CN110982945A - 一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物、试剂盒以及方法 - Google Patents

一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物、试剂盒以及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物、试剂盒以及方法，涉及生物技术领域。本发明公开的核酸组合物包括：第一核酸组合和第二核酸组合的至少一种，第一核酸组合包括SEQ ID NO.4‑6，第二核酸组合包括SEQ ID NO.7‑9。采用本发明提供的核酸组合物、试剂盒或方法检测2019新型冠状病毒具有更高的灵敏度和特异性。

Description

一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物、试剂盒以及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物、试剂盒以及方法。
背景技术
2020年2月11日，国际病毒分类委员会（ICTV）宣布，2019新型冠状病毒的分类名为严重急性呼吸综合证冠状病毒2（SARS‑Cov‑2），同日世界卫生组织（WHO）将这一病毒感染导致的疾病正式命名为COVID‑19。2019新型冠状病毒肺炎主要经飞沫、接触传播，人群普遍易感。2019新型冠状病毒感染的一般症状有：发热、乏力、干咳，逐渐出现呼吸困难，部分患者起病症状轻微，甚至可无明显发热。严重症状有：急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍。除上述症状，还有可能具有如下不典型症状：如轻度纳差、乏力、恶心呕吐、腹泻、头痛等。从目前的收治的病例情况看，多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至与其它基础性疾病并发导致死亡。因此及时、准确检测该新型冠状病毒十分重要。
从公开的报道来看，已有厂家研发出相应的检测试剂盒，但仍需提供一种检测灵敏度高、特异性好的方案。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物、试剂盒以及方法，以提高检测2019新型冠状病毒的灵敏度和特异性。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物，其包括：第一核酸组合和第二核酸组合的至少一种；
所述第一核酸组合包括：SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的第一引物对，以及SEQ IDNO.5所示的第一探针；
所述第二核酸组合包括：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的第二引物对，以及SEQ IDNO.9所示的第二探针。
本发明提供的第一核酸组合和第二核酸组合根据2019年新型冠状病毒（SARS-Cov-2）保守且特异于其它已发现冠状病毒的两个基因片段（S基因片段和N基因片段）进行特异性设计而成，第一核酸组合可特异性检测2019年新型冠状病毒的S基因片段，第二核酸组合可特异性检测2019年新型冠状病毒的N基因片段；该核酸组合物与其他呼吸道病毒无交叉反应，仅能检测2019年新型冠状病毒，且能够将低至20copies/mL浓度的阳性样本检测出；采用第一核酸组合或第二核酸组合，或者是两种的组合均可以实现对2019年新型冠状病毒的高灵敏度和高特异性的检测。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸组合物还包括第三核酸组合；
所述第三核酸组合包括：SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的第三引物对，以及SEQID NO.12所示的第三探针。
第三核酸组合作为内对照，使用第三核酸组合同时检测，有利于提高对检测结果判读的准确性，且第三核酸组合与第一核酸组合和第二核酸组合，相互间没有干扰，不会产生非特异性扩增，能够确保检测结果的可靠性。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述第一探针、所述第二探针以及所述第三探针的5’端标记有不同的荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、JOE、CY3、VIC、TET、TAXAS RED、NED、ALEXA、TAMRA、CY5.5和CY5中的一种。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和DABCYL中的任意一种。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际需要，选择其他类型的荧光报告基因和荧光淬灭基团，无论选择何种荧光报告基因和荧光淬灭基团，其均属于本发明的保护范围。
第二方面，本发明提供一种检测2019新型冠状病毒的试剂盒，其包括如上任一项所述的核酸组合物。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括PCR buffer和酶混合液，所述PCR buffer含有PCR缓冲物质、阳离子、脱氧核糖核苷酸中的至少一种。
可选地，在本发明的一些实施方案中，PCR缓冲物质为Tris-HCl。
可选地，在本发明的一些实施方案中，Tris-HCl的浓度为50-200mM。
可选地，在本发明的一些实施方案中，阳离子包括K+和Mg2+。
可选地，在本发明的一些实施方案中，K+的浓度为100-400mM。
可选地，在本发明的一些实施方案中，Mg2+浓度为10-30mM。
可选地，在本发明的一些实施方案中，脱氧核糖核苷酸包括dATP、dCTP、dGTP以及dUTP。
可选地，在本发明的一些实施方案中，dATP、dCTP、dGTP的浓度为0.5-3mM，dUTP的浓度为1-6mM。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述酶混合液包括DNA聚合酶、逆转录酶和UNG酶。
可选地，在本发明的一些实施方案中，DNA聚合酶可以为Taq、Tfl、Pfu或Tth DNA聚合酶中的至少一种。
可选地，在本发明的一些实施方案中，DNA聚合酶的浓度为1-10U/μL。
可选地，在本发明的一些实施方案中，逆转录酶为M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
可选地，在本发明的一些实施方案中，逆转录酶的浓度为30-100U/μL。
可选地，在本发明的一些实施方案中，UNG酶为温度敏感型的UNG酶。
可选地，在本发明的一些实施方案中，UNG酶的浓度为0.3-2 U/μL。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂包括冻干PCR反应试剂；
所述冻干PCR反应试剂由上述的PCR buffer、上述的酶混合液、所述核酸组合物和冻干保护剂混合后经冻干制得。
其中，冻干的参数本领域技术人员可以根据实际情况进行常规调节，无论以何种方式值得的冻干制剂，均属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述冻干保护剂选自甘露醇、葡聚糖、海藻糖、明胶和蔗糖中的至少一种。
需要说明的是，本发明的冻干保护剂并不限于上述的甘露醇、葡聚糖、海藻糖、明胶和蔗糖，采用其他的冻干保护也属于本发明的保护范围。
需要说明的是，Tris-HCl、K+、Mg2+、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、DNA聚合酶、逆转录酶和UNG酶可以以混合的方式存在于试剂盒中，也可以以部分混合或各自分开的方式存在于试剂盒中，无论以何种方式存在于试剂盒中，其均属于本发明的保护范围。
另外，Tris-HCl、K+、Mg2+、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、DNA聚合酶、逆转录酶和UNG酶的浓度也可以根据实际需要调整，无论以何种浓度存在于试剂盒中，其均属于本发明的保护范围。
第三方面，本发明提供一种检测2019新型冠状病毒的方法，其采用如上任一项所述的核酸组合物，或者采用如上任一项所述的试剂盒进行检测。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述方法包括：将所述核酸组合物与待测核酸样本的混合液进行PCR扩增检测；
其中，所述PCR扩增的程序如下：22-28℃、50-120s，45-55℃、5-20min，93-96℃、20-60s；93-96℃、4-15s，55-62℃、15-30s，循环40-50次。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述待测核酸样本为RNA样本、DNA样本或二者（RNA和DNA）的混合物。
采用本发明的检测方法，可以直接对RNA样本进行检测，操作简单，可以实现快速检测的目的，缩短检测时间。同时可以增加有效样本量，提高检测灵敏度。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述方法是以非疾病的诊断为目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1中浓度为20cp/mL的S基因片段的荧光扩增曲线。
图2为实验例1中浓度为20cp/mL的N基因片段的荧光扩增曲线。
图3为实验例1中浓度为40cp/mL的S基因片段的荧光扩增曲线。
图4为实验例1中浓度为40cp/mL的N基因片段的荧光扩增曲线。
图5为实验例1中浓度为400-40000cp/mL的S基因片段的荧光扩增曲线。
图6为实验例1中浓度为400-40000cp/mL的N基因片段的荧光扩增曲线。
图7为实验例3中组合（1）扩增不同浓度S基因片段模板的荧光扩增曲线。
图8为实验例3中组合（2）扩增不同浓度S基因片段模板的荧光扩增曲线。
图9为实验例3中组合（3）扩增不同浓度S基因片段模板的荧光扩增曲线。
图10为实验例3中组合（4）扩增不同浓度S基因片段模板的荧光扩增曲线。
图11为实验例3中组合（5）扩增不同浓度S基因片段模板的荧光扩增曲线。
图12为实验例3中组合（6）扩增不同浓度S基因片段模板的荧光扩增曲线。
图13为实验例4中组合（7）扩增不同浓度N基因片段模板的荧光扩增曲线。
图14为实验例4中组合（8）扩增不同浓度N基因片段模板的荧光扩增曲线。
图15为实验例4中组合（9）扩增不同浓度N基因片段模板的荧光扩增曲线。
图16为实验例4中组合（10）扩增不同浓度N基因片段模板的荧光扩增曲线。
图17为实验例4中组合（11）扩增不同浓度N基因片段模板的荧光扩增曲线。
图18为实验例4中组合（12）扩增不同浓度N基因片段模板的荧光扩增曲线。
图19为实验例4中组合（13）扩增不同浓度N基因片段模板的荧光扩增曲线。
图20为实验例4中组合（14）扩增不同浓度N基因片段模板的荧光扩增曲线。
图21为实验例5中组合（15）的荧光扩增曲线。
图22为实验例5中组合（16）的荧光扩增曲线。
图23为实验例5中组合（17）的荧光扩增曲线。
图24为实验例5中组合（18）的荧光扩增曲线。
图25为实验例5中组合（19）的荧光扩增曲线。
图26为实验例5中组合（20）的荧光扩增曲线。
图27为实验例5中组合（21）的荧光扩增曲线。
图28为实验例5中组合（22）的荧光扩增曲线。
图29为实验例5中组合（23）的荧光扩增曲线。
图30为实验例6中组合（24）的荧光扩增曲线。
图31为实验例6中组合（25）的荧光扩增曲线。
图32为实验例6中组合（26）的荧光扩增曲线。
图33为实验例6中组合（27）的荧光扩增曲线。
图34为实验例6中组合（28）的荧光扩增曲线。
图35为实验例6中组合（29）的荧光扩增曲线。
图36为实验例6中组合（30）的荧光扩增曲线。
图37为puc57载体图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的检测2019新型冠状病毒的核酸组合物包括：
第一核酸组合，其包括：
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的第一引物对，以及SEQ ID NO.5所示的第一探针；其中，第一探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
第二核酸组合，其包括：
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的第二引物对，以及SEQ ID NO.9所示的第二探针；第二探针的5’端标记有荧光报告基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
以及，第三核酸组合，其包括：
SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的第三引物对，以及SEQ ID NO.12所示的第三探针；第三探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
本实施例还提供采用上述核酸组合物检测2019新型冠状病毒的方法，该方法包括：
（1）PCR扩增：
取50μL待检测核酸样本与冻干PCR反应试剂混合，混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，PCR程序如下：
Figure 536099DEST_PATH_IMAGE001
其中，上述待检测核酸样本可以通过如下方法提取：
取500 μL待测样本，参考发明专利《一种通用型核酸提取试剂盒及其使用方法》（申请号：201910274779.9，申请公布号 CN 109880824A）中公开的方法提取待测样本中的核酸；
其中，待测样本可以是咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽分泌物、肺泡灌洗液、痰液、血清和血浆中的任一种；
所提取的核酸可以是RNA和/或DNA；
其中，上述冻干PCR反应试剂通过如下方法制备：
单人份冻干PCR反应试剂：
（a）按下表配制PCR反应液，混匀后30μL/管分装到PCR管中：
Figure 125343DEST_PATH_IMAGE002
其中，PCR buffer含有：100mM Tris-HCl，pH8.3，200mM KCl，15mM MgCl2，dATP、dCTP、dGTP各1mM以及dUTP 2mM；酶混合液含有：Taq热启动酶 3U/μL，M-MLV逆转录酶50U/μL，UNG酶0.5U/μL。
（b）将分装好的PCR反应液按以下参数进行冻干：（1）第一阶段：预冷冻，缓慢降温至-48℃，降温时长1小时，并保持在该温度条件下3小时；第二阶段：一次干燥，温度缓慢升至-32℃，保持9小时，其中气压保持在0 .2mbar；第三阶段：加强干燥，温度保持25摄氏度，干燥时间2小时，气压保持0.1mbar。制得冻干PCR反应试剂。
需要说明的是，在其他的实施方式中，也可以直接将待测核酸样本与PCR buffer和酶混合液混合后进行PCR扩增进行检测，其取得的技术效果与使用冻干PCR反应试剂相同。
（2）结果判读：
按下表判读方法，根据Ct值进行判读：
Figure 577184DEST_PATH_IMAGE003
实验例1
验证实施例1的核酸组合物的灵敏度
检测方法如下：
将分别含有S基因片段（SEQ ID NO.1）和N基因片段（SEQ ID NO.2）的两种阳性质粒（S基因阳性质粒和N基因阳性质粒，其骨架为puc57载体，载体图谱见图37）模板混合后稀释到均为4.0E+04copies/mL、4.0E+03copies/mL、4.0E+02copies/mL、40copies/mL和20copies/mL进行提取（提取方法参考实施例1的待测核酸样本的提取方法，在其他的实施例中，阳性质粒模板可不用经提取处理即可进行PCR扩增检测，本实验例中对其进行提取，主要是为了模拟样本经过本发明使用的提取方法提取后用本发明的试剂盒进行检测的灵敏度），其中20copies/mL和40copies/mL各4管，其余浓度各2管，每管中加入5μL内对照RNA假病毒（蛋白外膜包裹的含有内对照RNA模板（序列见SEQ ID NO.3）的RNA假病毒）。提取体积为0.5mL，洗脱体积60μL，提取完后取50μL加入到根据实施例1的方法制备的冻干PCR反应试剂中，混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，PCR程序如下：
Figure 375988DEST_PATH_IMAGE004
S基因片段序列如下（SEQ ID NO.17）：
5’-CTTAGTAAAGGTAGACTTATAATTAGAGAAAACAACAGAGTTGTTATTTCTAGTGATGTTCTTGTTAACAACTAAACGAACAATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATT-3’
N基因片段序列如下（SEQ ID NO.18）：
5’-GCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATG-3’
内对照RNA假病毒序列（SEQ ID NO.19）：
5’-GAAATCTTTTCTTTGCAGCTGCTGTGTAATAAGAAGAAGATCGCCATCGAATCCTCAACTCATTCCATCCTTTTGTCGACCAGTCTCACGCTCACTCGTCCTCTGCAATTATCAGGCTACTGCTATGCGCTGTGAGTGCTATCCCAATTTGGACCGGCTAAACAGACGTATCCACTATCAATAAGCTTAACTCCTTTAAG-3’。
结果如图1~图6和表1：
表1 灵敏度检测的Ct值
Figure 862464DEST_PATH_IMAGE005
从图1~图6和（图中，实线为S基因片段的扩增曲线，三角形标记为N基因片段的扩增曲线，虚线为内对照的扩增曲线）和表1中可以看出：采用实施例1的核酸组合物，对两个基因片段均能稳定检测出低至20copies/mL的模板，而目前已知的同类产品的灵敏度多数为200~1000copies/mL；可见，本发明实施例的核酸组合物的检测灵敏度较高，远远优于已有的同类产品。
实验例2
验证实施例1的核酸组合物的特异性
检测呼吸道合胞病毒A型、呼吸道病毒B型，甲型流感病毒H1N1，甲型流感病毒H3N2，甲型流感病毒H1N1（2009），乙型流感病毒Yamagata和乙型流感病毒Victoria病毒以及金黄色葡萄球菌培养物，验证是否与实施例的核酸组合物有交叉反应。
检测方法如下：
将上述8种病毒的培养物及对照品（阴性对照为生理盐水，阳性对照品中含有S基因片段的质粒和N基因片段的质粒）按照实施例1中的提取方法进行提取，提取体积为0.5mL，洗脱体积60μL，提取完后取50μL加入到按照实施例1的方法制备得到的冻干PCR反应试剂中，混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，PCR程序如下：
Figure 622610DEST_PATH_IMAGE006
结果如表2所示：
表2 特异性检测的Ct值
Figure 296168DEST_PATH_IMAGE007
由表2的结果可知，本发明的核酸组合物的检测特异性良好，能够将2019新型冠状病毒特异性地检测出，与上述8种呼吸道常见的病原体无交叉反应。
实验例3
设置检测S基因片段的不同的核酸组合，检测不同核酸组合的扩增效果。
检测S基因片段的不同的核酸组合如下表3：
表3
Figure 901593DEST_PATH_IMAGE008
其中，组合(4)即为实施例1的核酸组合1，各组合的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
将表3中6个不同的组合配制成PCR反应液，配制方法如下（25μL体系）：
Figure 935187DEST_PATH_IMAGE009
将配制好的不同组合的反应液按15μL/管分装到PCR反应管中，再分别加入10μL不同浓度（0.2copies/μL、2copies/μL、20copies/μL、200copies/μL）的S基因阳性质粒，其中0.2copies/μL、2copies/μL、20copies/μL各2管，200copies/μL和NTC（水）各1管。混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，PCR程序如下：
Figure 335075DEST_PATH_IMAGE010
结果如图7~图12及表4-表5所示：
表4 核酸组合（1）-（6）检测S基因片段的Ct值比较
Figure 27088DEST_PATH_IMAGE011
表5核酸组合（1）-（6）检测S基因片段的Rn值比较
Figure 436204DEST_PATH_IMAGE012
从图7~图12及表4-表5的结果中，可以看出：各组引物探针均能扩增出新型冠状病毒的模板，其中组合（4）的扩增曲线成明显的S型，且信号强度（Rn值）最高，能稳定扩增出2copies/μL浓度以上的模板，组合（3）的扩增曲线形状及信号强度略次之；虽然组合（5）能扩增出0.2copies/μL的模板，但该组合扩增曲线形状不好，且信号强度最低。同时考虑到0.2copies/μL极低，本身存在不确定性；因此，可以看出，组合（4）的引物探针组合是检测S基因片段的最佳引物探针组合，其扩增效果明显优于其他组合。
实验例4
根据2019新冠病毒及已有冠状病毒的序列，设置检测N基因片段的不同核酸组合（7）-（14），如下表6所示：
表6 检测2019新冠病毒N基因片段的不同核酸组合（7）-（14）
Figure 897272DEST_PATH_IMAGE013
将表6中8个不同的引物探针组合配制成PCR反应液，配制方法如下（25μL体系）：
Figure 999220DEST_PATH_IMAGE014
将配制好的不同引物探针组合的反应液按15μL/管分装到PCR反应管中，再分别加入10μL不同浓度（1copies/μL、10copies/μL、100copies/μL、1000copies/μL、10000copies/μL）的N基因阳性质粒，其中 1copies/μL、10copies/μL各2管，其余浓度和NTC（水）各1管。混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，PCR程序如下：
Figure 582124DEST_PATH_IMAGE015
结果如图13~图20及表7-表8所示：
表7核酸组合（7）-（14）检测N基因片段的Ct值比较
Figure 467034DEST_PATH_IMAGE016
表8核酸组合（7）-（14）检测N基因片段的Rn值比较
Figure 517030DEST_PATH_IMAGE017
从图13~图20及表7-表8中结果可以看出：各组引物探针均能扩增出新型冠状病毒的N基因片段模板，其中组合（14）（即实施例1中的核酸组合2）的扩增曲线成明显的S型，且信号强度（Rn值）最高，能稳定扩增出1copies/μL浓度以上的模板，组合（10）和组合（12）的扩增曲线形状及信号强度略次之。基于此，选择组合（14）、组合（10）和组合（12）与内对照引物探针放在一起，进行进一步比较。
实验例5
将实验例4中的组合（14）、组合（10）和组合（12）的引物探针与内对照的引物探针进行组合，配制成双重扩增体系进行比较，比较不同组合的检测效果和互相干扰的程度。
组合方式见下表9：
表9
Figure 993142DEST_PATH_IMAGE018
将表9中9个不同的引物探针组合配制成PCR反应液，配制方法如下（25μL体系）：
A.N基因片段单重体系：
Figure 391238DEST_PATH_IMAGE019
B.N基因片段与内对照双重体系：
Figure 876577DEST_PATH_IMAGE020
将配制好的单重体系反应液和双重体系反应液均按10μL/管分装到PCR反应管中，每管中加入5μL内对照RNA模板，再分别加入10μL不同浓度（1copies/μL、10copies/μL、100copies/μL、1000copies/μL、10000copies/μL）的N基因阳性质粒，其中 1copies/μL、10copies/μL各2管，其余浓度和NTC（水）各1管。混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，PCR程序如下：
Figure 46658DEST_PATH_IMAGE021
结果如图21~图29所示（图中：实线为N基因片段的扩增曲线，虚线为内对照的扩增曲线），从图中可以看出：在两条内对照探针（SEQ ID NO.12和13）中，SEQ ID NO.12（组18-20）的扩增曲线形状较好，Ct值较小。
因此，说明实施例1中的第三核酸组合一SEQ ID NO.12作为内对照的探针的效果更好。此外，检测N基因片段的3组引物探针（表6中的组合（14）、组合（10）和组合（12））与内标引物探针组合后，其中组合（14）与内标引物探针（SEQ ID NO.10-12，即实施例1中的第三核酸组合）组合（即表9中的组合20），受到的干扰较小，整体效果较好，检测效果好于其他的组合。
实验例6
设置不同的可检测多个基因的引物探针组合，比较不同组合的检测效果，检测多基因的组合设置见下表10：
表10
Figure 693671DEST_PATH_IMAGE022
将表10中7个不同的引物探针组合配制成PCR反应液，配制方法如下（25μL体系）：
A.单基因体系：
Figure 50834DEST_PATH_IMAGE023
或者：
Figure 71355DEST_PATH_IMAGE024
B.多基因体系：
Figure 830364DEST_PATH_IMAGE025
将配制好的反应液10μL/管分装到PCR反应管中，分别加入10μL不同浓度的混合质粒模板，每种基因模板的浓度分别为1copies/μL、10copies/μL、100copies/μL、1000copies/μL、10000copies/μL，其中 1copies/μL、10copies/μL各2管，其余浓度和NTC（水）各1管，每管中加入5μL内对照RNA模板。混匀后放到PCR仪上进行扩增检测，PCR程序如下：
Figure 445016DEST_PATH_IMAGE026
结果见图30-图36（图中，实线为S基因片段的扩增曲线，三角形标记为N基因片段的扩增曲线，虚线为内对照的扩增曲线），从中可以看出：在多基因扩增的三个组合中，组合29与对照组（组合24和组合26）的差异较小，说明组合29多条引物探针之间的干扰较小，且组合29（即实施例1中的第一核酸组合、第二核酸组合以及第三核酸组合）的两个基因片段及内对照均能得到较好的扩增效果。由此说明，实施例1提供的核酸组合物相较于其他的引物探针组合，其能够取得更好的扩增效果，具有明显的扩增优势。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海丽珠试剂股份有限公司
<120> 一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物、试剂盒以及方法
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accccctgca tacactaatt ctttc 25
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accctgacaa agttttcaga tcctcagttt tac 33
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggtcccaga gacatgtata gc 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgtggtgttt attaccctga caaag 25
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcagtttta cattcaactc aggacttgtt ctt 33
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagacatgta tagcatggaa ccaag 25
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctggcaatgg cggtgatg 18
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgttgttggc ctttaccaga c 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttgctgctgc ttgacagatt gaac 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgccatcgaa tcctcaactc a 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatagcactc acagcgca 18
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgaccagtct cacgctcact cg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccagtctcac gctcactcgt cc 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagacatttt gctctcaagc tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 17
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cttagtaaag gtagacttat aattagagaa aacaacagag ttgttatttc tagtgatgtt 60
cttgttaaca actaaacgaa caatgtttgt ttttcttgtt ttattgccac tagtctctag 120
tcagtgtgtt aatcttacaa ccagaactca attaccccct gcatacacta attctttcac 180
acgtggtgtt tattaccctg acaaagtttt cagatcctca gttttacatt caactcagga 240
cttgttctta cctttctttt ccaatgttac ttggttccat gctatacatg tctctgggac 300
caatggtact aagaggtttg ataaccctgt cctaccattt aatgatggtg tttattttgc 360
ttccactgag aagtctaaca taataagagg ctggattttt ggtactactt tagattcgaa 420
gacccagtcc ctacttattg ttaataacgc tactaatgtt gttattaaag tctgtgaatt 480
<210> 18
<211> 506
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcaatcctgc taacaatgct gcaatcgtgc tacaacttcc tcaaggaaca acattgccaa 60
aaggcttcta cgcagaaggg agcagaggcg gcagtcaagc ctcttctcgt tcctcatcac 120
gtagtcgcaa cagttcaaga aattcaactc caggcagcag taggggaact tctcctgcta 180
gaatggctgg caatggcggt gatgctgctc ttgctttgct gctgcttgac agattgaacc 240
agcttgagag caaaatgtct ggtaaaggcc aacaacaaca aggccaaact gtcactaaga 300
aatctgctgc tgaggcttct aagaagcctc ggcaaaaacg tactgccact aaagcataca 360
atgtaacaca agctttcggc agacgtggtc cagaacaaac ccaaggaaat tttggggacc 420
aggaactaat cagacaagga actgattaca aacattggcc gcaaattgca caatttgccc 480
ccagcgcttc agcgttcttc ggaatg 506
<210> 19
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaaatctttt ctttgcagct gctgtgtaat aagaagaaga tcgccatcga atcctcaact 60
cattccatcc ttttgtcgac cagtctcacg ctcactcgtc ctctgcaatt atcaggctac 120
tgctatgcgc tgtgagtgct atcccaattt ggaccggcta aacagacgta tccactatca 180
ataagcttaa ctcctttaag 200

Claims (12)

1.一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物，其特征在于，其包括：第一核酸组合和第二核酸组合的至少一种；
所述第一核酸组合包括：SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的第一引物对，以及SEQ IDNO.5所示的第一探针；
所述第二核酸组合包括：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的第二引物对，以及SEQ IDNO.9所示的第二探针。
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物还包括第三核酸组合；
所述第三核酸组合包括：SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的第三引物对，以及SEQID NO.12所示的第三探针。
3.根据权利要求2所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一探针、所述第二探针以及所述第三探针的5’端标记有不同的荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的核酸组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、JOE、CY3、VIC、TET、TAXAS RED、NED、ALEXA、TAMRA、CY5.5和CY5中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和DABCYL中的任意一种。
5.一种检测2019新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的核酸组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR buffer和酶混合液；所述PCR buffer含有PCR缓冲物质、阳离子和脱氧核糖核苷酸中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲物质为浓度50-200mM 的Tris-HCl。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳离子包括浓度为100-400mM的K+和浓度为10-30mM的Mg2+。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸包括dATP、dCTP、dGTP以及dUTP，其中dATP、dCTP和dGTP的浓度均为0.5-3mM，dUTP的浓度为1-6mM。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括DNA聚合酶、逆转录酶和UNG酶，所述DNA聚合酶选自Taq、Tfl、Pfu或Tth DNA聚合酶中的至少一种，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
11.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括冻干PCR反应试剂；所述冻干PCR反应试剂由PCR buffer、酶混合液、所述核酸组合物和冻干保护剂混合后经冻干制得。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂选自甘露醇、海藻糖、葡聚糖、明胶和蔗糖中的至少一种。
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