KR20140092941A - 면역검출능의 개선 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에는, 혈액, 혈청 또는 혈장의 임의로 희석된 샘플에서 적어도 하나의 단백질의 면역검출능을 개선시키는 방법으로써, 상기 샘플과, 적어도 하나의 단백질의 검출 및/또는 정량화를 위한 적어도 하나의 친화성 리간드를 접촉시키기 전에 64 내지 85℃의 온도로 상기 샘플을 가열하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 혈액 또는 혈액 유도된 샘플에서 단백질의 검출 분야에 관한 것이다.
현재, 프로테옴(proteome)분석에서 광범위하게 사용되며 잘 받아드려지는 수용되는 기술은 종종 2D 겔 전기영동 또는 크로마토그래피 기술과 조합하여 사용되는 질량 분광측정법이다. 그러나, 소형화 및 병렬화 (parallelized) 기술 플랫폼에 대한 최근의 개발은 질량 분광 분석을 지원하고 보충하는 가능성을 열었다.
첫째, 샘플과, 적어도 하나의 친화성 리간드를 접촉시키기 전에 50 내지 85℃의 온도로 샘플을 가열하는 단계를 포함하는, 혈액, 혈청 또는 혈장의 임의로 희석된 샘플에서 적어도 하나의 단백질의 면역검출능을 개선시키는 방법이 제공된다.
둘째, 본원 발명에서는 a) 피검체로부터 혈액, 혈청 또는 혈장의 임의로 희석된 제1 및 제2 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 제1 샘플을 50 내지 85℃의 온도로 가열시키는 단계;
c) 상기 제1 샘플을, 단계 (b)의 가열 후에, 면역검출능이 가열에 의해 증가된 표적 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시키는 단계;
d) 가열처리하지 않은 제2 샘플을, 면역검출능이 가열에 의해 증가되지 않은 표적 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시키는 단계; 및
e) 단계 c) 및 d)에서 형성된 항체 및 상응하는 표적 단백질 사이의 상호작용을 검출하여 혈액, 혈청 또는 혈장에서 단백질을 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함하는, 피검체의 혈액, 혈청 또는 혈장에서 단백질을 검출 및/또는 정량화하는 방법이 제공된다.
셋째, a) 의학적 상태를 갖는 제1 피검체 그룹 및 의학적 상태를 갖지 않는 제2 피검체 그룹으로부터 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플을 제공하는 단계,
b) 상기 샘플을, 임의로 희석 후에, 50 내지 85℃의 온도로 가열시키는 단계,
c) 상기 샘플을, 적어도 하나의 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시켜 각각의 그룹에서 적어도 하나의 단백질 레벨을 측정하는 단계, 및
d) 상기 레벨을 비교하여, 제2 그룹의 샘플보다 제1 그룹의 샘플에서 높거나 낮은 레벨로 발생하는 단백질을 동정하고, 이에 의해 의학적 상태의 바이오마커를 동정하는 단계를 포함하는, 의학적 상태의 바이오마커를 동정하는 방법이 제공된다.
상기 방법의 다양한 실시양태가 하기에서 보다 상세히 설명된다.
본 발명의 첫번째 양태는 혈액, 혈청 또는 혈장의 임의로 희석된 샘플에서 적어도 하나의 단백질의 면역검출능을 개선시키는 방법으로써, 상기 샘플과, 적어도 하나의 친화성 리간드를 접촉시키기 전에 50 내지 85℃의 온도로 샘플을 가열하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
첫번째 양태의 구성은 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 중의 단백질을 검출하는 방법이며,
a) 상기 샘플을 50 내지 85℃의 온도로 가열시키는 단계,
b) 상기 샘플을, 공지된 표적 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 샘플로부터 적어도 하나의 친화성 리간드 및 상응하는 표적 단백질(들) 사이의 상호작용(들)을 검출하여 샘플 중의 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명은, 혈장 또는 혈청 샘플이 분석 전에 가열되는 경우에 혈장 및 혈청 샘플의 일부 단백질이 항체에 의해 고도로 검출된다는 발견에 기초한다. 임의의 특정한 과학적 이론에 구속되지 않지만, 혈청 또는 혈장 단백질에서 항체 및 이들의 상응하는 에피토프 사이의 상호작용은 가열에 의해 촉진되는 것으로 보인다.
본 발명의 발견은 다수의 잇점을 수반할 수 있다. 가열을 사용함으로써, 면역학적 방법을 사용하여 이전에 검출할 수 없었던 단백질을 검출할 수 있다. 따라서, 복합 생물학적 샘플의 단백질 내용물의 보다 포괄적인 그림을 얻을 수 있다. 또한, 상기 가열은 이러한 복합 생물학적 샘플에 낮은 레벨로 존재하는 단백질을 검출할 수 있게 한다. 이것은, 많은 흥미있는 바이오마커들이 더 낮은 농도 범위로 발견되는 것으로 보고되었기 때문에 특히 흥미로울 수 있다. 따라서, 본 발명의 가열은 프로테옴 연구의 민감도를 증가시키는 유용한 도구일 수 있다.
본 명세서의 문맥에서, 단백질의 "면역검출능 (immunodetectability)"은 단백질의 선형 또는 입체구조 에피토프가 이러한 에피토프와 선택적 상호작용할 수 있는 친화성 리간드, 예를 들면, 항체에 의해 검출될 수 있는 정도를 언급한다.
추가로, 본 명세서의 문맥에서, 단백질의 면역검출능의 "개선"은 가열을 수행하지 않은 경우 단백질의 시그날(또는 아웃풋)과 비교하여 에피토프 인식에 기반한 분석에서 단백질의 시그날(또는 아웃풋)를 증가시킴을 언급한다. 따라서, 면역검출능이 개선되었는지를 측정하기 위해, 문제 단백질의 시그날은 동시에 채취한 환자로부터의 2개의 샘플에서 측정될 수 있고, 여기서, 샘플 중의 하나는 측정 전에 가열되었다. 면역검출능은 가열된 샘플내의 단백질의 시그날이 가열되지 않은 샘플내의 단백질의 시그날보다 높은 경우에 개선된다. 이러한 비교의 정확도를 개선시키기 위해, 각 샘플에 대한 1회 이상의 측정 및/또는 각 카테고리의 하나 이상의 샘플에 대한 측정을 수행할 수 있다. 몇몇 양태에서, 면역검출능은 당해 시그날이 절대값으로 1.5배 또는 2배 증가한 경우에 개선된 것으로 간주될 수 있다.
"샘플과 적어도 하나의 친화성 리간드 간의 접촉"은 샘플 중의 단백질(들)의 검출 및/또는 정량화를 가능하게 한다. 따라서, 친화성 리간드의 선택성은, 친화성 리간드가 인식하는 단백질의 존재 및/또는 풍부를 측정하는데 사용할 수 있다. 접촉은 하기에 추가로 언급된 바와 같이 다양한 설정 및 포맷을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 두번째 양태는 피검체의 혈액, 혈청 또는 혈장에서 단백질을 검출 및/또는 정량화하는 방법이며,
a) 피검체로부터 혈액, 혈청 또는 혈장의 임의로 희석된 제1 및 제2 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 제1 샘플을 50 내지 85℃의 온도로 가열시키는 단계;
c) 상기 제1 샘플을, 단계 b)의 가열 후에, 면역검출능이 가열에 의해 증가된 표적 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시키는 단계;
d) 가열처리하지 않은 제2 샘플을, 면역검출능이 가열에 의해 증가되지 않은 표적 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시키는 단계; 및
e) 단계 c) 및 d)에서 형성된 항체 및 상응하는 표적 단백질 사이의 상호작용을 검출하여 혈액, 혈청 또는 혈장에서 단백질을 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
두번째 양태는, 몇몇 단백질의 면역검출능은 본 발명의 열 처리 중에 개선되는 반면, 몇몇 다른 단백질의 면역검출능은 증가되지 않거나 심지어 감소된다는 본 발명자들의 식견에 기초한다. 따라서, 전자 단백질의 검출이 가열된 샘플에서 수행되고, 후자 단백질의 검출이 가열되지 않은 샘플에서 수행되는 경우, 보다 넓은 범위의 단백질에 대해 감도의 최적화를 달성할 수 있다.
당해 분야의 기술자는, 과도한 부담 없이, 동일한 단백질의 2회 측정, 즉 가열된 샘플에서 1회 및 가열되지 않은 샘플에서 1회 측정을 단순히 수행함으로써 단백질의 면역검출능이 개선되었는지 또는 개선되지 않았는지를 측정한 다음, 수득된 시그날을 비교한다. 당해 시그날이 가열 처리된 샘플에서 보다 높으면, 당해 단백질은 가열에 의해 면역검출능이 증가된 단백질로서 선택하고, 상응하는 친화성 리간드는 추가의 분석에서 가열 처리된 샘플과 접촉시킨다.
본 발명의 세번째 양태는 의학적 상태의 바이오마커를 동정하는 방법이며,
a) 의학적 상태를 갖는 제1 피검체 그룹 및 의학적 상태를 갖지 않는 제2 피검체 그룹으로부터 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 샘플을, 임의로 희석 후에, 50 내지 85℃의 온도로 가열시키는 단계;
c) 상기 샘플을, 가열 후에, 적어도 하나의 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시켜 각각의 그룹에서 적어도 하나의 단백질 레벨을 측정하는 단계; 및
d) 상기 레벨을 비교하여, 제2 그룹의 샘플보다 제1 그룹의 샘플에서 높거나 낮은 정도로 발생하는 단백질을 동정하고, 이에 의해 의학적 상태의 바이오마커를 동정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세번째 양태는 정상 및 발병 환자의 가열된 샘플의 비교가, 가열되지 않은 샘플을 분석하는 경우에 검출할 수 없었던 단백질 발현의 차이를 나타냈다는 본 발명자들의 발견에 기초한다. 그 결과로, 이전에 인식불가능한 바이오마커는 본 발명의 방법을 사용하여 동정할 수 있다. 이것은 도 7 및 도 8에 예시되어 있고, 여기서 정상 피검체 및 전립선암을 갖는 피검체의 가열된 샘플과 가열되지 않은 샘플 중의 특정 단백질의 레벨이 나타나있고, 전립선암의 2개 단백질 바이오마커가 동정된다.
제3 양태의 의학적 상태는, 예를 들면, 질환 또는 또 다른 의학적 질환, 예를 들면, 암일 수 있다.
당해 분야의 기술자는 단계 d)에서 2개 그룹의 레벨을 비교하고, 당해 레벨 사이의 차이가 단백질이 바이오마커이다라고 결론내리는데 충분한지를 결정하는 방법을 이해한다.
제3 양태의 한 양태에서, 단백질은 이의 농도가 제2 그룹 샘플에서보다 제1 그룹 샘플에서 적어도 25% 높거나, 예를 들면 적어도 50% 높거나, 예를 들면 적어도 100% 높은 경우에 단계 d)에서 바이오마커로서 동정된다. 추가로, 단백질은 검출 시스템에서 시그날이 제2 그룹의 샘플에서보다 제1 그룹의 샘플에서 적어도 25% 높거나, 예를 들면 적어도 50% 높거나, 예를 들면 적어도 100% 높은 경우에 바이오마커로서 동정될 수 있다. 따라서, 비교되는 농도 또는 시그날은 샘플 중의 농도의 평균 또는 중간 값일 수 있다. 또한, 당해 상황은 단백질이 단지 샘플 중의 일부에서 검출되는 것일 수 있고, 이러한 경우에 단백질은 제2 그룹의 샘플보다 제1 그룹의 샘플에서 보다 높은 비율로 검출하는 경우에 단계 d)에서 바이오마커로서 동정될 수 있다.
단백질은 또한 발병 그룹의 샘플에서 보다 낮은 정도로 검출되는 경우에 바이오마커로서 동정될 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, 당해 방법은 단지 혈액, 혈장 또는 혈청의 비-면역글로불린 단백질을 검출 및/또는 정량화하는 것에 관한 것이다. 면역글로불린 단백질의 몇몇 에피토프의 검출능은 면역글로불린 단백질이 이의 항원과 관련되는지 또는 그렇지 않은지에 영향을 받는다. 임의의 특정한 과학적 이론에 구속되지 않지만, 본 발명자들은 표적 단백질의 이러한 상호작용의 형성 또는 분리가 가열 효과의 원인이 되지 않는다고 생각한다. 그외에, 샘플의 가열은 면역글로불린 단백질의 결합 활성을 변경하고 이에 의해 이들의 기능의 동정을 절충할 수 있다. 그 결과적으로, 본 발명의 방법의 실시양태에서, 적어도 하나의 친화성 리간드는 적어도 하나의 비-면역글로불린 단백질과 선택적 상호작용할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 샘플은 50 내지 85℃의 온도로 가열된다. 하기 예시적 실시양태 및 도 1에서, 이러한 온도 범위는 면역검출능을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 방법의 실시양태에서, 샘플은 64 내지 85℃, 예를 들면 66 내지 78℃, 예를 들면 70 내지 74℃, 예를 들면 약 72℃로 가열된다. 하기 예시적 실시양태 및 도 1, 3 및 4에서, 이러한 범위 내의 온도는 적어도 몇몇 양태에서, 50 내지 85℃의 보다 넓은 범위, 보다 더 바람직한 것으로 밝혀졌다.
통상, 본 발명의 가열은 시간으로 한정되고, 이는 샘플을 먼저 소정 온도로 가열시키고 당해 온도에서 일정시간 유지시킨 다음, 통상 실온(예: 20 내지 25℃)의 온도로 냉각하는 것을 의미한다. 그 결과, 가열 후의 단계, 예를 들면, 친화성 리간드와의 접촉은 통상 증가된 온도에서 수행되지 않는다. 본 발명자들은 가열 및 임의의 냉각이 써모 사이클러에서 수행될 수 있음을 밝혔다. (써모 사이클러는 통상 PCR에서 사용된다). 그러나, 다른 가열 수단이 또한 사용될 수 있다.
가열 시간은 노동 및 물질을 효율적으로 사용하여 분석의 경제성을 개선시키기 위해 낮게 유지할 수 있다. 예를 들면, 이것은 거대한 피검체 그룹에서 다수의 단백질이 분석될 수 있는 프로테옴에서 유익할 수 있다. 본 발명자들은 1시간 미만 또는 30분 미만 기간 동안의 가열이 만족스러운 결과를 얻는데 충분하다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명의 실시양태에서, 상기 가열은 0.5 내지 55분, 예를 들면 1 내지 40분, 예를 들면 1 내지 29분, 예를 들면 5 내지 20분, 예를 들면 15분 동안 수행된다.
하기 실시예에서, 샘플의 단백질은 가열 전에 표지된다. 표지 (label)는 이후에 형광단과 반응하고, 최종 검출 단계에서 검출된다. 본 발명자들은 이러한 표지화가 효율적인 분석 도구를 제공하고 가열 전의 표지화가 가열 후의 표지화보다 면역검출능이 증가된 고도의 단백질 수를 제공함을 밝혀냈다. 추가로, 샘플은 표지화와 가열 사이에 희석(예: 10 내지 100배)시킬 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, 샘플의 단백질은 샘플과 적어도 하나의 친화성 리간드를 접촉시킨 후의 검출 단계에서 직접 또는 간접적으로 검출할 수 있는 표지로 가열 전에 표지할 수 있다. 표지는, 예를 들면, 비오틴을 포함할 수 있다. 즉, 표지화는, 예를 들면, 비오티닐화일 수 있다. 표지는 자체(직접) 또는 제2 표지(간접)를 통해 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 실시양태에서, 표지된 단백질은, 친화성 리간드(들)과의 접촉 후, 후속의 검출 단계에서 검출할 수 있는 제2 표지로 접촉시킬 수 있다. 제2 표지는, 예를 들면 형광단일 수 있다.
본 발명의 방법의 샘플은 가열 전에 희석 할 수 있다. 희석은 일반적으로 면역학적 검출에 기초하는 분석물에서 표적 단백질로부터의 시그날 뿐만 아니라 배경 시그날(노이즈)을 감소시키는 것으로 간주된다. 본 발명의 실시양태에서, 샘플은 가열 전에 10 내지 10000배, 예를 들면 100 내지 2500배, 예를 들면 200 내지 1000배, 예를 들면 약 500배 희석될 수 있다.
샘플은, 예를 들면, 래빗 IgG 및/또는 카제인과 같은 첨가제를 포함하는 완충제를 사용하여 희석시킬 수 있다. 이들 첨가제는 샘플 중의 단백질과 (특이적) 친화성 리간드(들) 사이의 비특이적 결합을 퀀칭하여, 검출시의 노이즈를 감소시킬 수 있다.
완충제 중의 퀀칭 항체의 농도는 0.05 내지 5 mg/ml, 예를 들면 0.1 내지 2 mg/ml, 예를 들면 약 0.5 mg/ml일 수 있고, 완충제 중의 카제인의 농도는 0.01 내지 10 %(w/v), 예를 들면 0.05 내지 2 %(w/v), 예를 들면 약 0.1 %(w/v)일 수 있다.
몇몇 단백질의 동시 검출 및 이에 의해 혈액, 샘플 또는 혈장의 단백질 함유량의 효율적인 분석을 제공하기 위해, 샘플은 동일한 반응 구획에서 하나 이상의 친화성 리간드와 접촉시킬 수 있다. 동일한 샘플에서 30개 이상의 상이한 단백질을 검출하기 위해, 리간드가 후속 검출 단계에서 분석되는 비드에 커플링될 수 있는 소형화 및 병렬화 시스템에서 친화성 리간드를 사용하는 데 유리하다. 추가로, 이러한 비드는 후속 검출 단계에서 시그날을 친화성 리간드 및 이어서 단백질에 연결하는 아이덴티디(identity)가 제공될 수 있다. 때때로, 이러한 비드는 "코드된 입자(coded particles)"로저 언급된다[참조: Kingsmore, S.F. Nat Rev. Drug Discovery 2006, 5(4), 310-320]. 종래의 샌드위치 분석을 사용하면, 동일한 샘플에서 30개 이상의 상이한 단백질을 검출할 수 있는 설정을 제공하는 것은 실제로 매우 어렵고 시간 소모적이다.
따라서, 본 발명의 방법의 실시양태에서, 가열은 샘플과 적어도 4개, 예를 들면 적어도 10개, 예를 들면 적어도 30개, 예를 들면 적어도 50개의 상이한 친화성 리간드의 접촉 전에 수행된다.
단백질에 커플링된 직접 또는 간접 검출가능한 표지 및 친화성 리간드(들)에 커플링된 아이덴티디를 갖는 검출가능한 잔기를 사용함으로써, 검출 단계에서 다수의 펄스 네가티브를 낮게 유지할 수 있는데, 이는 단백질과 관련된 표지 및 친화성 리간드와 관련된 잔기로부터 시그날을 제공하지 않는 임의의 엔터티(entity)가 무시될 수 있기 때문이다.
상기 제시된 실시양태는 주로 제1 양태와 관련하여 설명되어 있다. 그러나, 당해 분야의 기술자는 당해 양태가 또한 필요한 부분만 약간 변경하여 제2 및 제3 양태에 적용할 수 있음을 이해한다.
본 발명과 관련하여, "적어도 하나의 친화성 리간드"는 적어도 1종 이상의 친화성 리간드를 언급하며, 여기서 당해 종은 친화성 리간드의 특이성 (specificity)에 의해 정의된다. 따라서, 당해 분야의 기술자는 친화성 리간드의 한 종류가 동일한 항원과 선택적 상호작용할 수 있는 모든 폴리클로날 항체 그룹을 지칭할 수 있는 것으로 이해한다.
따라서, "상이한 친화성 리간드"는 상이한 특이성을 갖는 친화성 리간드를 언급한다.
적절한 친화성 리간드를 선택 또는 제조하고 본 발명에 따르는 검출 및/또는 정량화에 적절한 포맷 및 조건을 선택하는 것은 당해 분야의 기술자의 능력 범위 내의 것으로 간주된다. 그렇지만, 검출 및/또는 정량화를 위한 포맷 및 조건의 예뿐만 아니라 유용한 것으로 입증할 수 있는 친화성 리간드의 예는 설명을 위해 하기에 제공되어 있다.
따라서, 본 발명의 실시양태에서, 친화성 리간드는 항체, 이의 단편 및 이의 유도체, 즉, 면역글로불린 스캐폴드에 기초한 친화성 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 항체 및 이의 단편 또는 유도체는 분리되고/되거나 단일특이성일 수 있다. 항체는 쥐, 래빗 및 사람을 포함하는 임의 기원의 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체, 및 상이한 종으로터의 서열을 포함하는 키메라 항체 뿐만 아니라 기타 항체, 예를 들면, 부분 사람화 마우스 항체와 같은 부분 사람화 항체 포함한다. 폴리클로날 항체는 동물을 선택 항원으로 면역화함으로써 제조할 수 있다. 소정 특이성을 갖는 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler and Milstein (Kohler G and Milstein C(1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519]에 의해 개발된 하이브리도마 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 항체 단편 및 유도체는 단편 또는 유도체인 항체와 동일한 항원과 선택적 상호작용할 수 있다. 항체 단편 및 유도체는 순수한 면역글로불린 단백질의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1), 경쇄의 불변 도메인(CL), 중쇄의 가변 도메인(VH) 및 경쇄의 가변 도메인(VL)으로 이루어진 Fab 단편; 2개의 가변 항체 도메인 VH 및 VL로 이루어진 Fv 단편[참조: Skerra A and Pluckthun A (1988) Science 240: 1038-1041]; 가요성 펩티드 링커에 의해 함께 연결된 2개의 VH 및 VL 도메인으로 이루어진 일본쇄 Fv 단편(scFv)[참조: Bird RE and Walker BW (1991) Trends Biotechnol. 9: 132-137]; 벤스 존스(Bence Jones) 이합체[참조: Stevens FJ et al. (1991) Biochemistry 30: 6803-6805]; 카멜리드 중쇄 이합체[참조: Hamers-Casterman C et al. (1993) Nature 363: 446-448] 및 단일 가변 도메인[참조: Cai X and Garen A (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 6280-6285; Masat L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 893-896] 및 단일 도메인 스케폴드 등, 예를 들면, 너스 샤크로부터의 새로운 항원 수용체(New Antigen Receptor: NAR)[참조: Dooley H et al. (2003) Mol. Immunol. 40: 25-33] 및 가변 중쇄에 기초한 미니바디[참조: Skerra A and Pluckthun A (1988) Science 240: 1038-1041]를 포함한다.
본 명세서의 문맥에서, "단일특이성 항체"는 자체 항원에 대해 친화성 정제됨으로써 이러한 단일특이성 항체를 다른 항혈청 단백질 및 비특이성 항체와 분리하는 폴리클로날 항체의 모집단 중의 하나이다. 이러한 친화성 정제는 이의 항원에 선택적으로 결합하는 항체를 생성한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 단일특이성 항체를 수득하기 위해, 폴리클로날 항혈청을 2단계 면역친화성 기반 프로토콜에 의해 정제하여 표적 단백질에 선택적인 단일특이성 항체를 수득할 수 있다. 항원 단편의 유전자 친화성 태그에 대해 지시된 항체는 포착제로서 고정 태그 단백질을 사용하여 주요 소모 단계에서 제거된다. 제1 소모 단계 후, 당해 항원에 특이적인 항체를 농후화시키기 위하여 혈청을 포착제로서 항원을 갖는 제2 친화성 컬럼 상에 적재한다[참조: Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5: 4327-4337].
폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 뿐만 아니라 이의 단편 및 유도체는 선택적 생물분자 인식을 요구하는 분야, 예를 들면, 본 발명에 따르는 단백질의 검출 및/또는 정량화에서 친화성 리간드의 종래의 선택을 나타낸다. 그러나, 당해 분야의 기술자는 선택적 결합 리간드의 대량 생성 및 낮은 제조 비용의 시스템에 대한 요구 증가에 기인하여 새로운 생물분자 다양한 기술이 개발되었음을 알고 있다. 이는 종종 생체분자 인식 분야에서 결합 리간드로서 동등하게 유용한 것으로 판명되고 면역글로불린 대신에 또는 이와 함께 사용될 수 있는, 비면역글로불린 기원 뿐 아니라 면역글로불린 기원의 친화성 리간드의 새로운 형태를 생성할 수 있게 했다.
친화성 리간드의 선택에 요구되는 생체분자 다양성은 복수의 가능한 스캐폴드 분자 중의 하나를 조합 조작하여 생성할 수 있고, 이어서 특이적 및/또는 선택적 친화성 리간드는 적합한 선택 플랫폼을 사용하여 선택한다. 스캐폴드 분자는 면역글로불린 단백질 기원[참조: Bradbury AR and Marks JD (2004) J. Immunol. Meths. 290: 29-49], 비면역글로불린 단백질 기원[참조: Nygren PA and Skerra A (2004) J. Immunol. Meths. 290: 3-28] 또는 올리고뉴클레오티드 기원[참조: Gold L et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64: 763-797]로 이루어질 수 있다.
다수의 비면역글로불린 단백질 스캐폴드는 새로운 결합 단백질을 개발할 때에 지지 구조물로서 사용되어 왔다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 친화성 리간드의 제조에 유용한 이러한 구조물의 비제한적 예는 스타필로콕쿠스 단백질 A 및 이의 도메인 및 이들 도메인의 유도체, 예를 들면, 단백질 Z[참조: Nord K et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:772-777]; 리포칼린[참조: Beste G et al . (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1898-1903]; 안키린 반복 도메인[참조: Binz HK et al . (2003) J..Mol. Biol. 332:489-503]; 셀룰로오즈 결합 도메인(CBD)[참조: Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277:317-332; Lehtio J et al. (2000) Proteins 41:316-322]; γ 결정질[참조: Fiedler U and Rudolph R, W001/04144]; 녹색 형광 단백질(GFP)[참조: Peelle B et al . (2001) Chem. Biol. 8:521-534]; 사람 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(CTLA-4)[참조: Hufton SE et al . (2000) FEBS Lett. 475:225-231; Irving RA et al . (2001) J. Immunol. Meth. 248:31-45]; 프로테아제 억제제, 예를 들면, 놋틴(Knottin) 단백질[참조: Wentzel A et al. (2001) J. Bacteriol. 183:7273-7284; Baggio R et al . (2002) J. Mol. Recognit. 15:126-134] 및 쿠니츠(Kunitz) 도메인[참조: Roberts BL et al . (1992) Gene 121:9-15; Dennis MS and Lazarus RA (1994) J. Biol. Chem. 269:22137-22144]; PDZ 도메인[참조: Schneider S et al . (1999) Nat. Biotechnol. 17:170-175]; 펩티드 앱타머, 예를 들면, 티오레독신[참조: Lu Z et al . (1995) Biotechnology 13:366-372; Klevenz B et al . (2002) Cell. Mol. Life Sci. 59:1993-1998]; 스타필로콕쿠스 뉴클레아제[참조: Norman TC et al. (1999) Science 285:591-595]; 텐다미스탯(tendamistat)[참조: McConell SJ and Hoess RH (1995) J. Mol. Biol. 250:460-479; Li R et al . (2003) Protein Eng. 16:65-72]; 피브로넥틴 유형 III 도메인에 기초한 트리넥틴[참조: Koide A et al . (1998) J. Mol. Biol. 284: 1141-1151; Xu L et al. (2002) Chem. Biol. 9:933-942]; 및 징크 핑거[참조: Bianchi E et al. (1995) J. Mol. Biol. 247:154-160; Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293:215-218; Segal DJ et al. (2003) Biochemistry 42:2137-2148]이다.
비면역글로불린 단백질 스캐폴드의 상기한 예는 새로운 결합 특이성의 생성에 사용된 단일 랜덤화 루프, 즉 경질 제2 구조를 갖는 단백질 스캐폴드를 제공하는 스캐폴드 단백질을 포함하고, 여기서 단백질 표면으로부터 돌출하는 측쇄는 새로운 결합 특이성의 생성을 위해 랜덤화되고, 스캐폴드는 새로운 결합 특이성의 생성에 사용된 불연속 고가변성 루프 영역을 나타낸다.
비면역글로불린 단백질 이외에, 올리고뉴클레오티드를 또한 친화성 리간드로서 사용할 수 있다. 앱타머 또는 데코이로서 지칭되는 단일 사슬의 핵산은 잘 규정된 3차원 구조물로 중첩하고 높은 친화성 및 특이성으로 이들의 표적에 결합한다[참조: Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822; Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13; Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359]. 올리고뉴크레오티드 리간드는 RNA 또는 DNA일 수 있고, 광범위한 표적 분자 부류에 결합할 수 있다.
상기 언급된 임의의 스캐폴드 구조물의 변이체 풀로부터 목적하는 친화성 리간드를 선택하기 위해, 다수의 선택 플랫폼이 선택 표적 단백질에 대한 특이적 신규 리간드의 분리에 이용가능하다. 선택 플랫폼은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 파지 디스플레이[참조: Smith GP (1985) Science 228: 1315-1317], 리보솜 디스플레이[참조: Hanes J and Pluckthun A (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 4937-4942], 효모단백질잡종시스템[참조: Fields S and Song O (1989) Nature 340:245-246], 효모 디스플레이[참조: Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17: 467-473], mRNA 디스플레이[참조: Roberts RW and Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12297-12302], 박테리아 디스플레이[참조: Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17: 474-480, Kronqvist N et al. (2008) Protein Eng Des Sel 1-9, Harvey BR et al. (2004) PNAS 101(25): 913-9198], 마이크로비드 디스플레이[참조: Nord O et al. (2003) J Biotechnol 106: 1-13, WO01/05808], SELEX[참조: System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)[참조: Tuerk C and Gold L (1990) Science 249: 505-510] 및 단백질 단편 상보성 분석(PCA)[참조: Remy I and Michnick SW (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 5394-5399]을 포함한다.
따라서, 본 발명의 실시양태에서, 친화성 리간드는 상기 나열된 임의의 단백질 스캐폴드로부터 유도된 비면역글로불린 친화성 리간드 또는 올리고뉴클레오티드 분자일 수 있다.
본 발명의 검출 및/또는 정량화는 친화성 리간드(예: 항체)와 항원 사이의 상호작용에 기반한 분석에서 결합 시약의 검출 및/또는 정량화를 위해 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 임의의 방식으로 달성될 수 있다. 따라서, 상기 기재된 임의의 친화성 리간드를 사용하여 혈액 또는 혈액 유도된 샘플 중의 단백질의 존재를 정량적 및/또는 정성적으로 검출할 수 있다. 이들 "제1 (primary)" 친화성 리간드는 자체로 다양한 마커로 표지되거나, 검출, 시각화 및/또는 정량화를 가능하게 하기 위해 제2 표지된 친화성 리간드에 의해 순차로 검출될 수 있다. 이는, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 임의의 하나 이상의 다수의 기술을 사용하여 과도한 실험을 수반하지 않고도, 임의의 하나 이상의 다수의 표지를 사용하여 달성될 수 있다.
제1 및/또는 제2 친화성 리간드에 접합될 수 있는 표지의 비제한적 예는 형광 염료 또는 금속(예: 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 플루오레스카민), 발색단 염료(예: 로돕신), 화학발광 화합물(예: 루미날, 이미다졸) 및 생물발광 단백질(예: 루시페린, 루시퍼라제), 합텐(예: 비오틴)을 포함한다. 다양한 기타 유용한 형광제 및 발색단은 문헌[참조: Stryer L (1968) Science 162:526-533 and Brand L and Gohlke JR (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868]에 기재되어 있다. 친화성 리간드는 또한 효소(예: 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 베타-락타마제), 방사선동위원소(예: 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I) 및 입자(예: 금)으로 표지될 수 있다. 본 명세서의 문맥에서, "입자"는 분자의 표지에 적합한 입자, 예를 들면, 금속 입자를 지칭한다. 추가로, 친화성 리간드는 또한 형광 반도체 나노결정(양자점)로 표지될 수 있다. 양자점은 우수한 양자 수율을 갖고 유기 형광단과 비교하여 보다 광안정하며, 따라서 보다 용이하게 검출된다[참조: Chan et al. (2002) Curr Opi Biotech. 13: 40-46]. 상이한 종류의 표지가 다양한 화학반응, 예를 들면, 아민 반응 또는 티올 반응을 사용하여 친화성 리간드에 접합될 수 있다. 그러나, 아민 및 티올 이외의 기타 반응성 그룹, 예를 들면, 알데히드, 카복실산 및 글루타민이 사용될 수 있다.
상기 방법의 양태는 비제한적 선택이 하기에 언급되어 있는 임의의 몇몇 공지된 포맷 및 설정에서 사용할 수 있다.
친화성 리간드에 대한 표지의 가시화 방법은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 형광측정, 발광측정 및/또는 효소적 기술을 포함할 수 있다.
형광 표지를 특정한 파장의 광에 노출시킨 다음 특정한 파장 영역에서 발광을 검출 및/또는 정량함으로써 형광은 검출 및/또는 정량화된다. 발광 태그된 친화성 리간드의 존재는 화학 반응 동안 현상된 발광에 의해 검출 및/또는 정량화될 수 있다. 효소적 반응의 검출은 화학적 반응으로부터 발생하는 샘플 중의 색 이동에 기인한다. 상이한 종류의 엘리사(ELISA)는 효소적 반응에 기반한 방법의 예이다. 당해 분야의 기술자는 다양한 상이한 프로토콜이 적절한 검출 및/또는 정량화를 위해 변형될 수 있음을 알고 있다.
어떠한 특정한 과학적 이론으로 구속되지 않지만, 본 발명자들은 선형 에피토프의 면역검출능이 본 발명의 가열을 사용하여 증가될 것으로 믿는다. 본 발명의 방법의 실시양태에서, 친화성 리간드는 선형/연속 에피토프와 선택적 상호작용할 수 있다. 예를 들면, 선형/연속 에피토프와 선택적 상호작용할 수 있는 항체는, 당해 에피토프를 포함하지만 (경질) 제2 구조물을 형성하지 않는 펩티드로 동물을 면역화함으로써 제조될 수 있다. 하기 실시예 부분에 사용된 항체는 단백질 에피토프 서명 태그(Protein Epitope Signature Tag: PrEST) 면역화를 사용하여 생성되며, 이는 종종 선형/연속 에피토프를 인식하는 항체를 야기한다.
혈액, 혈청 또는 혈장의 임의로 희석된 샘플에서 적어도 하나의 단백질의 면역검출능을 개선시키는 방법을 제공할 수 있다.
도 1 내지 4에서, 실선은 혈장 중의 단백질을 나타내고, 점선은 혈청 중의 단백질을 나타낸다.
도 1은 상이한 온도(x축)에서 열 처리 후에 적어도 2배 증가된 면역검출능(y축)을 나타내는 혈장 또는 혈청 중의 단백질 수를 나타낸다.
도 2는 상이한 온도(x축)에서 열 처리 후에 적어도 2배 감소된 면역검출능(y축)을 나타내는 혈장 또는 혈청 중의 단백질 수를 나타낸다.
도 3은 상이한 온도(x축)에서 열 처리 후에 적어도 2배 증가된 면역검출능(y축)을 나타내는 혈장 또는 혈청 중의 단백질 수를 나타낸다.
도 4는 상이한 온도(x축)에서 열 처리 후에 적어도 2배 감소된 면역검출능(y축)을 나타내는 혈장 또는 혈청 중의 단백질 수를 나타낸다.
도 5는 23℃, 56℃ 및 72℃에서 처리 후에 혈청 중의 단백질과 상호작용하는 6개의 상이한 친화성 리간드로부터의 시그날을 나타낸다. 박스 플롯은 본래 형광 시그날 강도 데이타로부터 작성되었고, 3회 반복 분석의 결과를 토대로 했다. MFI = 중간 형광 강도, AU = 임의 단위.
도 6은 23℃, 56℃ 및 72℃에서 처리 후에 혈장 중의 단백질과 상호작용하는 6개의 상이한 친화성 리간드로부터의 시그날을 나타낸다. 박스 플롯은 본래 형광 시그날 강도 데이타로부터 작성되었고, 3회 반복 분석의 결과를 토대로 했다. MFI = 중간 형광 강도, AU = 임의 단위.
도 7은 72℃에서 처리 후에 PSA가 낮은 또는 높은 환자(PSA > 60 ng/ml)로부터 혈장 중의 단백질 레벨의 차이를 나타낸다. 결과는 볼케이토 플롯(volcano plot)으로 나타냈고, 여기서 상대 폴드 변화(x-축)는 t-시험 결과(y-축)에 대한 유의성(P-값)에 대해 플롯팅되어 있다. 실선은 p-값 < 0.01을 나타내고, 점선은 p-값 < 0.05를 나타낸다. 점박스는 ... 을 나타낸다.
도 8은 23℃에서 처리 후에 PSA가 낮은 또는 높은 환자(PSA > 60 ng/ml)로부터 혈장 중의 단백질 레벨의 차이를 나타낸다. 결과는 볼케이노 플롯으로 나타냈으며, 여기서 상대적 폴드 변화(x-축)은 t-시험 결과(y-축)에 대한 유의성(P-값)에 대해 플롯팅되어 있다. 실선은 p-값 < 0.01을 나타내고, 점선은 p-값 < 0.05를 나타낸다. 점박스는 폴드 변화 및 유의값이 작은 단백질이 위치되어 있는 볼케이노 플롯 부분의 확대도를 나타낸다.
도 1은 상이한 온도(x축)에서 열 처리 후에 적어도 2배 증가된 면역검출능(y축)을 나타내는 혈장 또는 혈청 중의 단백질 수를 나타낸다.
도 2는 상이한 온도(x축)에서 열 처리 후에 적어도 2배 감소된 면역검출능(y축)을 나타내는 혈장 또는 혈청 중의 단백질 수를 나타낸다.
도 3은 상이한 온도(x축)에서 열 처리 후에 적어도 2배 증가된 면역검출능(y축)을 나타내는 혈장 또는 혈청 중의 단백질 수를 나타낸다.
도 4는 상이한 온도(x축)에서 열 처리 후에 적어도 2배 감소된 면역검출능(y축)을 나타내는 혈장 또는 혈청 중의 단백질 수를 나타낸다.
도 5는 23℃, 56℃ 및 72℃에서 처리 후에 혈청 중의 단백질과 상호작용하는 6개의 상이한 친화성 리간드로부터의 시그날을 나타낸다. 박스 플롯은 본래 형광 시그날 강도 데이타로부터 작성되었고, 3회 반복 분석의 결과를 토대로 했다. MFI = 중간 형광 강도, AU = 임의 단위.
도 6은 23℃, 56℃ 및 72℃에서 처리 후에 혈장 중의 단백질과 상호작용하는 6개의 상이한 친화성 리간드로부터의 시그날을 나타낸다. 박스 플롯은 본래 형광 시그날 강도 데이타로부터 작성되었고, 3회 반복 분석의 결과를 토대로 했다. MFI = 중간 형광 강도, AU = 임의 단위.
도 7은 72℃에서 처리 후에 PSA가 낮은 또는 높은 환자(PSA > 60 ng/ml)로부터 혈장 중의 단백질 레벨의 차이를 나타낸다. 결과는 볼케이토 플롯(volcano plot)으로 나타냈고, 여기서 상대 폴드 변화(x-축)는 t-시험 결과(y-축)에 대한 유의성(P-값)에 대해 플롯팅되어 있다. 실선은 p-값 < 0.01을 나타내고, 점선은 p-값 < 0.05를 나타낸다. 점박스는 ... 을 나타낸다.
도 8은 23℃에서 처리 후에 PSA가 낮은 또는 높은 환자(PSA > 60 ng/ml)로부터 혈장 중의 단백질 레벨의 차이를 나타낸다. 결과는 볼케이노 플롯으로 나타냈으며, 여기서 상대적 폴드 변화(x-축)은 t-시험 결과(y-축)에 대한 유의성(P-값)에 대해 플롯팅되어 있다. 실선은 p-값 < 0.01을 나타내고, 점선은 p-값 < 0.05를 나타낸다. 점박스는 폴드 변화 및 유의값이 작은 단백질이 위치되어 있는 볼케이노 플롯 부분의 확대도를 나타낸다.
실시 양태의 상세한 설명
재료 및 방법
비드 커플링 (bead coupling)
단일특이성 항체를 약간의 변형과 함께 제조업자의 프로토콜에 따라 카복실화 비드(COOH Micorspheres, Luminex-Corp.)에 커플링시켰다. 각 항체의 전립선암 연구를 위해, 최종 농도 40 μg/ml로 원심 여과 장치(Ultrafree-MC, Millipore)를 사용하여 3.2 μg를 106개 비드에 커플링시켰다. 비드를 NaN3를 갖는 단백질 함유 완충제(Blocking Reagent for ELISA, Roche)에 저장했다. 모든 커플링된 비드를 4℃에서 저장하기 전에 초음파 세정기(Branson, Ultrasonic Corporation)에서 5분간 초음파 처리와 함께 현탁시켰다. 100-플렉스 비드 혼합물을 용액에서 생성하고, 상기 기재한 바와 같이 최적화하고[참조: Schwenk et al (2007) Mol Cell Proteomics 6, 125-132], 연구 전반에 걸쳐 사용했다.
하기 제시된 제1 및 제2 방법을 위해, 자기 카복실화된 비드(MagPlex Micorspheres, Luminex-Corp.)를 사용했다. 상기 언급된 프로토콜과의 차이는 당해 비드를 미소적정 플레이트(Greiner Bioone)에서 커플링시키고, 플레이트를 자석(LifeSept, Dexter)에 위치시켜 비드를 세척하는 것이다. 최종적으로 76-플렉스 비드 혼합물이 용액내에 만들어졌다.
혈청 및 혈장 표지화 및 분석 공정
먼저, 샘플(혈장 또는 혈청)을 RT에서 해동시키고, 10분 동안 10,000 rpm으로 원심분리했다. 각 샘플 30 ㎕를 미소적정 플레이트(Abgene)으로 옮긴 다음, 플레이트를 밀봉하고, 와동(vortex)시키고, 원심분리했다(3,000 rpm에서 1분). 이어서, 각 샘플 3㎕를 새로운 미소적정 플레이트로 옮기고, 액체 조정기(Plate mate 2×2, Matrix)를 사용하여 각 샘플에 22 ㎕ 1× PBS를 첨가한 다음, 플레이트를 밀봉하고, 와동시키고, 원심분리했다(3,000 rpm에서 1분). 이어서, 비오티노일-테트라옥사펜타데칸산의 N-하이드록시석신이미딜 에스테르(NHS-PEO4-비오틴, Pierce)를 10배 몰 과량으로 첨가하여 전체 1/10 샘플 희석물을 수득한 다음, 미소적정 플레이트 진탕기(Thermomixer, Eppendorf)에서 2시간에 걸쳐 4℃에서 항온처리했다. 반응은 비오틴에 대해 250배 몰 과량의 트리스-HCl(pH 8.0)을 첨가하여 중단시키고, 추가로 20분 동안 4℃에서 항온처리했다. 이어서, 샘플을 즉시 사용하거나 -80℃에서 저장했다.
모든 샘플은 비혼입된 비오틴을 제거하지 않고서 사용했고 1/50으로 희석했다. 즉, 0.5 mg/ml 비특이적 래빗 IgG(Bethyl)이 보충된 PBS(PVXC)중의 0.1 %(w/v) 카세인 중의 0.5 %(w/v) 폴리비닐알콜 및 0.8 %(w/v) 폴리비닐피롤리돈(Sigma)으로 구성된 49 ㎕ 분석 완충제 및 1 ㎕ 샘플이다. 대조군으로서, 비특이적 래빗 IgG(Jackson ImmunoResearch) 및 HSA 결합 애피바디(애피바디 AB)를 포함시켰다. 이어서, 플레이트를 72℃에서 15분 동안 열 처리한 다음, 써모 사이클러(DNA Engine Tetrad cycler, PTC225, BioRad)에서 15분 동안 23℃에서 항온처리했다. 이어서, 플레이트를 원심분리하고(3,000 rpm에서 1분), 45 ㎕의 각 샘플을 5 ㎕의 비드 혼합물에 첨가했다. 항온처리는 밤새 진탕기에서 23℃로 수행하고, 이어서 비드를 웰에서 3×50 ㎕ PBST(1×PBS pH 7.4, 0.1% Tween 20)로 세척했다.
자기 비드로 수행된 제1 및 제2 방법에 있어서, 미소적정 플레이트(Greiner Bioone)는 플레이트 세척을 위해 자기 비드 침전과 함께 사용했다. 언급된 전립선암 방법에서는 필터 하부 미소적정 플레이트(Millipore)를 사용하고, 비드의 세척에는 진공 장치(Millipore)를 사용했다.
세척 후, PBS 중에 0.1% 파라포름알데히드를 함유하는 50 ㎕의 정지 용액과 함께 10분 동안 항온처리했다. 이어서, 1×50 ㎕의 PBST 및 PBST 중의 0.5 ㎍/ml R-피코에리트린 표지된 스트렙트아비딘(Invitrogen) 50 ㎕를 비드-혼합물에 첨가하고, 진탕기에서 20분 동안 23℃로 항온처리했다. 마지막으로, 웰을 3×50 ㎕ PBST에서 세척하고, 100 ㎕ PBST에서 측정했다.
판독 및 데이타 분석
측정은 각각의 단일 특이적 분석을 위해 색 코드 ID당 100번을 계수하는 루미넥스(Luminex) IS 2.3 소프트웨어를 사용하여 루미넥스 LX200 장치로 수행했다. 각 항체에 대한 커플링 효율은 R-피코에리트린 표지된 항-래빗 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch)를 통해 측정했다. 항체-단백질 상호작용을 나타내기 위해, 중간 형광 강도(MFI)를 선택했다. 데이타 분석 및 그래프 표시는 마이크로소프트 오피스 엑셀 2003 또는 R, 통계학적 컴퓨팅 및 그래픽용 언어 및 환경을 사용하여 수행했다[참조: Ihaka, R et al. (1996) J. Comput. Graph. Stat. 5, 299-3214].
결과
a) 제1 방법
하나의 정상 환자로부터의 혈청 및 혈장 샘플은 EU 프로젝트 MolPAGE를 통해 수득했다.
연구된 항체를 선택하여 공지된 혈청 단백질과 같은 상이한 부류의 단백질을 표적화했다. 전체로서, 135개의 단일특이성 항체(msAbs)가 유전자를 코딩하는 독특한 93개 단백질의 생성물을 표적화하는 본 연구에서 포함되었다. 단일특이성 항체는 HPA 프로젝트(www.proteinatlas.org)로부터 수득했다. 대조군으로서, 비특이적 래빗 IgG(Jackson ImmunoResearch) 및 HSA 결합 애피바디(애피바디 AB)가 포함되었다. 모든 혈청 및 혈장 샘플은 3중으로 분석했다. 이와 함께, 온도당 1회 시간 간격을 혈장 및 혈청 둘 다에 대해 조사했다. 샘플을 희석하고, 표지하고, 이에 따라 분석 완충제에서 제조했다. 이어서, 처리는 23℃, 37℃, 45℃ 및 56℃에서 30분 뿐만 아니라, 72℃에서 15분 및 96℃에서 5분을 포함했다. 모든 샘플은 각각의 열 처리 간격 후에 23℃로 냉각시킨 다음, 비드 혼합물과 배합했다.
면역검출능을 최적화하기 위해, 샘플을 비오티닐화에 이어서 소정 온도 범위에서 열 처리했다. 당해 시험에 포함된 온도는 23℃, 37℃, 45℃, 56℃, 72℃ 및 96℃이었다. 도 1에는, 적어도 2배 시그날 강도 증가를 나타내는 단백질의 수가 열 처리 온도에 대해 플롯팅되어 있다. 72℃는 시그날이 증가된 최고 단백질 수를 생성했다. 56℃는 또한 시그날이 증가된 상당한 단백질 수를 생성했지만, 당해 결과는 특히 혈청 샘플에서 72℃보다 우수하지 않았다. 96℃는 단지 시그날이 증가된 소수의 단백질을 생성했다.
도 2에는, 가열의 네가티브 효과가 열 처리 온도에 대해 적어도 2배의 시그날 강도 감소를 나타내는 단백질 수의 플롯에 의해 제시되어 있다. 여기서, 96℃는 특히 혈청 샘플에서 시그날이 감소된 비교적 높은 단백질 수를 생성하는 것으로 나타났다. 96℃에서, 시그날이 감소된 단백질 수는 사실 혈청 샘플 및 혈장 샘플 둘 다에서 시그날이 증가된 단백질 수보다 더욱 높았다. 56℃에서 72℃로 온도를 상승시키면, 시그날이 감소된 단백질 수는 혈청에서는 증가했지만 혈장에서는 감소했다.
37℃ 및 45℃로 가열하면 시그날 강도(signal intensity)에 대해 거의 영향이 없거나 약간 영향이 있는 것으로 나타났다.
b) 제2 방법
하나의 정상 환자로부터 혈청 및 혈장 샘플을 EU 프로젝트 MolPAGE를 통해 수득했다.
공지된 혈청 단백질과 같은 상이한 부류의 단백질을 표적하는 연구된 항체를 선택했다. 전체로서, 135개의 단일특이성 항체(msAbs)가 유전자를 코딩하는 독특한 93개 단백질의 생성물을 표적화하는 본 연구에서 포함되었다. 단일특이성 항체는 HPA 프로젝트(www.proteinatlas.org)로부터 수득했다. 대조군으로서, 비특이적 래빗 IgG(Jackson ImmunoResearch) 및 HSA 결합 애피바디(애피바디 AB)가 포함되었다. 이와 함께, 2개 온도당 4회 시간 간격을 혈장 및 혈청 둘 다에 대해 조사했다. 샘플을 희석하고, 표지하고, 이에 따라 분석 완충제에서 제조했다. 이어서, 23℃에서 30분과 비교하여 5, 10, 15 및 30분의 간격을 56℃ 및 72℃ 둘 다에 대해 선택했다. 모든 샘플을 각각의 열 처리 간격 후에 23℃로 냉각시킨 다음, 비드 혼합물과 배합했다. 23℃에서 30분, 56℃에서 30분 및 72℃에서 15분 처리에 대해 샘플을 삼중으로 분석했다.
도 3에는, 적어도 2배의 시그날 강도 증가를 나타내는 단백질 수가 제1 방법에서와 같이 열 처리 온도에 대해 플롯팅되어 있다. 다시, 72℃는 혈청 및 혈장 둘 다에서 시그날이 증가된 최고 단백질 수를 생성했다. 56℃는 혈장에서 시그날이 증가된 상당한 단백질 수를 생성했지만, 그 결과는 72℃만큼 양호하지 않았다.
도 4에는, 제2 방법의 가열의 네가티브 효과가 열 처리 온도에 대해 적어도 2배 시그날 강도 감소를 나타내는 단백질 수의 플롯에 의해 제시되어 있다. 온도를 56℃에서 72℃로 상승시키면, 시그날이 감소된 단백질 수는 혈청 및 혈장 둘 다에 있어서 보다 작았다. 이는, 단백질은 일반적으로 열 유도된 응고와 함께 침전에 더욱 민감하다고 생각되었기 때문에 놀라운 것이다.
도 5는 23℃, 56℃ 및 72℃에서 열 처리 후에 혈청에서 표적화된 92개 단백질 중의 6개의 검출 수준을 나타낸다. 도 6은 혈장에서 달성된 상응하는 결과를 나타낸다. 당해 데이타는 비표준 중간 형광 강도 수준을 사용하여 박스 플롯에 요약되어 있다. 각 표적 단백질로부터의 시그날 강도는 각각 30분 동안 23℃에서 처리, 30분 동안 56℃로 가열 및 15분 동안 72℃로 가열 후에 직접 비교했다. 단백질 일부의 시그날 강도는 가열 후에 감소했던 반면, 몇몇 다른 단백질의 시그날 강도는 증가했다. 그러나, 시그날은 도면의 모든 단백질에 있어서 56℃ 처리 후보다 72℃ 처리 후에 더욱 높은 것이 주목할 만하다. 사실, 제2 연구에서 검출된 모든 단백질 중에서, 시그날은 하나의 단일 단백질에 있어서 온도를 56℃에서 72℃로 상승시킬 때에 유일하게 감소했다.
결론적으로, 약 50℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도로 가열시키는 것은 면역학적 검출을 사용하는 경우에 혈액 또는 혈액 유도된 샘플에서 단백질 분석에 유익한 효과를 갖는 것으로 나타난다. 72℃ 주위의 온도 범위, 예를 들면 64 내지 85℃, 66 내지 78℃ 또는 70 내지 74℃가 특히 유리한 것으로 나타난다.
c) 전립선암 집단
혈장 샘플은 룬드 및 말모 대학 병원(Lund and Malmo University Hospitals, Sweden)의 병리학부로부터 수득했다. 전립선 특이적 항원(PSA)의 수준에 대해 통상의 시험을 받은 남성 환자로부터, PSA 수준이 정상인 20개 샘플 및 PSA 수준이 높은 20개 샘플을 수집했다. 후자 그룹은 전립선암에 대한 지표로서 사용되는 60 내지 3,000 ng/ml의 PSA 수준을 갖고, 따라서 이 그룹을 암 그룹으로서 지칭했다. 정상 그룹은 PSA 수준이 1.5 ng/ml 미만이었다. 언급된 PSA 수준을 벗어난 어떠한 환자 정보도 이용할 수 없었고, 윤리적 요건에 일치하도록 익명의 샘플을 수득했다.
연구된 항체는 임의의 사전 질병 특혜 없이 및 HPA 프로젝트(www.proteinatlas.org) 내에서 사용된 정당한 절차에서 이들의 실시에 기인해서만 선택되었다. 전체로서, 96개 단일특이성 항체(msAbs)가 95개의 상이한 혈청 단백질을 표적화하는 본 연구에 포함되었다. 또한, 3개의 항-PSA 항체(HPX 항체)는 로슈(Roche, Basel) 및 하이테스트(HyTest, Finland)로부터 수득했고, 포지티브 대조군으로서 포함되었다. 모든 혈장 샘플은 랜덤화 설계로 분석했고, 수득된 강도 값은 log2-변환, 적분 정규화 및 확률적 지수(quotient) 정규화를 통해 처리했다.
정상 샘플과 암 샘플 사이의 유의적으로 상이한 검출을 나타내는 단백질은, 도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, 스튜던트 t-시험에 의해 및 볼케이노 플롯에 의해 가시화되는 상대적 폴드 변화와 관련하여 확인했다. 플롯은 정규화 형광 강도 비(x-축) 및 상응하는 펄스 발견율 보정된 P-값(y-축)을 나타내고, 이는 특정한 단백질이 상이하게 검출되는지의 유의성을 반영한다. 각 표적의 P-값이 작을수록, 단백질이 상이하게 존재할 가능성은 더욱 높다. 플롯 내부의 수평선은 각각 0.05 및 0.01의 통상 사용된 P-값을 나타낸다.
도 7에서, 샘플은 재료 및 방법 부분에서 기재된 바와 같이 72℃에서 열 처리했다. 3개의 HPX 항체는 정상 환자(낮은 PSA 수준)와 비교하여 암 그룹(높은 PSA 수준)에서 유의적으로 높은 수준으로 PSA를 검출하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 2개의 새로운 마커 단백질, 즉 HPA0464(p<0.01) 및 HPA0481(p<0.05)는 암 그룹에서 하향 조절되는 것으로 나타났고, 72℃에서 가열 후에 유일하게 발견되었다. 도 8에서, 열 처리하지 않은 샘플 및 이들 환자의 경우, 항-PSA 항체에 대한 전체 유의성이 감소되었다. 여기서, 전립선암으로 진단될 위험이 상승된 환자에서 HPA0006의 표적 수준이 높고 HPA0058의 표적 수준이 낮은 2개의 새로운 단백질이 발견되었다. 결과적으로, 몇몇 단백질의 면역검출능은 가열에 의해 증가했던 반면, 몇몇 다른 단백질의 면역검출능은 무가열 후에도 우수하였다.
결론적으로, 2개의 단백질(HPA0464 및 HPA0481)은 건강한 피검체의 열 처리된 샘플보다 전립선암을 갖는 피검체의 열 처리된 샘플에서 낮은 정도로 검출되었다(도 7). 그러나, 이러한 차이는 열처리되지 않은 샘플에서 발견되지 않는다(도 8). 결과적으로, 열 처리는 이러한 종류의 분석에서 전립선암에 대한 바이오마커로서 2개 단백질을 동정하는데 필요한 것으로 보인다.
Claims (13)
- 혈액, 혈청 또는 혈장의 임의로 희석된 샘플에서 적어도 하나의 단백질의 면역검출능을 개선시키는 방법이며, 상기 샘플과, 적어도 하나의 단백질의 검출 및/또는 정량화를 위한 적어도 하나의 친화성 리간드를 접촉시키기 전에 상기 샘플을 64 내지 85℃의 온도로 가열하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플이 66 내지 78℃, 예를 들면 70 내지 74℃, 예를 들면 약 72℃의 온도로 가열되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가열이 샘플과 적어도 4개, 예를 들면 적어도 10개, 예를 들면 적어도 30개, 예를 들면 적어도 50개의 상이한 친화성 리간드를 접촉시키기 전에 수행되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 온도가 0.5 내지 45분, 예를 들면 1 내지 30분, 예를 들면 1 내지 29분, 예를 들면 5 내지 20분 동안 유지되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플의 단백질이, 가열 전에, 샘플과 적어도 하나의 친화성 리간드를 접촉시킨 후의 검출 단계에서 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 표지로 표지되는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 표지가 비오틴을 함유하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 가열 전에 10 내지 10000배, 예를 들면 100 내지 2500배 희석되는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 샘플이 래빗 IgG 및/또는 카제인을 포함하는 완충제로 희석되는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 완충제 내의 래빗 IgG의 농도가 0.05 내지 5 mg/ml, 예를 들면 0.1 내지 2 mg/ml이고, 완충제 내의 카제인의 농도가 0.01 내지 1 %(w/v), 예를 들면 0.05 내지 2 %(w/v)인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 친화성 리간드가 적어도 하나의 항체인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 친화성 리간드가 확인가능한 잔기, 예를 들면 확인가능한 비드에 커플링되어 있는 방법.
- 피검체의 혈액, 혈청 또는 혈장에서 단백질을 검출 및/또는 정량화하는 방법이며,
a) 피검체로부터 혈액, 혈청 또는 혈장의 임의로 희석된 제1 및 제2 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 제1 샘플을 50 내지 85℃의 온도로 가열시키는 단계;
c) 상기 제1 샘플을, 단계 b)의 가열 후에, 면역검출능이 가열에 의해 증가된 표적 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시키는 단계;
d) 가열처리하지 않은 제2 샘플을, 면역검출능이 가열에 의해 증가되지 않은 표적 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시키는 단계; 및
e) 단계 c) 및 d)에서 형성된 항체 및 상응하는 표적 단백질 사이의 상호작용을 검출하여 혈액, 혈청 또는 혈장에서 단백질을 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함하는 방법. - 의학적 상태의 바이오마커를 동정하는 방법이며,
a) 의학적 상태를 갖는 제1 피검체 그룹 및 의학적 상태를 갖지 않는 제2 피검체 그룹으로부터 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플을 제공하는 단계,
b) 상기 샘플을, 임의로 희석 후에, 50 내지 85℃의 온도로 가열시키는 단계,
c) 상기 샘플을, 가열 후에, 적어도 하나의 단백질과 선택적 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 친화성 리간드와 접촉시켜 각각의 그룹 중의 적어도 하나의 단백질 레벨을 측정하는 단계, 및
d) 상기 레벨을 비교하여, 제2 그룹의 샘플보다 제1 그룹의 샘플에서 높거나 낮은 레벨로 발생하는 단백질을 동정하고, 이에 의해 의학적 상태의 바이오마커를 동정하는 단계를 포함하는 방법.
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