CN104195132A - 一种-20°c保存的2×pcr混合液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可放-20°C保存的2×PCR混合液，属于生物技术领域。100μl2×PCR混合液配置如下：7.5μl二甲基亚砜，7.5μl0.1%牛血清蛋白溶液，10μl10mMdNTP溶液，20μl10×PCRbuffer，50μl30%重量比甘油溶液，5μlrTaq酶，将上述混匀后离心，存放于-20°C冰箱中。该混合液能长期存放于-20°C保存，具有较高的应用价值，能减少PCR扩增体系配置时间以及提高PCR体系配置的准确性和减少PCR扩增过程中的污染。

Description

一种-20°C保存的2×PCR混合液

技术领域

本发明涉及一种可放-20°C保存的2×PCR混合液，属于生物技术领域。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术，它是现代分子生物学最重要的手段之一。其基本原理是根据获诺贝尔1953年生理学奖的DNA双螺旋模型所建立的体细胞复制的机制以及双链DNA在体外可随温度变化发生变性与复性的特点设计。1985年Randll.K.Skaii等利用Klenow DNA聚合酶建立了聚合酶链式反应技术，并将其应用于镰刀形贫血病的基因诊断。它是80年代分子生物学领域的一项革命性突破，被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。此项技术一经问世就因其操作简单、快速、灵敏度高和特异性强等优点迅速在与分子生物学相关的学科得到广泛应用，如分子生物学研究、医学检验、动植物检验、法医鉴定及考古等各个领域。

在PCR过程中，DNA聚合酶起着关键性作用。目前已有100多个DNA聚合酶的相关基因被克隆和测序，Thermus aquaticus是一种水生嗜热菌，从该菌中分离出的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)具有催化以DNA为模板合成DNA的功能。

Taq NDA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。研究表明，Mg2+浓度低于lmM，dNTP过多，鳌合Mg2+作用强时，Mg2+对Taq DNA聚合酶的催化作用几乎丧失，不产生扩增产物。随着Mg2+浓度的增加，其催化作用增强，扩增产物增多，但产物浓度增大的同时，背景也明显增强。

常规的PCR扩增体系配置，往往是将dNTP、Buffer、rTaq酶等试剂单独保存，待要进行PCR扩增时，将样品分别加到同一PCR管中，在操作过程中除了经常忘记加入个别试剂的缺点外，多次的使用会对试剂造成污染，影响后续使用。因此，研发一种PCR扩增体系对于减少PCR扩增体系配置时间以及提高PCR体系配置的准确性和减少PCR扩增过程中的污染有着极其大的意义。

发明内容

本发明提供一种可放-20°C保存的2×PCR混合液，该混合液能长期存放于-20°C保存，具有较高的应用价值。

本发明的一种-20°C保存的2×PCR混合液：

（1）2× PCR混合液的配置：100μl 2×PCR混合液配置如下：7.5μl 二甲基亚砜，7.5μl 0.1%牛血清蛋白溶液，10μl 10mM dNTP溶液，20μl 10×PCR buffer，50μl 30%重量比甘油溶液，5μl rTaq酶，将上述混匀后离心，存放于-20°C冰箱中。

其中10×PCR buffer的配置如下：100mM Tris-HCl pH 8.3，500 mM KCl，15mM MgCl₂。

（2）2× PCR混合液的使用：从冰箱中取出2× PCR混合液，配置PCR体系，以20μl的PCR体系为例，配置如下： 2× PCR混合液 10μl，引物R 1μl，引物F 1μl,模版1μl，灭菌水 7μl。

常规性的PCR扩增体系的配置都是将每个实验药品单独加到PCR管中进行PCR扩增，这样的配置方式不仅费时，同时也增加了实验操作的不稳定性。通过将PCR体系配置过程中必须的实验药品配成混合体系不仅可以节省大量时间，同时可以防止药品的交叉污染，单纯地将PCR体系配置中的必须药品混合在一起并无法长期放于-20°C保存。因此本混合液中加入了30%甘油溶液对DNA聚合酶的活性进行保护，使其可以长期放于-20°C。

本发明的显著优点：

                      1.   能够减少PCR体系配置的时间。

                      2.   能够尽量降低PCR的污染。

                      3.   能够低温保存，使用方便。

附图说明

    图 1为PCR扩增结果图，泳道1是DNA mark，泳道2-4是新鲜配置的rTaq酶扩增结果，泳道5-6是存放于-20°C 6个月的混合液的扩增结果。

具体实施方式

 实施例1

本发明的-20°C保存的2×PCR混合液的试剂盒及方法，具体步骤如下：

（1）2× PCR混合液的配置：100μl PCR混合液体系配置如下：7.5μl 二甲亚砜（DMSO）溶液，7.5μl 0.1%牛血清蛋白(BSA)溶液，10μl 10mM DNTP溶液，20μl 10×PCR buffer，50μl 30%甘油溶液，5μl rTaq酶。将配置好的溶液混匀后离心，存放于-20°C冰箱中。

PCR扩增体系的配置：从冰箱中取出2× PCR混合液，配置PCR体系，20μl的PCR体系配置如下： 2× PCR混合液 10μl，引物R 1μl，引物F 1μl,模版1μl，灭菌水 7μl。同时配置新鲜的rTaq酶扩增体系（常规配置），20μl的PCR体系配置如下：2ul 10×PCR buffer，0.5ul二甲亚砜（DMSO）溶液，0.5μl 0.1%牛血清蛋白(BSA)溶液,1μl 10mM DNTP溶液，引物R 1μl，引物F 1μl,模版1μl，0,5μl rTaq酶,12.5ul灭菌水。模板为水稻cDNA。将以上配置好的体系同时进行PCR扩增，PCR扩增的程序为：

将获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

其中10×PCR buffer的配置方法如下：100mM Tris-Hcl（PH 8.3）,500 mM Kcl，15mM Mgcl2。引物R：5'-TATAGGGTACCGCGAGGCCGGCCAAGGTGCAGGAGATGTTCG-3'

引物F:  5'-GGCGACTAGTCTAGTTGGTGAAGTTGTTGAGGCAGGCGTGGG-3'

     如图1所示， -20°C保存6个月的2×PCR混合液的扩增结果仍然与常规的PCR体系配置方法扩增效果相当，且本发明通过添加DMSO和BSA等物质提高了PCR扩增过程中的稳定性和特异性。另外在大批量PCR体系的配置过程中，由于需要加的样品过多经常导致漏加或多加，对实验的结果产生了很大的影响，通过配置2×PCR混合液可以大大缩减PCR体系配置的时间，同时进一步提高了实验的准确性。同时由于本混合液可放于-20°C保存，在最大程度上保护了DNA聚合酶的活性。因此可以一次配置，多次使用，提高了PCR扩增体系配置的便捷性和稳定性。

Claims (2)

1.一种-20°C保存的2×PCR混合液，其特征在于， 100μl 2×PCR混合液配置如下：7.5μl 二甲基亚砜，7.5μl 0.1%牛血清蛋白溶液，10μl 10mM dNTP溶液，20μl 10×PCR buffer，50μl 30%重量比甘油溶液，5μl rTaq酶，将上述混匀后离心，存放于-20°C冰箱中。

2.根据权利要求1所述的-20°C保存的2×PCR混合液，其特征在于，所述10×PCR buffer的配置如下：100mM Tris-HCl pH 8.3，500 mM KCl，15mM MgCl₂。