.
- 제146항에 있어서, 검출 시약은 제1 검출 시약이고, 여기서 키트는 제2 검출 시약을 추가로 포함하며, 제2 검출 시약은 ECL 표지를 포함하는, 키트.
- 제143항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 표면을 추가로 포함하는, 키트.
- 검정 시스템으로서,
적어도 하나의 메모리 유닛;
적어도 하나의 메모리 유닛에 대한 명령에 따라 프로그램된 적어도 하나의 처리 유닛; 및
적어도 하나의 처리 유닛에 의해 제어되도록 구성된 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 처리 유닛은:
샘플에서 더 높은 존재량의 분석물의 제1 측정; 및 샘플에서 더 낮은 존재량의 분석물의 제2 측정 중 하나 또는 둘 모두를 수행하도록 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 제어하도록 구성되고,
여기서 더 높은 존재량의 분석물은 더 낮은 존재량의 분석물보다 대략적으로 10 내지 100000 더 높은 배수로 샘플에 존재하고,
여기서 더 높은 존재량의 분석물은 ECL 표지를 포함하는 검출 시약을 사용하여 검출되고,
그리고 여기서 더 낮은 존재량의 분석물은 (i) ECL 표지를 포함하는 검출 시약 및 (ii) ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 사용하여 검출되는, 검정 시스템. - 제149항에 있어서, 제1 및/또는 제2 측정은 (i) 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인 및 (ii) 더 낮은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 표면 상에서 수행되는, 검정 시스템.
- 제150항에 있어서, 검정 시스템은 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인에 대해 제1 측정을 선택적으로 수행하고, 더 낮은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인에 대해 제2 측정을 선택적으로 수행하도록 구성되는, 검정 시스템.
- 제151항에 있어서, 검정 시스템은 제1 측정으로부터의 값이 사전정의된 역치보다 낮다는 결정에 기반하여 결합 도메인에 대한 제2 측정을 선택적으로 수행하도록 구성되는, 검정 시스템.
- 제149항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 시스템은 제1 측정 및 제2 측정을 순차적으로 수행하도록 구성되는, 검정 시스템.
- 제149항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 시스템은 제1 측정 및 제2 측정을 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 수행하도록 구성되는, 검정 시스템.
- 적어도 하나의 처리 유닛에 의해 실행될 때, 적어도 하나의 처리 유닛이:
검정 시스템의 제어를 통해, 샘플에서 더 높은 존재량의 분석물의 제1 측정; 및 샘플에서 더 낮은 존재량의 분석물의 제2 측정 중 하나 또는 둘 모두를 수행하게 하는 명령이 이에 저장된 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체로서,
여기서 더 높은 존재량의 분석물은 더 낮은 존재량의 분석물보다 대략적으로 10 내지 100000 더 높은 배수로 샘플에 존재하고,
여기서 더 높은 존재량의 분석물은 ECL 표지를 포함하는 검출 시약을 사용하여 검출되고,
그리고 여기서 더 낮은 존재량의 분석물은 (i) ECL 표지를 포함하는 검출 시약 및 (ii) ECL 표지에 특이적으로 결합하는 신호 증폭 시약을 사용하여 검출되는, 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체. - 제155항에 있어서, 제1 및/또는 제2 측정은 (i) 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인 및 (ii) 더 낮은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 표면 상에서 수행되는, 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
- 제156항에 있어서, 검정 시스템은 더 높은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인에 대해 제1 측정을 선택적으로 수행하고, 더 낮은 존재량의 분석물을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인에 대해 제2 측정을 선택적으로 수행하도록 구성되는, 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
- 제156항에 있어서, 검정 시스템은 제1 측정으로부터의 값이 사전정의된 역치보다 낮다는 결정에 기반하여 결합 도메인에 대한 제2 측정을 선택적으로 수행하도록 구성되는, 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
- 제155항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 시스템은 제1 측정 및 제2 측정을 순차적으로 수행하도록 구성되는, 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
- 제155항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 시스템은 제1 측정 및 제2 측정을 동시적으로 또는 실질적으로 동시적으로 수행하도록 구성되는, 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
- 검정 시스템으로서,
적어도 하나의 메모리 유닛;
적어도 하나의 메모리 유닛에 대한 명령에 따라 프로그램된 적어도 하나의 처리 유닛; 및
적어도 하나의 처리 유닛에 의해 제어되도록 구성된 적어도 하나의 검정 시스템 구성요소를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 처리 유닛은:
샘플에서 분석물의 측정을 수행하기 위해 적어도 하나의 검정 시스템 구성성분을 제어하도록 구성되고,
여기서 분석물은 ECL 표지를 포함하는 단일 검출 시약을 사용하여 약 0.0001 내지 약 100000 pg/mL의 농도로 존재할 때 샘플에서 검출될 수 있는, 검정 시스템.
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