CN116891909A - 鼠诺如病毒的检测引物探针组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物检测领域，具体公开了一种鼠诺如病毒的检测引物探针组、试剂盒及检测方法。该引物探针组为用于检测GV型诺如病毒的引物组和荧光探针。该鼠诺如病毒的检测方法，包括：提取样品RNA；采用上述引物探针组建立RT‑qPCR检测体系，进行RT‑qPCR检测；根据荧光信号进行检测结果的判断。该检测方法的灵敏性高、特异性强，不易出现假阴性，可作为小鼠日常监测常用方法，提早发现小鼠中诺如病毒的感染情况，及时作出防控措施，提高实验动物质量，为科研提供更多高品质实验动物。

Description

鼠诺如病毒的检测引物探针组、试剂盒及检测方法
技术领域
本申请涉及生物检测领域，更具体地说，它涉及一种鼠诺如病毒的检测引物探针组、试剂盒及检测方法。
背景技术
2003年诺如病毒(mouse norovirus，MNV)在小鼠中被首次发现，美国、日本等相继在实验动物中检测到该病毒，且感染率位于实验小鼠病毒自然感染率榜首，排在第二位的是细小病毒，该病毒的检出率约为细小病毒的10倍。诺如病毒会导致免疫缺陷小鼠死亡，对正常小鼠也存在一定的影响，已有研究报道该病毒对正常小鼠也存在一定的影响，例如组织病理学改变、加重小鼠肠炎模型的发生等，对实验研究产生一定的影响。国内外已经将鼠诺如病毒筛查作为筛查的病原之一，因此建立一种高灵敏度、高特异性的鼠诺如病毒检测方法是非常重要的。
诺如病毒的常规检测方法有电镜法、免疫学方法、分子生物学方法。电镜法由于其仪器昂贵，且灵敏度低，观察到的病毒颗粒较少，在浓度达到106个病毒颗粒时才能检测到，因此不被广泛使用；免疫学方法操作简单，检测快速，不需要昂贵的仪器，但灵敏性较低，而且需要小鼠产生抗体，对于免疫缺陷鼠不适用；分子生物学方法被认为是诺如病毒检测的“金标准”，具有良好的灵敏度和特异性，能够在病毒浓度较低的情况下被检测到。目前荧光PCR作为一种比普通PCR方法敏感性高1至2个数量级，且PCR产物无需琼脂糖凝胶电泳，节省了实验时间，并且减少了污染的几率，有着普通PCR不能比拟的优势。单次PCR相比套氏PCR，PCR进行一轮扩增，所用时间短，但单次PCR的敏感性不如套氏PCR；套氏PCR敏感性高，但需要进行两轮扩增，第2轮PCR反应是以第1轮的PCR产物为模板，因而增加了污染的几率，容易产生假阳性结果。荧光PCR方法包含染料法和探针法两种方法，均可用来定量检测鼠诺如病毒。
染料法是在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光染料能特异的掺入DNA双链从而发射荧光信号，而单链DNA则不会掺入结合的特点，荧光信号的增加与PCR产物的增加成正比，通过检查荧光信号来判断是否有产物扩增。从原理来看，染料法不含特异探针，只有一对特异性引物，其特异性会降低，因此结果判定需要结合溶解曲线来进行，但染料法的敏感性高于探针法，最低可检测到10拷贝/μL MNV核酸。
人们依照诺如病毒NoVs衣壳蛋白VP1的完整序列将其分成5个基因群(genegroup，GG)，GGⅠ、GGⅡ、GGⅢ、GGⅣ和GGⅤ。GGI、GGII及GGIV型为人诺如病毒，GGII型中还包含猪诺如病毒，GGⅢ型为牛和羊诺如病毒，GGV型为鼠诺如病毒。鼠诺如病毒具有较高的变异性，且与人源诺如病毒存在较高差异性。目前，已有的检测小鼠诺如病毒的荧光PCR方法，灵敏度低，特异性较差，在低浓度时检出率较差，存在假阴性的情况。鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请提供一种鼠诺如病毒的检测引物探针组、试剂盒及检测方法，该检测方法的灵敏性高、特异性强，不易出现假阴性，可作为小鼠日常监测常用方法，提早发现小鼠中诺如病毒的感染情况，及时作出防控措施，提高实验动物质量，为科研提供更多高品质实验动物。
本申请的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种检测鼠诺如病毒的引物探针组，包括用于检测GV型诺如病毒的引物组和荧光探针；
引物组包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
名称 序列(5’-3’) 序号
正向引物 CCGCAGGAACGCTCAGCAG SEQ ID NO.1
反向引物 GGYTGAATGGGGACGGCCTG SEQ ID NO.2
探针 荧光报告基团-ATGAGTGATGGCGCA-荧光淬灭基团 SEQ ID NO.3
进一步地，上述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团；3’端标记有荧光淬灭基团。
进一步地，上述荧光报告基团为FMA或HEX；荧光淬灭基团为BHQ1。
第二方面，本申请提供一种鼠诺如病毒的检测试剂盒，其包括上述引物探针组。
进一步地，上述检测试剂盒还包括：病毒核酸提取试剂、PCR扩增试剂、反转录酶混合液、阳性对照品。
第三方面，本申请提供一种鼠诺如病毒的检测方法，其包括：
(1)提取样品RNA；
(2)采用上述引物探针组建立RT-qPCR检测体系，进行RT-qPCR检测；
(3)根据荧光信号进行检测结果的判断。
进一步地，上述根据荧光信号进行检测结果的判断方法为：
有明显扩增曲线且Ct值≤35，定为阳性；
无明显扩增曲线且Ct值≥40，定为阴性；
当35≤Ct值≤40时，需要复检。
进一步地，上述反转录反应体系为10μL，体系中的RT Buffer 2μL、RT Enzyme Mix1μL、RT Primer Mix 2μL、其余用RNase-Free ddH2O补齐。
进一步地，上述RT-qPCR检测体系为20μL，体系中预混酶10μL、正向引物0.6μL、反向引物0.6μL、荧光探针0.4μL，模板2μL，其余用水补齐。
进一步地，上述RT-qPCR的反应参数为：42℃反转录15min，95℃预变性15min，95℃变性5s，58℃退火延伸30s，40个循环。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请采用RT-qPCR法检测鼠粪便中的诺如病毒，发明人通过在GenBank中选取不同来源的鼠诺如病毒基因序列，找出特异性保守序列VP1，进行比对，筛选出一对高特异性和灵敏性的引物，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，同时设计了特异性的荧光探针，在其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；而在有特异PCR扩增时，Taq酶的酶切活性将探针酶切降解，报告基团和淬灭基团分离，淬灭作用消失，因而产生荧光信号。通过有无明显扩增曲线以及Ct值的大小，可以非常便捷的判断小鼠是否感染诺如病毒。
1、本申请提供的方法对鼠诺如病毒检测具有高敏感性，通过对不同来源引物的对比发现，本申请提供的引物敏感性优于其他引物，在1000个粪便样本中，得到的阳性率最高。因此在动物感染初期，体内病毒量较少时就能被检测到，减小动物污染的范围，及时作出应对措施。
2、本申请提供的方法对小鼠诺如病毒的检测具有高特异性，对其他RNA病毒与交叉反应，1000个粪便样本的检测结果与测序结果完全一致，不会出现假阳性或者假阴性的出现，避免假阴性时没有及时对动物隔离，使其感染范围增大，也避免了假阳性出现时对未感染小鼠进行安乐死。
3、本申请采用动物粪便样本，避免处死动物，符合动物福利的3R原则中的减少动物使用量，提高动物福利。
附图说明
图1是本申请灵敏度实验中通过对比引物1对阳性样本的倍比稀释得出不同扩增曲线；
图2是本申请灵敏度实验中通过对比引物2对阳性样本的倍比稀释得出不同扩增曲线；
图3是本申请灵敏度实验中通过对比引物3对阳性样本的倍比稀释得出不同扩增曲线；
图4是本申请灵敏度实验中通过对比引物4对阳性样本的倍比稀释得出不同扩增曲线；
图5是本申请灵敏度实验中通过本申请引物对阳性样本的倍比稀释得出不同扩增曲线；
图6是本申请特异性实验的扩增曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例
实施例1
本实施例提供一种用于检测鼠诺如病毒的引物探针组：
发明人在NCBI上检索出所有鼠诺如病毒衣壳蛋白VP1基因，经过序列比对与分析，找到高度保守区域的相对保守区域，针对该保守序列设计引物，并进行BLAST序列比对，得到1对敏感性和特异性相对较好的，并查找文献，找到4对已经报道过的引物作为对照，用于检测鼠诺如病毒，合成，并在后续进行验证。
引物信息如表1所示：
表1.引物信息
实施例2
本实施例提供一种鼠粪便中诺如病毒RT-qPCR检测方法，其采用如表1所示的引物信息。
一、提取病毒RNA：
操作过程中所有与相关试剂接触的物品与液体试剂均经过无酶处理，核酸提取采用天根病毒RNA提取试剂盒(天根DP315-R)。
1.向装有310μg Carrier RNA冻干粉的管中加入310μLRNase-Free ddH2O。
2.将Carrier RNA彻底溶解，得到终浓度为1μg/μL的溶液。
3.将裂解液RL与Carrier RNA溶液按照说明书比例配制Carrier RNA工作液。
4.用移液器将560μL Carrier RNA工作液加入1.5mL离心管中。
5.向离心管中加入140μL已预处理的样品上清液，涡旋振荡15sec混匀。
6.在室温下(15-25℃)孵育10min。
7.简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
8.加入560μL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15sec。
9.简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
10.仔细将离心管中的630μL液体转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)。
11.盖上管盖，6000×g(8000rpm)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
12.将剩余离心管中液体按步骤11再次过柱。
13.小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液GD，盖上管盖，6000×g(8000rpm)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
14.小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW，盖上管盖，6000×g(8000rpm)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
15.重复步骤14。
16.将吸附柱放回收集管中，13,400×g(12,000rpm)离心3min，打开吸附柱盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。
17.将吸附柱放入一个RNase-Free离心管(1.5ml)中，小心打开吸附柱的盖子，向吸附膜的中间部位悬空滴加60μL RNase-Free ddH2O，盖上盖子，室温放置5min。6000×g(8000rpm)离心1min，得到病毒RNA。
二、反转录：
1.将模板RNA在冰上解冻，5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RTBuffer、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。以下操作步骤在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2.按照表2的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min，然后置于冰上放置。
表2.gDNA去除反应体系
3按照表3的反转录反应体系配制混合液：
表3.反转录反应体系
组分说明 浓度 使用量
10×King RT Buffer 10× 2μL
FastKing RT Enzyme Mix 5× 1μL
FQ-RT Primer Mix 10× 2μL
RNase-Free ddH2O 5μL 补足到10μL
4.将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀后，42℃，孵育15min。
5.然后在95℃下孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。
三、实时荧光PCR反应：
探针法(即对比引物1、对比引物3以及本申请的引物)采用如表4所示的实时荧光PCR反应的体系：
表4.实时荧光PCR反应体系(探针法)
组分说明 浓度 使用量
预混酶 2× 10μL
上游引物 10μm 0.6μL
下游引物 10μm 0.6μL
荧光探针 10μm 0.4μL
模版DNA 原液 2μL
RNase-Free ddH2O - 补足到20μL
其中，预混酶为天根预混酶(SuperReal荧光定量预混试剂(探针法)(FP206))；
染料法(即对比引物2和对比引物4)采用如表5所示的实时荧光PCR反应的体系：
表5.实时荧光PCR反应体系(染料法)
组分说明 浓度 使用量
预混酶 2× 10μL
上游引物 10μm 0.6μL
下游引物 10μm 0.6μL
模版DNA 原液 2μL
RNase-Free ddH2O - 补足到20μL
预混酶为天根预混酶(SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBR Green)(FP205))
实时荧光PCR反应的反应条件如表6和表7所示：退火温度从50℃～60℃进行验证，每个温度设置3组重复，最终确定58℃为最佳退火温度。
表6.实时荧光PCR反应条件(探针法)
表7.实时荧光PCR反应条件(染料法)
四.检测结果
根据荧光信号进行检测结果的判断：
(1)有明显扩增曲线且Ct值≤35，定为阳性；
(2)无明显扩增曲线且Ct值≥40，定为阴性；
(3)当35≤Ct值≤40时，需要复检，若CT值仍＜40则判定为阳性，若＞40，则判定为阴性。
实验例：
一、采用实施例2的检测方法对实验动物粪便进行检测：
1.处理样品：
分别对动物房1000盒实验动物的粪便进行收集处理：取老鼠粪便置于1.5mL离心管中，加入500μL生理盐水，浸泡30min，振荡10min，7000rpm离心1min，取上清备用，采用实施例2的方法提取病毒RNA。
2.制备阳性质控品：
使用普通PCR进行验证，所用引物的正向引物序列为：CAGATCACATGCTTCCCAC(SEQID NO.14)，反向引物序列为AGACCACAAAAGACTCATCAC(SEQ ID NO.15)，扩增产物大小为187bp，将扩增得到的片段送至天一辉远测序公司进行测序，得到的片段在NCBI上进行比对，比对率为99.2％，确定为小鼠诺如病毒阳性，将其作为阳性质控品进行后续试验。
3.采用表1中的引物，以实施例2的方法进行反转录实时荧光PCR反应，对该1000份粪便样本进行检测。
4.检测结果：
检测结果如表8所示：
表8.粪便样本检测结果
引物 阳性率
对比引物1 55.3％
对比引物2 53.4％
对比引物3 55.8％
对比引物4 53.3％
本申请引物 56.2％
由表8可见，本申请的引物与其它四对引物相比，检测的阳性率最高(为56.2％)，由此说明本申请提供的引物的特异性强。
选取1000个样本中，对比引物1～4检测为阴性，而本申请引物检测为阳性的29个样本，送至天一辉远进行测序，验证是否为诺如病毒，将测序得到的序列在NCBI上进行比对，结果表明均为诺如病毒。由此说明，本申请提供的引物检测不存在假阴性。
二、灵敏度实验：
将上述阳性质控品进行稀释，分别用表1中的5对引物对不同浓度的阳性质控品进行检测，结果如图1和表9所示：
表9.灵敏度检测结果
由图1和表9中的数据可见，由于对比引物2和对比引物4采用染料法，对比引物1和对比引物3以及本申请均采用探针法，在相同稀释倍数时，探针法较染料法的灵敏度更高。且在三条荧光探针中，本申请的探针敏感性最高。
三、特异性实验：
选择鼠诺如病毒、轮状病毒、脑脊髓炎病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒进行特异性实验：
以下表所述的引物作为引物探针组，采用实施例2提供的检测方法对对鼠诺如病毒、轮状病毒、脑脊髓炎病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒阳性样本进行检测，检测结果如图2所示：
由图2可见，本申请的上述引物仅对鼠诺如病毒有扩增曲线，而对轮状病毒、脑脊髓炎病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒均无响应。由此说明，本申请提供的引物特异性强。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种检测鼠诺如病毒的引物探针组，其特征在于，包括用于检测GV型诺如病毒的引物组和荧光探针；
所述引物组包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的检测鼠诺如病毒的引物探针组，其特征在于，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团；3’端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的检测鼠诺如病毒的引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团为FMA或HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ1。
4.一种鼠诺如病毒的检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1~3任一项所述的引物探针组。
5.根据权利要求4所述的鼠诺如病毒的检测试剂盒，其特征在于，还包括：病毒核酸提取试剂、PCR扩增试剂、反转录酶混合液、阳性对照品。
6.一种鼠诺如病毒的检测方法，其特征在于，其包括：
提取样品RNA；
采用如权利要求1~3任一项所述的引物探针组建立RT-qPCR检测体系，进行RT-qPCR检测；
根据荧光信号进行检测结果的判断。
7.根据权利要求6所述的鼠诺如病毒的检测方法，其特征在于，根据所述荧光信号进行检测结果的判断方法为：
有明显扩增曲线且Ct值≤35，定为阳性；
无明显扩增曲线且Ct值≥40，定为阴性；
当35≤Ct值≤40时，需要复检。
8.根据权利要求6所述的鼠诺如病毒的检测方法，其特征在于，反转录反应体系为10μL，体系中的RT Buffer 2μL、RT Enzyme Mix 1μL、RT Primer Mix 2μL、其余用RNase-FreeddH2O补齐。
9.根据权利要求6所述的鼠诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述RT-qPCR检测体系为20μL，体系中预混酶10μL、正向引物0.6μL、反向引物0.6μL、荧光探针0.4μL，模板2μL，其余用水补齐。
10.根据权利要求6所述的鼠诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述RT-qPCR的反应参数为：42℃反转录15min，95℃预变性15min，95℃变性5s， 58℃退火延伸30s， 40个循环。
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