CN111363851A - 一种检测新型冠状病毒的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医疗技术领域，具体地涉及一种检测新型冠状病毒的方法和试剂盒。试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1～6所示的引物对和探针。本发明发数字PCR检测试剂盒检测的灵敏度最低可达到50copies/ml，且实现对微量病原体核酸的精确定量，能够从大量背景信号中检测到病原体核酸，摆脱了对标准曲线的依赖，无需公式换算，实现病原体拷贝的绝对定量。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，具体地涉及一种用于新型冠状病毒检测的数字PCR检测体系引物组，及包括该引物组的数字PCR检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV)是2019年12月在人体中发现的一种新型的冠状病毒且有极强传染性和传播力，临床表现为发热、乏力等全身症状，伴有干咳，呼吸困难等，可迅速发展为重症肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征等。冠状病毒主要通过直接接触分泌物或经气溶胶、飞沫传播。实验室检测方法主要有病毒分离、核酸检测等。发展针对新型冠状病毒的核酸检测技术是及时发现传染源，实施及时有效隔离和对症治疗的关键。目前主要采用荧光定量PCR技术进行检测，优点是快速、检测结果较准确。但是目前受到检测样品类型限制，荧光定量PCR对咽拭子样品核酸检测存在一定比例的假阴性，实际检测中对于病原检测的灵敏度和特异性具有更高要求。
发明内容
为了解决现有技术中存在的假阴性问题，本发明提供一种新型冠状病毒检测的引物组，以及包括该引物组的数字PCR检测试剂盒，能够快速、准确地检出样本中的新型冠状病毒，且特异性和灵敏度极佳。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明一方面提供一种检测新型冠状病毒的引物和探针组合，包括以下引物和探针：
新型冠状病毒Orf1ab基因上游引物：
1AB-F：5'-CAAGGTAAACCTTTGGAATTTG-3'(SEQ ID NO.1)
新型冠状病毒Orf1ab基因下游引物：
1AB-R：5'-TTGTCCTCACTGCCGT-3'(SEQ ID NO.2)
新型冠状病毒Orf1ab基因探针：
1AB-P:5'-FAM-TGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACC-BHQ1-3'(SEQ ID NO.3)
内参基因β-actin上游引物：
ACTB-F：5'-GTCTTCCCCTCCATCGTG-3'(SEQ ID NO.4)
内参基因β-actin下游引物：
ACTB-R：5'-GTACTTCAGGGTGAGGATGC-3'(SEQ ID NO.5)
内参基因β-actin探针：
ACTB-PROE:5'-VIC-AATCCTTCTGACCCATGCCCACC-BHQ2-3'(SEQ ID NO.6)
进一步地，所述探针均为自身淬灭探针；所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC中的一种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2中的一种。
本发明第二方面提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒，包括上述的引物和探针组合。
进一步地，所述试剂盒还含有数字PCR反应预混液；逆转录酶；DNA模板；无核酸酶水中的一种或多种。
优选地，所述逆转录酶为HiScript III Reverse Transcriptase逆转录酶，使逆转录和PCR扩增过程一步完成，减少了开盖污染的风险。
本发明第三方面提供了一种检测新型冠状病毒的方法，所述方法使用上述试剂盒进行检测。
进一步地，所述方法使用数字PCR，所述PCR体系中内参基因β-actin上下游引物的工作浓度为450nM，新型冠状病毒Orf1ab基因的上下游引物的工作浓度为450nM，内参基因β-actin探针ACTB-PROE的工作浓度为225nM，新型冠状病毒Orf1ab基因的探针1AB-P的工作浓度为450nM；所述PCR体系中逆转录酶的量为400U。
进一步地，所述PCR扩增程序为：1)50℃，50min；2)96℃，10min；3)57℃，2min，98℃，30sec，39个循环；4)57℃，2min；5)10℃保存。
本申请采用的芯片式数字PCR的检测原理如下：数字PCR芯片上含有20000个纳米级微孔，混合液由于亲疏水的作用进入微孔中并进行PCR反应。PCR结束后，含有野生型和突变型RNA模板的微孔中会出现相应的荧光信号，没有模板的微孔则没有荧光信号产生。通过芯片扫描仪对这些荧光信号进行扫描、读取和分析，并得到新型冠状假病毒的拷贝数和病毒含量。
本发明的有益效果：本发明的新型冠状病毒数字PCR检测试剂盒检测的灵敏度最低可达到50copies/ml，且实现对微量病原体核酸的精确定量，能够从大量背景信号中检测到病原体核酸，摆脱了对标准曲线的依赖，无需公式换算，实现病原体拷贝的绝对定量。
附图说明
图1实施例1中新型冠状假病毒含量为100copies/ml的参考品的检测结果的图；
图2新冠病毒理论含量和实际含量的线性关系
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
用于新型冠状病毒数字PCR检测体系的引物和探针组合设计及数字PCR检测体系和方法的建立。
1.1引物探针设计：
根据人类新型冠状病毒的序列和β-actin基因的序列设计了如下用于新型冠状病毒数字PCR检测体系的引物和探针组合(SEQ ID NO.1-3；SEQ ID NO.4-6)：
新型冠状病毒上游引物：
1AB-F：5'-CAAGGTAAACCTTTGGAATTTG-3'(SEQ ID NO.1)
新型冠状病毒下游引物：
1AB-R：5'-TTGTCCTCACTGCCGT-3'(SEQ ID NO.2)
新型冠状病毒探针：1AB-P:5'-FAM-TGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACC-BHQ1-3'(SEQIDNO.3)
内参基因β-actin上游引物：
ACTB-F：5'-GTCTTCCCCTCCATCGTG-3'(SEQ ID NO.4)
内参基因β-actin下游引物：
ACTB-R：5'-GTACTTCAGGGTGAGGATGC-3'(SEQ ID NO.5)
内参基因β-actin探针：
ACTB-PROE:5'-VIC-AATCCTTCTGACCCATGCCCACC-BHQ2-3'(SEQ ID NO.6)
1.2实验材料
本实施例中使用的数字PCR为QuantStudioTM 3D数字PCR。
本实施例中所用到的人基因RNA参考品来自于100个正常人的基因组RNA等体积混合而成。
新型冠状假病毒质粒合成于上海生工生物，该假病毒质粒含有完整的Orf1ab基因序列。将人基因组RNA、假病毒质粒按照一定比例进行混合分别形成假病毒含量为100000copies/ml、10000copies/ml、1000copies/ml、100copies/ml、50copies/ml、25copies/ml的参考品。
各个梯度参考品的具体制备方法如下：
1、进行假病毒含量为100000copies/ml的假病毒突变参考品的制备，在100μL的体系中，将104的假病毒质粒、人基因RNA按照体积分别为10μL、90μL的比例进行混合，即得到假病毒含量为100000copies/ml的假病毒参考品；
2、进行假病毒含量为10000copies/ml的假病毒突变参考品的制备，将假病毒含量为100000copies/ml的假病毒参考品和人基因RNA按照10μL、90μL的比例混合，即得到假病毒含量为10000copies/ml的假病毒参考品；
3、进行假病毒含量为1000copies/ml的假病毒突变参考品的制备，将假病毒含量为10000copies/ml的假病毒参考品和野生型基因组RNA按照10μL、90μL的比例混合，即得到假病毒含量为1000copies/ml的假病毒参考品；
4、进行假病毒含量为100copies/ml的假病毒突变参考品的制备，将假病毒含量为1000copies/ml的假病毒参考品和野生型基因组RNA按照10μL、90μL的比例混合，即得到假病毒含量为100copies/ml的假病毒参考品；
5、进行假病毒含量为50copies/ml的假病毒突变参考品的制备，将假病毒含量为100copies/ml的假病毒参考品和野生型基因组RNA按照50μL、50μL的比例混合，即得到假病毒含量为50copies/ml的假病毒参考品；
6、进行假病毒含量为25copies/ml的假病毒突变参考品的制备，将假病毒含量为50copies/ml的假病毒参考品和野生型基因组RNA按照50μL、50μL的比例混合，即得到假病毒含量为25copies/ml的假病毒参考品；
1.3引物探针体系
通过对检测体系中探针和引物浓度的调整优化，将新型冠状病毒Orf1ab基因上游引物、下游引物、新型冠状病毒Orf1ab探针、β-actin内参基因的上游引物、下游引物、β-actin内参基因探针按照其在数字PCR体系中的浓度分别为450nM、450nM、450nM、450nM、450nM、225nM的最适比例进行混合，配置成20X的引物探针混合液。
1.4数字PCR检测过程
(1)按照下表配制新型冠状病毒数字PCR 20X引物探针混合液及检测体系，其中将上述的100000copies/ml或10000copies/ml或1000copies/ml或100copies/ml或50copies/ml或25copies/ml的假病毒参考品作为模板进行实验。
新型冠状病毒引物探针20X引物探针混合液配制：
新型冠状病毒数字PCR标检测体系：
| QuantStudioTM 3D Digital PCR Master Mix v2(2×) | 7.3μL |
| 新型冠状病毒引物探针混合液(20×) | 0.7μL |
| HiScript III Reverse Transcriptase(200U/μL) | 2μL |
| 假病毒模板 | 4.5μL |
逆转录酶为诺唯赞生物的HiScript III Reverse Transcriptase逆转录酶(R302-01)。
(2)将以上配置好的体系加入到数字PCR芯片中(QμantStμdioTM 3D Digital PCR20K Chip Kit v2)，并用矿物油覆盖芯片，密封好并确保无泄漏。再把芯片放到PCR仪器(例如，ProFlexTMPCR System)中，进行PCR反应，
PCR扩增程序为：
1)50℃，50min；
2)96℃，10min；
3)57℃，2min，98℃，30sec，39个循环；
4)57℃，2min；
5)10℃保存；
将反应之后的芯片放入芯片扫描仪中进行扫描，并根据荧光信号计算拷贝数和假病毒含量。
1.5数据结果分析
分析软件：QuantStudioTM3D AnalysisSuiteTMSoftware
| 样本名称 | 新型冠状假病毒含量检测结果 |
| 假病毒含量参考品-100000copies/ml | 131000.43copies/ml |
| 假病毒含量参考品-10000copies/ml | 8652.28copies/ml |
| 假病毒含量参考品-1000copies/ml | 1280.75copies/ml |
| 假病毒含量参考品-100copies/ml | 170.71copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 70.18copies/ml |
由上表及图2可以发现，在该体系的条件下，新型冠状假病毒的理论值病毒含量和实际检测病毒含量基本一致且都呈现出很好的线性关系，其线性回归系数R2已经达到0.998，更加证明了本申请数字PCR体系及探针引物的特异性和准确性。
此外对于新型冠状假病毒数字PCR体系的灵敏度做了评估，并进行了下述实验：对新型冠状假病毒含量参考品50copies/ml和25copies/ml进行10次重复实验。结论：最终该体系50copies/ml的参考品10次均稳定检出，25copies/ml的参考品共有2次检出，8次未检出，由此可见新型冠状假病毒数字PCR体系的灵敏度为50copies/ml。
数据结果如下表所示：
| 样本名称 | 新型冠状假病毒含量检测结果 |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 70.18copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 40.98copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 70.55copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 60.05copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 41.01copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 59.22copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 62.17copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 53.97copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 68.55copies/ml |
| 假病毒含量参考品-50copies/ml | 56.72copies/ml |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 未检出 |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 未检出 |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 10.88copies/ml |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 未检出 |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 未检出 |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 35.22copies/ml |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 未检出 |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 未检出 |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 未检出 |
| 假病毒含量参考品-25copies/ml | 未检出 |
以新型冠状假病毒含量为100copies/ml的参考品为例，
图1中，显示的每个点对应芯片上一个微孔。其中区域1没有荧光信号，代表没有模板扩增。区域2有FAM信号没有VIC信号，代表微孔中含有新型冠状假病毒的RNA模板；区域3有VIC信号没有FAM信号代表含有野生型RNA模板；区域4有VIC信号和FAM信号代表同时混入了野生型和新型冠状假病毒模板。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连晶态生物技术有限公司江苏宏微特斯医药科技有限公司
<120> 一种检测新型冠状病毒的方法和试剂盒
<130> 2020.04.10
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
caaggtaaac ctttggaatt tg 22
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tgccacttct gctgctcttc aacc 24
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtcttcccct ccatcgtg 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gtacttcagg gtgaggatgc 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
aatccttctg acccatgccc acc 23
Claims (9)
1.一种检测新型冠状病毒的引物和探针组合，其特征在于，包括以下引物和探针：
Orf1ab基因上游引物如SEQ ID NO.1所示，
Orf1ab基因下游引物如SEQ ID NO.2所示，
Orf1ab基因探针如SEQ ID NO.3所示；
内参基因β-actin下游引物如SEQ ID NO.4所示，
内参基因β-actin下游引物如SEQ ID NO.5所示，
内参基因β-actin探针如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测新型冠状病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述探针均为自身淬灭探针；所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的一种检测新型冠状病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC中的一种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2中的一种。
4.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。
5.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有数字PCR反应预混液；逆转录酶；DNA模板；无核酸酶水中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为HiScript III Reverse Transcriptase逆转录酶。
7.一种检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求5所述试剂盒检测。
8.根据权利要求7所述的一种检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述方法使用数字PCR，所述数字PCR体系中内参基因β-actin上下游引物的工作浓度为450nM，新型冠状病毒Orf1ab基因的上下游引物的工作浓度为450nM，内参基因β-actin探针ACTB-PROE的工作浓度为225nM，新型冠状病毒Orf1ab基因的探针1AB-P的工作浓度为450nM；所述PCR体系中逆转录酶的量为400U。
9.根据权利要求8所述的一种检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：1)50℃，50min；
2)96℃，10min；
3)57℃，2min，98℃，30sec，39个循环；
4)57℃，2min；
5)10℃保存。
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