CN117999482A - 用于测定信号扩增的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于测定信号扩增的方法、组合物、试剂盒和测定系统。本文还提供了信号扩增试剂，其中所述信号扩增试剂是抗体或其抗原结合片段。
Description
技术领域
本发明涉及用于测定信号扩增的方法、组合物和试剂盒。本文还提供了信号扩增试剂，其中所述信号扩增试剂是抗体或其抗原结合片段。
背景技术
免疫测定，例如夹心免疫测定通常用于检测样品中的分析物。典型的免疫测定通常不够灵敏，不足以准确地检测样品中的低丰度分析物，或者测定仪器本身在检测低信号水平方面受到限制。用于提高测定灵敏度的方法通常涉及复杂的优化程序，这可能是一个耗时耗力的过程。此外，经优化的测定可能需要更长的运行时间和/或复杂的分析方法。
发明内容
在实施例中，本发明提供了一种检测样品中的所关注的分析物的方法，所述方法包括：
(a)使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与以下接触，其中所述第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括结合部分，以及(II)可检测部分，所述可检测部分包括(1)所述结合部分的结合配偶体，以及(2)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；以及(b)测量(I)所述第二可检测标记或(II)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(c)使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与以下接触，其中所述第一可检测标记是ECL标记：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括酶，以及(II)所述酶的底物；以及(d)测量酶活性，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(e)使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与信号扩增试剂接触，其中所述第一可检测标记是ECL标记，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且任选地包括第二可检测标记；以及(f)测量(I)所述第一可检测标记；(II)所述第二可检测标记；或(III)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(g)使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与信号扩增试剂接触，其中所述第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，其中所述信号扩增试剂包括信号扩增(SA)核酸探针，由此形成包括所述第一复合物和所述信号扩增试剂的第二复合物；(h)延伸所述核酸探针以形成经延伸的序列；以及(i)测量经延伸的序列的量，由此检测所述所关注的分析物。在实施例中，第一复合物在表面上。
在实施例中，信号扩增试剂包括核酸探针，并且表面包括固定于其上的锚定试剂。在实施例中，信号扩增试剂包括核酸探针，并且所述方法进一步包括将锚定试剂固定在表面上。在实施例中，在所述方法的步骤(h)之前或期间，将锚定试剂固定在表面上。在实施例中，锚定试剂与经延伸的序列的锚定区结合，并且测量包括测量通过锚定试剂与表面结合的经延伸的序列的量。
在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其用于检测样品中的所关注的分析物，所述试剂盒包括在一个或多个小瓶、容器或隔室中的以下各项：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合；(b)检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合，其中所述检测试剂包括第一可检测标记，其中所述第一可检测标记是ECL标记；以及(c)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合。在实施例中，试剂盒进一步包括表面。
在实施例中，本发明提供了一种检测样品中的所关注的分析物的方法，所述方法包括(a)在表面上形成第一复合物，所述第一复合物包括所述所关注的分析物；捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合，其中所述捕获试剂固定在所述表面上，或者其中所述捕获试剂能够固定到所述表面；以及检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合并且包括第一核酸探针；(b)延伸所述第一核酸探针以形成包括第一锚定区的第一经延伸的序列，其中所述第一锚定区与固定在所述表面上的第一锚定试剂结合；(c)将所述第一经延伸的序列与包括第一可检测标记的第一标记探针结合，其中所述第一可检测标记是ECL标记；以及：
(d)使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括结合部分，以及(II)可检测部分，所述可检测部分包括(1)所述结合部分的结合配偶体，以及(2)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；以及(e)测量所述表面上的(I)所述第二可检测标记或(II)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(f)使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括酶，以及(II)所述酶的底物；以及(g)测量酶活性，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(h)使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且任选地包括第二可检测标记；以及(i)测量(I)所述第一可检测标记；(II)所述第二可检测标记；或(III)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(j)使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，其中所述信号扩增试剂包括第二核酸探针，由此形成包括所述信号扩增试剂和所述第一标记探针的第二复合物；(k)延伸所述第二核酸探针以形成包括第二锚定区的第二经延伸的序列，其中所述第二锚定区与固定在所述表面上的第二锚定试剂结合；以及(l)测量与所述表面结合的(I)所述第二经延伸的序列或(II)所述第一经延伸的序列和所述第二经延伸的序列的量，由此检测所述所关注的分析物。
在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其用于检测样品中的所关注的分析物，所述试剂盒包括在一个或多个小瓶、容器或隔室中的以下各项：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合；(b)检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合，其中所述检测试剂包括第一核酸探针；(c)第一标记探针，所述第一标记探针包括第一可检测标记，其中所述第一可检测标记是ECL标记；以及(d)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合。在实施例中，试剂盒进一步包括表面。
在实施例中，本发明提供了包括对ECL标记具有特异性的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。
在实施例中，本发明提供了包括对以下具有特异性的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段：ECL标记和缀合接头。
在实施例中，本发明提供了一种组合物，其包括：(a)本文所提供的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括核酸探针；以及(b)模板寡核苷酸，所述模板寡核苷酸能够与所述核酸探针结合。在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其包括本文所提供的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括核酸探针。在实施例中，试剂盒进一步包括(i)模板寡核苷酸，所述模板寡核苷酸能够与核酸探针结合，以及(ii)标记探针，所述标记探针包括可检测标记，其中所述可检测标记是ECL标记。在实施例中，模板寡核苷酸是环状模板寡核苷酸。在实施例中，试剂盒进一步包括(iii)锚定试剂。在实施例中，试剂盒进一步包括核酸扩增酶(例如，聚合酶)、表面、捕获试剂和/或检测试剂。
在实施例中，本发明提供了一种组合物，其包括：(a)本文所提供的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括酶；以及(b)所述酶的底物。在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其包括本文所提供的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括酶。
在实施例中，本发明提供了一种组合物，其包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括可检测标记。在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其包括本文所提供的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括可检测标记。
在实施例中，本发明提供了一种组合物，其包括：(a)本文所提供的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括结合部分；以及(b)可检测部分，所述可检测部分包括(i)所述结合部分的结合配偶体，以及(ii)一个或多个可检测标记。在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其包括本文所提供的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括结合部分。
在实施例中，本发明提供了一种测定系统，其包括：至少一个存储器单元；至少一个处理单元，所述至少一个处理单元根据所述至少一个存储器单元上的指令编程；以及至少一个测定系统组件，所述至少一个测定系统组件被配置成由所述至少一个处理单元控制，其中所述至少一个处理单元被配置成：控制所述至少一个测定系统组件以进行以下中的一项或两项：对样品中的较高丰度分析物进行第一测量；以及对所述样品中的较低丰度分析物进行第二测量，其中存在于所述样品中的所述较高丰度分析物是所述较低丰度分析物的大约10至100000倍，其中使用包括ECL标记的检测试剂来检测所述较高丰度分析物，并且其中使用(i)包括ECL标记的检测试剂和(ii)与所述ECL标记特异性结合的信号扩增试剂来检测所述较低丰度分析物。
在实施例中，本发明提供了一种或多种非暂时性计算机可读介质，在其上存储有指令，所述指令在由至少一个处理单元执行时使所述至少一个处理单元：通过控制测定系统进行以下中的一项或两项：对样品中的较高丰度分析物进行第一测量；以及对所述样品中的较低丰度分析物进行第二测量，其中存在于所述样品中的所述较高丰度分析物是所述较低丰度分析物的大约10至100000倍，其中使用包括ECL标记的检测试剂来检测所述较高丰度分析物，并且其中使用(i)包括ECL标记的检测试剂和(ii)与所述ECL标记特异性结合的信号扩增试剂来检测所述较低丰度分析物。
在实施例中，本发明提供了一种测定系统，其包括：至少一个存储器单元；至少一个处理单元，所述至少一个处理单元根据所述至少一个存储器单元上的指令编程；以及至少一个测定系统组件，所述至少一个测定系统组件被配置成由所述至少一个处理单元控制，其中所述至少一个处理单元被配置成：控制所述至少一个测定系统组件以对样品中的分析物进行测量，其中当所述分析物以约0.0001至约100000pg/mL的浓度存在时，所述分析物能够使用包括ECL标记的单一检测试剂在所述样品中检测到。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且被包含以进一步阐述本发明的某些方面的示例性实施例。
图1A-1D展示了本文所描述的方法的实施例。在图1A中，在表面上形成包括捕获试剂、分析物和具有多个第一可检测标记的检测试剂的第一复合物。通过捕获试剂上的靶向剂补体与表面上的靶向剂的结合，将捕获试剂固定到表面。将包括核酸探针的信号扩增试剂(“具有核酸探针的信号扩增试剂”)添加到第一复合物中，由此形成第二复合物。检测试剂包括多个第一可检测标记，从而允许多种信号扩增试剂与每种检测试剂结合。在实施例中，使用本文所描述的方法扩增每种信号扩增试剂的核酸探针。图1B示出了包括捕获试剂(“CR”)、分析物、包括第一可检测标记(“第1标记”)的检测试剂(“DR”)和包括核酸探针的信号扩增试剂(“SAR”)的第二复合物，其中所述核酸探针通过模板寡核苷酸(“模板oligo”)延伸以形成经延伸的序列(“经延伸的seq”)，并且标记探针与经延伸的序列结合。图1C示出了另外的实施例，其中检测试剂包括三个第一可检测标记，每个可检测标记与包括与两个标记探针结合的经延伸的序列的第一信号扩增试剂结合。图1D示出了另外的实施例，其中检测试剂包括两个第一可检测标记，其中每个可检测标记与包括核酸探针的信号扩增试剂结合，并且两个模板寡核苷酸与两个核酸探针杂交，其中每个模板寡核苷酸与两个核酸探针杂交。在实施例中，两个模板寡核苷酸能够连接在一起以形成环状模板。
图2展示了本文所描述的方法的实施例。在表面上形成包括捕获试剂、分析物和具有多个第一可检测标记的检测试剂的第一复合物。在一个或多个步骤中，将(1)包括结合部分的信号扩增试剂以及(2)包括多个第二可检测标记的可检测部分两者添加到第一复合物中。检测试剂包括多个第一可检测标记，从而允许多种信号扩增试剂与每种检测试剂结合。包括多个第二可检测标记的可检测部分通过结合部分与每种信号扩增试剂结合。
图3展示了本文所描述的方法的实施例。在表面上形成包括捕获试剂、分析物和具有多个第一可检测标记的检测试剂的第一复合物。通过捕获试剂上的靶向剂补体与表面上的靶向剂的结合，将捕获试剂固定到表面。在一个或多个步骤中，将(1)包括寡核苷酸结合部分的信号扩增试剂以及(2)包括多个第二可检测标记的寡核苷酸可检测部分两者添加到第一复合物中。检测试剂包括多个第一可检测标记，从而允许多种信号扩增试剂与每种检测试剂结合。包括多个第二可检测标记的可检测部分通过结合部分与每种信号扩增试剂结合。
图4展示了本文所描述的方法的实施例。在表面上形成包括捕获试剂、分析物和具有多个第一可检测标记的检测试剂的第一复合物。将多种信号扩增试剂和可检测部分混合，其中每个可检测部分包括多个第二可检测标记，并且其中每个可检测部分能够与多个结合部分结合，由此形成包括多种信号扩增试剂和可检测部分的信号扩增复合物。然后将信号扩增复合物添加到第一复合物中。检测试剂包括多个第一可检测标记，从而允许信号扩增复合物的多种信号扩增试剂与每种检测试剂结合。包括多个第二可检测标记的可检测部分通过结合部分与每种信号扩增试剂结合。
图5展示了本文所描述的用于筛选抗血清和杂交瘤的方法的实施例。将山羊抗小鼠(GAM)抗体被固定在测定板的结合结构域(“点”)上，并结合样品中小鼠产生的抗体。在测定形式1中，BSA缀合的MSD SULFO-TAGTMECL标记(“SULFO-TAG”)用于检测样品中对SULFO-TAG具有特异性的抗体。在测定形式2中，未经缀合的SULFO-TAG用于检测样品中对SULFO-TAG具有特异性的抗体。
图6示出了用于筛选十一个抗SULFO-TAG抗体克隆作为信号扩增试剂的示例性免疫测定的结果。免疫测定的分析物是人ZnT8、人IA-2、人TGM-2或小鼠IL-1b。示出了在每个分析物特异性免疫测定中的每个抗SULFO-TAG抗体的经测量的ECL测定信号。
图7示出了使用六种不同的抗SULFO-TAG抗体克隆作为信号扩增试剂，以人ZnT8作为分析物的示例性校准物滴定免疫测定的结果。示出了具有七种不同浓度的人ZnT8校准物(编号为STD 01至STD 07)和空白(STD 08)的经测量的ECL信号。示出了希尔斜率(Hillslope)、R平方值、最低检测极限(LLOD)、STD 04的信号背景比(S/B)(基于STD 04/STD 08值)和STD 04的信噪比(S/N)(基于STD 04/STD 08值)。
图8示出了使用六种不同的抗SULFO-TAG抗体克隆作为信号扩增试剂，以人TGM-2作为分析物的示例性校准物滴定免疫测定的结果。示出了具有七种不同浓度的人TGM-2校准物(编号为STD 01至STD 07)和空白(STD 08)的经测量的ECL信号。示出了希尔斜率、R平方值、最低检测极限(LLOD)、STD 04的信号背景比(S/B)(基于STD 04/STD 08值)和STD 04的信噪比(S/N)(基于STD 04/STD 08值)。
图9示出了使用与如图7和8中所示出的相同的人ZnT8和TGM-2校准物的示例性校准滴定免疫测定的结果，但是在没有抗SULFO-TAG作为信号扩增试剂的情况下进行免疫测定。示出了经测量的ECL信号、希尔斜率、R平方值、最低检测极限(LLOD)、STD 04的信号背景比(S/B)(基于STD 04/STD 08值)和STD 04的信噪比(S/N)(基于STD 04/STD 08值)。
图10示出了使用六种不同的抗SULFO-TAG抗体克隆作为信号扩增试剂，以小鼠IL-23作为分析物的示例性校准物滴定免疫测定的结果。示出了具有三种不同浓度的小鼠IL-23校准物(编号为STD 01至STD 03)和空白(STD 04)的经测量的ECL信号。示出了希尔斜率、R平方值、最低检测极限(LLOD)、STD 02的信号背景比(S/B)(基于STD 02/STD 04值)和STD02的信噪比(S/N)(基于STD 02/STD 04值)。
图11示出了使用六种不同的抗SULFO-TAG抗体克隆作为信号扩增试剂，以小鼠IL-17C作为分析物的示例性校准物滴定免疫测定的结果。示出了具有三种不同浓度的小鼠IL-17C校准物(编号为STD 01至STD 03)和空白(STD 04)的经测量的ECL信号。示出了希尔斜率、R平方值、最低检测极限(LLOD)、STD 02的信号背景比(S/B)(基于STD 02/STD 04值)和STD 02的信噪比(S/N)(基于STD 02/STD 04值)。
图12示出了使用与如图10和11中所示出的相同的小鼠IL-23和IL-17C校准物的示例性校准滴定免疫测定的结果，但是在没有抗SULFO-TAG作为信号扩增试剂的情况下进行免疫测定。示出了经测量的ECL信号和最低检测极限(LLOD)。
图13示出了使用六种不同的抗SULFO-TAG抗体克隆作为信号扩增试剂，以人IL-10作为分析物的示例性校准物滴定免疫测定的结果。示出了具有三种不同浓度的人IL-10校准物(编号为STD 01至STD 03)和空白(STD 04)的经测量的ECL信号。示出了希尔斜率、R平方值、最低检测极限(LLOD)、STD 02的信号背景比(S/B)(基于STD 02/STD 04值)和STD 02的信噪比(S/N)(基于STD 02/STD 04值)。
图14示出了使用与如图13中所示出的相同的人IL-10校准物的示例性校准滴定免疫测定的结果，但是在没有抗SULFO-TAG作为信号扩增试剂的情况下进行免疫测定。示出了经测量的ECL信号和最低检测极限(LLOD)。
图15展示了本文所描述的方法的实施例。在表面上形成包括捕获试剂、分析物和具有第一核酸探针的检测试剂的第一复合物。延伸第一核酸探针(“扩增1”)以形成第一经延伸的序列。多个第一标记探针与第一经延伸的序列结合，每个第一标记探针包括第一可检测标记。各自包括第二核酸探针的多种信号扩增试剂与第一可检测标记结合。延伸第二核酸探针中的每个第二核酸探针(“扩增2”)以形成第二经延伸的序列。各自包括第二可检测标记的一个或多个第二标记探针与第二经延伸的序列结合。
图16A-16C示出了为测量图6中所示出的抗SULFO-TAG抗体克隆的信号抑制和信号增强而进行的示例性测定的结果。图16A示出了每个抗SULFO-TAG抗体克隆的信号抑制百分比(％)和信号增加％。图16B示出了每个抗体克隆的信号抑制％的柱状图。图16B示出了每个抗体克隆的信号增加％的柱状图。
图17示出了本文所描述的方法的实施例。包括捕获试剂、分析物和具有第一可检测标记的检测试剂的第一复合物在表面上。在一个或多个步骤中，将包括酶和酶底物的信号扩增试剂添加到第一复合物中。酶作用于底物以产生可检测信号。
图18A示出了具有不同数量的磺甲基联吡啶(“SM”)、联吡啶(“Bpy”)或酸(“A”)配体的示例性有机金属Ru2+化合物(“TAG化合物”)。图18B示出了示例性TAG化合物的ECL产生能力。
图19示出了用图18A中所示出的TAG化合物和实例4中所描述的抗SULFO-TAG抗体克隆进行的示例性结合测定的结果。测量来自抗SULFO-TAG抗体的ECL信号，其中较高的信号指示较强的结合亲和力。右边的插图示出了在较高浓度下(从10至1000nM)与Ru+2(Bpy)3化合物结合的抗体。
图20示出了图18A中所示出的TAG化合物和图18A中所示出的SM、Bpy或A配体与实例4中所描述的抗SULFO-TAG抗体克隆之间的示例性竞争性结合测定的结果。该图示出了抗SULFO-TAG抗体暴露于2μM每种配体，然后改变每种TAG化合物浓度后的剩余ECL信号。较低的ECL信号指示对特定配体的结合亲和力较强。最右栏中的三个小图示出了将抗SULFO-TAG抗体克隆单独暴露于10nM TAG化合物(无配体)时的ECL信号。
图21示出了含有作为联吡啶配体上的取代基的不同带电荷的官能团的示例性有机金属Ru2+化合物。
图22A-22D示出了本文所描述的方法的实施例。在图22A-22D的每个图中，复合物包括捕获试剂(“CR”)、分析物、包括第一可检测标记(“第1标记”)的第一检测试剂(“第1DR”)、包括第一可检测标记的第二检测试剂(“第2DR”)、同时与第一检测试剂上的第一可检测标记和第二检测试剂上的第一可检测标记结合的信号扩增试剂(“SAR”)。在图22A中，描绘了没有任何其它组分的信号扩增试剂。如在图22A中标记的组分与图22B-22D中的相同。在图22B中，信号扩增试剂包括与可检测部分结合的结合部分和如本文所描述的第二可检测标记，所述可检测部分包括结合部分的结合配偶体。在图22C中，信号扩增试剂包括如本文所描述的第二可检测标记。在图22D中，信号扩增试剂包括核酸探针，所述核酸探针通过模板寡核苷酸延伸以形成与如本文所描述的一个或多个包括第二可检测标记的标记探针结合的经延伸的序列。
具体实施方式
除非本文另外定义，否则本公开中所使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另外要求，否则单数术语应当包含复数含义，并且复数术语应当包含单数含义。冠词“一个/一种(a/an)”在本文中用于指代所述冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法宾语。举例来说，“要素”意指一个要素或多于一个要素。
权利要求中对术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅指代替代方案以及指代“和/或”的定义。
如本文所使用的，术语“包括(comprising)”(以及包括的任何变体或形式，如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何变体或形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包含(including)”(以及包含的任何变体或形式，如“包含(includes)”和“包含(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何变体或形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或开放性的并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
术语“例如(for example)”及其对应的缩写“例如(e.g.)”(无论是否斜体)的使用意指所引用的特定术语是本公开的代表性实例和实施例，除非另有明确说明，否则所述代表性实例和实施例不旨在限于所参考或引用的特定实例。
如本文所使用的，“在…之间”是包含范围末端的范围。例如，x与y之间的数字明确地包含数字x和y以及落入x和y内的任何数字。
本发明提供了优于现有技术中所描述的测定方法的若干个优点。例如，本发明提供了一种简单方便的方法来增加测定中的可检测信号，使得可检测标记能够使用较低成本和/或较低复杂性的仪器来测量。此信号的增加也可以例如提供一种简单方便的方法，通过扩增可检测信号来提高测定的灵敏度。在实施例中，本文的方法提高了信噪比，并且能够更准确地检测例如样品中的低丰度物种。
在实施例中，本文的方法利用与可能已用于可商购获得的免疫测定中的可检测标记，例如ECL标记特异性结合的信号扩增试剂。取决于样品中分析物的浓度，当前可商购获得的免疫测定对于相同分析物可能需要不同的检测试剂。例如，当分析物浓度相对较高(例如，大于或为约1pg/mL)时，可以使用包括可检测标记的检测试剂，而当分析物浓度相对较低(例如，小于约1pg/mL)时，可以使用包括核酸探针的检测试剂。当测量以不同浓度存在于样品中的多种分析物时，当前的商业免疫测定还可能需要不同的测定形式和/或需要稀释或浓缩样品。在实施例中，当分析物浓度低时，本发明的方法使用信号扩增试剂来扩增测定信号，由此消除了使用多种类型的检测试剂、针对不同分析物浓度以不同的形式进行测定和/或浓缩或稀释样品以用于测量样品中的不同分析物的需要。在实施例中，对于由信号扩增试剂结合的每个第一可检测标记，信号扩增试剂提供和/或募集多个第二可检测标记，由此扩增测定信号。在实施例中，信号扩增试剂能够检测以低浓度(例如，小于1pg/mL)存在于样品中的分析物，由此允许当样品供应有限时稀释样品(例如，脑脊液样品、来自婴儿的生物样品和/或来自小动物如小鼠的生物样品)，从而保存有价值的样品。
在实施例中，信号扩增试剂包括一个或多个可检测标记，例如ECL标记；或者信号扩增试剂包括或形成募集一个或多个可检测标记，例如ECL标记的结合的部分，例如本文所描述的结合部分。因此，在实施例中，本文所描述的信号扩增试剂(1)特异性识别并结合第一可检测标记(例如，在如本文所描述的检测试剂上)，以及(2)能够募集一个或多个第二可检测标记以扩增测定信号。意外地发现，即使在第一可检测标记和第二可检测标记是相同标记的实施例中，信号扩增试剂也提供了令人惊讶的高水平的信号扩增。在此类情况下，预期第二可检测标记会与第一可检测标记竞争信号扩增试剂，即与第二可检测标记结合的信号扩增试剂不会结合第一可检测标记，因为信号扩增试剂对第一可检测标记和第二可检测标记两者具有相同的亲和力。信号扩增试剂与第二可检测标记的结合预期防止第二可检测标记被检测到，并且还防止信号扩增试剂成为表面上复合物的一部分，由此导致信号损失。因此，高水平的信号扩增是出乎意料的，特别是在第一可检测标记和第二可检测标记是相同标记的实施例中。
方法的实施例在图1A-1D中展示。在图1A中，在表面上形成包括捕获试剂、分析物和具有多个第一可检测标记的检测试剂的第一复合物。通过捕获试剂上的靶向剂补体与表面上的靶向剂的结合，将捕获试剂固定到表面。将包括核酸探针的信号扩增试剂添加到第一复合物中，由此形成包括捕获试剂、分析物、检测试剂和信号扩增试剂的第二复合物，如在图1B中所示出的。在实施例中，检测试剂包括多个第一可检测标记，由此允许多种信号扩增试剂与相同的检测试剂结合，如在图1A、1C和1D中所示出的。在实施例中，经延伸的序列由与检测试剂结合的每种信号扩增试剂形成，如在图1B和1C中所示出的。在实施例中，各自包括核酸探针的两种信号扩增试剂与检测试剂上的两个第一可检测标记结合。在实施例中，两个模板寡核苷酸与两个核酸探针杂交，例如，其中每个模板寡核苷酸与两个核酸探针杂交，如在图1D中所示出的。在实施例中，两个模板寡核苷酸例如通过连接形成环状模板，并且核酸探针中的一个或两个核酸探针被延伸以形成经延伸的序列。在实施例中，经延伸的序列与表面上的锚定试剂结合。在实施例中，在第一复合物形成之前、期间或之后，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，每个经延伸的序列与多个标记探针(例如，如在图1C中所示出的)结合，所述标记探针中的每个标记探针包含多个第二可检测标记。因此，在实施例中，每个第一可检测标记对应于多个第二可检测标记，由此扩增用于测量的信号。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。
所述方法的另外的实施例在图2中展示。在图2中，在表面上形成包括捕获试剂、分析物和具有多个第一可检测标记的检测试剂的第一复合物。将(1)包括结合部分的信号扩增试剂以及(2)包括多个第二可检测标记的可检测部分两者添加到第一复合物中。在实施例中，信号扩增试剂和可检测部分同时与第一复合物接触。在实施例中，信号扩增试剂和可检测部分依次与第一复合物接触。在实施例中，检测试剂包括多个第一可检测标记，由此允许多种信号扩增试剂与相同的检测试剂结合。因此，如在图2中所示出的，在实施例中，检测试剂上的每个第一可检测标记对应于可检测部分上的多个第二可检测标记，由此扩增用于测量的信号。本文进一步描述了方法的组成部分。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。
所述方法的另外的实施例在图3中展示。在图3中，在表面上形成包括捕获试剂、分析物和具有多个第一可检测标记的检测试剂的第一复合物。通过捕获试剂上的靶向剂补体与表面上的靶向剂的结合，将捕获试剂固定到表面。将(1)包括寡核苷酸结合部分的信号扩增试剂以及(2)包括多个第二可检测标记的寡核苷酸可检测部分两者添加到第一复合物中。在实施例中，信号扩增试剂和可检测部分同时与第一复合物接触。在实施例中，信号扩增试剂和可检测部分依次与第一复合物接触。在实施例中，检测试剂包括多个第一可检测标记，由此允许多种信号扩增试剂与相同的检测试剂结合。在实施例中，寡核苷酸可检测部分与寡核苷酸结合部分结合。因此，如在图3中所示出的，在实施例中，检测试剂上的每个第一可检测标记对应于可检测部分上的多个第二可检测标记，由此扩增用于测量的信号。本文进一步描述了方法的组成部分。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。
所述方法的另外的实施例在图4中展示。在图4中，在表面上形成包括捕获试剂、分析物和检测试剂的第一复合物。将多种信号扩增试剂和可检测部分混合，其中包括多个第二可检测标记的每个可检测部分，并且其中每个可检测部分能够与多个结合部分结合，由此形成包括多种信号扩增试剂和可检测部分的信号扩增复合物。在实施例中，第一复合物和信号扩增复合物同时或基本上同时形成。在实施例中，第一复合物和信号扩增复合物依次形成。在实施例中，第一复合物在表面上形成，并且信号扩增复合物在单独的容器或单独的反应器皿中形成。然后将信号扩增复合物添加到第一复合物中。在实施例中，检测试剂包括多个第一可检测标记，由此允许信号扩增复合物的多种信号扩增试剂与每种检测试剂结合。因此，如在图4中所示出的，检测试剂上的每个第一可检测标记对应于可检测部分上的多个第二可检测标记，由此扩增用于测量的信号。本文进一步描述了方法的组成部分。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。
所述方法的另外的实施例包括在表面上形成第一复合物，所述第一复合物包括捕获试剂、分析物和包括第一核酸探针的检测试剂。延伸第一核酸探针以形成第一经延伸的序列。在实施例中，通过滚环扩增延伸第一核酸探针。多个第一标记探针与第一经延伸的序列结合，每个第一标记探针包括第一可检测标记。将(1)包括结合部分的信号扩增试剂以及(2)包括多个第二可检测标记的可检测部分中的一者或两者与第一复合物接触。在实施例中，信号扩增试剂和可检测部分同时与第一复合物接触。在实施例中，信号扩增试剂和可检测部分依次与第一复合物接触。在实施例中，与第一经延伸的序列结合的每个第一标记探针与信号扩增试剂结合。因此，每个第一可检测标记对应于可检测部分上的多个第二可检测标记，由此扩增用于测量的信号。本文进一步描述了方法的组成部分。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。
所述方法的另外的实施例在图15中展示。在图15中，在表面上形成包括捕获试剂、分析物和包括第一核酸探针的检测试剂的第一复合物。延伸第一核酸探针以形成第一经延伸的序列。在实施例中，通过滚环扩增延伸第一核酸探针。多个第一标记探针与第一经延伸的序列结合，每个第一标记探针包括第一可检测标记。各自包括第二核酸探针的多种信号扩增试剂与第一可检测标记结合。延伸第二核酸探针中的每个第二核酸探针以形成第二经延伸的序列。在实施例中，通过滚环扩增延伸第二核酸探针。各自包括第二可检测标记的一个或多个第二标记探针与第二经延伸的序列结合。因此，如在图15中所示出的，每个第一可检测标记对应于可以与包括第二可检测标记的多个第二标记探针结合的第二经延伸的序列，由此扩增用于测量的信号。本文进一步描述了方法的组成部分。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。
所述方法的另外的实施例在图17中展示。在图17中，在表面上形成包括捕获试剂、分析物和包括第一可检测标记的检测试剂的第一复合物。将(1)包括酶的信号扩增试剂以及(2)酶的底物两者添加到第一复合物中。在实施例中，信号扩增试剂和酶底物同时与第一复合物接触。在实施例中，信号扩增试剂和酶底物依次与第一复合物接触。在实施例中，酶作用于底物以产生可检测信号。在实施例中，所述方法包括检测可检测信号。本文进一步描述了方法的组成部分。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。
所述方法的另外的实施例在图22A-22D中展示。在图22A-22D的每个图中，复合物包括捕获试剂(“CR”)、分析物、包括第一可检测标记(“第1标记”)的第一检测试剂(“第1DR”)、以及包括第一可检测标记的第二检测试剂(“第2DR”)、同时与第一检测试剂上的第一可检测标记和第二检测试剂上的第一可检测标记结合的信号扩增试剂(“SAR”)。在实施例中，信号扩增试剂与两个第一可检测标记的结合稳定了第一检测试剂和第二检测试剂与分析物的结合。在实施例中，信号扩增试剂充当两种检测试剂之间的系链，并保持两种检测试剂与分析物的结合。例如，如果两种检测试剂中的一种检测试剂与分析物解离，但仍与信号扩增试剂结合，则经解离的检测试剂保持在分析物附近，以促进再结合。因此，信号扩增试剂通过稳定用于检测的复合物来扩增测定信号。
在图22A中，描绘了没有任何其它组分的信号扩增试剂。如在图22A中标记的组分与图22B-22D中的相同。在图22B中，信号扩增试剂包括与可检测部分结合的结合部分和如本文所描述的第二可检测标记，所述可检测部分包括结合部分的结合配偶体。在图22C中，信号扩增试剂包括如本文所描述的第二可检测标记。在图22D中，信号扩增试剂包括核酸探针，所述核酸探针通过模板寡核苷酸延伸以形成与如本文所描述的一个或多个包括第二可检测标记的标记探针结合的经延伸的序列。因此，在图22B-22D中，信号扩增试剂以双重方式扩增测定信号，所述双重方式即通过稳定如本文所描述的复合物和通过提供通过如本文所描述的第二可检测标记的另外的可检测信号。
测定组分和方法
在实施例中，本发明提供了一种方法，其包括：(a)使ECL标记与和ECL标记特异性结合的信号扩增试剂接触，其中：
信号扩增试剂包括结合部分，并且所述方法进一步包括使ECL标记与可检测部分接触；或者
信号扩增试剂包括酶，并且所述方法进一步包括使ECL标记与酶的底物接触；或者
信号扩增试剂任选地包括第二可检测标记；或者
信号扩增试剂包括核酸探针，并且所述方法进一步包括延伸核酸探针以形成经延伸的序列，以及
(b)检测可检测部分、酶活性、第二可检测标记或经延伸的序列，由此检测ECL标记。在实施例中，ECL标记存在在表面上。在实施例中，在步骤(a)中，ECL标记存在于表面上。在实施例中，在步骤(b)中，ECL标记存在于表面上。在实施例中，ECL标记存在于包括固定于其上的锚定试剂的表面上。
在实施例中，本发明提供了一种检测样品中的所关注的分析物的方法，所述方法包括：
(a)使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括结合部分，以及(II)可检测部分，所述可检测部分包括(1)所述结合部分的结合配偶体，以及(2)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；以及(b)测量所述表面上的(I)所述第二可检测标记或(II)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(c)使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括酶，以及(II)所述酶的底物；以及(d)测量酶活性，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(e)使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与信号扩增试剂接触，其中所述第一可检测标记是ECL标记，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且任选地包括第二可检测标记；以及(f)测量(I)所述第一可检测标记；(II)所述第二可检测标记；或(III)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(g)使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与信号扩增试剂接触，其中所述第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，其中所述信号扩增试剂包括核酸探针，由此形成包括所述第一复合物和所述信号扩增试剂的第二复合物；(h)延伸所述核酸探针以形成经延伸的序列；以及(i)测量经延伸的序列的量，由此检测所述所关注的分析物。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第一复合物在表面上。在实施例中，所述第一复合物包括：所述所关注的分析物；捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合，其中所述捕获试剂固定在所述表面上，或者其中所述捕获试剂能够固定到所述表面；以及检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合并且包括所述第一可检测标记。
在实施例中，信号扩增试剂包括核酸探针，并且表面包括固定于其上的锚定试剂。在实施例中，信号扩增试剂包括核酸探针，并且所述方法进一步包括将锚定试剂固定在表面上。在实施例中，在所述方法的步骤(h)之前或期间，将锚定试剂固定在表面上。在实施例中，锚定试剂与经延伸的序列的锚定区结合，并且测量包括测量通过锚定试剂与表面结合的经延伸的序列的量。在实施例中，所述第一复合物包括：所述所关注的分析物；捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合，其中所述捕获试剂固定在所述表面上，或者其中所述捕获试剂能够固定到所述表面；以及检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合并且包括所述第一可检测标记。
在实施例中，本发明提供了一种检测样品中的所关注的分析物的方法，所述方法包括(a)在表面上形成第一复合物，所述第一复合物包括：所述所关注的分析物；捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合，其中所述捕获试剂固定在所述表面上，或者其中所述捕获试剂能够固定到所述表面；以及检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合并且包括第一核酸探针；(b)延伸所述第一核酸探针以形成包括第一锚定区的第一经延伸的序列，其中所述第一锚定区与固定在所述表面上的第一锚定试剂结合；(c)将所述第一经延伸的序列与包括第一可检测标记的第一标记探针结合；以及：
(d)使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括结合部分，以及(II)可检测部分，所述可检测部分包括(1)所述结合部分的结合配偶体，以及(2)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；以及(e)测量所述表面上的(I)所述第二可检测标记或(II)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(f)使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括酶，以及(II)所述酶的底物；以及(g)测量酶活性，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(h)使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且任选地包括第二可检测标记；以及(i)测量(I)所述第一可检测标记；(II)所述第二可检测标记；或(III)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
(j)使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，其中所述信号扩增试剂包括第二核酸探针，由此形成包括所述信号扩增试剂和所述第一标记探针的第二复合物；(k)延伸所述第二核酸探针以形成包括第二锚定区的第二经延伸的序列，其中所述第二锚定区与固定在所述表面上的第二锚定试剂结合；以及(l)测量与所述表面结合的(I)所述第二经延伸的序列或(II)所述第一经延伸的序列和所述第二经延伸的序列的量，由此检测所述所关注的分析物。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。
捕获试剂
在实施例中，捕获试剂包括抗体或其抗原结合片段、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。在实施例中，捕获试剂包括抗体或其变体，包含其抗原/表位结合部分、抗体片段或衍生物、抗体类似物、工程化抗体或以与抗体类似的方式与抗原结合的物质。在实施例中，捕获试剂包括抗体的至少一个重链或轻链互补决定区(CDR)。在实施例中，捕获试剂包括来自一种或多种抗体的至少两个CDR。在实施例中，捕获试剂包括抗体或其抗原结合片段。
在实施例中，捕获试剂与分析物特异性结合。如本文所使用的，“特异性结合”意指相对于随机的、不相关的物质，试剂(例如，捕获试剂)优先与其结合配偶体(例如分析物的表位)结合。在实施例中，捕获试剂包括包含与分析物的表位特异性结合的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。
在实施例中，将捕获试剂固定在表面上。在实施例中，捕获试剂能够固定到表面。本文进一步描述了将捕获试剂固定到表面的方法。在实施例中，捕获试剂通过硫酯、硫醚、二硫化物或其组合固定到表面。在实施例中，捕获试剂通过如本文所描述的靶向剂固定到表面。在实施例中，在本文所描述的第一复合物形成之前、期间或之后，将捕获试剂固定到表面。在实施例中，在所述方法的步骤(a)之前，将捕获试剂固定到表面。
检测试剂
在实施例中，检测试剂包括抗体或其抗原结合片段、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。在实施例中，检测试剂包括抗体或其变体，包含其抗原/表位结合部分、抗体片段或衍生物、抗体类似物、工程化抗体或以与抗体类似的方式与抗原结合的物质。在实施例中，检测试剂包括抗体的至少一个重链或轻链互补决定区(CDR)。在实施例中，检测试剂包括来自一种或多种抗体的至少两个CDR。在实施例中，检测试剂包括抗体或其抗原结合片段。
在实施例中，检测试剂与分析物特异性结合。在实施例中，检测试剂包括包含与分析物的表位特异性结合的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。在实施例中，与捕获试剂相比，检测试剂与分析物的不同表位结合。
在实施例中，第一复合物包括多于一种的检测试剂。在实施例中，第一复合物包括至少两种检测试剂。在实施例中，如本文所描述的第一复合物的检测试剂是第一检测试剂，并且第一复合物进一步包括第二检测试剂。在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂各自与分析物特异性结合。在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂与分析物上的相同表位结合。在实施例中，分析物包括用于与第一检测试剂和第二检测试剂结合的表位的多个拷贝，使得第一检测试剂和第二检测试剂能够同时与分析物上表位的单独拷贝结合。在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂与分析物上的不同表位结合。在实施例中，捕获试剂以及第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种与分析物上的不同表位结合。在实施例中，捕获试剂于分析物上的第一表位结合，并且第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种与分析物上的第二表位结合。在实施例中，分析物包括第二表位的多个拷贝，使得第一检测试剂和第二检测试剂能够同时与分析物上第二表位的单独拷贝结合。在实施例中，第一复合物包括捕获试剂、分析物、第一检测试剂和第二检测试剂，其中捕获试剂、第一检测试剂和第二检测试剂与分析物结合。
在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂各自独立地包括抗体或其抗原结合片段、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种包括抗体或其变体，包含其抗原/表位结合部分、抗体片段或衍生物、抗体类似物、工程化抗体或以与抗体类似的方式与抗原结合的物质。在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种包括抗体的至少一个重链或轻链互补决定区(CDR)。在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种包括来自一种或多种抗体的至少两个CDR。在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种包括抗体或其抗原结合片段。
包括第一可检测标记的检测试剂
在实施例中，检测试剂包括第一可检测标记。在实施例中，检测试剂包括多个第一可检测标记。在实施例中，检测试剂包括第一可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第一可检测标记。在第一复合物包括第一检测试剂和第二检测试剂的实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种包括第一可检测标记。在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种包括第一可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第一可检测标记。在实施例中，第一复合物的检测试剂，或第一复合物的第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种包括第一可检测标记中的至少两个第一可检测标记。在实施例中，第一可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来检测。在实施例中，第一可检测标记包括ECL标记。
在实施例中，ECL标记包括电化学发光有机金属络合物。在实施例中，电化学发光有机金属络合物包括钌、锇、铱、铼和/或镧系金属。在实施例中，ECL标记包括钌。在实施例中，电化学发光有机金属络合物包括经取代的或未经取代的联吡啶或经取代的或未经取代的菲咯啉。在实施例中，ECL标记包括经取代的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，包括至少一个磺酸酯基团的经取代的联吡啶配体是式I化合物：
在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个与检测试剂共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个与检测试剂共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，有机金属络合物包括钌、锇或铼。
示例性ECL标记可以US 5,714,089；US 6,136,268；US 6,316,607；US 6,468,741；US 6,479,233；US 6,808,939和US 9,499,573中找到。
在实施例中，第一可检测标记是式II化合物：
在实施例中，第一可检测标记是式III化合物：
在实施例中，第一可检测标记是式IV化合物：
在实施例中，第一可检测标记是式V化合物：
其中每个X包括磷酸酯、碳酸酯、硼酸酯或其组合。
在实施例中，第一可检测标记是式VI化合物：
在实施例中，检测试剂(例如，如本文所描述的第一检测试剂和/或第二检测试剂)通过缀合接头与第一可检测标记共价连接。在实施例中，缀合接头包括酰胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亚胺、三唑、二氢哒嗪、肽、寡核苷酸、亲水聚合物或其组合。在实施例中，缀合接头的酰胺由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯与胺之间的反应产生。在实施例中，缀合接头的硫酯由NHS酯与硫醇(也称为巯基)之间的反应产生。在实施例中，缀合接头的硫醚由马来酰亚胺或烯烃与硫醇之间的反应产生。在实施例中，缀合接头的二硫化物由二硫化物与硫醇之间的反应产生。在实施例中，缀合接头的亚胺由醛或酮与胺之间的反应产生。在实施例中，缀合接头的三唑由炔或环炔与叠氮化物之间的反应产生。在实施例中，缀合接头的二氢哒嗪由反式环辛烯与四嗪之间的反应产生。
在实施例中，缀合接头包括间隔子，例如，以增加检测试剂与第一可检测标记之间的距离和/或移动灵活性。在实施例中，缀合接头包括肽。在实施例中，缀合接头包括寡核苷酸。在实施例中，缀合接头包括亲水聚合物。在实施例中，亲水聚合物包括聚乙二醇(PEG)。
包括第一核酸探针的检测试剂
在实施例中，检测试剂包括第一核酸探针。在实施例中，第一核酸探针能够被延伸以形成第一经延伸的序列。在实施例中，第一核酸探针能够与另外的寡核苷酸连接以形成第一经延伸的序列。在实施例中，第一核酸探针能够与另外的寡核苷酸连接，其中至少一部分另外的寡核苷酸包括与第一核酸探针的互补序列，以形成第一经延伸的序列。在实施例中，第一核酸探针能够与模板寡核苷酸结合。在实施例中，第一核酸探针是用于延伸反应的引物。在实施例中，延伸反应包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、自我维持合成反应(3SR)、等温扩增(例如，解旋酶依赖性扩增或滚环扩增)或其组合。在实施例中，第一核酸探针与模板寡核苷酸结合，并且通过PCR、LCR、SDA、3SR、等温扩增(例如，解旋酶依赖性扩增或滚环扩增)或其组合延伸，以形成第一经延伸的序列。在实施例中，第一核酸探针与模板寡核苷酸结合，并且通过PCR延伸以形成第一经延伸的序列。在实施例中，第一核酸探针与模板寡核苷酸结合，形成环状模板寡核苷酸(例如，通过线性模板寡核苷酸的连接)，并且通过滚环扩增延伸以形成第一经延伸的序列。在第一复合物包括第一检测试剂和第二检测试剂的实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种包括邻近核酸探针，其中仅当两个邻近核酸探针接近时，邻近核酸探针中的一个或两个邻近核酸探针才能够延伸以形成第一经延伸的序列。
在实施例中，第一经延伸的序列包括第一锚定区。在实施例中，第一锚定区与表面上的第一锚定试剂结合。在实施例中，在形成本文所描述的第一复合物之前、期间或之后，第一锚定试剂固定在表面上。在实施例中，在本文所描述的方法的步骤(a)之前，将第一锚定试剂固定到表面。在实施例中，在形成第一经延伸的序列之前，将第一锚定试剂固定到表面。在实施例中，通过硫酯、硫醚、二硫化物或其组合将第一锚定试剂固定到表面。在实施例中，如本文进一步所描述的，通过靶向剂将第一锚定试剂固定到表面。
在实施例中，第一锚定试剂包括寡核苷酸、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位。在实施例中，第一锚定试剂包括适体配体，并且第一锚定区包括适体。在实施例中，第一锚定试剂包括寡核苷酸结合蛋白，并且第一锚定区包括寡核苷酸序列。在实施例中，第一锚定试剂包括单链寡核苷酸。在实施例中，第一锚定试剂包括双链寡核苷酸。在实施例中，第一锚定试剂和第一锚定区包括互补寡核苷酸。在实施例中，第一锚定试剂包括锚定寡核苷酸。在实施例中，第一锚定区包括与锚定寡核苷酸互补的锚定寡核苷酸补体。
在实施例中，将第一经延伸的序列与第一锚定试剂结合包括在第一锚定试剂与第一锚定区之间形成三螺旋。在实施例中，将第一经延伸的序列与第一锚定试剂结合包括在结合之前变性第一锚定区以暴露单链寡核苷酸区；在结合之前将第一锚定区暴露于解旋酶活性；和/或在结合之前将第一锚定区暴露于核酸酶处理，其中第一锚定区包括一个或多个经半抗原修饰的碱基，并且第一锚定试剂包括一个或多个对半抗原具有特异性的抗体；和/或第一锚定区包括一个或多个经配体修饰的碱基，并且第一锚定试剂包括一个或多个对配体具有特异性的受体。
在实施例中，在延伸第一核酸探针后，包括捕获试剂、分析物和检测试剂(或第一检测试剂和第二检测试剂)的第一复合物与表面结合。在实施例中，第一经延伸的序列在距表面上的第一复合物约1nm至约500nm、约5nm至约250nm、约10nm至约200nm或约15nm至约150nm内的位置处与第一锚定试剂结合。在实施例中，第一经延伸的序列在距表面上的第一复合物小于1μm的位置处与第一锚定试剂结合。在实施例中，第一经延伸的序列在距表面上的第一复合物小于500nm的位置处与第一锚定试剂结合。在实施例中，第一经延伸的序列在距表面上的第一复合物小于200nm的位置处与第一锚定试剂结合。
在实施例中，所述方法包括在第一核酸探针的延伸和/或第一经延伸的序列与第一锚定试剂的结合之后，将第一经延伸的序列与包括第一可检测标记的第一标记探针结合。在实施例中，第一经延伸的序列和第一标记探针包括互补寡核苷酸。在实施例中，第一标记探针包括第一可检测标记信号中的多于一个的第一可检测标记。在实施例中，第一标记探针包括第一可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第一可检测标记。在实施例中，第一可检测标记与第一标记探针共价连接，例如通过如本文所描述的缀合接头。
本文进一步描述了第一可检测标记。在实施例中，第一可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来检测。在实施例中，第一可检测标记包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，经取代的联吡啶配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个与第一标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个与第一标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，有机金属络合物包括钌、锇或铼。
在实施例中，第一可检测标记包括式II化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式III化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式IV化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式V化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式VI化合物。
信号扩增试剂
在实施例中，信号扩增试剂包括抗体或其抗原结合片段、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。在实施例中，信号扩增试剂包括抗体或其变体，包含其抗原/表位结合部分、抗体片段或衍生物、抗体类似物、工程化抗体或以与抗体类似的方式与抗原结合的物质。在实施例中，信号扩增试剂包括抗体的至少一个重链或轻链互补决定区(CDR)。在实施例中，信号扩增试剂包括来自一种或多种抗体的至少两个CDR。在实施例中，信号扩增试剂包括抗体或其抗原结合片段。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括包含IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域的恒定区。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括IgG结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型抗体或其抗原结合片段。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括IgG2a、IgG2b或IgG2c亚类抗体或其抗原结合片段。在实施例中，抗体或其抗原结合片段源自小鼠、大鼠、山羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或绵羊。在实施例中，抗体或其抗原结合片段源自小鼠。本文进一步描述了抗体和抗原结合片段。
在实施例中，信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂包括包含与第一可检测标记特异性结合的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。
在实施例中，信号扩增试剂能够与至少两个第一可检测标记特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂包括至少两个抗原结合结构域，其中每个抗原结合结构域与第一可检测标记特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂能够于第一检测试剂上的第一可检测标记和第二检测试剂上的第一可检测标记结合，例如，如在图22A中所描述的。如本文所描述的，能够与第一检测试剂和第二检测试剂上的至少两个可检测标记结合的信号扩增试剂稳定了检测试剂与分析物的结合，由此扩增了用于检测分析物的测定信号。在实施例中，由信号扩增试剂结合的至少两个第一可检测标记包括相同的结构。在实施例中，由信号扩增试剂结合的至少两个第一可检测标记包括不同的结构。
本文描述了第一可检测标记。在实施例中，第一可检测标记是如本文所描述的ECL标记。在实施例中，信号扩增试剂结合两个第一可检测标记，其中由信号扩增试剂结合的每个第一可检测标记是如本文所描述的ECL标记。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，经取代的联吡啶配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中配体中的至少一个配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中配体中的一个配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物。
在实施例中，信号扩增试剂特异性结合式II化合物。在实施例中，信号扩增试剂特异性结合式IV化合物。在实施例中，信号扩增试剂特异性结合式VI化合物。
在实施例中，信号扩增试剂特异性结合两个第一可检测标记，其中两个第一可检测标记包括相同的结构，例如，每个第一可检测标记包括式II、III、IV、V或VI化合物。在实施例中，信号扩增试剂特异性结合两个第一可检测标记，其中两个第一可检测标记包括不同的结构，例如，两个第一可检测标记中的每个第一可检测标记包括式II、III、IV、V或VI化合物，条件是两个第一可检测标记不包括相同的化合物。在实施例中，每个第一可检测标记独立地包括式II、III、IV、V或VI化合物。在实施例中，每个第一可检测标记独立地包括式II、IV或VI化合物。
在实施例中，第一可检测标记例如，与如本文所描述的检测试剂(例如，第一检测试剂和/或第二检测试剂)或第一标记探针共价连接。在实施例中，信号扩增试剂与第一可检测标记和缀合接头特异性结合。在实施例中，在实施例中，信号扩增试剂包括包含与第一可检测标记和缀合接头特异性结合的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。在此类实施例中，信号扩增试剂不与未经缀合的第一可检测标记结合(即，不与检测试剂或第一标记探针连接)。未经缀合的第一可检测标记可以存在于测定混合物中，例如，来自将第一可检测标记与检测试剂或第一标记探针连接的缀合反应。在实施例中，相对于利用与单独的第一可检测标记结合的信号扩增试剂的方法，利用与第一可检测标记和缀合接头特异性结合的信号扩增试剂的方法具有改善的特异性。
在实施例中，缀合接头包括酰胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亚胺、三唑、二氢哒嗪、肽、寡核苷酸、亲水聚合物或其组合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和酰胺特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和硫酯特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和硫醚特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和二硫化物特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和亚胺特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和三唑特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和二氢哒嗪特异性结合。
在实施例中，缀合接头包括间隔子(例如，如本文所描述的肽、寡核苷酸或亲水聚合物)，并且信号扩增试剂与第一可检测标记和缀合接头的肽、寡核苷酸或亲水聚合物的至少一部分特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和缀合接头的肽的至少一部分特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和缀合接头的寡核苷酸的至少一部分特异性结合。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和缀合接头的亲水聚合物的至少一部分特异性结合。
进一步令人惊讶地发现，抗体信号扩增试剂对本文所描述的ECL标记具有高特异性，包含磺化ECL标记。大多数抗体需要疏水性斑块来实现特异性，并且因此与非磺化标记相比，预期磺酸酯基团的免疫原性较低。
I.包括第一可检测标记的第一复合物的信号扩增
在实施例中，本发明提供了一种检测样品中的所关注的分析物的方法，所述方法包括使包括(A)第一可检测标记和(B)所关注的分析物的第一复合物与信号扩增试剂接触，其中所述第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记。在实施例中，第一复合物包括所关注的分析物、与分析物特异性结合的捕获试剂和与分析物特异性结合的检测试剂。在实施例中，检测试剂包括如本文所描述的第一可检测标记。在实施例中，检测试剂是第一检测试剂，并且第一复合物进一步包括第二检测试剂，所述第二检测试剂与分析物特异性结合并且包括如本文所描述的第一可检测标记。
在实施例中，第一复合物在表面上。在实施例中，第一复合物包括分析物、与分析物特异性结合的捕获试剂和与分析物特异性结合的检测试剂。在实施例中，所述方法包括在接触之前形成第一复合物。在实施例中，形成第一复合物包括：使所关注的分析物与(i)表面；(ii)捕获试剂；以及(iii)检测试剂接触。在实施例中，形成第一复合物包括：使样品与(i)表面；(ii)捕获试剂；以及(iii)检测试剂接触。
在实施例中，第一复合物包括所关注的分析物、与分析物特异性结合的捕获试剂、与分析物特异性结合的第一检测试剂和与分析物特异性结合的第二检测试剂，其中第一检测试剂和第二检测试剂中每一个包括如本文所描述的第一可检测标记。在实施例中，所述方法包括在接触之前形成第一复合物。在实施例中，形成第一复合物包括：使所关注的分析物与(i)表面；(ii)捕获试剂；(iii)第一检测试剂；以及(iv)第二检测试剂接触。在实施例中，形成第一复合物包括：使样品与(i)表面；(ii)捕获试剂；(iii)第一检测试剂；以及(iv)第二检测试剂接触。在实施例中，通过使分析物与捕获试剂以及第一检测试剂和第二检测试剂以任何顺序接触来形成第一复合物。
在实施例中，如本文所描述的将捕获试剂固定在表面上。在实施例中，捕获试剂能够固定到表面上。在实施例中，所述方法包括在第一复合物形成之前、期间或之后将捕获试剂固定到表面。在实施例中，所述方法包括在所述方法的步骤(a)之前将捕获试剂固定到表面。
在实施例中，所述方法进一步包括在使第一复合物与信号扩增试剂接触之前，检测表面上的第一复合物。在实施例中，检测包括测量例如检测试剂上的第一可检测标记的量。在第一复合物包括第一检测试剂和第二检测试剂的实施例中，检测包括测量第一检测试剂和第二检测试剂上的第一可检测标记的量。在实施例中，第一可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第一可检测标记包括ECL标记，并且测量第一可检测标记的量包括测量ECL信号。
在实施例中，检测试剂包括多个第一可检测标记，并且多种信号扩增试剂与检测试剂结合，其中每种信号扩增试剂与检测试剂上的单独的第一可检测标记结合。
在实施例中，第一复合物包括第一检测试和第二检测试剂，其中第一检测试和第二检测试剂中的每一种包括如本文所描述的第一可检测标记，并且信号扩增试剂能够同时与第一检测试剂上的第一可检测标记和第二检测试剂上的第一可检测标记结合，例如，如在图22A-22D中所示出的。
I.A.包括结合部分的信号扩增试剂
在实施例中，包括捕获试剂、分析物和包括第一可检测标记的检测试剂的第一复合物与以下接触：(1)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括结合部分，以及(2)可检测部分，其中所述可检测部分包括：(i)结合部分的结合配偶体以及(ii)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记。在实施例中，第一复合物包括各自包括第一可检测标记的第一检测试剂和第二检测试剂，并且信号扩增试剂与第一检测试剂上的第一可检测标记和第二检测试剂上的第一可检测标记特异性结合，如本文所描述的和如图22B中所描绘的。
在实施例中，结合部分包括寡核苷酸，并且可检测部分包括互补寡核苷酸。在实施例中，结合部分和可检测部分包括受体-配体对、抗原-抗体对、半抗原-抗体对、表位-抗体对、模拟表位-抗体对、适体-靶分子对或嵌入剂-靶分子对。在实施例中，结合部分包括可检测部分的多个结合位点。在实施例中，结合部分包括可检测部分的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个结合位点。在实施例中，可检测部分包括结合部分的多个结合位点。在实施例中，可检测部分包括结合部分的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个结合位点。例如，一个链霉亲和素能够结合四个生物素分子。在实施例中，结合部分包括生物素，并且可检测部分包括亲和素或链霉亲和素。在实施例中，结合部分包括亲和素或链霉亲和素，并且可检测部分包括生物素。
在实施例中，可检测部分包括第二可检测标记。在实施例中，可检测部分包括第二可检测标记中的多于一个的第二可检测标记。在实施例中，可检测部分包括第二可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第二可检测标记。
在实施例中，第二可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来检测。在实施例中，第二可检测标记包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，经取代的联吡啶配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个与可检测部分共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个与可检测部分共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，有机金属络合物包括钌、锇或铼。
在实施例中，第二可检测标记包括式II化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式III化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式IV化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式V化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式VI化合物。
在实施例中，检测试剂(例如，第一检测试剂和/或第二检测试剂)的第一可检测标记和可检测部分的第二可检测标记相同。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式II化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式III化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式IV化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式V化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式VI化合物。
在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记不同。在实施例中，一旦第一可检测标记由信号扩增试剂结合，那么所述第一可检测标记就不可检测。在实施例中，信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合，而不是与第二可检测标记特异性结合。在实施例中，第一可检测标记包括式II化合物，并且第二可检测标记包括式III、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式III化合物，并且第二可检测标记包括式II、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式IV化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式V化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式VI化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或V中的任一者的化合物。
在实施例中，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。如本文所使用的,“可检测地不同”的两个物种意指使用不同的检测方法或参数来检测这两个物种。例如，荧光物种可检测地不同于化学发光或电化学发光物种。在一另外的实例中，电化学发光物种可检测地不同于生色物种。在另外的实例中，具有不同的、不重叠的激发和/或发射波长的两个荧光物种是可检测地不同的。在实施例中，第一可检测标记的存在，例如在由信号扩增试剂结合的检测试剂上存在，不干扰第二可检测标记的检测。
在实施例中，第一复合物首先与信号扩增试剂接触，然后与可检测部分接触。在实施例中，第一复合物与信号扩增试剂和可检测部分同时或基本上同时接触。如本文所使用的，关于一个或多个事件(例如，使第一结合复合物与信号扩增试剂和可检测部分接触)的术语“同时”意指事件在完全相同的时间或基本上相同的时间发生，例如，本文所描述的同时事件可以间隔小于或约10分钟、间隔小于或约5分钟、间隔小于或约2分钟、间隔小于或约1分钟、间隔小于或约30秒，间隔小于或约15秒或间隔小于或约5秒。
在实施例中，接触包括：(i)形成包括所述信号扩增试剂和所述可检测部分的信号扩增复合物；以及(ii)使所述第一复合物与所述信号扩增复合物接触。在实施例中，可检测部分包括结合部分的多个结合位点，和/或结合部分包括可检测部分的多个结合位点，并且信号扩增复合物包括多种信号扩增试剂，并且其中每种信号扩增试剂与一个或多个可检测部分结合。在实施例中，第一复合物和信号扩增复合物同时或基本上同时形成。在实施例中，第一复合物和信号扩增复合物依次形成。在实施例中，第一复合物在表面上形成，并且信号扩增复合物在单独的反应器皿或容器中形成。
在结合部分包括寡核苷酸结合部分并且可检测部分包括寡核苷酸结合部分的互补寡核苷酸的实施例中，所述该方法进一步包括在与可检测部分结合之前增加寡核苷酸结合部分的长度。在实施例中，增加寡核苷酸结合部分的长度包括将寡核苷酸结合部分与另外的寡核苷酸连接。在实施例中，增加寡核苷酸结合部分的长度包括将寡核苷酸结合部分与另外的寡核苷酸杂交，其中至少一部分另外的寡核苷酸包括寡核苷酸结合部分的互补序列。在实施例中，另外的寡核苷酸另外地包括多于一个的标记探针的互补序列，由此允许多于一个拷贝的可检测部分与第二复合物结合，并且进一步扩增测定信号，如在本文实施例中所描述的。
图4中展示了信号扩增复合物的示例性实施例，其包括多种交联的信号扩增试剂和可检测部分，其中每个可检测部分包括多个第二可检测标记。在包括形成信号扩增复合物并且其中第一可检测标记和第二可检测标记相同的实施例中，信号扩增试剂与第一可检测标记和检测试剂的缀合接头特异性结合，由此减少信号扩增试剂与可检测部分上的第二可检测标记的结合。在包括形成信号扩增复合物的实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记不同，由此减少信号扩增试剂与可检测部分上的第二可检测标记的结合。
在实施例中，所述方法包括测量第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记和第二可检测标记是可检测地不同的。在实施例中，所述方法包括分别测量第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括ECL标记，并且测量第一可检测标记和第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
在实施例中，所述方法包括测量第二可检测标记的量。在实施例中，第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第二可检测标记包括ECL标记，并且测量第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
I.B.包括酶的信号扩增试剂
在实施例中，包括捕获试剂、分析物和检测试剂的第一复合物与以下接触：(1)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括酶，以及(2)所述酶的底物。在实施例中，第一复合物包括各自包括第一可检测标记的第一检测试剂和第二检测试剂，并且信号扩增试剂与第一检测试剂上的第一可检测标记和第二检测试剂上的第一可检测标记特异性结合，如本文所描述的。
在实施例中，信号扩增试剂包括作用于底物的酶。在实施例中，酶是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶(GO)、乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶或β-内酰胺酶。
在实施例中，信号扩增试剂包括作用于底物的酶，例如，如在图17中所展示的。在实施例中，酶与底物结合并作用于底物，例如通过氧化、还原、水解或其组合，以产生可检测的信号。在实施例中，可检测信号包括生色信号、化学发光、荧光或其组合。在实施例中，酶是HRP、AP或β-半乳糖苷酶。在实施例中，酶是HRP，并且底物是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐(ABTS)或邻苯二胺二盐酸盐(OPD)。在实施例中，TMB在被HRP氧化时从无色转化为蓝色。在实施例中，ABTS在被HRP氧化时从无色转化为绿色。在实施例中，OPD在被HRP氧化时从无色转化为黄橙色。在实施例中，酶是AP，并且底物是磷酸对硝基苯酯(PNPP)。在实施例中，PNPP在被AP水解时从无色转化为黄色。在实施例中，酶是β-半乳糖苷酶，并且底物是邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)。在实施例中，ONPG在被β-半乳糖苷酶水解时从无色转化为黄色。HRP底物的另外的非限制性实例包含化学发光底物如SUPERSIGNALTM和荧光底物如QUANTABLUTM、QUANTAREDTM和AMPLEXTMRed。AP底物的另外的非限制性实例包含化学发光底物CDPTM和DYNALIGHTTM。本文所描述的检测底物的方法在本领域中是已知的，并且例如由Crowther,J.R.“ELISA指南(TheELISA Guidebook).”《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》.新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(Humana Press；Totowa,NJ)(2001)。
在实施例中，所述方法包括测量酶的活性。在实施例中，测量包括测量酶作用于底物时产生的可检测信号。在实施例中，可检测信号通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，底物是TMBM、ABTS、OPD、PNPP或ONPG，并在与酶反应时产生生色信号。在实施例中，底物在与酶反应时产生荧光信号。在实施例中，底物在与酶反应时产生化学发光信号。在实施例中，经测量的可检测信号的量用于确定样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的可检测信号的量用于确定样品中分析物的量。
I.C.包括第二可检测标记的信号扩增试剂
在实施例中，包括捕获试剂、分析物和检测试剂的第一复合物与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合并且包括第二可检测标记。在实施例中，第一复合物包括各自包括第一可检测标记的第一检测试剂和第二检测试剂，并且信号扩增试剂与第一检测试剂上的第一可检测标记和第二检测试剂上的第一可检测标记特异性结合，如本文所描述的和如图22C中所描绘的。
本文进一步描述了第二可检测标记。在实施例中，第二可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来检测。在实施例中，第二可检测标记包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，经取代的联吡啶配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个与标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个与标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，有机金属络合物包括钌、锇或铼。
在实施例中，第二可检测标记包括式II化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式III化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式IV化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式V化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式VI化合物。
在实施例中，检测试剂(例如，第一检测试剂和/或第二检测试剂)的第一可检测标记和信号扩增试剂的第二可检测标记相同。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式II化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式III化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式IV化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式V化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式VI化合物。
在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记不同。在实施例中，一旦第一可检测标记由信号扩增试剂结合，那么所述第一可检测标记就不可检测。在实施例中，信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合，而不是与第二可检测标记特异性结合。在实施例中，第一可检测标记包括式II化合物，并且第二可检测标记包括式III、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式III化合物，并且第二可检测标记包括式II、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式IV化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式V化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式VI化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或V中的任一者的化合物。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。
在实施例中，所述方法包括测量第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记和第二可检测标记是可检测地不同的。在实施例中，所述方法包括分别测量第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括ECL标记，并且测量第一可检测标记和第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
在实施例中，所述方法包括测量第二可检测标记的量。在实施例中，第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第二可检测标记包括ECL标记，并且测量第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
I.D.包括核酸探针的信号扩增试剂
在实施例中，包括捕获试剂、分析物和检测试剂的第一复合物与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合并且包括核酸探针。在实施例中，第一复合物包括各自包括第一可检测标记的第一检测试剂和第二检测试剂，并且信号扩增试剂与第一检测试剂上的第一可检测标记和第二检测试剂上的第一可检测标记特异性结合，如本文所描述的和如图22D中所示出的。在实施例中，所述方法包括在表面上形成包括第一复合物和信号扩增试剂的第二复合物。
在实施例中，第一复合物包括至少两个第一可检测标记，例如，其存在于如本文所描述的第一检测试剂和第二检测试剂上，或者存在于如本文所描述的个检测试剂上。在实施例中，所述方法包括使第一复合物与至少两种信号扩增试剂接触。在实施例中，如本文所描述的第二复合物的信扩增试剂是第一信号扩增试剂，并且第二复合物进一步包括第二信号扩增试剂，其中第一信号扩增试剂和第二信号扩增试剂各自与存在于一种或多种检测试剂上的不同的第一可检测标记结合。在实施例中，第二复合物包含至少两种信号扩增试剂，其中每种信号扩增试剂包括核酸探针，例如，如在图1C(示出于检测试剂结合的三种信号扩增试剂)和图1D(示出与检测试剂结合的两种信号扩增试剂)所示出的。因此，在实施例中，第二复合物包括一个或多个核酸探针。在实施例中，第二复合物的每个核酸探针包括相同的序列。在实施例中，第二复合物的每个核酸探针由相同的序列组成。在实施例中，第二复合物的每个核酸探针包括不同的序列。在实施例中，第二复合物的核酸探针中的两个或梗多个核酸探针包括相同的序列。
在实施例中，所述方法包括延伸核酸探针(例如，第二复合物的每个核酸探针)以形成经延伸的序列。在实施例中，延伸包括将核酸探针(例如，第二复合物的每个核酸探针)与另外的寡核苷酸连接以形成经延伸的序列。在实施例中，延伸包括将核酸探针(例如，第二复合物的每个核酸探针)与另外的寡核苷酸杂交，其中至少一部分另外的寡核苷酸包括核酸探针的互补序列，以形成经延伸的序列。
在实施例中，延伸包括将核酸探针(例如，第二复合物的每个核酸探针)与模板寡核苷酸结合，用于延伸反应以形成经延伸的序列。在实施例中，第二复合物包括多个，例如至少两个核酸探针，并且延伸包括将每个核酸探针与不同的模板寡核苷酸结合，并且延伸每个核酸探针以形成多个，例如至少两个经延伸的序列。在实施例中，第二复合物包括多个，例如至少两个核酸探针，并且延伸包括将两个核酸探针与单个模板寡核苷酸结合，并且延伸一个或两个核酸探针以形成经延伸的序列。在实施例中，第二复合物包括多个，例如至少两个核酸探针，并且延伸包括将两个核酸探针与两个模板寡核苷酸结合，其中每个模板寡核苷酸与两个核酸探针中的每个核酸探针的一部分结合，并且延伸一个或两个核酸探针以形成经延伸的序列。
在实施例中，第一核酸探针是用于延伸反应的引物。在实施例中，延伸反应包括PCR、LCR、SDA、3SR、等温扩增(例如，解旋酶依赖性扩增或滚环扩增)或其组合。在实施例中，延伸包括将核酸探针与模板寡核苷酸结合，并且通过PCR、LCR、SDA、3SR、等温扩增(例如，解旋酶依赖性扩增或滚环扩增)或其组合延伸核酸探针。在实施例中，延伸包括将核酸探针与模板寡核苷酸结合，并且通过PCR延伸核酸探针。在实施例中，延伸包括将核酸探针与模板寡核苷酸结合，形成环状模板寡核苷酸(例如，通过线性模板寡核苷酸的连接)，以及通过滚环扩增延伸核酸探针。
在实施例中，第二复合物包括至少两个核酸探针，并且延伸包括：将每个核酸探针与不同的模板寡核苷酸结合，由每个模板寡核苷酸形成环状模板，并且通过RCA延伸每个核酸探针，例如，如在图1C中所示出的。在实施例中，第二复合物包括两个核酸探针，并且延伸包括：使两个核酸探针与两种模板寡核苷酸接触，其中每个模板寡核苷酸同时与两个核酸探针中每个核酸探针的一部分结合；连接两个模板寡核苷酸以形成环状模板；并且通过RCA延伸核酸探针中的一个或两个核酸探针，例如，如在图1D中所示出的。
在实施例中，第二复合物包括第一信号扩增试剂和第二信号扩增试剂，并且第一信号扩增试剂和第二信号扩增试剂的核酸探针包括相同的序列或由其组成。在实施例中，第一信号扩增试剂和第二信号扩增试剂的核酸探针包括不同的序列。在第一信号扩增试剂和第二信号扩增试剂的核酸探针包括不同的序列的实施例中，当两个核酸探针接近时，模板寡核苷酸能够被连接，由此增加用于检测分析物的方法的特异性。
在实施例中，第二复合物包括至少两个包括不同序列的核酸探针。在实施例中，两种核酸探针与模板寡核苷酸的相邻区结合。在实施例中，模板寡核苷酸包括与两个核酸探针中的第一核酸探针互补的内部序列；以及与两个核酸探针中的第二核酸探针的非重叠区互补的5'和3'序列。在实施例中，使两个核酸探针与以下接触：第一模板寡核苷酸，所述第一模板寡核苷酸包括与两个核酸探针中的第一核酸探针上的第一区和两个核酸探针中的第二核酸探针上的第一区互补的序列；以及第二模板寡核苷酸，所述第二模板寡核苷酸包括与两个核酸探针中的第一核酸探针上的第二区和两个核酸探针中的第二核核酸探针上的第二区互补的序列，其中每个核酸探针上的第一区和第二区不重叠；连接第一模板寡核苷酸和第二模板寡核苷酸以形成环状模板；并且通过RCA延伸一个或两个核酸探针以形成经延伸的序列。
在实施例中，经延伸的序列包括能够与锚定试剂结合的锚定区。在实施例中，第一复合物在表面上，并且所述方法进一步包括将锚定试剂固定在表面上。在实施例中，第一复合物在表面上，并且所述表面进一步包括经固定的锚定试剂。在实施例中，锚定试剂通过硫酯、硫醚、二硫化物或其组合固定在到表面。在实施例中，如本文进一步所描述的，通过靶向剂将锚定试剂固定到表面。在实施例中，在本文所描述的第一复合物形成之前、期间或之后，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，在所述方法的步骤(a)之前，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，在形成经延伸的序列之前，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，在测量经延伸的序列的量之前，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，所述方法包括将经延伸的序列的锚定区与锚定试剂结合。在实施例中，测量包括测量通过锚定试剂与表面结合的经延伸的序列的量。
在实施例中，锚定试剂包括寡核苷酸、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位。在实施例中，锚定试剂包括适体配体，并且经延伸的序列的锚定区包括适体。在实施例中，锚定试剂包括寡核苷酸结合蛋白，并且经延伸的序列的锚定区包括寡核苷酸序列。在实施例中，锚定试剂包括单链寡核苷酸。在实施例中，锚定试剂包括双链寡核苷酸。在实施例中，锚定试剂和锚定区包括互补寡核苷酸。在实施例中，锚定试剂包括锚定寡核苷酸。在实施例中，经延伸的序列的锚定区包括与锚定寡核苷酸互补的锚定寡核苷酸补体。
在实施例中，将经延伸的序列与锚定试剂结合包括在锚定试剂与经延伸的序列的锚定区之间形成三螺旋。在实施例中，将经延伸的序列与锚定试剂结合包括在结合之前变性锚定区以暴露单链寡核苷酸区；在结合之前将锚定区暴露于解旋酶活性；和/或在结合之前将锚定区暴露于核酸酶处理，其中锚定区包括一个或多个经半抗原修饰的碱基，并且锚定试剂包括一个或多个对半抗原具有特异性的抗体；和/或锚定区包括一个或多个经配体修饰的碱基，并且锚定试剂包括一个或多个对配体具有特异性的受体。
在实施例中，如本文所描述的，第一复合物包括分析物、捕获试剂和检测试剂。在实施例中，如本文所描述的，第一复合物包括分析物、捕获试剂、第一检测试剂和第二检测试剂。在实施例中，第二复合物包括捕获试剂、分析物、检测试剂和信号扩增试剂。在实施例中，第二复合物包括捕获试剂、分析物、第一检测试剂、第二检测试剂和信号扩增试剂。在实施例中，在标记探针的延伸后，第二复合物与表面结合。在实施例中，在与标记探针接触之前，第二复合物与表面结合。在实施例中，经延伸的序列在距表面上的第二复合物约1nm至约500nm、约5nm至约250nm、约10nm至约200nm或约15nm至约150nm内的位置处与锚定试剂结合。在实施例中，经延伸的序列在距表面上的第二复合物小于1μm的位置处与锚定试剂结合。在实施例中，经延伸的序列在距表面上的第二复合物小于500nm的位置处与锚定试剂结合。在实施例中，经延伸的序列在距表面上的第二复合物小于200nm的位置处与锚定试剂结合。
在实施例中，测量经延伸的序列的量包括使经延伸的序列与包括第二可检测标记的标记探针接触。在实施例中，标记探针包括第二可检测标记中的多于一个的第二可检测标记。在实施例中，标记探针包括第二可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第二可检测标记。在实施例中，包括第二可检测标记的标记探针与经延伸的序列结合。在实施例中，经延伸的序列和标记探针包括互补寡核苷酸。在实施例中，经延伸的序列包括经修饰的碱基，并且测量经延伸的序列的量包括使经延伸的序列与和经修饰的碱基结合的可检测部分接触。在实施例中，经修饰的碱基包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位，并且可检测部分包括经修饰的碱基的结合配偶体和第二可检测标记。在实施例中，经修饰的碱基包括链霉亲和素或亲和素，并且可检测部分包括生物素和第二可检测标记。在实施例中，经修饰的碱基包括生物素，并且可检测部分包括亲和素和第二可检测标记。
本文进一步描述了第二可检测标记。在实施例中，第二可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来检测。在实施例中，第二可检测标记包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，经取代的联吡啶配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个与标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个与标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，有机金属络合物包括钌、锇或铼。
在实施例中，第二可检测标记包括式II化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式III化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式IV化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式V化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式VI化合物。
在实施例中，检测试剂(例如，第一检测试剂和/或第二检测试剂)的第一可检测标记和标记探针的第二可检测标记相同。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式II化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式III化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式IV化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式V化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式VI化合物。
在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记不同。在实施例中，一旦第一可检测标记由信号扩增试剂结合，那么所述第一可检测标记就不可检测。在实施例中，信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合，而不是与第二可检测标记特异性结合。在实施例中，第一可检测标记包括式II化合物，并且第二可检测标记包括式III、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式III化合物，并且第二可检测标记包括式II、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式IV化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式V化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式VI化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或V中的任一者的化合物。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。
在实施例中，所述方法包括通过测量表面上的第二可检测标记的量来测量经延伸的序列的量。在实施例中，第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第二可检测标记包括ECL标记，并且测量第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
在实施例中，所述方法进一步包括测量表面上的第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记和第二可检测标记是可检测地不同的。在实施例中，所述方法包括分别测量第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括ECL标记，并且测量第一可检测标记和第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
II.包括第一核酸探针的检测试剂的信号扩增
在实施例中，本发明提供了一种检测样品中的所关注的分析物的方法，所述方法包括：
在表面上形成第一复合物，其中所述第一复合物包括所关注的分析物、特异性结合分析物的捕获试剂和特异性结合分析物的检测试剂，其中诉搜狐检测试剂包括第一核酸探针；
延伸所述第一核酸探针以形成包括第一锚定区的第一经延伸的序列，其中所述第一锚定区与固定在所述表面上的第一锚定试剂结合；
将所述第一经延伸的序列与包括第一可检测标记的第一标记探针结合；以及
将所述第一标记探针与信号扩增试剂接触。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。包括第一核酸探针的检测试剂；延伸所述第一核酸探针以形成第一经延伸的序列；并且将第一标记探针与第一经延伸的序列结合。
在实施例中，通过以下形成第一复合物：使所关注的分析物与(i)表面；(ii)捕获试剂；以及(iii)检测试剂接触。在实施例中，通过以下形成第一复合物：使样品与(i)表面；(ii)捕获试剂；以及(iii)检测试剂接触。
在实施例中，第一复合物的检测试剂是第一检测试剂，并且第一复合物进一步包括第二检测试剂，其中第一检测试剂和第二检测试剂中的每一种包括如本文所描述的邻近核酸探针。在实施例中，邻近核酸探针中的一个或两个邻近核酸探针被延伸以形成包括如本文所描述的第一锚定区的第一经延伸的序列。在实施例中，通过以下形成第一复合物：使所关注的分析物和/或样品与(i)表面；(ii)捕获试剂；(iii)第一检测试剂；以及(iv)第二检测试剂接触。如本文所描述的，捕获试剂以及第一检测试剂和第二检测试剂可以以任何顺序与样品和/或分析物接触。
在实施例中，如本文所描述的将捕获试剂固定在表面上。在实施例中，捕获试剂能够固定到表面上。在实施例中，所述方法包括在第一复合物形成之前、期间或之后将捕获试剂固定到表面。在实施例中，所述方法包括在所述方法的步骤(a)之前将捕获试剂固定到表面。本文提供了将捕获试剂固定到表面的方法。
在实施例中，所述方法进一步包括在使第一标记探针与信号扩增试剂接触之前，检测表面上的第一复合物。在实施例中，检测包括测量与表面结合的第一经延伸的序列的量。在实施例中，检测包括测量与第一经延伸的序列结合的第一标记探针的量。在实施例中，检测包括测量第一标记探针的第一可检测标记的量。在实施例中，第一可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第一可检测标记包括ECL标记，并且测量第一可检测标记的量包括测量ECL信号。
在实施例中，第一标记探针包括多个第一可检测标记，并且多种信号扩增试剂与第一标记探针结合，其中每种信号扩增试剂与检测试剂上的单独的第一可检测标记结合。在实施例中，第一经延伸的序列结合多个第一标记探针，并且单独的信号扩增试剂与多个第一标记探针中的每个第一标记探针结合。
II.A.包括结合部分的信号扩增试剂
在实施例中，第一标记探针与以下接触：(1)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂包括结合部分，以及(2)可检测部分，其中所述可检测部分包括：(i)结合部分的结合配偶体以及(ii)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记。
在实施例中，结合部分包括寡核苷酸，并且可检测部分包括互补寡核苷酸。在实施例中，结合部分和可检测部分包括受体-配体对、抗原-抗体对、半抗原-抗体对、表位-抗体对、模拟表位-抗体对、适体-靶分子对、嵌入剂-靶分子对或酶-底物对。在实施例中，结合部分包括可检测部分的多个结合位点。在实施例中，结合部分包括可检测部分的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个结合位点。在实施例中，可检测部分包括结合部分的多个结合位点。在实施例中，可检测部分包括结合部分的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个结合位点。例如，一个链霉亲和素能够结合四个生物素分子。在实施例中，结合部分包括生物素，并且可检测部分包括亲和素或链霉亲和素。在实施例中，结合部分包括亲和素或链霉亲和素，并且可检测部分包括生物素。
在实施例中，可检测部分包括第二可检测标记。在实施例中，可检测部分包括第二可检测标记中的多于一个的第二可检测标记。在实施例中，可检测部分包括第二可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第二可检测标记。
在实施例中，第二可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来检测。在实施例中，第二可检测标记包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，经取代的联吡啶配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个与可检测部分共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个与可检测部分共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，有机金属络合物包括钌、锇或铼。
在实施例中，第二可检测标记包括式II化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式III化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式IV化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式V化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式VI化合物。
在实施例中，第一标记探针的第一可检测标记和可检测部分的第二可检测标记相同。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式II化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式III化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式IV化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式V化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式VI化合物。
在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记不同。在实施例中，一旦第一可检测标记由信号扩增试剂结合，那么所述第一可检测标记就不可检测。在实施例中，信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合，而不是与第二可检测标记特异性结合。在实施例中，第一可检测标记包括式II化合物，并且第二可检测标记包括式III、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式III化合物，并且第二可检测标记包括式II、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式IV化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式V化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式VI化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或V中的任一者的化合物。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。
在实施例中，第一标记探针首先与信号扩增试剂接触，然后与可检测部分接触。在实施例中，第一标记探针与信号扩增试剂和可检测部分同时或基本上同时接触。
在实施例中，接触包括：(i)形成包括信号扩增试剂和可检测部分的信号扩增复合物；以及(ii)使第一标记探针与信号扩增复合物接触。在实施例中，可检测部分包括结合部分的多个结合位点，和/或结合部分包括可检测部分的多个结合位点，并且信号扩增复合物包括多种信号扩增试剂，并且其中每种信号扩增试剂与一个或多个可检测部分结合。在实施例中，第一复合物和信号扩增复合物同时或基本上同时形成。在实施例中，第一复合物和信号扩增复合物依次形成。在实施例中，第一复合物在表面上形成，并且信号扩增复合物在单独的反应器皿或容器中形成。
在结合部分包括寡核苷酸结合部分并且可检测部分包括寡核苷酸结合部分的互补寡核苷酸的实施例中，所述该方法进一步包括在与可检测部分结合之前增加寡核苷酸结合部分的长度。在实施例中，增加寡核苷酸结合部分的长度包括将寡核苷酸结合部分与另外的寡核苷酸连接。在实施例中，增加寡核苷酸结合部分的长度包括将寡核苷酸结合部分与另外的寡核苷酸杂交，其中至少一部分另外的寡核苷酸包括寡核苷酸结合部分的互补序列。在实施例中，另外的寡核苷酸包括多于一个的可检测部分的互补序列，由此允许多于一个拷贝的可检测部分与第二复合物结合，并且进一步扩增测定信号，如在本文实施例中所描述的。
在实施例中，所述方法包括测量表面上的第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记和第二可检测标记是可检测地不同的。在实施例中，所述方法包括分别测量第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括ECL标记，并且测量第一可检测标记和第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
在实施例中，所述方法包括测量表面上的第二可检测标记的量。在实施例中，第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第二可检测标记包括ECL标记，并且测量第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
II.B.包括酶的信号扩增试剂
在实施例中，第一标记探针与以下接触：(1)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括酶，以及(2)所述酶的底物。
在实施例中，信号扩增试剂包括作用于底物的酶。在实施例中，酶是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶(GO)、乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶或β-内酰胺酶。
在实施例中，信号扩增试剂包括作用于酶的底物的酶。在实施例中，酶与底物结合并作用于底物，例如通过氧化、还原、水解或其组合，以产生可检测的信号。在实施例中，可检测信号包括生色信号、化学发光、荧光或其组合。在实施例中，酶是HRP、AP或β-半乳糖苷酶。在实施例中，酶是HRP，并且可检测部分是TMB、ABTS或OPD。在实施例中，结合部分是AP，并且可检测部分是PNPP。在实施例中，结合部分是β-半乳糖苷酶，并且可检测部分是ONPG。HRP底物的另外的非限制性实例包含化学发光底物如SUPERSIGNALTM和荧光底物如QUANTABLUTM、QUANTAREDTM和AMPLEXTMRed。AP底物的另外的非限制性实例包含化学发光底物CDPTM和DYNALIGHTTM。本文进一步描述了各种酶底物的检测方法，所述检测方法包含TMB、ABTS、OPD、PNPP和ONPG。
在实施例中，所述方法包括测量酶的活性。在实施例中，测量包括测量酶作用于底物时产生的可检测信号。在实施例中，可检测信号通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，底物是TMBM、ABTS、OPD、PNPP或ONPG，并在与酶反应时产生生色信号。在实施例中，底物在与酶反应时产生荧光信号。在实施例中，底物在与酶反应时产生化学发光信号。在实施例中，经测量的可检测信号的量用于确定样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的可检测信号的量用于确定样品中分析物的量。
II.C.包括第二可检测标记的信号扩增试剂
在实施例中，第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合并且包括第二可检测标记。
本文进一步描述了第二可检测标记。在实施例中，第二可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来检测。在实施例中，第二可检测标记包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，经取代的联吡啶配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个与标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个与标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，有机金属络合物包括钌、锇或铼。
在实施例中，第二可检测标记包括式II化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式III化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式IV化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式V化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式VI化合物。
在实施例中，标记探针的第一可检测标记和信号扩增试剂的第二可检测标记相同。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式II化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式III化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式IV化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式V化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式VI化合物。
在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记不同。在实施例中，一旦第一可检测标记由信号扩增试剂结合，那么所述第一可检测标记就不可检测。在实施例中，信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合，而不是与第二可检测标记特异性结合。在实施例中，第一可检测标记包括式II化合物，并且第二可检测标记包括式III、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式III化合物，并且第二可检测标记包括式II、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式IV化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式V化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式VI化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或V中的任一者的化合物。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。
在实施例中，所述方法包括测量第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记和第二可检测标记是可检测地不同的。在实施例中，所述方法包括分别测量第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括ECL标记，并且测量第一可检测标记和第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
在实施例中，所述方法包括测量第二可检测标记的量。在实施例中，第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第二可检测标记包括ECL标记，并且测量第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
II.D.包括第二核酸探针的信号扩增试剂
在实施例中，第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合并且包括第二核酸探针。在实施例中，所述方法包括在表面上形成包括第一标记探针和信号扩增试剂的第二复合物。
在实施例中，所述方法包括延伸第二核酸探针以形成第二经延伸的序列。在实施例中，延伸包括将第二核酸探针与另外的寡核苷酸连接以形成第二经延伸的序列。在实施例中，延伸包括将第二核酸探针与另外的寡核苷酸杂交，其中至少一部分另外的寡核苷酸包括第二核酸探针的互补序列，以形成第二经延伸的序列。在实施例中，延伸包括将第二核酸探针与模板寡核苷酸结合，用于延伸反应以形成第二经延伸的序列。在实施例中，第二核酸探针是用于延伸反应的引物。在实施例中，延伸反应包括PCR、LCR、SDA、3SR、等温扩增(例如，解旋酶依赖性扩增或滚环扩增)或其组合。在实施例中，延伸包括将第二核酸探针与模板寡核苷酸结合，并且通过PCR、LCR、SDA、3SR、等温扩增(例如，解旋酶依赖性扩增或滚环扩增)或其组合延伸第二核酸探针。在实施例中，延伸包括将第二核酸探针与模板寡核苷酸结合，并且通过PCR延伸第二核酸探针。在实施例中，延伸包括将第二核酸探针与模板寡核苷酸结合，形成环状模板寡核苷酸(例如，通过线性模板寡核苷酸的连接)，以及通过滚环扩增延伸第二核酸探针。
在实施例中，第二经延伸的序列包括第二锚定区。在实施例中，第二锚定区与表面上的第二锚定试剂结合。在实施例中，在本文所描述的第一复合物形成之前、期间或之后，将第二锚定试剂固定在表面上。在实施例中，在本文所描述的第二复合物形成之前、期间或之后，将第二锚定试剂固定在表面上。在实施例中，在所述方法的步骤(a)之前，将第二锚定试剂固定到表面。在实施例中，在形成第二经延伸的序列之前，将第二锚定试剂固定到表面。在实施例中，在测量第二经延伸的序列的量之前，将第二锚定试剂固定到表面。在实施例中，第二锚定试剂通过硫酯、硫醚、二硫化物或其组合固定在到表面。在实施例中，如本文进一步所描述的，通过靶向剂将第二锚定试剂固定到表面。
在实施例中，第二锚定试剂包括寡核苷酸、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位。在实施例中，第二锚定试剂包括适体配体，并且第二锚定区包括适体。在实施例中，第二锚定试剂包括寡核苷酸结合蛋白，并且第二锚定区包括寡核苷酸序列。在实施例中，第二锚定试剂包括单链寡核苷酸。在实施例中，第二锚定试剂包括双链寡核苷酸。在实施例中，第二锚定试剂和第二锚定区包括互补寡核苷酸。在实施例中，第二锚定试剂包括第二锚定寡核苷酸。在实施例中，第二锚定区包括与第二锚定寡核苷酸互补的第二锚定寡核苷酸补体。
在实施例中，将第二经延伸的序列与第二锚定试剂结合包括在锚定试剂与第二锚定区之间形成三螺旋。在实施例中，将第二经延伸的序列与第二锚定试剂结合包括在结合之前变性第二锚定区以暴露单链寡核苷酸区；在结合之前将第二锚定区暴露于解旋酶活性；和/或在结合之前将第二锚定区暴露于核酸酶处理，其中第二锚定区包括一个或多个经半抗原修饰的碱基，并且第二锚定试剂包括一个或多个对半抗原具有特异性的抗体；和/或第二锚定区包括一个或多个经配体修饰的碱基，并且第二锚定试剂包括一个或多个对配体具有特异性的受体。
在实施例中，第二经延伸的序列在与第二标记探针接触之前与第二锚定试剂结合。在实施例中，在延伸第二核酸探针后，第二复合物与表面结合。在实施例中，第二经延伸的序列在距表面上的第二复合物约1nm至约500nm、约5nm至约250nm、约10nm至约200nm或约15nm至约150nm内的位置处与第二锚定试剂结合。在实施例中，第二经延伸的序列在距表面上的第二复合物小于1μm的位置处与第二锚定试剂结合。在实施例中，第二经延伸的序列在距表面上的第二复合物小于500nm的位置处与第二锚定试剂结合。在实施例中，第二经延伸的序列在距表面上的第二复合物小于200nm的位置处与第二锚定试剂结合。
在实施例中，第一锚定区和第二锚定区包括相同的寡核苷酸序列。在实施例中，第一锚定区和第二锚定区包括不同的寡核苷酸序列。在实施例中，第一锚定试剂和第二锚定试剂包括相同的寡核苷酸序列。在实施例中，第一锚定试剂和第二锚定试剂包括不同的寡核苷酸序列。在实施例中，第一锚定区和第二锚定区与第一锚定试剂和/或第二锚定试剂的分离部分结合。
在实施例中，所述方法包括测量表面上的第一经延伸的序列、第二经延伸的序列或两者的量。在实施例中，第二经延伸的序列与包括第二可检测标记的第二标记探针接触。在实施例中，第一标记探针和第二标记探针包括相同的寡核苷酸序列。在实施例中，第一标记探针和第二标记探针包括不同的寡核苷酸序列。
在实施例中，第二标记探针包括第二可检测标记中的多于一个的第二可检测标记。在实施例中，第二标记探针包括第二可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第二可检测标记。在实施例中，包括第二可检测标记的第二标记探针与第二经延伸的序列结合。在实施例中，第二经延伸的序列和第二标记探针包括互补寡核苷酸。在实施例中，第二经延伸的序列包括经修饰的碱基，并且测量经延伸的序列的量包括使经延伸的序列与和经修饰的碱基结合的可检测部分接触。在实施例中，经修饰的碱基包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位，并且可检测部分包括经修饰的碱基的结合配偶体和第二可检测标记。在实施例中，经修饰的碱基包括链霉亲和素或亲和素，并且可检测部分包括生物素和第二可检测标记。在实施例中，经修饰的碱基包括生物素，并且可检测部分包括亲和素和第二可检测标记。
本文进一步描述了第二可检测标记。在实施例中，第二可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来检测。在实施例中，第二可检测标记包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，经取代的联吡啶配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个与第二标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个与第二标记探针共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，有机金属络合物包括钌、锇或铼。
在实施例中，第二可检测标记包括式II化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式III化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式IV化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式V化合物。在实施例中，第二可检测标记包括式VI化合物。
在实施例中，检测试剂的第一可检测标记和第二标记探针的第二可检测标记相同。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括如本文所描述的ECL标记。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式II化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式III化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式IV化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式V化合物。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括式VI化合物。
在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记不同。在实施例中，一旦第一可检测标记由信号扩增试剂结合，那么所述第一可检测标记就不可检测。在实施例中，信号扩增试剂与第一可检测标记特异性结合，而不是与第二可检测标记特异性结合。在实施例中，第一可检测标记包括式II化合物，并且第二可检测标记包括式III、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式III化合物，并且第二可检测标记包括式II、IV、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式IV化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、V或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式V化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或VI中的任一者的化合物。在实施例中，第一可检测标记包括式VI化合物，并且第二可检测标记包括式II、III、IV或V中的任一者的化合物。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。
在实施例中，所述方法包括通过测量表面上的第一可检测标记和第二可检测标记的量来测量第一经延伸的序列和第二经延伸的序列的量。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记和第二可检测标记是可检测地不同的。在实施例中，所述方法包括分别测量第一可检测标记和第二可检测标记的量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记各自包括ECL标记，并且测量第一可检测标记和第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
在实施例中，所述方法包括通过测量表面上的第二可检测标记的量来测量第二经延伸的序列的量。在实施例中，第二可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合测量。在实施例中，第二可检测标记包括ECL标记，并且测量第二可检测标记的量包括测量ECL信号。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于检测样品中分析物的存在。在实施例中，经测量的ECL信号的量用于确定样品中分析物的量。
表面
在实施例中，第一复合物包括捕获试剂，并且将捕获试剂固定到表面。在实施例中，第一复合物包括捕获试剂，并且将捕获试剂直接固定在表面上。在实施例中，将捕获试剂通过次级结合试剂，例如靶向剂间接固定在表面上。在实施例中，捕获试剂与靶向剂补体连接，所述靶向剂补体与固定在表面上的靶向剂结合。在实施例中，靶向剂补体直接与靶向剂结合。在实施例中，靶向剂和靶向剂补体包括互补寡核苷酸、受体-配体对、抗原-抗体对、半抗原-抗体对、表位-抗体对、模拟表位-抗体对、适体-靶分子对、杂交配偶体或嵌入剂-靶分子对。在实施例中，靶向剂和靶向剂补体是交叉反应性部分，例如硫醇和马来酰亚胺或碘乙酰胺；醛和酰肼；或叠氮化物和炔或环炔。在实施例中，靶向剂是生物素，并且靶向剂补体是亲和素或链霉亲和素。
在实施例中，靶向剂补体通过靶向桥剂与靶向剂结合，所述靶向桥剂是靶向剂和靶向剂补体两者的结合配偶体。在实施例中，靶向桥剂包括多个结合位点。在实施例中，靶向桥剂是链霉亲和素或亲和素，并且靶向剂和靶向剂补体各自是生物素。
在实施例中，包括捕获试剂、分析物和检测试剂的第一复合物在单个步骤中形成。在实施例中，包括捕获试剂、分析物以及第一检测试剂和第二检测试剂的第一复合物在单个步骤中形成。在实施例中，第一复合物在一个或多个步骤中形成。在实施例中，第一复合物在表面上形成。在实施例中，第一复合物在溶液中形成，然后固定到表面。在实施例中，通过将分析物与固定在表面上的捕获试剂结合，然后将检测试剂与分析物结合以在表面上形成第一复合物，来形成第一复合物。在实施例中，通过将分析物与固定在表面上的捕获试剂结合，然后将第一检测试剂和第二检测试剂与分析物结合以在表面上形成第一复合物，来形成第一复合物。在实施例中，通过将分析物与固定在表面上的捕获试剂结合，并且同时与检测试剂结合来形成第一复合物。在实施例中，通过将分析物与固定在表面上的捕获试剂结合，并且同时与第一检测试剂和第二检测试剂中的一种或两种检测试剂结合来形成第一复合物。在实施例中，通过将分析物与溶液中的检测试剂结合以形成分析物-检测试剂复合物，然后将分析物-检测试剂复合物与表面上的捕获试剂结合来形成第一复合物。在实施例中，通过将分析物与溶液中的第一检测试剂和第二检测试剂结合以形成分析物-检测试剂复合物，然后将分析物-检测试剂复合物与表面上的捕获试剂结合来形成第一复合物。在实施例中，如本文所描述的，通过将分析物与溶液中的捕获试剂和检测试剂结合，然后将捕获试剂固定到表面来形成第一复合物。在实施例中，如本文所描述的，通过将分析物与溶液中的捕获试剂以及第一检测试剂和第二检测试剂结合，然后将捕获试剂固定到表面来形成第一复合物。在第一复合物包括第一检测试剂和第二检测试剂的实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂可以同时或依次与分析物结合。
在包括锚定试剂(例如，如本文所描述的，用于与经延伸的序列结合的锚定试剂、用于与第一经延伸的序列结合的第一锚定试剂和/或用于与第二经延伸的序列结合的第二锚定试剂)的实施例中，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，锚定试剂直接固定在表面上。在实施例中，将锚定试剂通过次级结合试剂，例如，如本文所描述的靶向试剂间接固定在表面上。在实施例中，选择用于锚定试剂的靶向剂和靶向剂补体，使得与锚定试剂缔合的靶向剂和靶向剂补体基本上不与和捕获试剂缔合的靶向剂和靶向剂补体交叉反应。在实施例中，相同的靶向剂和靶向补体对与捕获试剂和锚定试剂缔合。在实施例中，靶向剂补体通过如本文所描述的靶向桥剂与靶向剂结合。在实施例中，在将捕获试剂固定到表面的同时或基本上同时，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，在将捕获试剂固定到表面之前，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，在将捕获试剂固定到表面之后，将锚定试剂被固定到表面。在实施例中，在本文所描述的第一复合物形成之前、期间或之后，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，在形成本文所描述的经延伸的序列之前，将锚定试剂固定到表面。在实施例中，在测量测量经延伸的序列的量之前，将锚定试剂固定到表面。
在实施例中，表面包括颗粒。在实施例中，表面包括多孔板的孔。在实施例中，表面包括多个不同的结合结构域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合结构域上。在表面包括孔的实施例中，孔包括多个不同的结合结构域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合结构域上。在实施例中，表面包括多个不同的结合结构域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合结构域上。在表面包括孔的实施例中，孔包括多个不同的结合结构域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合结构域上。在实施例中，捕获试剂在表面上锚定试剂的约1nm至约500nm、约5nm至约250nm、约10nm至约200nm或约15nm至约150nm内。在实施例中，捕获试剂距表面上的锚定试剂小于1μm。在实施例中，捕获试剂距表面上的锚定试剂小于500nm。在实施例中，捕获试剂距表面上的锚定试剂小于200nm。
在检测试剂包括形成第一经延伸的序列的第一核酸探针并且信号扩增试剂包括形成第二经延伸的序列的第二核酸探针的实施例中，表面包括能够与第一经延伸的序列结合的第一锚定试剂和能够与第二经延伸的序列结合的第二锚定试剂。在实施例中，第一锚定试剂和第二锚定试剂位于表面上的不同结合结构域上。在实施例中，第一锚定试剂和第二锚定试剂在表面上的相同结合结构域中。在实施例中，捕获试剂在与第一锚定试剂和第二锚定试剂中的每一种的另外的不同结合结构域中。在实施例中，捕获试剂在与第一锚定试剂和第二锚定试剂相同的结合结构域中。
在实施例中，表面包括电极。在实施例中，电极是碳墨电极。在实施例中，测量第二可检测标记的量包括向电极施加电压波形(例如，电势)以产生ECL信号。在实施例中，表面包括颗粒，并且所述方法包括在电极上收集颗粒，并且向电极施加电压波形(例如，电势)以产生ECL信号。
多重方法
在实施例中，所述方法是能够检测多种分析物的多重方法。在实施例中，多重方法同时检测多种分析物。在实施例中，多重方法包括重复一个或多个方法步骤以测量多种分析物。在实施例中，对每种分析物并行进行方法步骤中的每个方法步骤。在实施例中，每种分析物与不同的捕获试剂和/或检测试剂结合。在实施例中，通过使表面与包括多种分析物的样品接触，并行进行每种分析物与其对应的捕获试剂的结合。在实施例中，多种分析物以不同的量(例如，浓度)存在于样品中。例如，一种分析物以比另一种分析物低或高10、100、1000、10000、100000、106、107、108、109或1010倍的浓度存在。因此，在实施例中，本文所公开的多重方法的优点是其能够检测在约0.0001pg/mL至约100000pg/mL、约0.0005pg/mL至约50000pg/mL、约0.001pg/mL至约10000pg/mL、约0.005pg/mL至约5000pg/mL、约0.01pg/mL至约1000pg/mL、约0.05pg/mL至约500pg/mL、约0.1pg/mL至约100pg/mL、约0.5pg/mL至约50pg/mL或约1pg/mL至约10pg/mL范围内的分析物的浓度。在实施例中，最高丰度分析物以大于或约10pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于约10pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以大于或约1pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以大于或约0.5pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于0.5pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以大于或约0.3pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于0.3pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以大于或约0.1pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于0.1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以约1pg/mL至约100000pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以约0.0001pg/mL至约1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以约0.1pg/mL至约100000pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以约0.0001pg/mL至约0.1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，存在于样品中的最高丰度分析物的量是存在于样品中的最低丰度分析物的量的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍、约250倍、约500倍、约750倍、约1000倍、约10000倍、约100000倍、约106倍、约107倍、约108倍、约109倍、约1010倍或大于1010倍。
在实施例中，本发明提供了一种检测样品中多种所关注的分析物的方法，其中所述分析物以约0.0001pg/mL至约100000pg/mL的浓度存在，所述方法包括：形成如本文所描述的多种第一复合物，其中每种第一复合物包括独特的分析物和针对所述独特的分析物的捕获试剂和检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂；测量第一复合物的量(例如，通过测量如本文所描述的第一可检测标记的量)，由此检测样品中较高丰度分析物；使多个第一复合物与如本文所描述的信号扩增试剂接触，其中所述信号扩增试剂包括结合包括第二可检测标记的可检测部分的结合部分，或者其中所述信号扩增试剂包括作用于酶的底物的酶，或者其中所述信号扩增试剂包括形成经延伸的序列的核酸探针；并且如本文所描述的测量第二可检测标记的量、酶活性或经延伸的序列的量(例如，通过测量与经延伸的序列结合的第二可检测标记)，由此检测样品中的较低丰度分析物；其中存在于样品中的较高丰度分析物的量是较低丰度分析物的量的约1.5倍、约2倍、约5倍、约10倍、约25倍、约50倍、约75倍、约100倍、约500倍、约1000倍、约106倍、约107倍、约108倍、约109倍或约1010倍，和/或其中存在于样品中的较高丰度分析物的浓度为约1pg/mL至约100000pg/mL，并且存在于样品中的最低丰度分析物的浓度为约0.0001pg/mL至约1pg/mL。在实施例中，被测量的第一可检测标记和第二可检测标记的量基本上相同。在实施例中，被测量的第一可检测标记和第二可检测标记的量在约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或约1％内。在实施例中，信号扩增试剂扩增来自较低丰度分析物的测定信号(例如，对应于第二可检测标记的量)，使得较高丰度分析物和较低丰度分析物提供测定装置的检测极限内的测定信号。因此，信号扩增试剂能够使用相同的测定装置和以相同的样品稀释度检测宽浓度范围(例如，约0.0001pg/mL至约100000pg/mL)的多种分析物，即，不需要为了测量单独的分析物而稀释或浓缩样品。
在实施例中，表面包括多个结合结构域，并且每种分析物在不同结合结构域中形成复合物(例如，如本文所描述的第一复合物)。在实施例中，多个结合结构域在单个表面上。在实施例中，表面包括多孔板，并且每个结合结构域在不同孔中。在实施例中，表面包括多孔板的孔，并且每个结合结构域在孔的单独部分中。在实施例中，多个结合结构域在一个或多个表面上。在实施例中，表面包括颗粒，并且每个结合结构域在不同颗粒上。在实施例中，颗粒被布置成颗粒阵列。在实施例中，颗粒被编码以允许鉴定特异性颗粒并区分每个结合结构域。
在实施例中，结合结构域可彼此分离。在实施例中，表面是包括可拆卸孔的多孔板，并且每个结合结构域在不同孔中。在实施例中，表面包括一个或多个颗粒，并且每个颗粒可与剩余颗粒分离。分离颗粒的方法是本领域已知的并且包含例如流式细胞术、磁分离、亲和分离等。在实施例中，包括较高丰度分析物的第一复合物在被检测后从反应混合物中去除。在实施例中，包括较高丰度分析物的第一复合物在被检测后从表面分离和/或去除。在实施例中，分离和/或去除包括从其结合结构域去除包括较高丰度分析物的第一复合物，例如通过选择性洗涤其结合结构域。在实施例中，分离和/或去除包括将含有包括较高丰度分析物的第一复合物的结合结构域与剩余结合结构域分离，例如，如本文所描述的可分离的孔和/或可分离的颗粒。
在实施例中，每个结合结构域包括能够与靶向剂补体结合的靶向剂，并且每种捕获试剂和/或锚定试剂(例如，如本文所描述的，用于与经延伸的序列结合的锚定、用于与第一经延伸的序列结合的第一锚定试剂和/或用于与第二经延伸的序列结合的第二锚定试剂)包括能够与连接剂结合的补充连接剂。在实施例中，捕获试剂和锚定试剂通过以下方式固定在结合结构域中：(1)通过补充连接剂将捕获试剂和锚定试剂与和连接剂连接的靶向试剂补体结合；以及(2)将(1)的产物与包括靶向剂的结合结构域结合，其中(i)每个结合结构域包括不同的靶向剂，以及(ii)每种靶向试剂补体选择性地与靶向试剂中的一种靶向试剂结合，由此将每种捕获试剂和锚定试剂固定到其相关的结合结构域。
在实施例中，任选的桥连剂(其为连接剂和补充连接剂两者的结合配偶体)桥连连接剂和补充连接剂，使得各自与其相应的靶向剂补体结合的捕获试剂和/或锚定试剂与结合结构域接触，并且通过桥连剂、捕获试剂和/或锚定试剂中的每一种上的靶向剂补体以及结合结构域中的每个结合结构域上的靶向剂与其相应的靶向剂结合。
在实施例中，靶向剂和靶向剂补体是选自以下的结合配偶体对的两个成员：亲和素-生物素、链霉亲和素-生物素、抗体-半抗原、抗体-抗原、抗体-表位标签、核酸-互补核酸、适体-适体靶标和受体-配体。在实施例中，靶向剂和靶向剂补体是交叉反应性部分，例如，硫醇和马来酰亚胺或碘乙酰胺；醛和酰肼；叠氮化物和炔或环炔；烯烃和马来酰亚胺；硫醇和二硫化物；醛或酮和胺；或反式环辛烯和四嗪。在实施例中，靶向剂是生物素，并且靶向剂补体是亲和素或链霉亲和素。
在实施例中，连接剂和补充连接剂是选自以下的结合配偶体对的两个成员：亲和素-生物素、链霉亲和素-生物素、抗体-半抗原、抗体-抗原、抗体-表位标签、核酸-互补核酸、适体-适体靶标和受体-配体。在实施例中，连接剂和补充连接剂是交叉反应性部分，例如，硫醇和马来酰亚胺或碘乙酰胺；醛和酰肼；叠氮化物和炔或环炔；烯烃和马来酰亚胺；硫醇和二硫化物；醛或酮和胺；或反式环辛烯和四嗪。在实施例中，连接剂是亲和素或链霉亲和素，并且补充连接剂是生物素。在实施例中，靶向剂和靶向剂补体是互补寡核苷酸。在实施例中，靶向剂补体是链霉亲和素，靶向剂是生物素，并且连接剂和补充连接剂是互补寡核苷酸。
在包括桥连剂的实施例中，桥连剂是链霉亲和素或亲和素，并且连接剂和补充连接剂各自是生物素。进行多重测定的方法在例如US10,189,023和US10,201,812中有另外的描述。
分析物和样品
在实施例中，样品是生物样品。在实施例中，样品是环境样品。在实施例中，样品获自人类受试者。在实施例中，样品获自动物受试者。在实施例中，样品包括哺乳动物流体、分泌物或排泄物。在实施例中，样品是经纯化的哺乳动物流体、分泌物或排泄物。在实施例中，哺乳动物流体、分泌物或排泄物是全血、血浆、血清、痰、泪液、淋巴液、滑液、胸腔积液、尿、汗、脑脊液、腹水、奶、粪便、支气管灌洗液、唾液、羊水、鼻分泌物、阴道分泌物、表面活检、精子、精液/精液(semen/seminal fluid)、伤口分泌物和排泄物，或从中提取、纯化或其稀释液。另外的示例性样品包含但不限于生理样品、含有细胞悬浮液的样品，如粘膜拭子、组织吸出物、组织匀浆、细胞培养物和细胞培养上清液。在实施例中，样品是全血、血清、血浆、脑脊液、尿、唾液或从中提取、纯化或其稀释液。在实施例中，样品是血清或血浆。在实施例中，血浆在EDTA、肝素或柠檬酸盐中。
样品可以从本文所描述的单一来源获得，或者可以含有来自两种或更多种来源的混合物。
可以使用本发明的方法测量的分析物包含但不限于蛋白质、毒素、核酸、微生物、病毒、细胞、真菌、孢子、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、药物、激素、类固醇、营养物、代谢物和上述分子的任何经修饰衍生物，或包括上述分子中的一种或多种分子或其组合的任何复合物。样品中的所关注的分析物的水平可以指示疾病或疾病病状，或者其可以简单地指示受试者是否暴露于所述分析物。
在实施例中，样品包括多种所关注的分析物。在实施例中，多种分析物以不同的量(例如，浓度)存在于样品中。例如，一种分析物以比另一种分析物低或高10、100、1000、10000、100000、106、107、108、109或1010倍的浓度存在。因此，在实施例中，本文所公开的方法的优点是其能够检测在约0.0001pg/mL至约100000pg/mL、约0.0005pg/mL至约50000pg/mL、约0.001pg/mL至约10000pg/mL、约0.005pg/mL至约5000pg/mL、约0.01pg/mL至约1000pg/mL、约0.05pg/mL至约500pg/mL、约0.1pg/mL至约100pg/mL、约0.5pg/mL至约50pg/mL或约1pg/mL至约10pg/mL范围内的分析物的浓度。在实施例中，本文所公开的方法的另外的优点是其能够在样品的相同稀释度下检测不同浓度(例如，约0.0001pg/mL至约100000pg/mL)的多种分析物，即，不需要为了测量单独的分析物而稀释或浓缩样品。在实施例中，本文所公开的方法的另外的优点是其能够使用相同的检测试剂(或相同的第一检测试剂和第二检测试剂)，所述检测试剂包括用于在介于约0.0001pg/mL至约100000pg/mL之间的任何浓度下待检测的任何特定分析物的第一可检测标记。
在实施例中，最高丰度分析物以大于或约10pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于约10pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以大于或约1pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以大于或约0.5pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于0.5pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以大于或约0.3pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于0.3pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以大于或约0.1pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以小于0.1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以约1pg/mL至约100000pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以约0.0001pg/mL至约1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，最高丰度分析物以约0.1pg/mL至约100000pg/mL的浓度存在于样品中，并且最低丰度分析物以约0.0001pg/mL至约0.1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，存在于样品中的最高丰度分析物的量是存在于样品中的最低丰度分析物的量的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍、约250倍、约500倍、约750倍、约1000倍、约10000倍、约100000倍、约106倍、约107倍、约108倍、约109倍、约1010倍或大于1010倍。
在实施例中，分析物是外泌体。在实施例中，样品包括经纯化的外泌体。外泌体，也称为细胞外囊泡或EV，是大多数细胞类型释放的小膜囊泡。外泌体的释放和随后的摄取是细胞间通讯的方法，并且在许多生理和病理过程的调节中发挥作用。已经表明外泌体含有多种信号传导分子，所述信号传导分子包含但不限于表面结合和胞质蛋白、脂质、mRNA和miRNA，并且已经表明这些物种在每个外泌体中的同一性和浓度可以用于推断其细胞起源和功能。因此，患者的总外泌体群体的基因组或蛋白质组谱可以为各种病理病状提供有价值的预后信息，包含癌症、传染病、肾病和肝病以及创伤性脑损伤等。
在实施例中，捕获试剂和检测试剂，或捕获试剂和第一检测试剂和第二检测试剂与外泌体表面上的表面标志物结合。例如，由大多数外泌体表达的常见蛋白质包含但不限于CD9、CD63、CD81、Hsp70、PDCD6IP和Tsg101。在实施例中，捕获试剂和检测试剂，或捕获试剂和第一检测试剂和第二检测试剂与由特定细胞类型释放的外泌体特异性表达的标志物结合。例如，所述方法可以用于检测特定的外泌体亚群，例如，与疾病相关的或有患病风险的外泌体亚群。在实施例中，捕获试剂和检测试剂，或捕获试剂和第一检测试剂和第二检测试剂与疾病相关的外泌体表面标志物结合。
在实施例中，分析物是外泌体的内部分析物，例如货物蛋白、脂质或核酸。在实施例中，外泌体在与捕获试剂结合之前或之后，但在添加检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂之前被透化。
另外的实施例
在实施例中，本文所提供的方法是竞争性测定形式。一般而言，竞争性测定，例如竞争性免疫测定或竞争性抑制测定，分析物和竞争剂竞争与捕获试剂和/或检测试剂(或第一检测试剂和第二检测试剂)结合。在此类测定中，通常通过直接测量竞争剂来间接测量分析物。如本文所使用的，“竞争剂”是指能够与和分析物相同的捕获试剂和/或检测试剂(或第一检测试剂和第二检测试剂)结合的化合物，使得捕获试剂和/或检测试剂(或第一检测试剂和第二检测试剂)仅能够结合分析物或竞争剂，而不能结合两者。在实施例中，竞争性测定用于检测和测量不能结合多于一种捕获试剂和/或检测试剂(或第一检测试剂和第二检测试剂)的分析物，例如小分子分析物或不具有对于一个不同结合位点的分析物。在实施例中，竞争性测定用于检测和测量抗体生物标志物。竞争性免疫测定的实例包含US 4,235,601；US 4,442,204；以及US 5,028,535中所描述的竞争性免疫测定。
本文的方法可以在单个测定室，如测定板的单个孔中进行。本文的方法也可以在测定盒的测定室中进行。例如，在US 8,343,526；US 9,731,297；US 9,921,166；US10,184,884；US10,281,678；US10,272,436；US2004/0022677；US2004/0189311；US2005/0052646；US2005/0142033；US2018/0074082；以及US2019/0391170中描述了测定模块，例如，测定板或测定盒，用于进行适于本发明的测定测量的方法和设备。
系统
在实施例中，本发明提供了一种测定系统，其用于执行如本文所描述的检测样品中的所关注的分析物的方法。在实施例中，样品包括多种分析物，其中分析物以约0.0001pg/mL至约100000pg/mL范围内的浓度存在。在实施例中，样品包括一种或多种分析物，所述一种或多种分析物的浓度是最低丰度分析物的浓度的10、100、1000、10000、100000、106、107、108、109或1010倍。在实施例中，利用如本文所描述的捕获试剂、检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂以及信号扩增试剂，所述测定系统能够在约0.0001pg/mL至约100000pg/mL的整个浓度范围内检测分析物。在实施例中，测定系统能够利用捕获试剂和检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂检测浓度大于或约1pg/mL的分析物，并且测定系统另外能够利用捕获试剂、检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂以及信号扩增试剂检测浓度小于1pg/mL的分析物。在实施例中，测定系统采用包括第一可检测标记的相同检测试剂，或各自包括第一可检测标记的相同第一检测试剂和第二检测试剂来检测介于约0.0001pg/ml与约100000pg/mL之间的任何浓度的分析物。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。
在实施例中，测定系统包括至少一个存储器单元，至少一个处理单元，所述至少一个处理单元根据所述至少一个存储器单元上的指令编程；以及至少一个测定系统组件，所述至少一个测定系统组件被配置成由所述至少一个处理单元控制。在实施例中，至少一个处理单元被配置成控制所述至少一个测定系统组件以对样品中的分析物进行测量。在实施例中，至少一个测定系统组件是读取器仪器。在实施例中，测定系统包括多于一个读取器仪器。在实施例中，测量包括测量可检测标记。在实施例中，可检测标记存在于如本文所描述的检测试剂、第一检测试剂和第二检测试剂、标记探针或可检测部分上。在实施例中，至少一个处理单元被配置成控制至少一个测定系统组件以进行以下中的一项或两项：对如本文所描述的较高丰度分析物的第一测量；以及对如本文所描述的较低丰度分析物的第二测量。在实施例中，存在于样品中的较高丰度分析物的量是存在于样品中的较低丰度分析物的量的约1.5倍、约2倍、约5倍、约10倍、约25倍、约50倍、约75倍、约100倍、约500倍、约1000倍、约10000倍、约100000倍、约106倍、约107倍、约108倍、约109倍、约1010或大于1010倍。在实施例中，较高丰度分析物以约1pg/mL至约100000pg/mL的浓度存在于样品中，并且较低丰度分析物以约0.0001pg/mL至约1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，较高丰度分析物和较低丰度分析物能够在相同稀释度的样品中被检测。在实施例中，使用包括ECL标记的检测试剂来检测较高丰度分析物。在实施例中，使用各自包括ECL标记的第一检测试剂和第二检测试剂来检测较高丰度分析物。在实施例中，使用(i)包括ECL标记的检测试剂和(ii)与所述ECL标记特异性结合的信号扩增试剂来检测较低丰度分析物。在实施例中，使用(i)各自包括ECL标记的第一检测试剂和第二检测试剂，以及(ii)与所述ECL标记特异性结合的信号扩增试剂来检测较低丰度分析物。
在实施例中，本发明提供了一种或多种非暂时性计算机可读介质。在实施例中，所述一种或多种非暂时性计算机可读介质，在其上存储有指令，所述指令在由至少一个处理单元执行时使所述至少一个处理单元：通过控制测定系统对样品中的分析物进行测量。在实施例中，测量包括测量可检测标记。在实施例中，可检测标记存在于如本文所描述的检测试剂、第一检测试剂和第二检测试剂、标记探针或可检测部分上。在实施例中，至少一个处理单元进行以下中的一项或两项：对如本文所描述的较高丰度分析物的第一测量；以及对如本文所描述的较低丰度分析物的第二测量。在实施例中，存在于样品中的较高丰度分析物的量是存在于样品中的较低丰度分析物的量的约1.5倍、约2倍、约5倍、约10倍、约25倍、约50倍、约75倍、约100倍、约500倍、约1000倍、约10000倍、约100000倍、约106倍、约107倍、约108倍、约109倍、约1010或大于1010倍。在实施例中，较高丰度分析物的量以约1pg/mL至约100000pg/mL的浓度存在于样品中，并且较低丰度分析物以约0.0001pg/mL至约1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，使用包括ECL标记的检测试剂来检测较高丰度分析物。在实施例中，使用各自包括ECL标记的第一检测试剂和第二检测试剂来检测较高丰度分析物。在实施例中，使用(i)包括ECL标记的检测试剂和(ii)与所述ECL标记特异性结合的信号扩增试剂来检测较低丰度分析物。在实施例中，使用(i)各自包括ECL标记的第一检测试剂和第二检测试剂，以及(ii)与所述ECL标记特异性结合的信号扩增试剂来检测较低丰度分析物。
在实施例中，第一测量是如本文所描述的第一可检测标记的测量。在实施例中，第一可检测标记存在于检测试剂上。在实施例中，第一可检测标记存在于第一检测试剂和第二检测试剂中的每一者上。在实施例中，第一可检测标记包含标记探针，所述标记探针与通过延伸检测试剂的核酸探针形成的经延伸的序列结合。在实施例中，第二测量是如本文所描述的可检测部分的测量。在实施例中，第二测量是如本文所描述的酶活性的测量。在实施例中，第二测量是如本文所描述的第二可检测标记的测量。在实施例中，第二可检测标记存在于与信号扩增试剂结合的可检测部分上。在实施例中，第二可检测标记包含标记探针，所述标记探针与通过延伸信号扩增试剂的核酸探针形成的经延伸的序列结合。本文描述了可检测部分、酶活性、标记探针以及第一可检测标记和第二可检测标记。
在实施例中，第一测量和/或第二测量是可检测信号的测量。在实施例中，第一测量和/或第二测量是光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光(ECL)、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合的测量。在实施例中，第一可检测标记和第二可检测标记中的每一个都是ECL标记。在实施例中，第一测量和第二测量中的每一者都是ECL测量。在实施例中，第一测量是ECL测量，并且第二测量是如本文所描述的酶活性的测量。在实施例中，第一测量是ECL测量，并且第二测量是生色信号、荧光或化学发光的测量。
在实施例中，第一测量的经测量的绝对值在第二测量的经测量的绝对值的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或约1％内，或与第二测量的经测量的绝对值基本上相同。在实施例中，在第一测量与第二测量之间不调整系统的检测上限和检测下限。在实施例中，测定系统被配置成在第一测量与第二测量之间调整系统的检测上限和检测下限。
在实施例中，包括多种分析物的样品与包括一个或多个结合结构域的表面接触，其中每个结合结构域包括针对独特的分析物的捕获试剂。在实施例中，所述表面包括(i)包括较高丰度分析物的一个或多个结合结构域，以及(ii)包括较低丰度分析物的一个或多个结合结构域。在实施例中，存在于样品中的较高丰度分析物的量是存在于样品中的较低丰度分析物的量的约1.5倍、约2倍、约5倍、约10倍、约25倍、约50倍、约75倍、约100倍、约500倍、约1000倍、约10000倍、约100000倍、约106倍、约107倍、约108倍、约109倍、约1010或大于1010倍。在实施例中，较高丰度分析物的量以约1pg/mL至约100000pg/mL的浓度存在于样品中，并且较低丰度分析物以约0.0001pg/mL至约1pg/mL的浓度存在于样品中。在实施例中，测定系统被配置成对含有较高丰度分析物的结合结构域选择性地进行第一测量，并且对含有较低丰度分析物的结合结构域选择性地进行第二测量。在实施例中，测定系统被配置成对具有低于来自第一测量的预定义阈值的值的结合结构域选择性地进行第二测量。在实施例中，依次进行第一测量和第二测量。在实施例中，测定系统被配置成进行：首先，对含有较高丰度分析物的结合结构域的第一测量；第二，对含有较低丰度分析物的结合结构域的第二测量。在实施例中，测定系统被配置成同时或基本上同时进行所述第一测量和所述第二测量。在实施例中，测定系统被配置成进行第一测量并且允许用户确定是否要进行第二测量。在实施例中，测定系统被配置成进行第一测量，并且例如基于在第一测量中测量的一种或多种较高丰度分析物和/或较低丰度分析物的值，自动确定是否要进行第二测量。例如，如果第一测量足以测量样品中的较高丰度分析物和较低丰度分析物两者，则可以不进行第二测量。
本文的方法可以手动进行，使用自动化技术，或两者。自动化技术可以是部分自动化的，例如一个或多个模块化仪器，或者完全集成的自动化仪器。在WO 2018/017156、WO2017/015636和WO 2016/164477中描述了示例性自动化系统和设备。
在实施例中，用于执行本文的方法的自动化系统，例如模块化系统和完全集成的系统，包括以下自动化子系统中的一个或多个自动化子系统：计算机子系统，所述计算机子系统包括硬件(例如，个人计算机、膝上型计算机、硬件处理器、磁盘、键盘、显示器、打印机)、软件(例如，驱动程序、驱动控制器和数据分析器等程序)和/或数据库；用于样品和/或试剂处理的液体处理子系统，例如包括机器人移液手、注射器、搅拌设备、超声混合设备和/或磁混合设备；样品、试剂和/或消耗品存储和处理子系统，例如，包括机器人操纵器、管或盖或箔穿孔设备、盖移除设备、如线性或环状输送机的输送设备、管支架、板载体、槽载体、移液管尖端载体、板摇动器和/或离心机；测定反应子系统，例如基于流体和/或基于消耗品的测定反应子系统(例如试管和多孔板)；容器和消耗品清洗子系统，例如包括板清洗设备；磁分离器或磁颗粒浓缩器子系统，例如流动池型、管式和/或板式；细胞和颗粒检测、分类和/或分离子系统，例如包括流式细胞仪和/或Coulter计数器；检测子系统，例如，包括比色检测器、浊度检测器、荧光检测器和/或ECL检测器；温度控制子系统，例如包括空气处理系统、空气冷却系统、空气加热系统、风扇、鼓风机和/或水浴；废物子系统，例如，包括液体和/或固体废物容器；全球唯一标识符(GUI)检测子系统，例如，包括1D和/或2D条形码扫描仪，如平板扫描仪和棒型扫描仪。在实施例中，自动化系统进一步包括模块化或完全集成的分析子系统，例如色谱法系统，如高效液相色谱法(HPLC)或快速蛋白质液相色谱法(FPLC)，或质谱仪。
在实施例中，进行样品鉴定和制备的系统或模块与进行和/或检测本文的测定的系统或模块组合、邻接、相邻和/或自动连接或耦接。相同类型的多个模块化系统可以组合以增加吞吐量。在实施例中，模块化系统与进行其它类型分析，如化学、生物化学和/或核酸分析的模块组合。
在实施例中，自动化系统允许批量、连续、随机存取和/或即时工作流程，以及单个、中等和高样品吞吐量。
在实施例中，自动化系统包括以下装置中的一个或多个装置：板密封器(例如，ZYMARK)、板清洗器(例如，BIOTEK、TECAN)、试剂分配器、自动化移液站和/或液体处理站(例如，TECAN、ZYMARK、LABSYSTEMS、BECKMAN、HAMILTON)、培养箱(例如，ZYMARK)、板摇动器(例如，Q.INSTRUMENTS、INHECO、THERMOFISHER SCIENTIFIC)、读板器(例如，SECTOR S600、/>QUICKPLEX SQ 120，和在US 6,977,722中描述的读板器)、化合物文库模块、样品存储模块和/或化合物和/或样品检索模块。在实施例中，这些装置中的一个或多个装置通过机器人组合件耦接到自动化系统，使得整个测定过程可以自动进行。在实施例中，容器(例如，板)在设备与本文所描述的各种装置(例如，板的堆叠)之间手动移动。
在实施例中，自动化系统被配置成执行以下功能中的一项或多项功能：将消耗品，如板移动到检测子系统中、移动到检测子系统内和移动出检测子系统；在其它子系统之间移动消耗品；储存消耗品；样品和试剂处理(例如，适于混合试剂和/或将试剂引入到消耗品中)；消耗品摇动(例如，用于混合试剂和/或用于提高反应速率)；消耗品清洗(例如，清洗板和/或进行测定清洗步骤(例如，孔抽吸))；测量流动池或消耗品如管或板中的可检测信号，例如ECL信号。自动化系统可以被配置成处理放置在支架和/或多孔板，如96孔板或384孔板中的单独的管。
如本文所描述的用于在自动化系统中集成组件和模块的方法，例如，由Sargeant等人,“平台完善(Platform Perfection),”《医疗产品外包(Medical ProductOutsourcing)》,2010年5月17日讨论。
在实施例中，自动化系统是完全自动化的、模块化的、计算机化的，对多种分析物进行体外定量和定性测试，和/或进行光度测定、离子选择性电极测量和/或电化学发光(ECL)测定。在实施例中，所述系统包括以下硬件单元中的一个或多个硬件单元：控制单元、核心单元和至少一个分析模块。
在实施例中，控制单元利用图形用户接口控制所有仪器功能，并且包括读出装置，如监视器；输入装置，如键盘和鼠标；以及例如使用Windows操作系统的个人计算机。在实施例中，核心单元包括管理样品到每个指定分析模块的输送的一个或多个组件。核心单元的实际组成取决于分析模块的配置，这可以由本领域技术人员使用本领域已知的方法来配置。在实施例中，核心单元至少包括采样单元和一个支架转子作为主要组件。在实施例中，控制单元进一步包括延伸单元，例如输送线和/或第二支架转子。在实施例中，核心单元进一步包括样品支架装载器/卸载器、端口、条形码读取器(用于支架和样品)、水源和系统接口端口。在实施例中，自动化系统进行ECL测定，并且包括试剂区域、测量区域、消耗品区域和预清洁区域。
与本文的实施例一致的测定装置可以用于，例如，以多孔板形式进行测定，所述多孔板形式具有以下所期望属性中的一种或多种所期望属性：(i)高灵敏度，(ii)大动态范围，(iii)小尺寸和重量，(iv)基于阵列的复用能力，(v)自动化操作；以及(vi)处理多个板的能力。设备和方法可以与多种测定检测技术一起使用，所述测定检测技术包含但不限于测量一个或多个可检测信号的技术。一些方面适于电化学发光测量，并且特定地，适于与具有集成电极的多孔板(以及使用这些板的测定方法)一起使用的实施例，如在美国专利第7,842,246号；第7,807,448号；以及第10,281,678号中描述的实施例。
在实施例中，提供了一种用于在多孔板中进行发光测定的测定装置。例如，测定装置的实施例包含光检测子系统和板处理子系统，其中板处理子系统包含提供可以进行发光测量的无光环境的不透光外壳。不透光外壳包含壳体和放置在壳体内的可移除的抽屉。壳体还包含具有一个或多个板引入孔的壳体顶部，通过所述板引入孔，板可以被降低到抽屉内的板平移台上或从板平移台移除(手动地或机械地)。在进行发光测量之前，壳体中的滑动不透光门用于密封板引入孔，使其免受环境光的影响。壳体进一步包含耦接到安装在壳体顶部的光检测器的检测孔，以及安装在壳体顶部上位于板引入孔上方的一个或多个板堆叠器，其中所述板堆叠器被配置成接收板或将板传送到可移除抽屉内的板升降机。可移除的抽屉包含用于将抽屉中的板水平平移到设备内的区域的板平移台，在所述区域中执行具体的测定处理和/或检测步骤。可移除的抽屉还包含一个或多个具有板升降平台的板升降机，所述板升降平台可以在抽屉内上升和下降，其中板升降机定位在一个或多个板引入孔的下方。板平移台被配置成将板定位在检测孔的下方，并将板定位在板升降平台上的板升降机的上方。
测定装置还可以包含安装到壳体顶部的检测孔的光检测器(例如，通过不透光连接器或挡板)。在某些实施例中，光检测器是成像光检测器，如CCD相机，并且还可以包含透镜。光检测器可以是传统的光检测器，如光电二极管、雪崩光电二极管、光电倍增管等。合适的光探测器还包含此类光探测器的阵列。可以使用的光探测器还包含成像系统，如CCD和CMOS相机。光检测器还可以包含透镜、光导等以用于在检测器上引导、聚焦和/或成像光。在某些特定实施例中，使用成像系统对来自测定板的一个或多个孔中的结合结构域的阵列的发光进行成像，并且测定设备报告从阵列的单独元件发射的发光的发光值。光检测器用不透光密封件安装在壳体顶部。设备的另外的组件包含板接触件以用于与板进行电接触，并且向定位在光检测器下方的孔中的电极提供电能(例如，用于诱导ECL)。
在实施例中，测定装置包含用于自动鉴定样品板的特征，如标识符控制器。在一实施例中，标识符控制器是通过不透光密封件安装在壳体顶部的孔上的条形码读取器，其中所述条形码读取器被配置成读取放置在壳体内的板平移台上的板上的条形码。在一优选实施例中，当板已被降低到抽屉中时，读取板上的条形码。在替代性或另外的实施例中，板包括如EEPROM或RFID的标识符，并且壳体顶部和/或抽屉包含适于与这些标识符中的每个标识符通信的标识符控制器。在另外的实施例中，标识符控制器可以与设备分开提供。在此实施例中，存储到附接到板或与板或一组板相关的标识符的信息通过附接到其上的计算机和/或网络传输到设备，和/或通过计算机和/或网络的用户接口手动输入。在这方面，参考美国专利公开第2011/0022331号和美国专利第8,770,471号。
在一些情况下，板处理子系统进一步包含一个或多个安装在板引入孔上方的壳体顶部的板堆叠器，其中所述板堆叠器被配置成接收板或将板传送到板升降机。板处理子系统任选地包含加热和/或冷却机构(例如，电阻加热器、风扇、散热器或热电加热器/冷却器)，以将子系统的温度维持在所期望的条件下。其还可以包含湿度控制机构(例如加湿器和/或除湿器，或者干燥剂室以将子系统的湿度维持在所期望的条件下。
如本文所描述的，测定装置被配置成执行校准测定和样品测定两者。如本文所描述的，校准测定包含对具有限定量的分析物的校准样品进行的测定。如本文所描述的，对一个或多个测试样品进行样品测定，每个测试样品具有未知量的分析物。对测试样品进行样品测定产生样品测定信号值。样品测定信号值指示与之相关的分析物的未知量。
在实施例中，本文提供了一种计算机系统。计算系统可以包含一个或多个处理器(在本文也可互换地称为处理单元)、一个或多个存储装置和/或其它组件。在其它实施例中，处理器的功能可以由硬件(例如，通过使用专用集成电路(“ASIC”)、可编程门阵列(“PGA”)、现场可编程门阵列(“FPGA”)等)或硬件与软件的任何组合来执行。存储装置包含任何类型的非暂时性计算机可读存储介质(medium)(或介质(media))和/或非暂时性计算机可读存储装置。此类计算机可读存储介质或装置可以存储用于使处理器执行本文所描述的一种或多种方法的计算机可读程序指令。计算机可读存储介质或装置的实例可以包含但不限于电子存储装置、磁存储装置、光存储装置、电磁存储装置、半导体存储装置或其任何合适的组合，例如计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪存)、静态随机存取存储器(SRAM)、便携式紧凑光盘只读存储器(CD-ROM)、数字通用光盘(DVD)、记忆棒，但不限于仅这些实例。
处理器由存储在存储装置上的一个或多个计算机程序指令编程，并且可由处理器执行。例如，处理器由协议管理器、网络管理器、数据管理器、校准拟合管理器、分析管理器和用户接口管理器编程。应当理解的是，如本文所讨论的各种管理器的功能是代表性的而不是限制性的。另外地，存储装置可以充当数据存储装置以为测定系统环境提供数据存储。如本文所使用的，为了方便起见，各种“管理器”将被描述为执行操作，实际上，当管理器对处理器(以及因此计算系统)进行编程时执行操作。
协议管理器是可以在计算系统上操作的软件协议(例如，软件模块或文库)。协议管理器被配置成向一个或多个测定装置提供一个或多个控制信号。由协议管理器提供的控制信号被配置成提供操作一个或多个测定装置所必需的指令。控制信号可以指定由一个或多个测定装置执行的一个或多个测定协议。由协议管理器提供的控制信号可以用于启动和/或控制本文所描述的测定装置能够进行的任何过程。
在实施例中，协议管理器可以进一步操作以接收一个或多个测定装置操作期间收集的数据。此类数据可以包含例如校准测定数据和样品测定数据。然后，可以通过数据管理器处理或存储接收到的数据。
协议管理器被配置成操作以控制一个或多个测定装置来进行校准测定。测定装置可以由协议管理器控制，以获得对具有限定量的分析物的多个校准样品(例如，作为校准物存储在多孔板中的校准样品)的校准测定测量。多个校准样品可以包含不同量的分析物。操作协议管理器以确定对应于多个校准样品的校准测定信号值。协议管理器被配置成执行校准测定以确定一个或多个校准数据集。校准数据集包含将多个量值与对应的多个校准测定信号值相关联的信息。
协议管理器被进一步配置成操作以控制一个或多个测定装置来进行样品测定。测定装置可以由协议管理器控制，以获得对具有未知量的分析物的多个测试样品(例如，安置在多孔板中的测试样品)的样品测定测量。操作协议管理器以确定对应于多个测试样品的样品测定信号值。协议管理器被配置成执行样品测定以确定一个或多个样品测定数据集。样品测定数据集可以包含将样品测定信号值与样品鉴定数据相关联的信息。样品鉴定数据可以包含用于鉴定测试样品的任何合适的数据，如板位置。
网络管理器是可以在计算系统上操作的软件协议(例如，软件模块或文库)。网络管理器被配置成在网络、测定装置、数据存储装置和/或测定系统环境中的任何其它装置之间建立网络通信。经建立的通信路径可以利用任何适当的网络传输协议，并且提供单向或双向数据传输。网络管理器可以根据需要建立尽可能多的网络通信，以与测定系统环境的各种元件进行通信。
网络管理器有助于发送和接收样品测定数据、校准测定数据(也称为校准测定信息)、样品测定和校准测定协议、校准模型和任何其它信息和/或与测定系统环境的操作一致的信息。
数据管理器是可以在计算系统上操作的软件协议或软件模块。数据管理器被配置成存取测定数据，如测定系统环境的一个或多个测定装置的样品测定数据和校准测定数据。测定数据可以包含例如样品测定数据集和校准数据集，其可以近实时获得，可以是存档数据，和/或可以是数据提取，以及过程信息和过程参数信息和由测定装置生成或存储在测定装置上的任何其它信息或数据。数据管理器被进一步配置成存取一个或多个数据存储装置、本地测定计算机系统和/或联网计算机系统，并且存储和/或接收存储在这些中的任何或全部中的测定数据。在另外的实施例中，数据管理器被配置成存取可以存储测定数据的各种可移动物理存储介质。
数据管理器可通过用户接口管理器向用户提供数据。在实施例中，数据管理器被进一步配置成向用户提供存取工具以管理和操纵测定数据(也称为测定系统数据)。例如，数据管理器616可以被配置成生成报告、核对测定系统数据、交叉引用测定系统数据、用测定系统数据填充数据库等。在实施例中，数据管理器可以提供数据保持能力。数据管理器被进一步配置成接收和存储在测定系统环境内收集和/或使用的任何数据和所有数据。
抗体和组合物
在实施例中，本发明提供了与电化学发光(ECL)标记结合的抗体或其抗原结合片段。
一般而言，抗体(可与术语“免疫球蛋白”互换地使用)至少包括重链的可变结构域；通常，抗体包括重链和轻链的可变结构域。重链和轻链两者分为结构同源性区和功能同源性区。通常，重链(VH)或轻链(VL)的可变结构域决定抗原识别和特异性，而重链(CH1、CH2或CH3)或轻链(CL)的恒定结构域赋予生物学特性，如分泌、受体结合、补体结合等。通常，抗体链的N末端部分是可变部分，并且C末端部分是恒定区；CH3和CL结构域通常分别包括重链和轻链的C末端。
一般而言，抗体由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。公认的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，这些进而分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
一般而言，可变区允许抗体选择性地识别并特异性结合抗原上的表位。因此，抗体的VL结构域和VH结构域或这些可变结构域内的互补决定区(CDR)的子集结合以形成可变区，所述可变区形成抗原结合结构域。抗原结合结构域通常由VL和VH结构域上的三个CDR定义。典型地存在于每个抗原结合结构域中的六个“互补决定区”或“CDR”是被特异性地定位以形成抗原结合结构域的短的、不连续的氨基酸序列。由定位的CDR形成的抗原结合结构域定义了与抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。
在实施例中，本发明提供了包括对电化学发光(ECL)标记具有特异性的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括包含IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域的恒定区。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括IgG结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型抗体或其抗原结合片段。在实施例中，抗体或其抗原结合片段是IgG2a、IgG2b或IgG2c亚类抗体或其抗原结合片段。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段源自小鼠、大鼠、山羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或绵羊。在实施例中，抗体或其抗原结合片段源自小鼠。
本文描述了ECL标记。在实施例中，ECL标记包括电化学发光有机金属络合物。在实施例中，电化学发光有机金属络合物包括钌、锇、铱、铼和/或镧系金属。在实施例中，ECL标记包括钌。在实施例中，电化学发光有机金属络合物包括经取代的或未经取代的联吡啶或经取代的或未经取代的菲咯啉。在实施例中，ECL标记包括经取代的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，ECL标记包括包含至少两个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。在实施例中，经取代的联吡啶配体是式I化合物。在实施例中，ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个能够形成共价键的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个能够形成共价键的取代基的联吡啶。在实施例中，第三配体包括具有至少一个包括缀合接头的取代基的联吡啶。本文进一步描述了缀合接头。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与式II、式IV或式VI化合物特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，抗体或抗原结合片段包括与以下特异性结合的抗原结合结构域：
在实施例中，本发明提供了包括对ECL标记和缀合接头具有特异性的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。本文描述了缀合接头。在实施例中，缀合接头包括酰胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亚胺、三唑、二氢哒嗪、肽、寡核苷酸、亲水聚合物或其组合。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和酰胺特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和硫酯特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和硫醚特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和二硫化物特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和亚胺特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和三唑特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，信号扩增试剂与ECL标记和二氢哒嗪特异性结合。
在实施例中，缀合接头包括间隔子(例如，如本文所描述的肽、寡核苷酸或亲水聚合物)，并且抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和缀合接头的肽、寡核苷酸或亲水聚合物的至少一部分特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和缀合接头的肽的至少一部分特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和缀合接头的寡核苷酸的至少一部分特异性结合的抗原结合结构域。在实施例中，抗体或其抗原结合片段包括与ECL标记和缀合接头的亲水聚合物的至少一部分特异性结合的抗原结合结构域。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段进一步包括核酸探针。本文描述了核酸探针。在实施例中，核酸探针能够与模板寡核苷酸结合。在实施例中，如本文所描述的，核酸探针是用于延伸反应的引物，所述延伸反应例如，聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、自我维持合成反应(3SR)和/或等温扩增(例如，解旋酶依赖性扩增或滚环扩增)。
在实施例中，本发明提供了一种组合物，其包括：(a)本文所提供的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括核酸探针；以及(b)模板寡核苷酸，所述模板寡核苷酸能够与所述核酸探针结合。本文进一步描述了模板寡核苷酸。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段进一步包括结合部分。本文描述了结合部分。在实施例中，结合部分能够与本文所描述的可检测部分结合。在实施例中，结合部分包括寡核苷酸。在实施例中，结合部分包括生物素。在实施例中，结合部分包括亲和素或链霉亲和素。在实施例中，结合部分包括可检测部分的多个结合位点。
在实施例中，本发明提供了一种组合物，其包括：(a)本文所提供的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括结合部分；以及(b)可检测部分，所述可检测部分包括(i)所述结合部分的结合配偶体，以及(ii)一个或多个可检测标记。本文描述了可检测部分。在实施例中，可检测部分包括可检测标记。在实施例中，可检测部分包括可检测标记中的多于一个的可检测标记。在实施例中，标记探针包括可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个可检测标记。在实施例中，抗体或其抗原结合片段的结合部分与可检测部分结合。在结合部分包括寡核苷酸的实施例中，可检测部分包括互补寡核苷酸。在结合部分包括生物素的实施例中，可检测部分包括亲和素或链霉亲和素。在结合部分包括亲和素或链霉亲和素的实施例中，可检测部分包括生物素。在实施例中，可检测部分包括结合部分的多个结合位点。
本文描述了可检测标记。在实施例中，可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来检测。在实施例中，可检测标记包括如本文所描述的ECL标记。
在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个与可检测部分共价连接的取代基的联吡啶。在实施例中，ECL标记包括包含三个配体的有机金属络合物，其中配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个与可检测部分共价连接的取代基的联吡啶。
在实施例中，可检测标记包括式II化合物。在实施例中，可检测标记包括式III化合物。在实施例中，可检测标记包括式IV化合物。在实施例中，可检测标记包括式V化合物。在实施例中，可检测标记包括式VI化合物。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段进一步包括酶。本文进一步描述了酶。在实施例中，酶是HRP、AP或β-半乳糖苷酶。
在实施例中，本发明提供了一种组合物，其包括：本文所提供的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括酶。在实施例中，组合物进一步包括酶的底物。在实施例中，酶是HRP，并且底物是TMB、ABTS或OPD。在实施例中，酶是AP，并且底物是PNPP。在实施例中，酶是β-半乳糖苷酶，并且底物是ONPG。本文进一步描述了如HRP、AP和β-半乳糖苷酶的酶和其底物，包含TMB、ABTS、OPD、PNPP和ONPG。
试剂盒
在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其用于检测所关注的分析物，所述试剂盒包括在一个或多个小瓶、容器或隔室中的以下各项：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合；(b)检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合，其中所述检测试剂包括第一可检测标记；以及(c)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，试剂盒进一步包括表面。在实施例中，检测试剂是第一检测试剂，并且试剂盒进一步包括与分析物特异性结合的第二检测试剂，其中第二检测试剂包括第一可检测标记。
在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其用于检测所关注的分析物，所述试剂盒包括在一个或多个小瓶、容器或隔室中的以下各项：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合；(b)检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合，其中所述检测试剂包括第一核酸探针；(c)第一标记探针，所述第一标记探针包括第一可检测标记；以及(d)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，试剂盒进一步包括表面。
在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其用于检测所关注的分析物，所述试剂盒包括在一个或多个小瓶、容器或隔室中的以下各项：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合；(b)检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合，其中所述检测试剂包括所述ECL标记；以及(c)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述ECL标记特异性结合。在实施例中，试剂盒进一步包括表面。在实施例中，检测试剂是第一检测试剂，并且试剂盒进一步包括与分析物特异性结合的第二检测试剂，其中第二检测试剂包括ECL标记。
在实施例中，本发明提供了一种试剂盒，其用于检测所关注的分析物，所述试剂盒包括在一个或多个小瓶、容器或隔室中的以下各项：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合；(b)检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合，其中所述检测试剂包括第一核酸探针；(c)第一标记探针，所述第一标记探针包括第一ECL标记；以及(d)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一ECL标记特异性结合。在实施例中，试剂盒进一步包括表面。
在实施例中，如本文所描述的，本发明提供了一种试剂盒，其包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括对ECL标记具有特异性的抗原结合结构域，并且包括结合部分。在实施例中，如本文所描述的，本发明提供了一种试剂盒，其包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括对ECL标记具有特异性的抗原结合结构域，并且包括酶。在实施例中，试剂盒进一步包括捕获试剂和检测试剂中的一种或两种，其中检测试剂包括ECL标记。在实施例中，试剂盒进一步包括捕获试剂、第一检测试剂和第二检测试剂中的一者或多者，其中第一检测试剂和第二检测试剂各自包括ECL标记。在实施例中，试剂盒进一步包括表面。
在实施例中，如本文所描述的，本发明提供了一种试剂盒，其包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括对ECL标记具有特异性的抗原结合结构域，并且包括核酸探针。在实施例中，试剂盒进一步包括锚定试剂、模板寡核苷酸、标记探针、聚合酶、连接酶、缓冲液、阻断剂、共反应物、稀释剂、稳定剂、校准剂、测定消耗品或其组合。在实施例中，试剂盒进一步包括捕获试剂和检测试剂中的一种或两种，其中检测试剂包括ECL标记。在实施例中，试剂盒进一步包括捕获试剂、第一检测试剂和第二检测试剂中的一者或多者，其中第一检测试剂和第二检测试剂各自包括ECL标记。在实施例中，试剂盒进一步包括表面。
本文描述了捕获试剂、检测试剂，例如第一检测试剂和第二检测试剂、第一可检测标记和信号扩增试剂。在实施例中，捕获试剂、检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂以及信号扩增试剂各自包括抗体或其抗原结合片段、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。在实施例中，捕获试剂、检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂以及信号扩增试剂各自包括抗体或其抗原结合片段。在实施例中，信号扩增试剂是IgG抗体。
在实施例中，第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记。在实施例中，信号扩增试剂是包括对ECL标记具有特异性的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。本文描述了ECL标记。
在实施例中，ECL标记是式II化合物。在实施例中，ECL标记是式III化合物。在实施例中，ECL标记是式IV化合物。在实施例中，ECL标记是式V化合物。在实施例中，ECL标记是式VI化合物。
在实施例中，信号扩增试剂包括结合部分。在实施例中，试剂盒进一步包括用于将结合部分与信号扩增试剂缀合的试剂。本文描述了结合部分。在实施例中，结合部分包括寡核苷酸。在实施例中，结合部分包括生物素。在实施例中，结合部分包括亲和素或链霉亲和素。在实施例中，试剂盒进一步包括可检测部分，所述可检测的部分包括：(i)结合部分的结合配偶体以及(ii)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记。本文描述了可检测部分。在实施例中，结合部分包括寡核苷酸，并且可检测部分包括互补寡核苷酸。在实施例中，结合部分包括生物素，并且可检测部分包括亲和素或链霉亲和素。在结合部分包括亲和素或链霉亲和素的实施例中，可检测部分包括生物素。
在实施例中，可检测部分包括第二可检测标记。本文进一步描述了第二可检测标记。在实施例中，可检测部分包括第二可检测标记中的多于一个的第二可检测标记。在实施例中，可检测部分包括第二可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第二可检测标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。
在实施例中，信号扩增试剂包括酶。在实施例中，试剂盒进一步包括酶的底物。本文进一步描述了酶和其底物。在实施例中，酶是HRP，并且底物是TMB、ABTS或OPD。在实施例中，酶是AP，并且底物是PNPP。在实施例中，酶是β-半乳糖苷酶，并且底物是ONPG。在实施例中，底物是如本文所描述的生色底物、荧光底物或化学发光底物。
在实施例中，信号扩增试剂包括第二可检测标记。本文进一步描述了第二可检测标记。在实施例中，信号扩增试剂包括第二可检测标记中的多于一个的第二可检测标记。在实施例中，信号扩增试剂包括第二可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第二可检测标记。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。在实施例中，第二可检测标记是如本文所描述的ECL标记。
在实施例中，检测试剂包括第一可检测标记，并且信号扩增试剂包括核酸探针。在实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂各自包括第一可检测标记，并且信号扩增试剂包括核酸探针。在实施例中，试剂盒进一步包括用于将核酸探针与信号扩增试剂缀合的试剂。本文描述了核酸探针。在实施例中，核酸探针是用于延伸反应的引物，所述延伸反应例如，聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、自我维持合成反应(3SR)和/或等温扩增(例如，解旋酶依赖性扩增或滚环扩增)，以形成如本文所描述的经延伸的序列。在实施例中，试剂盒进一步包括模板寡核苷酸，例如用于进行延伸反应。在实施例中，试剂盒进一步包括锚定试剂，例如，用于与延伸反应产生的经延伸的序列结合。本文进一步描述了模板寡核苷酸和锚定试剂。在实施例中，锚定试剂包括单链寡核苷酸。在实施例中，锚定试剂包括双链寡核苷酸。在实施例中，试剂盒进一步包括标记探针，所述标记探针包括第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记，其中标记探针和经延伸的序列包括互补寡核苷酸。在实施例中，标记探针包括第二可检测标记中的多于一个的第二可检测标记。在实施例中，标记探针包括第二可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第二可检测标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。
在实施例中，检测试剂包括第一核酸探针，并且信号扩增试剂包括第二核酸探针。在实施例中，试剂盒进一步包括用于将第一核酸探针与检测试剂缀合的试剂。在实施例中，试剂盒进一步包括用于将第二核酸探针与信号扩增试剂缀合的试剂。本文描述了第一核酸探针和第二核酸探针。在实施例中，试剂盒进一步包括一种或多种模板寡核苷酸，例如用于延伸第一核酸探针和第二核酸探针。在实施例中，如本文所描述的，试剂盒进一步包括分别结合第一经延伸的序列和第二经延伸的序列的第一锚定试剂和第二锚定试剂。在实施例中，试剂盒进一步包括第一标记探针，所述第一标记探针包括第一可检测标记中的一个或多个第一可检测标记，其中第一标记探针和第一经延伸的序列包括互补寡核苷酸。在实施例中，第一标记探针包括第一可检测标记信号中的多于一个的第一可检测标记。在实施例中，第一标记探针包括第一可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第一可检测标记。在实施例中，试剂盒进一步包括第二标记探针，所述第二标记探针包括第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记，其中第二标记探针和第二经延伸的序列包括互补寡核苷酸。在实施例中，第二标记探针包括第二可检测标记中的多于一个的第二可检测标记。在实施例中，第二标记探针包括第二可检测标记中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个第二可检测标记。本文描述了第一标记探针和第二标记探针。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第二可检测标记是ECL标记。在实施例中，如本文所描述的，第一可检测标记可检测地不同于第二可检测标记。
在实施例中，检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂是冻干的。在实施例中，检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂以溶液形式提供。在实施例中，信号扩增试剂是冻干的。在实施例中，信号扩增试剂以溶液形式提供。在实施例中，将捕获试剂固定在试剂盒中提供的表面上。在实施例中，捕获试剂是冻干的或者以溶液形式提供，并且试剂盒进一步包括用于将捕获试剂固定到表面的试剂。在包括锚定试剂(例如，如本文所描述的，用于与经延伸的序列结合的锚定、用于与第一经延伸的序列结合的第一锚定试剂和/或用于与第二经延伸的序列结合的第二锚定试剂)的实施例中，将锚定试剂固定在试剂盒中提供的表面上。在实施例中，锚定试剂是冻干的或者以溶液形式提供，并且试剂盒进一步包括用于将锚定试剂固定到表面的试剂。在实施例中，将捕获试剂固定在表面上锚定试剂的约1nm至约500nm、约5nm至约250nm、约10nm至约200nm或约15nm至约150nm内。在实施例中，将捕获试剂固定在距表面上的锚定试剂小于1μm的位置。在实施例中，将捕获试剂固定在距表面上的锚定试剂小于500nm的位置。在实施例中，将捕获试剂固定在距表面上的锚定试剂小于200nm的位置。本文描述了用于例如通过靶向剂/靶向剂补体、连接剂/补充连接剂和桥连剂将捕获试剂和/或锚定试剂固定到表面的试剂和方法。
在实施例中，本文所提供的试剂盒进一步包括表面。在实施例中，表面是板。在实施例中，表面是多孔板。在实施例中，表面是颗粒。在实施例中，试剂盒包括颗粒阵列。在实施例中，表面是盒。在实施例中，表面包括电极。在实施例中，电极是碳墨电极。
在实施例中，试剂盒的捕获试剂、检测试剂和/或信号扩增试剂和其它组分单独提供。在实施例中，试剂盒的组分根据其最佳运输或储存温度单独提供。
在实施例中，试剂盒进一步包括校准试剂。在实施例中，校准试剂包括已知量的分析物。在实施例中，试剂盒包括包含一系列浓度的分析物的多种校准试剂。在实施例中，多种校准试剂包括接近所述方法的定量上限和下限的分析物的浓度。在实施例中，多种校准试剂跨越所述方法的整个动态范围。在实施例中，校准试剂是阳性对照试剂。在实施例中，校准试剂是阴性对照试剂。在实施例中，阳性对照试剂或阴性对照试剂用于提供待测样品与本发明的方法的比较基础。在实施例中，校准试剂是冻干的。在实施例中，校准试剂以溶液形式提供。
在实施例中，试剂盒进一步包括聚合酶、连接酶、缓冲液、阻断剂、共反应物、稀释剂、稳定剂、校准剂、测定消耗品、电极或其组合。
在实施例中，试剂盒进一步包括聚合酶，例如用于进行聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、自我维持合成反应(3SR)和/或等温扩增(例如，解旋酶依赖性扩增或滚环扩增)。在实施例中，试剂盒进一步包括连接酶，例如用于连接模板寡核苷酸。
在实施例中，试剂盒进一步包括缓冲液，例如，测定缓冲液、重构缓冲液、储存缓冲液、读取缓冲液或其组合。在实施例中，试剂盒进一步包括共反应物，例如用于进行电化学发光测量。示例性共反应物例如在WO 2020/142313中描述。
在实施例中，试剂盒进一步包括阻断剂，例如以减少除所关注的分析物之外的组分与本文所描述的捕获试剂和检测试剂或捕获试剂和第一检测试剂和第二检测试剂的非特异性结合。示例性阻断剂包含但不限于mBSA、剪切的poly(A)、polyBSA-I、mIgG、吐温、polyBSA-II、酵母RNA、mBSA+poly(a)和/或polyBSA+poly(A)。在实施例中，试剂盒进一步包括用于试剂盒的一种或多种组分的稀释剂。在实施例中，包括上述组分的试剂盒包含的组分的储备浓度是用于本文所提供的方法的工作浓度的浓度的5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、125倍、150倍或更多倍。在实施例中，试剂盒进一步包括稳定剂，例如用于储存试剂盒的一种或多种组分。
在实施例中，试剂盒进一步包括测定消耗品，例如测定模块、小瓶、管、液体处理和转移装置，如移液管吸头、盖子以及密封件、支架、标记等。在实施例中，试剂盒进一步包括电极，例如用于进行电化学发光测量。在实施例中，电极被施加到本文所提供的表面。在实施例中，试剂盒进一步包括用于实施本文所描述的方法的测定仪器和/或说明书。
本领域普通技术人员应当理解，本文所描述的试剂盒的组分(其可以在一个或多个小瓶、容器或隔室中提供)不一定包含在同一容器中，例如同一盒子和/或在同一时间。在实施例中，本文所描述的试剂盒的组分同时或依次在一个或多个单独的容器或隔室中提供。本领域普通技术人员将进一步理解，用户可以例如，在一个或多个单独的容器或隔室中单独获得(例如，购买或拥有)试剂盒的组分(例如，本文所描述的信号扩增试剂)，但是当组合使用时，例如，如在本文的实施例中所描述的，所述组分被认为是“试剂盒”的一部分。在一些实施例中，试剂盒包括在单个包装或容器中一起供应的多个容器、小瓶或隔室。
在实施例中，本发明提供了一套试剂盒，其包括多个第一试剂盒和第二试剂盒，其中每个第一试剂盒用于检测独特的所关注的分析物，并且其中每个第一试剂盒包括：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与独特的分析物特异性结合；以及(b)检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂，其各自(i)与独特的分析物特异性结合以及(ii)包括第一可检测标记；并且其中第二试剂盒包括与第一可检测标记特异性结合的信号扩增试剂。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第一试剂盒和/或第二试剂盒进一步包括表面。在实施例中，该套试剂盒进一步包括包含表面的第三试剂盒。本文进一步描述了试剂盒的组分。
在实施例中，本发明提供了一套试剂盒，其包括多个第一试剂盒和第二试剂盒，其中每个第一试剂盒用于检测独特的所关注的分析物，并且其中每个第一试剂盒包括：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与独特的分析物特异性结合；(b)检测试剂，所述检测试剂(i)与独特的分析物特异性结合以及(ii)包括第一核酸探针；以及(c)第一标记探针，所述第一标记探针包括第一可检测标记；并且其中第二试剂盒包括与第一可检测标记特异性结合的信号扩增试剂。在实施例中，第一可检测标记是ECL标记。在实施例中，第一试剂盒和/或第二试剂盒进一步包括表面。在实施例中，该套试剂盒进一步包括包含表面的第三试剂盒。本文进一步描述了试剂盒的组分。
在实施例中，该套试剂盒能够检测样品中的多种所关注的分析物，其中分析物以约0.0001pg/mL至约100000pg/mL范围内的浓度存在。在实施例中，样品包括一种或多种分析物，所述一种或多种分析物的浓度是最低丰度分析物的浓度的10、100、1000、10000、100000、106、107、108、109或1010倍。在实施例中，每个第一试剂盒能够检测样品中的较高丰度分析物。在实施例中，每个第一试剂盒能够检测样品中的较低丰度分析物。在实施例中，第一试剂盒和第二试剂盒的组分的组合能够检测样品中的较低丰度分析物。在实施例中，存在于样品中的较高丰度分析物的量是较低丰度分析物的量的约1.5倍、约2倍、约5倍、约10倍、约25倍、约50倍、约75倍、约100倍、约500倍、约1000倍、约10000倍、约100000倍、约106倍、约107倍、约108倍、约109倍、约1010或大于1010倍。在实施例中，较高丰度分析物的量以约1pg/mL至约100000pg/mL的浓度存在于样品中，并且较低丰度分析物以约0.0001pg/mL至约1pg/mL的浓度存在于样品中。
在实施例中，用户执行如本文所描述的方法，所述方法包括使用一个或多个第一试剂盒的组分检测一种或多种所关注的分析物；并且如果一种或多种分析物中的任何分析物基本上未被检测到，则添加第二试剂盒的信号扩增试剂以提供一种或多种基本上未被检测到的分析物的经扩增的测定信号。
在实施例中，本发明提供了一种方法，所述方法包括：向用户提供用于检测第一样品中的所关注的分析物的第一试剂盒，其中所述第一试剂盒包括在一个或多个小瓶、容器或隔室中的以下各项：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与分析物特异性结合；以及(b)检测试剂或第一检测试剂和第二检测试剂，其各自与分析物特异性结合；从而向用户提供用于检测第二样品中的分析物的第二试剂盒，其中第二试剂盒包括信号扩增试剂；其中与第二样品相比，第一样品包含更高量的分析物。在实施例中，第一试剂盒和/或第二试剂盒进一步包括表面。在实施例中，该套试剂盒进一步包括包含表面的第三试剂盒。本文进一步描述了试剂盒的组分。在实施例中，本发明提供了一种方法，所述方法包括向用户提供用于检测样品中的所关注的分析物的第二试剂盒，其中第二试剂盒包括与经标记的检测试剂或经标记的第一检测试剂和第二检测试剂上的标记特异性结合的信号扩增试剂，并且其中第二试剂盒被设计成用于与第一试剂盒结合使用，第一试剂盒包括(a)捕获试剂，所述捕获试剂与分析物特异性结合；以及(b)经标记的检测试剂或经标记的第一检测试剂和第二检测试剂，其各自与分析物特异性结合。
本文所引用的所有参考文献，包含专利、专利申请、论文、教科书等，以及本文所引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，在此通过引用整体并入。
实例
实例1.针对ECL标记的单克隆抗体开发
进行实验以开发和筛选针对MSD SULFO-TAGTMECL标记的抗体(马里兰州罗克维尔市(Rockville,MD)的MESO SCALE)。
a)试剂制备
使用IMJECTTMEDC mcKLH旋转试剂盒(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA))，将未经缀合的MSD GOLD SULFO-TAGTMNHS-酯(以下称为“SULFO-TAG”)单独与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)缀合。使用典型的蛋白质缀合方案将SULFO-TAG分别与单体牛血清白蛋白(BSA)缀合。KLH缀合的SULFO-TAG用作免疫原，并且BSA缀合的SULFO-TAG用作筛选试剂。将在每个孔中含有七个不同结合结构域(“点”)的96孔测定板用山羊抗小鼠(“GAM”)抗体固定在点中的一个点中，而其余的点用BSA包被。将板用于抗血清或杂交瘤筛选。
b)免疫接种
将一组六只6至8周龄的雌性小鼠(两只Balb/C小鼠、两只CFW小鼠和两只CD-1小鼠)用于免疫接种。将所有小鼠在第0天皮下(SC)和腹膜内(IP)注射与完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant)混合的40μg的KLH-SULFO-TAG，并在第14天、第28天、第42天和第56天注射与不完全弗氏佐剂混合的20μg的KLH-SULFO-TAG。将在第36天和第64天收集的血清样品通过两种不同的测定法以不同的稀释度测试免疫应答。如上文所描述的，将GAM固定在96孔测定板的七个点中的一个点中，并将其余的点用BSA包被。在用1x TBS-T/3％ BSA阻断板30分钟后，将来自小鼠的抗血清的各种稀释液添加到板中并温育1小时。在将板用TBS-T洗涤后，将BSA缀合的SULFO-TAG(测定形式1)或未经缀合的SULFO-TAG(测定形式2)以0.75μg/ml的浓度添加到板中，并且然后温育1小时。然后使用读取缓冲液对板进行洗涤和显影。所有温育均在室温下进行。用于筛选的测定形式如在图5中所描绘的。
通过在不存在佐剂的情况下注射15μg的免疫原，在第77天对具有最佳免疫滴度的小鼠进行预融合(最终)加强。将所有剩余小鼠在第70天和第84天用20μg的与SIGMAADJUVANT(密苏里州圣路易斯的密理博西格玛公司(MilliporeSigma,St.Louis,MO))和MAGICTM小鼠佐剂(纽约希尔兰的创新诊断公司(Creative Diagnostics,Shirley,NY))混合的免疫原进一步加强。如上文所描述的，再次测试在第92天从这些小鼠收集的血清样品的免疫应答。在第98天对具有最佳抗体滴度的小鼠进行预融合加强。在美国马里兰州的临床前感染实验室(preclinical contract laboratory in Maryland,US)进行免疫接种、血清收集、脾脏采集和动物维护。
在第64天(对于262号小鼠和265号小鼠)和第92天(对于261号小鼠、263号小鼠、264号小鼠和266号小鼠)收集的抗血清的筛选数据在表1中示出。基于1:37,500稀释度下的相对ECL信号强度选择小鼠进行融合。在经免疫的6只小鼠中，两只Balb/C小鼠和两只CFW小鼠表现出相对较好的免疫应答，并且因此被选择用于融合。免疫应答相对较差的两只CD-1小鼠被排除在研究之外。
表1.用于评估免疫应答的血清筛选
c)杂交瘤发展
在最终加强后三天，从选择用于融合的小鼠中收集脾脏。将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653以2:1的比率混合，并进行PEG辅助的细胞融合。融合后，将细胞以20×106个细胞/板的最小细胞密度接种在AH选择培养基中的平底96孔板中。在融合后第12天收集来自所有融合板的杂交瘤培养物上清液，并且通过如上文所描述的测定形式1测试抗原特异性。将所有抗原阳性杂交瘤延伸至48孔板，并且重新测试抗原特异性，以通过上文所描述的两种测定形式进一步证实。这些杂交瘤随后通过有限稀释进行亚克隆。
从总共四次融合中筛选出39个板，从所述板鉴定出对SULFO-TAG具有特异性的23个亲本杂交瘤克隆(表2)。来自融合体F144和F145的所有抗原特异性克隆被直接亚克隆，而没有在48孔阶段进行另外的测试。因此，在测定格式2中不存在这些克隆的可用数据。
如再表2中所示出的，尽管ECL信号强度在两种测定形式之间有所不同，但未观察到显著的差异。
表2.融合阶段的杂交瘤筛选和克隆选择
d)杂交瘤亚克隆和抗体纯化
通过在96孔板中进行有限稀释，对抗原特异性亲本杂交瘤进行亚克隆，并且通过在显微镜下目视检查标志具有一个、两个(在克隆ID中用“t”指示)或多个菌落(用“m”指示)的孔。在接种后12天收集来自这些孔的上清液，并且如上文所描述的测试抗原特异性。在补充有超低IgG FBS的DMEM培养基中，将来自每个亲本系的至少一个具有最佳抗原特异性的亚克隆扩增至50mL。根据制造商的说明，使用来自GenScript的AMMAGTM蛋白A磁珠进行抗体纯化。
在23个亲本杂交瘤中，11个克隆在亚克隆中存活。这些克隆的筛选数据在表3中示出。与融合筛选结果一致，在两种测定形式之间未观察到显著差异。总共产生了11种经纯化的单克隆抗体。经纯化的抗SULFO-TAG抗体在表4中列出。
表3.亚克隆阶段的杂交瘤筛选和克隆选择
表4.十一种抗SULFO TAG抗体
鉴定了产生抗体的特定种系基因。轻链由IGLV1*01 F基因产生，并且重链由IGHV2-9*02 F基因产生。
实例2.抗体与核酸探针的缀合
如本文实施例中所描述的，实例1中产生的每种抗SULFO-TAG抗体与核酸探针缀合。对于核酸探针缀合，将浓度高于1mg/mL的抗体在PBS中稀释至1mg/mL，并且浓度低于1mg/mL的抗体不进行浓度调节。使用0.5M EDTA储备溶液使所有抗体的缓冲液达到1mMEDTA。接下来，将每种抗体与5摩尔过量的PEG化SMCC交联剂、SM(PEG)4在室温下温育1小时。然后，添加8倍摩尔过量的核酸探针，并在室温下温育1小时。用最终浓度为1mM的碘乙酰胺淬灭所有缀合反应，并在室温下温育30分钟。
实例3.抗体筛选
实验1
筛选如实例2中所描述的与核酸探针缀合的抗SULFO-TAG抗体作为如本文实施例中所描述的信号扩增试剂的性能。可行性测试在96孔链霉亲和素包被的测定板中进行，所述测定板具有针对人ZnT8、人IA-2、人TGM-2和小鼠IL-1b的捕获抗体和检测抗体。检测单一分析物的浓度的测定如下进行：
1)在包被溶液/稀释剂混合物中，用50μL的0.25μg/mL生物素化捕获抗体和0.2ng/mL生物素化锚定试剂包被96孔链霉亲和素包被的测定板。在室温下以705rpm摇动1小时。
2)将板洗涤三次，每次用300μL的洗涤缓冲液洗涤。
3)在稀释剂中添加25μL的阻断溶液和25μL的校准物或样品。在室温下以705rpm摇动1.5小时。
4)将板洗涤三次，每次用300μL的洗涤缓冲液洗涤。
5)在稀释剂中添加50μL的含有1μg/mL SULFO-TAG的检测抗体(“SULFO-TAG检测抗体”)。在室温下以705rpm摇动1小时。
6)将板洗涤三次，每次用300μL的洗涤缓冲液洗涤。
7)在稀释剂中添加50μL的0.125μg/mL抗SULFO-TAG抗体。在室温下以705rpm摇动1小时。
8)将板洗涤三次，每次用300μL的洗涤缓冲液洗涤。
9)添加50μL的含有用于延伸抗SULFO-TAG抗体的核酸探针以形成经延伸的序列的组分的增强溶液。
10)将板洗涤三次，每次用300μL的洗涤缓冲液洗涤。
11)添加50μL的含有用于检测经延伸的序列的组分的检测溶液。
12)将板洗涤三次，每次用300μL的洗涤缓冲液洗涤。
13)添加150μL的读取缓冲液。
14)在读板器上读取板。
ECL测定信号的结果在图6中示出。基于经测量的ECL测定信号，选择抗SULFO-TAG抗体克隆F136-1B4-8、F136-3F10-6、F136-6F9-3、F136-7D11-4m、F136-8E1-1和F137-6B9-1用于随后实验中的校准物滴定。
实验2
在免疫测定中，用针对人ZnT8和TGM-2的生物素化捕获抗体和抗SULFO-TAG检测抗体对抗SULFO-TAG抗体克隆F136-1B4-8、F136-3F10-6、F136-6F9-3、F136-7D11-4m、F136-8E1-1和F137-6B9-1在校准物滴定免疫测定中作为信号扩增试剂的性能进行了测试。实验方案如在实验1中进行概述。用于人ZnT8测定的抗体是生物素化抗人ZnT8捕获抗体克隆编号F67-7C2-8和抗人ZnT8 SULFO-TAG检测抗体克隆编号F67-1A7-6。用于人TGM-2测定的抗体是生物素化抗人TGM-2捕获抗体克隆编号F74-6A5-6和抗人TGM-2SULFO-TAG检测抗体克隆编号F69-5E8-3t。
ECL测定信号、变异系数(CV)、希尔斜率、R平方值、最低检测极限(LLOD)、标准品4(STD 04)的信号背景比(S/B)和STD 04的信噪比(S/N)的结果在图7和8中示出。S/B和S/N由STD 04/STD 08(空白)的值确定。图9示出了使用针对ZnT8和TGM-2的相同的捕获抗体和检测抗体但没有抗SULFO-TAG抗体进行的免疫测定的比较结果。
如通过数据所证明的，与不使用抗SULFO-TAG抗体进行的测定相比，使用抗SULFO-TAG抗体为两种测定提供了测定信号的强增强和>10倍的LLOD减少。
实验3
在免疫测定中，用针对小鼠IL-23和小鼠IL-17C的生物素化捕获抗体和抗SULFO-TAG检测抗体对抗SULFO-TAG抗体克隆F136-1B4-8、F136-3F10-6、F136-6F9-3、F136-7D11-4m、F136-8E1-1和F137-6B9-1在校准物滴定中作为信号扩增试剂的性能进行了测试。实验方案如在实验1中进行概述。用于小鼠IL-23测定的抗体是来自商业来源的生物素化的抗小鼠IL-23捕获抗体和SULFO-TAG抗小鼠IL-23检测抗体。用于小鼠IL-17C测定的抗体是来自商业来源的生物素化的抗小鼠IL-17C捕获抗体和SULFO-TAG抗小鼠IL-17C检测抗体。
ECL测定信号、变异系数(CV)、希尔斜率、R平方值、最低检测极限(LLOD)、标准品2(STD 02)的信号背景比(S/B)和STD 02的信噪比(S/N)的结果在图10和11中示出。S/B和S/N由STD 02/STD 04(空白)的值确定。图12示出了使用针对小鼠IL-23和小鼠IL-17C的相同的捕获抗体和检测抗体但没有抗SULFO-TAG抗体进行的免疫测定的比较结果。
如通过数据所证明的，与不使用抗SULFO-TAG抗体进行的测定相比，使用抗SULFO-TAG抗体提供了测定信号的强增强，并且小鼠IL-23测定的LLOD减少了40倍至230倍，以及小鼠IL-17C测定的LLOD减少了4倍至120倍。
实验4
在免疫测定中，用针对人IL-10的生物素化捕获抗体和抗SULFO-TAG检测抗体对抗SULFO-TAG抗体克隆F136-1B4-8、F136-3F10-6、F136-6F9-3、F136-7D11-4m、F136-8E1-1和F137-6B9-1在校准物滴定中的性能进行了测试。实验方案如在实验1中所概述的，除了在步骤5)中，添加0.5μg/mL的SULFO-TAG检测抗体。用于人IL-10测定的抗体是生物素化抗人IL-10捕获抗体克隆编号2108-A82-8和SULFO-TAG抗人IL-10检测抗体克隆编号1299-A06-5。
ECL测定信号、变异系数(CV)、希尔斜率、R平方值、最低检测极限(LLOD)、标准品2(STD 02)的信号背景比(S/B)和STD 02的信噪比(S/N)的结果在图13中示出。S/B和S/N由STD 02/STD 04(空白)的值确定。图14示出了使用针对人IL-10的相同的捕获抗体和检测抗体但没有抗SULFO-TAG抗体进行的免疫测定的比较结果。
如通过数据所证明的，与不使用抗SULFO-TAG抗体进行的测定相比，使用抗SULFO-TAG抗体为人IL-10测定提供了测定信号的强增强和50倍至140倍的LLOD减少。
实例4.抗SULFO-TAG抗体的信号抑制和增强
使用多重夹心测定面板来评估图6中示出的十一个抗SULFO-TAG抗体(本文也称为“a-STAG Ab”)克隆的信号抑制和信号增强，其从实例3的筛选中鉴定。使用所提供的用于测定的校准物共混物来执行测定面板，所述测定面板利用含有针对面板中的每种分析物的经SULFO-TAG标记的检测抗体的检测抗体混合物。通过将重构的冻干校准物稀释大约2.43倍来制备校准物共混物，以提供大约100pg/mL的为面板中的分析物中的一种分析物的IL-4。进行了标准的夹心测定方案，简要总结如下：
1)用洗涤缓冲液洗涤测定面板板；
2)向板的每个孔中添加校准物；
3)用洗涤缓冲液洗涤测定面板板；
4)添加检测抗体混合物，以在每个孔中形成具有捕获抗体、分析物和经SULFO-TAG标记的检测抗体(“cAb-分析物-dAb”)的夹心复合物；
5)用洗涤缓冲液洗涤测定面板板。
在夹层复合物形成之后，将板分成三个区段：标准信号；信号抑制；以及信号增强。添加到每个区段的孔中的后续组分总结如下：
因此，标准信号区段不具有任何添加到夹心复合物中的抗SULFO-TAG抗体。信号抑制区段具有与抗SULFO-TAG抗体结合的cAb-分析物-dAb复合物。信号增强区段具有与抗SULFO-TAG抗体结合的cAb-分析物-dAb复合物，以及与抗SULFO-TAG抗体的核酸探针结合的经SULFO-TAG标记的寡核苷酸。对于信号抑制和信号增强区段，测试了十一个抗SULFO-TAG抗体克隆中的每一个。用九个复制进行测定。
对于步骤6和7中的每个步骤，在室温下在705rpm的摇动下将测定面板板温育1小时，并在温育后用洗涤缓冲液洗涤。对于步骤6和7中的一个步骤或两个步骤，标准信号和信号抑制条件与稀释剂的温育确保了在所有三个区段中测量的信号在所有温育步骤中相对于稀释剂中的抗体解离速率是相等的。将ECL读取缓冲液添加到板中，并在成像仪上读取板。
结果在图16A-16C中示出。图16A示出了每个抗SULFO-TAG抗体克隆的信号抑制百分比(％)和信号增加％。图16B和16C分别示出了信号抑制％和信号增加％的条形图。信号抑制的百分比(％)计算为1─(信号抑制/标准信号)。信号增加的线性百分比(％)计算为(信号增强─信号抑制)/[跨所有十一种抗SULFO-TAG抗体的(信号增强─信号抑制)的最大值]。信号增加的比率％可以计算为(信号增强/标准信号)─1。有或没有经SULFO-TAG标记的寡聚物的信号比率可以计算为(信号增强/信号抑制)。
如在图16A-16C中所示出的，抗SULFO-TAG抗体克隆F136-1B4-8、F136-3F10-6和F136-6F9-3具有最高信号抑制％和最高信号增加％，从而证明了对SULFO-TAG标记的特异性。计算每个抗SULFO-TAG抗体克隆的亲和力，如在表5中所示出的。
表5.抗SULFO-TAG抗体克隆的信号增加％
实例5.抗SULFO-TAG抗体表位识别研究
对实例4中所描述的十一个抗SULFO-TAG抗体克隆进行了表位识别研究。为了研究这些抗体克隆的表位识别，制备了四种具有不同数量的磺甲基-联吡啶(“SM”)或联吡啶(“Bpy”)配体的有机金属Ru2+化合物(“TAG化合物”)，如在图18A中所示出的。SULFO-TAG表示为Ru+2(SM)2A1，其在Bpy基团中的一个Bpy基团中包含酸配体(“A”)，并且在结构上与Bpy比SM更相似。通过将TAG化合物掺入到ECL读取缓冲液中来验证每种TAG化合物的ECL产生，并且在96孔裸碳板上测量每种游离TAG化合物的ECL信号。结果在图18B中示出，并且表明当对TAG化合物的浓度进行归一化时，所有TAG化合物产生大致相等的ECL信号，从而证明了联吡啶配体的修饰对ECL产生效率的影响最小。当浓度归一化时，Ru(Bpy)3ECL信号将是248,576个ECL单元，类似于其它TAG化合物。
为了研究抗SULFO-TAG抗体对TAG化合物的特异性和亲和力，将抗体包被在96孔小点链霉亲和素板上，然后暴露于不同浓度的四种TAG化合物。如在实例4中所描述的测量来自抗SULFO-TAG抗体的ECL信号，其中较高的信号指示较强的结合亲和力。结果在图19中示出。结果表明抗SULFO-TAG抗体克隆可以根据其对具有不同配体的TAG化合物的亲和力进行分组。四种抗体(克隆编号1、3、5和7)对SULFO-TAG的亲和力(KD)<1nM，而其余抗体的KD>20nM，其中一些可能在微摩尔范围内。对于具有三个SM配体的Ru+2(SM)3，观察到相同的亲和力模式。对于仅具有一个SM配体和两个Bpy配体的Ru+2(Bpy)2(SM)，抗体克隆1、3和5保持相对高的亲和力，但是抗体克隆7具有显著降低的<100nM的亲和力。用Bpy、Ru+2(Bpy)3进一步替换剩余的SM配体，几乎消除了所有抗体克隆的识别。这些结果证明SM配体至少部分负责与抗体克隆1、3、5和7的强结合。独特地，抗体克隆7需要两个SM配体进行识别。
为了进一步验证配体在抗体识别中的作用，将抗体包被在96孔小点链霉亲和素板上，并且首先暴露于2μM的配体SM、Bpy或A，然后暴露于不同浓度的TAG化合物作为竞争测定。竞争测定结果在图20中示出。结果表明TAG化合物上的SM配体是抗体克隆1、3、5和7中强结合的关键表位。在这四个抗体克隆中，克隆1、3和5仅需要TAG化合物中的一个SM配体进行强结合，而克隆7需要两个SM配体进行强结合。所有抗体克隆都不能识别具有三个Bpy配体的TAG化合物。配体竞争研究进一步证明，具有最强结合的SM配体是抗体识别的主要配体，而Bpy和A配体不能显著地胜过与Ru+2(SM)3和SULFO-TAG化合物结合的抗体。
实例6.另外的表位识别研究
进行另外的表位识别研究，以确定SM配体上的磺酸盐官能团是否是抗体识别所必需的，以及向亚甲基添加不同的带电荷的官能团是否会改变抗体识别。用于这项研究的有机金属Ru2+化合物在图21中示出。
Claims (161)
1.一种检测样品中的所关注的分析物的方法，所述方法包括
a.使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与以下接触，其中所述第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记：
(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括结合部分，以及
(II)可检测部分，所述可检测部分包括(1)所述结合部分的结合配偶体，以及(2)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；以及
b.测量(I)所述第二可检测标记或(II)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
c.使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与以下接触，其中所述第一可检测标记是ECL标记：
(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括酶，以及
(II)所述酶的底物；以及
d.测量酶活性，由此检测所述所关注的分析物；
或者
e.使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与信号扩增试剂接触，其中所述第一可检测标记是ECL标记，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且任选地包括第二可检测标记；以及
f.测量(I)所述第一可检测标记；(II)所述第二可检测标记；或(III)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
g.使包括(A)第一可检测标记和(B)所述所关注的分析物的第一复合物与信号扩增试剂接触，其中所述第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，其中所述信号扩增试剂包括核酸探针，由此形成包括所述第一复合物和所述信号扩增试剂的第二复合物；
h.延伸所述核酸探针以形成经延伸的序列；以及
i.测量经延伸的序列的量，由此检测所述所关注的分析物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一复合物在表面上。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一复合物包括：捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合，其中所述捕获试剂固定在所述表面上，或者其中所述捕获试剂能够固定到所述表面；以及检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合并且包括所述第一可检测标记。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述检测试剂是第一检测试剂，并且其中所述第一复合物进一步包括与所述分析物特异性结合的第二检测试剂，其中所述第二检测试剂包括第一可检测标记，其中所述信号扩增试剂能够与所述第一检测试剂上的所述第一可检测标记和与所述第二检测试剂上的所述第一可检测标记同时结合。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述捕获试剂固定在所述表面上。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述捕获试剂能够固定到所述表面，并且其中所述方法包括在(a)、(c)、(e)或(g)的所述接触之前将所述捕获试剂固定到所述表面。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一复合物与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括结合部分；以及(II)可检测部分，所述可检测部分包括(1)所述结合部分的结合配偶体，以及(2)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记。
8.根据权利要求7所述的方法，其中(b)的所述测量包括测量所述第二可检测标记；或者其中(b)的所述测量包括测量所述第一可检测标记和所述第二可检测标记。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述第一复合物首先与所述信号扩增试剂接触，然后与所述可检测部分接触；或者
其中所述第一复合物与所述信号扩增试剂和所述可检测部分同时或基本上同时接触。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中(a)的所述接触包括：(I)形成包括所述信号扩增试剂和所述可检测部分的信号扩增复合物；以及(II)使所述第一复合物与所述信号扩增复合物接触。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述可检测部分包括所述结合部分的多个结合位点，和/或所述结合部分包括所述可检测部分的多个结合位点，其中所述信号扩增复合物包括多种信号扩增试剂，并且其中每种信号扩增试剂与一个或多个可检测部分结合。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述结合部分和所述可检测部分包括互补寡核苷酸、受体-配体对、抗原-抗体对、半抗原-抗体对、表位-抗体对、模拟表位-抗体对、适体-靶分子对或嵌入剂-靶分子对。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合部分包括寡核苷酸，并且所述可检测部分包括互补寡核苷酸以及第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；或者
其中所述结合部分包括生物素，并且所述可检测部分包括亲和素或链霉亲和素以及第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；或者
其中所述结合部分包括亲和素或链霉亲和素，并且所述可检测部分包括生物素以及第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一复合物与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括所述酶；以及(II)所述酶的底物。
15.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一复合物与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，并且(f)的所述测量包括测量所述第一可检测标记。
16.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一复合物与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，并且(f)的所述测量包括测量所述第一可检测标记、所述第二可检测标记或两者。
17.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一复合物与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括核酸探针，由此形成包括所述第一复合物和所述信号扩增试剂的第二复合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中(h)的所述延伸包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、自我维持合成反应(3SR)、等温扩增或其组合。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中(h)的所述延伸包括将所述核酸探针与模板寡核苷酸结合，并且通过PCR延伸所述核酸探针；或者
其中所述延伸包括将所述核酸探针与模板寡核苷酸结合，从而形成环状模板，并且通过滚环扩增(RCA)延伸所述核酸探针。
20.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一复合物包括至少两个第一可检测标记；
其中所述信号扩增试剂是第一信号扩增试剂，并且(g)的所述接触进一步包括使所述第一复合物与包括核酸探针的第二信号扩增试剂接触，其中所述第一信号扩增试剂和所述第二信号扩增试剂各自与不同的第一可检测标记结合，并且所述第二复合物包括所述第一复合物以及所述第一信号扩增试剂和所述第二信号扩增试剂；并且
其中(h)的所述延伸包括延伸所述第一信号扩增试剂和所述第二信号扩增试剂的所述核酸探针中的一个或两个核酸探针以形成所述经延伸的序列。
21.根据权利要求20所述的方法，其中(h)的所述延伸包括将所述第一信号扩增试剂和所述第二信号扩增试剂的所述核酸探针中的一个或两个核酸探针与模板寡核苷酸结合，从而形成环状模板，并且通过RCA延伸一个或两个核酸探针。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中(h)的所述延伸包括：将每个核酸探针与不同的模板寡核苷酸结合；从而由每个模板寡核苷酸形成环状模板；并且通过RCA延伸每个核酸探针。
23.根据权利要求20或21所述的方法，其中(h)的所述延伸包括：
使两个核酸探针与两个模板寡核苷酸接触，其中每个模板寡核苷酸与每个核酸探针的一部分结合；
连接所述两个模板寡核苷酸以形成环状模板；并且
通过RCA延伸所述核酸探针中的一个或两个核酸探针。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述第一信号扩增试剂和所述第二信号扩增试剂的所述核酸探针包括相同的序列或由其组成。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述第一复合物在表面上，并且其中所述方法进一步包括将锚定试剂固定在所述表面上，其中所述锚定试剂与所述经延伸的序列的锚定区结合，并且其中(i)的所述测量包括测量通过所述锚定试剂与所述表面结合的经延伸的序列的量。
26.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述第一复合物在表面上，并且其中所述表面包括经固定的锚定试剂，其中所述锚定试剂与所述经延伸的序列的锚定区结合，并且其中(i)的所述测量包括测量通过所述锚定试剂与所述表面结合的经延伸的序列的量。
27.根据权利要求26所述的方法，其中在(h)的所述延伸之前或期间，将所述锚定试剂固定到所述表面。
28.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，其中所述第一复合物在表面上，并且其中所述第二复合物在所述延伸之后与所述表面结合。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述锚定试剂和所述锚定区包括互补寡核苷酸。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述经延伸的序列在距所述表面上的所述第二复合物小于100μm的位置处与所述锚定试剂结合。
31.根据权利要求17至30中任一项所述的方法，其中(i)的所述测量包括将所述经延伸的序列与包括第二可检测标记的标记探针结合，并且测量所述表面上的(I)所述第二可检测标记或(II)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记的量。
32.根据权利要求31所述的方法，其包括测量所述表面上的所述第二可检测标记的量；或者测量所述表面上的所述第一可检测标记和所述第二可检测标记的量。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述经延伸的序列和所述标记探针包括互补寡核苷酸。
34.根据权利要求3至33中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记通过缀合接头与所述检测试剂连接。
35.根据权利要求4至34中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记通过缀合接头与所述第二检测试剂连接。
36.根据权利要求2至35中任一项所述的方法，其中所述表面包括颗粒，或者其中所述表面包括多孔板的孔。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其中所述第一复合物包括捕获试剂，并且其中所述表面包括多个不同结合结构域，并且所述捕获试剂和所述锚定试剂位于所述表面上的两个不同结合结构域上；或者其中所述捕获试剂和所述锚定试剂位于所述表面上的相同结合结构域上。
38.根据权利要求25至37中任一项所述的方法，其中所述第一复合物包括捕获试剂，并且其中所述捕获试剂距所述表面上的所述锚定试剂小于1μm。
39.根据权利要求2至38中任一项所述的方法，其中所述表面包括电极，并且所述测量进一步包括向所述电极施加电压形式以产生电化学发光信号。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述表面包括颗粒，并且所述方法进一步包括在电极上收集所述颗粒，并且所述测量进一步包括向所述电极施加电压波形以产生电化学发光信号。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在(a)、(c)、(e)或(g)的所述接触之前，检测所述第一复合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述检测第一复合物包括测量所述第一可检测标记的量。
43.一种检测样品中的所关注的分析物的方法，所述方法包括
a.在表面上形成第一复合物，所述第一复合物包括：所述所关注的分析物；捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合，其中所述捕获试剂固定在所述表面上，或者其中所述捕获试剂能够固定到所述表面；以及检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合并且包括第一核酸探针；
b.延伸所述第一核酸探针以形成包括第一锚定区的第一经延伸的序列，其中所述第一锚定区与固定在所述表面上的第一锚定试剂结合；
c.将所述第一经延伸的序列与包括第一可检测标记的第一标记探针结合，其中所述第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记；以及
d.使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与以下接触：
(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括结合部分，以及
(II)可检测部分，所述可检测部分包括(1)所述结合部分的结合配偶体，以及(2)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；以及
e.测量(I)所述第二可检测标记或(II)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
f.使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与以下接触：
(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括酶，以及
(II)所述酶的底物；以及
g.测量酶活性，由此检测所述所关注的分析物；
或者
h.使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且任选地包括第二可检测标记；以及
i.测量(I)所述第一可检测标记；(II)所述第二可检测标记；或(III)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记，由此检测所述所关注的分析物；
或者
j.使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，其中所述信号扩增试剂包括第二核酸探针，由此形成包括所述信号扩增试剂和所述第一标记探针的第二复合物；
k.延伸所述第二核酸探针以形成包括第二锚定区的第二经延伸的序列，其中所述第二锚定区与固定在所述表面上的第二锚定试剂结合；以及
l.测量与所述表面结合的(I)所述第二经延伸的序列或(II)所述第一经延伸的序列和所述第二经延伸的序列的量，由此检测所述所关注的分析物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述捕获试剂固定在所述表面上。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述捕获试剂能够固定到所述表面，并且其中所述方法包括在步骤(a)之前或期间将所述捕获试剂固定到所述表面。
46.根据权利要求43至45所述的方法，其中(b)的所述延伸包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、自我维持合成反应(3SR)、等温扩增或其组合。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的方法，其中(b)的所述延伸包括将所述第一核酸探针与模板寡核苷酸结合，并且通过PCR延伸所述第一核酸探针；或者
其中(b)的所述延伸包括将所述第一核酸探针与模板寡核苷酸结合，从而形成环状模板，并且通过滚环扩增(RCA)延伸所述第一核酸探针。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的方法，其中在(b)的所述延伸之后，所述第一复合物与所述表面结合。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(b)之前或期间将所述第一锚定试剂固定到所述表面。
50.根据权利要求43至49中任一项所述的方法，其中所述第一锚定试剂和所述第一锚定区包括互补寡核苷酸。
51.根据权利要求43至50中任一项所述的方法，其中所述第一经延伸的序列和所述第一标记探针包括互补寡核苷酸。
52.根据权利要求43至51中任一项所述的方法，其中与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括结合部分，以及(II)可检测部分，所述可检测部分包括(1)所述结合部分的结合配偶体，以及(2)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记。
53.根据权利要求52所述的方法，其中与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针首先与所述信号扩增试剂接触，然后与所述可检测部分接触；或者
其中与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与所述信号扩增试剂和所述可检测部分同时或基本上同时接触。
54.根据权利要求52或53中任一项所述的方法，其中(d)的所述接触包括：(I)形成包括所述信号扩增试剂和所述可检测部分的信号扩增复合物；以及(II)使与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与所述信号扩增复合物接触。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述可检测部分包括所述结合部分的多个结合位点，和/或所述结合部分包括所述可检测部分的多个结合位点，其中所述信号扩增复合物包括多种信号扩增试剂，并且其中每种信号扩增试剂与一个或多个可检测部分结合。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述结合部分和所述可检测部分包括互补寡核苷酸、受体-配体对、抗原-抗体对、半抗原-抗体对、表位-抗体对、模拟表位-抗体对、适体-靶分子对或嵌入剂-靶分子对。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述结合部分包括寡核苷酸，并且所述可检测部分包括互补寡核苷酸以及第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；或者
其中所述结合部分包括生物素，并且所述可检测部分包括亲和素或链霉亲和素以及第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；或者
其中所述结合部分包括亲和素或链霉亲和素，并且所述可检测部分包括生物素以及第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记。
58.根据权利要求43至51中任一项所述的方法，其中与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与以下接触：(I)信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括酶；以及(II)所述酶的底物。
59.根据权利要求43至51中任一项所述的方法，其中与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，并且(i)的所述测量包括测量所述第一可检测标记。
60.根据权利要求43至51中任一项所述的方法，其中与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合，并且(i)的所述测量包括测量所述第一可检测标记、所述第二可检测标记或两者。
61.根据权利要求43至51中任一项所述的方法，其中与所述第一经延伸的序列结合的所述第一标记探针与信号扩增试剂接触，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合并且包括第二核酸探针，由此形成包括所述信号扩增试剂和所述第一标记探针的第二复合物。
62.根据权利要求61所述的方法，其中(k)的所述延伸包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、自我维持合成反应(3SR)、等温扩增或其组合。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中(k)的所述延伸包括将次级核酸探针与模板寡核苷酸结合，并且通过PCR延伸所述次级核酸探针；或者
其中(k)的所述延伸包括将所述次级核酸探针与模板寡核苷酸结合，从而形成环状模板，并且通过滚环扩增(RCA)延伸所述次级核酸探针。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其进一步包括在(k)的所述延伸之前或期间将所述第二锚定试剂固定到所述表面。
65.根据权利要求61至64中任一项所述的方法，其中在(k)的所述延伸之后，所述第二复合物与所述表面结合。
66.根据权利要求61至65中任一项所述的方法，其中所述第二锚定试剂和所述第二锚定区包括互补寡核苷酸。
67.根据权利要求61至66中任一项所述的方法，其中所述第一锚定区和所述第二锚定区包括相同的寡核苷酸序列，或者其中所述第一锚定区和所述第二锚定区包括不同的寡核苷酸序列。
68.根据权利要求61至67中任一项所述的方法，其中(l)的所述测量包括将所述第二经延伸的序列与包括第二可检测标记的第二标记探针结合，并且测量所述表面上的(I)所述第二可检测标记或(II)所述第一可检测标记和所述第二可检测标记的量。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述第二经延伸的序列和所述第二标记探针包括互补寡核苷酸。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述第一标记探针和所述第二标记探针包括相同的寡核苷酸序列，或者其中所述第一标记探针和所述第二标记探针包括不同的寡核苷酸序列。
71.根据权利要求43至70中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记通过缀合接头与所述第一标记探针连接。
72.根据权利要求43至71中任一项所述的方法，其中所述表面包括颗粒；或者其中所述表面包括多孔板的孔。
73.根据权利要求43至72中任一项所述的方法，其中所述表面包括多个不同结合结构域，并且所述捕获试剂和所述第一锚定试剂位于所述表面上的两个不同结合结构域上；或者其中所述捕获试剂和所述第一锚定试剂位于所述表面上的所述相同结合结构域上。
74.根据权利要求43至73中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂距所述表面上的所述第一锚定试剂小于1μm。
75.根据权利要求43至74中任一项所述的方法，其中所述表面包括电极，并且所述测量进一步包括向所述电极施加电压形式以产生电化学发光信号。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述表面包括颗粒，并且所述方法进一步包括在电极上收集所述颗粒，并且所述测量进一步包括向所述电极施加电压波形以产生电化学发光信号。
77.根据权利要求43至76中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在(d)、(f)、(h)或(j)的所述接触之前，检测所述表面上的所述第一复合物。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述检测包括测量所述表面上的所述第一可检测标记的量。
79.根据权利要求34至42中任一项或权利要求71至78中任一项所述的方法，其中所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记和所述缀合接头特异性结合。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述缀合接头包括酰胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亚胺、三唑、肽、寡核苷酸、亲水聚合物或其组合。
81.根据权利要求3至80中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂、所述检测试剂和所述信号扩增试剂各自包括抗体或其抗原结合片段、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述捕获试剂、所述检测试剂和所述信号扩增试剂各自包括抗体或其抗原结合片段。
83.根据权利要求1至82中任一项所述的方法，其中所述信号扩增试剂是包括对电化学发光(ECL)标记具有特异性的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。
84.根据权利要求1至83中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记、所述第二可检测标记或两者是使用光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量的。
85.根据权利要求1至84中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记各自包括电化学发光(ECL)标记。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述ECL标记包括包含至少一个经取代的联吡啶配体的有机金属络合物，其中所述经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团，任选地其中所述有机金属络合物包括至少两个经取代的联吡啶配体，其中每个经取代的联吡啶配体包括至少一个磺酸酯基团。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述经取代的联吡啶配体是式I化合物：
88.根据权利要求85至87中任一项所述的方法，其中所述ECL标记包括三个配体，其中第一配体是式I化合物，并且其中第二配体包括具有至少一个形成共价键的取代基的联吡啶。
89.根据权利要求85至88中任一项所述的方法，其中所述ECL标记包括三个配体，其中所述配体中的两个配体各自是式I化合物，并且其中第三配体包括具有至少一个形成共价键的取代基的联吡啶。
90.根据权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述有机金属络合物包括钌、锇或铼。
91.根据权利要求85至90中任一项所述的方法，其中所述ECL标记是式II化合物：
92.根据权利要求1至91中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记包括相同的标记。
93.根据权利要求1至90中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记包括不同的标记。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述第一可检测标记包括式II化合物，并且所述第二可检测标记包括式III、IV、V或VI中的任一者的化合物：
其中X是磷酸酯、碳酸酯、硼酸酯或其组合；
95.根据权利要求93所述的方法，其中所述第一可检测标记包括式III化合物，并且所述第二可检测标记包括式II、IV、V或VI中的任一者的化合物。
96.根据权利要求93所述的方法，其中所述第一可检测标记包括式IV化合物，并且所述第二可检测标记包括式II、III、V或VI中的任一者的化合物。
97.根据权利要求93所述的方法，其中所述第一可检测标记包括式V化合物，并且所述第二可检测标记包括式II、III、IV或VI中的任一者的化合物。
98.根据权利要求93所述的方法，其中所述第一可检测标记包括式VI化合物，并且所述第二可检测标记包括式II、III、IV或V中的任一者的化合物。
99.一种试剂盒，其用于检测样品中的所关注的分析物，所述试剂盒包括在一个或多个小瓶、容器或隔室中的以下各项：
a.捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合；
b.检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合，其中第一检测试剂包括第一可检测标记，其中所述第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记；以及
c.信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合。
100.根据权利要求99所述的试剂盒，其中所述检测试剂是第一检测试剂，并且其中所述试剂盒进一步包括与所述分析物特异性结合的第二检测试剂，其中所述第二检测试剂包括第一可检测标记。
101.一种试剂盒，其用于检测样品中的所关注的分析物，所述试剂盒包括在一个或多个小瓶、容器或隔室中的以下各项：
a.捕获试剂，所述捕获试剂与所述分析物特异性结合；
b.检测试剂，所述检测试剂与所述分析物特异性结合，其中所述检测试剂包括第一核酸探针；
c.第一标记探针，所述第一标记探针包括第一可检测标记，其中所述第一可检测标记是电化学发光(ECL)标记；以及
d.信号扩增试剂，所述信号扩增试剂与所述第一可检测标记特异性结合。
102.根据权利要求99至101中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获试剂、所述第一检测试剂和所述信号扩增试剂各自包括抗体或其抗原结合片段、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。
103.根据权利要求102所述的试剂盒，其中所述捕获试剂、所述检测试剂和所述信号扩增试剂各自包括抗体或其抗原结合片段。
104.根据权利要求99至103中任一项所述的试剂盒，其中所述信号扩增试剂是包括对电化学发光(ECL)标记具有特异性的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段。
105.根据权利要求99至104中任一项所述的试剂盒，其中所述信号扩增试剂包括结合部分。
106.根据权利要求99至104中任一项所述的试剂盒，其进一步包括用于将结合部分与所述信号扩增试剂缀合的试剂。
107.根据权利要求105或106所述的试剂盒，其中所述结合部分包括寡核苷酸；或者其中所述结合部分包括生物素。
108.根据权利要求105至107中任一项所述的试剂盒，其进一步包括可检测部分，所述可检测部分包括(i)所述结合部分的结合配偶体，以及(ii)第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记。
109.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述结合部分包括寡核苷酸，并且所述可检测部分包括互补寡核苷酸以及第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记；或者其中所述结合部分包括生物素，并且所述可检测部分包括链霉亲和素以及第二可检测标记中的一个或多个第二可检测标记。
110.根据权利要求99至104中任一项所述的试剂盒，其中所述信号扩增试剂包括酶。
111.根据权利要求110所述的试剂盒，其进一步包括所述酶的底物。
112.根据权利要求99至104中任一项所述的试剂盒，其中所述信号扩增试剂包括第二可检测标记。
113.根据权利要求99或100、或权利要求102至104中任一项所述的试剂盒，其中所述信号扩增试剂包括核酸探针。
114.根据权利要求99或100、或权利要求102至104中任一项所述的试剂盒，其进一步包括用于将核酸探针与所述信号扩增试剂缀合的试剂。
115.根据权利要求101至104中任一项所述的试剂盒，其中所述信号扩增试剂包括第二核酸探针。
116.根据权利要求101至104中任一项所述的试剂盒，其进一步包括用于将次级核酸探针与所述信号扩增试剂缀合的试剂。
117.根据权利要求113至116中任一项所述的试剂盒，其进一步包括模板寡核苷酸。
118.根据权利要求113至117中任一项所述的试剂盒，其进一步包括锚定试剂。
119.根据权利要求99至118中任一项所述的试剂盒，其进一步包括表面。
120.根据权利要求119所述的试剂盒，其中所述表面包括颗粒，或者其中所述表面包括多孔板的孔。
121.根据权利要求119或120所述的试剂盒，其中所述捕获试剂固定在所述表面上。
122.根据权利要求119或120所述的试剂盒，其进一步包括用于将所述捕获试剂固定到所述表面的试剂。
123.根据权利要求119至122中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括锚定试剂，其中所述锚定试剂固定在所述表面上。
124.根据权利要求119至122中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括锚定试剂和用于将所述锚定试剂固定到所述表面的试剂。
125.根据权利要求123或124所述的试剂盒，其中所述表面包括多个不同结合结构域，并且所述捕获试剂和所述锚定试剂位于所述表面上的两个不同结合结构域上；或者其中所述捕获试剂和所述锚定试剂位于所述表面上的相同结合结构域上。
126.根据权利要求123至125中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获试剂距所述表面上的所述锚定试剂小于1μm。
127.根据权利要求119至126中任一项所述的试剂盒，其中所述表面包括电极。
128.根据权利要求99至127中任一项所述的试剂盒，其进一步包括聚合酶、连接酶、缓冲液、阻断剂、共反应物、稀释剂、稳定剂、校准剂、测定消耗品、电极或其组合。
129.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括对电化学发光(ECL)标记具有特异性的抗原结合结构域。
130.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括对所述ECL标记具有特异性的抗原结合结构域和缀合接头。
131.根据权利要求129或130所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述ECL标记包括式II化合物。
132.根据权利要求130或131所述的抗体或抗原结合片段，其中所述缀合接头包括酰胺、硫酯、硫醚、二硫化物、亚胺、三唑、肽、寡核苷酸或亲水聚合物。
133.根据权利要求129至132中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包括核酸探针。
134.一种组合物，其包括
a.根据权利要求133所述的抗体或抗原结合片段；以及
b.模板寡核苷酸，所述模板寡核苷酸能够与所述核酸探针结合。
135.根据权利要求129至132中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包括酶。
136.一种组合物，其包括
a.根据权利要求135所述的抗体或抗原结合片段；以及
b.所述酶的底物。
137.根据权利要求129至132中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包括可检测标记。
138.根据权利要求129至132中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包括结合部分。
139.一种组合物，其包括
a.根据权利要求138所述的抗体或抗原结合片段；以及
b.可检测部分，所述可检测部分包括(I)所述结合部分的结合配偶体，以及(II)一个或多个可检测标记。
140.根据权利要求139所述的组合物，其中所述结合部分包括寡核苷酸，并且所述可检测部分包括互补寡核苷酸以及可检测标记中的一个或多个可检测标记；或者其中所述结合部分包括生物素，并且所述可检测部分包括链霉亲和素以及可检测标记中的一个或多个可检测标记。
141.根据权利要求137至140中任一项所述的组合物，其中所述可检测标记能够通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合进行测量。
142.根据权利要求141所述的组合物，其中所述可检测标记是电化学发光标记。
143.一种试剂盒，其包括根据权利要求133所述的抗体或抗原结合片段。
144.一种试剂盒，其包括根据权利要求135、137或138所述的抗体或抗原结合片段。
145.根据权利要求143或144所述的试剂盒，其进一步包括锚定试剂、模板寡核苷酸、标记探针、聚合酶、连接酶、缓冲液、阻断剂、共反应物、稀释剂、稳定剂、校准剂、测定消耗品或其组合。
146.根据权利要求143至145中任一项所述的试剂盒，其进一步包括捕获试剂和检测试剂中的一种或两种，其中所述检测试剂包括所述ECL标记。
147.根据权利要求146所述的试剂盒，其中所述检测试剂是第一检测试剂，并且其中所述试剂盒进一步包括第二检测试剂，其中所述第二检测试剂包括所述ECL标记。
148.根据权利要求143至147中任一项所述的试剂盒，其进一步包括表面。
149.一种测定系统，其包括：
至少一个存储器单元；
至少一个处理单元，所述至少一个处理单元根据所述至少一个存储器单元上的指令编程；以及
至少一个测定系统组件，所述至少一个测定系统组件被配置成由所述至少一个处理单元控制，其中所述至少一个处理单元被配置成：
控制所述至少一个测定系统组件以进行以下中的一项或两项：对样品中的较高丰度分析物进行第一测量；以及对所述样品中的较低丰度分析物进行第二测量，
其中存在于所述样品中的所述较高丰度分析物是所述较低丰度分析物的大约10至100000倍，
其中使用包括ECL标记的检测试剂来检测所述较高丰度分析物，
并且其中使用(i)包括ECL标记的检测试剂和(ii)与所述ECL标记特异性结合的信号扩增试剂来检测所述较低丰度分析物。
150.根据权利要求149所述的测定系统，其中所述第一测量和/或所述第二测量在包括以下的表面上进行：(i)包括所述较高丰度分析物的一个或多个结合结构域，以及(ii)包括所述较低丰度分析物的一个或多个结合结构域。
151.根据权利要求150所述的测定系统，其中所述测定系统被配置成对包括所述较高丰度分析物的所述一个或多个结合结构域选择性地进行所述第一测量，并且对包括所述较低丰度分析物的所述一个或多个结合结构域选择性地进行所述第二测量。
152.根据权利要求151所述的测定系统，其中所述测定系统被配置成基于确定来自所述第一测量的值低于预定义阈值来选择性地对所述结合结构域进行第二测量。
153.根据权利要求149至152中任一项所述的测定系统，其中所述测定系统被配置成依次进行所述第一测量和所述第二测量。
154.根据权利要求149至153中任一项所述的测定系统，所述测定系统被配置成同时或基本上同时进行所述第一测量和所述第二测量。
155.一种或多种非暂时性计算机可读介质，在其上存储有指令，所述指令在由至少一个处理单元执行时使所述至少一个处理单元：
通过控制测定系统进行以下中的一项或两项：对样品中的较高丰度分析物进行第一测量；以及对所述样品中的较低丰度分析物进行第二测量，
其中存在于所述样品中的所述较高丰度分析物是所述较低丰度分析物的大约10至100000倍，
其中使用包括ECL标记的检测试剂来检测所述较高丰度分析物，
并且其中使用(i)包括ECL标记的检测试剂和(ii)与所述ECL标记特异性结合的信号扩增试剂来检测所述较低丰度分析物。
156.根据权利要求155所述的一种或多种非暂时性计算机可读介质，其中所述第一测量和/或所述第二测量在包括以下的表面上进行：(i)包括所述较高丰度分析物的一个或多个结合结构域，以及(ii)包括所述较低丰度分析物的一个或多个结合结构域。
157.根据权利要求156所述的一种或多种非暂时性计算机可读介质，其中所述测定系统被配置成对包括所述较高丰度分析物的所述一个或多个结合结构域选择性地进行所述第一测量，并且对包括所述较低丰度分析物的所述一个或多个结合结构域选择性地进行所述第二测量。
158.根据权利要求156所述的一种或多种非暂时性计算机可读介质，其中所述测定系统被配置成基于确定来自所述第一测量的值低于预定义阈值来选择性地对所述结合结构域进行第二测量。
159.根据权利要求155至158中任一项所述的一种或多种非暂时性计算机可读介质，其中所述测定系统被配置成依次进行所述第一测量和所述第二测量。
160.根据权利要求155至158中任一项所述的一种或多种非暂时性计算机可读介质，所述测定系统被配置成同时或基本上同时进行所述第一测量和所述第二测量。
161.一种测定系统，其包括：
至少一个存储器单元；
至少一个处理单元，所述至少一个处理单元根据所述至少一个存储器单元上的指令编程；以及
至少一个测定系统组件，所述至少一个测定系统组件被配置成由所述至少一个处理单元控制，其中所述至少一个处理单元被配置成：
控制所述至少一个测定系统组件以对样品中的分析物进行测量，
其中当所述分析物以约0.0001至约100000pg/mL的浓度存在时，所述分析物能够使用包括ECL标记的单一检测试剂在所述样品中检测到。
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