TW202317992A - 用於分析信號放大之方法、組合物及套組 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於用於分析信號放大之方法、組合物、套組及分析系統。本文亦提供信號放大試劑，其中該信號放大試劑為抗體或其抗原結合片段。
Description
本發明係關於用於分析信號放大之方法、組合物及套組。本文亦提供信號放大試劑，其中該信號放大試劑為抗體或其抗原結合片段。
例如夾心免疫分析之免疫分析常用於偵測樣本中之分析物。典型免疫分析常常不夠靈敏而無法準確地偵測樣本中之低豐度分析物，或分析儀器自身在偵測低信號位準方面受到限制。用於提高分析靈敏度之方法常常涉及複雜最佳化程序，該等程序可為時間密集型及勞力密集型製程。此外，經最佳化分析可能需要更長的運作時間及/或複雜的分析方法。
在實施例中，本發明提供偵測樣本中之所關注分析物之方法，其包括：
（a）使包括（A）第一可偵測標記及（B）所關注分析物之第一複合物與以下接觸，其中第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記：（I）特異性結合至第一可偵測標記且包括結合部分之信號放大試劑，及（II）包括（1）結合部分之結合搭配物及（2）第二可偵測標記中之一或多者的可偵測部分；及（b）量測（I）第二可偵測標記或（II）第一可偵測標記及第二可偵測標記，藉此偵測所關注分析物；
或
（c）使包括（A）第一可偵測標記及（B）所關注分析物之第一複合物與以下接觸，其中第一可偵測標記為ECL標記：（I）特異性結合至第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑，及（II）酶之受質；及（d）量測酶活性，藉此偵測所關注分析物；
或
（e）使包括（A）第一可偵測標記及（B）所關注分析物之第一複合物與特異性結合至第一可偵測標記且視情況包括第二可偵測標記之信號放大試劑接觸，其中第一可偵測標記為ECL標記；及（f）量測（I）第一可偵測標記；（II）第二可偵測標記；或（III）第一可偵測標記及第二可偵測標記，藉此偵測所關注分析物；
或
（g）使包括（A）第一可偵測標記及（B）所關注分析物之第一複合物與特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，其中第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記，其中信號放大試劑包括信號放大（SA）核酸探針，藉此形成包括第一複合物及信號放大試劑之第二複合物；（h）延伸核酸探針以形成延伸序列；及（i）量測延伸序列之量，藉此偵測所關注分析物。在實施例中，第一複合物處於表面上。
在實施例中，信號放大試劑包括核酸探針，且表面包括固定在其上之錨定試劑。在實施例中，信號放大試劑包括核酸探針，且該方法進一步包括使錨定試劑固定在表面上。在實施例中，在該方法之步驟（h）之前或期間使錨定試劑固定在表面上。在實施例中，錨定試劑結合至延伸序列之錨定區，且量測包括量測經由錨定試劑結合至表面之延伸序列之量。
在實施例中，本發明提供用於偵測樣本中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或區室中包括：（a）特異性結合至分析物之捕捉試劑；（b）特異性結合至分析物之偵測試劑，其中偵測試劑包括第一可偵測標記，其中第一可偵測標記為ECL標記；及（c）特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑。在實施例中，套組進一步包括表面。
在實施例中，本發明提供偵測樣本中之所關注分析物之方法，其包括（a）在表面上形成包括所關注分析物、特異性結合至分析物之捕捉試劑及特異性結合至分析物且包括第一核酸探針之偵測試劑的第一複合物，其中捕捉試劑固定在表面上或其中捕捉試劑能夠固定至表面；（b）延伸第一核酸探針以形成包括第一錨定區之第一延伸序列，其中第一錨定區結合固定在表面上之第一錨定試劑；（c）使第一延伸序列結合至包括第一可偵測標記之第一經標記探針，其中第一可偵測標記為ECL標記；及：
（d）使結合至第一延伸序列之第一經標記探針與以下接觸：（I）特異性結合至第一可偵測標記且包括結合部分之信號放大試劑，及（II）包括（1）結合部分之結合搭配物及（2）第二可偵測標記中之一或多者的可偵測部分；及（e）量測表面上之（I）第二可偵測標記或（II）第一可偵測標記及第二可偵測標記，藉此偵測所關注分析物；
或
（f）使結合至第一延伸序列之第一經標記探針與以下接觸：（I）特異性結合至第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑，及（II）酶之受質；及（g）量測酶活性，藉此偵測所關注分析物；
或
（h）使結合至第一延伸序列之第一經標記探針與特異性結合至第一可偵測標記且視情況包括第二可偵測標記之信號放大試劑接觸；及（i）量測（I）第一可偵測標記；（II）第二可偵測標記；或（III）第一可偵測標記及第二可偵測標記，藉此偵測所關注分析物；
或
（j）使結合至第一延伸序列之第一經標記探針與特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，其中信號放大試劑包括第二核酸探針，藉此形成包括信號放大試劑及第一經標記探針之第二複合物；（k）延伸第二核酸探針以形成包括第二錨定區之第二延伸序列，其中第二錨定區結合固定在表面上之第二錨定試劑；及；（l）量測結合至表面之（I）第二延伸序列或（II）第一延伸序列及第二延伸序列之量，藉此偵測所關注分析物。
在實施例中，本發明提供用於偵測樣本中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或區室中包括：（a）特異性結合至分析物之捕捉試劑；（b）特異性結合至分析物之偵測試劑，其中偵測試劑包括第一核酸探針；（c）包括第一可偵測標記之第一經標記探針，其中第一可偵測標記為ECL標記；及（d）特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑。在實施例中，套組進一步包括表面。
在實施例中，本發明提供包括對ECL標記具有特異性之抗原結合域的抗體或其抗原結合片段。
在實施例中，本發明提供包括對ECL標記及結合連接子具有特異性之抗原結合域的抗體或其抗原結合片段。
在實施例中，本發明提供包括以下之組合物：（a）本文所提供之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括核酸探針；及（b）能夠結合至核酸探針之模板寡核苷酸。在實施例中，本發明提供包括本文所提供之抗體或抗原結合片段之套組，其中該抗體或其抗原結合片段包括核酸探針。在實施例中，套組進一步包括（i）能夠結合至核酸探針之模板寡核苷酸及（ii）包括可偵測標記之經標記探針，其中可偵測標記為ECL標記。在實施例中，模板寡核苷酸為環狀寡核苷酸模板。在實施例中，套組進一步包括（iii）錨定試劑。在實施例中，套組進一步包括核酸擴增酶（例如聚合酶）、表面、捕捉試劑及/或偵測試劑。
在實施例中，本發明提供包括以下之組合物：（a）本文所提供之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括酶；及（b）酶之受質。在實施例中，本發明提供包括本文所提供之抗體或抗原結合片段之套組，其中該抗體或其抗原結合片段包括酶。
在實施例中，本發明提供包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段之組合物，其中該抗體或其抗原結合片段包括可偵測標記。在實施例中，本發明提供包括本文所提供之抗體或抗原結合片段之套組，其中該抗體或其抗原結合片段包括可偵測標記。
在實施例中，本發明提供包括以下之組合物：（a）本文所提供之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括結合部分；及（b）包括（i）結合部分之結合搭配物及（ii）一或多個可偵測標記的可偵測部分。在實施例中，本發明提供包括本文所提供之抗體或抗原結合片段之套組，其中該抗體或其抗原結合片段包括結合部分。
在實施例中，本發明提供分析系統，其包括：至少一個記憶體單元；根據至少一個記憶體單元上之指令經程式化之至少一個處理單元；及經組態以受至少一個處理單元控制之至少一個分析系統組件，其中至少一個處理單元經組態以：控制至少一個分析系統組件以執行以下中之一或兩者：樣本中之較高豐度分析物之第一次量測；及樣本中之較低豐度分析物之第二次量測，其中樣本中存在比較低豐度分析物多大致10至100000倍之較高豐度分析物，其中使用包括ECL標記之偵測試劑偵測較高豐度分析物，且其中使用（i）包括ECL標記之偵測試劑及（ii）特異性結合至ECL標記之信號放大試劑偵測較低豐度分析物。
在實施例中，本發明提供一或多種非暫時性電腦可讀媒體，其上儲存有指令，該等指令在由至少一個處理單元執行時使至少一個處理單元：經由控制分析系統來執行以下中之一或兩者：樣本中之較高豐度分析物之第一次量測；及樣本中之較低豐度分析物之第二次量測，其中樣本中存在比較低豐度分析物多大致10至100000倍之較高豐度分析物，其中使用包括ECL標記之偵測試劑偵測較高豐度分析物，且其中使用（i）包括ECL標記之偵測試劑及（ii）特異性結合至ECL標記之信號放大試劑偵測較低豐度分析物。
在實施例中，本發明提供分析系統，其包括：至少一個記憶體單元；根據至少一個記憶體單元上之指令經程式化之至少一個處理單元；及經組態以受至少一個處理單元控制之至少一個分析系統組件，其中至少一個處理單元經組態以：控制至少一個分析系統組件以執行樣本中之分析物之量測，其中分析物能夠在以在0.0001 pg/mL至100000 pg/mL內之濃度存在時使用包括ECL標記之單一偵測試劑在樣本中被偵測到。
除非本文另外定義，否則本揭示案中使用之科學及技術術語應具有本領域中一般熟習此項技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包含複數且複數術語應包含單數。冠詞「一(a/an)」在本文中用於指該冠詞之文法對象中之一個或超過一個（亦即，至少一個）。舉例而言，「一元件」意謂一個元件或超過一個元件。
儘管本揭示案支援僅指替代方案及「及/或」之定義，但除非明確地指示為僅指替代方案或替代方案相互排斥，否則術語「或」之使用在申請專利範圍中用於意謂「及/或」。
如本文所使用之術語「包括（comprising）」（及諸如「包括（comprise/comprises）」之包括（comprising）之任何變型或形式）、「具有（having）」（及諸如「具有（have/has）」之具有（having）之任何變型或形式）、「包含（including）」（及諸如「包含（includes/include）」之包含（including）之任何變型或形式）或「含有（containing）」（及諸如「含有（contains/contain）」之含有（containing）之任何變型或形式）為包含性的或開放的且不排除額外未列出之元件或方法步驟。
術語「例如（for example）」及其對應縮寫「例如（e.g.）」（無論是否斜體）之使用意謂所敍述之特定術語為本揭示案之代表性實例及實施例，除非另外明確陳述，否則該等代表性實例及實施例不意欲受限於所提及或引用之特定實例。
如本文所使用之「在……之間（between）」為包含範圍端值之範圍。舉例而言，x與y之間的數值明確包含數值x及y以及落入x及y內之任何數值。
本發明提供優於本領域中所描述之分析方法的若干優點。舉例而言，本發明提供用於在分析中增大可偵測信號，使得能夠使用更低的成本及/或更低複雜度的儀器來量測可偵測標記之簡單且便利的方法。舉例而言，此信號增大亦可提供用於藉由放大可偵測信號來改善分析靈敏度之簡單且便利的方法。在實施例中，本文方法改善信號雜訊比且使得能夠更準確地偵測例如樣本中之低豐度物種。
在實施例中，本文方法利用特異性結合至例如ECL標記之可偵測標記的信號放大試劑，該信號放大試劑可能已用於市售免疫分析中。當前市售免疫分析可能需要不同偵測試劑用於相同分析物，此視樣本中之分析物濃度而定。舉例而言，當分析物濃度相對高（例如大於或約1 pg/mL）時，可使用包括可偵測標記之偵測試劑，而當分析物濃度相對低（例如小於約1 pg/mL）時，可使用包括核酸探針之偵測試劑。當前商業免疫分析亦可能需要不同分析格式及/或需要在量測以不同濃度存在於樣本中之多種分析物時稀釋或濃縮樣本。在實施例中，當分析物濃度低時，本發明方法使用信號放大試劑來放大分析信號，藉此消除對使用多種類型之偵測試劑之要求，執行呈用於不同分析物濃度之不同格式的分析，及/或濃縮或稀釋樣本以量測樣本中之不同分析物。在實施例中，對於與信號放大試劑結合之各第一可偵測標記，信號放大試劑提供及/或募集多個第二可偵測標記，藉此放大分析信號。在實施例中，信號放大試劑能夠偵測以低濃度（例如小於1 pg/mL）存在於樣本中之分析物，藉此允許在樣本供應受到限制時（例如大腦脊髓液樣本、嬰兒生物樣本及/或諸如小鼠之小型動物生物樣本）稀釋樣本，因此保存有價值的樣本。
在實施例中，信號放大試劑包括例如（多個）ECL標記之一或多個可偵測標記；或信號放大試劑包括或形成例如本文所描述之結合部分的部分，該部分募集例如（多個）ECL標記之一或多個可偵測標記的結合。因此，在實施例中，本文所描述之信號放大試劑（1）特異性辨識且結合第一可偵測標記（例如在如本文所描述之偵測試劑上）及（2）能夠募集一或多個第二可偵測標記以放大分析信號。出乎意料地發現，信號放大試劑提供意外地高位準信號放大，即使在其中第一可偵測標記及第二可偵測標記為相同標記之實施例中。在該等情形下，預期當信號放大試劑對第一可偵測標記及第二可偵測標記兩者具有相同親和力時，第二可偵測標記與第一可偵測標記競爭用於信號放大試劑，亦即，結合至第二可偵測標記之信號放大試劑將不結合第一可偵測標記。預期信號放大試劑與第二可偵測標記之結合阻止了第二可偵測標記被偵測到，且亦阻止了信號放大試劑成為表面上之複合物之一部分，藉此導致信號漏失。因此，高位準信號放大係出人意料的，尤其在其中第一可偵測標記及第二可偵測標記為相同標記之實施例中。
該方法之一實施例繪示於圖1A-1D中。在圖1A中，包括捕捉試劑、分析物及具有多個第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。經由使捕捉試劑上之靶向劑補體結合至表面上之靶向劑來使捕捉試劑固定至表面。將包括核酸探針之信號放大試劑添加至第一複合物中，藉此形成包括捕捉試劑、分析物、偵測試劑及信號放大試劑之第二複合物，如圖1B中所示。在實施例中，偵測試劑包括多個第一可偵測標記，藉此允許多種信號放大試劑結合至相同偵測試劑，如圖1A、1C及1D中所示。在實施例中，由結合至偵測試劑之各信號放大試劑形成延伸序列，如圖1B及1C中所示。在實施例中，各自包括核酸探針之兩種信號放大試劑結合至偵測試劑上之兩個第一可偵測標記。在實施例中，兩個模板寡核苷酸與兩個核酸探針雜交，例如其中各模板寡核苷酸與兩個核酸探針雜交，如圖1D中所示。在實施例中，兩個模板寡核苷酸例如經由接合而形成環狀模板，且該等核酸探針中之一或兩者經延伸以形成延伸序列。在實施例中，延伸序列結合至表面上之錨定試劑。在實施例中，在第一複合物形成之前、期間或之後，錨定試劑固定至表面。在實施例中，各延伸序列結合至多個經標記探針（例如如圖1C中所示），該多個經標記探針中之各者包含多個第二可偵測標記。因此，在實施例中，各第一可偵測標記對應於多個第二可偵測標記，藉此放大信號以用於量測。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。
該方法之另一實施例繪示於圖2中。在圖2中，包括捕捉試劑、分析物及具有多個第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。將（1）包括結合部分之信號放大試劑及（2）包括多個第二可偵測標記之可偵測部分兩者均添加至第一複合物中。在實施例中，信號放大試劑及可偵測部分同時與第一複合物接觸。在實施例中，信號放大試劑及可偵測部分依序與第一複合物接觸。在實施例中，偵測試劑包括多個第一可偵測標記，藉此允許多種信號放大試劑結合至相同偵測試劑。因此，如圖2中所示，在實施例中，偵測試劑上之各第一可偵測標記對應於可偵測部分上之多個第二可偵測標記，藉此放大信號以用於量測。本文進一步描述該方法之組分。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。
該方法之另一實施例繪示於圖3中。在圖3中，包括捕捉試劑、分析物及具有多個第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。經由使捕捉試劑上之靶向劑補體結合至表面上之靶向劑來使捕捉試劑固定至表面。將（1）包括寡核苷酸結合部分之信號放大試劑及（2）包括多個第二可偵測標記之寡核苷酸可偵測部分兩者均添加至第一複合物中。在實施例中，信號放大試劑及可偵測部分同時與第一複合物接觸。在實施例中，信號放大試劑及可偵測部分依序與第一複合物接觸。在實施例中，偵測試劑包括多個第一可偵測標記，藉此允許多種信號放大試劑結合至相同偵測試劑。在實施例中，寡核苷酸可偵測部分結合至寡核苷酸結合部分。因此，如圖3中所示，在實施例中，偵測試劑上之各第一可偵測標記對應於可偵測部分上之多個第二可偵測標記，藉此放大信號以用於量測。本文進一步描述該方法之組分。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。
該方法之另一實施例繪示於圖4中。在圖4中，包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑之第一複合物形成於表面上。複數種信號放大試劑與可偵測部分混合，其中各可偵測部分包括多個第二可偵測標記，且其中各可偵測部分能夠結合至多個結合部分，藉此形成包括複數種信號放大試劑及可偵測部分之信號放大複合物。在實施例中，第一複合物與信號放大複合物同時或實質上同時形成。在實施例中，第一複合物與信號放大複合物依序形成。在實施例中，第一複合物形成於表面上，且信號放大複合物形成於單獨容器或單獨反應罐中。隨後，將信號放大複合物添加至第一複合物中。在實施例中，偵測試劑包括多個第一可偵測標記，藉此允許信號放大複合物之多種信號放大試劑結合至各偵測試劑。因此，如圖4中所示，偵測試劑上之各第一可偵測標記對應於可偵測部分上之多個第二可偵測標記，藉此放大信號以用於量測。本文進一步描述該方法之組分。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。
該方法之另一實施例包括在表面上形成第一複合物，第一複合物包括捕捉試劑、分析物及包括第一核酸探針之偵測試劑。第一核酸探針經延伸以形成第一延伸序列。在實施例中，藉由滾環擴增使第一核酸探針延伸。各自包括第一可偵測標記之複數個第一經標記探針結合至第一延伸序列。（1）包括結合部分之信號放大試劑及（2）包括多個第二可偵測標記之可偵測部分中之一或多者與第一複合物接觸。在實施例中，信號放大試劑及可偵測部分同時與第一複合物接觸。在實施例中，信號放大試劑及可偵測部分依序與第一複合物接觸。在實施例中，結合至第一延伸序列之各第一經標記探針結合至信號放大試劑。因此，各第一可偵測標記對應於可偵測部分上之多個第二可偵測標記，藉此放大信號以用於量測。本文進一步描述該方法之組分。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。
該方法之另一實施例繪示於圖15中。在圖15中，包括捕捉試劑、分析物及包括第一核酸探針之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。第一核酸探針經延伸以形成第一延伸序列。在實施例中，藉由滾環擴增使第一核酸探針延伸。各自包括第一可偵測標記之複數個第一經標記探針結合至第一延伸序列。各自包括第二核酸探針之多種信號放大試劑結合至第一可偵測標記。該等第二核酸探針中之各者經延伸以形成第二延伸序列。在實施例中，藉由滾環擴增使第二核酸探針延伸。各自包括第二可偵測標記之一或多個第二經標記探針結合至第二延伸序列。因此，如圖15中所示，各第一可偵測標記對應於第二延伸序列，該第二延伸序列可結合至包括第二可偵測標記之多個第二經標記探針，藉此放大信號以用於量測。本文進一步描述該方法之組分。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。
該方法之另一實施例繪示於圖17中。在圖17中，包括捕捉試劑、分析物及包括第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。將（1）包括酶之信號放大試劑及（2）酶之受質兩者均添加至第一複合物中。在實施例中，信號放大試劑及酶受質同時與第一複合物接觸。在實施例中，信號放大試劑及酶受質依序與第一複合物接觸。在實施例中，酶作用於受質以產生可偵測信號。在實施例中，該方法包括偵測可偵測信號。本文進一步描述該方法之組分。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。
該方法之另一實施例繪示於圖22A-22D中。在圖22A-22D中之各者中，複合物包括捕捉試劑（「CR」）、分析物、包括第一可偵測標記（「第1標記」）之第一偵測試劑（「第1 DR」）及包括第一可偵測標記之第二偵測試劑（「第2 DR」）、同時結合至第一偵測試劑上之第一可偵測標記及第二偵測試劑上之第一可偵測標記的信號放大試劑（「SAR」）。在實施例中，信號放大試劑與兩個第一可偵測標記之結合使第一偵測試劑及第二偵測試劑與分析物之結合穩定。在實施例中，信號放大試劑充當兩種偵測試劑之間的繫栓且維持兩種偵測試劑與分析物之結合。舉例而言，若兩種偵測試劑中之一者與分析物解離、但保持與信號放大試劑結合，則將經解離之偵測試劑維持在分析物附近以便於再結合。因此，信號放大試劑藉由使複合物穩定來放大分析信號以用於偵測。
在圖22A中，描繪了無任何其他組分之信號放大試劑。如圖22A中所標記之組分與圖22B-22D相同。在圖22B中，信號放大試劑包括結合至可偵測部分之結合部分，該可偵測部分包括結合部分之結合搭配物及如本文所描述之第二可偵測標記。在圖22C中，信號放大試劑包括如本文所描述之第二可偵測標記。在圖22D中，信號放大試劑包括核酸探針，該核酸探針經由模板寡核苷酸延伸以形成延伸序列，該延伸序列結合至包括如本文所描述之第二可偵測標記的一或多個經標記探針。因此，在圖22B-22D中，信號放大試劑以兩倍方式，亦即藉由使如本文所描述之複合物穩定及藉由經由如本文所描述之第二可偵測標記提供另一可偵測信號來放大分析信號。
分析組分及方法
在實施例中，本發明提供包括以下之方法：（a）使ECL標記與特異性結合至ECL標記之信號放大試劑接觸，其中：
信號放大試劑包括結合部分，且該方法進一步包括使ECL標記與可偵測部分接觸；或
信號放大試劑包括酶，且該方法進一步包括使ECL標記與酶之受質接觸；或
信號放大試劑視情況包括第二可偵測標記；或
信號放大試劑包括核酸探針，且該方法進一步包括延伸核酸探針以形成延伸序列，及
（b）偵測可偵測部分、酶活性、第二可偵測標記或延伸序列，藉此偵測ECL標記。在實施例中，ECL標記存在於表面上。在實施例中，ECL標記在步驟（a）中存在於表面上。在實施例中，ECL標記在步驟（b）中存在於表面上。在實施例中，ECL標記存在於包括固定於其上之錨定試劑的表面上。
在實施例中，本發明提供偵測樣本中之所關注分析物之方法，其包括：
（a）使包括（A）第一可偵測標記及（B）所關注分析物之第一複合物與以下接觸：（I）特異性結合至第一可偵測標記且包括結合部分之信號放大試劑，及（II）包括（1）結合部分之結合搭配物及（2）第二可偵測標記中之一或多者的可偵測部分；及（b）量測表面上之（I）第二可偵測標記或（II）第一可偵測標記及第二可偵測標記，藉此偵測所關注分析物；
或
（c）使包括（A）第一可偵測標記及（B）所關注分析物之第一複合物與以下接觸：（I）特異性結合至第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑，及（II）酶之受質；及（d）量測酶活性，藉此偵測所關注分析物；
或
（e）使包括（A）第一可偵測標記及（B）所關注分析物之第一複合物與特異性結合至第一可偵測標記且視情況包括第二可偵測標記之信號放大試劑接觸，其中第一可偵測標記為ECL標記；及（f）量測（I）第一可偵測標記；（II）第二可偵測標記；或（III）第一可偵測標記及第二可偵測標記，藉此偵測所關注分析物；
或
（g）使包括（A）第一可偵測標記及（B）所關注分析物之第一複合物與特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，其中第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記，其中信號放大試劑包括核酸探針，藉此形成包括第一複合物及信號放大試劑之第二複合物；（h）延伸核酸探針以形成延伸序列；及（i）量測延伸序列之量，藉此偵測所關注分析物。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第一複合物處於表面上。在實施例中，第一複合物包括所關注分析物；特異性結合至分析物之捕捉試劑，其中捕捉試劑固定在表面上，或其中捕捉試劑能夠固定至表面；及特異性結合至分析物且包括第一可偵測標記之偵測試劑。
在實施例中，信號放大試劑包括核酸探針，且表面包括固定在其上之錨定試劑。在實施例中，信號放大試劑包括核酸探針，且該方法進一步包括使錨定試劑固定在表面上。在實施例中，在該方法之步驟（h）之前或期間使錨定試劑固定在表面上。在實施例中，錨定試劑結合至延伸序列之錨定區，且量測包括量測經由錨定試劑結合至表面時延伸序列之量。在實施例中，第一複合物包括所關注分析物；特異性結合至分析物之捕捉試劑，其中捕捉試劑固定在表面上，或其中捕捉試劑能夠固定至表面；及特異性結合至分析物且包括第一可偵測標記之偵測試劑。
在實施例中，本發明提供偵測樣本中之所關注分析物之方法，其包括（a）在表面上形成包括所關注分析物、特異性結合至分析物之捕捉試劑及特異性結合至分析物且包括第一核酸探針之偵測試劑的第一複合物，其中捕捉試劑固定在表面上或其中捕捉試劑能夠固定至表面；（b）延伸第一核酸探針以形成包括第一錨定區之第一延伸序列，其中第一錨定區結合固定在表面上之第一錨定試劑；（c）使第一延伸序列結合至包括第一可偵測標記之第一經標記探針；及：
（d）使結合至第一延伸序列之第一經標記探針與以下接觸：（I）特異性結合至第一可偵測標記且包括結合部分之信號放大試劑，及（II）包括（1）結合部分之結合搭配物及（2）第二可偵測標記中之一或多者的可偵測部分；及（e）量測（I）第二可偵測標記或（II）第一可偵測標記及第二可偵測標記，藉此偵測所關注分析物，藉此偵測所關注分析物；
或
（f）使結合至第一延伸序列之第一經標記探針與以下接觸：（I）特異性結合至第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑，及（II）酶之受質；及（g）量測酶活性，藉此偵測所關注分析物；
或
（h）使結合至第一延伸序列之第一經標記探針與特異性結合至第一可偵測標記且視情況包括第二可偵測標記之信號放大試劑接觸；及（i）量測（I）第一可偵測標記；（II）第二可偵測標記；或（III）第一可偵測標記及第二可偵測標記，藉此偵測所關注分析物；
或
（j）使結合至第一延伸序列之第一經標記探針與特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，其中信號放大試劑包括第二核酸探針，藉此形成包括信號放大試劑及第一經標記探針之第二複合物；（k）延伸第二核酸探針以形成包括第二錨定區之第二延伸序列，其中第二錨定區結合固定在表面上之第二錨定試劑；及；（l）量測結合至表面之（I）第二延伸序列或（II）第一延伸序列及第二延伸序列之量，藉此偵測所關注分析物。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。
捕捉試劑
在實施例中，捕捉試劑包括抗體或其抗原結合片段、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在實施例中，捕捉試劑包括抗體或其變異體，包含其抗原/抗原決定基結合部分；抗體片段或衍生物、抗體類似物、經工程改造之抗體或以與抗體類似之方式結合至抗原之物質。在實施例中，捕捉試劑包括抗體之至少一個重鏈或輕鏈互補決定區（CDR）。在實施例中，捕捉試劑包括一或多個抗體之至少兩個CDR。在實施例中，捕捉試劑包括抗體或其抗原結合片段。
在實施例中，捕捉試劑特異性結合至分析物。如本文所使用之「特異性結合（specifically binds）」意謂相對於隨機不相關物質，試劑（例如捕捉試劑）優先結合至其結合搭配物（例如分析物之抗原決定基）。在實施例中，捕捉試劑包括抗體或其抗原結合片段，包括特異性結合至分析物之抗原決定基的抗原結合域。
在實施例中，捕捉試劑固定在表面上。在實施例中，捕捉試劑能夠固定至表面。本文進一步描述使捕捉試劑固定至表面之方法。在實施例中，捕捉試劑經由硫酯、硫醚、二硫化物或其組合固定至表面。在實施例中，捕捉試劑經由如本文所描述之靶向劑固定至表面。在實施例中，在本文所描述之第一複合物形成之前、期間或之後，捕捉試劑固定至表面。在實施例中，在該方法之步驟（a）之前，捕捉試劑固定至表面。
偵測試劑
在實施例中，偵測試劑包括抗體或其抗原結合片段、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在實施例中，偵測試劑包括抗體或其變異體，包含其抗原/抗原決定基結合部分；抗體片段或衍生物、抗體類似物、經工程改造之抗體或以與抗體類似之方式結合至抗原之物質。在實施例中，偵測試劑包括抗體之至少一個重鏈或輕鏈互補決定區（CDR）。在實施例中，偵測試劑包括一或多個抗體之至少兩個CDR。在實施例中，偵測試劑包括抗體或其抗原結合片段。
在實施例中，偵測試劑特異性結合至分析物。在實施例中，偵測試劑包括抗體或其抗原結合片段，包括特異性結合至分析物之抗原決定基的抗原結合域。在實施例中，偵測試劑結合至與捕捉試劑不同的分析物之抗原決定基。
在實施例中，第一複合物包括超過一種偵測試劑。在實施例中，第一複合物包括至少兩種偵測試劑。在實施例中，如本文所描述之第一複合物之偵測試劑為第一偵測試劑，且第一複合物進一步包括第二偵測試劑。在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑各自特異性結合至分析物。在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑結合至分析物上之相同抗原決定基。在實施例中，分析物包括抗原決定基之多個複本以結合至第一偵測試劑及第二偵測試劑，以使得第一偵測試劑及第二偵測試劑能夠同時結合至分析物上之抗原決定基之單獨複本。在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑結合至分析物上之不同抗原決定基。在實施例中，捕捉試劑以及第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者結合至分析物上之不同抗原決定基。在實施例中，捕捉試劑結合至分析物上之第一抗原決定基，且第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者結合至分析物上之第二抗原決定基。在實施例中，分析物包括第二抗原決定基之多個複本以使得第一偵測試劑及第二偵測試劑能夠同時結合至分析物上之第二抗原決定基之單獨複本。在實施例中，第一複合物包括捕捉試劑、分析物、第一偵測試劑及第二偵測試劑，其中捕捉試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑結合至分析物。
在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑各自獨立地包括抗體或其抗原結合片段、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括抗體或其變異體，包含其抗原/抗原決定基結合部分；抗體片段或衍生物、抗體類似物、經工程改造之抗體或以與抗體類似之方式結合至抗原之物質。在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括抗體之至少一個重鏈或輕鏈互補決定區（CDR）。在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括一或多個抗體之至少兩個CDR。在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括抗體或其抗原結合片段。
包括第一可偵測標記之偵測試劑
在實施例中，偵測試劑包括第一可偵測標記。在實施例中，偵測試劑包括多個第一可偵測標記。在實施例中，偵測試劑包括第一可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在其中第一複合物包括第一偵測試劑及第二偵測試劑之實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括第一可偵測標記。在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括第一可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在實施例中，第一複合物之偵測試劑或第一複合物之第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括第一可偵測標記中之至少兩個。在實施例中，第一可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來偵測。在實施例中，第一可偵測標記包括ECL標記。
在實施例中，ECL標記包括電化學發光有機金屬錯合物。在實施例中，電化學發光有機金屬錯合物包括釕、鋨、銥、錸及/或鑭系金屬。在實施例中，ECL標記包括釕。在實施例中，電化學發光有機金屬錯合物包括經取代或未經取代之聯吡啶或經取代或未經取代之啡啉。在實施例中，ECL標記包括經取代之聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，包括至少一個磺酸根基團之經取代之聯吡啶配位體為式I化合物：
。
在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個共價連接至偵測試劑之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個共價連接至偵測試劑之取代基的聯吡啶。在實施例中，有機金屬錯合物包括釕、鋨或錸。
例示性ECL標記可見於US 5,714,089；US 6,136,268；US 6,316,607；US 6,468,741；US 6,479,233；US 6,808,939；及US 9,499,573中。
在實施例中，第一可偵測標記為式II化合物：
。
在實施例中，第一可偵測標記為式III化合物：
。
在實施例中，第一可偵測標記為式IV化合物：
。
在實施例中，第一可偵測標記為式V化合物：
，其中各X包括磷酸根、碳酸根、硼酸根或其組合。
在實施例中，第一可偵測標記為式VI化合物：
。
在實施例中，偵測試劑（例如如本文所描述之第一偵測試劑及/或第二偵測試劑）經由結合連接子共價連接至第一可偵測標記。在實施例中，結合連接子包括醯胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亞胺、三唑、二氫嗒
、肽、寡核苷酸、親水性聚合物或其組合。在實施例中，結合連接子中之醯胺由N-羥基丁二醯亞胺（NHS）酯與胺之間的反應產生。在實施例中，結合連接子中之硫酯由NHS酯與硫醇（亦稱為硫氫基）之間的反應產生。在實施例中，結合連接子中之硫醚由順丁烯二醯亞胺或烯烴與硫醇之間的反應產生。在實施例中，結合連接子中之二硫化物由二硫化物與硫醇之間的反應產生。在實施例中，結合連接子中之亞胺由醛或酮與胺之間的反應產生。在實施例中，結合連接子中之三唑由炔烴或環炔與疊氮化合物之間的反應產生。在實施例中，結合連接子中之二氫嗒
由反式環辛烯與四
之間的反應產生。
在實施例中，結合連接子包括間隔子，例如以增加偵測試劑與第一可偵測標記之間的距離及/或移動可撓性。在實施例中，結合連接子包括肽。在實施例中，結合連接子包括寡核苷酸。在實施例中，結合連接子包括親水性聚合物。在實施例中，親水性聚合物包括聚乙二醇（PEG）。
包括第一核酸探針之偵測試劑
在實施例中，偵測試劑包括第一核酸探針。在實施例中，第一核酸探針能夠經延伸以形成第一延伸序列。在實施例中，第一核酸探針能夠與另一寡核苷酸接合以形成第一延伸序列。在實施例中，第一核酸探針能夠與另一寡核苷酸接合以形成第一延伸序列，其中另一寡核苷酸之至少一部分包括與第一核酸探針之互補序列。在實施例中，第一核酸探針能夠結合至模板寡核苷酸。在實施例中，第一核酸探針為用於延伸反應之引子。在實施例中，延伸反應包括聚合酶鏈反應（PCR）、接合酶鏈反應（LCR）、股置換擴增（SDA）、自持續合成反應（3SR）、等溫擴增（諸如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增）或其組合。在實施例中，第一核酸探針結合至模板寡核苷酸且藉由PCR、LCR、SDA、3SR、等溫擴增（諸如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增）或其組合延伸以形成第一延伸序列。在實施例中，第一核酸探針結合至模板寡核苷酸且藉由PCR延伸以形成第一延伸序列。在實施例中，第一核酸探針結合至模板寡核苷酸，形成環狀模板寡核苷酸（例如藉由使線性模板寡核苷酸接合），且藉由滾環擴增延伸以形成第一延伸序列。在其中第一複合物包括第一偵測試劑及第二偵測試劑之實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括近接核酸探針，其中僅當兩個近接核酸探針近接時，該等近接核酸探針中之一或兩者能夠經延伸以形成第一延伸序列。
在實施例中，第一延伸序列包括第一錨定區。在實施例中，第一錨定區結合至表面上之第一錨定試劑。在實施例中，在本文所描述之第一複合物形成之前、期間或之後，第一錨定試劑固定在表面上。在實施例中，在本文所描述之方法之步驟（a）之前，第一錨定試劑固定至表面。在實施例中，在形成第一延伸序列之前，第一錨定試劑固定至表面。在實施例中，第一錨定試劑經由硫酯、硫醚、二硫化物或其組合固定至表面。在實施例中，第一錨定試劑經由如本文進一步描述之靶向劑固定至表面。
在實施例中，第一錨定試劑包括寡核苷酸、適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基。在實施例中，第一錨定試劑包括適體配位體，且第一錨定區包括適體。在實施例中，第一錨定試劑包括寡核苷酸結合蛋白，且第一錨定區包括寡核苷酸序列。在實施例中，第一錨定試劑包括單股寡核苷酸。在實施例中，第一錨定試劑包括雙股寡核苷酸。在實施例中，第一錨定試劑及第一錨定區包括互補寡核苷酸。在實施例中，第一錨定試劑包括錨定寡核苷酸。在實施例中，第一錨定區包括與錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體。
在實施例中，使第一延伸序列結合至第一錨定試劑包括在第一錨定試劑與第一錨定區之間形成三螺旋。在實施例中，使第一延伸序列結合至第一錨定試劑包括在結合之前使第一錨定區變性以暴露單股寡核苷酸區；在結合之前使第一錨定區暴露於解螺旋酶活性；及/或在結合之前使第一錨定區暴露於核酸酶處理，其中第一錨定區包括一或多個經半抗原修飾之鹼基且第一錨定試劑包括一或多個半抗原特異性抗體；及/或第一錨定區包括一或多個經配位體修飾之鹼基且第一錨定試劑包括一或多個配位體特異性受體。
在實施例中，在第一核酸探針延伸之後，包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑（或第一偵測試劑及第二偵測試劑）之第一複合物結合至表面。在實施例中，第一延伸序列在距離表面上之第一複合物約1 nm至約500 nm、約5 nm至約250 nm、約10 nm至約200 nm或約15 nm至約150 nm內之位置處結合至第一錨定試劑。在實施例中，第一延伸序列在距離表面上之第一複合物小於1 μm之位置處結合至第一錨定試劑。在實施例中，第一延伸序列在距離表面上之第一複合物小於500 nm之位置處結合至第一錨定試劑。在實施例中，第一延伸序列在距離表面上之第一複合物小於200 nm之位置處結合至第一錨定試劑。
在實施例中，該方法包括在第一核酸探針延伸及/或第一延伸序列結合至第一錨定試劑之後，使第一延伸序列結合至包括第一可偵測標記之第一經標記探針。在實施例中，第一延伸序列及第一經標記探針包括互補寡核苷酸。在實施例中，第一經標記探針包括第一可偵測標記中之超過一個。在實施例中，第一經標記探針包括第一可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在實施例中，第一可偵測標記例如經由如本文所描述之結合連接子共價連接至第一經標記探針。
本文進一步描述第一可偵測標記。在實施例中，第一可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來偵測。在實施例中，第一可偵測標記包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，經取代之聯吡啶配位體為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個共價連接至第一經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個共價連接至第一經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，有機金屬錯合物包括釕、鋨或錸。
在實施例中，第一可偵測標記包括式II化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式III化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式IV化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式V化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式VI化合物。
信號放大試劑
在實施例中，信號放大試劑包括抗體或其抗原結合片段、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在實施例中，信號放大試劑包括抗體或其變異體，包含其抗原/抗原決定基結合部分；抗體片段或衍生物、抗體類似物、經工程改造之抗體或以與抗體類似之方式結合至抗原之物質。在實施例中，信號放大試劑包括抗體之至少一個重鏈或輕鏈互補決定區（CDR）。在實施例中，信號放大試劑包括一或多個抗體之至少兩個CDR。在實施例中，信號放大試劑包括抗體或其抗原結合片段。在實施例中，抗體或其抗原結合片段包括有包括IgA、IgD、IgE、IgG或IgM域之恆定區。在實施例中，抗體或其抗原結合片段包括IgG域。在實施例中，抗體或其抗原結合片段包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型抗體或其抗原結合片段。在實施例中，抗體或其抗原結合片段包括IgG2a、IgG2b或IgG2c子類抗體或其抗原結合片段。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段衍生自小鼠、大鼠、山羊、兔、雞、天竺鼠、倉鼠、馬或綿羊。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段衍生自小鼠。本文進一步描述抗體及抗原結合片段。
在實施例中，信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記。在實施例中，信號放大試劑包括有包括特異性結合至第一可偵測標記之抗原結合域的抗體或其抗原結合片段。
在實施例中，信號放大試劑能夠特異性結合至至少兩個第一可偵測標記。在實施例中，信號放大試劑包括至少兩個抗原結合域，其中各抗原結合域特異性結合至第一可偵測標記。在實施例中，信號放大試劑能夠結合至第一偵測試劑上之第一可偵測標記及第二偵測試劑上之第一可偵測標記，例如如圖22A中所描繪。如本文所描述，能夠結合至第一偵測試劑及第二偵測試劑上之至少兩個可偵測標記的信號放大試劑使偵測試劑與分析物之結合穩定，藉此放大分析信號以用於偵測分析物。在實施例中，與信號放大試劑結合之至少兩個第一可偵測標記包括相同結構。在實施例中，與信號放大試劑結合之至少兩個第一可偵測標記包括不同結構。
本文描述第一可偵測標記。在實施例中，第一可偵測標記為如本文所描述之ECL標記。在實施例中，信號放大試劑結合兩個第一可偵測標記，其中與信號放大試劑結合之各第一可偵測標記為如本文所描述之ECL標記。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，經取代之聯吡啶配位體為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中該等配位體中之至少一者為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中該等配位體中之一者為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物。
在實施例中，信號放大試劑特異性結合式II化合物。在實施例中，信號放大試劑特異性結合式IV化合物。在實施例中，信號放大試劑特異性結合式VI化合物。
在實施例中，信號放大試劑特異性結合兩個第一可偵測標記，其中該兩個第一可偵測標記包括相同結構，例如各第一可偵測標記包括式II、III、IV、V或VI化合物。在實施例中，信號放大試劑特異性結合兩個第一可偵測標記，其中該兩個第一可偵測標記包括不同結構，例如該兩個第一可偵測標記中之各者包括式II、III、IV、V或VI化合物，其限制條件為該兩個第一可偵測標記不包括相同化合物。在實施例中，各第一可偵測標記獨立地包括式II、III、IV、V或VI化合物。在實施例中，各第一可偵測標記獨立地包括式II、IV或VI化合物。
在實施例中，第一可偵測標記共價連接至例如如本文所描述之偵測試劑（例如第一偵測試劑及/或第二偵測試劑）或第一經標記探針。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記及結合連接子。在實施例中，在實施例中，信號放大試劑包括有包括特異性結合至第一可偵測標記及結合連接子之抗原結合域的抗體或其抗原結合片段。在該等實施例中，信號放大試劑不結合至未結合第一可偵測標記（亦即不連接至偵測試劑或第一經標記探針）。未結合第一可偵測標記可存在於例如來自用於使第一可偵測標記連接至偵測試劑或第一經標記探針之結合反應的分析混合物中。在實施例中，相對於利用結合至單獨第一可偵測標記之信號放大試劑的方法，利用特異性結合至第一可偵測標記及結合連接子之信號放大試劑的方法具有改善之特定性。
在實施例中，結合連接子包括醯胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亞胺、三唑、二氫嗒
、肽、寡核苷酸、親水性聚合物或其組合。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及醯胺。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及硫酯。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及硫醚。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及二硫化物。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及亞胺。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及三唑。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及二氫嗒
。
在實施例中，結合連接子包括間隔子（例如如本文所描述之肽、寡核苷酸或親水性聚合物），且信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記及結合連接子之肽、寡核苷酸或親水性聚合物之至少一部分。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及結合連接子之肽之至少一部分。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及結合連接子之寡核苷酸之至少一部分。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及結合連接子之親水性聚合物之至少一部分。
進一步出乎意料地發現，抗體信號放大試劑對包含磺化ECL標記之本文所描述之ECL標記具有高特異性。大部分抗體需要疏水性補片以獲得特異性，且因此預期磺酸根基團與非磺化標記相比免疫原性較低。
I. 包括第一可偵測標記之第一複合物之信號放大
在實施例中，本發明提供偵測樣本中之所關注分析物之方法，其包括使包括（A）第一可偵測標記及（B）所關注分析物之第一複合物與信號放大試劑接觸，其中第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記。在實施例中，第一複合物包括所關注分析物、特異性結合至分析物之捕捉試劑及特異性結合至分析物之偵測試劑。在實施例中，如本文所描述，偵測試劑包括第一可偵測標記。在實施例中，偵測試劑為第一偵測試劑，且第一複合物進一步包括特異性結合至分析物且包括如本文所描述之第一可偵測標記的第二偵測試劑。
在實施例中，第一複合物處於表面上。在實施例中，第一複合物包括分析物、特異性結合至分析物之捕捉試劑及特異性結合至分析物之偵測試劑。在實施例中，該方法包括在接觸之前形成第一複合物。在實施例中，形成第一複合物包括：使所關注分析物與（i）表面、（ii）捕捉試劑及（iii）偵測試劑接觸。在實施例中，形成第一複合物包括：使樣本與（i）表面、（ii）捕捉試劑及（iii）偵測試劑接觸。
在實施例中，第一複合物包括所關注分析物、特異性結合至分析物之捕捉試劑、特異性結合至分析物之第一偵測試劑及特異性結合至分析物之第二偵測試劑，其中第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括如本文所描述之第一可偵測標記。在實施例中，該方法包括在接觸之前形成第一複合物。在實施例中，形成第一複合物包括：使所關注分析物與（i）表面、（ii）捕捉試劑、（iii）第一偵測試劑及（iv）第二偵測試劑接觸。在實施例中，形成第一複合物包括：使樣本與（i）表面、（ii）捕捉試劑、（iii）第一偵測試劑及（iv）第二偵測試劑接觸。在實施例中，第一複合物係藉由使分析物與捕捉試劑以及第一偵測試劑及第二偵測試劑按任何次序接觸而形成。
在實施例中，如本文所描述，捕捉試劑固定在表面上。在實施例中，捕捉試劑能夠固定在表面上。在實施例中，該方法包括在第一複合物形成之前、期間或之後使捕捉試劑固定至表面。在實施例中，該方法包括在該方法之步驟（a）之前使捕捉試劑固定至表面。
在實施例中，該方法進一步包括在使第一複合物與信號放大試劑接觸之前偵測表面上之第一複合物。在實施例中，偵測包括量測例如偵測試劑上之第一可偵測標記之量。在其中第一複合物包括第一偵測試劑及第二偵測試劑之實施例中，偵測包括量測第一偵測試劑及第二偵測試劑上之第一可偵測標記之量。在實施例中，第一可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第一可偵測標記包括ECL標記，且量測第一可偵測標記之量包括量測ECL信號。
在實施例中，偵測試劑包括多個第一可偵測標記，且多種信號放大試劑結合至偵測試劑，其中各信號放大試劑結合至偵測試劑上之單獨的第一可偵測標記。
在實施例中，第一複合物包括第一偵測試劑及第二偵測試劑，其中第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括如本文所描述之第一可偵測標記，且信號放大試劑能夠同時結合至第一偵測試劑上之第一可偵測標記及第二偵測試劑上之第一可偵測標記，例如如圖22A-22D中所示。
I.A. 包括結合部分之信號放大試劑
在實施例中，使包括捕捉試劑、分析物及包括第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物與以下接觸：（1）特異性結合至第一可偵測標記且包括結合部分之信號放大試劑，及（2）可偵測部分，其中可偵測部分包括：（i）結合部分之結合搭配物及（ii）第二可偵測標記中之一或多者。在實施例中，第一複合物包括第一偵測試劑及第二偵測試劑，第一偵測試劑及第二偵測試劑各自包括第一可偵測標記，且信號放大試劑特異性結合至第一偵測試劑上之第一可偵測標記及第二偵測試劑上之第一可偵測標記，如本文所描述且如圖22B中所描繪。
在實施例中，結合部分包括寡核苷酸，且可偵測部分包括互補寡核苷酸。在實施例中，結合部分及可偵測部分包括受體-配位體對、抗原-抗體對、半抗原-抗體對、抗原決定基-抗體對、模擬抗原決定基-抗體對、適體-目標分子對或嵌入劑-目標分子對。在實施例中，結合部分包括用於可偵測部分之多個結合位點。在實施例中，結合部分包括用於可偵測部分之2、3、4、5、6、7、8、9或10個結合位點。在實施例中，可偵測部分包括用於結合部分之多個結合位點。在實施例中，可偵測部分包括用於結合部分之2、3、4、5、6、7、8、9或10個結合位點。舉例而言，一種鏈黴抗生物素蛋白能夠結合四種生物素分子。在實施例中，結合部分包括生物素，且可偵測部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。在實施例中，結合部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白，且可偵測部分包括生物素。
在實施例中，可偵測部分包括第二可偵測標記。在實施例中，可偵測部分包括第二可偵測標記中之超過一個。在實施例中，可偵測部分包括第二可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。
在實施例中，第二可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來偵測。在實施例中，第二可偵測標記包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，經取代之聯吡啶配位體為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個共價連接至可偵測部分之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個共價連接至可偵測部分之取代基的聯吡啶。在實施例中，有機金屬錯合物包括釕、鋨或錸。
在實施例中，第二可偵測標記包括式II化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式III化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式IV化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式V化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式VI化合物。
在實施例中，偵測試劑（例如第一偵測試劑及/或第二偵測試劑）之第一可偵測標記與可偵測部分之第二可偵測標記相同。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式II化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式III化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式IV化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式V化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式VI化合物。
在實施例中，第一可偵測標記與第二可偵測標記不同。在實施例中，一旦第一可偵測標記與信號放大試劑結合，則其為不可偵測的。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記而非第二可偵測標記。在實施例中，第一可偵測標記包括式II化合物，且第二可偵測標記包括式III、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式III化合物，且第二可偵測標記包括式II、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式IV化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式V化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式VI化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或V中任一者之化合物。
在實施例中，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。如本文所使用，「可偵測地不同」之兩種物種意謂使用不同偵測方法或參數偵測兩種物種。舉例而言，螢光物種可偵測地不同於化學發光或電化學發光物種。在另一實例中，電化學發光物種可偵測地不同於顯色物種。在另一實例中，具有不同的非重疊激發及/或發射波長之兩種螢光物種係可偵測地不同的。在實施例中，例如在與信號放大試劑結合之偵測試劑上存在第一可偵測標記不會干擾對第二可偵測標記之偵測。
在實施例中，首先使第一複合物與信號放大試劑接觸，隨後與可偵測部分接觸。在實施例中，使第一複合物同時或實質上同時與信號放大試劑及可偵測部分接觸。如本文關於一或多個事件（例如使第一結合複合物與信號放大試劑及可偵測部分接觸）使用之術語「同時（simultaneous）」意謂該等事件在恰好同一時間或在實質上同一時間發生，例如本文所描述之同時事件可相隔少於或約10分鐘、相隔少於或約5分鐘、相隔少於或約2分鐘、相隔少於或約1分鐘、相隔少於或約30秒、相隔少於或約15秒或相隔少於或約5秒發生。
在實施例中，接觸包括：（i）形成包括信號放大試劑及可偵測部分之信號放大複合物；及（ii）使第一複合物與信號放大複合物接觸。在實施例中，可偵測部分包括用於結合部分之多個結合位點及/或結合部分包括用於可偵測部分之多個結合位點，且信號放大複合物包括複數種信號放大試劑，且其中各信號放大試劑結合至一或多個可偵測部分。在實施例中，第一複合物與信號放大複合物同時或實質上同時形成。在實施例中，第一複合物與信號放大複合物依序形成。在實施例中，第一複合物形成於表面上，且信號放大複合物形成於單獨反應罐或容器中。
在其中結合部分包括寡核苷酸結合部分且可偵測部分包括與寡核苷酸結合部分之互補寡核苷酸的實施例中，該方法進一步包括在結合至可偵測部分之前增加寡核苷酸結合部分長度。在實施例中，增加寡核苷酸結合部分長度包括使寡核苷酸結合部分與另一寡核苷酸接合。在實施例中，增加寡核苷酸結合部分長度包括使寡核苷酸結合部分與另一寡核苷酸雜交，其中另一寡核苷酸之至少一部分包括與寡核苷酸結合部分之互補序列。在實施例中，另一寡核苷酸另外包括超過一個與經標記探針之互補序列，藉此允許可偵測部分之超過一個複本結合至第二複合物且進一步放大分析信號，如本文實施例中所描述。
包括複數種交聯信號放大試劑及可偵測部分之信號放大複合物之例示性實施例繪示於圖4中，其中各可偵測部分包括多個第二可偵測標記。在包括形成信號放大複合物且其中第一可偵測標記與第二可偵測標記相同之實施例中，信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記及偵測試劑之結合連接子，藉此減少信號放大試劑與可偵測部分上之第二可偵測標記的結合。在包括形成信號放大複合物之實施例中，第一可偵測標記與第二可偵測標記不同，藉此減少信號放大試劑與可偵測部分上之第二可偵測標記的結合。
在實施例中，該方法包括量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記與第二可偵測標記可偵測地不同。在實施例中，該方法包括分別量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括ECL標記，且量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
在實施例中，該方法包括量測第二可偵測標記之量。在實施例中，第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第二可偵測標記包括ECL標記，且量測第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
I.B. 包括酶之信號放大試劑
在實施例中，使包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑之第一複合物與以下接觸：（1）特異性結合至第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑，及（2）酶之受質。在實施例中，第一複合物包括第一偵測試劑及第二偵測試劑，第一偵測試劑及第二偵測試劑各自包括第一可偵測標記，且信號放大試劑特異性結合至第一偵測試劑上之第一可偵測標記及第二偵測試劑上之第一可偵測標記，如本文所描述。
在實施例中，信號放大試劑包括作用於受質之酶。在實施例中，酶為辣根過氧化酶（HRP）、鹼性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶（GO）、乙醯膽鹼酯酶、過氧化氫酶或β-內醯胺酶。
在實施例中，信號放大試劑包括作用於受質之酶，例如如圖17中所繪示。在實施例中，酶例如經由氧化、還原、水解或其組合而結合至受質且作用於受質以產生可偵測信號。在實施例中，可偵測信號包括顯色信號、化學發光、螢光或其組合。在實施例中，酶為HRP、AP或β-半乳糖苷酶。在實施例中，酶為HRP，且受質為3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）、2,2'-次偶氮基雙[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽（ABTS）或鄰苯二胺二鹽酸鹽（OPD）。在實施例中，TMB在經HRP氧化後自無色轉換成藍色。在實施例中，ABTS在經HRP氧化後自無色轉換成綠色。在實施例中，OPD在經HRP氧化後自無色轉換成黃橙色。在實施例中，酶為AP，且受質為對硝基苯磷酸酯（PNPP）。在實施例中，PNPP在經AP水解後自無色轉換成黃色。在實施例中，酶為β-半乳糖苷酶，且受質為鄰硝基苯基-β-D-哌喃半乳糖苷（ONPG）。在實施例中，ONPG在經β-半乳糖苷酶水解後自無色轉換成黃色。HRP之受質之另外的非限制性實例包含諸如SUPERSIGNAL™之化學發光受質及諸如QUANTABLU™、QUANTARED™及AMPLEX™紅之螢光受質。AP之受質之另外的非限制性實例包含化學發光受質CDP™及DYNALIGHT™。偵測本文所描述之受質之方法係本領域中已知的且例如由Crowther, J.R.《ELISA指南（The ELISA Guidebook）》. 《分子生物學方法（Methods in Molecular Biology）》. Humana Press; Totowa, NJ（2001）描述。
在實施例中，該方法包括量測酶活性。在實施例中，量測包括量測在酶作用於受質後產生之可偵測信號。在實施例中，可偵測信號係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，受質為TMBM、ABTS、OPD、PNPP或ONPG且在與酶反應後產生顯色信號。在實施例中，受質在與酶反應後產生螢光信號。在實施例中，受質在與酶反應後產生化學發光信號。在實施例中，使用該量之經量測可偵測信號來判定樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測可偵測信號來測定樣本中分析物之量。
I.C. 包括第二可偵測標記之信號放大試劑
在實施例中，使包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑之第一複合物與特異性結合至第一可偵測標記且包括第二可偵測標記之信號放大試劑接觸。在實施例中，第一複合物包括第一偵測試劑及第二偵測試劑，第一偵測試劑及第二偵測試劑各自包括第一可偵測標記，且信號放大試劑特異性結合至第一偵測試劑上之第一可偵測標記及第二偵測試劑上之第一可偵測標記，如本文所描述且如圖22C中所描繪。
本文進一步描述第二可偵測標記。在實施例中，第二可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來偵測。在實施例中，第二可偵測標記包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，經取代之聯吡啶配位體為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個共價連接至經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個共價連接至經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，有機金屬錯合物包括釕、鋨或錸。
在實施例中，第二可偵測標記包括式II化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式III化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式IV化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式V化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式VI化合物。
在實施例中，偵測試劑（例如第一偵測試劑及/或第二偵測試劑）之第一可偵測標記與信號放大試劑之第二可偵測標記相同。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式II化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式III化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式IV化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式V化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式VI化合物。
在實施例中，第一可偵測標記與第二可偵測標記不同。在實施例中，一旦第一可偵測標記與信號放大試劑結合，則其為不可偵測的。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記而非第二可偵測標記。在實施例中，第一可偵測標記包括式II化合物，且第二可偵測標記包括式III、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式III化合物，且第二可偵測標記包括式II、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式IV化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式V化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式VI化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或V中任一者之化合物。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。
在實施例中，該方法包括量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記與第二可偵測標記可偵測地不同。在實施例中，該方法包括分別量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括ECL標記，且量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
在實施例中，該方法包括量測第二可偵測標記之量。在實施例中，第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第二可偵測標記包括ECL標記，且量測第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
I.D. 包括核酸探針之信號放大試劑
在實施例中，使包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑之第一複合物與特異性結合至第一可偵測標記且包括核酸探針之信號放大試劑接觸。在實施例中，第一複合物包括第一偵測試劑及第二偵測試劑，第一偵測試劑及第二偵測試劑各自包括第一可偵測標記，且信號放大試劑特異性結合至第一偵測試劑上之第一可偵測標記及第二偵測試劑上之第一可偵測標記，如本文所描述且如圖22D中所示。在實施例中，該方法包括在表面上形成包括第一複合物及信號放大試劑之第二複合物。
在實施例中，第一複合物包括例如存在於如本文所描述之第一偵測試劑及第二偵測試劑上或存在於如本文所描述之單一偵測試劑上的至少兩個第一可偵測標記。在實施例中，該方法包括使第一複合物與至少兩種信號放大試劑接觸。在實施例中，如本文所描述之第二複合物之信號放大試劑為第一信號放大試劑，且第二複合物進一步包括第二信號放大試劑，其中第一信號放大試劑及第二信號放大試劑各自結合至存在於一或多種偵測試劑上之不同的第一可偵測標記。在實施例中，第二複合物包括至少兩種信號放大試劑，其中各信號放大試劑包括核酸探針，例如如圖1C（顯示三種結合至偵測試劑之信號放大試劑）及圖1D（顯示兩種結合至偵測試劑之信號放大試劑）中所示。因此，在實施例中，第二複合物包括一或多個核酸探針。在實施例中，第二複合物之各核酸探針包括相同序列。在實施例中，第二複合物之各核酸探針由相同序列組成。在實施例中，第二複合物之各核酸探針包括不同序列。在實施例中，第二複合物之核酸探針中之兩者或更多者包括相同序列。
在實施例中，該方法包括延伸核酸探針（例如第二複合物之各核酸探針）以形成延伸序列。在實施例中，延伸包括使核酸探針（例如第二複合物之各核酸探針）與另一寡核苷酸接合以形成延伸序列。在實施例中，延伸包括使核酸探針（例如第二複合物之各核酸探針）與另一寡核苷酸雜交以形成延伸序列，其中另一寡核苷酸之至少一部分包括與核酸探針之互補序列。
在實施例中，延伸包括使核酸探針（例如第二複合物之各核酸探針）結合至用於延伸反應之模板寡核苷酸以形成延伸序列。在實施例中，第二複合物包括多個，例如至少兩個核酸探針，且延伸包括使各核酸探針結合至不同模板寡核苷酸且延伸各核酸探針以形成多個，例如至少兩個延伸序列。在實施例中，第二複合物包括多個，例如至少兩個核酸探針，且延伸包括使兩個核酸探針結合至單一模板寡核苷酸且延伸一或兩個核酸探針以形成延伸序列。在實施例中，第二複合物包括多個，例如至少兩個核酸探針，且延伸包括使兩個核酸探針結合至兩個模板寡核苷酸，其中各模板寡核苷酸結合至兩個核酸探針中之各者之一部分，且延伸一或兩個核酸探針以形成延伸序列。
在實施例中，核酸探針為用於延伸反應之引子。在實施例中，延伸反應包括PCR、LCR、SDA、3SR、等溫擴增（諸如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增）或其組合。在實施例中，延伸包括使核酸探針結合至模板寡核苷酸且藉由PCR、LCR、SDA、3SR、等溫擴增（諸如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增）或其組合延伸核酸探針。在實施例中，延伸包括使核酸探針結合至模板寡核苷酸且藉由PCR延伸核酸探針。在實施例中，延伸包括使核酸探針結合至模板寡核苷酸，形成環狀模板寡核苷酸（例如藉由使線性模板寡核苷酸接合），且藉由滾環擴增延伸核酸探針。
在實施例中，第二複合物包括至少兩個核酸探針，且延伸包括：使各核酸探針結合至不同模板寡核苷酸，由各模板寡核苷酸形成環狀模板，且藉由RCA延伸各核酸探針，例如如圖1C中所示。在實施例中，第二複合物包括兩個核酸探針，且延伸包括：使兩個核酸探針與兩個模板寡核苷酸接觸，其中各模板寡核苷酸同時結合至兩個核酸探針中之各者之一部分；使兩個模板寡核苷酸接合以形成環狀模板；及藉由RCA延伸核酸探針中之一或兩者，例如如圖1D中所示。
在實施例中，第二複合物包括第一信號放大試劑及第二信號放大試劑，且第一信號放大試劑及第二信號放大試劑之核酸探針包括相同序列或由相同序列組成。在實施例中，第一信號放大試劑及第二信號放大試劑之核酸探針包括不同序列。在其中第一信號放大試劑及第二信號放大試劑之核酸探針包括不同序列之實施例中，當兩個核酸探針近接時模板寡核苷酸能夠接合，藉此提高用於偵測分析物之方法之特定性。
在實施例中，第二複合物包括至少兩個包括不同序列之核酸探針。在實施例中，兩個核酸探針結合至模板寡核苷酸之相鄰區域。在實施例中，模板寡核苷酸包括與兩個核酸探針中之第一者互補之內部序列；及與兩個核酸探針中之第二者之非重疊區域互補之5'序列及3'序列。在實施例中，使兩個核酸探針與以下接觸：第一模板寡核苷酸，其包括與兩個核酸探針中之第一者上之第一區及兩個核酸探針中之第二者上之第一區互補的序列；及第二模板寡核苷酸，其包括與兩個核酸探針中之第一者上之第二區及兩個核酸探針中之第二者上之第二區互補的序列，其中各核酸探針上之第一區及第二區為非重疊的；使第一模板寡核苷酸及第二模板寡核苷酸接合以形成環狀模板；及藉由RCA延伸一或兩個核酸探針以形成延伸序列。
在實施例中，延伸序列包括能夠結合至錨定試劑之錨定區。在實施例中，第一複合物處於表面上，且該方法進一步包括使錨定試劑固定在表面上。在實施例中，第一複合物處於表面上，且表面進一步包括經固定之錨定試劑。在實施例中，錨定試劑經由硫酯、硫醚、二硫化物或其組合固定至表面。在實施例中，錨定試劑經由如本文進一步描述之靶向劑固定至表面。在實施例中，在本文所描述之第一複合物形成之前、期間或之後，錨定試劑固定至表面。在實施例中，在該方法之步驟（a）之前，錨定試劑固定至表面。在實施例中，在形成延伸序列之前，錨定試劑固定至表面。在實施例中，在量測延伸序列之量之前，錨定試劑固定至表面。在實施例中，該方法包括使延伸序列之錨定區結合至錨定試劑。在實施例中，量測包括量測經由錨定試劑結合至表面之延伸序列之量。
在實施例中，錨定試劑包括寡核苷酸、適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基。在實施例中，錨定試劑包括適體配位體，且延伸序列之錨定區包括適體。在實施例中，錨定試劑包括寡核苷酸結合蛋白，且延伸序列之錨定區包括寡核苷酸序列。在實施例中，錨定試劑包括單股寡核苷酸。在實施例中，錨定試劑包括雙股寡核苷酸。在實施例中，錨定試劑及錨定區包括互補寡核苷酸。在實施例中，錨定試劑包括錨定寡核苷酸。在實施例中，延伸序列之錨定區包括與錨定寡核苷酸互補之錨定寡核苷酸補體。
在實施例中，使延伸序列結合至錨定試劑包括在錨定試劑與延伸序列之錨定區之間形成三螺旋。在實施例中，使延伸序列結合至錨定試劑包括在結合之前使錨定區變性以暴露單股寡核苷酸區；在結合之前使錨定區暴露於解螺旋酶活性；及/或在結合之前使錨定區暴露於核酸酶處理，其中錨定區包括一或多個經半抗原修飾之鹼基且錨定試劑包括一或多個半抗原特異性抗體；及/或錨定區包括一或多個經配位體修飾之鹼基且錨定試劑包括一或多個配位體特異性受體。
在實施例中，第一複合物包括如本文所描述之分析物、捕捉試劑及偵測試劑。在實施例中，第一複合物包括如本文所描述之分析物、捕捉試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑。在實施例中，第二複合物包括捕捉試劑、分析物、偵測試劑及信號放大試劑。在實施例中，第二複合物包括捕捉試劑、分析物、第一偵測試劑、第二偵測試劑及信號放大試劑。在實施例中，在延伸經標記探針之後第二複合物結合至表面。在實施例中，在與經標記探針接觸之前第二複合物結合至表面。在實施例中，延伸序列在距離表面上之第二複合物約1 nm至約500 nm、約5 nm至約250 nm、約10 nm至約200 nm或約15 nm至約150 nm內之位置處結合至錨定試劑。在實施例中，延伸序列在距離表面上之第二複合物小於1 μm之位置處結合至錨定試劑。在實施例中，延伸序列在距離表面上之第二複合物小於500 nm之位置處結合至錨定試劑。在實施例中，延伸序列在距離表面上之第二複合物小於200 nm之位置處結合至錨定試劑。
在實施例中，量測延伸序列之量包括使延伸序列與包括第二可偵測標記之經標記探針接觸。在實施例中，經標記探針包括第二可偵測標記中之超過一個。在實施例中，經標記探針包括第二可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在實施例中，包括第二可偵測標記之經標記探針結合至延伸序列。在實施例中，延伸序列及經標記探針包括互補寡核苷酸。在實施例中，延伸序列包括經修飾鹼基，且量測延伸序列之量包括使延伸序列與結合至經修飾鹼基之可偵測部分接觸。在實施例中，經修飾鹼基包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且可偵測部分包括經修飾鹼基之結合搭配物及第二可偵測標記。在實施例中，經修飾鹼基包括鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，且可偵測部分包括生物素及第二可偵測標記。在實施例中，經修飾鹼基包括生物素，且可偵測部分包括抗生物素蛋白及第二可偵測標記。
本文進一步描述第二可偵測標記。在實施例中，第二可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來偵測。在實施例中，第二可偵測標記包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，經取代之聯吡啶配位體為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個共價連接至經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個共價連接至經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，有機金屬錯合物包括釕、鋨或錸。
在實施例中，第二可偵測標記包括式II化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式III化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式IV化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式V化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式VI化合物。
在實施例中，偵測試劑（例如第一偵測試劑及/或第二偵測試劑）之第一可偵測標記與經標記探針之第二可偵測標記相同。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式II化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式III化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式IV化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式V化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式VI化合物。
在實施例中，第一可偵測標記與第二可偵測標記不同。在實施例中，一旦第一可偵測標記與信號放大試劑結合，則其為不可偵測的。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記而非第二可偵測標記。在實施例中，第一可偵測標記包括式II化合物，且第二可偵測標記包括式III、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式III化合物，且第二可偵測標記包括式II、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式IV化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式V化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式VI化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或V中任一者之化合物。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。
在實施例中，該方法包括藉由量測表面上之第二可偵測標記之量來量測延伸序列之量。在實施例中，第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第二可偵測標記包括ECL標記，且量測第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
在實施例中，該方法進一步包括量測表面上之第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記與第二可偵測標記可偵測地不同。在實施例中，該方法包括分別量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括ECL標記，且量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
II. 包括第一核酸探針之偵測試劑之信號放大
在實施例中，本發明提供偵測樣本中之所關注分析物之方法，其包括
在表面上形成第一複合物，其中第一複合物包括所關注分析物、特異性結合分析物之捕捉試劑及特異性結合分析物之偵測試劑，其中偵測試劑包括第一核酸探針；
延伸第一核酸探針以形成包括第一錨定區之第一延伸序列，其中第一錨定區結合固定在表面上之第一錨定試劑；
使第一延伸序列結合至包括第一可偵測標記之第一經標記探針；及
使第一經標記探針與信號放大試劑接觸。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。本文進一步描述包括第一核酸探針之偵測試劑；延伸第一核酸探針以形成第一延伸序列；及使第一經標記探針結合至第一延伸序列。
在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使所關注分析物與（i）表面、（ii）捕捉試劑及（iii）偵測試劑接觸。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使樣本與（i）表面、（ii）捕捉試劑及（iii）偵測試劑接觸。
在實施例中，第一複合物之偵測試劑為第一偵測試劑，且第一複合物進一步包括第二偵測試劑，其中第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者包括如本文所描述之近接核酸探針。在實施例中，近接核酸探針中之一或兩者經延伸以形成包括如本文所描述之第一錨定區的第一延伸序列。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使所關注分析物及/或樣本與（i）表面、（ii）捕捉試劑、（iii）第一偵測試劑及（iv）第二偵測試劑接觸。如本文所描述，可使捕捉試劑以及第一偵測試劑及第二偵測試劑與樣本及/或分析物按任何次序接觸。
在實施例中，如本文所描述，捕捉試劑固定在表面上。在實施例中，捕捉試劑能夠固定在表面上。在實施例中，該方法包括在第一複合物形成之前、期間或之後使捕捉試劑固定至表面。在實施例中，該方法包括在該方法之步驟（a）之前使捕捉試劑固定至表面。本文提供使捕捉試劑固定至表面之方法。
在實施例中，該方法進一步包括在使第一經標記探針與信號放大試劑接觸之前，偵測表面上之第一複合物。在實施例中，偵測包括量測結合至表面之第一延伸序列之量。在實施例中，偵測包括量測結合至第一延伸序列之第一經標記探針之量。在實施例中，偵測包括量測第一經標記探針之第一可偵測標記之量。在實施例中，第一可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第一可偵測標記包括ECL標記，且量測第一可偵測標記之量包括量測ECL信號。
在實施例中，第一經標記探針包括多個第一可偵測標記，且多種信號放大試劑結合至第一經標記探針，其中各信號放大試劑結合至偵測試劑上之單獨的第一可偵測標記。在實施例中，第一延伸序列結合多個第一經標記探針，且單獨的信號放大試劑結合至多個第一經標記探針中之各者。
II.A. 包括結合部分之信號放大試劑
在實施例中，使第一經標記探針與以下接觸：（1）包括結合部分之信號放大試劑，及（2）可偵測部分，其中可偵測部分包括：（i）結合部分之結合搭配物及（ii）第二可偵測標記中之一或多者。
在實施例中，結合部分包括寡核苷酸，且可偵測部分包括互補寡核苷酸。在實施例中，結合部分及可偵測部分包括受體-配位體對、抗原-抗體對、半抗原-抗體對、抗原決定基-抗體對、模擬抗原決定基-抗體對、適體-目標分子對、嵌入劑-目標分子對或酶-受質對。在實施例中，結合部分包括用於可偵測部分之多個結合位點。在實施例中，結合部分包括用於可偵測部分之2、3、4、5、6、7、8、9或10個結合位點。在實施例中，可偵測部分包括用於結合部分之多個結合位點。在實施例中，可偵測部分包括用於結合部分之2、3、4、5、6、7、8、9或10個結合位點。舉例而言，一種鏈黴抗生物素蛋白能夠結合四種生物素分子。在實施例中，結合部分包括生物素，且可偵測部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。在實施例中，結合部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白，且可偵測部分包括生物素。
在實施例中，可偵測部分包括第二可偵測標記。在實施例中，可偵測部分包括第二可偵測標記中之超過一個。在實施例中，可偵測部分包括第二可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。
在實施例中，第二可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來偵測。在實施例中，第二可偵測標記包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，經取代之聯吡啶配位體為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個共價連接至可偵測部分之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個共價連接至可偵測部分之取代基的聯吡啶。在實施例中，有機金屬錯合物包括釕、鋨或錸。
在實施例中，第二可偵測標記包括式II化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式III化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式IV化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式V化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式VI化合物。
在實施例中，第一經標記探針之第一可偵測標記與可偵測部分之第二可偵測標記相同。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式II化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式III化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式IV化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式V化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式VI化合物。
在實施例中，第一可偵測標記與第二可偵測標記不同。在實施例中，一旦第一可偵測標記與信號放大試劑結合，則其為不可偵測的。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記而非第二可偵測標記。在實施例中，第一可偵測標記包括式II化合物，且第二可偵測標記包括式III、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式III化合物，且第二可偵測標記包括式II、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式IV化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式V化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式VI化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或V中任一者之化合物。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。
在實施例中，首先使第一經標記探針與信號放大試劑接觸，隨後與可偵測部分接觸。在實施例中，使第一經標記探針同時或實質上同時與信號放大試劑及可偵測部分接觸。
在實施例中，接觸包括：（i）形成包括信號放大試劑及可偵測部分之信號放大複合物；及（ii）使第一經標記探針與信號放大複合物接觸。在實施例中，可偵測部分包括用於結合部分之多個結合位點及/或結合部分包括用於可偵測部分之多個結合位點，且信號放大複合物包括複數種信號放大試劑，且其中各信號放大試劑結合至一或多個可偵測部分。在實施例中，第一複合物與信號放大複合物同時或實質上同時形成。在實施例中，第一複合物與信號放大複合物依序形成。在實施例中，第一複合物形成於表面上，且信號放大複合物形成於單獨反應罐或容器中。
在其中結合部分包括寡核苷酸結合部分且可偵測部分包括與寡核苷酸結合部分之互補寡核苷酸的實施例中，該方法進一步包括在結合至可偵測部分之前增加寡核苷酸結合部分長度。在實施例中，增加寡核苷酸結合部分長度包括使寡核苷酸結合部分與另一寡核苷酸接合。在實施例中，增加寡核苷酸結合部分長度包括使寡核苷酸結合部分與另一寡核苷酸雜交，其中另一寡核苷酸之至少一部分包括與寡核苷酸結合部分之互補序列。在實施例中，另一寡核苷酸包括超過一個與可偵測部分之互補序列，藉此允許可偵測部分之超過一個複本結合至第二複合物且進一步放大分析信號，如本文實施例中所描述。
在實施例中，該方法包括量測表面上之第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記與第二可偵測標記可偵測地不同。在實施例中，該方法包括分別量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括ECL標記，且量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
在實施例中，該方法包括量測表面上之第二可偵測標記之量。在實施例中，第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第二可偵測標記包括ECL標記，且量測第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
II.B. 包括酶之信號放大試劑
在實施例中，使第一經標記探針與以下接觸：（1）特異性結合至第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑及（2）酶之受質。
在實施例中，信號放大試劑包括作用於受質之酶。在實施例中，酶為辣根過氧化酶（HRP）、鹼性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶（GO）、乙醯膽鹼酯酶、過氧化氫酶或β-內醯胺酶。
在實施例中，信號放大試劑包括作用於酶之受質的酶。在實施例中，酶例如經由氧化、還原、水解或其組合而結合至受質且作用於受質以產生可偵測信號。在實施例中，可偵測信號包括顯色信號、化學發光、螢光或其組合。在實施例中，酶為HRP、AP或β-半乳糖苷酶。在實施例中，酶為HRP，且可偵測部分為TMB、ABTS或OPD。在實施例中，結合部分為AP，且可偵測部分為PNPP。在實施例中，結合部分為β-半乳糖苷酶，且可偵測部分為ONPG。HRP之受質之另外的非限制性實例包含諸如SUPERSIGNAL™之化學發光受質及諸如QUANTABLU™、QUANTARED™及AMPLEX™紅之螢光受質。AP之受質之另外的非限制性實例包含化學發光受質CDP™及DYNALIGHT™。本文進一步描述用於包含TMB、ABTS、OPD、PNPP及ONPG之各種酶受質之偵測方法。
在實施例中，該方法包括量測酶活性。在實施例中，量測包括量測在酶作用於受質後產生之可偵測信號。在實施例中，可偵測信號係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，受質為TMBM、ABTS、OPD、PNPP或ONPG且在與酶反應後產生顯色信號。在實施例中，受質在與酶反應後產生螢光信號。在實施例中，受質在與酶反應後產生化學發光信號。在實施例中，使用該量之經量測可偵測信號來判定樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測可偵測信號來測定樣本中分析物之量。
II.C. 包括第二可偵測標記之信號放大試劑
在實施例中，使第一經標記探針與特異性結合至第一可偵測標記且包括第二可偵測標記之信號放大試劑接觸。
本文進一步描述第二可偵測標記。在實施例中，第二可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來偵測。在實施例中，第二可偵測標記包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，經取代之聯吡啶配位體為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個共價連接至經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個共價連接至經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，有機金屬錯合物包括釕、鋨或錸。
在實施例中，第二可偵測標記包括式II化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式III化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式IV化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式V化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式VI化合物。
在實施例中，經標記探針之第一可偵測標記與信號放大試劑之第二可偵測標記相同。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式II化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式III化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式IV化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式V化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式VI化合物。
在實施例中，第一可偵測標記與第二可偵測標記不同。在實施例中，一旦第一可偵測標記與信號放大試劑結合，則其為不可偵測的。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記而非第二可偵測標記。在實施例中，第一可偵測標記包括式II化合物，且第二可偵測標記包括式III、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式III化合物，且第二可偵測標記包括式II、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式IV化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式V化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式VI化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或V中任一者之化合物。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。
在實施例中，該方法包括量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記與第二可偵測標記可偵測地不同。在實施例中，該方法包括分別量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括ECL標記，且量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
在實施例中，該方法包括量測第二可偵測標記之量。在實施例中，第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第二可偵測標記包括ECL標記，且量測第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
II.D. 包括第二核酸探針之信號放大試劑
在實施例中，使第一經標記探針與特異性結合至第一可偵測標記且包括第二核酸探針之信號放大試劑接觸。在實施例中，該方法包括在表面上形成包括第一經標記探針及信號放大試劑之第二複合物。
在實施例中，該方法包括延伸第二核酸探針以形成第二延伸序列。在實施例中，延伸包括使第二核酸探針與另一寡核苷酸接合以形成第二延伸序列。在實施例中，延伸包括使第二核酸探針與另一寡核苷酸雜交以形成第二延伸序列，其中另一寡核苷酸之至少一部分包括與第二核酸探針之互補序列。在實施例中，延伸包括使第二核酸探針結合至用於延伸反應之模板寡核苷酸以形成第二延伸序列。在實施例中，第二核酸探針為用於延伸反應之引子。在實施例中，延伸反應包括PCR、LCR、SDA、3SR、等溫擴增（諸如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增）或其組合。在實施例中，延伸包括使第二核酸探針結合至模板寡核苷酸且藉由PCR、LCR、SDA、3SR、等溫擴增（諸如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增）或其組合延伸第二核酸探針。在實施例中，延伸包括使第二核酸探針結合至模板寡核苷酸且藉由PCR延伸第二核酸探針。在實施例中，延伸包括使第二核酸探針結合至模板寡核苷酸，形成環狀模板寡核苷酸（例如藉由使線性模板寡核苷酸接合），且藉由滾環擴增延伸第二核酸探針。
在實施例中，第二延伸序列包括第二錨定區。在實施例中，第二錨定區結合至表面上之第二錨定試劑。在實施例中，在本文所描述之第一複合物形成之前、期間或之後，第二錨定試劑固定在表面上。在實施例中，在本文所描述之第二複合物形成之前、期間或之後，第二錨定試劑固定在表面上。在實施例中，在該方法之步驟（a）之前，第二錨定試劑固定至表面。在實施例中，在形成第二延伸序列之前，第二錨定試劑固定至表面。在實施例中，在量測第二延伸序列之量之前，第二錨定試劑固定至表面。在實施例中，第二錨定試劑經由硫酯、硫醚、二硫化物或其組合固定至表面。在實施例中，第二錨定試劑經由如本文進一步描述之靶向劑固定至表面。
在實施例中，第二錨定試劑包括寡核苷酸、適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基。在實施例中，第二錨定試劑包括適體配位體，且第二錨定區包括適體。在實施例中，第二錨定試劑包括寡核苷酸結合蛋白，且第二錨定區包括寡核苷酸序列。在實施例中，第二錨定試劑包括單股寡核苷酸。在實施例中，第二錨定試劑包括雙股寡核苷酸。在實施例中，第二錨定試劑及第二錨定區包括互補寡核苷酸。在實施例中，第二錨定試劑包括第二錨定寡核苷酸。在實施例中，第二錨定區包括與第二錨定寡核苷酸互補之第二錨定寡核苷酸補體。
在實施例中，使第二延伸序列結合至第二錨定試劑包括在錨定試劑與第二錨定區之間形成三螺旋。在實施例中，使第二延伸序列結合至第二錨定試劑包括在結合之前使第二錨定區變性以暴露單股寡核苷酸區；在結合之前使第二錨定區暴露於解螺旋酶活性；及/或在結合之前使第二錨定區暴露於核酸酶處理，其中第二錨定區包括一或多個經半抗原修飾之鹼基且第二錨定試劑包括一或多個半抗原特異性抗體；及/或第二錨定區包括一或多個經配位體修飾之鹼基且第二錨定試劑包括一或多個配位體特異性受體。
在實施例中，在與第二經標記探針接觸之前，使第二延伸序列結合至第二錨定試劑。在實施例中，在延伸第二核酸探針之後，使第二複合物結合至表面。在實施例中，第二延伸序列在距離表面上之第二複合物約1 nm至約500 nm、約5 nm至約250 nm、約10 nm至約200 nm或約15 nm至約150 nm內之位置處結合至第二錨定試劑。在實施例中，第二延伸序列在距離表面上之第二複合物小於1 μm之位置處結合至第二錨定試劑。在實施例中，第二延伸序列在距離表面上之第二複合物小於500 nm之位置處結合至第二錨定試劑。在實施例中，第二延伸序列在距離表面上之第二複合物小於200 nm之位置處結合至第二錨定試劑。
在實施例中，第一錨定區及第二錨定區包括相同寡核苷酸序列。在實施例中，第一錨定區及第二錨定區包括不同寡核苷酸序列。在實施例中，第一錨定試劑及第二錨定試劑包括相同寡核苷酸序列。在實施例中，第一錨定試劑及第二錨定試劑包括不同寡核苷酸序列。在實施例中，第一錨定區及第二錨定區結合至第一錨定試劑及/或第二錨定試劑之單獨部分。
在實施例中，該方法包括量測表面上之第一延伸序列、第二延伸序列或兩者之量。在實施例中，使第二延伸序列與包括第二可偵測標記之第二經標記探針接觸。在實施例中，第一經標記探針及第二經標記探針包括相同寡核苷酸序列。在實施例中，第一經標記探針及第二經標記探針包括不同寡核苷酸序列。
在實施例中，第二經標記探針包括第二可偵測標記中之超過一個。在實施例中，第二經標記探針包括第二可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在實施例中，包括第二可偵測標記之第二經標記探針結合至第二延伸序列。在實施例中，第二延伸序列及第二經標記探針包括互補寡核苷酸。在實施例中，第二延伸序列包括經修飾鹼基，且量測延伸序列之量包括使延伸序列與結合至經修飾鹼基之可偵測部分接觸。在實施例中，經修飾鹼基包括適體、適體配位體、抗體、抗原、配位體、受體、半抗原、抗原決定基或模擬抗原決定基，且可偵測部分包括經修飾鹼基之結合搭配物及第二可偵測標記。在實施例中，經修飾鹼基包括鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，且可偵測部分包括生物素及第二可偵測標記。在實施例中，經修飾鹼基包括生物素，且可偵測部分包括抗生物素蛋白及第二可偵測標記。
本文進一步描述第二可偵測標記。在實施例中，第二可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來偵測。在實施例中，第二可偵測標記包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，經取代之聯吡啶配位體為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個共價連接至第二經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個共價連接至第二經標記探針之取代基的聯吡啶。在實施例中，有機金屬錯合物包括釕、鋨或錸。
在實施例中，第二可偵測標記包括式II化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式III化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式IV化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式V化合物。在實施例中，第二可偵測標記包括式VI化合物。
在實施例中，偵測試劑之第一可偵測標記與第二經標記探針之第二可偵測標記相同。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括如本文所描述之ECL標記。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式II化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式III化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式IV化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式V化合物。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括式VI化合物。
在實施例中，第一可偵測標記與第二可偵測標記不同。在實施例中，一旦第一可偵測標記與信號放大試劑結合，則其為不可偵測的。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至第一可偵測標記而非第二可偵測標記。在實施例中，第一可偵測標記包括式II化合物，且第二可偵測標記包括式III、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式III化合物，且第二可偵測標記包括式II、IV、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式IV化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、V或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式V化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或VI中任一者之化合物。在實施例中，第一可偵測標記包括式VI化合物，且第二可偵測標記包括式II、III、IV或V中任一者之化合物。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。
在實施例中，該方法包括藉由量測表面上之第一可偵測標記及第二可偵測標記之量來量測第一延伸序列及第二延伸序列之量。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記與第二可偵測標記可偵測地不同。在實施例中，該方法包括分別量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記各自包括ECL標記，且量測第一可偵測標記及第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
在實施例中，該方法包括藉由量測表面上之第二可偵測標記之量來量測第二延伸序列之量。在實施例中，第二可偵測標記係藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測。在實施例中，第二可偵測標記包括ECL標記，且量測第二可偵測標記之量包括量測ECL信號。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來偵測樣本中分析物之存在。在實施例中，使用該量之經量測ECL信號來測定樣本中分析物之量。
表面
在實施例中，第一複合物包括捕捉試劑，且捕捉試劑固定至表面。在實施例中，第一複合物包括捕捉試劑，且捕捉試劑直接固定在表面上。在實施例中，捕捉試劑經由例如靶向劑之二級結合試劑間接固定在表面上。在實施例中，捕捉試劑連接至結合至固定在表面上之靶向劑的靶向劑補體。在實施例中，靶向劑補體直接結合至靶向劑。在實施例中，靶向劑及靶向劑補體包括互補寡核苷酸、受體-配位體對、抗原-抗體對、半抗原-抗體對、抗原決定基-抗體對、模擬抗原決定基-抗體對、適體-目標分子對、雜交搭配物或嵌入劑-目標分子對。在實施例中，靶向劑及靶向劑補體為交叉反應性部分，例如硫醇及順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺；醛及醯肼；或疊氮化合物及炔烴或環炔。在實施例中，靶向劑為生物素，且靶向劑補體為抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。
在實施例中，靶向劑補體經由靶向橋接劑結合至靶向劑，靶向橋接劑為靶向劑及靶向劑補體兩者之結合搭配物。在實施例中，靶向橋接劑包括多個結合位點。在實施例中，靶向橋接劑為鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，且靶向劑及靶向劑補體各自為生物素。
在實施例中，包括捕捉試劑、分析物及偵測試劑之第一複合物係在單個步驟中形成。在實施例中，包括捕捉試劑、分析物以及第一偵測試劑及第二偵測試劑之第一複合物係在單個步驟中形成。在實施例中，第一複合物係在一或多個步驟中形成。在實施例中，第一複合物形成於表面上。在實施例中，第一複合物形成於溶液中，隨後固定至表面。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使分析物結合至固定在表面上之捕捉試劑，隨後使偵測試劑結合至分析物以在表面上形成第一複合物。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使分析物結合至固定在表面上之捕捉試劑，隨後使第一偵測試劑及第二偵測試劑結合至分析物以在表面上形成第一複合物。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使分析物同時結合至固定在表面上之捕捉試劑及偵測試劑。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使分析物同時結合至固定在表面上之捕捉試劑以及第一偵測試劑及第二偵測試劑中之一或兩者。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使分析物在溶液中結合至偵測試劑以形成分析物-偵測試劑複合物，隨後使分析物-偵測試劑複合物結合至表面上之捕捉試劑。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使分析物在溶液中結合至第一偵測試劑及第二偵測試劑以形成分析物-偵測試劑複合物，隨後使分析物-偵測試劑複合物結合至表面上之捕捉試劑。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使分析物在溶液中結合至捕捉試劑及偵測試劑，隨後使捕捉試劑固定至表面，如本文所描述。在實施例中，第一複合物係藉由以下形成：使分析物在溶液中結合至捕捉試劑以及第一偵測試劑及第二偵測試劑，隨後使捕捉試劑固定至表面，如本文所描述。在其中第一複合物包括第一偵測試劑及第二偵測試劑之實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑可同時或依序結合至分析物。
在包括錨定試劑（例如如本文所描述之用於結合至延伸序列之錨定試劑、用於結合至第一延伸序列之第一錨定試劑及/或用於結合至第二延伸序列之第二錨定試劑）的實施例中，錨定試劑固定至表面。在實施例中，錨定試劑直接固定在表面上。在實施例中，錨定試劑經由例如如本文所描述之靶向試劑之二級結合試劑間接固定在表面上。在實施例中，選擇用於錨定試劑之靶向劑及靶向劑補體以使得與錨定試劑相關之靶向劑及靶向劑補體實質上對與捕捉試劑相關之靶向劑及靶向劑補體不具有交叉反應性。在實施例中，相同的靶向劑及靶向補體對與捕捉試劑及錨定試劑相關。在實施例中，靶向劑補體經由如本文所描述之靶向橋接劑結合至靶向劑。在實施例中，在捕捉試劑固定至表面之同時或實質上同時，錨定試劑固定至表面。在實施例中，在捕捉試劑固定至表面之前，錨定試劑固定至表面。在實施例中，在捕捉試劑固定至表面之後，錨定試劑固定至表面。在實施例中，在本文所描述之第一複合物形成之前、期間或之後，錨定試劑固定至表面。在實施例中，在形成本文所描述之延伸序列之前，錨定試劑固定至表面。在實施例中，在量測量測延伸序列之量之前，錨定試劑固定至表面。
在實施例中，表面包括粒子。在實施例中，表面包括多孔盤之孔。在實施例中，表面包括複數個不同的結合域，且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之兩個不同的結合域上。在其中表面包括孔之實施例中，孔包括複數個不同的結合域，且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之兩個不同的結合域上。在實施例中，表面包括複數個不同的結合域，且捕捉試劑及錨定試劑位於表面上之相同的結合域上。在其中表面包括孔之實施例中，孔包括複數個不同的結合域，且捕捉試劑及錨定試劑位於孔內之相同的結合域上。在實施例中，捕捉試劑係在表面上之錨定試劑之約1 nm至約500 nm、約5 nm至約250 nm、約10 nm至約200 nm或約15 nm至約150 nm內。在實施例中，捕捉試劑距離表面上之錨定試劑小於1 μm。在實施例中，捕捉試劑距離表面上之錨定試劑小於500 nm。在實施例中，捕捉試劑距離表面上之錨定試劑小於200 nm。
在其中偵測試劑包括形成第一延伸序列之第一核酸探針且信號放大試劑包括形成第二延伸序列之第二核酸探針的實施例中，表面包括能夠結合至第一延伸序列之第一錨定試劑及能夠結合至第二延伸序列之第二錨定試劑。在實施例中，第一錨定試劑及第二錨定試劑位於表面上之不同的結合域上。在實施例中，第一錨定試劑及第二錨定試劑處於表面上之相同的結合域中。在實施例中，捕捉試劑處於與第一錨定試劑及第二錨定試劑中之各者不同的另一結合域中。在實施例中，捕捉試劑處於與第一錨定試劑及第二錨定試劑相同的結合域中。
在實施例中，表面包括電極。在實施例中，電極為碳墨電極。在實施例中，量測第二可偵測標記之量包括向電極施加電壓波形（例如電位）以產生ECL信號。在實施例中，表面包括粒子，且該方法包括在電極上集合粒子且向電極施加電壓波形（例如電位）以產生ECL信號。
多工方法
在實施例中，該方法為能夠偵測多種分析物之多工方法。在實施例中，多工方法同時偵測多種分析物。在實施例中，多工方法包括重複一或多個方法步驟以量測多種分析物。在實施例中，對各分析物並行地執行方法步驟中之各者。在實施例中，各分析物結合至不同的捕捉試劑及/或偵測試劑。在實施例中，藉由使（多個）表面與包括多種分析物之樣本接觸來並行地執行各分析物與其對應捕捉試劑之結合。在實施例中，多種分析物以不同量（例如濃度）存在於樣本中。舉例而言，一種分析物以比另一分析物低或高10、100、1000、10000、100000、10
6、10
7、10
8、10
9或10
10倍之濃度存在。因此，在實施例中，本文所揭示之多工方法之優點在於其能夠偵測範圍為約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL、約0.0005 pg/mL至約50000 pg/mL、約0.001 pg/mL至約10000 pg/mL、約0.005 pg/mL至約5000 pg/mL、約0.01 pg/mL至約1000 pg/mL、約0.05 pg/mL至約500 pg/mL、約0.1 pg/mL至約100 pg/mL、約0.5 pg/mL至約50 pg/mL或約1 pg/mL至約10 pg/mL之分析物濃度。在實施例中，最高豐度分析物以大於或約10 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於約10 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以大於或約1 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以大於或約0.5 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於0.5 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以大於或約0.3 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於0.3 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以大於或約0.1 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於0.1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以約1 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以約0.0001 pg/mL至約1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以約0.1 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以約0.0001 pg/mL至約0.1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，存在於樣本中之最高豐度分析物之量比存在於樣本中之最低豐度分析物之量高約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍、約250倍、約500倍、約750倍、約1000倍、約10000倍、約100000倍、約10
6倍、約10
7倍、約10
8倍、約10
9倍、約10
10倍或大於10
10倍。
在實施例中，本發明提供偵測樣本中之多種所關注分析物之方法，其中分析物以範圍為約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在，該方法包括：形成如本文所描述之複數種第一複合物，其中各第一複合物包括獨特分析物及用於獨特分析物之捕捉試劑及偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑；量測第一複合物之量（例如藉由量測如本文所描述之第一可偵測標記之量），藉此偵測樣本中之較高豐度分析物；使複數種第一複合物與如本文所描述之信號放大試劑接觸，其中信號放大試劑包括結合包括第二可偵測標記之可偵測部分的結合部分，或其中信號放大試劑包括作用於酶之受質的酶，或其中信號放大試劑包括形成延伸序列之核酸探針；及量測如本文所描述之第二可偵測標記之量、酶活性或延伸序列之量（例如藉由量測結合至延伸序列之第二可偵測標記），藉此偵測樣本中之較低豐度分析物；其中存在於樣本中之較高豐度分析物之量比較低豐度分析物之量高約1.5倍、約2倍、約5倍、約10倍、約25倍、約50倍、約75倍、約100倍、約500倍、約1000倍、約10
6倍、約10
7倍、約10
8倍、約10
9倍或約10
10倍，及/或其中較高豐度分析物以約1 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以約0.0001 pg/mL至約1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，所量測之第一可偵測標記與第二可偵測標記之量實質上相同。在實施例中，所量測之第一可偵測標記及第二可偵測標記之量係在約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%或約1%內。在實施例中，信號放大試劑放大來自較低豐度分析物之分析信號（例如對應於第二可偵測標記之量），以使得較高豐度分析物及較低豐度分析物提供在分析裝置之偵測極限內之分析信號。因此，信號放大試劑使得能夠使用相同分析裝置且在相同稀釋度之樣本中，亦即不要求為了量測個別分析物而稀釋或濃縮樣本，來偵測呈廣泛範圍之濃度（例如約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL）之多種分析物。
在實施例中，表面包括複數個結合域，且各分析物在不同結合域中形成複合物（例如如本文所描述之第一複合物）。在實施例中，複數個結合域處於單個表面上。在實施例中，表面包括多孔盤，且各結合域處於不同孔中。在實施例中，表面包括多孔盤之孔，且各結合域處於孔之單獨部分中。在實施例中，複數個結合域處於一或多個表面上。在實施例中，表面包括粒子，且各結合域處於不同粒子上。在實施例中，粒子係以粒子陣列排列。在實施例中，對粒子進行編碼以允許鑑別特定粒子且在各結合域間區分開來。
在實施例中，結合域可彼此分離。在實施例中，表面為包括可分孔之多孔盤，且各結合域處於不同孔中。在實施例中，表面包括一或多個粒子，且各粒子可與剩餘粒子分離。分隔粒子之方法係本領域中已知的且包含例如流動式細胞測量術、磁力分離、親和分離及其類似分離方法。在實施例中，在被偵測到之後自反應混合物移除包括較高豐度分析物之第一複合物。在實施例中，在被偵測到之後自表面分離及/或移除包括較高豐度分析物之第一複合物。在實施例中，分離及/或移除包括例如藉由選擇性洗滌其結合域來自其結合域移除包括較高豐度分析物之第一複合物。在實施例中，分離及/或移除包括自例如如本文所描述之可分孔及/或可分離粒子之剩餘結合域分離含有包括較高豐度分析物之第一複合物的結合域。
在實施例中，各結合域包括能夠結合至靶向劑補體之靶向劑，且各捕捉試劑及/或錨定試劑（例如如本文所描述之用於結合至延伸序列之錨定、用於結合至第一延伸序列之第一錨定試劑及/或用於結合至第二延伸序列之第二錨定試劑）包括能夠結合至連接劑之補充連接劑。在實施例中，捕捉試劑及錨定試劑藉由以下固定在結合域中：（1）經由補充連接劑使捕捉試劑及錨定試劑結合至與連接劑連接之靶向試劑補體；及（2）使（1）之產物結合至包括靶向劑之結合域，其中（i）各結合域包括不同的靶向劑，及（ii）各靶向試劑補體選擇性結合至靶向試劑中之一者，藉此使各捕捉試劑及錨定試劑固定至其相關結合域。
在實施例中，作為連接劑及補充連接劑兩者之結合搭配物的視情況選用之橋接劑橋接連接劑及補充連接劑，以使得各自結合至其各別靶向劑補體之捕捉試劑及/或錨定試劑與結合域接觸且經由橋接劑、捕捉試劑及/或錨定試劑中之各者上之靶向劑補體及結合域中之各者上之靶向劑結合至其各別靶向劑。
在實施例中，靶向劑及靶向劑補體為選自以下之結合搭配物對中之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、鏈黴抗生物素蛋白-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。在實施例中，靶向劑及靶向劑補體為交叉反應性部分，例如硫醇及順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺；醛及醯肼；疊氮化合物及炔烴或環炔；烯烴及順丁烯二醯亞胺；硫醇及二硫化物；醛或酮及胺；或反式環辛烯及四
。在實施例中，靶向劑為生物素，且靶向劑補體為抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。
在實施例中，連接劑及補充連接劑為選自以下之結合搭配物對中之兩個成員：抗生物素蛋白-生物素、鏈黴抗生物素蛋白-生物素、抗體-半抗原、抗體-抗原、抗體-抗原決定基標籤、核酸-互補核酸、適體-適體目標及受體-配位體。在實施例中，連接劑及補充連接劑為交叉反應性部分，例如硫醇及順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺；醛及醯肼；疊氮化合物及炔烴或環炔；烯烴及順丁烯二醯亞胺；硫醇及二硫化物；醛或酮及胺；或反式環辛烯及四
。在實施例中，連接劑為抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白，且補充連接劑為生物素。在實施例中，靶向劑及靶向劑補體為互補寡核苷酸。在實施例中，靶向劑補體為鏈黴抗生物素蛋白，靶向劑為生物素，且連接劑及補充連接劑為互補寡核苷酸。
在包括橋接劑之實施例中，橋接劑為鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，且連接劑及補充連接劑各自為生物素。進行多工分析之方法進一步描述於例如US 10,189,023及US 10,201,812中。
分析物及樣本
在實施例中，樣本為生物樣本。在實施例中，樣本為環境樣本。在實施例中，樣本係獲自人類個體。在實施例中，樣本係獲自動物個體。在實施例中，樣本包括哺乳動物流體、分泌物或排泄物。在實施例中，樣本為經純化哺乳動物流體、分泌物或排泄物。在實施例中，哺乳動物流體、分泌物或排泄物為全血、血漿、血清、痰、淚液（lachrymal fluid）、淋巴液、滑液、胸膜滲出液、尿液、汗液、腦脊髓液、腹水、乳汁、糞便、支氣管灌洗物、唾液、羊水、鼻分泌物、陰道分泌物、表面生物檢體、精子、精液（semen/seminal fluid）、傷口分泌物及排泄物或其提取物、純化物或其稀釋物。另外的例示性樣本包含但不限於生理樣本、含有諸如黏膜拭子之細胞懸浮液、組織抽出物、組織均質物、細胞培養物及細胞培養物上清液之樣本。在實施例中，樣本為全血、血清、血漿、腦脊髓液、尿液、唾液或其提取物或純化物或其稀釋物。在實施例中，樣本為血清或血漿。在實施例中，血漿處於EDTA、肝素或檸檬酸鹽中。
樣本可獲自本文所描述之單一來源，或可含有來自兩個或更多個來源之混合物。
可使用本發明之方法量測之分析物包含但不限於蛋白質、毒素、核酸、微生物體、病毒、細胞、真菌、孢子、碳水化合物、脂質、醣蛋白、脂蛋白、多醣、藥物、激素、類固醇；以上分子之營養物、代謝物及任何經改質衍生物；或包括以上分子中之一或多者的任何複合物；或其組合。樣本中所關注分析物之含量可指示疾病或疾病病況，或其可簡單地指示個體是否暴露於該分析物。
在實施例中，樣本包括多種所關注分析物。在實施例中，多種分析物以不同量（例如濃度）存在於樣本中。舉例而言，一種分析物以比另一分析物低或高10、100、1000、10000、100000、10
6、10
7、10
8、10
9或10
10倍之濃度存在。因此，在實施例中，本文所揭示之方法之優點在於其能夠偵測範圍為約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL、約0.0005 pg/mL至約50000 pg/mL、約0.001 pg/mL至約10000 pg/mL、約0.005 pg/mL至約5000 pg/mL、約0.01 pg/mL至約1000 pg/mL、約0.05 pg/mL至約500 pg/mL、約0.1 pg/mL至約100 pg/mL、約0.5 pg/mL至約50 pg/mL或約1 pg/mL至約10 pg/mL之分析物濃度。在實施例中，本文所揭示之方法之另一優點在於其能夠在相同稀釋度之樣本中，亦即不要求為了量測個別分析物而稀釋或濃縮樣本，來偵測呈不同濃度（例如約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL）之多種分析物。在實施例中，本文所揭示之方法之另一優點在於其能夠使用包括第一可偵測標記之相同的偵測試劑（或相同的第一及第二偵測試劑）用於待偵測之呈在約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL之間的任何濃度之任何特定分析物。
在實施例中，最高豐度分析物以大於或約10 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於約10 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以大於或約1 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以大於或約0.5 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於0.5 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以大於或約0.3 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於0.3 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以大於或約0.1 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以小於0.1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以約1 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以約0.0001 pg/mL至約1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，最高豐度分析物以約0.1 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在於樣本中，且最低豐度分析物以約0.0001 pg/mL至約0.1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，存在於樣本中之最高豐度分析物之量比存在於樣本中之最低豐度分析物之量高約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍、約250倍、約500倍、約750倍、約1000倍、約10000倍、約100000倍、約10
6倍、約10
7倍、約10
8倍、約10
9倍、約10
10倍或大於10
10倍。
在實施例中，分析物為胞外體。在實施例中，樣本包括經純化胞外體。亦稱為胞外囊泡或EV之胞外體為經大部分細胞類型釋放之小膜囊泡。胞外體之釋放及後續吸收為細胞間通訊之方法且在許多生理及病理過程之調控中起作用。已顯示胞外體含有廣泛多種的信號傳導分子，包含但不限於表面結合蛋白及胞質蛋白、脂質、mRNA及miRNA，且已表明此等物種之身分及其於各胞外體中之濃度可用於推斷其細胞起源及功能。因此，患者之總胞外體群體之基因體或蛋白質體剖析可為尤其包含癌症、感染性疾病、腎病及肝病以及創傷性腦損傷之各種病理病況提供有價值的預後資訊。
在實施例中，捕捉試劑及偵測試劑或捕捉試劑及第一偵測試劑及第二偵測試劑結合至胞外體表面上之表面標記物。舉例而言，經大部分胞外體表現之常見蛋白質包含但不限於CD9、CD63、CD81、Hsp70、PDCD6IP及Tsg101。在實施例中，捕捉試劑及偵測試劑或捕捉試劑及第一偵測試劑及第二偵測試劑結合至經由特異性細胞類型釋放之胞外體特異性表現的標記物。舉例而言，該方法可用於偵測例如與疾病相關或處於罹患疾病之風險下之特定胞外體亞群。在實施例中，捕捉試劑及偵測試劑或捕捉試劑及第一偵測試劑及第二偵測試劑結合至疾病相關胞外體表面標記物。
在實施例中，分析物為例如貨物蛋白、脂質或核酸之胞外體內部分析物。在實施例中，胞外體在結合至捕捉試劑之前或之後、但在添加偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑之前經滲透。
額外實施例
在實施例中，本文所提供之方法係呈競爭性分析格式。一般而言，例如競爭性免疫分析或競爭性抑制分析之競爭性分析、分析物及競爭物競爭結合至捕捉試劑及/或偵測試劑（或第一偵測試劑及第二偵測試劑）。在該等分析中，通常藉由直接量測競爭物來間接量測分析物。如本文所使用之「競爭物」係指能夠與分析物結合至相同的捕捉試劑及/或偵測試劑（或第一偵測試劑及第二偵測試劑）以使得捕捉試劑及/或偵測試劑（或第一偵測試劑及第二偵測試劑）僅可結合分析物或競爭物而非兩者的化合物。在實施例中，競爭性分析係用於偵測及量測不能夠結合超過一種捕捉試劑及/或偵測試劑（或第一偵測試劑及第二偵測試劑）之分析物，例如小分子分析物或不具有超過一個不同結合位點之分析物。在實施例中，競爭性分析係用於偵測及量測抗體生物標記物。競爭性免疫分析之實例包含US 4,235,601、US 4,442,204及US 5,028,535中所描述之競爭性免疫分析。
本文方法可在諸如分析盤之單個孔的單個分析腔室中進行。本文方法亦可在分析筒之分析腔室中進行。用於進行適用於本發明之分析量測之例如分析盤或分析筒之分析模組、方法及設備描述於例如US 8,343,526；US 9,731,297；US 9,921,166；US 10,184,884；US 10,281,678；US 10,272,436；US 2004/0022677；US 2004/0189311；US 2005/0052646；US 2005/0142033；US 2018/0074082；及US 2019/0391170中。
系統
在實施例中，本發明提供用於執行如本文所描述之偵測樣本中之所關注分析物之方法的分析系統。在實施例中，樣本包括多種分析物，其中分析物以範圍為約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在。在實施例中，樣本包括一或多種濃度比最低豐度分析物高10、100、1000、10000、100000、10
6、10
7、10
8、10
9或10
10倍之分析物。在實施例中，分析系統能夠利用如本文所描述之捕捉試劑、偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑以及信號放大試劑偵測在約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL之總體濃度範圍內之分析物。在實施例中，分析系統能夠利用捕捉試劑及偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑偵測呈大於或約1 pg/mL之濃度之分析物，且分析系統進一步能夠利用捕捉試劑、偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑以及信號放大試劑偵測呈小於1 pg/mL之濃度之分析物。在實施例中，分析系統採用相同的包括第一可偵測標記之偵測試劑或相同的各自包括第一可偵測標記之第一偵測試劑及第二偵測試劑來偵測呈在約0.0001 pg/mL與約100000 pg/mL之間的任何濃度之分析物。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。
在實施例中，分析系統包括：至少一個記憶體單元；至少一個處理單元，其根據至少一個記憶體單元上之指令經程式化；及至少一個分析系統組件，其經組態以受至少一個處理單元控制。在實施例中，至少一個處理單元經組態以控制至少一個分析系統組件來執行樣本中之分析物之量測。在實施例中，至少一個分析系統組件為讀取器儀器。在實施例中，分析系統包括超過一個讀取器儀器。在實施例中，量測包括量測可偵測標記。在實施例中，可偵測標記存在於如本文所描述之偵測試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑、經標記探針或可偵測部分上。在實施例中，至少一個處理單元經組態以控制至少一個分析系統組件來執行以下中之一或兩者：如本文所描述之較高豐度分析物之第一次量測；及如本文所描述之較低豐度分析物之第二次量測。在實施例中，存在於樣本中之較高豐度分析物之量比存在於樣本中之較低豐度分析物之量高約1.5倍、約2倍、約5倍、約10倍、約25倍、約50倍、約75倍、約100倍、約500倍、約1000倍、約10000倍、約100000倍、約10
6倍、約10
7倍、約10
8倍、約10
9倍、約10
10倍或大於10
10倍。在實施例中，較高豐度分析物以約1 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在於樣本中且較低豐度分析物以約0.0001 pg/mL至約1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，較高豐度分析物及較低豐度分析物能夠在相同稀釋度之樣本中被偵測到。在實施例中，使用包括ECL標記之偵測試劑偵測較高豐度分析物。在實施例中，使用各自包括ECL標記之第一偵測試劑及第二偵測試劑偵測較高豐度分析物。在實施例中，使用（i）包括ECL標記之偵測試劑及（ii）特異性結合至ECL標記之信號放大試劑偵測較低豐度分析物。在實施例中，使用（i）各自包括ECL標記之第一偵測試劑及第二偵測試劑及（ii）特異性結合至ECL標記之信號放大試劑偵測較低豐度分析物。
在實施例中，本發明提供一或多種非暫時性電腦可讀媒體。在實施例中，一或多種非暫時性電腦可讀媒體之上儲存有指令，該等指令在由至少一個處理單元執行時使至少一個處理單元：經由控制分析系統執行樣本中之分析物之量測。在實施例中，量測包括量測可偵測標記。在實施例中，可偵測標記存在於如本文所描述之偵測試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑、經標記探針或可偵測部分上。在實施例中，至少一個處理單元執行以下中之一或兩者：如本文所描述之較高豐度分析物之第一次量測；及如本文所描述之較低豐度分析物之第二次量測。在實施例中，存在於樣本中之較高豐度分析物之量比存在於樣本中之較低豐度分析物之量高約1.5倍、約2倍、約5倍、約10倍、約25倍、約50倍、約75倍、約100倍、約500倍、約1000倍、約10000倍、約100000倍、約10
6倍、約10
7倍、約10
8倍、約10
9倍、約10
10倍或大於10
10倍。在實施例中，該量之較高豐度分析物以約1 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在於樣本中，且較低豐度分析物以約0.0001 pg/mL至約1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，使用包括ECL標記之偵測試劑偵測較高豐度分析物。在實施例中，使用各自包括ECL標記之第一偵測試劑及第二偵測試劑偵測較高豐度分析物。在實施例中，使用（i）包括ECL標記之偵測試劑及（ii）特異性結合至ECL標記之信號放大試劑偵測較低豐度分析物。在實施例中，使用（i）各自包括ECL標記之第一偵測試劑及第二偵測試劑及（ii）特異性結合至ECL標記之信號放大試劑偵測較低豐度分析物。
在實施例中，第一次量測為如本文所描述之第一可偵測標記之量測。在實施例中，第一可偵測標記存在於偵測試劑上。在實施例中，第一可偵測標記存在於第一偵測試劑及第二偵測試劑中之各者上。在實施例中，結合至藉由延伸偵測試劑之核酸探針而形成之延伸序列的經標記探針包括第一可偵測標記。在實施例中，第二次量測為如本文所描述之可偵測部分之量測。在實施例中，第二次量測為如本文所描述之酶活性之量測。在實施例中，第二次量測為如本文所描述之第二可偵測標記之量測。在實施例中，第二可偵測標記存在於結合至信號放大試劑之可偵測部分上。在實施例中，結合至藉由延伸信號放大試劑之核酸探針而形成之延伸序列的經標記探針包括第二可偵測標記。本文描述可偵測部分、酶活性、經標記探針以及第一可偵測標記及第二可偵測標記。
在實施例中，第一次量測及/或第二次量測為可偵測信號之量測。在實施例中，第一次量測及/或第二次量測為光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光（ECL）、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合之量測。在實施例中，第一可偵測標記及第二可偵測標記中之各者為ECL標記。在實施例中，第一次量測及第二次量測中之各者為ECL量測。在實施例中，第一次量測為ECL量測，且第二次量測為如本文所描述之酶活性之量測。在實施例中，第一次量測為ECL量測，且第二次量測為顯色信號、螢光或化學發光量測。
在實施例中，第一次量測之經量測絕對值係在第二次量測之經量測絕對值之約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%或約1%內，或與第二次量測之經量測絕對值實質上相同。在實施例中，第一次量測與第二次量測之間的系統之偵測上限及偵測下限未經調節。在實施例中，分析系統經組態以調節第一次量測與第二次量測之間的系統之偵測上限及偵測下限。
在實施例中，使包括多種分析物之樣本與包括一或多個結合域之表面接觸，其中各結合域包括用於獨特分析物之捕捉試劑。在實施例中，表面包括（i）一或多個包括較高豐度分析物之結合域及（ii）一或多個包括較低豐度分析物之結合域。在實施例中，存在於樣本中之較高豐度分析物之量比存在於樣本中之較低豐度分析物之量高約1.5倍、約2倍、約5倍、約10倍、約25倍、約50倍、約75倍、約100倍、約500倍、約1000倍、約10000倍、約100000倍、約10
6倍、約10
7倍、約10
8倍、約10
9倍、約10
10倍或大於10
10倍。在實施例中，該量之較高豐度分析物以約1 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在於樣本中，且較低豐度分析物以約0.0001 pg/mL至約1 pg/mL之濃度存在於樣本中。在實施例中，分析系統經組態以選擇性執行針對含有較高豐度分析物之結合域之第一次量測，且選擇性執行針對含有較低豐度分析物之結合域之第二次量測。在實施例中，分析系統經組態以選擇性執行針對結合域之第二次量測，該第二次量測之值低於第一次量測之預定義臨限值。在實施例中，依序執行第一次量測及第二次量測。在實施例中，分析系統經組態以執行：首先，含有較高豐度分析物之（多個）結合域之第一次量測；其次，含有較低豐度分析物之（多個）結合域之第二次量測。在實施例中，分析系統經組態以同時或實質上同時執行第一次量測及第二次量測。在實施例中，分析系統經組態以執行第一次量測且允許使用者確定是否執行第二次量測。在實施例中，分析系統經組態以執行第一次量測且例如基於在第一次量測中所量測之一或多種較高豐度分析物及/或較低豐度分析物之值自動地確定是否執行第二次量測。舉例而言，若第一次量測足以量測樣本中之較高豐度分析物及較低豐度分析物兩者，則可不執行第二次量測。
本文方法可手動、使用自動化技術或以上兩種方式執行。自動化技術可為部分自動化的，例如一或多個模組化儀器，或全積體自動化儀器。例示性自動化系統及設備描述於WO 2018/017156、WO 2017/015636及WO 2016/164477中。
在實施例中，用於執行本文方法之例如模組化系統及全積體系統之自動化系統包括以下中之一或多者：自動化子系統：包括硬體（例如個人電腦、膝上型電腦、硬體處理器、光碟、鍵盤、顯示器、印表機）、軟體（例如處理器，諸如驅動器、驅動器控制器及資料分析器）及/或資料庫之電腦子系統；用於樣本及/或試劑搬運之液體搬運子系統，例如包括機械移液手、注射器、攪拌設備、超音波混合設備及/或磁力混合設備；樣本、試劑及/或消耗品儲存及搬運子系統，例如包括機械操縱器、管或蓋或箔穿孔設備、蓋移除設備、諸如線性或環狀輸送機之輸送設備、管托架、盤載架、槽載架、移液管尖端載架、盤搖動器及/或離心機；例如基於流體及/或基於消耗品之分析反應子系統（諸如管及多孔盤）；容器及消耗品洗滌子系統，例如包括盤洗滌設備；例如流通槽型、管型及/或盤型磁力分離器或磁力粒子聚集器子系統；細胞及粒子偵測、分類及/或分離子系統，例如包括流式細胞儀及/或庫爾特計數器（Coulter counter）；偵測子系統，例如包括比色偵測器、比濁偵測器、螢光偵測器及/或ECL偵測器；溫度控制子系統，例如包括空氣處理系統、空氣冷卻系統、空氣升溫系統、風扇、鼓風機及/或水浴；廢棄物子系統，例如包括液體及/或固體廢棄物容器；總體唯一識別符（global unique identifier；GUI）偵測子系統，例如包括1D及/或2D條碼掃描器，諸如平床及棒型掃描器。在實施例中，自動化系統進一步包括模組化分析性子系統或全積體分析性子系統，例如層析系統，諸如高效液相層析（HPLC）或快速蛋白質液相層析（FPLC）系統；或質譜儀。
在實施例中，執行樣本鑑別及製備之系統或模組與執行及/或偵測本文分析之系統或模組組合、鄰接、相鄰及/或以機械方式連接或耦接。相同類型之多個模組化系統可經組合以增加通量。在實施例中，模組化系統與執行諸如化學分析、生物化學分析及/或核酸分析之其他類型之分析的模組組合。
在實施例中，自動化系統允許分批、連續、隨機存取及/或即時工作流程以及單一、中等及高樣本通量。
在實施例中，自動化系統包括以下裝置中之一或多者：盤密封機（例如ZYMARK）、盤洗滌器（例如BIOTEK、TECAN）、試劑分配器、自動化移液台及/或液體搬運台（例如TECAN、ZYMARK、LABSYSTEMS、BECKMAN、HAMILTON）、培育箱（例如ZYMARK）、盤搖動器（例如Q.INSTRUMENTS、INHECO、THERMOFISHER SCIENTIFIC）、盤讀取器（例如MESO® SECTOR S 600、MESO® QUICKPLEX SQ 120及US 6,977,722中所描述之盤讀取器）、化合物庫模組、樣本儲存模組及/或化合物及/或樣本擷取模組。在實施例中，此等裝置中之一或多者經由機械總成耦接至自動化系統以使得可自動執行整個分析過程。在實施例中，將容器（例如盤）在設備與本文所描述之各種裝置（例如一堆盤）之間手動移動。
在實施例中，自動化系統經組態以執行以下功能中之一或多者：將諸如盤之消耗品移動至偵測子系統中、在偵測子系統內部移動及移出偵測子系統；在其他子系統之間移動消耗品；儲存消耗品；樣本及試劑搬運（例如適於混合試劑及/或將試劑引入消耗品中）；消耗品搖動（例如用於混合試劑及/或用於提高反應速率）；消耗品洗滌（例如洗滌盤及/或執行分析洗滌步驟（例如孔抽吸））；量測流通槽或諸如管或盤之消耗品中例如ECL信號之可偵測信號。自動化系統可經組態以處理置放於托架及/或諸如96或384孔盤之多孔盤中之個別管。
在如本文所描述之自動化系統中整合組件及模組之方法例如由Sargeant等人,「Platform Perfection」, Medical Product Outsourcing, 2010年5月17日論述。
在實施例中，自動化系統為全自動的、模組化的、電腦化的，對廣泛範圍之分析物執行活體外定量及定性測試及/或執行光度分析、離子選擇性電極量測及/或電化學發光（ECL）分析。在實施例中，系統包括以下硬體單元中之一或多者：控制單元、核心單元及至少一個分析模組。
在實施例中，控制單元利用圖形使用者介面來控制所有儀器功能，且包括諸如監測器之讀出裝置、諸如鍵盤及滑鼠之輸入裝置及例如使用Windows作業系統之個人電腦。在實施例中，核心單元包括一或多個管理向各經指配之分析模組輸送樣本之組件。核心單元之實際組成視分析模組之組態而定，該等分析模組可由本領域中熟習此項技術者使用本領域中已知之方法來組態。在實施例中，核心單元包括至少取樣單元及一個齒條轉子作為主要組件。在實施例中，控制單元進一步包括例如輸送管線及/或第二齒條轉子之延伸單元。在實施例中，核心單元進一步包括樣本托架裝載器/卸載器、埠、條碼讀取器（用於托架及樣本）、水供應器及系統介面埠。在實施例中，自動化系統進行ECL分析且包括試劑區、量測區、消耗品區及預清潔區。
與本文實施例一致之分析裝置可用於例如以多孔盤格式進行分析，該格式具有以下期望屬性中之一或多者：（i）高靈敏度、（ii）大動態範圍、（iii）小尺寸及重量、（iv）基於陣列之多工能力、（v）自動化操作；及（vi）處理多個盤之能力。設備及方法可與多種分析偵測技術一起使用，該等分析偵測技術包含但不限於量測一或多個可偵測信號之技術。一些態樣適用於電化學發光量測及特定言之，適用於與具有積體電極之多孔盤一起使用之實施例（及使用此等盤之分析方法），諸如美國專利第7,842,246號；第7,807,448號；及第10,281,678號中所描述之實施例。
在實施例中，提供用於在多孔盤中進行發光分析之分析裝置。舉例而言，分析裝置之實施例包含光偵測子系統及盤處理子系統，其中盤處理子系統包含提供其中可進行發光量測之無光環境的不透光外殼。不透光外殼包含殼體及置放於殼體內之可移除抽屜。殼體亦包含具有一或多個盤引入孔之殼體頂部，盤可經由該一或多個盤引入孔在抽屜內降至盤平移台上或自盤平移台移除（手動地或機械地）。殼體中之滑動不透光門係用於在進行發光量測之前將盤引入孔密封以免受環境光影響。殼體進一步包含耦接至經安裝於殼體頂部上之光偵測器的偵測孔及經安裝於盤引入孔上方之殼體頂部上之一或多個盤堆疊器，其中盤堆疊器經組態以接受盤或將盤遞送至可移除抽屜內之盤升降機。可移除抽屜包含盤平移台，該盤平移台用於在抽屜中將盤水平地平移至設備內進行特定分析處理及/或偵測步驟之區域。可移除抽屜亦包含一或多個可在抽屜內升高及降低之具有盤提昇平台之盤升降機，其中盤升降機定位在一或多個盤引入孔下方。盤平移台經組態以將盤定位在偵測孔下方且經組態以將盤定位在盤提昇平台上之盤升降機上方。
分析裝置亦可包含光偵測器，該光偵測器經安裝至殼體頂部上之偵測孔（例如經由不透光連接器或擋板）。在某些實施例中，光偵測器為諸如CCD攝影機之成像光偵測器，且亦可包含透鏡。光偵測器可為諸如光電二極體、突崩光二極體、光電倍增管或其類似光偵測器之習知光偵測器。適合的光偵測器亦包含該等光偵測器之陣列。可使用之光偵測器亦包含諸如CCD及CMOS攝影機之成像系統。光偵測器亦可包含用於在偵測器上導引光、使光聚焦及/或使光成像之透鏡、光導等。在某些特定實施例中，成像系統係用於使來自分析盤之一或多個孔中之結合域之陣列的發光成像，且分析設備報導自陣列之個別元件發射之發光的發光值。用不透光密封件將光偵測器安裝於殼體頂部上。設備之額外組件包含用於與盤進行電接觸且向定位於光偵測器下方之孔中之電極提供電能（例如用於感應ECL）的盤接觸件。
在實施例中，分析裝置包含諸如標識符控制器之用於自動標識樣本盤之零件。在實施例中，標識符控制器為經由不透光密封件經安裝於殼體頂部中之孔上的條碼讀取器，其中條碼讀取器經組態以讀取置放於殼體內之盤平移台上之盤上的條碼。在較佳實施例中，在盤已降低至抽屜時讀取盤上之條碼。在替代或額外實施例中，盤包括諸如EEPROM或RFID之標識符，且殼體頂部及/或抽屜包含適用於與此等標識符中之各者通訊之標識符控制器。在另外實施例中，標識符控制器可與設備分開設置。在此實施例中，經儲存至與盤連接或與盤或盤集合相聯結之標識符的資訊經由連接至其之電腦及/或網路轉移至設備及/或經由電腦及/或網路之使用者介面手動輸入。就此而言，參考美國專利公開案第2011/0022331號及美國專利第8,770,471號。
在一些情況下，盤處理子系統進一步包含經安裝於盤引入孔上方之殼體頂部上的一或多個盤堆疊器，其中盤堆疊器經組態以接受盤或將盤遞送至盤升降機。盤處理子系統視情況包含加熱機制及/或冷卻機制（例如電阻加熱器、風扇、散熱器或熱電加熱器/冷卻器）以維持子系統在期望條件下之溫度。其亦可包含濕度控制機制（例如加濕器及/或除濕器或用於維持子系統在期望條件下之濕度的乾燥腔室）。
如本文所描述，分析裝置經組態以執行校準分析及樣本分析兩者。如本文所描述，校準分析包含對具有限定數量之分析物之校準樣本執行的分析。如本文所描述，樣本分析係對各自具有未知數量之分析物之一或多種測試樣本進行。對測試樣本執行樣本分析產生樣本分析信號值。樣本分析信號值指示與其相關之分析物之未知數量。
在實施例中，本文提供電腦系統。計算系統可包含一或多個處理器（在本文中亦可互換地稱為處理單元）、一或多個儲存裝置及/或其他組件。在其他實施例中，處理器之功能可藉由硬體（例如經由使用特殊應用積體電路（「ASIC」）、可程式化閘陣列（「PGA」）、場可程式化閘陣列（「FPGA」）等）或硬體與軟體之任何組合執行。儲存裝置包含（多個）任何類型之非暫時性電腦可讀儲存媒體及/或非暫時性電腦可讀儲存裝置。該等電腦可讀儲存媒體或裝置可儲存用於使處理器進行此處所描述之一或多種方法的電腦可讀程式指令。電腦可讀儲存媒體或裝置之實例可包含但不限於電子儲存裝置、磁儲存裝置、光學儲存裝置、電磁儲存裝置、半導體儲存裝置或其任何適合組合，例如電腦磁片、硬碟、隨機存取記憶體（RAM）、唯讀記憶體（ROM）、可抹除可程式化唯讀記憶體（EPROM或快閃記憶體）、靜態隨機存取記憶體（SRAM）、攜帶型光碟唯讀記憶體（CD-ROM）、數位化通用光碟（DVD）、記憶棒，但不限於僅彼等實例。
處理器經儲存於儲存裝置上且可由處理器執行之一或多個電腦程式指令程式化。舉例而言，處理器經協定管理器、網路管理器、資料管理器、校準擬合管理器、分析管理器及使用者介面管理器程式化。應理解，如本文所論述之各種管理器之功能為代表性且非限制性的。另外，儲存裝置可充當資料儲存裝置以為分析系統環境提供資料儲存。如本文所使用，出於方便起見，當實際上管理器程式化處理器（且因此程式化計算系統）以執行操作時，將各種「管理器」描述為執行操作。
協定管理器為可在計算系統上操作之軟體協定（例如軟體模組或庫）。協定管理器經組態以向一或多個分析裝置提供一或多個控制信號。由協定管理器提供之控制信號經組態以提供操作一或多個分析裝置所必需的指令。控制信號可規定將由一或多個分析裝置進行之一或多個分析協定。由協定管理器提供之控制信號可用於起始及/或控制本文所描述之分析裝置能夠進行的任何過程。
在實施例中，協定管理器可進一步操作以接收在一或多個分析裝置操作期間收集之資料。該資料可包含例如校準分析資料及樣本分析資料。接著，可經由資料管理器處理或儲存所接收到之資料。
協定管理器經組態以操作，從而控制一或多個分析裝置來執行校準分析。分析裝置可受協定管理器控制以獲得對具有限定數量之分析物之複數個校準樣本（例如作為校準劑儲存於多孔盤中之校準樣本）進行的校準分析量測。複數個校準樣本可包含不同數量之分析物。協定管理器進行操作以測定對應於複數個校準樣本之校準分析信號值。協定管理器經組態以執行校準分析來確定一或多個校準資料集。校準資料集包含使複數個數量值與對應複數個校準分析信號值相關之資訊。
協定管理器進一步經組態以操作，從而控制一或多個分析裝置來執行樣本分析。分析裝置可受協定管理器控制以獲得對具有未知數量之分析物之複數個測試樣本（例如經安置於多孔盤中之測試樣本）進行之樣本分析量測。協定管理器進行操作以測定對應於複數個測試樣本之樣本分析信號值。協定管理器經組態以執行樣本分析來確定一或多個樣本分析資料集。樣本分析資料集可包含使樣本分析信號值與樣本標識資料相關之資訊。樣本標識資料可包含諸如盤位置之用於標識測試樣本之任何適合資料。
網路管理器為可在計算系統上操作之軟體協定（例如軟體模組或庫）。網路管理器經組態以在分析系統環境中在網路、分析裝置、資料儲存裝置及/或任何其他裝置之間建立網路通訊。已建立之通訊路徑可利用任何適當的網路傳送協定且提供單向或雙向資料傳送。網路管理器可建立根據與分析系統環境之各種元件通訊之需要而儘可能多的網路通訊。
網路管理器便於發送及接收樣本分析資料、校準分析資料（亦稱為校準分析資訊）、樣本分析及校準分析協定、校準模型及任何其他資訊及/或與分析系統環境之操作一致的資訊。
資料管理器為可在計算系統上操作之軟體協定或軟體模組。資料管理器經組態以存取諸如分析系統環境之一或多個分析裝置之樣本分析資料及校準分析資料的分析資料。分析資料可包含例如樣本分析資料集及校準資料集，該等樣本分析資料集及校準資料集可近乎即時獲得，可為存檔資料及/或可為資料提取物，以及過程資訊及過程參數資訊及由分析裝置產生或儲存於分析裝置上的任何其他資訊或資料。資料管理器進一步經組態以存取一或多個資料儲存裝置、本端分析電腦系統及/或網路化電腦系統，且儲存及/或接收經儲存於此等裝置中之任一者或全部中之分析資料。在另外實施例中，資料管理器經組態以存取可儲存分析資料之各種可移除物理儲存媒體。
資料管理器可經由使用者介面管理器向使用者提供資料。在實施例中，資料管理器進一步經組態以向使用者提供存取工具來管理及操縱分析資料（亦稱為分析系統資料）。舉例而言，資料管理器616可經組態以產生報告、校對分析系統資料、交叉參考分析系統資料、用分析系統資料填充資料庫等。在實施例中，資料管理器可提供資料保存能力。資料管理器進一步經組態以接收及儲存在分析系統環境內收集及/或使用之任何及所有資料。
抗體及組合物
在實施例中，本發明提供結合至電化學發光（ECL）標記之抗體或其抗原結合片段。
一般而言，抗體（可與術語「免疫球蛋白」互換使用）包括至少重鏈之可變域；通常，抗體包括重鏈及輕鏈之可變域。將重鏈及輕鏈兩者分成具有結構及功能同源性之區域。一般而言，重鏈（V
H）或輕鏈（V
L）之可變域決定抗原辨識及特異性，且重鏈（C
H1、C
H2或C
H3）或輕鏈（C
L）之恆定域賦予諸如分泌、受體結合、補體結合及其類似生物特性之生物特性。一般而言，抗體鏈之N端部分為可變部分，且C端部分為恆定區；C
H3域及C
L域通常分別包括重鏈及輕鏈之C端。
一般而言，抗體經免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼。所辨識之免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因以及免疫球蛋白可變區基因。將輕鏈分類為κ或λ。將重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，其繼而分別界定免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。
一般而言，可變區允許抗體選擇性辨識且特異性結合抗原上之抗原決定基。因此，抗體之V
L域及V
H域或此等可變域內之互補決定區（CDR）子集組合以形成可變區，該可變區形成抗原結合域。抗原結合域通常由V
L域及V
H域中之各者上之三個CDR界定。通常存在於各抗原結合域中之六個「互補決定區」或「CDR」為經特異性定位以形成抗原結合域之胺基酸之不連續短序列。由經定位之CDR形成之抗原結合域界定與抗原上之抗原決定基互補的表面。此互補表面促進抗體與其同源抗原決定基之非共價結合。
在實施例中，本發明提供包括對電化學發光（ECL）標記具有特異性之抗原結合域的抗體或其抗原結合片段。
在實施例中，抗體或其抗原結合片段包括有包括IgA、IgD、IgE、IgG或IgM域之恆定區。在實施例中，抗體或其抗原結合片段包括IgG域。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型抗體或其抗原結合片段。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段為IgG2a、IgG2b或IgG2c子類抗體或其抗原結合片段。
在實施例中，該抗體或其抗原結合片段衍生自小鼠、大鼠、山羊、兔、雞、天竺鼠、倉鼠、馬或綿羊。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段衍生自小鼠。
本文描述ECL標記。在實施例中，ECL標記包括電化學發光有機金屬錯合物。在實施例中，電化學發光有機金屬錯合物包括釕、鋨、銥、錸及/或鑭系金屬。在實施例中，ECL標記包括釕。在實施例中，電化學發光有機金屬錯合物包括經取代或未經取代之聯吡啶或經取代或未經取代之啡啉。在實施例中，ECL標記包括經取代之聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括至少一種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，ECL標記包括有包括至少兩種經取代之聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中各經取代之聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。在實施例中，經取代之聯吡啶配位體為式I化合物。在實施例中，ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個能夠形成共價鍵之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個能夠形成共價鍵之取代基的聯吡啶。在實施例中，第三配位體包括具有至少一個包括結合連接子之取代基的聯吡啶。本文進一步描述結合連接子。
在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至式II、式IV或式VI化合物之抗原結合域。在實施例中，該抗體或抗原結合片段包括特異性結合至以下之抗原結合域：
或
。
在實施例中，本發明提供包括對ECL標記及結合連接子具有特異性之抗原結合域的抗體或其抗原結合片段。本文描述結合連接子。在實施例中，結合連接子包括醯胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亞胺、三唑、二氫嗒
、肽、寡核苷酸、親水性聚合物或其組合。
在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及醯胺之抗原結合域。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及硫酯之抗原結合域。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及硫醚之抗原結合域。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及二硫化物之抗原結合域。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及亞胺之抗原結合域。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及三唑之抗原結合域。在實施例中，信號放大試劑特異性結合至ECL標記及二氫嗒
。
在實施例中，結合連接子包括間隔子（例如如本文所描述之肽、寡核苷酸或親水性聚合物），且該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及結合連接子之肽、寡核苷酸或親水性聚合物之至少一部分的抗原結合域。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及結合連接子之肽之至少一部分的抗原結合域。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及結合連接子之寡核苷酸之至少一部分的抗原結合域。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括特異性結合至ECL標記及結合連接子之親水性聚合物之至少一部分的抗原結合域。
在實施例中，該抗體或其抗原結合片段進一步包括核酸探針。本文描述核酸探針。在實施例中，核酸探針能夠結合至模板寡核苷酸。在實施例中，核酸探針為用於例如如本文所描述之聚合酶鏈反應（PCR）、接合酶鏈反應（LCR）、股置換擴增（SDA）、自持續合成反應（3SR）及/或等溫擴增（諸如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增）之延伸反應的引子。
在實施例中，本發明提供包括以下之組合物：（a）本文所提供之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括核酸探針；及（b）能夠結合至核酸探針之模板寡核苷酸。本文進一步描述模板寡核苷酸。
在實施例中，該抗體或其抗原結合片段進一步包括結合部分。本文描述結合部分。在實施例中，結合部分能夠結合至本文所描述之可偵測部分。在實施例中，結合部分包括寡核苷酸。在實施例中，結合部分包括生物素。在實施例中，結合部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。在實施例中，結合部分包括用於可偵測部分之多個結合位點。
在實施例中，本發明提供包括以下之組合物：（a）本文所提供之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括結合部分；及（b）包括（i）結合部分之結合搭配物及（ii）一或多個可偵測標記的可偵測部分。本文描述可偵測部分。在實施例中，可偵測部分包括可偵測標記。在實施例中，可偵測部分包括可偵測標記中之超過一個。在實施例中，經標記探針包括可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在實施例中，該抗體或其抗原結合片段之結合部分結合至可偵測部分。在其中結合部分包括寡核苷酸之實施例中，可偵測部分包括互補寡核苷酸。在其中結合部分包括生物素之實施例中，可偵測部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。在其中結合部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白之實施例中，可偵測部分包括生物素。在實施例中，可偵測部分包括用於結合部分之多個結合位點。
本文描述可偵測標記。在實施例中，可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來偵測。在實施例中，可偵測標記包括如本文所描述之ECL標記。
在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個共價連接至可偵測部分之取代基的聯吡啶。在實施例中，ECL標記包括有包括三種配位體之有機金屬錯合物，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個共價連接至可偵測部分之取代基的聯吡啶。
在實施例中，可偵測標記包括式II化合物。在實施例中，可偵測標記包括式III化合物。在實施例中，可偵測標記包括式IV化合物。在實施例中，可偵測標記包括式V化合物。在實施例中，可偵測標記包括式VI化合物。
在實施例中，該抗體或其抗原結合片段進一步包括酶。本文進一步描述酶。在實施例中，酶為HRP、AP或β-半乳糖苷酶。
在實施例中，本發明提供包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段之組合物，其中該抗體或其抗原結合片段包括酶。在實施例中，該組合物進一步包括酶之受質。在實施例中，酶為HRP，且受質為TMB、ABTS或OPD。在實施例中，酶為AP，且受質為PNPP。在實施例中，酶為β-半乳糖苷酶且受質為ONPG。本文進一步描述諸如HRP、AP及β-半乳糖苷酶之酶及其包括TMB、ABTS、OPD、PNPP及ONPG之受質。
套組
在實施例中，本發明提供用於偵測所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或區室中包括：（a）特異性結合至分析物之捕捉試劑；（b）特異性結合至分析物之偵測試劑，其中偵測試劑包括第一可偵測標記；及（c）特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，套組進一步包括表面。在實施例中，偵測試劑為第一偵測試劑，且套組進一步包括特異性結合至分析物之第二偵測試劑，其中第二偵測試劑包括第一可偵測標記。
在實施例中，本發明提供用於偵測所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或區室中包括：（a）特異性結合至分析物之捕捉試劑；（b）特異性結合至分析物之偵測試劑，其中偵測試劑包括第一核酸探針；（c）包括第一可偵測標記之第一經標記探針；及（d）特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，套組進一步包括表面。
在實施例中，本發明提供用於偵測所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或區室中包括：（a）特異性結合至分析物之捕捉試劑；（b）特異性結合至分析物之偵測試劑，其中偵測試劑包括ECL標記；及（c）特異性結合至ECL標記之信號放大試劑。在實施例中，套組進一步包括表面。在實施例中，偵測試劑為第一偵測試劑，且套組進一步包括特異性結合至分析物之第二偵測試劑，其中第二偵測試劑包括ECL標記。
在實施例中，本發明提供用於偵測所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或區室中包括：（a）特異性結合至分析物之捕捉試劑；（b）特異性結合至分析物之偵測試劑，其中偵測試劑包括第一核酸探針；（c）包括第一ECL標記之第一經標記探針；及（d）特異性結合至第一ECL標記之信號放大試劑。在實施例中，套組進一步包括表面。
在實施例中，本發明提供包括抗體或抗原結合片段之套組，如本文所描述，該抗體或抗原結合片段包括對ECL標記具有特異性之抗原結合域且包括結合部分。在實施例中，本發明提供包括抗體或抗原結合片段之套組，如本文所描述，該抗體或抗原結合片段包括對ECL標記具有特異性之抗原結合域且包括酶。在實施例中，套組進一步包括捕捉試劑及偵測試劑中之一或兩者，其中偵測試劑包括ECL標記。在實施例中，套組進一步包括捕捉試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑中之一或多者，其中第一偵測試劑及第二偵測試劑各自包括ECL標記。在實施例中，套組進一步包括表面。
在實施例中，本發明提供包括抗體或抗原結合片段之套組，如本文所描述，該抗體或抗原結合片段包括對ECL標記具有特異性之抗原結合域且包括核酸探針。在實施例中，套組進一步包括錨定試劑、模板寡核苷酸、經標記探針、聚合酶、接合酶、緩衝劑、阻斷劑、共反應物、稀釋劑、穩定劑、校準劑、分析消耗品或其組合。在實施例中，套組進一步包括捕捉試劑及偵測試劑中之一或兩者，其中偵測試劑包括ECL標記。在實施例中，套組進一步包括捕捉試劑、第一偵測試劑及第二偵測試劑中之一或多者，其中第一偵測試劑及第二偵測試劑各自包括ECL標記。在實施例中，套組進一步包括表面。
本文描述捕捉試劑、例如第一偵測試劑及第二偵測試劑之偵測試劑、第一可偵測標記及信號放大試劑。在實施例中，捕捉試劑、偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑以及信號放大試劑各自包括抗體或其抗原結合片段、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。在實施例中，捕捉試劑、偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑以及信號放大試劑各自包括抗體或其抗原結合片段。在實施例中，信號放大試劑為IgG抗體。
在實施例中，第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記。在實施例中，信號放大試劑為包括對ECL標記具有特異性之抗原結合域的抗體或其抗原結合片段。本文描述ECL標記。
在實施例中，ECL標記為式II化合物。在實施例中，ECL標記為式III化合物。在實施例中，ECL標記為式IV化合物。在實施例中，ECL標記為式V化合物。在實施例中，ECL標記為式VI化合物。
在實施例中，信號放大試劑包括結合部分。在實施例中，套組進一步包括用於使結合部分結合至信號放大試劑之試劑。本文描述結合部分。在實施例中，結合部分包括寡核苷酸。在實施例中，結合部分包括生物素。在實施例中，結合部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。在實施例中，套組進一步包括有包括以下之可偵測部分：（i）結合部分之結合搭配物及（ii）第二可偵測標記中之一或多者。本文描述可偵測部分。在實施例中，結合部分包括寡核苷酸，且可偵測部分包括互補寡核苷酸。在實施例中，結合部分包括生物素，且可偵測部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。在其中結合部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白之實施例中，可偵測部分包括生物素。
在實施例中，可偵測部分包括第二可偵測標記。本文進一步描述第二可偵測標記。在實施例中，可偵測部分包括第二可偵測標記中之超過一個。在實施例中，可偵測部分包括第二可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。
在實施例中，信號放大試劑包括酶。在實施例中，套組進一步包括酶之受質。本文進一步描述酶及其受質。在實施例中，酶為HRP，且受質為TMB、ABTS或OPD。在實施例中，酶為AP，且受質為PNPP。在實施例中，酶為β-半乳糖苷酶且受質為ONPG。在實施例中，受質為如本文所描述之顯色受質、螢光受質或化學發光受質。
在實施例中，信號放大試劑包括第二可偵測標記。本文進一步描述第二可偵測標記。在實施例中，信號放大試劑包括第二可偵測標記中之超過一個。在實施例中，信號放大試劑包括第二可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。在實施例中，第二可偵測標記為如本文所描述之ECL標記。
在實施例中，偵測試劑包括第一可偵測標記，且信號放大試劑包括核酸探針。在實施例中，第一偵測試劑及第二偵測試劑各自包括第一可偵測標記，且信號放大試劑包括核酸探針。在實施例中，套組進一步包括用於使核酸探針結合至信號放大試劑之試劑。本文描述核酸探針。在實施例中，核酸探針為用於例如如本文所描述之聚合酶鏈反應（PCR）、接合酶鏈反應（LCR）、股置換擴增（SDA）、自持續合成反應（3SR）及/或等溫擴增（諸如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增）之用於形成延伸序列之延伸反應的引子。在實施例中，套組進一步包括例如用於執行延伸反應之模板寡核苷酸。在實施例中，套組進一步包括例如用於結合至由延伸反應產生之延伸序列的錨定試劑。本文進一步描述模板寡核苷酸及錨定試劑。在實施例中，錨定試劑包括單股寡核苷酸。在實施例中，錨定試劑包括雙股寡核苷酸。在實施例中，套組進一步包括有包括第二可偵測標記中之一或多者的經標記探針，其中經標記探針及延伸序列包括互補寡核苷酸。在實施例中，經標記探針包括第二可偵測標記中之超過一個。在實施例中，經標記探針包括第二可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。
在實施例中，偵測試劑包括第一核酸探針，且信號放大試劑包括第二核酸探針。在實施例中，套組進一步包括用於使第一核酸探針結合至偵測試劑之試劑。在實施例中，套組進一步包括用於使第二核酸探針結合至信號放大試劑之試劑。本文描述第一核酸探針及第二核酸探針。在實施例中，套組進一步包括例如用於延伸第一核酸探針及第二核酸探針之一或多個模板寡核苷酸。在實施例中，套組進一步包括如本文所描述之分別結合第一延伸序列及第二延伸序列之第一錨定試劑及第二錨定試劑。在實施例中，套組進一步包括有包括第一可偵測標記中之一或多者的第一經標記探針，其中第一經標記探針及第一延伸序列包括互補寡核苷酸。在實施例中，第一經標記探針包括第一可偵測標記中之超過一個。在實施例中，第一經標記探針包括第一可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。在實施例中，套組進一步包括有包括第二可偵測標記中之一或多者的第二經標記探針，其中第二經標記探針及第二延伸序列包括互補寡核苷酸。在實施例中，第二經標記探針包括第二可偵測標記中之超過一個。在實施例中，第二經標記探針包括第二可偵測標記中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個。本文描述第一經標記探針及第二經標記探針。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第二可偵測標記為ECL標記。在實施例中，如本文所描述，第一可偵測標記可偵測地不同於第二可偵測標記。
在實施例中，偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑經凍乾。在實施例中，偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑經設置於溶液中。在實施例中，信號放大試劑經凍乾。在實施例中，信號放大試劑經設置於溶液中。在實施例中，捕捉試劑固定在設置於套組中之表面上。在實施例中，捕捉試劑經凍乾或經設置於溶液中，且套組進一步包括用於使捕捉試劑固定至表面之試劑。在包括錨定試劑（例如如本文所描述之用於結合至延伸序列之錨定、用於結合至第一延伸序列之第一錨定試劑及/或用於結合至第二延伸序列之第二錨定試劑）的實施例中，錨定試劑固定在設置於套組中之表面上。在實施例中，錨定試劑經凍乾或經設置於溶液中，且套組進一步包括用於使錨定試劑固定至表面之試劑。在實施例中，捕捉試劑固定在表面上之錨定試劑之約1 nm至約500 nm、約5 nm至約250 nm、約10 nm至約200 nm或約15 nm至約150 nm內。在實施例中，捕捉試劑距離表面上之錨定試劑小於1 μm固定。在實施例中，捕捉試劑距離表面上之錨定試劑小於500 nm固定。在實施例中，捕捉試劑距離表面上之錨定試劑小於200 nm固定。本文描述用於例如經由靶向劑/靶向劑補體、連接劑/補充連接劑及橋接劑使捕捉試劑及/或錨定試劑固定至表面之試劑及方法。
在實施例中，本文所提供之套組進一步包括表面。在實施例中，表面為盤。在實施例中，表面為多孔盤。在實施例中，表面為粒子。在實施例中，套組包括粒子陣列。在實施例中，表面為筒。在實施例中，表面包括電極。在實施例中，電極為碳墨電極。
在實施例中，套組之捕捉試劑、偵測試劑及/或信號放大試劑及其他組分經分開設置。在實施例中，套組之組分係根據其最佳運送或儲存溫度而經分開設置。
在實施例中，套組進一步包括校準試劑。在實施例中，校準試劑包括已知數量之分析物。在實施例中，套組包括多種校準試劑，該等校準試劑包括一定範圍之濃度的分析物。在實施例中，多種校準試劑包括接近用於該方法之定量上限及下限之濃度的分析物。在實施例中，多種校準試劑跨越該方法之總體動態範圍。在實施例中，校準試劑為陽性對照試劑。在實施例中，校準試劑為陰性對照試劑。在實施例中，陽性或陰性對照試劑係用於為待用本發明方法測試之樣本提供比較基礎。在實施例中，校準試劑經凍乾。在實施例中，校準試劑經設置於溶液中。
在實施例中，套組進一步包括聚合酶、接合酶、緩衝劑、阻斷劑、共反應物、稀釋劑、穩定劑、校準劑、分析消耗品、電極或其組合。
在實施例中，套組進一步包括例如用於執行聚合酶鏈反應（PCR）、接合酶鏈反應（LCR）、股置換擴增（SDA）、自持續合成反應（3SR）及/或等溫擴增（諸如解螺旋酶依賴性擴增或滾環擴增）之聚合酶。在實施例中，套組進一步包括例如用於使模板寡核苷酸接合之接合酶。
在實施例中，套組進一步包括例如分析緩衝劑、復原緩衝劑、儲存緩衝劑、讀取緩衝劑或其組合之緩衝劑。在實施例中，套組進一步包括例如用於執行電化學發光量測之共反應物。例示性共反應物描述於例如WO 2020/142313中。
在實施例中，套組進一步包括例如用於減少除所關注分析物以外之組分與本文所描述之捕捉試劑及偵測試劑或捕捉試劑及第一偵測試劑及第二偵測試劑之非特異性結合的阻斷劑。例示性阻斷劑包含但不限於mBSA、剪切poly(A)、polyBSA-I、mIgG、Tween、polyBSA-II、酵母RNA、mBSA+poly(A)及/或polyBSA+poly(A)。在實施例中，套組進一步包括用於套組之一或多種組分的稀釋劑。在實施例中，包括以上組分之套組包含儲備濃度為用於本文所提供之方法之工作濃度之5×、10×、20×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、125×、150×或更高倍濃度的組分。在實施例中，套組進一步包括例如用於儲存套組之一或多種組分的穩定劑。
在實施例中，套組進一步包括例如分析模組、小瓶、管、諸如移液管尖端之液體搬運及轉移裝置、罩蓋及密封件、托架、標記及其類似物的分析消耗品。在實施例中，套組進一步包括例如用於執行電化學發光量測之電極。在實施例中，將電極施加至本文所提供之表面。在實施例中，套組進一步包括分析儀器及/或用於進行本文所描述之方法的說明書。
本領域中一般熟習此項技術者應理解，可設置於一或多個小瓶、容器或區室中之本文所描述之套組之組分未必包含於同一容器，例如同一盒中及/或同時包含在內。在實施例中，本文所描述之套組之組分同時或依序經設置於一或多個單獨容器或區室中。本領域中一般熟習此項技術者應進一步理解，使用者可例如在一或多個單獨容器或區室中分開獲得（例如購買或擁有）套組之組分（例如本文所描述之信號放大試劑），但儘管如此，該等組分在組合使用時視為「套組」之一部分，例如如本文實施例中所描述。在一些實施例中，套組包括在單一封裝或容器中一起供應之多個容器、小瓶或區室。
在實施例中，本發明提供包括複數個第一套組及第二套組之套組集合，其中各第一套組係用於偵測所關注之獨特分析物，且其中各第一套組包括：（a）特異性結合至獨特分析物之捕捉試劑；及（b）偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑，其各自（i）特異性結合至獨特分析物及（ii）包括第一可偵測標記；且其中第二套組包括特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第一套組及/或第二套組進一步包括表面。在實施例中，套組集合進一步包括第三套組，該第三套組包括表面。本文進一步描述套組之組分。
在實施例中，本發明提供包括複數個第一套組及第二套組之套組集合，其中各第一套組係用於偵測所關注之獨特分析物，且其中各第一套組包括：（a）特異性結合至獨特分析物之捕捉試劑；（b）偵測試劑，其（i）特異性結合至獨特分析物及（ii）包括第一核酸探針；及（c）包括第一可偵測標記之第一經標記探針；且其中第二套組包括特異性結合至第一可偵測標記之信號放大試劑。在實施例中，第一可偵測標記為ECL標記。在實施例中，第一套組及/或第二套組進一步包括表面。在實施例中，套組集合進一步包括第三套組，該第三套組包括表面。本文進一步描述套組之組分。
在實施例中，套組集合能夠偵測樣本中之多種所關注分析物，其中分析物以範圍為約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在。在實施例中，樣本包括濃度比最低豐度分析物高10、100、1000、10000、100000、10
6、10
7、10
8、10
9或10
10倍之一或多種分析物。在實施例中，各第一套組能夠偵測樣本中之較高豐度分析物。在實施例中，各第一套組不能夠偵測樣本中之較低豐度分析物。在實施例中，第一套組及第二套組之組分之組合能夠偵測樣本中之較低豐度分析物。在實施例中，存在於樣本中之較高豐度分析物之量比較低豐度分析物之量高約1.5倍、約2倍、約5倍、約10倍、約25倍、約50倍、約75倍、約100倍、約500倍、約1000倍、約10000倍、約100000倍、約10
6倍、約10
7倍、約10
8倍、約10
9倍、約10
10倍或大於10
10倍。在實施例中，該量之較高豐度分析物以約1 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在於樣本中，且較低豐度分析物以約0.0001 pg/mL至約1 pg/mL之濃度存在於樣本中。
在實施例中，使用者執行如本文所描述之方法，該方法包括使用一或多種第一套組之組分偵測一或多種所關注分析物；及若一或多種分析物中之任一者實質上未被偵測到，則添加第二套組之信號放大試劑以為一或多種實質上未被偵測到之分析物提供經放大之分析信號。
在實施例中，本發明提供包括以下之方法：向使用者提供用於偵測第一樣本中之所關注分析物之第一套組，其中第一套組在一或多個小瓶、容器或區室中包括：（a）特異性結合至分析物之捕捉試劑；及（b）偵測試劑或第一偵測試劑及第二偵測試劑，其各自特異性結合至分析物；向使用者提供用於偵測第二樣本中之分析物之第二套組，其中第二套組包括信號放大試劑；其中第一樣本包括與第二樣本相比較高量之分析物。在實施例中，第一套組及/或第二套組進一步包括表面。在實施例中，套組集合進一步包括第三套組，該第三套組包括表面。本文進一步描述套組之組分。在實施例中，本發明提供包括以下之方法：向使用者提供用於偵測樣本中之所關注分析物之第二套組，其中第二套組包括特異性結合至經標記偵測試劑或經標記第一偵測試劑及第二偵測試劑上之標記的信號放大試劑，且其中第二套組經設計與第一套組結合使用，該第一套組包括（a）特異性結合至分析物之捕捉試劑；及（b）經標記偵測試劑或經標記第一偵測試劑及第二偵測試劑，其各自特異性結合至分析物。
包含專利、專利申請案、論文、教科書及其類似者及其中引用之參考文獻（就尚未引用而言）的本文所引用之所有參考文獻特此以全文引用之方式併入本文中。
實例 實例 1. 研發針對 ECL 標記之單株抗體
進行用於研發及篩檢針對MSD SULFO-TAG™ ECL標記之抗體（MESO SCALE DISCOVERY®，Rockville，MD）的實驗。
a）試劑製備
使用IMJECT™ EDC mcKLH自旋套組（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）使未結合MSD GOLD SULFO-TAG™ NHS-酯（在下文稱為「SULFO-TAG」）單獨結合至匙孔螺血氰蛋白（KLH）。使用典型蛋白質結合方案使SULFO-TAG單獨結合至單體牛血清白蛋白（BSA）。使用結合KLH之SULFO-TAG作為免疫原，且使用結合BSA之SULFO-TAG作為篩檢試劑。使在各孔中含有七個不同結合域（「斑點」）之96孔分析盤經山羊抗小鼠（「GAM」）抗體在該等斑點中之一者中固定，同時使剩餘斑點經BSA塗佈。使用盤用於抗血清或融合瘤篩檢。
b）免疫接種
使用一組六隻6至8週齡雌性小鼠（兩隻Balb/C小鼠、兩隻CFW小鼠及兩隻CD-1小鼠）用於免疫接種。在第0天向所有小鼠皮下（SC）及腹膜內（IP）注射40 μg KLH-SULFO-TAG與弗氏完全佐劑（Complete Freund's Adjuvant）之混合物，且在第14、28、42及56天注射20 µg KLH-SULFO-TAG與弗氏不完全佐劑之混合物。藉由兩種不同分析測試在第36及64天收集之血清樣本在各種稀釋度下的免疫反應。如上文所描述，將GAM固定在96孔分析盤中之七個斑點中之一者中，且剩餘斑點經BSA塗佈。在用1× TBS-T/3% BSA阻斷盤30分鐘之後，將來自小鼠之各種稀釋度之抗血清添加至盤中且培育1小時。在用TBS-T洗滌盤之後，將結合BSA之SULFO-TAG（分析格式1）或未結合SULFO-TAG（分析格式2）以0.75 μg/ml之濃度添加至盤中且隨後培育1小時。隨後，洗滌盤且使用讀取緩衝劑使其顯影。所有培育皆在室溫下執行。用於篩檢之分析格式描繪於圖5中。
在第77天藉由在不存在佐劑之情況下注射15 µg免疫原以最佳免疫力價對小鼠執行融合前（最終）加打。在第70及84天用20 µg免疫原與SIGMA ADJUVANT SYSTEM®（MilliporeSigma，St. Louis，MO）及MAGIC™小鼠佐劑（Creative Diagnostics，Shirley，NY）之混合物進一步對所有剩餘小鼠進行加打。在第92天如上文所描述再次測試自此等小鼠收集之血清樣本的免疫反應。在第98天以最佳抗體力價對小鼠執行融合前加打。在US Maryland之臨床前合同實驗室執行免疫接種、血清收集、脾收取及動物維護。
在第64天（對於262及265之小鼠編號）及第92天（對於261、263、264及266之小鼠編號）收集之抗血清之篩檢資料示於表1中。基於在1:37,500稀釋度下之相對ECL信號強度選擇小鼠用於融合。在6隻經免疫接種小鼠中，兩隻Balb/C小鼠及兩隻CFW小鼠顯示相對較好的免疫反應且因此經選擇用於融合。免疫反應相對較差之兩隻CD-1小鼠被排除在研究之外。
表1.用於評估免疫反應之血清篩檢
| 動物 ID | 菌株 | 血清稀釋度 | 分析格式 -1 | 分析格式 -2 | 小鼠經選擇用於融合 ? | ||
| GAM | BSA | GAM | BSA | ||||
| M05-106-261 | Balb/C | 1:1500 | 42,344 | 77 | 67,602 | 5,418 | 是 |
| 1:7500 | 35,772 | 87 | 61,439 | 5,350 | |||
| 1:37500 | 30,027 | 73 | 48,774 | 5,336 | |||
| 1:187500 | 18,210 | 86 | 31,180 | 5,491 | |||
| M05-106-262 | Balb/C | 1:1500 | 45,756 | 117 | 40,186 | 2,762 | 是 |
| 1:7500 | 41,980 | 100 | 37,408 | 2,777 | |||
| 1:37500 | 27,387 | 129 | 31,248 | 2,678 | |||
| 1:187500 | 12,499 | 127 | 17,361 | 2,733 | |||
| M05-106-263 | CD-1 | 1:1500 | 9,055 | 79 | 23,236 | 5,611 | 否 |
| 1:7500 | 8,109 | 90 | 20,298 | 5,618 | |||
| 1:37500 | 6,671 | 80 | 19,079 | 5,373 | |||
| 1:187500 | 4,519 | 75 | 12,370 | 5,516 | |||
| M05-106-264 | CD-1 | 1:1500 | 20,778 | 91 | 29,638 | 5,582 | 否 |
| 1:7500 | 17,654 | 78 | 29,891 | 5,572 | |||
| 1:37500 | 14,587 | 92 | 24,097 | 5,093 | |||
| 1:187500 | 11,034 | 100 | 16,051 | 5,433 | |||
| M05-106-265 | CFW | 1:1500 | 60,114 | 142 | 52,297 | 2,784 | 是 |
| 1:7500 | 48,108 | 123 | 44,902 | 2,700 | |||
| 1:37500 | 33,649 | 137 | 29,564 | 2,622 | |||
| 1:187500 | 12,623 | 127 | 13,464 | 2,679 | |||
| M05-106-266 | CFW | 1:1500 | 71,798 | 76 | 114,809 | 5,355 | 是 |
| 1:7500 | 62,955 | 74 | 93,455 | 5,525 | |||
| 1:37500 | 39,156 | 74 | 74,885 | 5,145 | |||
| 1:187500 | 19,660 | 99 | 38,633 | 5,293 |
c）融合瘤研發
在最終加打之後三天自經選擇用於融合之小鼠收集脾。將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag8.653以2:1比率混合，且執行PEG輔助之細胞融合。融合後，將細胞以20 × 10
6個細胞/盤之最低細胞密度接種於平底96孔盤中之AH選擇培養基中。在融合之後12天收集來自所有融合盤之融合瘤培養物上清液且藉由如上文所描述之分析格式1測試其抗原特異性。將所有抗原陽性融合瘤擴增至48孔盤且藉由上文所描述之兩種分析格式再測試其抗原特異性以進行進一步確認。隨後，藉由限制稀釋法次選殖此等融合瘤。
自總共四個融合體篩檢出39個盤，自其中鑑別出23個對SULFO-TAG具有特異性之親本融合瘤純系（表2）。在不在48孔載物台處執行額外測試之情況下直接次選殖來自融合體F144及F145之所有抗原特異性純系。因此，在分析格式2中無法獲得此等純系之資料。
如表2中所示，儘管兩種分析格式之間的ECL信號強度發生變化，但未觀測到顯著差異。
表2.在融合階段之融合瘤篩檢及純系選擇
| 純系編號 | 分析格式 -1 | 分析格式 -2 | |||
| GAM | BSA | GAM | BSA | ||
| 1 | F136-1B4 | 50,070 | 109 | 53,298 | 3341 |
| 2 | F136-3A12 | 51,521 | 114 | 55,119 | 3341 |
| 3 | F136-3F10 | 113,694 | 101 | 92,194 | 3292 |
| 4 | F136-5E9 | 78,896 | 108 | 68,946 | 3072 |
| 5 | F136-6F9 | 118,530 | 106 | 96,312 | 3223 |
| 6 | F136-7D11 | 72,914 | 101 | 65,768 | 3386 |
| 7 | F136-7E2 | 49,984 | 109 | 42,597 | 3219 |
| 8 | F136-8E1 | 60,696 | 94 | 50,952 | 3249 |
| 9 | F136-9B7 | 81,463 | 104 | 69,923 | 3166 |
| 10 | F136-10H6 | 68,698 | 98 | 64,043 | 3433 |
| 11 | F137-2F11 | 30,603 | 115 | 97,285 | 3312 |
| 12 | F137-6B9 | 59,177 | 111 | 49,589 | 3288 |
| 13 | F144-2C7 | 28,986 | 74 | ||
| 14 | F144-3C4 | 64,650 | 58 | ||
| 15 | F144-3F4 | 26,587 | 56 | ||
| 16 | F144-4E1 | 18,252 | 46 | ||
| 17 | F144-4G1 | 40,081 | 67 | ||
| 18 | F144-4G7 | 42,006 | 49 | ||
| 19 | F144-5G7 | 18,241 | 79 | ||
| 20 | F144-8B2 | 130,890 | 54 | ||
| 21 | F144-9B2 | 64,554 | 68 | ||
| 22 | F145-10A9 | 18,330 | 58 | ||
| 23 | F145-10H2 | 15,760 | 43 |
d）融合瘤次選殖及抗體純化
在96孔盤中藉由限制稀釋法使抗原特異性親本融合瘤進行次選殖，且藉由在顯微鏡下進行目視檢查標示具有一個、兩個（在純系ID中經「t」指示）或多個菌落（經「m」指示）之孔。在接種之後12天收集來自此等孔之上清液且如上文所描述測試其抗原特異性。在補充有超低IgG FBS之DMEM培養基中將來自具有最佳抗原特異性之各親本株之至少一個次純系擴增至50 mL。根據製造商說明書使用來自GenScript之AMMAG™蛋白A磁珠執行抗體純化。
在23個親本融合瘤中，11個純系在次選殖中存活。此等純系之篩檢資料示於表3中。與融合篩檢結果一致，在兩種分析格式之間未觀測到顯著差異。產生總共11種純化單株抗體。經純化抗SULFO-TAG抗體列於表4中。
表3.在次選殖階段之融合瘤篩檢及純系選擇
表4.十一種抗SULFO TAG抗體
| 純系 ID | 分析格式 -1 | 分析格式 -2 | |||
| GAM | BSA | GAM | BSA | ||
| 1 | F136-1B4-8 | 76,376 | 84 | 50,071 | 1,318 |
| 2 | F136-3A12-2 | 75,034 | 121 | 52,344 | 1,511 |
| 3 | F136-3F10-6 | 165,381 | 145 | 117,152 | 1,800 |
| 4 | F136-5E9-2t | 98,044 | 87 | 84,482 | 1,510 |
| 5 | F136-6F9-3 | 129,696 | 88 | 99,565 | 1,397 |
| 6 | F136-7D11-4m | 91,923 | 90 | 55,193 | 1,529 |
| 7 | F136-8E1-1 | 68,167 | 93 | 60,101 | 1,521 |
| 8 | F137-6B9-1 | 33,100 | 85 | 27,858 | 1,488 |
| 9 | F144-4G7-3 | 46,464 | 150 | 72,481 | 96,603 |
| 10 | F144-8B2-2 | 145,460 | 145 | 172,353 | 96,246 |
| 11 | F145-10A9-1m | 26,632 | 147 | 91,949 | 93,168 |
| 抗體純系名稱 | 濃度（ mg/mL ） | 所產生之抗體體積（ ml ） | 所產生之抗體量（ mg ） | 同型 |
| F136-1B4-8 | 1.4 | 2.0 | 2.72 | IgG2b |
| F136-3A12-2 | 1.9 | 2.0 | 3.71 | IgG1 |
| F136-3F10-6 | 1.0 | 2.0 | 1.94 | IgG3 |
| F136-5E9-2t | 0.8 | 2.0 | 1.59 | IgG1 |
| F136-6F9-3 | 1.8 | 2.0 | 3.57 | IgG3 |
| F136-7D11-4m | 1.7 | 2.0 | 3.39 | IgG3 |
| F136-8E1-1 | 1.7 | 2.0 | 3.46 | IgG1 |
| F137-6B9-1 | 1.2 | 0.4 | 0.46 | IgG2b |
| F144-4G7-3 | 1.4 | 2.0 | 2.75 | IgG1 |
| F144-8B2-2 | 2.0 | 2.0 | 3.98 | IgG1 |
| F145-10A9-1m | 1.2 | 0.3 | 0.37 | IgG2b |
鑑別出產生抗體之特異性生殖系基因。由IGLV1*01 F基因產生輕鏈，且由IGHV2-9*02 F基因產生重鏈。
實例 2. 使抗體與核酸探針結合
如本文實施例中所描述，使實例1中產生之各抗SULFO-TAG抗體與核酸探針結合。對於核酸探針結合，在PBS中將高於1 mg/mL濃度之抗體稀釋至1 mg/mL，且不對低於1 mg/mL濃度之抗體進行濃度調節。使用0.5 M EDTA儲備溶液將用於所有抗體之緩衝劑引至1 mM EDTA。接下來，將各抗體與5莫耳過量之聚乙二醇化SMCC交聯劑SM(PEG)4一起在室溫下培育1小時。隨後，以8倍莫耳過量添加核酸探針且在室溫下培育1小時。用1 mM最終濃度之碘乙醯胺淬滅所有結合反應物且在室溫下培育30分鐘。
實例 3. 抗體篩檢
實驗1
篩檢如實例2中所描述之與核酸探針結合之抗SULFO-TAG抗體作為如本文實施例中所描述之信號放大試劑的效能。在經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之96孔分析盤中用針對人類ZnT8、人類IA-2、人類TGM-2及小鼠IL-1b之捕捉抗體及偵測抗體執行可行性測試。如下執行用於偵測單一分析物之濃度的分析：
1）用50 μL之0.25 μg/mL經生物素標記之捕捉抗體及0.2 ng/mL經生物素標記之錨定試劑/塗佈溶液/稀釋劑混合物塗佈經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之96孔分析盤。在室溫下以705 rpm搖動1小時。
2）洗滌盤三次，每次用300 μL洗滌緩衝劑進行洗滌。
3）添加25 μL阻斷溶液及25 μL校準劑或樣本/稀釋劑。在室溫下以705 rpm搖動1.5小時。
4）洗滌盤三次，每次用300 μL洗滌緩衝劑進行洗滌。
5）添加50 μL之1 μg/mL含有SULFO-TAG之偵測抗體（「SULFO-TAG-偵測抗體」）/稀釋劑。在室溫下以705 rpm搖動1小時。
6）洗滌盤三次，每次用300 μL洗滌緩衝劑進行洗滌。
7）添加50 μL之0.125 μg/mL抗SULFO-TAG抗體/稀釋劑。在室溫下以705 rpm搖動1小時。
8）洗滌盤三次，每次用300 μL洗滌緩衝劑進行洗滌。
9）添加50 μL含有用於延伸抗SULFO-TAG抗體之核酸探針以形成延伸序列之組分的增強溶液。
10）洗滌盤三次，每次用300 μL洗滌緩衝劑進行洗滌。
11）添加50 μL含有用於偵測延伸序列之組分的偵測溶液。
12）洗滌盤三次，每次用300 μL洗滌緩衝劑進行洗滌。
13）添加150 μL讀取緩衝劑。
14）在盤讀取器上讀取盤。
ECL分析信號之結果示於圖6中。基於經量測ECL分析信號，選擇抗SULFO-TAG抗體純系F136-1B4-8、F136-3F10-6、F136-6F9-3、F136-7D11-4m、F136-8E1-1及F137-6B9-1用於後續實驗中之校準劑滴定。
實驗2
在免疫分析中用針對人類ZnT8及TGM-2之經生物素標記之捕捉抗體及SULFO-TAG-偵測抗體測試抗SULFO-TAG抗體純系F136-1B4-8、F136-3F10-6、F136-6F9-3、F136-7D11-4m、F136-8E1-1及F137-6B9-1在校準劑滴定免疫分析中作為信號放大試劑的效能。實驗方案係如實驗1中所概述。用於人類ZnT8分析中之抗體為經生物素標記之抗人類ZnT8捕捉抗體純系編號F67-7C2-8及抗人類ZnT8 SULFO-TAG-偵測抗體純系編號F67-1A7-6。用於人類TGM-2分析中之抗體為經生物素標記之抗人類TGM-2捕捉抗體純系編號F74-6A5-6及抗人類TGM-2 SULFO-TAG-偵測抗體純系編號F69-5E8-3t。
ECL分析信號、變化係數（CV）、希爾斜率、R平方值、最低偵測極限（LLOD）、用於標準物4（STD 04）之信號背景比（S/B）及用於STD 04之信號雜訊比（S/N）的結果示於圖7及8中。自STD 04/STD 08（空白）之值測定S/B及S/N。圖9顯示使用相同的針對ZnT8及TGM-2之捕捉抗體及偵測抗體、但不利用抗SULFO-TAG抗體執行之免疫分析的比較結果。
如藉由資料所表明，抗SULFO-TAG抗體之使用為兩種分析提供了與不使用抗SULFO-TAG抗體執行之分析相比分析信號之強烈增強及＞10倍之LLOD降低。
實驗3
在免疫分析中用針對小鼠IL-23及小鼠IL-17C之經生物素標記之捕捉抗體及SULFO-TAG-偵測抗體測試抗SULFO-TAG抗體純系F136-1B4-8、F136-3F10-6、F136-6F9-3、F136-7D11-4m、F136-8E1-1及F137-6B9-1在校準劑滴定中作為信號放大試劑的效能。實驗方案係如實驗1中所概述。用於小鼠IL-23分析中之抗體為來自商業來源之經生物素標記之抗小鼠IL-23捕捉抗體及SULFO-TAG-抗小鼠IL-23偵測抗體。用於小鼠IL-17C分析中之抗體為來自商業來源之經生物素標記之抗小鼠IL-17C捕捉抗體及SULFO-TAG-抗小鼠IL-17C偵測抗體。
ECL分析信號、變化係數（CV）、希爾斜率、R平方值、最低偵測極限（LLOD）、用於標準物2（STD 02）之信號背景比（S/B）及用於STD 02之信號雜訊比（S/N）的結果示於圖10及11中。自STD 02/STD 04（空白）之值測定S/B及S/N。圖12顯示使用相同的針對小鼠IL-23及小鼠IL-17C之捕捉抗體及偵測抗體、但不利用抗SULFO-TAG抗體執行之免疫分析的比較結果。
如藉由資料所表明，抗SULFO-TAG抗體之使用為小鼠IL-23分析提供了與不使用抗SULFO-TAG抗體執行之分析相比分析信號之強烈增強及40倍至230倍之LLOD降低及為小鼠IL-17C分析提供了4倍至120倍之LLOD降低。
實驗4
在免疫分析中用針對人類IL-10之經生物素標記之捕捉抗體及SULFO-TAG-偵測抗體測試抗SULFO-TAG抗體純系F136-1B4-8、F136-3F10-6、F136-6F9-3、F136-7D11-4m、F136-8E1-1及F137-6B9-1在校準劑滴定中的效能。實驗方案係如實驗1中所概述，不同之處在於在步驟5）中，添加0.5 μg/mL SULFO-TAG-偵測抗體。用於人類IL-10分析中之抗體為經生物素標記之抗人類IL-10捕捉抗體純系編號2108-A82-8及SULFO-TAG抗人類IL-10偵測抗體純系編號1299-A06 -5。
ECL分析信號、變化係數（CV）、希爾斜率、R平方值、最低偵測極限（LLOD）、用於標準物2（STD 02）之信號背景比（S/B）及用於STD 02之信號雜訊比（S/N）的結果示於圖13中。自STD 02/STD 04（空白）之值測定S/B及S/N。圖14顯示使用相同的針對人類IL-10之捕捉抗體及偵測抗體、但不利用抗SULFO-TAG抗體執行之免疫分析的比較結果。
如藉由資料所表明，抗SULFO-TAG抗體之使用為人類IL-10分析提供了與不使用抗SULFO-TAG抗體執行之分析相比分析信號之強烈增強及50倍至140倍之LLOD降低。
實例 4. 抗 SULFO-TAG 抗體之信號抑制及增強
使用多工夾心分析面板來評估圖6中所示之十一種抗SULFO-TAG抗體（在本文中亦稱為「a-STAG Ab」）純系之信號抑制及信號增強，該等純系係自實例3之篩檢鑑別出。使用經提供用於分析之校準劑摻合物執行利用用於分析面板中之分析物中之各者之含有經SULFO-TAG標記之偵測抗體的偵測抗體混合物的分析面板。藉由將經復原之經凍乾校準劑稀釋大致2.43倍以得到大致100 pg/mL作為面板中之分析物中之一者的IL-4來製備校準劑摻合物。執行標準夾心分析方案，該方案簡單概述如下：
1）用洗滌緩衝劑洗滌分析面板盤；
2）向盤之各孔添加校準劑；
3）用洗滌緩衝劑洗滌分析面板盤；
4）在各孔中添加偵測抗體混合物以形成具有捕捉抗體、分析物及經SULFO-TAG標記之偵測抗體之夾心複合物（「cAb-分析物-dAb」）；
5）用洗滌緩衝劑洗滌分析面板盤。
在夾心複合物形成之後，將盤分成三個部分：標準信號；信號抑制；及信號增強。經添加至各部分之孔中之後續組分概述如下：
| 方案步驟 | 標準信號 | 信號抑制 | 信號增強 |
| 6 | 添加稀釋劑 | 添加具有寡核苷酸結合部分之抗SULFO-TAG抗體（1 μg/mL） | 添加具有寡核苷酸結合部分之抗SULFO-TAG抗體（1 μg/mL） |
| 7 | 添加稀釋劑 | 添加稀釋劑 | 添加與結合部分互補之經SULFO-TAG標記之寡核苷酸（50 nM） |
因此，標準信號部分不具有任何經添加至夾心複合物中之抗SULFO-TAG抗體。信號抑制部分具有結合至抗SULFO-TAG抗體之cAb-分析物-dAb複合物。信號增強部分具有結合至抗SULFO-TAG抗體之cAb-分析物-dAb複合物及結合至抗SULFO-TAG抗體之核酸探針的經SULFO-TAG標記之寡核苷酸。對於信號抑制及信號增強部分，測試十一種抗SULFO-TAG抗體純系中之各者。一式九份地執行分析。
將分析面板盤在室溫下培育1小時且以705 rpm搖動以進行步驟6及7中之各者且在培育之後用洗滌緩衝劑洗滌。用於進行步驟6及7中之一或兩者之與稀釋劑一起進行之標準信號及信號抑制條件之培育確保在所有三個部分中經量測之信號就所有培育步驟內於稀釋劑中之抗體異常速率而言係等效的。將ECL讀取緩衝劑添加至盤中，且在成像器上讀取盤。
結果示於圖16A-16C中。圖16A顯示抗SULFO-TAG抗體純系中之各者之信號抑制百分比（%）及信號增大%。圖16B及16C分別顯示信號抑制%及信號增大%之條形圖。信號抑制百分比（%）經計算為1-（信號抑制/標準信號）。線性信號增大百分比（%）經計算為（信號增強-信號抑制）/ [所有十一種抗SULFO-TAG抗體中之（信號增強-信號抑制）之最大值]。信號增大比率%可經計算為（信號增強/標準信號）-1。在存在或不存在經SULFO-TAG標記之寡核苷酸情況下之信號比率可經計算為（信號增強/信號抑制）。
如圖16A-16C中所示，抗SULFO-TAG抗體純系F136-1B4-8、F136-3F10-6及F136-6F9-3具有最高信號抑制%及最高信號增大%，此證實對SULFO-TAG標記之特異性。如5表中所示，計算抗SULFO-TAG抗體純系中之各者之親和力。
表5.在存在抗SULFO-TAG抗體純系情況下之信號增大%
實例 5. 抗 SULFO-TAG 抗體抗原決定基辨識研究
| 抗體純系名稱 | 信號增大 % |
| F136-1B4-8 | 71% |
| F136-3A12-2 | 20% |
| F136-3F10-6 | 87% |
| F136-5E9-2t | 27% |
| F136-6F9-3 | 100% |
| F136-7D11-4m | 21% |
| F136-8E1-1 | 39% |
| F137-6B9-1 | 12% |
| F144-4G7-3 | 11% |
| F144-8B2-2 | 22% |
| F145-10A9-1m | 10% |
對實例4中所描述之十一種抗SULFO-TAG抗體純系執行抗原決定基辨識研究。為了研究此等抗體純系之抗原決定基辨識，製備四種具有不同數目之如圖18A中所示之磺甲基-聯吡啶（「SM」）或聯吡啶（「Bpy」）配位體之有機金屬Ru
2+化合物（「TAG化合物」）。SULFO-TAG表示為Ru
+2(SM)
2A
1，其在Bpy基團中之一者中包含酸配位體（「A」）且在結構上比SM更類似於Bpy。藉由將TAG化合物外加至ECL讀取緩衝劑中來驗證自各TAG化合物之ECL產生，且在96孔裸碳盤上量測來自各游離TAG化合物之ECL信號。結果示於圖18B中且指示當以TAG化合物之濃度標準化時所有TAG化合物皆產生大致相等之ECL信號，此表明聯吡啶配位體之修飾對ECL產生效率具有最少影響。當針對濃度標準化時Ru(Bpy)
3ECL信號將為248,576個ECL單位，類似於其他TAG化合物。
為了研究抗SULFO-TAG抗體對TAG化合物之特異性及親和力，將抗體塗佈於MSD® 96孔小斑點鏈黴抗生物素蛋白盤上，隨後暴露於不同濃度之四種TAG化合物。如實例4中所描述量測來自抗SULFO-TAG抗體之ECL信號，其中較高信號指示較強結合親和力。結果示於圖19中。結果表明，抗SULFO-TAG抗體純系可根據其對具有不同配位體之TAG化合物之親和力進行分組。四種抗體（純系編號1、3、5及7）對SULFO-TAG具有＜1 nM親和力（K
D），而剩餘抗體具有＞20 nM之K
D，其中一些可能處於微莫耳濃度範圍內。對於具有三種SM配位體之Ru
+2(SM)
3，觀測到相同的親和力模式。對於僅具有一種SM配位體及兩種Bpy配位體之Ru
+2(Bpy)
2(SM)，抗體純系1、3及5保持相對高之親和力，但抗體純系7具有＜100 nM之顯著地降低之親和力。用Bpy進一步置換剩餘SM配位體，Ru
+2(Bpy)
3幾乎消除了由所有抗體純系進行之辨識。此等結果表明，SM配位體至少部分地引起強的與抗體純系1、3、5及7之結合。獨特的是，抗體純系7需要兩種SM配位體用於辨識。
為了進一步驗證配位體在抗體辨識中之作用，作為競爭分析，將抗體塗佈於MSD® 96孔小斑點鏈黴抗生物素蛋白盤上，且首先暴露於2 μM配位體SM、Bpy或A，隨後暴露於不同濃度之TAG化合物。競爭分析結果示於圖20中。結果表明，TAG化合物上之SM配位體為用於抗體純系1、3、5及7中之強結合的關鍵抗原決定基。在此等四個抗體純系中，純系1、3及5僅需要TAG化合物中之一種SM配位體用於強結合，但純系7需要兩種SM配位體用於強結合。所有抗體純系皆不辨識具有三種Bpy配位體之TAG化合物。配位體競爭研究進一步表明，具有最強結合之SM配位體為由抗體辨識之主要配位體，而Bpy及A配位體不能顯著地勝過與Ru
+2(SM)
3及SULFO-TAG化合物之抗體結合。
實例 6. 另外的抗原決定基辨識研究
執行用於判定是否需要SM配位體上之磺酸根官能基用於抗體辨識及向亞甲基添加不同帶電官能基是否改變抗體辨識的另一抗原決定基辨識研究。用於此研究之有機金屬Ru
2+化合物示於圖21中。
616:資料管理器
以下圖式形成本說明書之部分且包含在內以進一步展現本發明之某些態樣之例示性實施例。
[圖1A-1D]繪示本文所描述之方法之實施例。在圖1A中，包括捕捉試劑、分析物及具有多個第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。經由使捕捉試劑上之靶向劑補體結合至表面上之靶向劑來使捕捉試劑固定至表面。將包括核酸探針之信號放大試劑（「具有核酸探針之信號放大試劑」）添加至第一複合物中，藉此形成第二複合物。偵測試劑包括多個第一可偵測標記，從而允許多種信號放大試劑結合至各偵測試劑。在實施例中，各信號放大試劑之核酸探針係使用本文所描述之方法來擴增。圖1B顯示包括捕捉試劑（「CR」）、分析物、包括第一可偵測標記（「第1標記」）之偵測試劑（「DR」）及包括核酸探針之信號放大試劑（「SAR」）的第二複合物，其中核酸探針經由模板寡核苷酸（template oligonucleotide）（「模板寡核苷酸（template oligo）」）延伸以形成延伸序列（extended sequence）（「延伸序列（extended seq）」），且經標記探針結合至延伸序列。圖1C顯示其中偵測試劑包括三個第一可偵測標記之另一實施例，各第一可偵測標記結合至包括結合至兩個經標記探針之延伸序列的第一信號放大試劑。圖1D顯示其中偵測試劑包括兩個第一可偵測標記之另一實施例，其中各可偵測標記結合至包括核酸探針之信號放大試劑，且兩個模板寡核苷酸與兩個核酸探針雜交，其中各模板寡核苷酸與兩個核酸探針雜交。在實施例中，兩個模板寡核苷酸能夠接合在一起以形成環狀模板。
[圖2]繪示本文所描述之方法之實施例。包括捕捉試劑、分析物及具有多個第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。在一或多個步驟中將（1）包括結合部分之信號放大試劑及（2）包括多個第二可偵測標記之可偵測部分兩者均添加至第一複合物中。偵測試劑包括多個第一可偵測標記，從而允許多種信號放大試劑結合至各偵測試劑。包括多個第二可偵測標記之可偵測部分經由（多個）結合部分結合至各信號放大試劑。
[圖3]繪示本文所描述之方法之實施例。包括捕捉試劑、分析物及具有多個第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。經由使捕捉試劑上之靶向劑補體結合至表面上之靶向劑來使捕捉試劑固定至表面。在一或多個步驟中將（1）包括寡核苷酸結合部分之信號放大試劑及（2）包括多個第二可偵測標記之寡核苷酸可偵測部分兩者均添加至第一複合物中。偵測試劑包括多個第一可偵測標記，從而允許多種信號放大試劑結合至各偵測試劑。包括多個第二可偵測標記之可偵測部分經由（多個）結合部分結合至各信號放大試劑。
[圖4]繪示本文所描述之方法之實施例。包括捕捉試劑、分析物及具有多個第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。複數種信號放大試劑與可偵測部分混合，其中各可偵測部分包括多個第二可偵測標記，且其中各可偵測部分能夠結合至多個結合部分，藉此形成包括複數種信號放大試劑及可偵測部分之信號放大複合物。隨後，將信號放大複合物添加至第一複合物中。偵測試劑包括多個第一可偵測標記，從而允許信號放大複合物之多種信號放大試劑結合至各偵測試劑。包括多個第二可偵測標記之可偵測部分經由（多個）結合部分結合至各信號放大試劑。
[圖5]繪示本文所描述之用於篩檢抗血清及融合瘤之方法之實施例。山羊抗小鼠（GAM）抗體固定至分析盤之結合域（「斑點」）上且結合樣本中之小鼠產生之抗體。在分析格式1中，使用結合BSA之MSD SULFO-TAG™ ECL標記（「SULFO-TAG」）來偵測樣本中對SULFO-TAG具有特異性之抗體。在分析格式2中，使用未結合SULFO-TAG來偵測樣本中對SULFO-TAG具有特異性之抗體。
[圖6]顯示用於篩檢十一種抗SULFO-TAG抗體純系作為信號放大試劑之例示性免疫分析的結果。用於免疫分析之分析物為人類ZnT8、人類IA-2、人類TGM-2或小鼠IL-1b。顯示用於各分析物特異性免疫分析中各抗SULFO-TAG抗體之經量測ECL分析信號。
[圖7]顯示利用人類ZnT8作為分析物、使用六種不同的抗SULFO-TAG抗體純系作為信號放大試劑之例示性校準劑滴定免疫分析的結果。顯示七種不同濃度之人類ZnT8校準劑（經編號為STD 01至STD 07）及空白（STD 08）情況下之經量測ECL信號。顯示希爾斜率（Hill slope）、R平方值、最低偵測極限（LLOD）、STD 04之信號背景比（S/B）（基於STD 04/STD 08值）及STD 04之信號雜訊比（S/N）（基於STD 04/STD 08值）。
[圖8]顯示利用人類TGM-2作為分析物、使用六種不同的抗SULFO-TAG抗體純系作為信號放大試劑之例示性校準劑滴定免疫分析的結果。顯示七種不同濃度之人類TGM-2校準劑（經編號為STD 01至STD 07）及空白（STD 08）情況下之經量測ECL信號。顯示希爾斜率、R平方值、最低偵測極限（LLOD）、STD 04之信號背景比（S/B）（基於STD 04/STD 08值）及STD 04之信號雜訊比（S/N）（基於STD 04/STD 08值）。
[圖9]顯示使用與圖7及8中所示相同的人類ZnT8及TGM-2校準劑之例示性校準滴定免疫分析的結果，但免疫分析係在不利用抗SULFO-TAG作為信號放大試劑之情況下執行。顯示經量測ECL信號、希爾斜率、R平方值、最低偵測極限（LLOD）、STD 04之信號背景比（S/B）（基於STD 04/STD 08值）及STD 04之信號雜訊比（S/N）（基於STD 04/STD 08值）。
[圖10]顯示利用小鼠IL-23作為分析物、使用六種不同的抗SULFO-TAG抗體純系作為信號放大試劑之例示性校準劑滴定免疫分析的結果。顯示三種不同濃度之小鼠IL-23校準劑（經編號為STD 01至STD 03）及空白（STD 04）情況下之經量測ECL信號。顯示希爾斜率、R平方值、最低偵測極限（LLOD）、STD 02之信號背景比（S/B）（基於STD 02/STD 04值）及STD 02之信號雜訊比（S/N）（基於STD 02/STD 04值）。
[圖11]顯示利用小鼠IL-17C作為分析物、使用六種不同的抗SULFO-TAG抗體純系作為信號放大試劑之例示性校準劑滴定免疫分析的結果。顯示三種不同濃度之小鼠IL-17C校準劑（經編號為STD 01至STD 03）及空白（STD 04）情況下之經量測ECL信號。顯示希爾斜率、R平方值、最低偵測極限（LLOD）、STD 02之信號背景比（S/B）（基於STD 02/STD 04值）及STD 02之信號雜訊比（S/N）（基於STD 02/STD 04值）。
[圖12]顯示使用與圖10及11中所示相同的小鼠IL-23及IL-17C校準劑之例示性校準滴定免疫分析的結果，但免疫分析係在不利用抗SULFO-TAG作為信號放大試劑之情況下執行。顯示經量測ECL信號及最低偵測極限（LLOD）。
[圖13]顯示利用人類IL-10作為分析物、使用六種不同的抗SULFO-TAG抗體純系作為信號放大試劑之例示性校準劑滴定免疫分析的結果。顯示三種不同濃度之人類IL-10校準劑（經編號為STD 01至STD 03）及空白（STD 04）之經量測ECL信號。顯示希爾斜率、R平方值、最低偵測極限（LLOD）、STD 02之信號背景比（S/B）（基於STD 02/STD 04值）及STD 02之信號雜訊比（S/N）（基於STD 02/STD 04值）。
[圖14]顯示使用與圖13中所示相同的人類IL-10校準劑之例示性校準滴定免疫分析的結果，但免疫分析係在不利用抗SULFO-TAG作為信號放大試劑之情況下執行。顯示經量測ECL信號及最低偵測極限（LLOD）。
[圖15]繪示本文所描述之方法之實施例。包括捕捉試劑、分析物及具有第一核酸探針之偵測試劑的第一複合物形成於表面上。第一核酸探針經延伸（「擴增1」）以形成第一延伸序列。各自包括第一可偵測標記之複數個第一經標記探針結合至第一延伸序列。各自包括第二核酸探針之多種信號放大試劑結合至第一可偵測標記。第二核酸探針中之各者經延伸（「擴增2」）以形成第二延伸序列。各自包括第二可偵測標記之一或多個第二經標記探針結合至第二延伸序列。
[圖16A-16C]顯示經執行以量測圖6中所示之抗SULFO-TAG抗體純系之信號抑制及信號增強之例示性分析的結果。圖16A顯示抗SULFO-TAG抗體純系中之各者之信號抑制百分比（%）及信號增大%。圖16B顯示該等抗體純系中之各者之信號抑制%的條形圖。圖16B顯示該等抗體純系中之各者之信號增大%的條形圖。
[圖17]顯示本文所描述之方法之實施例。包括捕捉試劑、分析物及具有第一可偵測標記之偵測試劑的第一複合物處於表面上。在一或多個步驟中將包括酶及酶受質之信號放大試劑添加至第一複合物中。酶作用於受質以產生可偵測信號。
[圖18A]顯示具有不同數目之磺甲基-聯吡啶（「SM」）、聯吡啶（「Bpy」）或酸（「A」）配位體之例示性有機金屬Ru
2+化合物（「TAG化合物」）。[圖18B]顯示例示性TAG化合物產生ECL之能力。
[圖19]顯示利用圖18A中所示之化合物TAG及實例4中所描述之抗SULFO-TAG抗體純系之例示性結合分析的結果。量測抗SULFO-TAG抗體之ECL信號，其中較高信號指示較強結合親和力。右側插圖顯示抗體與較高濃度（10 nM至1000 nM）之Ru
+2(Bpy)
3化合物之結合。
[圖20]顯示利用實例4中所描述之抗SULFO-TAG抗體純系的圖18A中所示之TAG化合物與圖18A中所示之SM、Bpy或A配位體之間的例示性競爭性結合分析的結果。圖式顯示抗SULFO-TAG抗體暴露於2 μM各配位體，隨後改變TAG化合物中之各者之濃度之後的剩餘ECL信號。較低ECL信號指示較強的針對特定配位體之結合親和力。最右欄中之三個圖顯示來自抗SULFO-TAG抗體純系暴露於單獨的10 nM TAG化合物（無配位體）之ECL信號。
[圖21]顯示含有不同的帶電官能基作為聯吡啶配位體上之取代基的例示性有機金屬Ru
2+化合物。
[圖22A-22D]顯示本文所描述之方法之實施例。在圖22A-22D中之各者中，複合物包括捕捉試劑（「CR」）、分析物、包括第一可偵測標記（「第1標記」）之第一偵測試劑（「第1 DR」）、包括第一可偵測標記之第二偵測試劑（「第2 DR」）、同時結合至第一偵測試劑上之第一可偵測標記及第二偵測試劑上之第一可偵測標記的信號放大試劑（「SAR」）。在圖22A中，描繪了無任何其他組分之信號放大試劑。如圖22A中所標記之組分與圖22B-22D相同。在圖22B中，信號放大試劑包括結合至可偵測部分之結合部分，該可偵測部分包括結合部分之結合搭配物及如本文所描述之第二可偵測標記。在圖22C中，信號放大試劑包括如本文所描述之第二可偵測標記。在圖22D中，信號放大試劑包括核酸探針，該核酸探針經由模板寡核苷酸延伸以形成延伸序列，該延伸序列結合至包括如本文所描述之第二可偵測標記的一或多個經標記探針。
Claims (161)
- 一種偵測樣本中之所關注分析物之方法，其包括 a. 使包括（A）第一可偵測標記及（B）該所關注分析物之第一複合物與以下接觸，其中該第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記： （I）特異性結合至該第一可偵測標記且包括結合部分之信號放大試劑，及 （II）包括（1）該結合部分之結合搭配物及（2）第二可偵測標記中之一或多者的可偵測部分；及 b. 量測（I）該第二可偵測標記或（II）該第一可偵測標記及該第二可偵測標記，藉此偵測該所關注分析物； 或 c. 使包括（A）第一可偵測標記及（B）該所關注分析物之第一複合物與以下接觸，其中該第一可偵測標記為ECL標記： （I）特異性結合至該第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑，及 （II）該酶之受質；及 d. 量測酶活性，藉此偵測該所關注分析物； 或 e. 使包括（A）第一可偵測標記及（B）該所關注分析物之第一複合物與特異性結合至該第一可偵測標記且視情況包括第二可偵測標記之信號放大試劑接觸，其中該第一可偵測標記為ECL標記；及 f. 量測（I）該第一可偵測標記；（II）該第二可偵測標記；或（III）該第一可偵測標記及該第二可偵測標記，藉此偵測該所關注分析物； 或 g. 使包括（A）第一可偵測標記及（B）該所關注分析物之第一複合物與特異性結合至該第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，其中該第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記，其中該信號放大試劑包括核酸探針，藉此形成包括該第一複合物及該信號放大試劑之第二複合物； h. 延伸該核酸探針以形成延伸序列；及 i. 量測延伸序列之量，藉此偵測該所關注分析物。
- 如請求項1之方法，其中該第一複合物處於表面上。
- 如請求項2之方法，其中該第一複合物包括特異性結合至該分析物之捕捉試劑，其中該捕捉試劑固定在該表面上或其中該捕捉試劑能夠固定至該表面；及特異性結合至該分析物且包括該第一可偵測標記之偵測試劑。
- 如請求項3之方法，其中該偵測試劑為第一偵測試劑，且其中該第一複合物進一步包括特異性結合至該分析物之第二偵測試劑，其中該第二偵測試劑包括第一可偵測標記，其中該信號放大試劑能夠同時結合至該第一偵測試劑上之該第一可偵測標記及該第二偵測試劑上之該第一可偵測標記。
- 如請求項3或4之方法，其中該捕捉試劑固定在該表面上。
- 如請求項3或4之方法，其中該捕捉試劑能夠固定至該表面，且其中該方法包括在（a）、（c）、（e）或（g）之該接觸之前使該捕捉試劑固定至該表面。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中使該第一複合物與（I）特異性結合至該第一可偵測標記且包括結合部分之信號放大試劑及（II）包括（1）該結合部分之結合搭配物及（2）第二可偵測標記中之一或多者的可偵測部分接觸。
- 如請求項7之方法，其中（b）之該量測包括量測該第二可偵測標記；或其中（b）之該量測包括量測該第一可偵測標記及該第二可偵測標記。
- 如請求項7或8之方法，其中首先使該第一複合物與該信號放大試劑接觸，隨後與該可偵測部分接觸；或 其中使該第一複合物同時或實質上同時與該信號放大試劑及該可偵測部分接觸。
- 如請求項7至9中任一項之方法，其中（a）之該接觸包括：（I）形成包括該信號放大試劑及該可偵測部分之信號放大複合物；及（II）使該第一複合物與該信號放大複合物接觸。
- 如請求項10之方法，其中該可偵測部分包括用於該結合部分之多個結合位點及/或該結合部分包括用於該可偵測部分之多個結合位點，其中該信號放大複合物包括複數種信號放大試劑，且其中各信號放大試劑結合至一或多個可偵測部分。
- 如請求項7至11中任一項之方法，其中該結合部分及該可偵測部分包括互補寡核苷酸、受體-配位體對、抗原-抗體對、半抗原-抗體對、抗原決定基-抗體對、模擬抗原決定基-抗體對、適體-目標分子對或嵌入劑-目標分子對。
- 如請求項12之方法，其中該結合部分包括寡核苷酸，且該可偵測部分包括互補寡核苷酸及第二可偵測標記中之一或多者；或 其中該結合部分包括生物素，且該可偵測部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白及第二可偵測標記中之一或多者；或 其中該結合部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白，且該可偵測部分包括生物素及第二可偵測標記中之一或多者。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中使該第一複合物與（I）特異性結合至該第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑及（II）該酶之受質接觸。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中使該第一複合物與特異性結合至該第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，且（f）之該量測包括量測該第一可偵測標記。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中使該第一複合物與特異性結合至該第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，且（f）之該量測包括量測該第一可偵測標記、該第二可偵測標記或兩者。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中使該第一複合物與特異性結合至該第一可偵測標記且包括核酸探針之信號放大試劑接觸，藉此形成包括該第一複合物及該信號放大試劑之第二複合物。
- 如請求項17之方法，其中（h）之該延伸包括聚合酶鏈反應（PCR）、接合酶鏈反應（LCR）、股置換擴增（SDA）、自持續合成反應（3SR）、等溫擴增或其組合。
- 如請求項17或18之方法，其中（h）之該延伸包括使該核酸探針結合至模板寡核苷酸且藉由PCR延伸該核酸探針；或 其中該延伸包括使該核酸探針結合至模板寡核苷酸，形成環狀模板，且藉由滾環擴增（RCA）延伸該核酸探針。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中該第一複合物包括至少兩個第一可偵測標記； 其中該信號放大試劑為第一信號放大試劑，且（g）之該接觸進一步包括使該第一複合物與包括核酸探針之第二信號放大試劑接觸，其中該第一信號放大試劑及該第二信號放大試劑各自結合至不同的第一可偵測標記，且該第二複合物包括該第一複合物以及該第一信號放大試劑及該第二信號放大試劑；且 其中（h）之該延伸包括延伸該第一信號放大試劑及該第二信號放大試劑之該等核酸探針中之一或兩者以形成該延伸序列。
- 如請求項20之方法，其中（h）之該延伸包括使該第一信號放大試劑及該第二信號放大試劑之該等核酸探針中之一或兩者結合至模板寡核苷酸，形成環狀模板，且藉由RCA延伸一或兩個核酸探針。
- 如請求項20或21之方法，其中（h）之該延伸包括：使各核酸探針結合至不同的模板寡核苷酸；由各模板寡核苷酸形成環狀模板；及藉由RCA延伸各核酸探針。
- 如請求項20或21之方法，其中（h）之該延伸包括： 使兩個核酸探針與兩個模板寡核苷酸接觸，其中各模板寡核苷酸結合至各核酸探針之一部分； 使該兩個模板寡核苷酸接合以形成環狀模板；及 藉由RCA延伸該核酸探針中之一或兩者。
- 如請求項20至23中任一項之方法，其中該第一信號放大試劑及該第二信號放大試劑之該等核酸探針包括相同序列或由相同序列組成。
- 如請求項17至24中任一項之方法，其中該第一複合物處於表面上，且其中該方法進一步包括使錨定試劑固定在該表面上，其中該錨定試劑結合至該延伸序列之錨定區，且其中（i）之該量測包括量測經由該錨定試劑結合至該表面之延伸序列之量。
- 如請求項17至24中任一項之方法，其中該第一複合物處於表面上，且其中該表面包括經固定之錨定試劑，其中該錨定試劑結合至該延伸序列之錨定區，且其中（i）之該量測包括量測經由該錨定試劑結合至該表面之延伸序列之量。
- 如請求項26之方法，其中在（h）之該延伸之前或期間使該錨定試劑固定至該表面。
- 如請求項17至27中任一項之方法，其中該第一複合物處於表面上，且其中在該延伸之後該第二複合物結合至該表面。
- 如請求項25至28中任一項之方法，其中該錨定試劑及該錨定區包括互補寡核苷酸。
- 如請求項25至29中任一項之方法，其中該延伸序列在距離該表面上之該第二複合物小於100 μm之位置處結合至該錨定試劑。
- 如請求項17至30中任一項之方法，其中（i）之該量測包括使該延伸序列結合至包括第二可偵測標記之經標記探針且量測該表面上之（I）該第二可偵測標記或（II）該第一可偵測標記及該第二可偵測標記之量。
- 如請求項31之方法，其包括量測該表面上之該第二可偵測標記之量；或量測該表面上之該第一可偵測標記及該第二可偵測標記之量。
- 如請求項31或32之方法，其中該延伸序列及該經標記探針包括互補寡核苷酸。
- 如請求項3至33中任一項之方法，其中經由結合連接子使該第一可偵測標記與該偵測試劑連接。
- 如請求項4至34中任一項之方法，其中經由結合連接子使該第一可偵測標記與該第二偵測試劑連接。
- 如請求項2至35中任一項之方法，其中該表面包括粒子，或其中該表面包括多孔盤之孔。
- 如請求項25至36中任一項之方法，其中該第一複合物包括捕捉試劑，且其中該表面包括複數個不同的結合域，且該捕捉試劑及該錨定試劑位於該表面上之兩個不同的結合域上；或其中該捕捉試劑及該錨定試劑位於該表面上之相同的結合域上。
- 如請求項25至37中任一項之方法，其中該第一複合物包括捕捉試劑，且其中該捕捉試劑距離該表面上之該錨定試劑小於1 μm。
- 如請求項2至38中任一項之方法，其中該表面包括電極，且該量測進一步包括向該電極施加電壓形式以產生電化學發光信號。
- 如請求項39之方法，其中該表面包括粒子，且該方法進一步包括使該粒子集合在電極上，且該量測進一步包括向該電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。
- 如請求項1至40中任一項之方法，其中該方法進一步包括在（a）、（c）、（e）或（g）之該接觸之前偵測該第一複合物。
- 如請求項41之方法，其中該偵測該第一複合物包括量測該第一可偵測標記之量。
- 一種偵測樣本中之所關注分析物之方法，其包括 a. 在表面上形成包括該所關注分析物、特異性結合至該分析物之捕捉試劑及特異性結合至該分析物且包括第一核酸探針之偵測試劑的第一複合物，其中該捕捉試劑固定在該表面上或其中該捕捉試劑能夠固定至該表面； b. 延伸該第一核酸探針以形成包括第一錨定區之第一延伸序列，其中該第一錨定區結合固定在該表面上之第一錨定試劑； c. 使該第一延伸序列結合至包括第一可偵測標記之第一經標記探針，其中該第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記；及 d. 使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與以下接觸： （I）特異性結合至該第一可偵測標記且包括結合部分之信號放大試劑，及 （II）包括（1）該結合部分之結合搭配物及（2）第二可偵測標記中之一或多者的可偵測部分；及 e. 量測（I）該第二可偵測標記或（II）該第一可偵測標記及該第二可偵測標記，藉此偵測該所關注分析物； 或 f. 使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與以下接觸： （I）特異性結合至該第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑，及 （II）該酶之受質；及 g. 量測酶活性，藉此偵測該所關注分析物； 或 h. 使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與特異性結合至該第一可偵測標記且視情況包括第二可偵測標記之信號放大試劑接觸；及 i. 量測（I）該第一可偵測標記；（II）該第二可偵測標記；或（III）該第一可偵測標記及該第二可偵測標記，藉此偵測該所關注分析物； 或 j. 使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與特異性結合至該第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，其中該信號放大試劑包括第二核酸探針，藉此形成包括該信號放大試劑及該第一經標記探針之第二複合物； k. 延伸該第二核酸探針以形成包括第二錨定區之第二延伸序列，其中該第二錨定區結合固定在該表面上之第二錨定試劑；及； l. 量測結合至該表面之（I）該第二延伸序列或（II）該第一延伸序列及該第二延伸序列之量，藉此偵測該所關注分析物。
- 如請求項43之方法，其中該捕捉試劑固定在該表面上。
- 如請求項43之方法，其中該捕捉試劑能夠固定至該表面，且其中該方法包括在步驟（a）之前或期間使該捕捉試劑固定至該表面。
- 如請求項43至45之方法，其中（b）之該延伸包括聚合酶鏈反應（PCR）、接合酶鏈反應（LCR）、股置換擴增（SDA）、自持續合成反應（3SR）、等溫擴增或其組合。
- 如請求項43至46中任一項之方法，其中（b）之該延伸包括使該第一核酸探針結合至模板寡核苷酸且藉由PCR延伸該第一核酸探針；或 其中（b）之該延伸包括使該第一核酸探針結合至模板寡核苷酸，形成環狀模板，且藉由滾環擴增（RCA）延伸該第一核酸探針。
- 如請求項43至47中任一項之方法，其中在（b）之該延伸之後使該第一複合物結合至該表面。
- 如請求項43至48中任一項之方法，其進一步包括在步驟（b）之前或期間使該第一錨定試劑固定至該表面。
- 如請求項43至49中任一項之方法，其中該第一錨定試劑及該第一錨定區包括互補寡核苷酸。
- 如請求項43至50中任一項之方法，其中該第一延伸序列及該第一經標記探針包括互補寡核苷酸。
- 如請求項43至51中任一項之方法，其中使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與以下接觸：（I）特異性結合至該第一可偵測標記且包括結合部分之信號放大試劑，及（II）包括（1）該結合部分之結合搭配物及（2）第二可偵測標記中之一或多者的可偵測部分。
- 如請求項52之方法，其中首先使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與該信號放大試劑接觸，隨後與該可偵測部分接觸；或 其中使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針同時或實質上同時與該信號放大試劑及該可偵測部分接觸。
- 如請求項52或53中任一項之方法，其中（d）之該接觸包括：（I）形成包括該信號放大試劑及該可偵測部分之信號放大複合物；及（II）使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與該信號放大複合物接觸。
- 如請求項54之方法，其中該可偵測部分包括用於該結合部分之多個結合位點及/或該結合部分包括用於該可偵測部分之多個結合位點，其中該信號放大複合物包括複數種信號放大試劑，且其中各信號放大試劑結合至一或多個可偵測部分。
- 如請求項52至55中任一項之方法，其中該結合部分及該可偵測部分包括互補寡核苷酸、受體-配位體對、抗原-抗體對、半抗原-抗體對、抗原決定基-抗體對、模擬抗原決定基-抗體對、適體-目標分子對或嵌入劑-目標分子對。
- 如請求項56之方法，其中該結合部分包括寡核苷酸，且該可偵測部分包括互補寡核苷酸及第二可偵測標記中之一或多者；或 其中該結合部分包括生物素，且該可偵測部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白及第二可偵測標記中之一或多者；或 其中該結合部分包括抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白，且該可偵測部分包括生物素及第二可偵測標記中之一或多者。
- 如請求項43至51中任一項之方法，其中使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與（I）特異性結合至該第一可偵測標記且包括酶之信號放大試劑及（II）該酶之受質接觸。
- 如請求項43至51中任一項之方法，其中使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與特異性結合至該第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，且（i）之該量測包括量測該第一可偵測標記。
- 如請求項43至51中任一項之方法，其中使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與特異性結合至該第一可偵測標記之信號放大試劑接觸，且（i）之該量測包括量測該第一可偵測標記、該第二可偵測標記或兩者。
- 如請求項43至51中任一項之方法，其中使結合至該第一延伸序列之該第一經標記探針與特異性結合至該第一可偵測標記且包括第二核酸探針之信號放大試劑接觸，藉此形成包括該信號放大試劑及該第一經標記探針之第二複合物。
- 如請求項61之方法，其中（k）之該延伸包括聚合酶鏈反應（PCR）、接合酶鏈反應（LCR）、股置換擴增（SDA）、自持續合成反應（3SR）、等溫擴增或其組合。
- 如請求項61或62之方法，其中（k）之該延伸包括使二級核酸探針結合至模板寡核苷酸且藉由PCR延伸該二級核酸探針；或 其中（k）之該延伸包括使該二級核酸探針結合至模板寡核苷酸，形成環狀模板，且藉由滾環擴增（RCA）延伸該二級核酸探針。
- 如請求項61至63中任一項之方法，其進一步包括在（k）之該延伸之前或期間使該第二錨定試劑固定至該表面。
- 如請求項61至64中任一項之方法，其中在（k）之該延伸之後使該第二複合物結合至該表面。
- 如請求項61至65中任一項之方法，其中該第二錨定試劑及該第二錨定區包括互補寡核苷酸。
- 如請求項61至66中任一項之方法，其中該第一錨定區及該第二錨定區包括相同的寡核苷酸序列，或其中該第一錨定區及該第二錨定區包括不同的寡核苷酸序列。
- 如請求項61至67中任一項之方法，其中（l）之該量測包括使該第二延伸序列結合至包括第二可偵測標記之第二經標記探針且量測該表面上之（I）該第二可偵測標記或（II）該第一可偵測標記及該第二可偵測標記之量。
- 如請求項68之方法，其中該第二延伸序列及該第二經標記探針包括互補寡核苷酸。
- 如請求項69之方法，其中該第一經標記探針及該第二經標記探針包括相同的寡核苷酸序列，或其中該第一經標記探針及該第二經標記探針包括不同的寡核苷酸序列。
- 如請求項43至70中任一項之方法，其中經由結合連接子使該第一可偵測標記與該第一經標記探針連接。
- 如請求項43至71中任一項之方法，其中該表面包括粒子；或其中該表面包括多孔盤之孔。
- 如請求項43至72中任一項之方法，其中該表面包括複數個不同的結合域，且該捕捉試劑及該第一錨定試劑位於該表面上之兩個不同的結合域上；或其中該捕捉試劑及該第一錨定試劑位於該表面上之相同的結合域。
- 如請求項43至73中任一項之方法，其中該捕捉試劑距離該表面上之該第一錨定試劑小於1 μm。
- 如請求項43至74中任一項之方法，其中該表面包括電極，且該量測進一步包括向該電極施加電壓形式以產生電化學發光信號。
- 如請求項75之方法，其中該表面包括粒子，且該方法進一步包括使該粒子集合在電極上，且該量測進一步包括向該電極施加電壓波形以產生電化學發光信號。
- 如請求項43至76中任一項之方法，其中該方法進一步包括在（d）、（f）、（h）或（j）之該接觸之前偵測該表面上之該第一複合物。
- 如請求項77之方法，其中該偵測包括量測該表面上之該第一可偵測標記之量。
- 如請求項34至42中任一項或如請求項71至78中任一項之方法，其中該信號放大試劑特異性結合至該第一可偵測標記及該結合連接子。
- 如請求項79之方法，其中該接合連接子包括醯胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亞胺、三唑、肽、寡核苷酸、親水性聚合物或其組合。
- 如請求項3至80中任一項之方法，其中該捕捉試劑、該偵測試劑及該信號放大試劑各自包括抗體或其抗原結合片段、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。
- 如請求項81之方法，其中該捕捉試劑、該偵測試劑及該信號放大試劑各自包括抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項1至82中任一項之方法，其中該信號放大試劑為包括對電化學發光（ECL）標記具有特異性之抗原結合域的抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項1至83中任一項之方法，其中使用光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來量測該第一可偵測標記、該第二可偵測標記或兩者。
- 如請求項1至84中任一項之方法，其中該第一可偵測標記及該第二可偵測標記各自包括電化學發光（ECL）標記。
- 如請求項85之方法，其中該ECL標記包括有包括至少一種經取代聯吡啶配位體之有機金屬錯合物，其中該經取代聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團，視情況其中該有機金屬錯合物包括至少兩種經取代聯吡啶配位體，其中各經取代聯吡啶配位體包括至少一個磺酸根基團。
- 如請求項86之方法，其中該經取代聯吡啶配位體為式I化合物：。
- 如請求項85至87中任一項之方法，其中該ECL標記包括三種配位體，其中第一配位體為式I化合物，且其中第二配位體包括具有至少一個形成共價鍵之取代基的聯吡啶。
- 如請求項85至88中任一項之方法，其中該ECL標記包括三種配位體，其中該等配位體中之兩者各自為式I化合物，且其中第三配位體包括具有至少一個形成共價鍵之取代基的聯吡啶。
- 如請求項86至89中任一項之方法，其中該有機金屬錯合物包括釕、鋨或錸。
- 如請求項85至90中任一項之方法，其中該ECL標記為式II化合物：。
- 如請求項1至91中任一項之方法，其中該第一可偵測標記及該第二可偵測標記包括相同標記。
- 如請求項1至90中任一項之方法，其中該第一可偵測標記及該第二可偵測標記包括不同標記。
- 如請求項93之方法，其中該第一可偵測標記包括式II化合物，且該第二可偵測標記包括式III、IV、V或VI中任一者之化合物：；
；
，其中X為磷酸根、碳酸根、硼酸根或其組合；
。
- 如請求項93之方法，其中該第一可偵測標記包括式III化合物，且該第二可偵測標記包括式II、IV、V或VI中任一者之化合物。
- 如請求項93之方法，其中該第一可偵測標記包括式IV化合物，且該第二可偵測標記包括式II、III、V或VI中任一者之化合物。
- 如請求項93之方法，其中該第一可偵測標記包括式V化合物，且該第二可偵測標記包括式II、III、IV或VI中任一者之化合物。
- 如請求項93之方法，其中該第一可偵測標記包括式VI化合物，且該第二可偵測標記包括式II、III、IV或V中任一者之化合物。
- 一種用於偵測樣本中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或區室中包括： a. 特異性結合至該分析物之捕捉試劑； b. 特異性結合至該分析物之偵測試劑，其中該第一偵測試劑包括第一可偵測標記，其中該第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記；及 c. 特異性結合至該第一可偵測標記之信號放大試劑。
- 如請求項99之套組，其中該偵測試劑為第一偵測試劑，且其中該套組進一步包括特異性結合至該分析物之第二偵測試劑，其中該第二偵測試劑包括第一可偵測標記。
- 一種用於偵測樣本中之所關注分析物之套組，其在一或多個小瓶、容器或區室中包括： a 特異性結合至該分析物之捕捉試劑； b 特異性結合至該分析物之偵測試劑，其中該偵測試劑包括第一核酸探針； c 包括第一可偵測標記之第一經標記探針，其中該第一可偵測標記為電化學發光（ECL）標記；及 d 特異性結合至該第一可偵測標記之信號放大試劑。
- 如請求項99至101中任一項之套組，其中該捕捉試劑、該第一偵測試劑及該信號放大試劑各自包括抗體或其抗原結合片段、抗原、配位體、受體、寡核苷酸、半抗原、抗原決定基、模擬抗原決定基或適體。
- 如請求項102之套組，其中該捕捉試劑、該偵測試劑及該信號放大試劑各自包括抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項99至103中任一項之套組，其中該信號放大試劑為包括對電化學發光（ECL）標記具有特異性之抗原結合域的抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項99至104中任一項之套組，其中該信號放大試劑包括結合部分。
- 如請求項99至104中任一項之套組，其進一步包括用於使結合部分結合至該信號放大試劑之試劑。
- 如請求項105或106之套組，其中該結合部分包括寡核苷酸；或其中該結合部分包括生物素。
- 如請求項105至107中任一項之套組，其進一步包括有包括（i）該結合部分之結合搭配物及（ii）第二可偵測標記中之一或多者的可偵測部分。
- 如請求項108之套組，其中該結合部分包括寡核苷酸，且該可偵測部分包括互補寡核苷酸及第二可偵測標記中之一或多者；或其中該結合部分包括生物素，且該可偵測部分包括鏈黴抗生物素蛋白及第二可偵測標記中之一或多者。
- 如請求項99至104中任一項之套組，其中該信號放大試劑包括酶。
- 如請求項110之套組，其進一步包括該酶之受質。
- 如請求項99至104中任一項之套組，其中該信號放大試劑包括第二可偵測標記。
- 如請求項99或100或如請求項102至104中任一項之套組，其中該信號放大試劑包括核酸探針。
- 如請求項99或100或如請求項102至104中任一項之套組，其進一步包括用於使核酸探針結合至該信號放大試劑之試劑。
- 如請求項101至104中任一項之套組，其中該信號放大試劑包括第二核酸探針。
- 如請求項101至104中任一項之套組，其進一步包括用於使二級核酸探針結合至該信號放大試劑之試劑。
- 如請求項113至116中任一項之套組，其進一步包括模板寡核苷酸。
- 如請求項113至117中任一項之套組，其進一步包括錨定試劑。
- 如請求項99至118中任一項之套組，其進一步包括表面。
- 如請求項119之套組，其中該表面包括粒子，或其中該表面包括多孔盤之孔。
- 如請求項119或120之套組，其中該捕捉試劑固定在該表面上。
- 如請求項119或120之套組，其進一步包括用於使該捕捉試劑固定至該表面之試劑。
- 如請求項119至122中任一項之套組，其中該套組包括錨定試劑，其中該錨定試劑固定在該表面上。
- 如請求項119至122中任一項之套組，其中該套組包括錨定試劑及用於使該錨定試劑固定至該表面之試劑。
- 如請求項123或124之套組，其中該表面包括複數個不同的結合域，且該捕捉試劑及該錨定試劑位於該表面上之兩個不同的結合域上，或其中該捕捉試劑及該錨定試劑位於該表面上之相同的結合域上。
- 如請求項123至125中任一項之套組，其中該捕捉試劑距離該表面上之該錨定試劑小於1 μm。
- 如請求項119至126中任一項之套組，其中該表面包括電極。
- 如請求項99至127中任一項之套組，其進一步包括聚合酶、接合酶、緩衝劑、阻斷劑、共反應物、稀釋劑、穩定劑、校準劑、分析消耗品、電極或其組合。
- 一種抗體或其抗原結合片段，其包括對電化學發光（ECL）標記具有特異性之抗原結合域。
- 一種抗體或其抗原結合片段，其包括對該ECL標記及結合連接子具有特異性之抗原結合域。
- 如請求項129或130之抗體或其抗原結合片段，其中該ECL標記包括式II化合物。
- 如請求項130或131之抗體或抗原結合片段，其中該結合連接子包括醯胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亞胺、三唑、肽、寡核苷酸或親水性聚合物。
- 如請求項129至132中任一項之抗體或抗原結合片段，其進一步包括核酸探針。
- 一種組合物，其包括 a. 如請求項133之抗體或抗原結合片段；及 b. 能夠結合至該核酸探針之模板寡核苷酸。
- 如請求項129至132中任一項之抗體或抗原結合片段，其進一步包括酶。
- 一種組合物，其包括 a. 如請求項135之抗體或抗原結合片段；及 b. 該酶之受質。
- 如請求項129至132中任一項之抗體或抗原結合片段，其進一步包括可偵測標記。
- 如請求項129至132中任一項之抗體或抗原結合片段，其進一步包括結合部分。
- 一種組合物，其包括 a. 如請求項138之抗體或抗原結合片段；及 b. 包括（I）該結合部分之結合搭配物及（II）一或多個可偵測標記之可偵測部分。
- 如請求項139之組合物，其中該結合部分包括寡核苷酸，且該可偵測部分包括互補寡核苷酸及可偵測標記中之一或多者；或其中該結合部分包括生物素，且該可偵測部分包括鏈黴抗生物素蛋白及可偵測標記中之一或多者。
- 如請求項137至140中任一項之組合物，其中該可偵測標記能夠藉由光散射、吸光度、螢光、化學發光、電化學發光、生物發光、磷光、放射性、磁場或其組合來加以量測。
- 如請求項141之組合物，其中該可偵測標記為電化學發光標記。
- 一種套組，其包括如請求項133之抗體或抗原結合片段。
- 一種套組，其包括如請求項135、137或138之抗體或抗原結合片段。
- 如請求項143或144之套組，其進一步包括錨定試劑、模板寡核苷酸、經標記探針、聚合酶、接合酶、緩衝劑、阻斷劑、共反應物、稀釋劑、穩定劑、校準劑、分析消耗品或其組合。
- 如請求項143至145中任一項之套組，其進一步包括捕捉試劑及偵測試劑中之一或兩者，其中該偵測試劑包括該ECL標記。
- 如請求項146之套組，其中該偵測試劑為第一偵測試劑，且其中該套組進一步包括第二偵測試劑，其中該第二偵測試劑包括該ECL標記。
- 如請求項143至147中任一項之套組，其進一步包括表面。
- 一種分析系統，其包括： 至少一個記憶體單元； 根據該至少一個記憶體單元上之指令經程式化之至少一個處理單元；及 經組態以受該至少一個處理單元控制之至少一個分析系統組件，其中該至少一個處理單元經組態以： 控制該至少一個分析系統組件以執行以下中之一或兩者：樣本中之較高豐度分析物之第一次量測；及該樣本中之較低豐度分析物之第二次量測， 其中該樣本中存在比該較低豐度分析物多大致10至100000倍之該較高豐度分析物， 其中使用包括ECL標記之偵測試劑偵測該較高豐度分析物， 且其中使用（i）包括ECL標記之偵測試劑及（ii）特異性結合至該ECL標記之信號放大試劑偵測該較低豐度分析物。
- 如請求項149之分析系統，其中對包括（i）包括該較高豐度分析物之一或多個結合域及（ii）包括該較低豐度分析物之一或多個結合域的表面執行該第一次量測及/或該第二次量測。
- 如請求項150之分析系統，其中該分析系統經組態以選擇性執行針對包括該較高豐度分析物之該一或多個結合域之該第一次量測，且選擇性執行針對包括該較低豐度分析物之該一或多個結合域之該第二次量測。
- 如請求項151之分析系統，其中該分析系統經組態以基於對來自該第一次量測之低於預定義臨限值之值進行的測定選擇性執行針對該等結合域之第二次量測。
- 如請求項149至152中任一項之分析系統，其中該分析系統經組態以依序執行該第一次量測及該第二次量測。
- 如請求項149至153中任一項之分析系統，該分析系統經組態以同時或實質上同時執行該第一次量測及該第二次量測。
- 一或多種非暫時性電腦可讀媒體，其上儲存有指令，該等指令在由至少一個處理單元執行時使該至少一個處理單元： 經由控制分析系統來執行以下中之一或兩者：樣本中之較高豐度分析物之第一次量測；及該樣本中之較低豐度分析物之第二次量測， 其中該樣本中存在比該較低豐度分析物多大致10至100000倍之該較高豐度分析物， 其中使用包括ECL標記之偵測試劑偵測該較高豐度分析物， 且其中使用（i）包括ECL標記之偵測試劑及（ii）特異性結合至該ECL標記之信號放大試劑偵測該較低豐度分析物。
- 如請求項155之一或多種非暫時性電腦可讀媒體，其中對包括（i）包括該較高豐度分析物之一或多個結合域及（ii）包括該較低豐度分析物之一或多個結合域的表面執行該第一次量測及/或該第二次量測。
- 如請求項156之一或多種非暫時性電腦可讀媒體，其中該分析系統經組態以選擇性執行針對包括該較高豐度分析物之該一或多個結合域之該第一次量測，且選擇性執行針對包括該較低豐度分析物之該一或多個結合域之該第二次量測。
- 如請求項156之一或多種非暫時性電腦可讀媒體，其中該分析系統經組態以基於對來自該第一次量測之低於預定義臨限值之值進行的測定選擇性執行針對該等結合域之第二次量測。
- 如請求項155至158中任一項之一或多種非暫時性電腦可讀媒體，其中該分析系統經組態以依序執行該第一次量測及該第二次量測。
- 如請求項155至158中任一項之一或多種非暫時性電腦可讀媒體，該分析系統經組態以同時或實質上同時執行該第一次量測及該第二次量測。
- 一種分析系統，其包括： 至少一個記憶體單元； 根據該至少一個記憶體單元上之指令經程式化之至少一個處理單元；及 經組態以受該至少一個處理單元控制之至少一個分析系統組件，其中該至少一個處理單元經組態以： 控制該至少一個分析系統組件以執行樣本中之分析物之量測， 其中該分析物能夠在以約0.0001 pg/mL至約100000 pg/mL之濃度存在時使用包括ECL標記之單一偵測試劑在該樣本中被偵測到。
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