CN103484529A - 转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针 - Google Patents

转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针 Download PDF

Info

Publication number
CN103484529A
CN103484529A CN201210202238.3A CN201210202238A CN103484529A CN 103484529 A CN103484529 A CN 103484529A CN 201210202238 A CN201210202238 A CN 201210202238A CN 103484529 A CN103484529 A CN 103484529A
Authority
CN
China
Prior art keywords
transgenic plant
probe
pmi
primer
plant product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201210202238.3A
Other languages
English (en)
Inventor
高宏伟
王述柏
孙敏
周茜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Agricultural University
Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Original Assignee
Qingdao Agricultural University
Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Agricultural University, Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau filed Critical Qingdao Agricultural University
Priority to CN201210202238.3A priority Critical patent/CN103484529A/zh
Publication of CN103484529A publication Critical patent/CN103484529A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/101—Taqman
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于转基因植物产品的引物和探针，具体地说是用实时荧光PCR技术检测转基因植物产品的磷酸甘露糖异构酶基因的引物和探针。方法包括PCR扩增反应液和上游引物PMI-taqF5’-CCGGGTGAATCAGCGTTTA-3’；下游引物PMI-taqR：5’-GCCGTGGCCTTTGACAGT-3’；探针PM1-taqP：FAM-TGCCGCCAACGAATCACCGG-TAMARA。转基因植物产品磷酸甘露糖异构酶基因的检测方法包括转基因植物产品DNA的提取、转基因植物磷酸甘露糖异构酶基因的实时荧光PCR扩增和使用荧光定量PCR仪随机软件分析扩增结果并进行结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便。

Description

转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针
技术领域
本发明属于植物源成分的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测转基因植物产品的磷酸甘露糖异构酶基因的检测用的引物和探针。 
背景技术
甘露糖阳性选择系统属于非抗生素筛选系统之一，它是利用大肠杆菌的磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)作为选择基因，甘露糖作为选择剂进行转基因植物的筛选。甘露糖经由植物内源己糖激酶催化磷酸化为6-磷酸甘露糖，反应消耗ATP和磷酸盐，会导致细胞分裂、生长缺少能量，并且6-磷酸甘露糖的过量积累对植物细胞有毒害作用。整合有外源PMI基因的转化细胞能将6-磷酸甘露糖异构酶为6-磷酸果糖，使得代谢可继续进行，避免了因6-磷酸甘露糖的大量积累，并产生ATP，为细胞的正常代谢提供了能量。非转化细胞因缺乏磷酸甘露糖异构酶，不能利用6-磷酸甘露糖正常生长。因此，在含有甘露糖的培养基上，只有转化细胞能正常生长，而非转化细胞则被淘汰。该选择系统在玉米转基因过程中运用广泛。 
在享有转基因技术带来的巨大实惠的同时，转基因产品潜在的生态安全、食品安全问题也日益引起人们的关注，各国纷纷制定相应的法律法规对转基因产品进行监管。除美国、加拿大、阿根廷和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上大多数国家如欧盟各国、匈牙利、瑞士、波兰、日本、韩国等均制定了强制性标识制度。我国于2001年、2002年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，启动了农业转基因生物的监督监管机制。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因作物，应当加以标识，未标识和不按规定标识的，不得进口和销售，因此，必须对转基因产品进行有效的检测。 
目前，国内还没有转基因植物中磷酸甘露糖异构酶基因PCR检测试剂盒，本发明可弥补上述缺陷，采用实时荧光PCR的检测方法完成转基因植物中磷酸甘露糖异构酶基因的检测。 
发明内容
本发明属于转基因植物产品的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测转基因植物产品的磷酸甘露糖异构酶基因的检测用检测方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些产品检测中的局限性，为转基因产品检测提供有效工具，从而加强转基因产品的监督监管，确保产品标签的一致性，保护消费者的知情权和选择权。 
本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物(上游引物：PMI-taqF 5’-ccgggtgaatcagcgttta-3’和 下游引物：PMI-TAQR 5’-gccgtggcctttgacagt-3’)和一条TAQMAN探针(PMI-TAQP：FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性集合。Taqman探针的5端标记有报告集团，3端有非荧光淬灭集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3’→5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团原理淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。 
本发明涉及的转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因的检测方法，其中的试剂包括如下： 
(1)PCR扩增反应液A 
包括10×PCR反应缓冲液、0.1-0.4mmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、1-2U Taq酶、0.2-0.6μmol/L上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、0.2-0.6μmol/L Taqman探针； 
其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X100； 
上游引物PMI-taqF：5’-ccgggtgaatcagcgttta-3’；下游引物PMI-taqR：5’-gccgtggcctttgacagt-3’； 
Taqman探针PMI-taqP：FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA 
其中上游引物、下游引物、Taqman探针的体积比为：1∶1∶0.6； 
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1。 
(2)阳性对照DNA 
上面所述PCR扩增反应液A，每管24μL的最佳组成为：2.5μL10×PCR反应缓冲液、2μL2.5mmol/LdNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2μL25mmol/L硫酸镁、1μL10μmol/L上游引物、1μL10μmol/L下游引物、0.6μL10μmol/L Taqman探针、0.3μLTaq酶、14.6μLddH2O。 
使用上述试剂盒检测转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)： 
(1)待检样品DNA的提取 
DNA提取可使用DNA提取试剂盒或CTAB法。 
(2)转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因的实时荧光PCR扩增 
A.在装有24μL PCR扩增反应液A的反应管中加入1μL待检样品DNA，混匀。 
B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增： 
95℃3min，1个循环； 
95℃30s，60℃30s，共40个循环。 
(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。 
实施例1 
按下述方法检测转基因玉米3272，使用59122、BT11、MON88017、MON810转基因玉米品系做阴性对照： 
包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L硫酸镁、1.5U Taq酶、0.4μmol/L上游引物PMI-taqF：5’-ccgggtgaatcagcgttta-3’；下游引物PMI-taqR：5’-gccgtggcctttgacagt-3’；Taqman探针PMI-taqP：FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA。其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100； 
按照以下程序进行检测： 
(1)待测转基因玉米样品DNA的提取 
采用安比奥试剂盒(GenoDNA Plant Mini Kit) 
A.充分研磨 
B.最多每75mg鲜料或15mg干材料样品中加400μgBufferAP1，0.5μl RNaseA，充分混匀； 
C.在65℃培养10min，期间上下颠倒离心管2-3次； 
D.加130μl BufferAP2，混匀，冰上放置5min，14000rpm离心5min； 
E.将上清转入新的1.5ml离心管内，加1.5倍体积的BufferAP3/E，颠倒3-4次，混匀； 
F.把溶液小心转入2ml收集管的吸附柱内，10000rpm离心1min，如果一次离不完，可多次加样直至过柱完成，倒掉收集管中的液体； 
G.加500μlBufferAW1，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体； 
H.加500μl BufferAW2，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体； 
I.重复8步一次； 
G.14000rpm离心3min，将离心柱转移至一干净1.5ml离心管内； 
K.小心加50-100μl BufferAE至吸附柱滤膜上，室温静置1-5min，10000rpm离心1min；4℃保存。也可等同采用CTAB法。 
(2)待测转基因植物样品DNA的实时荧光PCR扩增 
A.在PCR反应管中加入24μL PCR反应液A和1μL样品DNA，混匀。 
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增： 
95℃3min，1个循环； 
95℃30s，60℃30s，共40个循环。 
(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。 
实施例2 
按下述方法检测转基因玉米MIR604，使用GTS 40-3-2、MON89788、A2704-12转基因大豆品系做阴性对照： 
包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L硫酸镁、1.5U Taq酶、0.4μmol/L上游引物PMI-taqF：5’-ccgggtgaatcagcgttta-3’；下游引物PMI-taqR：5’-gccgtggcctttgacagt-3’；Taqman-MGB探针PMI-taqP：FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA。其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100； 
按照以下程序进行检测： 
(1)待测转基因玉米样品DNA的提取 
采用安比奥试剂盒(GenoDNA Plant Mini Kit) 
A.充分研磨 
B.最多每75mg鲜料或15mg干材料样品中加400μgBufferAP1，0.5μl RNaseA，充分混匀； 
C.在65℃培养10min，期间上下颠倒离心管2-3次； 
D.加130μl BufferAP2，混匀，冰上放置5min，14000rpm离心5min； 
E.将上清转入新的1.5ml离心管内，加1.5倍体积的BufferAP3/E，颠倒3-4次，混匀； 
F.把溶液小心转入2ml收集管的吸附柱内，10000rpm离心1min，如果一次离不完，可多次加样直至过柱完成，倒掉收集管中的液体； 
G.加500μl BufferAW1，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体； 
H.加500μl BufferAW2，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体； 
I.重复8步一次； 
G.14000rpm离心3min，将离心柱转移至一干净1.5ml离心管内； 
K.小心加50-100μl BufferAE至吸附柱滤膜上，室温静置1-5min，10000rpm离心1min；4℃保存。也可等同采用CTAB法。 
(2)待测转基因植物样品DNA的实时荧光PCR扩增 
A.在PCR反应管中加入24μL PCR反应液A和1μL样品DNA，混匀。 
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增： 
95℃3min，1个循环； 
95℃30s，60℃30s，共40个循环。 
(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。 
附图说明
图1玉米3272荧光PCR产物的曲线图。图中坐标轴以外实横线以上为阳性样品，以下为阴性样品或空白对照。 
图2玉米MIR604荧光PCR产物的曲线图。图中坐标轴以外实横线以上为阳性样品，以下为阴性样品或空白对照。 

Claims (2)

1.一种转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因的引物和探针，其特征在于其中的引物和探针：
上游引物PMI-taqF 5’-CCGGGTGAATCAGCGTTTA-3’；
下游引物PMI-taqR：5’-GCCGTGGCCTTTGACAGT-3’。
探针PMI-taqP：FAM-TGCCGCCAACGAATCACCGG-TAMARA
2.使用权利要求一使用所述的引物和探针快速检测转基因植物磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)的方法，其特征是依次包括下列步骤：
(1)待检样品的DNA提取；
(2)转基因植物磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)的实时荧光PCR扩增：
在装有24μL的PCR扩增反应液的反应管中加入1μL的待检样品DNA，混匀。按照下述步骤完成PCR扩增。
95℃3min，1个循环；
95℃30s，60℃30s，共40个循环。
(3)使用扩增曲线分析PCR产物。
CN201210202238.3A 2012-06-13 2012-06-13 转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针 Pending CN103484529A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210202238.3A CN103484529A (zh) 2012-06-13 2012-06-13 转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210202238.3A CN103484529A (zh) 2012-06-13 2012-06-13 转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103484529A true CN103484529A (zh) 2014-01-01

Family

ID=49825121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210202238.3A Pending CN103484529A (zh) 2012-06-13 2012-06-13 转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103484529A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102094085A (zh) * 2010-11-30 2011-06-15 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种磷酸甘露糖异构酶等温扩增检测试剂盒
CN102260668A (zh) * 2004-03-25 2011-11-30 辛根塔参与股份公司 玉米事件mir604

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102260668A (zh) * 2004-03-25 2011-11-30 辛根塔参与股份公司 玉米事件mir604
CN102094085A (zh) * 2010-11-30 2011-06-15 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种磷酸甘露糖异构酶等温扩增检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
贺艳等: "磷酸甘露糖异构酶基因快速初筛方法的建立", 《食品研究与开发》 *
钱方等: "转基因作物的安全标记基因", 《河南农业科学》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102634593B (zh) 转基因玉米event98140及其衍生品种的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法
CN101775440A (zh) 一种转基因大豆检测用质粒标准分子及其构建方法
CN103952463B (zh) 一种基于特异引物鉴定5种常见储粮扁谷盗的试剂盒
CN104480202B (zh) 一种丝瓜内参基因及其应用
CN102634588B (zh) 转基因玉米mir604及其衍生品种的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法
CN102634591B (zh) 转基因水稻bt63及其衍生品种的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法
Li et al. A high-throughput, high-quality plant genomic DNA extraction protocol
CN103276101B (zh) 利用四重荧光定量pcr检测番茄转基因成分的方法
CN102162012B (zh) 转基因水稻科丰6号的定性pcr检测方法
CN103146811A (zh) 检测红脂大小蠹的方法及检测试剂盒
CN104404173B (zh) 一种用于检测番茄斑萎病毒的nasba方法
CN101550445B (zh) 抗草甘膦转基因大豆及其加工品快速检测试剂盒的制备和检测方法
CN103451291B (zh) Cry1Ab/Cry1Ac抗虫基因RPA检测方法
CN103409515B (zh) 一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒及其使用方法
CN101550444B (zh) 用于检测食品和饲料中花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子的引物
CN101864489B (zh) 一种富集转基因产品中外源dna的方法
CN103773867A (zh) 转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
CN103614476B (zh) 食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒
CN103484529A (zh) 转基因植物产品中磷酸甘露糖异构酶基因检测用的引物和探针
CN105274258A (zh) 用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
CN102776268A (zh) 恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒及方法
CN104561366A (zh) 利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法
CN103509875A (zh) 应用RPA技术检测CaMV 35S启动子和nos终止子
CN102634592A (zh) 转基因玉米bt176及其衍生品种的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN101792814A (zh) 转基因抗虫棉gk12的转化体特异性pcr检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140101