CN102094085B - 一种磷酸甘露糖异构酶等温扩增检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种磷酸甘露糖异构酶等温扩增检测试剂盒，属于食品检验领域。本发明为一种磷酸甘露糖异构酶扩增用引物，以及一种磷酸甘露糖异构酶扩增用试剂及扩增产物制备方法。本发明灵敏度高、精确度好，适合于玉米、甜菜、小麦、水稻、木薯、甜橙和葡萄中转基因成分筛查，便于在各检测机构推广应用。

Description

一种磷酸甘露糖异构酶等温扩增检测试剂盒
技术领域
本发明提供一种磷酸甘露糖异构酶的检测方法，属于转基因食品检测领域，具体地讲，涉及用环介导等温扩增方法来检测磷酸甘露糖异构酶基因的技术。
背景技术
植物遗传转化的转化频率通常较低，筛选时必须利用选择标记来保证转化细胞的存活和防止非转化细胞的再生。传统的筛选方法是利用抗生素和除草剂类选择剂，但这些物质对人类和环境的影响还不完全了解，因此，非抗生素筛选系统应运而生。
甘露糖阳性选择系统属于非抗生素筛选系统之一，它是利用大肠杆菌的磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)作为选择基因，甘露糖作为选择剂进行转基因植物的筛选。甘露糖经由植物内源己糖激酶催化磷酸化为6-磷酸甘露糖，反应消耗ATP和磷酸盐，会导致细胞分裂、生长缺少能量，并且6-磷酸甘露糖的过量积累对植物细胞有毒害作用。整合有外源pmi基因的转化细胞能将6-磷酸甘露糖异构酶为6-磷酸果糖，使得代谢可继续进行，避免了因6-磷酸甘露糖的大量积累，并产生ATP，为细胞的正常代谢提供了能量。非转化细胞因缺乏磷酸甘露糖异构酶，不能利用6-磷酸甘露糖正常生长。因此，在含有甘露糖的培养基上，只有转化细胞能正常生长，而非转化细胞则被淘汰。
在转基因植株筛选过程中主要用氯酚法(chlorophenol red，CPR)进行检测，这种方法仅适用于活植株的筛选，对于已经没有活性的植株或加工产品就不适用。杨彩云等为了方便载体构建在引物前都设计了Xho玉的酶切位点，并在引物两边加入保护碱基。引物序列为：
Ppmi-1：5′-GCACTCGAGCATGCAAAAACTCATTAACTCAG-3′；
Ppmi-2：5′-GCACTCGAGCTCTTACAGCTTGTTGTAAAC-3′
扩增片段大小1.2kb左右，对转基因食品检测就不太适用。因为食品大部分是进行深加工处理，DNA片段破碎比较严重，检测目标片段太长就容易出现假阴性结果。
本专利应用环介导等温扩增技术建立的检测方法用于快速筛选鉴别磷酸甘露糖异构酶基因。为基层实验室开展转基因玉米筛选检测和监控工作提供有效的技术手段。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一种应用等温扩增方法检测磷酸甘露糖异构酶的方法。本发明是通过以下技术方案实现的：
1.磷酸甘露糖异构酶核酸序列
2.引物的设计：通过Primer Premier 5.0和Oligo6.0针对磷酸甘露糖异构酶基因设计特异性引物和特异性探针。
磷酸甘露糖异构酶基因的全基因序列
1    TCCCCGATCA TGCAAAAACT CATTAACTCA GTGCAAAACT ATGCCTGGGG CAGCAAAACG
61   GCGTTGACTG AACTTTATGG TATGGAAAAT CCGTCCAGCC AGCCGATGGC CGAGCTGTGG
121  ATGGGCGCAC ATCCGAAAAG CAGTTCACGA GTGCAGAATG CCGCCGGAGA TATCGTTTCA
181  CTGCGTGATG TGATTGAGAG TGATAAATCG ACTCTGCTCG GAGAGGCCGT TGCCAAACGC
241  TTTGGCGAAC TGCCTTTCCT GTTCAAAGTA TTATGCGCAG CACAGCCACT CTCCATTCAG
301  GTTCATCCAA ACAAACACAA TTCTGAAATC GGTTTTGCCA AAGAAAATGC CGCAGGTATC
361  CCGATGGATG CCGCCGAGCG TAACTATAAA GATCCTAACC ACAAGCCGGA GCTGGTTTTT
421  GCGCTGACGC CTTTCCTTGC GATGAACGCG TTTCGTGAAT TTTCCGAGAT TGTCTCCCTA
481  CTCCAGCCGG TCGCAGGTGC ACATCCGGCG ATTGCTCACT TTTTACAACA GCCTGATGCC
541  GAACGTTTAA GCGAACTGTT CGCCAGCCTG TTGAATATGC AGGGTGAAGA AAAATCCCGC
601  GCGCTGGCGA TTTTAAAATC GGCCCTCGAT AGCCAGCAGG GTGAACCGTG GCAAACGATT
661  CGTTTAATTT CTGAATTTTA CCCGGAAGAC AGCGGTCTGT TCTCCCCGCT ATTGCTGAAT
721  GTGGTGAAAT TGAACCCTGG CGAAGCGATG TTCCTGTTCG CTGAAACACC GCACGCTTAC
781  CTGCAAGGCG TGGCGCTGGA AGTGATGGCA AACTCCGATA ACGTGCTGCG TGCGGGTCTG
841  ACGCCTAAAT ACATTGATAT TCCGGAACTG GTTGCCAATG TGAAATTCGA AGCCAAACCG
901  GCTAACCAGT TGTTGACCCA GCCGGTGAAA CAAGGTGCAG AACTGGACTT CCCGATTCCA
                                                              F3
961  GTGGATGATT TTGCCTTCTC GCTGCATGAC CTTAGTGATA AAGAAACCAC CATTAGCCAG
                          F2
1021 CAGAGTGCCG CCATTTTGTT CTGCGTCGAA GGCGATGCAA CGTTGTGGAA AGGTTCTCAG
             F1C                       B1C
1081 CAGTTACAGC TTAAACCGGG TGAATCAGCG TTTATTGCCG CCAACGAATC ACCGGTGACT
                                       B2
1141 GTCAAAGGCC ACGGCCGTTT AGCGCGTGTT TACAACAAGC TGTAAGAGCT TACTGAAAAA
      B3
1201 ATTA
引物1：5-TCCCGATTCCAGTGGATGA
引物2：5-ACAGTCACCGGTGATTCGT
引物3：5-ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC
引物4：5-CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT
这一系列的引物可以使不与上述碱基序列的互补链完全互补的寡核苷酸。即，前述各引物中，除3’末端的碱基以外的部分可以与完全互补的寡核苷酸有1-5个碱基不同。
而且，本发明的磷酸甘露糖异构酶扩增用试剂，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增磷酸甘露糖异构酶的试剂，含有上述本发明的磷酸甘露糖异构酶扩增用引物对。
本发明的扩增产物的制备方法，其特征在于，其为通过基因扩增法制备磷酸甘露糖异构酶扩增产物的方法，含有下述步骤：以试样中的核酸作为模板，使用本发明所述的磷酸甘露糖异构酶扩增用引物对，在反应液中扩增所述的磷酸甘露糖异构酶的步骤。
试样可以是玉米、甜菜、小麦、水稻、木薯、甜橙和葡萄及其加工产品，通过磷酸甘露糖异构酶扩增来判断其是否有转基因成分。如果出现磷酸甘露糖异构酶阳性结果则试样中含有转基因成分，如果出现磷酸甘露糖异构酶阴性结果则试样中不含转基因成分。
此外，根据常规方法，将等温扩增的引物用于PCR反应。反应体系包括以下组分Thermopol buffer、dNTP、MgSO4、Betaine、ddH2O、Bst DNApol。反应体系组分可以有变化，例如加入甘油、矿物油等。根据常识，各组分的体积可根据条件不同而变化，每次不同批次试剂的最佳组合均可能会不同。
反应条件可以是55℃-65℃，30-75分钟。最佳的温度可以是60℃-63℃，时间是40-50分钟。
3.检测方法
其检测方法可以是SYBR Green染色方法，也可以是常规电泳或者实时荧光的方法。
PCR反应体系可以和上述一致，也可以有变动。
酶可以是Bst DNApol，也可以是其他具有相同功能的酶。
应当理解的是，整个扩增反应体系可以是每个组分是单独存放，在进行扩增前将各组分按照合适的浓度加入，混匀后进行反应。也可以事先将所有的组分按照一定的配比混好后，在进行扩增前加入去离子水和模板即可以进行扩增。
与现有技术相比，本发明涉具有以下优点：
1.本发明的引物能够特异地扩增磷酸甘露糖异构酶；
2.能够在等温条件下对磷酸甘露糖异构酶进行扩增，可以不用高端的仪器只需要保温杯即可完成扩增，适合现场检测；
3.当使用本发明的引物对时，能以优于以往的扩增效率进行扩增反应，因此还能够缩短扩增时间；
4.由于本引物设计时针对目标片段上6个不同的区域，因此检测特异性提高，假阴性结果大大降低，有效提高阳性检出率；
5.适用范围更加广泛，不仅能检测植株，而且能够对深加工食品进行检测。
总之，本发明的引物对、含有其的试剂以及使用他们的扩增产物的制备方法，能够迅速而简单地检测磷酸甘露糖异构酶，在检验检疫系统等是非常有效地。
附图说明
图1是用SYBRG reen染色进行检测结果。1：3272，2：MIR604，3：MON89034，4：BT176，，5：1507，6：MON810，7：MON863，8：NK603，9：GA21，10：BT21，11：空白对照。从该检测结果可以看出，1，2为磷酸甘露糖异构酶阳性。
图2是用琼脂糖凝胶电泳检测结果。1：3272，2：MIR604，3：MON89034，4：BT176，，5：1507，6：MON810，7：MON863，8：NK603，9：GA21，10：BT21，11：空白对照，M：DL2000DNA marker。从该检测结果可以看出，图2中1，2为磷酸甘露糖异构酶阳性。
具体实施方式
现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的分子生物学常规技术。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，分子克隆等。
各引物长度自身没有特别的限制，可以适当调整到通常的长度，作为引物长度的一例，例如在13-50mer的范围内，优选1445mer，更优选15-40mer。而且由于上述引物的3’末端被固定，由引物延伸出的区域是固定的，获得的扩增产物的总长根据所使用的引物长度而变化。
实施例1
样品：已知是转基因玉米事件3272，MIR604，MON89034，BT176，1507，MON810，MON863，NK603，GA21，BT21，其中3272和MIR604磷酸甘露糖异构酶阳性，检测时用到的引物对为：
磷酸甘露糖异构酶
引物1：5-TCCCGATTCCAGTGGATGA
引物2：5-ACAGTCACCGGTGATTCGT
引物3：5-ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC
引物4：5-CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT
反应体系如下：
表1磷酸甘露糖异构酶检测体系1
  工作液名称   保存浓度   单管所需体积(ul/人份)
  引物1   10uM   1
  引物2   10uM   1
  引物3   10uM   0.5
  引物4   10uM   0.5
  Thermo pol buffer   10x   2.5
  dNTP   10mM   4
  MgSO4   100mM   2
  Betaine   5M   7
  ddH2O   2.5
  Bst DNApol   8U/ul   1
  Template   5
  总体积(ul)   25
按照上述配制好反应体系后，63℃保温45分钟，用SYBR Green染色进行检测，结果见附图1。用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见附图2。
序列表
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
TCCCGATTCCAGTGGATGA 19
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ACAGTCACCGGTGATTCGT 19
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC 39
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT39

Claims (7)

1.一种磷酸甘露糖异构酶基因扩增用引物组，其特征在于，通过等温扩增法扩增磷酸甘露糖异构酶基因，所述引物组由4条引物组成，序列如下所示：
引物1：5’-TCCCGATTCCAGTGGATGA-3’
引物2：5’-ACAGTCACCGGTGATTCGT-3’
引物3：5’-ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC-3’
引物4：5’-CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT-3’。
2.权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶基因扩增用引物组在扩增生物试样中的磷酸甘露糖异构酶基因中的应用，所述生物试样为玉米、甜菜、小麦、水稻、木薯、甜橙和葡萄及其加工产品。
3.一种磷酸甘露糖异构酶基因扩增用试剂，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增磷酸甘露糖异构酶基因的试剂，含有权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶基因扩增用引物组。
4.一种扩增产物的制备方法，其特征在于，其为通过基因扩增法制备磷酸甘露糖异构酶基因扩增产物的方法，含有下述步骤：以试样中的核酸作为模板，使用权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶基因扩增用引物组，在反应液中扩增所述的磷酸甘露糖异构酶基因的步骤。
5.根据权利要求4所述的扩增产物的制备方法，其还包括使用SYBR Green染色方法对扩增产物进行检测的步骤。
6.根据权利要求4所述的扩增产物的制备方法，其中所述扩增步骤的反应条件是55-65℃，30-75分钟。
7.根据权利要求4所述的扩增产物的制备方法，其还包括对扩增产物进行检测的步骤，所述检测方法包括试纸条、常规电泳和染色法。
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