CN114107439A - 一种用于制备病原体检测目的的测试液的方法、系统、试剂盒、及检测引物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于待测样本制备用于病原体例如新型冠状病毒COVID‑19检测目的的测试液的方法，采用裂解液对待测样本进行裂解处理以释放出样本中包含的核酸，获得包含核酸的裂解液，所述核酸包括宿主核酸，或者当所述待测样本包含病原体时，所述核酸还包含病原体核酸；将所述含有核酸的裂解液通过核酸提取装置进行提取，获得提取物，所述提取物包含宿主核酸，或者当所述待测样本包含病原体时，所述提取物中还包含病原体核酸；由所述提取物制备所述用于病毒检测目的的测试液。本发明可以提取和浓缩大体积样本中的核酸，保留病原体核酸和宿主核酸，从而可以同时检测病原体核酸和多种宿主核酸，以提高病原体检测的灵敏度以及阳性率。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制备病原体检测目的的测试液的方法、系统、试剂盒、及检测引物和方法。
背景技术
新型冠状病毒COVID-19(SARS-CoV-2)是由蛋白包裹的单链正义RNA病毒，其主要通过上呼吸道和消化道入侵机体，病毒表面棘突蛋白(Spike protein)与上呼吸道，消化道细胞表达的ACE2受体高亲和力，高特异性结合，进入宿主细胞，并利用宿主细胞器进行病毒蛋白合成和病毒复制。目前临床上新型冠状病毒COVID-19检测方法主要有两种：核酸检测和抗原抗体免疫学检测。
对于核酸检测，需要从各种体液标本(比如：血液、痰液、唾液、胸腔积液、胸/腹水、脑脊液、支气管/肺部灌洗液、分泌物(如鼻咽部分泌物)、排泄物(如尿、粪)等)中提取病毒核酸RNA，由于新型冠状病毒COVID-19与上呼吸道表达的ACE2受体高亲和力，因此，常以鼻咽拭子(nasopharyngeal swab)采集的鼻部分泌物，口咽拭子(oropharyngeal swab)采集咽部和扁桃体分泌物、肺泡灌洗液等作为标本。
目前最广泛使用的COVID-19感染诊断方法是逆转录定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)。RT-qPCR检测涉及以下几个步骤：1)标本采集和稳定病毒RNA；2)提取RNA；3)逆转录反应或直接(一步法)RT-qPCR。
目前在用PCR方法检测COVID-19核酸RNA时，RNA提取技术为主要瓶颈，由于受限于现有商业化提取装置，导致现有的标本体积一般量不超过200-300μl，如商用提取装置(Qiagen的QIAamp Viral RNA Mini Kit，QIAamp DNA Blood Mini Kit；中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒(磁珠法)粤穗械备20170583号和粤穗械备20150302号；天根生化科技(北京)有限公司生产的病毒RNA提取试剂盒(DP315-R))，导致RNA的得率较低。
另外，目前新型冠状病毒COVID-19检测的阳性率仅为30％～50％，且实验室检测过程中会将医护人员暴露在交叉感染的环境中。并且目前新型冠状病毒COVID-19检测还受限于标本运输，试剂原料和仪器，费用，实验室技术、环境和完成时间。
目前已知，一旦感染新冠病毒，随着宿主机体免疫细胞应答，在不同阶段产生不同细胞因子等炎症蛋白的过量生产，可导致细胞因子风暴，其结果是危及生命的炎症反应，典型表现为导致急性呼吸窘迫综合征(ARS)和器官衰竭，甚至有可能在疾病痊愈后阻止长期免疫的发展。因此有针对性的筛查和动态检测细胞因子水平有助于区别一般感染者和更有可能罹患严重COVID-19的患者，对症施治，从而提高治疗效果和降低死亡率。临床上现有检测细胞因子的方法多为从血液样本通过免疫学检测，如ELISA等，通过抗体检测特定的细胞因子蛋白，此种方法比较昂贵，难以满足快速，动态和床边检测临床需求。
相比于临床常规的生化、免疫和分子诊断方法和昂贵但无所不包的宏基因微生物测序方法，开发一种简便快速，适合于床边应用，性价比高，具有同时检测同一样品中不同病原体核酸以及宿主核酸以监控机体对病原体免疫反应如细胞因子动态变化的方法，显然对于传染病如新冠病毒感染的早期鉴别诊断，指导用药，临床分期和判定预后都有明显的临床实用价值和指导意义，然而，这类方法极少有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够提高核酸的稳定性的用于制备病原体检测目的的测试液的方法、系统、试剂盒；以及检测病原体以及宿主核酸的检测引物和方法，该引物和方法的检测灵敏度高。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个方面提供一种基于待测样本制备用于病原体例如新型冠状病毒COVID-19检测目的的测试液的方法，所述方法包括如下步骤：
采用裂解液对待测样本进行裂解处理以释放出样本中包含的核酸，获得包含核酸的裂解液，所述核酸包括宿主核酸，或者当所述待测样本包含病原体时，所述核酸还包含病原体核酸；
将所述含有核酸的裂解液通过核酸提取装置进行提取，获得提取物，所述提取物包含宿主核酸，或者当所述待测样本包含病原体时，所述提取物中还包含病原体核酸；
由所述提取物制备所述用于病毒检测目的的测试液；
所述方法还包括选自如下至少一项的步骤：
A.控制所述提取物所处的环境，以稳定所述提取物中的宿主核酸，使所述测试液中包含有所述宿主核酸；
B.使提取过程中所采用的裂解液和/或清洗液中包含三(2-羧乙基)膦盐酸盐，以加快、增强蛋白或其
他物质的降解，稳定核酸；
C.控制所述待测样本的体积为1～40mL；
D.采用封闭式核酸提取装置进行所述提取。
新型冠状病毒COVID-19感染大概分成三个阶段，即早期淋巴细胞下降、中期肺炎、后期细胞因子风暴(CRS)。COVID-19感染后会引起一系列严重的症状，全身多器官受到感染并出现多项细胞因子升高及所谓的细胞因子风暴。细胞因子(Cytokine)：是由细胞分泌的、用于细胞间信号传导的多种小分子蛋白的总称，如白细胞介素(Interleukin，IL)、干扰素(Interferon，IFN)、趋化因子(Chemokine)、集落刺激因子(Colony stimulating factor，CSF)以及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等。目前细胞因子检测多数使用免疫技术，通过血液抗体检测特定的细胞因子蛋白。而我们所用的技术是通过唾液或其他体液既可检测宿主反应细胞因子的mRNA，又可检测感染宿主的病毒的RNA。mRNA作为新的生物标记物(BIOMARKERS)，连同病毒核酸变化监测，用于帮助判断临床分期，指导临床治疗，这是本发明的独特点。
该技术的引物不同于现有各国已发表的引物，具有其独特性，这是该技术的又一创新点。
优选地，所述A中，控制所述提取物所处的环境中的氧含量低于0.01～1％，进一步地，可通过在环境中加入脱氧剂控制氧含量；再进一步地，可在提取结束后，将提取物所处环境中加入脱氧剂。
优选地，所述提取包括将所述含有核酸的裂解液通过过滤器柱进行吸附，之后通入所述清洗液进行清洗，获得所述提取物，然后采用洗脱液对过滤器柱进行洗脱得到测试液，其中，至少所述吸附、清洗在封闭环境下进行。
优选地，所述的提取装置包括：
限定内部体积的容器；
用于所述容器的可移除帽体，所述帽体具有面向所述容器的所述内部体积的内侧和背向所述内部体积的外侧，所述帽体包括在所述内侧和所述外侧之间连通的通气器端口和在所述内侧和所述外侧之间连通的样品连接端口，所述样品连接端口包括第一互锁部件，所述第一互锁部件用于可释放地将所述样品连接端口锁定到配合的第二互锁部件，所述帽体的所述内侧包括与所述样品连接端口流体连通的连接接口；
过滤器柱，其适于可移除地附接到所述容器帽体的所述连接接口，所述过滤器柱具有开放的第一端、开放的第二端和在其之间的容纳用于收集所述核酸的基片的内部通道；
运输容纳器，其具有开放的端并限定适于容纳所述过滤器柱的体积，所述运输容纳器适于可释放地接合所述过滤器柱用于将其从所述容器帽体的所述连接接口拆卸，所述运输容纳器还包括用于暂时地将所述过滤器柱密封在所述运输容纳器内的可移除盖。
根据一种具体且优选实施方式，所述的提取装置的结构如专利CN201480042043.4公开的用于收集核酸的样品的系统和方法的说明书0035～0067段，以及附图1至附图6所示。
进一步优选地，所述的提取装置还包括用于加入或者预存在所述的容器和/或所述的运输容纳器内的脱氧剂。
本发明通过采用所述的提取装置进行核酸提取，使得核酸提取步骤可以在密闭环境中进行，从而避免了样本间的交叉污染，且能够防止样本对外在环境的污染，有效保护实验操作者的安全；此外，本发明的方法可以提取大体积待测样本，明显提高检测灵敏度，且获得的核酸还包括短片段核酸，即游离核酸；再者，本发明的方法提取的RNA和DNA可在室温下长时间保持稳定，从而本发明的方法解决了现有商用提取装置对提取液体的容量限制，适合在高端、低端等各类实验室环境操作，对实验室环境和技术条件无特殊要求。
优选地，使所述含有核酸的裂解液通过经处理后的过滤器柱进行核酸的吸附，或者使所述含有核酸的裂解液与吸附液混合后通过过滤器柱进行核酸的吸附。
优选地，所述的方法还包括采用样本收集装置收集所述待测样本的步骤，所述的收集装置包括样本收集器、与所述的样本收集器相可拆卸地连接的样本贮存容器。
进一步优选地，所述的样本收集器包括与所述的样本贮存容器相可拆卸地连接的连接部、一端与所述的连接部相固定连接或一体成型且具有开口的收集部，所述的收集部的开口处的横截面积大于所述的收集部与所述的连接部相连接处的横截面积。
更为优选地，所述的收集部的开口处的横截面呈圆形或椭圆形。
进一步优选地，所述的样本收集器与所述的样本贮存容器通过螺纹配合连接。
进一步优选地，所述的连接部包括与所述的收集部的下部相固定连接或一体成型且具有与所述的收集部相连通的内部通道的第一部分、固定设置在所述的第一部分的外部且内壁与所述的第一部分的外壁之间具有容纳空间的第二部分，所述的第二部分的内壁上形成有内螺纹；当所述的样本收集器与所述的样本贮存容器相连接时，所述的样本贮存容器与所述的第二部分相连接且所述的样本贮存容器的内壁与所述的第一部分的外壁之间形成有间隙。
进一步优选地，所述的收集装置还包括用于加入或预存在所述的样本贮存容器中以灭活、保存、消化或释放样本中的核酸的样本处理液，以便进一步核酸提取。
更为优选地，所述的样本处理液呈液态或固态。
更进一步优选地，所述的样本处理液呈干粉状态，一旦接触到体液，固态形式的样本处理液成分迅速溶解，产生与液体样本处理液相同或类似作用。
优选地，所述的待测样本包括但不限于血液、体液、分泌物、排泄物中的一种或多种；进一步优选地，所述待测样本为唾液、尿液、鼻咽拭子、口咽拭子、支气管/肺部灌洗液、脑脊液、淋巴液、腹水、羊水、腹膜透析液中的一种或多种中的一种或多种。我们优先推荐使用唾液样本，理由为唾液或者漱口液采集很容易达到1-2ml的体积，受检者可自行采集唾液或者漱口液而避免了医护人员和受检者的交叉感染。我们经实验证明：通过采集1-2ml唾液按照本发明的方法进行提取和检测，可以检出病毒RNA，且灵敏度是现有国内主流核酸提取和检测商品试剂盒的16倍。
需要说明，所述待测样本核酸来自单一或者多种病原体和宿主，所述病原体包括病毒，细菌，真菌和寄生虫，优选地，寄生虫包括但不限于各种血吸虫，肝吸虫，肺吸虫，绦虫/包虫，土源性线虫和脑囊虫；所述宿主包括人和其它哺乳类动物。
优选地，控制所述待测样本的体积为2～20mL。
本发明的大体积待测样本可以用10～40mL水或生理盐水口腔漱口，及咽喉部位漱口，并与唾液合并到一起进行RNA浓缩和提取；或者是其他大液量体液如尿液、支气管/肺部灌洗液，脑脊液，淋巴液，腹水,羊水和腹膜透析液等。
优选地，所述的宿主核酸包括但不限于细胞因子、趋化因子、生物标记物中的一种或多种的核酸。
进一步优选地，所述的细胞因子、趋化因子、生物标记物为病原体如新型冠状病毒COVID-19进入宿主后宿主产生的细胞因子、趋化因子或生物标记物。
进一步优选地，所述的细胞因子为IL1B、IL1RA、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12p70、IL13、IL15、IL17A、IL23、IL25、IL27、IL-33中的一种或多种，所述的化学趋化因子为化学趋化因子CCL1、CCL2、CCL3、CCL11、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10和CXCL11以及嗜酸细胞活化趋化因子中的一种或多种，所述的生物标记物为碱性FGF2、CSF、GCSF、GMCSF、IFN、IFNγ、IP-10、MCP1、MIP1A、MIP1B、PDGFB、RANTES、TNF、TGFβ、TSLP、VEGFA、HO1、CRP、PCT、SAA、vWF、SELP、THBD中的一种或多种。
更为优选地，所述的细胞因子为IL2、IL6、IL10、IL17A、IL13中的一种或两种或三种或四种或全部，所述的生物标记物为HO1、CRP、IP-10、SAA、TNF、MCP1、IFNγ、vWF、SELP、THBD中的一种或两种或三种或四种或更多种。
更为优选地，所述的生物标记物包括HO1；更为优选地，所述的细胞因子包括IL2、IL6、IL10中的一种或多种，所述的生物标记物包括HO1，CRP、IP-10中的一种或两种以及SAA
优选地，所述的宿主核酸为mRNA。
优选地，所述的清洗液还包括无水乙醇。
优选地，所述的三(2-羧乙基)膦盐酸盐在所述的裂解液或所述的清洗液中的浓度为1～20mM。
本发明中，将三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于无水乙醇中，可以进一步保护、稳定已提取的核酸。三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Tris-(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride，TCEP-HCl)：又名TCEP盐酸盐；三(2-羧基)膦盐酸盐；三(2-羧基乙基)膦盐酸盐。TCEP-HCl是纯净、无臭、稳定的三(2-羧乙基)膦晶体，这是一种可高效还原蛋白质和多肽的二硫键的无巯基的化合物。室温稳定，抗空气氧化。水溶性缓冲液，酸液以及碱液中稳定，并且抑制RNase酶活性。
本发明的提取方法可以进一步分离或去除基因组DNA，保留病毒RNA和宿主RNA，采用不同固相-液相组合，特异性提取待分析物质，或特异性排除干扰物质。
本发明的第二方面是提供一种基于待测样本制备用于病原体例如新型冠状病毒COVID-19检测目的的测试液的制备系统，其包括上述方法中采用的收集装置以及提取装置。
本发明的第三方面是提供一种基于待测样本制备用于病原体例如新型冠状病毒COVID-19检测目的的测试液的试剂盒，其包括上述方法中采用的清洗液；和/或，所述的试剂盒还包括上述方法中采用的样本处理液；和/或，所述的试剂盒还包括上述方法中采用的脱氧剂；和/或，所述的试剂盒还包括上述方法中采用的裂解液、吸附液、洗脱液、蛋白酶中的一种或多种。
本发明的第四方面是提供一种上述方法和/或上述制备系统和/或上述试剂盒在提取待测样本中的病原体核酸以及宿主核酸中的应用。
本发明的第五方面是提供一种用于检测新型冠状病毒COVID-19核酸以及宿主核酸的引物，所述的引物包括针对新型冠状病毒COVID-19核酸的引物对、以及针对宿主核酸中的一种或多种的引物对。
优选地，所述的引物对为跨内含子的引物对，可以只扩增拼接完成后的由mRNA转录的cDNA，序列中内含子已被剪除，不扩增基因组DNA(gDNA)，避免了gDNA的干扰。
优选地，所述的针对新型冠状病毒COVID-19核酸的引物对为针对新型冠状病毒COVID-19的E基因的引物对中的一种或多种，和/或针对新型冠状病毒COVID-19的N基因的引物对中的一种或多种，和/或针对新型冠状病毒COVID-19的RdRp基因的引物对，和/或针对新型冠状病毒COVID-19的ORFab基因的引物对；其中，
所述的针对E基因的引物对的序列如SEQ ID NO.119～124所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对N基因的引物对的序列如SEQ ID NO.27～28、31～36、115～118所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对RdRp基因的引物对的序列如SEQ ID NO.113～114、125～126所示的引物对中的一对或两对；
所述的针对ORFab基因的引物对的序列如SEQ ID NO.137～142所示的引物对中的一对、多对或全部。
优选地，所述的针对宿主核酸的引物对包括针对IP-10的引物对、针对IL6的引物对、针对IL2的引物对、针对IL17A的引物对、针对IL13的引物对、针对TNF的引物对、针对MCP1的引物对、针对HO1的引物对、针对IFNγ的引物对、针对vWF的引物对、针对SELP的引物对、针对THBD的引物对、针对SAA的引物对、针对CRP的引物对中的一种或多种；其中，
所述的针对IP10的引物对的序列如SEQ ID NO.1～8所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对IL6的引物对的序列如SEQ ID NO.9～24所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对IL2的引物对的序列如SEQ ID NO.37～46所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对IL17A的引物对的序列如SEQ ID NO.47～50所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对IL13的引物对的序列如SEQ ID NO.51～54所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对TNF的引物对的序列如SEQ ID NO.55～64所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对MCP1的引物对的序列如SEQ ID NO.65～68所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对HO1的引物对的序列如SEQ ID NO.69～80所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对IFNγ的引物对的序列如SEQ ID NO.81～84所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对vWF的引物对的序列如SEQ ID NO.85～90所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对SELP的引物对的序列如SEQ ID NO.91～96所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对THBD的引物对的序列如SEQ ID NO.97～102所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对SAA的引物对的序列如SEQ ID NO.103～106所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对CRP的引物对的序列如SEQ ID NO.107～112所示的引物对中的一对、多对或全部。
优选地，所述引物还包括针对宿主管家基因的引物对，所述引物对的序列如SEQID NO.29～30、127～136、143～144所示的引物对中的一对、多对或全部。针对宿主管家基因的引物对为针对健康宿主和感染宿主均具有的基因的引物对，该引物对可以用作内标，其中，SEQ ID NO.29～30以及SEQ ID NO.129～136所示的引物对为针对RNA聚合酶2设计的引物对，SEQ ID NO.127～128是针对Beta微球蛋白-2设计的引物对。
上述引物对序列中，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2为第1引物对，SEQ ID NO：3、SEQID NO：4为第2对，SEQ ID NO：5、EQID NO：6为第3引物对，SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8为第4引物对，……，以此类推。其中单数为上游引物，双数为下游引物，引物的书写顺序自5’端至3’端。
本发明的第六方面提供一种核酸检测试剂盒，包括上述引物，和/或用于制备测试液的试剂盒。
本发明的第七方面提供一种核酸检测系统，包括上述核酸检测试剂盒，和/或用于制备测试液的系统。
本发明的第八方面是提供一种核酸检测方法，采用上述引物分别或同时对采用上述方法、或上述系统、或上述试剂盒提取得到的包含病原体核酸以及宿主核酸的测试液进行定量PCR检测。
本发明中，PCR方法包括经典PCR、qPCR、RT-PCR。本发明除了采用PCR进行核酸检测外，还可以通过测序等方法进行核酸物质的检测。
发明人通过采用本发明的技术提取了唾液和尿液等体液样本中的核酸，并进一步检测到了病毒RNA以及宿主RNA，其中病毒RNA包括新型冠状病毒COVID-19；宿主RNA(mRNA)包括细胞因子(Cytokines)：IL2、IL6、IL10、HO1(血红素氧化酶1，heme oxygenase 1，HMOX1)、CRP、IP-10、SAA(Serum Amyloid A)、IL17A、IL13、TNF、MCP1、IFNγ、vWF、SELP、THBD等的核酸。由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的方法可以浓缩和提取大体积样本中的核酸，分离或去除基因组DNA(genomic DNA)，保留病原体核酸和宿主核酸。进一步地，通过逆转录反应和PCR反应，从而可以同时检测病原体RNA和多种宿主RNA，从而可以提高病原体检测的灵敏度以及阳性率，从而有助于早期诊断并分期，及时指导治疗方案和判定临床疗效和预后；并且，本发明的方法可以避免医护人员暴露在交叉感染的环境中。
附图说明
图1为具体实施方式的样本收集器的结构示意图；
图2为具体实施方式的样本收集器与样本贮存容器相连接时的结构示意图；
图3为具体实施方式的样本收集器的连接部的剖视图；
图4为一种实施方式的样本收集器的俯视图；
图5为另一种实施方式的样本收集器的俯视图。
具体实施方式
下面结合具体的实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但本发明不只限于下面的实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
本实施例中基于待测样本制备用于病原体检测目的的测试液的装置包括用于收集待测样本的收集装置，以及用于提取核酸的提取装置。
其中，收集装置包括样本收集器1、与样本收集器1通过螺纹配合实现相可拆卸地连接的样本贮存容器2。样本收集器1的结构如图1至5所示，其包括与样本贮存容器2相可拆卸地连接的连接部11、一端与连接部11相固定连接或一体成型且具有开口的收集部12，收集部12的开口处的横截面积大于收集部12与连接部11相连接处的横截面积，优选地，收集部12呈倒置的圆台形，收集部12的开口处的横截面呈圆形(如图4所示)或椭圆形(如图5所示)，以配合体表形状。
如图3所示，连接部11包括与收集部12的下部相固定连接或一体成型且具有与收集部12相连通的内部通道的第一部分111、固定设置在第一部分111的外部且内壁与第一部分111的外壁之间具有容纳空间的第二部分112，第二部分112的内壁上形成有内螺纹113。
样本贮存容器2的口部外壁上形成有外螺纹，当样本收集器1与样本贮存容器2相连接时，第二部分112的内螺纹113与样本贮存容器2的外螺纹相配合，且样本贮存容器2的内壁与第一部分111的外壁之间具有间隙(如图2所示)从而可以避免样本贮存容器2与样本收集器1的连接处被污染。
样本贮存容器2可以采用现有技术中的离心管等能够容纳液体的容器，本实施例中样本贮存容器采用离心管，例如50mL离心管(29cm*117cm)，使用时，将样本收集器的连接部11与样本贮存容器2相固定，然后收集待测样本，如唾液、尿液、漱口水等；待收集完毕后，旋下样本收集器1，盖上样本贮存容器2的盖子即可。
优选地，可以在样本贮存容器中加入或者预存样本处理液以灭活、保存、消化或释放样本中的核酸。该样本处理液呈液态或固态，固态时可以为(冻)干粉状态。样本处理液可以采用现有的样本裂解液、样本保存液或者样本灭活液，优选采用成分中含有曲拉通(Triton X-100)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐以及Tris-HCl缓冲液的样本处理液，其中，三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度优选为1～20mM。
通过采用该收集装置可以实现待检人员自行采集样本，避免样本采集过程中的交叉感染。
提取装置包括：
限定内部体积的容器；
用于容器的可移除帽体，帽体具有面向容器的内部体积的内侧和背向内部体积的外侧，帽体包括在内侧和外侧之间连通的通气器端口和在内侧和外侧之间连通的样品连接端口，样品连接端口包括第一互锁部件，第一互锁部件用于可释放地将样品连接端口锁定到配合的第二互锁部件，帽体的内侧包括与样品连接端口流体连通的连接接口；
过滤器柱，其适于可移除地附接到容器帽体的所述连接接口，过滤器柱具有开放的第一端、开放的第二端和在其之间的容纳用于收集核酸的基片的内部通道；
运输容纳器，其具有开放的端并限定适于容纳过滤器柱的体积，运输容纳器适于可释放地接合过滤器柱用于将其从容器帽体的连接接口拆卸，运输容纳器还包括用于暂时地将过滤器柱密封在运输容纳器内的可移除盖。
该提取装置(Manually-Operated Extraction System，简称MOES)的详细结构参见专利CN201480042043.4用于收集核酸的样品的系统和方法的说明书0035～0067段，以及附图1至附图6所示。该专利中涉及到的结构以及所采用的试剂和方法，只要与本发明的方案没有冲突，均可适用于本发明。
在专利CN201480042043.4公开的内容基础上，本实施例还包括脱氧剂或抗氧化剂(antioxidants)，以控制环境中的氧含量低于1％，优选低于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％等，例如氧含量控制为0.01～1％，进一步为0.01％～0.1％，以进一步保护、稳定提取到的核酸，其中，环境包括提取开始前、提取过程中或者提取结束后的环境。本实施例中，主要通过控制提取结束后的环境中的氧含量，即使提取到的提取物处于氧含量低的环境中，具体可以将脱氧剂加入或者预存在运输容纳器内。
其中，脱氧剂(吸氧剂)(oxygen scavenger-Also known as an oxygenabsorbent)：又名去氧剂、吸氧剂，是可吸收氧气、减缓保护对象氧化作用的添加剂。它是一组易与游离氧或溶解氧起反应的化学混合物，把它装在有一定透气度和强度的密封袋中，如同干燥剂袋那样，能除去密封环境中残留的氧，防止保护对象因氧化变色、变质和油脂酸败，也对霉菌、好氧细菌和有害生物的生长有抑制作用。
通过本实施例的收集装置和提取装置，能够实现大样本的收集，例如样本收集量为1～40mL，并可以对大体积样本进行有效浓缩至100μL及以下，例如60μL等；也可完成来自多人小量样品的合并混合富集，例如可以将100～200份鼻/咽拭子合并混合富集，从而可以用于人群流行病学调查，节省人力成本和检测成本。
实施例1
本实施例的测试液的制备以及PCR检测所用的材料和具体步骤如下：
一.试剂组分
1.收集提取试剂
1a.裂解液Lysis Buffer(LB)。
1b.吸附液Binding Buffer(BB)。
1c.清洗液Washing Buffer(WB)：三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于无水乙醇中，三(2-羧乙基)膦盐酸盐浓度为1～20mM。
1d.洗脱液Elution Buffer(EB)。
1e.Proteinase K。-20℃保存。
2.RT-qPCR检测
涉及RNA定量核酸PCR检测，样本有一步法RT-qPCR或两步法RT-qPCR。前者在同一试管中，合并RT和PCR反应，使用目标引物进行RT反应，产生特定的cDNA片段，继而利用相同特异性引物对进行PCR扩增反应，反应过程不需开试管盖，极大减少污染。后者先使用随机引物进行RT反应，将提取物中的RNA转换成相应的cDNA，然后加入一对或多对特异性引物，对其中的特异性目标cDNA(靶核酸)进行特异性扩增和定量检测。
通常有两种方法实时定量监测PCR产物：1.采用非特异性荧光染料如SYBR Green嵌合到PCR产物双链DNA片段中产生荧光；2.荧光分子和淬灭基团标记的核酸序列特异性探针。在PCR反应过程中，荧光探针与特定PCR产物序列互补并水解，释放淬灭基团，从而产生荧光。
本发明实施举例采用两步法RT-qPCR，即RT反应使用Moloney Murine LeukemiaVirus Reverse Transcriptase(M-MLV RT，M1701，Promega,WI,USA)，然后进行SYBR GreenqPCR(QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kit，Cat No.208054，QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)。实际应用中，一步法RT-qPCR或2步法RT-qPCR常可以根据具体需要选择其一，荧光嵌合染料法和核酸序列特异性探针法选择亦然。本发明实施举例暂未列入特异性探针。
二.自备设备和材料
1.裂解管：50ml离心管
2.洗脱液收集管：1.5ml微量离心管
3. 30ml一次性注射器(螺口接头)
4. 5-10ml一次性注射器(自备)
5.高速微量离心机(≥12000G)
6. 60℃水浴箱或干热模块
7.无水乙醇(自备)
三.样本来源
收集炎症和感染病人的鼻咽拭子，离心10分钟(3000g)，吸取上清液2-20ml于预存有样本处理液的样本贮存容器中，-20℃冰冻保存。选取经抗炎治疗好转或治愈的患者样本，并在其中加入新型冠状病毒假病毒作为后续实验用样本。
四.操作步骤
1.体液游离核酸提取：
A.将冻存的实验用样本室温解冻，高速离心3分钟(12000g)，留上清备用。
B.吸取LB 1.9ml至50ml离心管(裂解管)，加入经高速离心后的体液2ml，充分混匀。加入100μlProteinase K溶液，再次充分混匀。
C.盖上裂解管，置于60℃水浴箱(或干热模块保温60℃)，30分钟。移出裂解管，室温下放置5-10分钟冷却。
D.加入BB 8ml，旋涡震荡30秒，静置3-5分钟。
E.将30ml注射器推杆拔出后与提取装置Luer锁紧套口紧密连接，垂直放置。转移裂解液至注射器，插入注射器推杆，缓慢均匀施压，将裂解液注入提取装置。注意观察液体流出吸附柱时应成间断滴液，控制整个推送过程在90秒至120秒之间。推入残余空气，排除残余液体。
F.吸入WB 4ml至10ml注射器，连接Luer锁紧套口，推入WB通过提取装置，清洗吸附柱。推入残余空气，排除残余液体。
G.吸入4ml无水酒精(Ethanol，自备)，连接Luer锁紧套口，推入无水乙醇(Ethanol)通过提取装置，清洗吸附柱。推入空气，排除残余液体。
H.反时针旋转取下吸附柱，盖上吸附柱盖，置于1.5ml微离心管，高速离心3分钟(12000g)，排除残余乙醇。移去吸附柱盖，室温放置5-10分钟，让残余乙醇挥发。
I.将吸附有核酸的吸附柱密封保存在运输容纳器内；待需要使用时进行下述步骤。
J.将吸附柱置于干净1.5ml微离心管，加60μl洗脱液(EB)于吸附柱内吸附膜上，盖上吸附柱盖，室温静置5分钟。
k.将含有吸附柱的离心管高速离心3分钟(12000g)，收集洗脱液。含有分离出的游离核酸的洗脱液，可作为模板，直接用于PCR，qPCR或其它分子检测，或冰冻保存待用。
2.游离核酸DNA的定量PCR检测：
2.1去DNA二级结构(由于模板中DNA二级结构对PCR扩增有影响，所以需除去)
将0.5μg随机引物(上海生工合成，6碱基随机引物(5，-NNN NNN-3，)；9碱基随机引物(5，-NNN NNN NNN-3，))以及15-20ul的RNA模板(上一步洗脱液)于4℃混合至总体积20μl，然后进行PCR扩增，扩增程序为70℃、5mins；扩增产物用于下一步试验，也可于4℃短期(1-2d)保存。
逆转录(25μl反应体系)
MMLV酶系统：Promega M170，简称MMLV；
Rnase inhibitor：Rnasin N2525，简称RNasin；
反应体系如下：
PCR扩增，程序:42℃，60mins。
产物4℃短期(5-7d)保存。
2.2.定量PCR(采用凯杰荧光定量PCR MIX)
定量PCR检测系通过扩增特有的片段，同时通过荧光染料SYBR Green嵌合入扩增产物，产生激发波长480nm，辐射波长520nm荧光信号，定量检测扩增产物，同时通过融解曲线分析确定特异性扩增产物。
A.2.0x qPCR反应液：室温下旋涡震荡，充分解冻反应液。取适量反应液，比如对20μl PCR总体积，取10μl反应液，加入引物对2.0μl，充分混匀，加入pcr反应管。
B.吸取洗脱液(模板)8.0μl加入PCR反应管，盖上管盖，充分混匀，离心至反应液聚于管底。置PCR反应管于qPCR仪反应模块。
C.PCR程序设定:
(1).激发波长480nm，辐射波长520nm，或选用适合HAM或SYBR Green的预设波长。反应体积20μl。
(2).热盖105℃，首轮PCR程序a.95℃3分钟；b.95°℃10秒；c.60℃10秒；d.72℃30秒；返回重复b.到d.44个循环；44个循环完成后，作融解曲线分析，65-95℃逐步升温(<0.5℃/步)。
本实施例中各引物对及检测结果见表1。
表1
实施例2
本实施例的方法与实施例1基本相同，不同之处如下：
1.样本来源如下表2，各样本中均混有新型冠状病毒假病毒：
表2
| 序号 | 标本 | 体积 | 数量 |
| A | 血浆(血清) | 2ml | 2 |
| B | 血浆(血清) | 2ml | 2 |
| C | 多份鼻咽拭子的混合 | 2ml | 2 |
| D | 尿液 | 8ml | 2 |
2.提取方法的不同之处如下：
样本A的处理方法与实施例1相同。
样本B和样本C分别先用第一吸附液按照与实施例1相同的方法进行游离核酸提取，获得第一次的洗脱液用于检测(该洗脱液对应结果记为第一次过柱)，并收集步骤E中裂解液过柱流出的液体，在该液体中加入第二吸附液，按照实施例1相同的方法进行过柱以提取游离核酸(该洗脱液对应结果记为第二次过柱)。其中，第一吸附液的主要成分为无水乙醇，用量为2mL；第二吸附液的主要成分为无水乙醇和异硫氰酸胍，用量为7mL。
样本D的处理方法与样本B或样本C的处理方法基本相同，不同之处在于吸附液的添加体积为样本B或样本C的处理方法中添加体积的4倍。
本实施例中各引物对见表3，采用各引物对分别对上述各样本的各洗脱液的检测结果见表4。
表3
表4
从表4可见，不同提取方法对不同类型样本均可行，通过改变吸附液各成分的比例，可以控制目标片段的获取量以适应不同检测要求，M11、K11、P可以作为内标标记物，上述各引物均可行。
实施例3
本实施例采用与实施例2中不同患者来源的样本，按照实施例2的方法进行样本中游离核酸的提取，并且，样本A和样本B中不添加新型冠状病毒假病毒。各引物及实验结果见表5。
表5
实施例4
本实施例的方法与实施例2中样本C的处理方法基本相同，样本经过两步提取(两次过柱)，样本及所用试剂如下表6：
表6
| 序号 | 标本 | 体积 | 数量 | BB | 蛋白酶K | 新冠假病毒标准品 |
| A | 唾液 | 1.8ml | 2 | 2.2ml | 0.2ml | 200ul |
| B | 唾液 | 1.8ml | 2 | 2.2ml | 0.2ml | 200ul |
| C | 唾液 | 1.8ml | 2 | 2.2ml | 0.2ml | 200ul |
| D | 唾液 | 1.8ml | 2 | 2.2ml | 0.2ml | 200ul |
各引物的检测结果见表7，其中，表7中样本编号的意思如下，以A2-1为例，其中A指表6中的标本对应的序号，2是指第二份该序号的标本，-1是指第一次过柱收集的测试液，因此，A2-1是指第二份A样本的第一次过柱收集的测试液对应的检测结果。
表7
其中，RdRp-2的上游引物为gtgaratggtcatgtgtggcgg(SEQ ID NO.125)，下游引物为caratgttaaasacactattagcata(SEQ ID NO.126)；
欧盟E的上游引物为acaggtacgttaatagttaatagcgt(SEQ ID NO.123)，下游引物为atattgcagcagtacgcacaca(SEQ ID NO.124)。
实施例5：
磁珠提取试剂盒/PCR新冠反应试剂盒(达安/圣湘)与OBI产品(MOES)灵敏度比较
达安/圣湘：提取200ul咽拭子，洗脱物约50ul，RT-qPCR时反应体系25ul，其中洗脱物(模板)使用5ul。
OBI产品(MOES)的提取与检测同实施例4。
检测结果见表8。
表8
从表7可见，本申请的OBI产品的N gene的ct值为31-33，内标ct值为21-23，E基因ct值为27-31；而达安和圣湘的相应Ct值比本申请高3～4，因此，OBI的灵敏度比达安/圣湘高16倍以上。
实施例6
本实施例对不同样本按照与实施例2基本相同的方法进行处理并进行检测，各序列见表9，部分序列见表13，各序列检测结果分别见表10至表16。
表9
表10
表11
表12
上述表10至表11中的样本编号代表的样本分别如下：T2-1为血清样本第一次过柱收集的测试液的检测结果，T4-1为尿液样本第一次过柱收集的测试液的检测结果，RT1为血清样本的检测结果，RT2为血清样本的检测结果，RT3为鼻咽拭子样本的检测结果，T1-2为血样样本第二次过柱收集的测试液的检测结果。
表13
表14
表15
上述表13至表15中的1号样本为血液，2号样本为尿液。
表16
| 引物对名称 | 样本1：咽拭子+假病毒(Ct) | 样本2：咽拭子+假病毒(Ct) |
| ORFab-2 | 26.66 | 24.16 |
| ORFab-3 | 27.83 | 23.03 |
现有技术与本实施例的技术在病毒采集和病毒RNA提取方面的比较，见表17。
表17
优势：1.利用MOES具有提取较大体积体液标本特点，用较大体积(10-40ml)水或生理盐水，咽喉部位漱口，并与唾液合并到一起提取RNA。2.跨内含子引物设计，只扩增拼接完成后的由mRNA转录的cDNA，序列中内含子已被剪除，不扩增基因组DNA(gDNA),避免了gDNA干扰。由此达到了测试灵敏度提高，特异性增强的总体效果。
以上对本发明做了详尽的描述，目的在于让本领域内的技术人员了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州同力生物医药有限公司
<120> 一种用于制备病原体检测目的的测试液的方法、系统、试剂盒、及检测引物和方法
<150> CN2020108892163
<151> 2020-08-28
<160> 144
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 1
gccttatctt tctgactct 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 2
taaagacctt ggattaaca 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 3
ctgccttatc tttctgact 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 4
taaagacctt ggattaaca 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 5
catcaagaat ttactgaaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 6
taactgcaaa ctaagaacaa 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 7
caagaattta ctgaaagca 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 8
agaacaatta tggcttgac 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 9
ccaggagccc agctatgaac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
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<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
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acatcctcga cggcatctca 20
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<212> DNA
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cctctttgct gctttcacac a 21
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<212> DNA
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aacaacctga accttccaaa ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 14
cagtgatgat tttcaccagg ca 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 15
gcccagctat gaactccttc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 16
gcggctacat ctttggaatc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 18
gcggctacat ctttggaatc t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
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ccaggagccc agctatgaac 20
<210> 20
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<212> DNA
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gggcggctac atctttgga 19
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<212> DNA
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ccagagctgt gcagatgagt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
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gcatttgtgg ttgggtcagg 20
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<211> 21
<212> DNA
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gagcccagct atgaactcct t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 25
tacatcctcg acggcatctc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 26
gcctctttgc tgctttcaca c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
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ttcggaagag acaggtacgt t 21
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<212> DNA
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cacacaatcg atgcgcagta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
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ggtcatgtgt ggcggttcac ta 22
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<211> 22
<212> DNA
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gcataagcag ttgtggcatc tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 33
caggcacagg tgttcttact ga 22
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<212> DNA
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caatgctgca atcgtgctac 20
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tgccgcctct gctcccttct g 21
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<212> DNA
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acagtgcacc tacttcaagt t 21
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tcctggtgag tttgggattc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
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ccaaactcac caggatgctc ac 22
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ccagaggttt gagttcttct tc 22
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<212> DNA
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gacccaggga cttaatcagc a 21
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tgtctcatca gcatattcac aca 23
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ctcctgggaa gacctcattg 20
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<212> DNA
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atggtatgga gcatcaacct g 21
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cttctgcctg ctgcactttg 20
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agagggctga ttagagagag gt 22
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gctacaggct tgtcactcgg 20
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gacctctctc taatcagcc 19
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ggcttgtcac tcggggttc 19
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agcctgtagc ccatgttgta g 21
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<212> DNA
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gctcatagca gccaccttca t 21
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acatagatgt ggtacaggga gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 87
agtttcgcca aggctttcat t 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 88
ctgacacctg agtgagacga g 21
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 89
cctccagttt cccagcttct ta 22
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 90
ttccatactg cagcactgac a 21
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 91
gacactggtc tgcaccctt 19
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 92
gactctccag cggctcaca 19
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 93
ttgactctgg acactggtct g 21
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 94
aatccatgct tccgtggaca 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 95
gctgcattga ctctggacac 20
<210> 96
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 96
gactctccag cggctcaca 19
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 97
acgtggatga ctgcatactg g 21
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 98
gtcgtagtta gggtagcagt gg 22
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 99
acgtggatga ctgcatactg g 21
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 100
caggtcgtag ttagggtagc a 21
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 101
ggacgtggat gactgcatac t 21
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 102
gaagccaccc tgtgtgttga 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 103
gggaactatg atgctgccaa 20
<210> 104
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 104
ccgcaccatg gccaaagaa 19
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 105
ccaattacat cggctcagac a 21
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 106
tctggatatt ctctctggca tc 22
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 107
ggtcttgacc agcctctctc 20
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 108
tccgactctt tgggaaacac a 21
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 109
ttcactgtgt gcctccactt c 21
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 110
cgccttgcac ttcatacttc a 21
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 111
agcctctcaa agccttcact 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 112
tgaacacttc gccttgcact 20
<210> 113
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 113
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 114
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 115
ctttgctgct gcttgacaga 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 116
gccttgttgt tgttggcctt 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 117
aactcaagcc ttaccgcaga 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 118
tgcagcagga agaagagtca 20
<210> 119
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 119
tacactagcc atccttact 19
<210> 120
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 120
gaaggtttta caagactca 19
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 121
gttacactag ccatccttac 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 122
gaaggtttta caagactcac 20
<210> 123
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 123
acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26
<210> 124
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 124
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 125
gtgaratggt catgtgtggc gg 22
<210> 126
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 126
caratgttaa asacactatt agcata 26
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 127
cgcgctactc tctctttctg g 21
<210> 128
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 128
agtcaacttc aatgtcggat gg 22
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 129
catgtgtggc ggttcactat 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 130
tgcattaaca ttggccgtga 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 131
ctacatgcac cagcaactgt 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 132
cacctgtgcc tgttaaacca 20
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 133
caatgctgca atcgtgctac 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 134
gttgcgacta cgtgatgagg 20
<210> 135
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 135
gagatctctc aacgtgctca g 21
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 136
cttggcataa aacaggttca gaa 23
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 137
aaataccagt ggcttaccgc a 21
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 138
gccaccagct cctttattac c 21
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 139
ggtagcagaa ctcgaaggca 20
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 140
atgagggaca aggacaccaa g 21
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 141
tccctgactt aaatggtgat gtg 23
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 142
tcttaaaaga gggtgtgtag tgt 23
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 143
gcctgctgaa aatgactgaa t 21
<210> 144
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Rengongxulie)
<400> 144
attagctgta tcgtcaaggc ac 22
Claims (15)
1.一种基于待测样本制备用于病原体例如新型冠状病毒COVID-19检测目的的测试液的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
采用裂解液对待测样本进行裂解处理以释放出样本中包含的核酸，获得包含核酸的裂解液，所述核酸包括宿主核酸，或者当所述待测样本包含病原体时，所述核酸还包含病原体核酸；
将所述含有核酸的裂解液通过核酸提取装置进行提取，获得提取物，所述提取物包含宿主核酸，或者当所述待测样本包含病原体时，所述提取物中还包含病原体核酸；
由所述提取物制备所述用于病毒检测目的的测试液；
所述方法还包括选自如下至少一项的步骤：
A.控制所述提取物所处的环境，以稳定所述提取物中的宿主核酸，使所述测试液中包含有所述宿主核酸；
B.使提取过程中所采用的裂解液和/或清洗液中包含三(2-羧乙基)膦盐酸盐；
C.控制所述待测样本的体积为1～40mL；
D.采用封闭式核酸提取装置进行所述提取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述A中，控制所述提取物所处的环境中的氧含量低于0.01～1％，进一步地，可通过在环境中加入脱氧剂控制氧含量；再进一步地，可在提取开始前、提取过程中或提取结束后，在提取物所处环境中加入脱氧剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述提取包括将所述含有核酸的裂解液通过过滤器柱进行吸附，之后通入所述清洗液进行清洗，然后采用洗脱液对过滤器柱进行洗脱得到测试液，其中，至少所述吸附、清洗在封闭环境下进行。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述的提取装置包括：
限定内部体积的容器；
用于所述容器的可移除帽体，所述帽体具有面向所述容器的所述内部体积的内侧和背向所述内部体积的外侧，所述帽体包括在所述内侧和所述外侧之间连通的通气器端口和在所述内侧和所述外侧之间连通的样品连接端口，所述样品连接端口包括第一互锁部件，所述第一互锁部件用于可释放地将所述样品连接端口锁定到配合的第二互锁部件，所述帽体的所述内侧包括与所述样品连接端口流体连通的连接接口；
过滤器柱，其适于可移除地附接到所述容器帽体的所述连接接口，所述过滤器柱具有开放的第一端、开放的第二端和在其之间的容纳用于收集所述核酸的基片的内部通道；
运输容纳器，其具有开放的端并限定适于容纳所述过滤器柱的体积，所述运输容纳器适于可释放地接合所述过滤器柱用于将其从所述容器帽体的所述连接接口拆卸，所述运输容纳器还包括用于暂时地将所述过滤器柱密封在所述运输容纳器内的可移除盖；
优选地，所述的提取装置还包括用于加入或者预存在所述的容器和/或所述的运输容纳器内的脱氧剂。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：使所述含有核酸的裂解液通过经处理后的过滤器柱进行核酸的吸附，或者使所述含有核酸的裂解液与吸附液混合后通过过滤器柱进行核酸的吸附。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述的方法还包括采用样本收集装置收集所述待测样本的步骤，所述的收集装置包括样本收集器、与所述的样本收集器相可拆卸地连接的样本贮存容器；
进一步优选地，所述的样本收集器包括与所述的样本贮存容器相可拆卸地连接的连接部、一端与所述的连接部相固定连接或一体成型且具有开口的收集部，所述的收集部的开口处的横截面积大于所述的收集部与所述的连接部相连接处的横截面积；
更为优选地，所述的收集部的开口处的横截面呈圆形或椭圆形；
进一步优选地，所述的样本收集器与所述的样本贮存容器通过螺纹配合连接；
进一步优选地，所述的连接部包括与所述的收集部的下部相固定连接或一体成型且具有与所述的收集部相连通的内部通道的第一部分、固定设置在所述的第一部分的外部且内壁与所述的第一部分的外壁之间具有容纳空间的第二部分，所述的第二部分的内壁上形成有内螺纹；当所述的样本收集器与所述的样本贮存容器相连接时，所述的样本贮存容器与所述的第二部分相连接且所述的样本贮存容器的内壁与所述的第一部分的外壁之间形成有间隙。
进一步优选地，所述的收集装置还包括用于加入或预存在所述的样本贮存容器中以灭活、保存、消化或释放样本中的核酸的样本处理液；
更为优选地，所述的样本处理液呈液态或固态；
更进一步优选地，所述的样本处理液呈干粉状态。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于：所述的待测样本包括但不限于血液、体液、分泌物、排泄物中的一种或多种；优选地，所述待测样本为唾液、尿液、鼻咽拭子、口咽拭子、支气管/肺部灌洗液、脑脊液、淋巴液、腹水、羊水、腹膜透析液中的一种或多种；和/或，
控制所述待测样本的体积为2～20mL；和/或，
所述的宿主核酸包括但不限于细胞因子、趋化因子、生物标记物中的一种或多种的核酸；优选地，所述的细胞因子、趋化因子、生物标记物为病原体例如新型冠状病毒COVID-19进入宿主后宿主产生的细胞因子、趋化因子或生物标记物；优选地，所述的细胞因子为IL1B、IL1RA、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12p70、IL13、IL15、IL17A、IL23、IL25、IL27、IL-33中的一种或多种，所述的化学趋化因子为化学趋化因子CCL1、CCL2、CCL3、CCL11、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10和CXCL11以及嗜酸细胞活化趋化因子中的一种或多种，所述的生物标记物为碱性FGF2、CSF、GCSF、GMCSF、IFN、IFNγ、IP-10、MCP1、MIP1A、MIP1B、PDGFB、RANTES、TNF、TGFβ、TSLP、VEGFA、HO1、CRP、PCT、SAA、vWF、SELP、THBD中的一种或多种；进一步优选地，所述的细胞因子为IL2、IL6、IL10、IL17A、IL13中的一种或两种或三种或四种或全部，所述的生物标记物为HO1、CRP、IP-10、SAA、TNF、MCP1、IFNγ、vWF、SELP、THBD中的一种或两种或三种或四种或更多种；进一步优选地，所述的生物标记物包括HO1；更为优选地，所述的细胞因子包括IL2、IL6、IL10中的一种或多种，所述的生物标记物包括HO1，CRP、IP-10中的一种或两种以及SAA；和/或，
所述的宿主核酸包括游离核酸，及RNA、mRNA和DNA；和/或，
所述的清洗液还包括无水乙醇；和/或，
所述的三(2-羧乙基)膦盐酸盐在所述的裂解液或所述的清洗液中的浓度为1～20mM。
8.一种基于待测样本制备用于病原体例如新型冠状病毒COVID-19检测目的的测试液的制备系统，其特征在于：其包括权利要求4或6所述的方法中采用的收集装置以及提取装置。
9.一种基于待测样本制备用于病原体例如新型冠状病毒COVID-19检测目的的测试液的试剂盒，其特征在于：其包括权利要求1至7中任一项所述的方法中采用的清洗液；和/或，所述的试剂盒还包括权利要求1至7中任一项所述的方法中采用的样本处理液；和/或，所述的试剂盒还包括权利要求1至7中任一项所述的方法中采用的脱氧剂；和/或，所述的试剂盒还包括权利要求1至7中任一项所述的方法中采用的裂解液、吸附液、洗脱液、蛋白酶中的一种或多种。
10.一种如权利要求1至7中任一项所述的方法和/或权利要求8所述的制备系统和/或权利要求9所述的试剂盒在提取待测样本中的病原体核酸以及宿主核酸中的应用；优选地，所述病原体包括病毒、细菌、真菌、寄生虫中的一种或多种，进一步优选地，寄生虫为血吸虫、肝吸虫、肺吸虫、包虫、绦虫、脑囊虫、土源性线虫中的一种或多种；所述宿主包括人或其它哺乳类动物。
11.一种用于检测新型冠状病毒COVID-19核酸以及宿主核酸的引物，其特征在于：所述的引物包括针对新型冠状病毒COVID-19核酸的引物对、以及针对宿主核酸中的一种或多种的引物对；优选地，所述的引物对为跨内含子的引物对以避免基因组DNA的干扰。
12.根据权利要求11所述的引物，其特征在于：所述的宿主核酸包括但不限于细胞因子、趋化因子、生物标记物中的一种或多种的核酸；优选地，所述的宿主核酸为mRNA；优选地，所述的细胞因子为IL1B、IL1RA、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12p70、IL13、IL15、IL17A、IL23、IL25、IL27、IL-33中的一种或多种，所述的化学趋化因子为化学趋化因子CCL1、CCL2、CCL3、CCL11、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10和CXCL11以及嗜酸细胞活化趋化因子中的一种或多种，所述的生物标记物为碱性FGF2、CSF、GCSF、GMCSF、IFN、IFNγ、IP-10、MCP1、MIP1A、MIP1B、PDGFB、RANTES、TNF、TGFβ、TSLP、VEGFA、HO1、CRP、PCT、SAA、vWF、SELP、THBD中的一种或多种；进一步优选地，所述的细胞因子为IL2、IL6、IL10、IL17A、IL13中的一种或两种或三种或四种或全部，所述的生物标记物为HO1、CRP、IP-10、SAA、TNF、MCP1、IFNγ、vWF、SELP、THBD中的一种或两种或三种或四种或更多种；进一步优选地，所述的生物标记物包括HO1；更为优选地，所述的细胞因子包括IL2、IL6、IL10中的一种或多种，所述的生物标记物包括HO1，CRP、IP-10中的一种或两种以及SAA；或者，
所述的针对新型冠状病毒COVID-19核酸的引物对为针对新型冠状病毒COVID-19的E基因的引物对中的一种或多种，和/或针对新型冠状病毒COVID-19的N基因的引物对中的一种或多种，和/或针对新型冠状病毒COVID-19的RdRp基因的引物对，和/或针对新型冠状病毒COVID-19的ORFab基因的引物对；
所述的针对E基因的引物对的序列如SEQ ID NO.119～124所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对N基因的引物对的序列如SEQ ID NO.27～28、31～36、115～118所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对RdRp基因的引物对的序列如SEQ ID NO.113～114、125～126所示的引物对中的一对或两对；
所述的针对ORFab基因的引物对的序列如SEQ ID NO.137～142所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对宿主核酸的引物对包括针对IP-10的引物对、针对IL6的引物对、针对IL2的引物对、针对IL17A的引物对、针对IL13的引物对、针对TNF的引物对、针对MCP1的引物对、针对HO1的引物对、针对IFNγ的引物对、针对vWF的引物对、针对SELP的引物对、针对THBD的引物对、针对SAA的引物对、针对CRP的引物对中的一种或多种；
所述的针对IP10的引物对的序列如SEQ ID NO.1～8所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对IL6的引物对的序列如SEQ ID NO.9～24所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对IL2的引物对的序列如SEQ ID NO.37～46所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对IL17A的引物对的序列如SEQ ID NO.47～50所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对IL13的引物对的序列如SEQ ID NO.51～54所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对TNF的引物对的序列如SEQ ID NO.55～64所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对MCP1的引物对的序列如SEQ ID NO.65～68所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对HO1的引物对的序列如SEQ ID NO.69～80所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对IFNγ的引物对的序列如SEQ ID NO.81～84所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对vWF的引物对的序列如SEQ ID NO.85～90所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对SELP的引物对的序列如SEQ ID NO.91～96所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对THBD的引物对的序列如SEQ ID NO.97～102所示的引物对中的一对、多对或全部；
所述的针对SAA的引物对的序列如SEQ ID NO.103～106所示的引物对中的一对或全部；
所述的针对CRP的引物对的序列如SEQ ID NO.107～112所示的引物对中的一对、多对或全部。
13.根据权利要求11所述的引物，其特征在于：所述引物还包括针对宿主管家基因的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.29～30、127～136、143～144所示的引物对中的一对、多对或全部。
14.一种核酸检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求11至13中任一项所述的引物，和/或权利要求9所述的试剂盒。
15.一种核酸检测系统，其特征在于：包括如权利要求14所述的试剂盒，和/或权利要求8所述的系统。
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