CN117268049A - 一种高纯度dNTP单体冻干粉及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物制品的冷冻干燥领域，具体公开了一种高纯度dNTP单体冻干粉及其制备工艺。该制备工艺包括如下步骤：在常压下，将dNTP水溶液在‑10～‑40℃低温预冻3‑5h，得到预冻结晶，然后在‑30～‑40℃的温度下真空冷冻干燥20‑30h，之后通入氮气恢复常压，得到dNTP单体冻干粉。本申请的制备工艺制得的dNTP冻干粉的HPLC纯度不低于99%，PCR条带清晰，水分含量低于10%，易于储存和运输，有效期较长，并且易于溶解，纯水复溶用时较短，复溶后液体澄清。
Description
技术领域
本申请涉及生物制品的冷冻干燥领域，更具体地说，它涉及一种dNTP单体的冷冻干燥过程。
背景技术
自20世纪70年代起，研究人员就已经开始进行DNA合成方面的研究，合成DNA对于药物、燃料以及其他化学用品的研发具有重要的意义。随着技术的不断发展和创新，现在人工合成的DNA片段已经可以被广泛应用于基因工程和分子生物学等生命科学领域。
DNA合成的基础物质是脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，根据其结构的不同可分为dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dUTP。目前，市面上售卖的多为10-100mmol的dNTP水溶液，其在做PCR等试验时可以直接配制使用。但是dNTP水溶液的保存均在稳定性差，空间占用较大等问题。
真空冷冻干燥技术是一种公认的可以用于增强温度敏感的生物分子的储存稳定性的方法，已被广泛应用于食品、药品、生物制品等多个领域的生产中。其原理是将需干燥的含水化合物先冷冻成固态，再在低温真空条件下使溶媒升华而达到干燥的目的，该方法与其他干燥方法相比具有热稳定性好的优点，特别适用于热敏化合物，例如核酸类物质。
目前的真空冷冻干燥技术通常会对核酸类物质造成一定的损伤，例如链的断裂、超螺旋的损伤等，因此，在实际操作过程中多采用加入众多冷冻保护剂、冻干保护剂或赋形剂的方式来防止这些损伤。现有的可参考公告号为CN 107567497A的中国专利，其提供了一种RNA的冻干方法，在该方法中需先将至少一种RNA和至少一种冻干保护剂进行混合后再冻干。但是，该方法中冻干保护剂加入会对dNTP在PCR中的应用产生干扰，影响PCR条带的清晰程度。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请提供一种不添加任何冻干保护剂或赋形剂的dNTP单体冻干粉的制备工艺及其制得的纯度高于99％的dNTP单体冻干粉。
第一方面，本申请提供的一种高纯度dNTP单体冻干粉的制备工艺，采用如下的技术方案：
一种高纯度dNTP单体冻干粉的制备工艺，包括如下步骤：
在常压下，将dNTP水溶液在-10～-40℃低温预冻3-5h，得到预冻结晶，然后在-30～-40℃的温度下真空冷冻干燥20h以上，之后通入氮气恢复常压，得到dNTP单体冻干粉。
通过采用上述技术方案，本申请的制备工艺中真空冷冻干燥过程一直维持在同一温度范围内，不存在升温过程，避免了热交换，显著降低了真空冷冻干燥过程对dNTP造成损伤的可能性，从而使得本申请的冻干工艺中无需加入任何的冷冻保护剂、冻干保护剂或赋形剂，大幅度降低了这些试剂对dNTP的HPLC纯度产生影响的可能性，有利于PCR的顺利进行，并且本申请的制备工艺采用氮气破真空，降低了化合物与水、氧直接发生碰撞而出现降解的可能性，从而提高了dNTP单体冻干粉的HPLC纯度。此外，本申请的制备工艺步骤简单，易操作，用时较短，成本较低，适合大规模工业化生产。
优选的，所述低温预冻的温度变化具体为：
先将dNTP水溶液降温至-30～-40℃预冻1-1.5h，然后升温至-10～-20℃预冻1-2h，之后再降温至-30～-40℃预冻1-1.5h。
通过采用上述技术方案，本申请采用折线式的温度变化进行低温预冻，可以得到较为疏松的预冻结晶，缩短了后期真空冷冻干燥的时间。并且可以使得dNTP单体冻干粉在复溶时的用时较短，大约在3-30s的范围内。
优选的，所述真空冷冻干燥的真空度为0.15-0.20mbar。
优选的，所述真空冷冻干燥包括升华干燥和解析干燥，其中，升华干燥的时间为10-15h，解析干燥的时间为10-15h。
通过采用上述技术方案，预冻结晶先进行一段时间的升华干燥过程，随着游离水的升华或蒸发，dNTP逐渐结晶析出变为冰晶状，然后再进行一段时间的解析干燥过程，dNTP由冰晶状逐渐转化为粉末状，最终dNTP冻干粉中游离水含量在4.8-9.2％。
优选的，所述dNTP水溶液的浓度为95-105mmol/L。在本申请的一个具体实施方式中，dNTP水溶液的浓度为95mmol/L。在本申请的一个具体实施方式中，dNTP水溶液的浓度为100mmol/L。在本申请的一个具体实施方式中，dNTP水溶液的浓度为105mmol/L。
第二方面，本申请提供一种由上述制备工艺制得的高纯度dNTP冻干粉。
优选的，所述dNTP冻干粉的HPLC纯度不低于99％。
优选的，所述dNTP冻干粉的水分含量为4.8-9.2％。
通过采用上述技术方案，本申请的dNTP冻干粉的纯度高达99％以上，杂质含量极低，水分含量低于10％，与dNTP水溶液相比便于储存和运输。一般dNTP水溶液能在-20℃保存12个月，而本申请的dNTP冻干粉能在-20℃保存至少3年，有效期较长。并且应用于PCR时条带清晰，易于溶解，纯水复溶时间大约在3-30s的范围内，用时较短，复溶后液体澄清，HPLC纯度与冻干前相比没有明显降低，可以大规模工业化生产。
第三方面，本申请提供一种高纯度dNTP冻干粉在基因扩增、测序和标记中的应用。
更具体地说，本申请的高纯度dNTP冻干粉可以应用于PCR扩增、real-time PCR(qPCR)、RT-PCR、长片段PCR、高保真PCR、cDNA合成、引物延伸反应、DNA测序、DNA标记等基因扩增、测序和标记中。
综上所述，本申请具有以下有益技术效果：
1.本申请的制备工艺制得的dNTP冻干粉的HPLC纯度较高，PCR条带清晰，水分含量较低，易于储存和运输，有效期较长，并且易于溶解，纯水复溶用时较短，复溶后液体澄清；2.本申请的制备工艺步骤简单，易操作，用时较短，成本较低，适合大规模工业化生产。
附图说明
图1(a)是冻干前dATP的HPLC谱图；
图1(b)本申请制得的dATP单体冻干粉的HPLC谱图；
图2(a)是冻干前dTTP的HPLC谱图；
图2(b)是本申请制得的dTTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图3(a)是冻干前dCTP的HPLC谱图；
图3(b)是本申请制得的dCTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图4(a)是冻干前dGTP的HPLC谱图；
图4(b)是本申请制得的dGTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图5(a)是冻干前dUTP的HPLC谱图；
图5(b)是本申请制得的dUTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图6是对比例1制得的dGTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图7是对比例2制得的dATP单体冻干粉的HPLC谱图；
图8是对比例3制得的dTTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图9是对比例4制得的dCTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图10是对比例5制得的dGTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图11是对比例6制得的dUTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图12是对比例7制得的dGTP单体冻干粉的HPLC谱图；
图13(左)是实施例6制得的dGTP单体冻干粉复溶后的照片；
图13(右)是对比例1制得的dGTP单体冻干粉复溶后的照片；
图14是本申请应用例1的PCR条带照片。
具体实施方式
以下结合附图、实施例、对比例和应用例对本申请作进一步详细说明。
本申请的dNTP可以为dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dUTP；
本申请的制备工艺采用金属冻干盘，金属冻干盘的内径尺寸为48.1×29×2.75cm；
本申请真空冷冻干燥时间对应本申请的dNTP水溶液在金属冻干盘中的液体高度，随着液体高度的不同，真空冷冻干燥时间可以适当延长或缩短。
实施例1
一种高纯度dATP单体冻干粉的制备工艺，包括如下步骤：
S1、在常压下，将浓度为95mmol/L的dATP水溶液加入金属冻干盘中，液体高度为1.0cm，然后降温至-30℃预冻1.5h，再升温至-10℃预冻2h，之后降温至-30℃预冻1.5h，得到预冻结晶；
S2、将预冻结晶在真空度为0.15mbar、温度为-30℃的条件下，先升华干燥15h，再解析干燥15h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dATP单体冻干粉。
实施例2
一种高纯度dATP单体冻干粉的制备工艺，包括如下步骤：
S1、在常压下，将浓度为105mmol/L的dATP水溶液加入金属冻干盘中，液体高度为0.7cm，然后降温至-40℃预冻1h，再升温至-20℃预冻1h，之后降温至-40℃预冻1h，得到预冻结晶；S2、将预冻结晶在真空度为0.2mbar、温度为-40℃的条件下，先升华干燥10h，再解析干燥10h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dATP单体冻干粉。
实施例3
一种高纯度dATP单体冻干粉的制备工艺，包括如下步骤：
S1、在常压下，将浓度为100mmol/L的dATP水溶液加入金属冻干盘中，液体高度为0.8cm，然后降温至-35℃预冻1.2h，再升温至-15℃预冻1.5h，之后降温至-35℃预冻1.3h，得到预冻结晶；
S2、将预冻结晶在真空度为0.18mbar、温度为-35℃的条件下，先升华干燥12h，再解析干燥14h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dATP单体冻干粉。
实施例4
一种高纯度dTTP单体冻干粉的制备工艺，包括如下步骤：
S1、在常压下，将浓度为100mmol/L的dTTP水溶液加入金属冻干盘中，液体高度为1.0cm，然后降温至-30℃预冻1.5h，再升温至-20℃预冻1h，之后降温至-30℃预冻1.5h，得到预冻结晶；
S2、将预冻结晶在真空度为0.2mbar、温度为-30℃的条件下，先升华干燥15h，再解析干燥15h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dTTP单体冻干粉。
实施例5
一种高纯度dCTP单体冻干粉的制备工艺，包括如下步骤：
S1、在常压下，将浓度为100mmol/L的dCTP水溶液加入金属冻干盘中，液体高度为1.0cm，然后降温至-30℃预冻1.5h，再升温至-15℃预冻1.5h，之后降温至-30℃预冻1.5h，得到预冻结晶；
S2、将预冻结晶在真空度为0.17mbar、温度为-30℃的条件下，先升华干燥15h，再解析干燥15h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dCTP单体冻干粉。
实施例6
一种高纯度dGTP单体冻干粉的制备工艺，包括如下步骤：
S1、在常压下，将浓度为100mmol/L的dGTP水溶液加入金属冻干盘中，液体高度为1.0cm，然后降温至-30℃预冻1.5h，再升温至-20℃预冻1h，之后降温至-40℃预冻1h，得到预冻结晶；
S2、将预冻结晶在真空度为0.17mbar、温度为-40℃的条件下，先升华干燥15h，再解析干燥10h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dGTP单体冻干粉。
实施例7
一种高纯度dUTP单体冻干粉的制备工艺，包括如下步骤：
S1、在常压下，将浓度为100mmol/L的dUTP水溶液加入金属冻干盘中，液体高度为1.0cm，然后降温至-40℃预冻1h，再升温至-20℃预冻1h，之后降温至-30℃预冻1.5h，得到预冻结晶；
S2、将预冻结晶在真空度为0.2mbar、温度为-30℃的条件下，先升华干燥15h，再解析干燥15h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dUTP单体冻干粉。
对比例1
与实施例6的不同之处在于：步骤S2中存在热交换过程；具体为，将预冻结晶在真空度为0.17mbar、温度为-40℃的条件下，先升华干燥10h，然后以20℃/h的升温速率升温至10℃进行解析干燥，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dGTP单体冻干粉。
对比例2
与实施例3的不同之处在于：步骤S2中，真空冷冻干燥的温度不同；具体为，将预冻结晶在真空度为0.18mbar、温度为-20℃的条件下，先升华干燥12h，再解析干燥14h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dATP单体冻干粉。
对比例3
与实施例4的不同之处在于：步骤S2中，真空冷冻干燥的温度不同；具体为，将预冻结晶在真空度为0.2mbar、温度为-20℃的条件下，先升华干燥15h，再解析干燥15h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dTTP单体冻干粉。
对比例4
与实施例5的不同之处在于：步骤S2中，真空冷冻干燥的温度不同；具体为，将预冻结晶在真空度为0.17mbar、温度为-20℃的条件下，先升华干燥15h，再解析干燥15h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dCTP单体冻干粉。
对比例5
与实施例6的不同之处在于：步骤S2中，真空冷冻干燥的温度不同；具体为，将预冻结晶在真空度为0.17mbar、温度为-20℃的条件下，先升华干燥15h，再解析干燥10h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dGTP单体冻干粉。
对比例6
与实施例7的不同之处在于：步骤S2中，真空冷冻干燥的温度不同；具体为，将预冻结晶在真空度为0.2mbar、温度为-20℃的条件下，先升华干燥15h，再解析干燥15h，之后通入氮气回复常压，密闭转移至氮气保护的手套箱中进行称重和包装，得到dUTP单体冻干粉。
对比例7
与实施例6的不同之处在于：步骤S1中，不采用折线式温度变化进行低温预冻；具体为，在常压下，将浓度为100mmol/L的dGTP水溶液加入金属冻干盘中，液体高度为1.5cm，然后降温至-50℃预冻3h，得到预冻结晶。
性能检测
1、分别检测实施例1-7和对比例1-7制得的dNTP单体冻干粉的纯度和水分含量，记录于表1中，其中，每组实施例中均包括多组试样，记录的纯度为多组试样的平均值。
表1性能检测结果表
| 项目 | 冻干前纯度(％) | 冻干后纯度(％) | 水分含量(％) |
| 实施例1 | 99.59 | 99.08 | 4.875 |
| 实施例2 | 99.58 | 99.09 | 4.878 |
| 实施例3 | 99.58 | 99.07 | 4.879 |
| 实施例4 | 99.48 | 99.35 | 5.025 |
| 实施例5 | 99.82 | 99.85 | 5.693 |
| 实施例6 | 99.64 | 99.29 | 9.154 |
| 实施例7 | 99.58 | 99.07 | 4.865 |
| 对比例1 | 99.64 | 81.44 | 9.137 |
| 对比例2 | 99.58 | 96.27 | 4.632 |
| 对比例3 | 99.48 | 94.87 | 4.729 |
| 对比例4 | 99.82 | 93.00 | 5.386 |
| 对比例5 | 99.64 | 98.54 | 9.574 |
| 对比例6 | 99.58 | 96.27 | 4.287 |
| 对比例7 | 99.64 | 98.22 | 9.061 |
从表1以及图1-5可以看出，本申请实施例1-3制得的dATP单体冻干粉的纯度为99.07-99.09％，水分含量为4.875-4.879％；本申请实施例4制得的dTTP单体冻干粉的纯度为99.35％，水分含量为5.025％；本申请实施例5制得的dCTP单体冻干粉的纯度为99.85％，水分含量为5.693％；本申请实施例6制得的dGTP单体冻干粉的纯度为99.29％，水分含量为9.154％；本申请实施例7制得的dUTP单体冻干粉的纯度为99.07％，水分含量为4.865％；试验数据和附图均表明，本申请的制备工艺制得的dNTP单体冻干粉具有较高的纯度，与冻干前的纯度相比几乎没有下降，仍然可以达到99％以上，生物活性不降低，并且水分含量较低，有效期较长，易于储存和运输。
由于dGTP是dNTP中从结构来看最不稳定，且最容易在冻干中变坏的，因此，本申请的对比例1以dGTP为例，证明在没有冻干保护剂或赋形剂的存在下，热交换对dNTP的影响。从表1和图6可以看出，对比例1制得的dGTP冻干粉的纯度为81.44％，水分含量为9.137％，虽然水分含量略低于实施例6，但是对比例1与冻干前的纯度相比下降了18.27％，明显差于实施例6，试验数据表明在没有冻干保护剂或赋形剂的存在下，热交换会对dNTP单体冻干粉的纯度造成较大的影响。
对比例2与实施例3的不同之处在于真空冷冻干燥过程的温度不同，从表1中的数据以及图1、图7可以看出，对比例2的dATP单体冻干粉的纯度为96.27％，与实施例3相比降低了2.83％；对比例3与实施例4的不同之处在于真空冷冻干燥过程的温度不同，从表1中的数据以及图2、图8可以看出，对比例3的dTTP单体冻干粉的纯度为94.87％，与实施例4相比降低了4.51％；对比例4与实施例5的不同之处在于真空冷冻干燥过程的温度不同，从表1中的数据以及图3、图9可以看出，对比例4的dCTP单体冻干粉的纯度为93％，与实施例5相比降低了6.86％；对比例5与实施例6的不同之处在于真空冷冻干燥过程的温度不同，从表1中的数据以及图4、图10可以看出，对比例5的dGTP单体冻干粉的纯度为98.54％，与实施例6相比降低了0.76％；对比例6与实施例7的不同之处在于真空冷冻干燥过程的温度不同，从表1中的数据以及图5、图11可以看出，对比例6的dUTP单体冻干粉的纯度为96.27％，与实施例7相比降低了2.83％；上述试验数据充分说明了本申请控制真空冷冻干燥过程的温度可以提高dNTP单体冻干粉的纯度，当真空冷冻干燥过程的温度由-30℃变为-20℃时就会使dNTP单体冻干粉的纯度降低。
对比例7和实施例6的不同之处在于预冻过程不同，从表1中的数据以及图4、图12可以看出，对比例7的dGTP单体冻干粉的纯度为98.22％，与实施例6相比降低了1.08％，试验数据表明，不采用折线式温度变化进行预冻会影响预冻结晶的疏松程度，从而使得该预冻结晶在本申请的冻干时间内无法达到良好的冻干效果，进而影响dNTP单体冻干粉的纯度。
2、分别将实施例1-7、对比例1和对比例7制得的dNTP单体冻干粉用纯水复溶，经观察实施例1-7制得的dNTP单体冻干粉的复溶时间为3-30s，对比例7制得的dGTP单体冻干粉的复溶时间约为45s，其中，实施例6和对比例1的复溶后的照片如图13所示。
从复溶时间以及图13可以看出，本申请制得的dNTP单体冻干粉复溶时间为3-30s，用时较短，且复溶后液体澄清。对比例7的复溶时间略长于实施例1-7，这说明本申请采用折线式温度变化进行预冻，可以得到较为疏松的预冻结晶，从而缩短了复溶时间。
应用例1
本申请以PCR扩增为例对本申请制得的dNTP冻干粉的应用进行验证。
一种高纯度dATP冻干粉在PCR扩增中的应用，包括如下步骤：
a.将实施例3制得的dATP冻干粉配制成终浓度为2.5mmol/L的dATP Mix；
b.引物、模板、DNA聚合酶、PCR Buffer放置于冰上融化，轻微震荡混匀并离心，与待测试的dATP Mix和水按照下表所示配制加样PCR预混液；
表2
c.打开基因扩增仪，设置PCR程序，进行PCR反应。
d.运行页面中，设置反应程序。设置反应体系为50μL，反应条件为第一阶段预变性95℃·3min；第二阶段变性95℃·20s，退火55℃·20s，延伸72℃·4min，循环次数30次；第三阶段72℃·5min；最后12℃保温放置。
e.制备琼脂糖凝胶进行电泳实验，结果如图14所示。
应用例2
与应用例1的不同之处在于：步骤a中，将实施例4制得的dTTP冻干粉配制成终浓度为2.5mmol/L的dTTP Mix。
应用例3
与应用例1的不同之处在于：步骤a中，将实施例5制得的dCTP冻干粉配制成终浓度为2.5mmol/L的dCTP Mix。
应用例4
与应用例1的不同之处在于：步骤a中，将实施例6制得的dGTP冻干粉配制成终浓度为2.5mmol/L的dGTP Mix。
应用例5
与应用例1的不同之处在于：步骤a中，将实施例7制得的dUTP冻干粉配制成终浓度为2.5mmol/L的dUTP Mix。
上述应用例2-5得到的PCR条带照片与应用例1的PCR条带照片相似。从图14可以看出，本申请制得的高纯度dNTP冻干粉应用于PCR时条带清晰。
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种高纯度dNTP单体冻干粉的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
在常压下，将dNTP水溶液在-10～-40℃低温预冻3-5h，得到预冻结晶，然后在-30～-40℃的温度下真空冷冻干燥20h以上，之后通入氮气恢复常压，得到dNTP单体冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度dNTP单体冻干粉的制备工艺，其特征在于，所述低温预冻的温度变化具体为：
先将dNTP水溶液降温至-30～-40℃预冻1-1.5h，然后升温至-10～-20℃预冻1-2h，之后再降温至-30～-40℃预冻1-1.5h。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度dNTP单体冻干粉的制备工艺，其特征在于：所述真空冷冻干燥的真空度为0.15-0.20mbar。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度dNTP单体冻干粉的制备工艺，其特征在于：所述真空冷冻干燥包括升华干燥和解析干燥，其中，升华干燥的时间为10-15h，解析干燥的时间为10-15h。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度dNTP单体冻干粉的制备工艺，其特征在于：所述dNTP水溶液的浓度为95-105mmol/L。
6.一种权利要求1-5任一项所述的制备工艺制得的高纯度dNTP冻干粉。
7.根据权利要求6所述的一种高纯度dNTP冻干粉，其特征在于：所述dNTP冻干粉的HPLC纯度不低于99%。
8.根据权利要求6所述的一种高纯度dNTP冻干粉，其特征在于：所述dNTP冻干粉的水分含量为4.8-9.2%。
9.一种权利要求7或8任一项所述的高纯度dNTP冻干粉在基因扩增、测序和标记中的应用。
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| CN202311216663.2A CN117268049A (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 一种高纯度dNTP单体冻干粉及其制备工艺 |
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